Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная активность лимфоцитов крови человека после ее УФ облучения в терапевтической дозе

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Функциональная активность лимфоцитов крови человека после ее УФ облучения в терапевтической дозе"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК СССР

На правах рукописи

ВОЛГАРЕВА

Елена Валентиновна

УДК 91.111.1:57.043

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ЕЕ УФ ОБЛУЧЕНИЯ В ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ДОЗЕ

03.00.25—КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1991

Работа выполнена в Институте цитологии АН СССР.

Научный руководитель — доктор биологических наук К. А. САМОЙЛОВА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. М. МИХЕЛЬСОН кандидат медицинских наук Л. Н. БУБНОВА

Ведущее учреждение — ВОНЦ АМН СССР.

на заседании специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии АН СССР по адресу: 194064, Ленинград, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Защита состоится « С/4 »

1991 г. в •ГЗ часов

Автореферат разослан « » 1991

г.

Ученый секретарь специализированного со] кандидат биологических

ПИСАРЕВА

© — Институт цитологии АН СССР.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В последние годы резко возрос интепес к немедикаментозным методам лечения. Это вызвано, с одной стороны, недостаточной эффективностью фармакологических препаратов, растущей аллергизацией населения, развитием других отрицательных последствий, а, с другой стороны, - накоплением обширной литературы, свидетельствующей о высокой терапевтической эффективности различных физических факторов, в частности, излучений оптического диапазона, получаемых от обычных и лазерных источников света. 3 70-80 гг. оформилась и быстро развивается новая отрасль медицины - фотомедицина и ез ведущий раздел - фотоиммунология. Среди их главных задач - разработка и научное обоснование новых методов светолечения. Весомый вклад в развитие этих направлений мояет знести изучение лечебного действия а^тотрансфузий УФ-облученной крови (АУ50К) -метода, получившего широкое признание в последние десятилетия благодаря своей простоте, экономичности, многообразия индуцируемых в организме положительных функциональных сдвигов, отсутствию побочных явлений, высокой терапевтической эффективности при самых различных заболеваниях (см. Атясов,1985,1987, 1889; Еанелина,Самойлова,1986). Использование метода АУЗОК для изучения природы лечебных сеойств света представляется особенно перспективным ввиду возмолэтости выделить пусковые (триггер-нне) механизмы развивающихся терапевтических эффектов. Поскольку начальным моментом АУфОК-терапии является поступление в кровоток небольших количеств облученной УФ лз'чами аутолоптчной крови (1/40-1/90 ее циркулирующего объема, а с учетом малой "прозрачности" крови для УФ лучей - 1/400-1/800), триггерные механизмы всех индуцируемых феноменов должны быть сеяээны с изменениями крови, происходящими как при ее УЗ-облучении (УФО), так и при действии УФ-облученной крови на интактную.

К настоящему времени получены многочисленный доказательства иммуностимулирующего и икмунокоррегт*рующего действия АУ50К--терапия, однако экспериментальных обоснований этого эффекта пока не предложено. Имеющиеся данные-сэ^етельотзуют о том, что УФ0 крови в нелетальных для форменных элементов крови до-

зах, в частности, УФО в аппарате "Изольда", применяемом в клиниках СССР, индуцирует шедцинг (десорбцию) надмембранпых компонентов гликокаликса иммунокомпетентных клеток (ИК), увеличение и демаскирование их мембранных рецепторов, стимуляцию фагоцитоза моноцитов, изменение презентации антигена, повышение ростостимулирующей активности мононуклеаров - Мнк (Крыленков и др.,1983; Лвкгау,ЗЬеуас11,1980; см. Самойлова,Дуткевич, 1986; фирулина, 1987; Самойлова и др., 1989,1990). Однако роль этих изменений в итерируемых АШЖ положительных сдвигах в иммунных процессах оставалась невыясненной. Очевидным пробелом в исследованиях механизмов действия АУФОК на иммунные процессы является отсутствие специальных работ, посвященных изучению влияния УФО в терапевтической дозе на функциональную активность лимфоцитов (Лфц). Остается также неясным, каким образом небольшое количество фотомодифицированных ИК может при ретранс-фузиях УФ-облученной крови влиять на иммунный статус организма и какой вклад в развитие фотоиммунологических реакций вносят изменения других форменных элементов и плазмы.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении клеточных иммунологических реакций после УФО донорской крови в аппарате "Изольда" и выяснении тех механизмов, с помощью которых малый объем УФ-облученной крови при ее ретранс-фузинх мояет привести к изменению иммунных процессов на уровне всего организма. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить жизнеспособность Мнк на разных сроках культивирования после УФО крови в дозах терапевтического диапазона.

2. Исследовэть спонтанную и индуцированную Т- и В-клеточны-ми митогенами ДНК-синтетическую активность Лфц УФ-облученной крови. 4

3. Выяснить, в какой степени изменение ДНК-синтетической активности Лфц облученной крови связано с изменением их про-лиферативной активности.

4. Оценить возможность модификации регуляторной активности Лфц при УФО крови.

5. Изучить влияние УФ-облученной аутологичной крови и ее компонентов на функциональное состояние Лфц необлученной крови.

Настоящая работа выполнена с использованием донорской крови, что диктовалось необходимостью выявления "нормы" реакции Лфц на действие УФ лучей, исключающей изменение ИК вследствие развития того или иного патологического состояния.

Научная новизна и теоретическое значение настоящей работы определяется прежде всего тем, что, будучи выполнена не в рамках традиционного для зарубежной фотоиммунологии направления (анализ механизмов формирования иммунодепрессивных состояний при воздействии на организм относительно высоких доз УФ лучей), она привлекает внимание к комплексу тех иммунологических реакций, которые могут развиваться в ответ на действие, малых (терапевтических) доз УФ-излучения. Исследование жизнеспособности, пролиферативной и регуляторной активности Лфц донорской крови, подвергнутой УФО в аппарате "Изольда", позволило охарактеризовать "норму" реакции циркулирующих ИК на действие УФ лучей в терапевтической дозе. Установлено, что после УФО крови пролиферативная активность Лфц у одних доноров возрастает, у других - снижается или не изменяется вообще. Характер ответа определяется Уф-чувствительностью не только самих Лфц, но и их микроокружения. Впервые доказана возможность изменения после УвО крови регуляторной активности Лфц: как правило усиливается тот тип активности, который характерен для данного образца крови. Впервые доказано, что смешение малых количеств УФ-облученноЙ крови с 10-40-кратными объемами необлученной аутологичной крови приводит к стимуляции функциональной активности интактных Лфц и что определяющую роль в данном эффекте играют УФ-облучеяные Мнк. В условиях ia vivo активация УФ-облученной кровью всех циркулирующих Ж может составить пусковой механизм стимуляции иммунных процессов при АУКК-терапии. Не исключено, что данный феномен лежит также и в основе иммуностимулирующего действия Уф лучей Солнца и имитирующих его источников. Доказательства этого предположения открывает новый подход к изучению механизмов традиционных методов светолечения.

Практическая значимость. В настоящей работе, посвященной изучению пусковых механизмов иммуностимулирующего действия

АУФОК-терапии, показано отсутствие гибели облученных Лфц на отдаленных сроках их культивирования (через 7 сут). Это является новым свидетельством "физиологичности" применяемой в аппарате "Изольда" дозы УФ излучения. Увеличение стандартной дозы в 2 раза вызывает гибель 53^ Мнк через 2 сут культивирования, что следует учитывать при проведении АУФОК-терашш. Практический интерес представляет также факт разнонаправленных изменений функциональной активности Лфц (или отсутствие изменений) у различных доноров, что указывает на наличие индивидуальной чувствительности ИК к действию УФ излучения. Способность облученных Лфц стимулировать функциональную активность интактных Лфц при смешении облученной и необлученной аутологичной крови в объемных соотношениях, близких к таковым при АУФОК, позволяет понять, каким образом малый объем УФ-об-лученной крови может изменить иммунные реакции на организмен-ном уровне.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения" (Ялта,1984), на Всесоюзном совещании по применению оптического излучения в сельскохозяйственном производстве (Львов,1984), на школе-семинаре "Механизмы действия лазерного излучения" (Ростов-на-Дону,1984), на П и Ш Европейских конгрессах по фотобиологии (Падуя,1987; Будапешт, 1989) , на Всесоюзной конференции "Применение УФ облучения крови в медицине и ветеринарии" (Ленинград,1989), на Международном конгрессе "Лазер 90" (Манчестер,1990), на Всесоюзной школе "Молекулярно-клеточные механизмы иммунной регуляции гомеостаза и проблемы.математического моделирования" (Щтшенское.1990), на межлабораторном семинаре Института цитологии АН СССР (Ленинград, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей и тезисы 4 докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на

//О страницах машинописного текста, включая /О рисунков и список литературы из /.£? публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использовано 140 образцов свежезаготовленной крови доноров мужского пола в возрасте 20-40 лет. К£овь стабилизировали гепарином (25 ед/мл) и облучали У® лучами' (254 нм) в аппарате "Изольда" МД-73 М в стандартной терапевтической дозе^

Материалом для исследования служили: Мнк в системе цельной крови и Мнк, выделенные в градиенте плотности фикол-верографина по общепринятой методике; плазма, обогащенная тромбоцитами (0ТП)ги плазма без тромбоцитов. Культивирование цельной крови в макро- и микровариантах проводили в среде ШП-1640, содержащей 200 мМ ь-глутамина, 5 • 10~% 2-меркаптоэтанола, 55? эмбриональной телячьей сыворотки, 80 мкг/мл гентамицина с внесением крови по 250 и 25 мкл при конечном объеме, равном 2.0 и 0.2 мл, соответственно. Клетки культивировали в течение 3 или 7 сут в термостате при 37°С в атмосфере абсолютной влажности с Ъ% С02-

Жизнеспособность Мнк оценивали с помощью 0.раствора трипанового синего и 0.001$ раствора акридинового оранжевого с последующим подсчетом числа нежизнеспособных клеток в обычном световом или люминесцентном микроскопе, функциональную активность Лфц определяли по реакции бласттрансформации (РБТЛ), регистрируемой радиометрически по включению %-тими-дина (уд.акт. 1 ТБк/мМ), который вносили в культуры за 18 ч до окончания инкубации. Включение изотопа в кислотонераство-римую фракцию оценивали на сцинтилляционном счетчике фирмы "Вескпапп". В работе использовали митогены: ФГА ^ в разведении 1:64, Кон А и рш в концентрации 5 мкг. Количество Лфц в З-лериоде клеточного цикла определяли методом флуоресцентной цитометрии с помощью проточного цитофлуориметра, созданного в Институте цитологии АН СССР на основе люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ. Регуляторную активность Лфц исследовали по методике Назарова и Горланова, 1981. Влияние УФ-облученных Мнк на функциональную активность Лфц, выделенных из аутологичной

б

необлучекной крови, изучали в двух вариантах опытов. В I варианте смешивали образцы облученной и необлученной аутологичной крови в соотношениях 1:10, 1:40 и 1:160 с последующим выделением Мнк и определением спонтанной ДНК-синтетической активности через 3 сут культивирования. Во П варианте опытов осуществляли сокультивирование Мнк, выделенных из облученного и не-облученного образцов крови, и изучали их спонтацную ДНК-синтетическую активность на 7 сут.

В качестве контроля использовали цельную кровь или Мнк, выделенные из цельной крови, после ее перфузии через аппарат "Изолвда" при выключенном облучателе.

Во всех экспериментах ставили три параллельные пробы.

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Стьюдента, коэффициента корреляции рангов и критерия знаков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Жизнеспособность Мнк УФ-облученной крови. С помощью 2 методов оценки жизнеспособности клеток было установлено, что на разных сроках культивирования жизнеспособность Мнк, выделенных из крови, облученной в стандартной терапевтической дозе, варьировала от 97 до 81% и не отличалась от таковой у клеток необлученной крови. Аналогичные результаты получены для Мнк, выделенных из крови, облученной в два раза меньшей дозой УФ излучения, тогда как в два раза более высокая доза вызывала повреждение Мнк,и через 48 ч количество кивых клеток снижалось до Щ.

ДНК-синтетическая активность Лфц УФ-облученной крови. Проведено радиометрическое исследование спонтанного (не стимулированного митогенами) и индуцированного Т- и В-клеточными ми-тогенами синтеза ДНК в Лфц 38 образцов донорской крови после ее УФ0 в аппарате "Изольда". Лфц каждого донора культивировали в течение 3 сут в системе цельной крови (I серия) и в составе выделенной фракции Мнк (П серия). В первом случае моделировалась ситуация, близкая к таковой in vivo, позволяющая регистрировать реакцию Л?:ц на действие как самого УФ излуче-

ния, так и УФ-облученного микроокружения (других компонентов облученной крови), которое, по имеющимся данным, существенно модифицируется при УФО в аппарате "Изольда". Во втором случае создавались условия для изучения реактивности непосредственно самих Лфц на действие УФ лучей.

Функциональная активность УФ-облученных Лфц, культивируемых как в системе цельной крови, так и в составе выделенной фракции, не отличалась по средним показателям от контрольных величин. При анализе индивидуальных результатов обнаружилось, что, если у 50-60^ изученных образцов крови изменения синтеза ДНК в Лфц действительно не выявлялись, то у остальных образцов регистрировались его достоверная стимуляция, либо снижение (табл. 1).

Корреляционный анализ результатов не выявил линейной зависимости данного эффекта от исходного уровня включения %-тими-дина как в спонтанные, так и в стимулированные митогенами культуры Лфц. В связи с этим не удалось разделить изученные . образцы крови на группы, в которых исходные значения ДНК-синтетической активности Лфц определяли бы характер их реакции на УФО. Тем не менее, для Лфц, культивируемых в системе цельной крови, была обнаружена обратная зависимость между ФГА-от-ветами облученных и необлученных Лфц (г = -0.46, р<0.05). Это означает, что стимуляция ФГА-ответа Лфц после УФО крови имеет место в случае недостаточно выраженной реакции на данный митоген необлученных Лфц, а, подавление - при исходно высоком ответе. Исходя из этого, можно предположить, что ФГА и УФ излучение в дозах, не снижающих жизнеспособность Лфц, имеют в клетке общие мишени. К аналогичному выводу приходят авторы, изучавшие стимулирующее действие на Лфц излучения ге-лий-неоноЕого лазера (Федосеева и др., 1987). Ими показано, что видимый свет и ФГА в течение первых 6 ч после воздействия индуцируют в Лфц человека сходные изменения: в хроматине увеличивается количество участков, доступных для транскрипции, активируется синтез РНК. Таким образом, сложность оценки ми-тогениндуцированных изменений в облученных Лфц может быть ■ связана с тем, что активация их пролиферации осуществляется

.Таблица I

Модуляция УЗ-излучением функциональной активности Лфц при их культивировании в система цельной крови (I) ив составе выдзгешюй фракции (П)

Метод ::ультл- випо- Характер влияния УФО Включение %-тимидина до (I) и после (2) УФО (Х+Зх,имл/мик), в скобках - число случаев {% от общего числа образцов)

вакил Спонтанный синтез ДНК Ответ на ФГА Ответ на Кон А Ответ на Р* М

I 2 I 2 I 2 I 2

Стагфляция 227 +31 373(27) 17 577 +1 903 30 747 +2 344 (18)' 8 680 +2 911 13 152(21) +3 599 2 649 7 558 + 190 + 245 (5)

I Подавление 254 +33 40 608 +3 051 26 499 +2 С>85 (21) 13 578 +1 633 7 007(26) +1 211 2 289 I 199 + 277 + 349 (29)

Отсутст вне эффекта 120 +18 107(60) 31 465 + 2215 31 748 +2 485 (61) 17 174 +1 895 16 737(53) +2 098 I 883 I 892 + 276 + 311 (66)

Стимуляция 570 +78 £ Гзо3(28) 82 006 +5 934 138 034 +6 322 (20) 35 383 +4 591 78 486(зз) +5 562 10 816 19 441 +1 903 +2 254 (18)

П Подавление 993 +88 ^(23) 96 929 ±7 531 62 616 +6 337 (49) 60 403 +5 835 23 358/oo^ +3 119^' 25 827 10 432 +2 .854 +1 611 (25)

Отсутствие эффекта 513 •+62 «¡(49) 81 54С +6 319 83 680 +7 008 (31) 52 677 +4 388 53 650(35) +4 739 34 835 37 027 +2 967 +7 099 (57)

уже в момент облучения крови, которое предшествует воздействию митогена.

Обращает на себя внимание тот факт, что ответы облученных Лфц на СГА и Кон А модифицируются чаще, чем ответ на рта. Как видно из табл. 1, при культивировании Лфц в составе выделенной фракции ФГА-иццуцированный синтез ДНК изменяется после УФО в 69$ случаев. Коя А-инцуцированный - в 65%, а РШ-ответ - только у 43% образцов. Таким образом, можно предположить, что Т- и В-Лфц обладают различной чувствительностью к УФ излучению в дозе, используемой в клинической практике. Аналогичные различия меиду Т- и В-Лфц были установлены при действии высоких доз УФ излучения (Horowitz, 1974).

Сопоставление результатов исследования функциональней активности облученных Лфц, культивируемых в системе цельной крови и в составе выделенной фракции, выявило, что уровень корреляции этих двух методов является низким. Это свидетельствует о том, что функциональная активность Лфц облученной крови может изменяться как вследствие прямого действия Уф лучей, так и за счет влияния фотомодифидироЕанного микроокружения. Чтобы выяснить, за счет каких компонентов Уф-облученной крови происходит модификация ДНК-синтетической активности Лфц, было проведено 3 серии опытов.

В I серии на 16 образцах донорской крови было показано, что культивирование необлученных Лфц в присутствии 15% ОТП, выделенной из аутологичной крови после ее УФО в аппарате "Изольда", приводит к подавлению спонтанного и индуцированного ФГА и Кон А синтеза ДНК в Лфц соответственно до 74, 57 и 53% от исходного, тогда как ответ на py.li достоверно не меняется (рис. 1).

В следующей (П) серии из 8 опытов перед облучением крови из нее удаляли ОТП, а эритроциты и лейкоциты ресуспевдировали и облучали б растворе Хенкса. Культивирование необлученных Лфц в присутствии 15% растЕора Хенкса после облучения в нем Форменных элементов не сопроЕоздалось подавлением спонтанного и митогениндуцированного синтеза ДНК в Лфц. Это позволило заключить, что данный феномен обусловлен фотокодификацией ОТП.

А Б В Г

100 75 50 25

■ь

а

12 12 12 12 Рис. 1. Влияние обогащенной тромбоцитами плазмы, выделенной из облученной в аппарате "Изольда" крови, на спонтанный (А) и стимулированный ФГА (Б), Кон А (В) и рш (Г) синтез ДНК в необлученных аутологичных Лфц.

По вертикали - включение ®Н-тимидина, % от исходного. I - до У50, 2 - после УФО. а - отличия от исходного не достоверны.

В последней серии опытов проводилось сопоставление степени ингибирования ДНК-синтетической активности необлученных Лфц при их культивировании в присутствии плазмы, облучавшейся с тромбоцитами и без них. В первом случае уровень спонтанного и индуцированного ФГА, Кон А и рта синтеза ДНК в Лфц составил 72, 65, 52 и 94$ от исходного, а во втором - 65, 40, 30 и 92^. Таким образом, подавление ДНК-синтетической активности Лфц в присутствии ОТП, выделенной из УФ-облученной ауто-логичной крови, связано .с фотопревращениями компонентов плазмы, при атом тромбоциты способны снижать ее ингибирующий эффект.

Следует отметить, что ответ В-Лфц на рш достоверно не изменялся при добавлении различных вариантов облученной плазмы (I и Ш серии экспериментов). Это свидетельствует о том, что Т- и В-Лфц обладают различной чувствительностью не только к прямому действию УФ лучей, но и к фотомодифициро-

и

ванному микроокружению.

Подавление изученных параметров функциональной активности необлученных Лфц в присутствии плазмы облученной крови может быть обусловлено несколькими причинами. Так, показано, что при действии УФ излучения с длиной волны 254 нм инициируются фотохимические реакции в белках и липидах, приводящие к образованию продуктов свободнорадикального окисления, которые даже в очень низких концентрациях способны ингибировать проли-феративную активность Лфц (КеЪг^ег et а1., 1980).. Действие таких продуктов ослабляется в присутствии тромбоцитов (Аносов, Рощупкин, 1983). Однако незначительные количества гидроперекисей липидов оказывают сильный токсический эффект и способны вызывать в организме целый ряд негативных биохимических и физиологических нарушений (Гевондян, 1979; Биленко, Чурако-ва, 1982). Тем не менее, процедура АУФОК не оказывает отрицательного действия на организм, что, вероятно, связано с ростом антиоксидантной активности крови как после ее УФО, так и ретрансфузии (Вихриев и др., 1986; Кукуй и др., 1989). Более того, имеются данные, что генерация активных форм кислорода тесно связана с продукцией ШГ-1, которая является одним из начальных этапов развития пролиферагивного ответа. Следовательно, усиление антиоксидантной активности крови может быть причиной, обусловливающей подавление ДНК-синтетической активности Лфц в присутствии облученной плазмы. Заключая анализ полученных результатов, можно сделать вывод, что пролифера-тивная активность Лфц облученной крови есть интегральный результат взаимодействия клеточного и плазменного факторов.

В последней части этого раздела работы было проведено исследование с целью выяснить, насколько установленные изменения в синтезе ДНК облученных Лфц отражают изменения их прояи-феративной активности. Это вызвано тем, что не всегда скорость включения ®Н-тимвдина можно оценивать просто как скорость синтеза новой ДНК. Существует ряд причин, которые могут приводить к изменению включения тимидина: более высокая скорость транспорта меченого предшественника в клетки, различная скорость обмена нуклеотвдов и нуклеозцдов между цитоплазмой и ядром, репарация ДНК и др. В 7 параллельных опытах проводилось

сопоставление результатов радиометрического и цитофлуоримет-рического способов оценки ЕБТЛ на разных сроках культивирования клеток (24, 48 и 72 ч). Установлено, что УФО крови вызывает как возрастание, так и снижение количества Лфц, находящихся в Б-фазе клеточного цикла, а в ряде случаев не влияет на этот показатель. Увеличение или подавление количества ДНК--синтезирующих клеток сопровождалось увеличением или снижением включения %-тимидина. О высокой степени сопряженности результатов двух методов оценки синтеза ДНК в облученных Лфц свидетельствуют следующие значения коэффициентов корреляции: +0.61 для спонтанного синтеза ДНК и +0.92 и +0.90 для ответов на ФГА и рш. Таким образом, изменения синтеза ДНК в Лфц после УФО крови связаны с изменением количества клеток, синтезирующих ДНК,и отражают сдвиги в их пролиферативной активности.

Спонтанная и митогеницдуцированная регуляторная активность Лфц УФ-облученной крови. По современным представлениям, кле-точно-опосредованную регуляцию активности ИК можно охарактеризовать как совокупность процессов межклеточных взаимодействий, определяющих интенсивность и продолжительность ответа активированных клеток. Инициация и реализация иммунного ответа сопряжены с активацией регуляторных субпопуляций Лфц. Несмотря на очевидные теоретические предпосылки, исследований влияния Уф излучения в терапевтической дозе на регуляторную активность Лфц, пока не проводилось.

Изучали спонтанную и Кон А-индуцированную регуляторную активность Лфц, выделенных из 13 образцов крови доноров после ее УФО в аппарате "Изольда". Использовали метод, основанный на том, что из одного образца крови одновременно готовятся испытуемая культура Лфц и тест-система, которые сокультивиру-ются в течение 24 ч. Стимуляция или подавление ДНК-синтетической активности в тест-системе в результате сокультивирования клеток указывает соответственно на наличие хелперной или суп-рессорной активности в испытуемых культурах. Расчет активности (А, %) производили по формуле:

имп/мин в тест-культуре_ имп/мин в испыт. кул-ре ^ _ при сокультивировании после митомицина С_ х 100

имп/мин в тест-культуре без сокультивирования

Наличие положительного знака у показателя регуляторной активности свидетельствует о супрессорной активности Лфц, а появление отрицательного - о хелперной.

Установлено, что спонтанная регуляторная активность необлученных Лфц варьировала в пределах от 35.8$? супрессии до 11.0$ стимуляции. При действии Кон А необлученные Лфц проявляли су-прессорную активность от 4.6 до 40.7%, и только в одном случае был зарегистрирован небольшой'хелперный эффект - 2.1%. УФО крови сопровождалось расширением границ варьирования спонтанной регуляторной активности от 44.3$ супрессии до 47.2% стимуляции, в то время как пределы варьирования Кон А-индуцирован-ной активности облученных Лфц оставались практически без изменения (рис. 2). Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что УВД крови в терапевтической дозе сопровождается изменением спонтанной регуляторной активности Лфц, которое прямо зависит от ее исходного состояния (г= +0.59, р< 0.05). Это означает, что УФ излучение вызывает усиление той регуляторной активности Лфц, которая преобладает в исследуемом

50 А Б

40 1---

- | 1 —

30

20 1 1

10

2

10

20 1 2 1

30 (

40 1

50 1

Рис.2. Влияние УФО крови в аппарате "Изольда" на спонтанную (А) и Кон А-индуцировайщш (Б) регуляторную активность Лфц.

По вертикали: интенсивность регуляторного эффекта, %. По горизонтали: 1, 2 - колебания регуляторной активности до и после УФО, соответственно.

образце крови до облучения. Прием митогенной стимуляции обеспечивает поликлональную активацию супрессорных клеток (Бег-аЬоп, 1972), и в этих условиях влияние У$0 на активность ре-гуляторных субпопуляций Лфц используемым методом зарегистрировать не удалось.

Влияние УФ-облученной крови на Функциональную активность необлученных аутологичных Лфц. Как показано в предыдущих разделах работы, экстракорпоральное УФО крови в терапевтической дозе вызывает определенные сдвиги в функциональной активности Лфц. Однако эти изменения, имеющие место в малом объеме крови, не позволяют объяснить регистрируемые при АУФОК сдвиги в иммунологической реактивности организма. Можно предположить, что УФ-облученная кровь при ее ретрансфузии вызывает изменения функциональной активности циркулирующих интактных Лфц.

На 10 образцах крови установлено, что смешение УФ-облучен-ной крови с интактной в соотношении 1:10 и 1:40 сопровождается достоверным повышением (в 1.5-2.0 раза) синтеза ДНК в Лфц, выделенных из данной смеси (рис. ЗА). Стимуляция ДНК-синтетической активности обнаруживалась на 3 сут культивирования, независимо от реакции Лфц на прямое УФО (рис. 3 Б,В,Г). Так как активация Лфц предполагает запуск целого ряда процессов, приводящих в конечном счете к клеточному делению и дифферен-цировке, то возрастание синтеза ДНК в Лфц интактной крови под действием УФ-облученной аутологичной следует рассматривать как проявление их функциональной активации. Установление этого феномена имеет принципиальное значение для понимания механизмов, с помощью которых малый объем УФ-облученной крови при ее ретрансфузиях может вызывать изменения процессов на уровне всего организма. Действительно, если УФ-облученная кровь при возвращении в кровяное русло будет активировать основную массу циркулирующих Лфц, то это, б свою очередь, приведет к целому ряду сдвигов в организме и, прежде всего, в иммунной системе. Можно прогнозировать увеличение клона ци-тотоксических клеток и стимуляцию антителообразования, а также объяснить ряд уже описанных в литературе эффектов АУФОК -терапии (стимуляцию иммуногенеза и процессов регенерации со-

1С 8 6 4 2

и.

4,

4

А

[}|

-Ь

+

Ь

\ь

II 23 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Гис.З. Влияние УФО и УФ-облученной крови на спонтанную Д1Ж-синтетическую активность аутологичнцх Лфц.

По зортлкалл - включение %-тимидина, имп/шн х 10^.

По горизонтали - варианты опыта: 1,2 - Лфц интактной и облученной крови; 3,4,5 - Лфц, выделенные из сглоси УФ-облученной и интактной кро-вл (1:10, 1:40 и 1:160, соответственно). А - суммарные данные; Б,В,Г -влияниз У'5-облученной крови на спонтанный синтез ДНК в зависимости от характера эффекта лржлого У50 (подавление, стшлуляция и отсутствие эффекта, соответственно). а - отличие от исходного не достоверно.

единительной ткани).

Как указывалось выше, плазма и тромбоциты облученной крови не оказывают стимулирующего действия на ДНК-синтетическую активность необлученных Лфц. Учитывая полученные ранее данные (Самойлова и др.,1987), можно предположить, что ведущая роль в актиЕации Лфц УФ-облученной аутологичной кровью принадлежит Мнк. При сокультивировании в течение 7 сут изолированных Мнк облученной и интактной крови, было зарегистрировано достоверное усиление спонтанного синтеза ДНК, который в 1.8 раза превышал величину, рассчитанную с учетом включения %-тимидина в облученные и необлученныв Лфц и их количественного соотношения в культуре (табл.2). При обработке митомицином С интакт-ных или облученных Лфц было установлено, что стимуляция ДНК-

Таблица 2

Спонтанный синтез ДНК в интактных и УФ-облученных Лфц при раздельном и совместном (2:1) культивировании в течение 7 сут

Исследуемые клетки Включение %-тимидина в Лфц, имп/ыин(х+з- )

без обработки митомицином после обработки митомицином интактных и в скобках УФ-облученных клеток

Интактные УФ-облученные Интактные + облученные (2:1) экспериментальные данные расчетные данные 2986+345 7292^865а 7939+735^6 4222+485 208+53 (259+40) 3332+411 (5235+534)6 2682+368 (1945+209)

а - отличие от исходного достоверно (р<0.05); б - отличив от расчетных данных достоверно (р<0.05).

-синтетической активности при сокультивировании отсутствует, если обработке митомицином подвергаются интактные клетки. Таким образом, интактные клетки"Являются отвечающими, а облученные - стимулирующими. Совокупность имеющихся в настоящее время данных позволяет допустить, что причиной активации является развитие реакции смешанной культуры Лфц в аутологичной

системе вследствие фотомодификации hla-d/dr антигенов. Действительно, принципиальная возможность модификации этих антигенов, а также их высокая чувствительность к У8 лучам показана в ряде работ (Slater,1980; Aberer,Leibi,1987). Реакция смешанной культуры Лфц, вероятно", начинается уже в момент облучения крови. Это обстоятельство позволяет объяснить высокую биологическую активность облученной крови, несмотря на то,что непосредственному воздействию УФ лучей в условиях аппарата "Изольда" подвергается не более 1/10 объеий Протекающей крови (Попов, Лазарев, 1986). .

В заключение следует отметить, что описанная выше способность УФ-облученной крови (Мнк) стимулировать функциональную активность циркулирующих ИК хорошо согласуется с работами, в которых показано, что УФ-облученная кровь является высоко активным биологическим препаратом по отношению к аутологичным эритроцитам, тромбоцитам, гранулоцитам и моноцитам. Их активация может составить один из основных механизмов широкого спектра лечебных эффектов, характерных для АУФОК-терашш.

ВЫВОДЫ

1. УФО донорской крови в терапевтической дозе (применяемой при проведении аутотрансфузий УФ-облученной крови - АУФОК) не вызывает изменения жизнеспособности мононуклеаров (Мнк) в течение 7 сут их культивирования; увеличение дозы в 2 раза приводит к гибели 53f0 клеток через 2 сут.

2. Радиометрическое исследование спонтанного и стимулированного Т- и В-клеточными митогенами (ФГЛ, Кон А, Р'.'Л) синтеза ДНК в лимфоцитах (Лфц) различных доноров выявило большие различия в чувствительности иммунокомпетентных клеток (ИК) к УФО в терапевтической дозе: синтез ДНК может возрастать, снижаться или не меняться. Характер и степень изменений синтеза ДНК не обнаруживают корреляционной зависимости от его исходных значений.

3. Изменения синтеза ДНК в Лфц, культивируемых после УФО в составе выделенной фракции и в системе цельной крови, слабо коррелируют друг с другом, что свидетельствует о модифицирую-

гцем влиянии компонентов УФ-облученной крови на функциональную активность Лфц.

4. Плазма УФ-облученной крови подавляет спонтанный и мито-ген-шдуцирующий синтез ДНК в Лфц, что связано с фотопревращениями компонентов плазмы; в присутствии тромбоцитов этот эффект снижается.

5. Т-Лфц по сравнению с В-Лфц проявляют более высокую чувствительность как к прямому действию Уф лучей, так и к фото-модифицированному микроокружению.

6. Изменения оинтеза ДНК в Лфц УФ-облученной крови отражают сдвиги в их пролиферагивной активности.

7.УФ0 крови сопровождается изменением спонтанной регулятор-ной активности Лфц. Как правило, усиливается тот тип активности, который характерен для данного образца крови до УФО. Изменения митогениндуцированной (Кон А) регуляторной активности Лфц УФ-облученной крови не обнаружено, что можно -объяснить поликлональной активацией супрессорных клеток при действии митогена.

8. Лфц УФ-облученной крови стимулируют спонтанный синтез ДНК в интактных аутологичных Лфц при их сокультивировании в течение 7 сут. Предполагается, что это может быть следствием развития феномена смешанной культуры Лфц в аутологичной системе.

9. При смешении УФ-облученной и интактной крови в объемных соотношениях, близких к таковым при АУФОК (1:10 - 1:40), происходит стимуляция спонтанного синтеза ДНК в Лфц, которая не зависит от их реакции на прямое действие УФ лучей. Этот феномен позволяет предполагать стимуляцию функциональной активности всех циркулирующих Лфц при ретрансфузиях УФ-облученной аутокрови, что может составить триггерный механизм активации ивдунных процессов при АУФОК-терагога.

СЛИЗОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волгарева Е.В., Оболенская К.Д. функциональная реактивность лимфоцитов периферической крови после ее УФ облучения в аппарате "Изольда" // В кн.: Всесоюзн. совещ. по применению оптич. излучения в с.-х. производстве: Тез.докл. Львов,1984.

- С.5.

2. Волгарева Е.В., Самойлова К.А. УФ облучение донорской крови в аппарате "Изольда": модуляция бластогенеза лимфоцитов // В кн.: Механизмы влияния облученной ультрафиолетовыми луча-га крови на организм человека и животных. Л.: Наука.-1986.-

С.187-193.

3. Волгарева Е.В., Протасова C.S. Подавление синтеза ДНК в лимфоцитах плазмой, подвергнутой УФ облучению // Болл.экопер. биол.мед.-1987.-$8.-С.205-206.

4. Самойлова К.А., Оболенская К.Д., Гамова И.М., Волгарева Е.В. Структурно-функциональные изменения поверхности циркулирующие форменных элементов и их активация как пусковой "механизм" лечебных эффектов УФ-облученной аутокрови // В кн.: Применение оптического излучения для профилактики и лечения заболеваний. Саранск, 1989.-С.4-15.

5. Самойлова К.А., Оболенская К.Д., фрейдлин И.С., Шйова И.М., Волгарева Е.В., Нисман Б.Х., Яновская И.В., Цтхурадзе Н.А., Васюхин В.И. Изменение поверхности и активация циркулирующих лейкоцитов при аутотрансфузиях УФ-облученной крови // Вестн. хирургии.-1990.-Г.144.-JJ5.-С.99-105.

6. Волгарева Е.В., Волгарев А.П., Самойлова К.А. Влияние УФ-облучения и УФ-облученной аутологичной крови на функциональное состояние лимфоцитов периферической крови человека // Цитология. -1990. -Т. 32. -й12. -С. 1217-1224. '

7. Belisheva IT.К., Volgareva E.V., Modification of limpho-cyte functional activity after UV irradiation of donor blood: changes in DITA synthetic activity and excretion of growth factors for human fibroblasts // Abstr.Book 2nd Congress of the Eur.Soc. for Photobiology. Padova, 1937. P.113.

8. Samoilova K., Obolenskaya K., Volgareva E., Gamova I. Immediate activation of iramunocompetenoe blood cells by UV-ir-radiated blood autotransfusion (OVTBA) and UV-irradiation (CJVI) of skin // Abstr.Book of 3d Congress of the Eur. Soc. for Photobiology. Budapest, 1989. P.860.

9. Volgareva E.V., Volgarev A.P., Samoilova K,A. The activation mechanism of lymphocytes after UV-irradiation of whole blood // Intern. Congress "Xazer-90". Manchester,1990. P.34.