Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетическое действие малых доз ионизирующих излучений на лимфоциты человека: экспериментальные и прикладные аспекты

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетическое действие малых доз ионизирующих излучений на лимфоциты человека: экспериментальные и прикладные аспекты"

'73 ОД

Российская Академия Медицинских Наук

? и \'-г''.Г:

Медико-генетический научный центр

На правах рукописи

УДК 616.899.65-092:612.112.94.014.482.014.49

ХАНДОГИНА Елена Константиновна

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ НА ЛИМФОЦИТЫ ЧЕЛОВЕКА: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ

АСПЕКТЫ

03.00.15 "Генетика"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -1995

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете.

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор А.П.Акифьев

доктор медицинских наук, профессор Г.Р.Мутовин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

A.В.Севанькаев

доктор биологических наук, профессор Д.М.Спитковский

доктор биологических наук, профессор

B.А.Шевченко

Ведущая организация: НИИ профилактической токсикологии Госкомсанэпиднадзора РФ.

Защита диссертации состоится на заседании

Диссертационного Совета Д.001.16.01 Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478 Москва, ул.Москворечье Д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН. Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук,

профессор Л.Ф.Курило

В В Е Д Е Н И Е

Актуальность проблемы. Изучение экспериментальных и прикладных аспектов действия малых дел понтирующих излучений на генетический аппарат человека представляет собой одну 1П актуальных проблем современной радиационной генетики. Теоретическая сторона проблемы малых доз проистекает из того факта, что все живое на Земле, в том числе и человек, эволющюнировалн в присутствии малых доз радиации а также вредных химических веществ, хотя нередко живые организмы подвергались действию и больших доз повреждающих агентов. То же самое можно сказать в отношении индивидуального развития животных и растений. Возможно, именно в силу постоянного контакта с малыми дозами радиации, последние оказывают на живые организмы не только, а в некоторых случаях и не столько повреждающее, сколько стимулирующее воздействие. Речь идет о явлении радиационного гормезиса.

Одним из отчетливых проявлений гормезиса является интенсивно изучаемый в последнее время феномен адаптивного ответа (АО), заключающийся в проявлении устойчивости клеток к действию повреждающих доз радиации (или химических агентов) после предварительного воздействия малыми, практически немутагенными дозами того же самого или другого повреждающего агента. АО удобно регистрировать, в частности, с помощью одного из наиболее надежных методов цитогенетики - учета аберраций хромосом (АХ) в метафазе митоза.

Среди нерешенных вопросов, касающихся АО как фундаментального аспекта биологического действия малых доз радиации, находятся такие, как зависимость от качества излучения и мощности дозы, .возможность модификации АО различными физическими и химическими воздействиями, связь АО с репарацией ДНК, генетический контроль АО, роль физиологического состояния клетки и организма в индукции АО, проблема АО в общем контексте идеи о мутагенном последействии. По всем этим вопросам в литературе нет общепринятой точки зрения.

Актуальность практического аспекта генетического действия малых доч радиации определяется, в первую очередь, ростом числа лиц. подвергающихся облучению низкими дочамн либо в процессе профессиональной деятельности, либо в результате проживания на территориях, загрязненных вследствие экологических катастроф, подобных аварии на Чернобыльской АЭС. В последнем случае особое значение приобретает выяснение конкретного механизма(ов) влияния малых доз, поскольку только с учетом его могут проводиться научно обоснованные лечебные и профилактические мероприятия по отношению к лицам, проживающим на загрязненных территориях.

Нормирование действия излучений основано на канцерогенном действии. Согласно современным молекулярно-биологическим представлениям о природе злокачественного перерождения клеток (малигнизации) последнее вызывается изменением функциональной активности генов, связанных так или иначе с контролем пролиферации соматических клеток. Появление радиационно-индуцированного рака связано с АХ, в первую очередь, симметричными транслокациями.

Особенность ответа на облучение связана с наличием плато в зависимости доза-эффект в области до 30 сГр. Это делает невозможным в этом диапазоне доз количественные оценки дозы облучения, основанные на результатах биологической дозиметрии. Хронический характер облучения, а также необходимость ретроспективной оценки обусловливают дополнительные сложности.

Имеющиеся данные по цитогенетическому обследованию лиц, проживающих в районах с повышенным радиоактивным фоном, не являются полными и свидетельствуют о необходимости проведения систематических исследований, направленных на оценку риска облучения низкими дозами.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение эффектов малых доз радиации на хромосомный аппарат лимфоцитов человека при облучении in vitro и in vivo.

Поставленная цель определила решение следующих основных задач:

1.Исследование выхода АХ при действии на культивируемые с ФГА лимфоциты человека хронического облучения с низкой мощностью дозы (на примере тритиевой воды).

2.Изучение радиозащитного действия малых доз радиации в системе "адаптивный ответ" при различных вариантах адаптирующего и повреждающего воздействия.

3. Изучение модификации чувствительности хромосом лимфоцитов периферической крови человека к действию низких доз облучения с использованием теста АО и анализа кривых доза-эффект выхода АХ.

4.Исследование формирования реакции АО в клетках больных с синдромом Дауна, как одного из заболеваний, связанных с повышенной радиочувствительностью хромосом.

5.Цитогенетическое обследование групп детей, проживающих на территориях с различным уровнем радиоактивного загрязнения. При этом особенное внимание уделяется детям с высокими дозами внешнего и внутреннего (от инкорпорированных радионуклидов)облучения.

6.Обследование 4 групп детей (здоровых и с тиреопахологией, проживающих в загрязненных радиацией районах а также в Москве) для установления связи между облучением низкими дозами и заболеваниями щитовидной железы (ЩЖ).

Таким образом, популяционным исследованиям целенаправленно предшествовали лабораторные эксперименты. Результаты последних были использованы при разработке методологии обследования лиц, проживающих в районах, пострадавших вследствие аварии на Чернобыльской АЭС.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Показано, что малые дозы излучения могут, с одной стороны, приводить к появлению регистрируемых цитогенетических эффектов, а с другой - оказывать при некоторых условиях стимулирующее воздействие. Обнаружена неоднозначность цитогенетического действия малых доз ионизирующего излучения в системе АО.

Изучена индукция радиационно-индуцированного АО при различных экспериментальных протоколах;, многие схемы облучения использованы впервые. Предложена схема,

позволяющая тестировать индивидуумов на АО как показатель генетического гомеостаза.

Показано, что радиозащитное действие адаптирующего облучения совпадает по величине с радиозащитным действием антиокисдантов. В то же время не происходит дальнейшего возрастания величины защитного эффекта при одновременном воздействии обоих факторов.

Впервые показано отсутствие АО в клетках больных с синдромом Дауна. У больного с мозаичной формой заболевания АО отсутствовал как в трисомных, так и в диплоидных клетках.

Впервые проведено цитогенетическое обследование, в том числе, с применением метода флюоресцентной гибридизации in situ - FISH (использованы пробы на хромосомы 1, 4 и 12), детей с высокими дозами внутреннего и внешнего облучения, которые могут рассматриваться как крайний случай по дозовой нагрузке. Показана повышенная частота асимметричных хромосомных обменов (дицентриков), являющихся маркером облучения, в лимфоцитах периферической крови. В то же время в клетках этих детей отсутствуют симметричные хромосомные транслокации, затрагивающие хромосомы 1, 4 и 12.

Впервые разработана схема обследования, позволяющая установить связь между уровнем загрязненности территории и заболеваемостью проживающего там населения. Для этого выбраны 4 группы детей: дети с заболеваниями ЩЖ и здоровые дети, проживающие в районах, загрязненных в результате аварии на ЧАЭС, а также дети с заболеваниями ЩЖ и здоровые дети г.Москвы (контроль). Показано, что частота АХ повышена в клетках детей с тиреопатологией, проживающих на загрязненной радионуклидами территории, по сравнению с соответствующими показателями в группе здоровых детей того же района; различий между двумя группами московских детей обнаружено не было. Таким образом, дети с заболеваниями ЩЖ представляют собой группу повышенного риска относительно действия низких доз радиации.

Полученные при обследовании детей из загрязненных радионуклидами районов данные говорят о том, что действие низких доз радиации на их клетки может быть различным.

Среди проживающих и л их районах встречаю ich индивидуумы, которых можно отнести к группе повышенного риска по индукции АХ.

Положения, выносимые на защиту:

1 .Доказательство высокой зависимости проявления различных эффектов малых доз ионизирующих излучении на хромосомный аппарат клеток человека по тесту АО от внешних по отношению к клетке и организму (качество излучения, мощность дозы, температура, присутствие антиокисдантов, лазерное облучение) и внутриклеточных (стадии клеточного цикла, генотип) факторов.

2.Обнаружение особой, отличной от канонических механизмов репарации ДНК, роли генетических факторов в регуляции биологическ'ого действия малых доз ионизирующей радиации в системе АО (на примере клеток больных с синдромом Дауна).

3.Разработка экспериментально-клинической модели для определения принадлежности к одной из групп риска по повышенной частоте АХ (и, следовательно, склонности к злокачественным опухолям) лиц, проживающих в районах, пострадавших от аварии на Чернобыльской АЭС.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Рабочем совещании по исследованию механизмов радиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК (Дубна, 1990), II Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Алма-Ата, 1990), Всесоюзном совещании "Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами" (Самарканд, 1990), VIII Международном конгрессе по генетике человека (США, Вашингтон, 1991), Рабочем совещании "Методы радиационной цитогенетики" (Германия, Мюнхен/Нойерберг, 1991), Международном совещании по определению доз облучения критических групп населения СНГ после Чернобыльской аварии (Германия, Мюнхен/Нойерберг, 1994), Всероссийской конференции "Радиоэкологические, медицинские и социально-экономические последствия аварии на Чернобыльской АЭС. Реабилитация территорий и населения" (Голицыно, 1995), 2

Международном симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз" (Москва. 1995). Международной конференции по медицинским последствиям Чернобыльской и других радиологических аварий (Швейцария, Женева, !995).

Получено положительное решение от 3.01.92 по заявке No 4939474/14 (043764 от 24.05.91), МКИ G01N 33/483 "Способ отбора лиц в группу риска по заболеваниям, обусловленным хромосомной нестабильностью", свидетельство No 140702.

Результаты исследования включены в отчет Научного Комитета по Действию Атомной Радиации ООН за 1994 г. "Sources and Effects of Ionizing Radiation", Suppl. No 46 (A/49/46).

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 18 публикациях: 11 статьях и 7 тезисах* докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, обсуждения и выводов. Работа содержит 29 таблиц и 15 рисунков. Список литературы включает 232 работы (69 опубликованы в отечественной печати, 163 - в зарубежной).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лимфоциты периферической крови культивировали по стандартной методике: 0,5 мл плазмы с лейкоцитами добавляли в 4,5 мл культуральной среды, содержащей RPMI 1640 с 20% эмбриональной сыворотки и 0,13 мл ФГА (GIBCO). При проведении популяционных исследований во всех случаях проводился контроль клеточного цикла с использованием FPG-окрашивания /Wagner et al., 1983/; анализировали метафазы, находящиеся в 1-м делении. В экспериментах по изучению адаптивного ответа (АО), требующих большего количества крови, культивировали цельную кровь; состав культуральной смеси - 6 мл среды Игла, 1,5 мл эмбриональной сыворотки и 0,15 мл ФГА ("Maimex", Болгария или "ПАНЭКО"). В этой же серии экспериментов контроль

клеточного цикла проводился выборочно в параллельных культурах.

Радиационно-индуцированнып АО был изучен на клетках 5 практически здоровых доноров 22-27 и 34 лет и одного ребенка в возрасте 6 мес. Чтобы исключить возможное влияние индивидуальных особенностей, каждый вариант 2-3 раза повторялся на клетках по крайней мере двух доноров, причем каждый раз - разных. Поскольку не наблюдалось статистически значимых различий в каждой точке, результаты были объединены для группы контрольных доноров.

АО изучали также в клетках 7 детей с синдромом Дауна (трисомия по 21-й хромосоме), у одного из которых была мозаичная форма заболевания.

Мы использовали следующие схемы облучения при изучении АО:

а) Адаптирующая доза 3,0 сГр рентгеновского облучения (190кВ, 6 мкА; мощность дозы 3 сГр/мин.) за 6 час. до стимуляции ФГА; повреждающее у-облучение в дозе 1,5 Гр и 3,0 Гр от источника 60Со (мощность дозы около 40 сГр/мин.) за 1 час до начала культивирования; проводилось облучение как цельной крови, так и крови с добавлением среды Игла; (Со - Оо).

В двух вариантах этого эксперимента как цельную кровь, так и клетки в культуральной среде между двумя облучениями помещали либо в термостат (37° С), либо в холодильник.

б) Адаптирующая доза 3,0 сГр рентгеновского облучения за 1 час до ФГА-стимуляции; повреждающая доза у-облу-чения 3,0 Гр на 6 часу или на 16 часу культивирования (Со - С|).

в) Адаптирующая доза 3,0 сГр рентгеновского облучения за 1 час до стимуляции ФГА; повреждающее у-облучение в дозе 1,5 Гр на 48 часу культивирования (Оо - Ог).

г) Адаптирующая доза 3,0 сГр рентгеновского облучения через 2 часа после начала культивирования; повреждающее у-облучение в дозе 3,0 Гр на 6 часу или на 16 часу культивирования (С| - СОд) Адаптирующее рентгеновское облучение в дозе 3 сГр

через 2 часа после ФГА-стимуляции; повреждающее у-облу-чение в дозе 1,5 Гр на 48 часу культивирования (С| - Ог).

е) Адаптирующее рентгеновское облучение 3 сГр на 30 часу (Э - в:) или на 44 часу ([Б] - Ог) культивирования; повреждающее у-облучение в дозе 1,5 Гр на 48 часу.

ж) Адаптирующее (импульсное) облучение в дозе 2,0 сГр вторичным излучением от протонов 70 ГэВ (ускоритель Института физики высоких энергий, Протвино); повреждающее у-облучение от источника '"Сэ в дозе 1,2 Гр (Брг - Ог).

з) Адаптирующее воздействие от хронического облучения при культивировании в присутствии тритиевой воды НТО; активность 4 мкКюри/мл выбиралась таким образом, чтобы суммарная доза облучения за 50 часов составила 3 сГр; повреждающее у-облучение - на 48 часу культивирования (НТО - С2).

и) Адаптирующее хроническое облучение при культивировании в течение всего клеточного цикла с 3Н-тимидином, активность которого составляла 0,05 мкКюри/мл и 0,01 мкКюри/мл; повреждающее у-облучение 1,5 Гр на 48 часу (рН-Т(Ш] - в:).

Радиозащитное действие антиоксидантов оценивали по тесту АО и исходя из анализа кривых доза-эффект выхода АХ в лимфоцитах. Мы использовали а-токоферол - природный антиоксидант, радиозащитное действие которого было показано ранее по другим тестам, и анфен - искусственный антиоксидант, синтезированный в Институте химической физики РАН А.А.Володькиным; это вещество хорошо растворимо в воде. Концентрация а-токоферола составила 10 мкг/мл, анфена - 10-4М.

При изучении радиозащитного действия антиоксидантов анализировались кривые доза-эффект в стадиях Со и С| клеточного цикла. Исследование выполнялось на клетках контрольных доноров и больной с синдромом Шерешевского-Тернера. Дозы гамма-облучения от источника 60Со составили 0,5 - 4,0 Гр при мощности дозы около 20 сГр/мин. В клетках, культивируемых в присутствии антиоксидантов, изучали также индукцию АО по схеме (Б - Ог). По этой же схеме изучали модифицирующее действие лазерного облучения.

Схема (Б - Ог) применялась также для исследования вариабельности индукции АО в клетках больных с синдромом Дауна.

Для изучения выхода АХ при хроническом облучении in vitro лимфоциты культивировали в прпсуктвин три гневом воды (НТО). Активность подбирались таким образом, чтобы дозы облучения составили за 50 часов культивирования 101" - 1 сГр.

При исследовании облучения низкими дозами in vivo (вследствие аварии на Чернобыльской АЭС) выход АХ исследовали в клетках 19 детей. проживающих в Красногорском районе Брянской области. Уровень радиационного загрязнения в этом районе после аварии на ЧАЭС составляет 15-40 Кюри/км2. Для обследования были выбраны практически здоровые дети, часть которых характеризуется высокими показателями содержания цезия, измеренного счетчиком излучения человека (СИЧ). Забор крови проводили в декабре 1993 г. Средний возраст в этой группе составил 13 (7-16) лет.

В группу детей с патологией щитовидной железы (ЩЖ), проживающих в г.Клинцы Брянской области, вошли 15 человек, страдающих аутоиммунным тиреоидитом, узловым зобом, кистами и другими заболеваниями ЩЖ. Эта группа была сформирована в результате клинического обследования, выполненного специалистами РГМУ и Медицинского радиологического научного центра РАМН (Обнинск) в течение 1991-1992 гг. Для сравнения была обследована группа из 34 практически здоровых детей, проживающих в той же местности, и соответствующих по возрасту и уровню содержания радионуклидов, измеренного с помощью СИЧ. Радиационная загрязненность г.Клинцы составляет < 15 Кюри/км2. Кровь для цитогенетического анализа брали в период октябрь 1992 - март 1994.

В качестве контроля были обследованы практически здоровые дети и дети с заболеваниями ЩЖ соответствующего возраста, проживающие в г.Москве. Характеристики групп приводятся ниже.

В клетках 6 детей с наиболее высокими показаниями СИЧ, а также в клетках 12 детей контрольной группы проводили анализ частоты симметричных транслокаций по методу флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с использованием проб на целые хромосомы 1, 4 и 12 и

центромерных проб. Гибридизацию проводили согласно протоколу, разработанному в Институте радиобиологии GSF (Мюнхен. Германия). Подробное описание методики приводится в /Salassidis et al., 1994/. Фрагмент работы, связанный с использованием FISH-методики, частично выполнен в данной лаборатории, а также на базе лаборатории цитогенетики Института диагностики и хирургии МЗ и МП РФ.

Для сравнения частоты АХ применяли t-критерий Стьюдента или точный критерий Фишера. Для количественной оценки радиозащитного действия антиоксидантов при сравнении кривых доза-эффект использовали описанный нами ранее показатель относительной радиочувствительности, численно равный отношению площадей под соответствующими дозовыми кривыми /Е.К.Хандогина и соавт., 1984/.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НИЗКИХ ДОЗ ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЛИМФОЦИТЫ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO

1.1. Частота АХ, индуцированных в культивируемых лимфоцитах малыми дозами хронического р-облучения

В работе изучена частота АХ, индуцируемая хроническим р-облучением от трития при культивировании лимфоцитов в присутствии тритиевой воды. Активность была выбрана таким образом, чтобы дозы за 50 часов составили от 1010 до 1 сГр. Оказалось, что даже такие низкие уровни облучения приводят к индукции АХ, в том числе, дицентриков (табл. 1). Следует отметить, что мы не ставили перед собой задачи получения калибровочной кривой доза-эффект. Полученные данные говорят о необходимости осторожного подхода к количественной оценке дозы облучения в случае действия низких доз.

1.2. Радиационно-индуцированиый АО в лимфоцитах контрольных доноров при различных схемах облучения

Стимулирующее действие облучения низкими дозами было изучено в системе АО.

Как указывалось выше, мы группировали контрольных доноров в разных экспериментах, чтобы избежать возможного

Таблица I

Частота аберраций хромосом, индуцированных хроническим Р-облучением при культивировании клеток в присутствии тритиевой воды, НТО

Доза хронического облучения за 50 час сГр Число клеток Число АХ на 100 клеток

обмены фрагм хромат. всего

1 247 0 1 5 6 (2,4 ±1,0)

10-' 188 1 3 4 8 (4,2 ±1,5)

10-2 91 0 1 2 3 (3,3 ± 1,9)

Ю-з 288 1 3 3 7 (2,4 ± 0,9)

Ю-4 177 0 1 2 3 (1,7 ± 1,0)

10-5 400 0 3 4 7 (1,8 ±0,7)

10 6 200 0 2 4 6 (3,0 ± 1,2)

10-7 422 1 1 11 13(3,1 ±0,9)

10-8 67 0 1 2 3 (4,5 ± 2,6)

10-9 200 0 3 6 9 (4,5 ± 1,5)

10-ю 200 0 0 2 2 (1,0 ±0,7)

Контроль 200 0 1 0 1 (0,5 ± 0,5)

влияния их индивидуальных особенностей. Поскольку в каждом отдельном варианте различий между ними выявлено не было, мы сочли возможным объединить результаты и в дальнейшем говорить о контрольной группе в целом.

Результаты представлены на рис. 1-5 и в табл. 2. Для более удобного изложения все схемы эксперимента разделены на группы.

Первая группа - это облучение повреждающей дозой в Оь Ни в одном варианте - (Оо - ОО, (О] - Сл), мы не обнаружили индукции АО (рис. 1).

Вторая группа - облучение повреждающей дозой в вг. Как видно из приводимых в табл. 2 и на рис. 2 данных, все схемы привели к снижению на 30-50% выхода индуцированных в Ог аберраций после предварительной обработки культур, при этом наиболее эффективными оказались схемы (Оо - Сп) и (Б - Ог). Для

ФГА сХс*

) о-)

(V З.огр

--54ч—

(3, Б

* 4ч 0,5

** 14ч

— 0

фиксация

1.5,_

ю!

Н

1,5— 1,00,50-

**

;о

0

Рис. 1. АО в клетках контрольных доноров при адаптирующем облучении в во и вч и повреждающем облучении в С^. По оси ординат — число АХ на клетку: О — ожидаемое число АХ, вычисленное как сумма эффектов двух облучений; Н — наблюдаемое

ФГА ^ фиксация

♦! 1ч 48ч ► * 54ч

а в, Б

ОД 0,2 0,1

о

вп— в.

ФГА фиксация х й 74 О.

о г- Ю . * р ¡-48ч ► 54ч " в, Б вг М

0,3-

о,2; Щ \ ЁЕ=Е ___.

0,11- ^Е 1

1 ^ о1 ^ и 1 1

з2

Рис. 2. АО в клетках контрольных доноров при адаптирующем облучении в во, О^ и Б и повреждающем облучении в вг-По оси ординат —• число АХ на клетку: О — ожидаемое число АХ, вычисленное как сумма эффектов двух облучений; Н — наблюдаемое

ФГА НТО

05мк Кюри/мм/ О 0,01мк Кюри/мм sA

С te

фиксация

-48ч

G,

54ч S

Q, M

Рис. 3. АО в клетках контрольных доноров при хроническом адаптирующем облучении от тритиевой воды и радиоактивного тимидина и повреждающем облучении в вг- По оси ординат — число АХ на клетку: О;— ожидаемое число АХ. вычисленное как сумма эффектов двух облучений; Н — наблюдаемое

Рис. 4. ДО в клетках контрольных доноров при адаптирующем облучении Х-лучамп н торичпым ичлучепнем от протонов 70 ГчВ в S (соотвествснноS Gj и Spi 02) и повреждающем облучении в С>2 ■ I lo оси ординат число АХ па клетку: О ожидаемое число АХ. вычисленное как сумма чффекчов двух облучении; II наблюдаемое

X

ЗсГр

во — Со

г* ФГА

1,5Гр

(ЗГр)

Т »

- 5ч ► 1ч --54ч—

фиксация

С„

5 (3*М

Рис. 5. АО в клетках контрольных доноров при адаптирующем и повреждающем облучении в во (а,Ь - повреждающая доза 1,5 Гр; с — повреждающая доза 3,0 Гр). Между двумя облучениями цельную кровь (*) или кровь в среде Игла (**) помещали в термостат (а) или холодильник (Ь,с). По оси ординат — число АХ на клетку:

О — ожидаемое число АХ, вычисленное как сумма эффектов двух облучений; Н — наблюдаемое

дальнейших исследований была выбрана схема (Б - Сг), надежно воспроизводимая как в нашей, так и в других лабораториях. АО возникал и в клетках, предварительно облученных в С| (С1 - Ог). В то же время интервал времени между адаптирующим и повреждающим облучением 4 часа оказался недостаточным для индукции АО ([Б] - вг), что согласуется с данными /БИасИеу е1 а1., 1989/.

До сих пор речь шла об адаптирующем однократном внешнем облучении редкоионизирующим рентгеновским излучением. В следующей серии опытов мы культивировали клетки в присутствии тритиевой воды (НТО - Ог), что приводило к хроническому р-облучению от инкорпорированного источника низкой мощности. В этом варианте возникала устойчивость к действию повреждающей дозы. В другом случае клетки культивировали с 3Н-тимидином, включающимся непосредственно в ДНК; при этом АО также возникал (рис. 3).

В то же время при адаптирующем облучении в Б-фазе (а эта схема, как указывалось выше, оказалась наиболее эффективной для Х-излучения) вторичным излучением протонов 70 ГэВ, представляющим собой модель жесткой компоненты космического излучения /И.Г.Акоев и соавт., 1973/, АО не индуцировался (рис. 4).

Мы изучали индукцию АО в нестимулированных ФГА лимфоцитах, поскольку именно эта ситуация наиболее близка к реальной. При этом не наблюдали радиозащитного действия предварительного облучения при схеме (Со - Со). Более того, если . клетки между двумя облучениями помещали в холодильник, то наблюдался сенсибилизирующий эффект предварительного облучения (рис. 5). Однако при повторении этого эксперимента сенсибилизации, как и АО, не возникало.

1.3. Модификация радиочувствительности хромосом и индукции АО аитиоксидантами и лазерным облучением

Было изучено модифицирующее действие анфена на индукцию АО по схеме (Б - (Зг).

У контрольных доноров присуствие анфена в момент облучения повреждающей дозой в стадии Ог привело к такому же снижению выхода радиационно-индуцированных аберраций, как и предварительное облучение в Б-фазе. Однако

I'ao.ntiia 2

Адаптивный ответ в лимфоцитах контрольных допоров при различных схемах облучения ("+" - АО наблюдается; "-" - АО отсутствует)

— Повреждающее Адаптирующее облучение облучение — -G« -G, -G2

Go- - - +

Gi - - +

S- +

[S|- -

нто- +

[3H-Tdhl - +

Spr - -

дополнительного снижения радиочувствительности при совместном действии адаптирующего облучения и антиоксиданта не происходило. Формальное заключение об отсутствии АО в клетках, культивируемых с анфеном, не является, таким образом, вполне корректным (рис. 6).

Изучение дозовых зависимостей выхода АХ, индуцированных in vitro, показало, что радиозащитное действие анфена и а-токоферола проявляется только при облучении стимулированных лимфоцитов (в стадии Gi), в то время как модификации радиочувствительности в Go не происходит. При этом эффект наблюдается только при облучении достаточно высокими (свыше 1 Гр) дозами (табл. 3).

В литературе неоднократно отмечается терапевтический эффект внутривенного лазерного облучения, его роль в стимуляции иммунной системы; на мембранно-клеточном уровне действие его опосредовано через активацию анти-оксидантной системы /Г.В.Морозов и соавт., 1990/. В нашей работе АО изучался в клетках одного из контрольных доноров-добровольцев после 1 и 5 сеансов лазерного воздействия.

Результаты приводятся на рис. 7. Показано, что лазерное облучение не меняет радиочувствительность клеток в G2, однако приводит к исчезновению реакции АО. Кроме того, лазерное облучение подавляло рост клеток в культуре, что обусловило относительно небольшое число проанализированных метафаз.

Таблица 3

Выход радиационно-индуцированных АХ в клетках контрольных доноров, облученных in vitro в стадии Go (1) и Gi (2) и больной с синдромом Шерешевского-Тернера, облученных in vitro в стадии Go (3) в присутствии антиоксидантов

До-

за, Число АХ на 100 клеток: обм ены/фрагменты

ГР

1 2 3

Интактные клетки

0 1 ± 1/ 1 ± 1 0/1 ± 1 0/1 ± 1

0,5 4± 1/3 ± 1 1 ± 1/1 ± 1 3 ± 117 ± 3

1,0 10 ± 2/ 9 ± 1 9 ± 3/ 6 ± 2 11 ± 3/8 ± 2

1,5 9 ± 219 ± 2 14 ±4/14 ±4

2,0 27 ±4/13 ±2 36 ±6/17 ±4 16 ±5/11 ±4

3,0 50 ± 4/29 ± 3

4,0 87 ± 7/48 ± 5 120 ± 14/69 ± 10 104 ± 7/56 ± 5

Облучение и культивирование в присутствии а - токоферола

0 0/0 0/0 0/1±1

0,5 3± 1/5 ±2 4 ± 1/ 5 ± 3

1,0 9 ± 3/ 9 ± 3 6 ± 2/ 5 ± 2 7 ± 212 ± 1

1,5 10 ± 3/ 7 ± 3

2,0 28 ± 6/21 ± 5 31 ±6/15 ±4 27 ± 5/ 9 ± 3

3,0 45 ± 4/28 ± 4

4,0 80 ±9/68 ± 11 102 ± 10/40 ±6

Облучение и культивирование в присутствии анфена

0 0 / 2 ± 2 0/2 ± 2 0/2 ± 2

0,5 3 ± 1/3 ± 1 5 ± 2/ 6 ± 3

1,0 9 ± 3/11 ± 3 7 ± 1/ 5 ± 2 9 ± 2/10 ± 3

1,5 12 ±3/14 ±4

2,0 24 ± 5/23 ± 5 20 ± 4/23 ± 5

3,0 ¡39 ± 6/28 ± 5

4,0 80 ± 14/51 ±11 59 ± 10/38 ± 8 111 ± 9/57 ± 6

(Для каждой точки проанализировано от 50 до 265 метафаз)

0,3 о,а_ 0,3 -

* **

0,2 0,2 ::: ;: 0,2

0,1 ::::: о,г : 0,1 :

0 : * ** : о С >:н 0_ ]о[н||

а) | Ь)

Рис. 6. Частота АХ (а) и АО (Ь) в интактных клетках (*) контрольных доноров и клетках, культивируемых с анфеном (**). По оси ординат — число АХ на клетку:

О — ожидаемое число АХ, вычисленное как сумма эффектов двух облучений; Н — наблюдаемое

Рис. 7. Частота АХ (а) и АО (Ь) в интактных клетках (К) контрольных доноров и клетках этого же донора после одного (1) и пяти (5) сеансов терапевтического лазерного облучения. По оси ординат — число АХ на клетку:

О — ожидаемое число АХ, вычисленное как сумма эффектов двух облучений; Н — наблюдаемое

1.4. АО в лимфоцитах больных с синдромом Дауна

Присутствие в популяции людей, у которых АО отсутствует, говорит о возможной роли генетических факторов в его формировании. Для проверки этого предположения мы выбрали группу больных с синдромом Дауна - заболеванием, относящимся к числу болезней генома. Люди, страдающие болезнями генома, занимают крайнее в популяции положение по радиочувствительности хромосом /А.П.Акифьев и соавт., 1984/. Эксперименты проводились по схеме (S - G2), приводящей, как указывалось выше, к повышению почти вдвое устойчивости к действию повреждающей дозы на клетки контрольных доноров. Поскольку при этом заболевании индивидуальные особенности доноров играют существенную роль, объединение результатов нецелесообразно. Данные приведены на рис. 8.

У пяти из шести обследованных больных с трисомией по 21-й хромосоме и одного больного с мозаичной формой заболевания АО отсутствовал. Относительно одного из них, СДЗ, сделать достоверного вывода нельзя при данном количестве метафаз, доступных для анализа (to,9o< t < to,95). Также, как в работах Shadley et al. /1987/, связь между радиочувствительностью в G2 и индукцией АО отсутствовала: мы не обнаружили повышения радиочувствительности клеток больных с синдромом Дауна по сравнению с контролем при облучении дозой 1,5 Гр в G2.

У больного с мозаичной формой синдрома Дауна АО отсутствовал как в диплоидных, так и трисомных клетках.

В экспериментах на лабораторных животных /А.А.Алиев и соавт., 1982/ введение витамина Е приводило к улучшению показателей АО. Мы изучали влияние этого препарата на клетки больных с синдромом Дауна. Добавление в культуры а-токоферола не привело к "нормализации" реакции АО у больных с синдромом Дауна за исключением донора СДЗ, но нельзя исключить, что АО у него индуцировался и в клетках, культивируемых обычным способом. Не было отмечено и радиозащитного действия на клетки больных, облученные in vitro в Gi (рис.9).

Анализ дозовых зависимостей выхода радиационно-индуцированных АХ в клетках больной с синдромом

ОД

Контроль СД2 СДЗ СД4 СД5 СД6 1 1 ф '

Рис.8. АО в клетках больных с синдромом Дауна (СД7 — соответственно в диплоидных и в трисомных клетках). По оси ординат — число АХ на клетку:

О — ожидаемое число АХ, вычисленное как сумма эффектов двух облучений; Н — наблюдаемое

о о о о

СД1 СДЗ СД4 СД6

Рис.9. АО в клетках больных с синдромом Дауна, культивируемых с а-токоферолом.

По оси ординат — число АХ на клетку:

О — ожидаемое число АХ, вычисленное как сумма эффектов двух облучений; Н — наблюдаемое

23

Шсренгевского-Тернера (заболеванием, относящимся, как и синдром Дауна, к болезням генома и также характеризующимся изменением числа хромосом) также не показал "нормализации" радиочувствительности при добавлении антиоксидантов (табл. 3).

2. ЧАСТОТА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ В ЛИМФОЦИТАХ ДЕТЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ ПОСЛЕ АВАРИИ НА ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ АЭС

2Л. Цитогенетические исследования в клетках детей с высоким уровнем содержания радиоактивного цезия

После аварии на Чернобыльской АЭС большое число людей подверглось хроническому облучению in vivo. Для проживающих на загрязненных территориях речь идет о действии низких доз радиации. Условия воздействия продолжительность, большое количество облучаемых) диктуют необходимость проведения цитогенетических обследований.

Мы изучали АХ в лимфоцитах периферической крови детей при действии хронического облучения in vivo вследствие проживания в загрязненных после аварии на Чернобыльской АЭС районах. Была выбрана группа практически здоровых детей Красногорского района (уровень загрязнения 15-40 Кюри/км2) с повышенным содержанием цезия. В клетках этих детей повышена частота дицентриков по сравнению с соответствующими показателями в контрольной группе (табл. 4).

Мы не наблюдали корреляции между показаниями СИЧ и частотой АХ: г=0,66 (р=0,343), однако если разделить обследованную выборку на 2 .подгруппы - с уровнем содержания цезия до 400 нКюри (значение, считающееся критическим для детей согласно принятым нормам) и свыше 400 нКюри, повышение частоты дицентриков, являющихся маркером облучения, будет наблюдаться лишь у детей с высоким содержанием радиоактивного цезия.

Радиационно-индуцированные дицентрики являются нестабильными АХ; частота их убывает со временем, прошедшим после облучения, что приводит к дополнительной неопределенности при оценке последствий облучения /А.В.Севанькаев, 1994/.

Таблица 4

АХ в клетках детей Красногорского района, характеризующихся различным уровнем внутреннего

облучения

Группа Число Число Число АХ на 1000 клеток

детей клеток

обмены фрагменты хрома-тидного типа клеток с АХ

М 16 7471 0,13±0,13 5,1 ± 0,8 102 ±02 15,4± 1,4

А 19 8337 1,1 ±0,4 2,9 ± 0,6 8,4 ± 1,0 12,1 ± 1,2

AI 9 3874 0,8 ± 0,4 1,3 ± 0,6 5,2 ±1,2 7,2 ± 1,4

А2 9 3963 1,5 ±0,6 4,0 ± 1,0 11£±1,7 17,4±2,1

A3 3 1574 2,5 ± 1,3 4,4 ± 1.7 ЮД ±2,5 172 ±3,3

М - контрольная группа детей г.Москвы А - группа детей Красногорского района (в группу вошли все обследованные дети)

AI - группа детей Красногорского района с содержанием цезия менее 400 нКюри

А2 - группа детей Красногорского района с содержанием цезия свыше 400 нКюри

A3 - группа детей Красногорского района с содержанием цезия свыше 600 нКюри (входит в группу А2)

В клетках 6 детей с наиболее высоким (более 500 нКюри) содержанием цезия и, следовательно/ наиболее высокими вероятными дозами облучения, определялась частота симметричных транслокаций по методу флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). В 3,5 тыс. проанализированных клеток мы не обнаружили ни одной транслокации, в то время как частота их в контрольной группе составила 1,1 ± 0,3 аберраций на 1000 клеток (табл. 5).

Таблица 5

Ци го) снстичсский анализ АХ с использованием Р1БН-метода в лимфоцитах детей Красногорского района с высоким содержанием радиоактивного цезия, измеренного счетчиком излучения человека (СИЧ)

Донор Число СИЧ, Аберрации

клеток нКюри

205 559 533 0

213 121 532 0

214 600 614 0

215 695 608 0

216 617 526 ё|с(1;г)+асе; del(4q)

217 909 588 <!е1(1)

Всего 3501 1 дицентрик: 0,3 ± 0,3 на 1000

клеток

2 делеции: 0,6 ± 0,4 на 1000 клеток

Контроль 7856 транслокации: 1,0 ± 0,4 на 1000 клеток

делеции

и фрагменты: 0,51 ± 0,25 на 1000 клеток

2.2. Частота АХ в клетках здоровых детей и детей с тиреопатологией, проживающих в Брянской области

Районы Брянской области характеризуются высоким "спонтанным" уровнем частоты заболеваний ЩЖ. После Чернобыльской аварии отмечен рост заболеваемости в загрязненных районах. На основании данных клинических обследований была предложена гипотеза, согласно которой вероятность развития тяжелых форм тиреопатологии повышена у детей, ЩЖ которых в первые дни после аварии поглотила большее количество радиоактивного иода. Для проверки ее мы предложили схему цитогенетического обследования 4 групп детей: здоровые дети и дети с

Таблица 6

Характеристика обследованных групп здоровых детей и детей с тиреопатологей

Дети с Здоровые дети

тиреопатоло-

гиеи

Клинцы Число

(Брянская обл.) обследованных 15 34

<15 Кюри/км2 Средний возраст 14(9-16) 12(7- 15)

Содержание

цезия (среднее) 56 нКюри 78 нКюри

по СЙЧ

Число клеток 6194 16763

Москва Число

(контроль) обследованных 9 16

Средний возраст 12(6- 16) 11 (5- 14)

Число клеток 4500 7471

тиреопатологией, проживающие на загрязненной территории (г.Клинцы) и соответствующие группы московских детей. Характеристики групп приведены в табл. 6.

Было показано, что частота АХ, являющихся маркерами облучения, повышена в группе детей с тиреопатологией из г.Клинцы по сравнению с таковой в группе здоровых детей. В то же время между двумя московскими группами достоверных различий не было (табл. 7).

Представляет интерес сравнить данные цитогенетического обследования детей с различными уровнями внешнего и внутреннего облучения. Из рис. 10 видно, что частота дицентриков в клетках детей, проживающих в районах с различным загрязнением и характеризующихся невысоким

Таблица 7

АХ в лимфоцитах здоровых детей и детей с тиреопатологией

на 1000 клеток

Дети с Здоровые

тирео- дети

патогией

Клинцы Число дицентриков и колец 1,6 ±0, 0,30 ±0,1

(Брянская Число клеток с

обл.) дицентриками и кольцами 1,1 ±о, 0,30 ± 0,1

Число фрагментов 8,2 ± 1, 3,6 ±0,

Число хроматидных

аберраций 8,4 ± 1, 7,8 ± 0,

Число клеток с АХ 17,0 ±1, 11,3 ± 0,

Москва Число дицентриков и колец 0,4 ± 0, 0,13.±0,1

(контроль) Число клеток с

дицентриками и кольцами 0,4 ±0, 0,13 ±0,1

Число фрагментов 3,8 ± 0, 5,1 ±0,

Число хроматидных

аберраций 7,6 ± 1, 10,2 ±1,

Число клеток с АХ 12,2 ±1, 15,4 ± 1,

уровнем облучения от инкорпорированного цезия, практически совпадают, и число дицентриков не отличается достоверно от контрольного уровня; частота парных фрагментов в клетках детей Брянской области ниже, чем у московских детей, и это может быть связано с действием нерадиационных факторов. В то же время лимфоциты детей с высоким уровнем содержания радиоактивного цезия характеризуются повышенной частотой дицентриков. Это может свидетельствовать о существенной роли внутреннего облучения в формировании цитогене-тических эффектов.

6_

£ (В !<

о

га

о с;

1о_ : ---- :

К 1 2 3

— дицентрики + кольца

| ' — фрагменты

'Рис.10. Частота АХ в клетках практически здоровых детей, проживающих в районах Брянской области с различным уровнем радиоактивного загрязнения: 1 —дети г.Клинцы (<15 Кюри/км2); 2,3 — дети Красногорского района (15-40 Кюри/км2), содержание цезия < 400 нКюри (2) и > 400 нКюри (3)

ОБСУЖДЕНИЕ

При интерпретации результатов популяционных исследований необходимо учитывать данные о действии малых доз в экспериментальных системах. С нашей точки зрения, эти исследования должны быть тщательно и непредвзято спланированы.

В экспериментах по культивированию клеток в присутствии тритиевой воды показано, что даже очень низкие концентрации ее способны приводить к появлению в клетках дицентриков. Это говорит о необходимости осторожчого подхода к количественной оценке дозы облучения. Количественное совпадение оценок дозы облучения по частоте дицентриков в клетках детей, подвергающихся хроническому облучению, следует, гаким образом, рассматривать в нашей работе как случайное. К тому же использование для оценки

23

дозы формулы, предложенной на основании расчетов Lloyd et al. /1992/ показало, что расчетное значение дозы оказалось выше.

Иными словами, при облучении низкими дозами in vivo также наблюдается "сверхлинейный" характер дозовой зависимости. Проведенное в рамках МАГАТЭ исследование привело к заключению, что экстраполяция возможна лишь до уровней доз не менее 5 .сГр для рентгеновского излучения и не менее 2 сГр для нейтронов 14,8 МэВ /Pohl-Rueling et al., 1983/.

На наблюдаемую частоту АХ может оказывать влияние и такое явление, как гормезис.

Наряду с цитогенетическими эффектами, облучение низкими дозами приводит к индукции клеточных систем, возможно, связанных с репарацией, что, в свою очередь, обусловливает рост радиорезистентности клеток (АО). Не исключено, что для включения этих систем необходимо определенное число повреждений и, следовательно, определенный уровень облучения. По мнению Pohl-Rueling et al. /1978/, могут существовать различные системы репарации, действующие в разных диапазонах доз. Д.М.Спитковский и соавт. /1994/ связывают АО с наличием субпопуляции клеток эволюционного резерва. Существование АО наблюдалось в исследовании М.А.Пилинской и соавт. /1993/, продемонстрировавших повышенную устойчивость клеток детей, проживающих в загрязненных районах, к действию химических .мутагенов. Однако наличие АО в клетках детей из загрязненных районов не было подтверждено в работах И.Е.Воробцовой и соавт. /1993/. Различия в индукции АО в клетках контрольных детей и детей из загрязненных районов продемонстрированы в работе И.И.Пелевиной и соавт. /1994/ (в последнем случае - по микроядерному тесту).

Изучение радиационно-индуцированного АО в клетках контрольных доноров показало, что АО может возникать только в случае повреждающего облучения в вг-фазе при любых видах адаптирующего воздействия (за исключением вторичного излучения протонов 70 ГэВ), Как уже говорилось, этот вид излучения является аналогом жесткой компоненты космического излучения и не встречается в фоновом излучении

Земли. Возможно, что отсутствие АО в этом случае указывает на эволюционную природу явления.

Непосредственное изучение модифицирующего действия нерадиационных факторов на радиочувствительность до сих пор проводилось в основном в диапазоне высоких доз облучения. Между тем, именно при низких дозах эти факторы могут играть значительно более существенную роль в индукции клеточных эффектов, величина и направленность которых может меняться в зависимости от условий эксперимента.

При сопоставлении результатов использования различных цитогенетических тестов можно придти к заключению, что присутствие в культурах лимфоцитов антиоксидантов оказывает радиозащитное действие только на метаболизирующие клетки, причем эффект проявляется при облучении большими дозами. Это ставит под сомнение перспективность применения антиоксидантов для профилактики отрицательных последствий облучения низкими дозами.

Проявление радиозащитного действия предварительного облучения низкими дозами может зависеть от действия многих факторов, таких как температура, генотип и состояние организма, присутствие антоксидантов и предварительное лазерное облучение, на клеточном уровне приводящее к активации антиоксидантной системы. Это указывает на неоднозначный характер эффектов. В то же время, как указывалось выше, даже очень низкие дозы хронического облучения могут индуцировать АХ, что подтверждается как данными экспериментов in vitro по культивированию с тритиевой водой, так и результатами цитогенетических обследований детей, проживающих на загрязненных в результате Чернобыльской аварии территориях (полученные дозы, как правило, не превышают предельно допустимых). "Исчезновение" АО у донора после лазерного облучения, отсутствие дополнительной модификации радиочувствительности после предварительного облучения в присутствии антиоксидантов, радиосенсибилизирущее действие низкой температуры и облучения (невоспроизводившееся при повторении) - это факты, свидетельствующие о непред-

сказуемости эффектов малых доз на основании простой экстраполяции.

Анализируя причины вариабельности в реакции АО, ОНу1еп и Воз! /1990/ связывают способность к его индукции с физиологическими факторами. Добавление в культуральную среду таких веществ, как инсулин, экстракт тимуса или адреналина, способно привести к появлению АО у тех доноров, у которых он ранее отсутствовал. Поскольку указанные вещества присутствуют в организме человека, авторы считают, что способность к индукции АО отражает клеточный метаболизм. Авторы отмечают, что присутствие в плазме гормонов регулируется, помимо прочего, такими факторами, как образ жизни, состояние здоровья и наличие стрессовых ситуаций.

В литературе отмечалось, что у некоторых людей АО отсутствует, и высказывалось предположение о роли генетических факторов в его формировании. Мы выбрали для изучения группу больных с синдромом Дауна - заболеванием, при котором клетки больных занимают по радиочувствительности крайнее в популяции положение. Эксперименты проводились на клетках 6 больных с трисомией по 21-й хромосоме и одного больного с мозаичной формой заболевания.

Если при изучении АО в клетках контрольных доноров по схеме (Б - Ог) мы наблюдали это явление практически при всех повторениях, то для синдрома Дауна отсутствие АО можно считать достаточно характерной чертой.

Мы впервые показали отсутствие у больных с синдромом Дауна радиационно-индуцированного АО — одной из важнейших общеклеточных гомеостатических реакций. Однако наши данные свидетельствуют о том, что генетический контроль АО (в частности, отсутствие АО в диплоидных клетках больного с мозаичной формой болезни Дауна) - далеко не такой простой, как контроль известных ферментов репарации ДНК. Поэтому можно ожидать, что дальнейшее изучение роли генетических факторов в формировании радиационно-индуцированного АО откроет новые стороны во взаимодействии таких факторов, как малые дозы радиации и

геном клетки, а также роли патологического окружения ■ (в случае мозаика) в работе генома нормальных клеток.

Связь генотип — ДО выглядит сложнее, чем генотип репарация одно- и двунитевых разрывов. Для диплоидных клеток больного с мозаичной формой синдрома Дауна она опосредована органнзменными факторами. Полученные факты расширяют наши представления о глубине нарушений различных клеточных и организменных процессов, в частности, связанных с поддержанием генетического гомеостаза при синдроме Дауна.

Мы не обнаружили повышения радиочувствительности хромосом после облучения клеток в G2 при этом заболевании по сравнению с контролем. Ранее при исследовании дозовых зависимостей выхода АХ в лимфоцитах, облученных in vitro в стадии Go, в нашей лаборатории была показана их повышенная радиочувствительность/А-П.Акифьев и соавт., 1984/.

Обращает на себя внимание тот факт, что радиозащитный эффект во всех случаях не превышал 50%. В наших ранних исследованиях радиочувствительность хромосом больных с болезнями генома не превышала величины 2. Из этого следует, что, по-видимому, существуют пределы модификации вариабельности радиочувствительности.

Мы не обнаружили АО при схеме облучения (Go - Go), наиболее близкой к ситуации in vivo. Тем не менее, индукция АО адаптирующим облучением в Go либо хроническим облучением (если повреждающее облучение проводили в G2) указывает на то, что это явление необходимо принимать во внимание при интерпретации данных популяционных обследований. В частности, именно наличие АО может в ряде случаев служить объяснением между результатами различных исследований.

Мы выбрали для обследования несколько групп детей.

Первую группу можно рассматривать как предельный случай по дозовой нагрузке в детской популяции: в нее вошли дети с высоким содержанием радиоактивного цезия, проживающие в Красногорском районе Брянской области. Частота дицентриков в лимфоцитах детей этой группы оказалась повышенной по сравнению с контрольными значениями, полученными для московских детей, причем эти

отличия нс наблюдаются в клетках детей лого же района с содержанием цезия, не превышающим допустимые уровни.

В настоящее время не представляется возможным предложить объяснение расхождения между данными рутинного цитогенетического анализа и анализа по FISH с использованием проб на хромосомы 1, 4 и 12. Возможно, эти хромосомы, содержащие 19% общего количества ДНК, реже вовлекаются в образование аберраций. Не исключены и другие причины, например, снижение жизнеспособности клеток, несущих стабильные транслокации, в результате эффекта положения. Последний заключается в изменении характера проявления генов, находящихся вблизи точек разрыва. При этом нередко происходит ослабление доминирования. Если такое событие произойдет у гетерозигот и эффект положения коснется доминантного аллеля, то клетка может потерять одну из жизненно важных функций, что завершится летальным событием для нее. Добавим к этому, что эффект положения может распространяться иногда на самые ближние к точке разрыва генетические локусы, но и может касаться достаточно удаленных генов. К тому же в результате хронического облучения низкими дозами иммунная система этих детей работает с повышенной нагрузкой, что подтверждается результатами иммунологическогих обследований /Yao et al., 1993/. Возможно, за счет этого осуществляется более эффективная элиминация клеток с транслокациями.

Среди радионуклидов 13|1 благодаря его физическим и химическим свойствам вносит наиболее существенный вклад в облучение популяции /Likhtarev et al., 1994/. Клиническое обследование детей, проживающих в загрязненных радиоактивным иодом районах Брянской области, выявило рост числа заболеваний ЩЖ, и особенно тяжелых форм. За последние годы 48 детей заболели раком ЩЖ; ранее число их составляло 1-2 в год /Е.М.Паршков и соавт., 1995/. Как известно, ЩЖ детей намного чувствительнее к облучению, чем ЩЖ взрослых /UNSCEAR, 1977/.

Для обследования были выбраны 4 группы детей: дети с заболеваниями ЩЖ и практически здоровые дети, проживающие в г.Клинцы Брянской области и соответствующие группы московских детей. Такая постановка задачи позволяет оценить

вклад радиации в заболеваемость ЩЖ. Обследуемый район является эндемичным по дефициту иода; велика также роль наследственных факторов.

Мы обнаружили увеличение частоты хромосомных обменов и фрагментов в группе детей с заболеваниями ЩЖ, проживающих в загрязненных районах, по сравнению с соответствующими показателями в группе здоровых детей. Этот факт не может быть объяснен влиянием факторов, связанных с заболеваниями, а также результатом лечения, поскольку разницы между аналогичными группами московских детей не было.

Анализ полученных в опытах in vitro результатов убедил нас в необходимости выработки собственного подхода к поиску повреждающих хромосомный аппарат эффектов малых доз радиации. Этот подход нашел свое воплощение в выделении четырех групп детей. Лишь одна из них оказалась принадлежащей к группе риска по повышенному уровню АХ и, следовательно, учитывая многочисленные данные литературы /И.В.Филюшкин, И.М.Петоян, 1988; Sandberg, 1992/, по склонности к развитию злокачественных опухолей.

Нельзя сделать однозначное заключение о том, является ли рак ЩЖ радиационно-индуцированным, либо формируется на фоне изменений ЩЖ, существовавших до облучения. Полученные нами данные по изучению частоты АХ в клетках 4 групп детей свидетельствуют в пользу предположения о том, что в первые дни после аварии в ЩЖ детей с различными формами гиперплазии могло происходить наиболее интенсивное поглощение радиоактивного иода. Следствием этого, в свою очередь, явились бы более высокие дозы облучения ЩЖ и более высокая вероятность развития тяжелых форм заболеваний. У детей, заболевших раком ЩЖ, наиболее вероятные значения реконструированной дозы составили от 70 до 140 сГр, хотя отмечены и более низкие значения /Е.М.Паршков и соавт., 1995/.

Хотя внутреннее облучение детей с тиреопатологией, проживающих в г.Клинцы, и практически здоровых детей Красногорского района с высокими значениями СИЧ, по-видимому, обусловлены преимущественным вкладом разных радионуклидов, обращает на себя внимание тот факт, что

значения частоты АХ в этих группах оказались близкими, что косвенно подтверждает предположение о более высокой дозе локального облучения заболевших детей.

Разумеется, нельзя исключить и предположения о большей радиочувствительности детей с заболеваниями ЩЖ.

Таким образом, действие малых доз радиации на клетки человека является неоднозначным. С одной стороны, очень низкие (даже по сравнению с фоновыми) дозы облучения in vitro и in vivo способны приводить к появлению эффектов, регистрируемых на цитогенетическом уровне. С другой стороны, острое и хроническое облучение в ряде случаев приводит к индукции АО и оказывает, таким образом, стимулирующее воздействие.

В настоящей работе изучено действие малых доз ионизирующей радиации на хромосомный аппарат лимфоцитов человека in vitro и in vivo. В первом случае был использован феномен радиационно-индуцированного адаптивного ответа (АО); во втором исследовались цитогенетические повреждения у детей, проживающих в районах, загрязненных вследствие аварии на ЧАЭС.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что низкие по сравнению с естественным уровнем излучения дозы хронического облучения могут приводить к появлению АХ в культивируемых с тритиевой водой лимфоцитах периферической крови.

2. Низкие дозы однократного рентгеновского или хронического р-излучения трития приводят к появлению радиационно-индуцированного АО при повреждающем у-облучении клеток в G2. Проявление радиозащитного эффекта при этом практически не зависит от мощности дозы адаптирующего облучения и от стадии клеточного цикла, на которой оно проводилось.

3. Вторичное излучение от протонов 70 ГэВ, являющееся аналогом жесткой компоненты космического излучения, не приводит к появлению АО в культивируемых лимфоцитах.

4. АО не возникает, если повреждающее облучение клеток проводится в стадиях Go, Gi клеточного цикла.

5. Адаптирующее облучение низкими дозами нестимули-рованных ФГА лимфоцитов в системе АО приводит к снижению радиочувствительности (при повреждающем облучении в G2), не меняет радиочувствительность (при повреждающем облучении в Go и Gi), вызывают радиосенсибилизацию (в условиях дополнительного воздействия низкой температуры в Go).

6. Радиозащитное действие предварительного рентгеновского облучения в S-фазе количественно совпадает с действием антиоксидантов. Совместное действие низких доз и антиоксидантов не приводит к дополнительному снижению радиочувствительности клеток, облученнных в G2. Радиозащитные свойства антиоксидантов на лимфоциты человека in vitro проявляются только при больших (свыше 1 Гр) значениях доз облучения.

7. Внутривенное лазерное облучение in vivo приводит к тому, что АО у донора не наблюдается после 1 и 5 процедур, в то время как до лазерного воздействия АО у этого донора индуцировался.

8. Впервые показано отсутствие АО у больных с синдромом Дауна. Это свидетельствует о генетическом контроле этого явления. Отсутствие индукции АО как в диплоидных, так и в трисомных клетках больного с мозаичной формой заболевания указывает на то, что проявление этого феномена может быть опосредовано организменными факторами.

9. При цитогенетическом обследовании детей с высоким уровнем внутреннего и внешнего облучения обнаружена повышенная частота нестабильных аберраций хромосом, являющихся маркером дейсвия радиации. Частота нестабильных АХ в лимфоцитах периферической крови практически здоровых детей в основном обусловлена внутренним облучением от инкорпорированных радионуклидов (в частности, ,37Cs) и в меньшей степени зависит от внешнего облучения.

10. При исследовании методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с использованием проб на

хромосомы I, 4 и 12 кс было обнаружено симметричных транслокацин в клетках детей с высоким уровнем внутреннего облучения.

11. Из 4 выбранных для обследования групп детей {дети с гиреопатологиеи и здоровые дети, проживающие на загрязненных радионуклидами территориях, и соответствующие группы московских детей) выделена группа риска по повышенной частоте АХ, являющихся маркерами облучения. Полученные данные свидетельствуют о том, что риск возникновения тяжелых форм тиреопатологии повышен у детей, щитовидная железа которых поглотила большее количество радиоактивного иода.

Список работ по теме диссертации

1.Е.К.Хандогина, Г.Р.Мутовин, С.В.Зверева, Д.О.Зверев, А.В.Антипов, А.П.Акифьев. Цитогенетика радиационно-индуцированного адаптивного ответа в лимфоцитах человека // Труды Рабочего совещания по исследованию механизмов радиационно-индуцированного мутагенеза и репарации ДНК (Дубна, 1990). - Дубна, 1990,-С.148-156.

2.А.П.Акифьев, Л.К.Обухова, Г.Р.Мутовин, Д.М.Измайлов, Е.К.Хандогина. Мутагенное последействие: экологические аспекты // Тез.докл. Всесоюзного совешания "Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами" (Самарканд, 1990).-М.-Самарканд, 1990.-С.32-33.

3.Г.Р.Мутовин, Е.К.Хандогина, С.В.Кулева, П.И.Андрю-щенко, Л.Ф.Марченко, Д.О.Зверев, Г.А.Худолий, А.И.Потапенко, А.В.Якименко, А.П.Акифьев. Клеточные и молекулярные механизмы синдромов хромосомной нестабильности // Тез. докл. II Всесоюзного съезда медицинских генетиков (Алма-Ата, 1990).-М., 1990.-С.310.

4.Е.К.Хандогина, Г.Р.Мутовин, С.В.Зверева, Д.О.Зверев, Е.В.Неудахин, Б.А.Архипов, А.П.Акифьев. Отсутствие радиационно-индуцированного адаптивного ответа в лимфоцитах больных с синдромом Дауна // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-1991.- Т.112, No 2.-С.290-292.

5.С.В.Зверева, Г.Р.Мутовин, Е.К.Хандогина, Е.В.Неудахин, Б.А.Архипов, Д.О.Зверев, А.П.Акифьев. Репарационные процессы в клетках больных с синдромом Дауна // "Иммунопатология

эндокринной системы у детей и подростков" (Республиканский сборник научных трудов).- М., 1991,- С.75-78.

ô.E.K.Khandogina, G.R.Mutovin, S.V.Zvereva, A.V.Antipov,

D.O.Zverev, A.P.Akifyev. Adaptive response in irradiated human lymphocytes: radiobiological and genetical aspects // Mutation Research.- 1991.- V.251.- P.181-186.

7.E.K.Khandogina, S.V.Zvereva, G.R.Mutovin, A.P.Akifyev. Adaptive response in lymphocytes from normal persons and from patients with Down's syndrome // Proceedings of the 8th International Congress of Human Genetics (Washington, 1991).- The American Journal of Human Genetics.- 1991,- V.49,No 4 (Suppl.).-P.267.

8.Е.К.Хандогина, С.В.Зверева, А.В.Якименко, Г.Р.Мутовин, Л.Ф.Марченко, В.А.Агейкин, А.П.Акифьев. Радиационно-индуци-рованный адаптивный ответ как показатель неоднозначного действия низких доз излучения и один из критериев генетического гомеостаза // "Медицинские аспекты влияния малых доз радиации на организм детей и подростков" (Сборник научных трудов. Вып.1).- Обнинск, М. - 1992,- С.28-33.

9.С.В.Зверева, Г.Р.Мутовин, Е.К.Хандогина, Л.Ф.Марченко,

E.В.Неудахин, Р.Г.Артамонов, А.П.Акифьев. Оценка радиозащитного действия антиоксидантов на клетки человека в норме и при болезнях генома с помощью различных цитогенетических тестов // Радиобиология,- 1993.-Т.ЗЗ, No 3.-С.425-432.

Ю.Г.Р.Мутовин, А.П.Акифьев, С.В.Зверева, Л.Ф.Марченко, Н.А.Рубцова, Е.К.Хандогина, А.В.Якименко. Неоднозначный характер цитогенетческого действия малых доз ионизирующей радиации на клетки человека // Материалы конференции ФУВ РГМУ,- М„ 1994,- С.38.

1 l.E.K.Khandogina, S.V.Zvereva, L.F.Marchenko, V.A.Agejkin, G.R.Mutovin, V.V.Shakhtarin, A.P.Akifyev. Frequency of chromosome aberrations in lymphocytes from healthy children and children \yith thyreopathology living in Bryansk region H International Workshop on Determination of Radiation Doses among Critical Groups of Population in the FSU after Chernobyl (Muenchen, 1994), Abstracts.-Muenchen, 1994.

12.А.П.Акифьев, Г.А.Худолий, А.В.Якименко, А.В.Красно-певцев, Е.К.Хандогина. G1 процесс в лимфоцитах человека,

культивируемых с ФГА, и образование радиационно-индуцирован-ных аберраций хромосом //Генетика.- I995.-T.31, N4,-С.485-491.

П.Е.К.Хандогина, С.В.Зверева, В.А.Агейкин, Л.Ф.Марченко,

B.В.Шахтарин, Г.Р.Мутовин, А.П.Акифьев. Частота аберраций хромосом в лимфоцитах детей с заболеваниями щитовидной железы, проживающих в Брянской области // Радиационная биология. Радиоэкология.-1995.- Т.33, N 5,- С.626-630.

Н.Е.К.Хандогина, В.А.Агейкин, С.В.Зверева, Л.Ф.Марченко, Г.Р.Мутовин, Г.П.Снигирева, Р.В.Ленская, В.М.Буянкин, В.В.Шахтарин, А.П.Акифьев. Цитогенетическое обследование различных групп детей, проживающих в районах Брянской области, загрязненных в результате Чернобыльской аварии II Радиационная биология. Радиоэкология.- 1995,- Т.35, N 5.- С.618-626.

15.Е.К.Хандогина, С.В.Зверева, Л.Ф.Марченко, В.А.Агейкин, Н.А.Рубцова, Г.Р.Мутовин, А.П.Акифьев. Цитогенетическое обследование детей Красногорского района Брянской области // "Медицинские аспекты влияния малых доз радиации на организм детей, подростков и беременных женщин" (Сборник научных трудов. Вып.2).- Обнинск, М. - 1995.- С.65-68.

16.Р.В.Ленская, Е.К.Хандогина, С.В.Зверева. Повышение числа хромосомных аберраций при омоложении пула периферических лимфоцитов у детей - накопителей радионуклидов из Российского Чернобыля // "Экопатология детского возраста" (Сборник лекций и статей).- М„ 1995,- С.255-261.

П.Е.К.Хандогина, С.В.Зверева, В.А.Агейкин, Л.Ф.Марченко, Г.Р.Мутовин, Р.В.Ленская, Г.П.Снигирева, А.П.Акифьев. Частота аберраций хромосом в лимфоцитах детей, проживающих в районах Брянской области с различным уровнем радиоактивного загрязнения // Тез. докл. Всероссийской конференции "Радиоэкологические, медицинские и социально-экономические последствия аварии на Чернобыльской АЭС. Реабилитация территорий и населения" (Голицыно, 1995). - М., 1995. - С.83.

18.Е.К.Хандогина, А.П.Акифьев, С.В.Зверева, Г.Р.Мутовин, Л.Ф.Марченко. Особенности цитогенетического действия малых доз ионизирующих излучений // Тез. докл. 2 Международного симпозиума "Механизмы действия сверхмалых доз" (М., 1995). - М., 1995.-

C.74.

4С