Закономерности формирования цитогенетических эффектов малых доз ионизирующего излучения

Гераськин, Станислав Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Закономерности формирования цитогенетических эффектов малых доз ионизирующего излучения
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности формирования цитогенетических эффектов малых доз ионизирующего излучения"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ И АГРОЭКОЛОГИИ

На правах рукописи

Гераськин Станислав Алексеевич

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ

{Специальность 03.00.01 - Радиобиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Обнинск -1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии РАСХН.

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

Академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор, Р.М.Алексахин

Доктор биологических наук, профессор В.И.Корогодин (Объединенный институт ядерных исследований, г.Дубна)

Доктор биологических наук, профессор В.Г.Петин (Медицинский радиологический научный центр РАМН, г.Обнинск)

Доктор биологических наук, профессор Б.И.Сынзыныс (Институт атомной энергетики, г.Обнинск)

Медицинский радиологический научный центр РАМН, г.Обнинск.

Защита дисертации состоится 4 декабря 1998г. в 12 часов на заседании Специализированного совета Д.120.81.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии.

Отзывы просим направлять по адресу: 249020, Калужская область, г. Обнинск, ВНИИСХРАЭ, Специализированный совет Д.120.81.01

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

1998г.

Н.И.Санжарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рост населения и масштабы производственной деятельности человечества выдвинули антропогенное воздействие на природные процессы в число наиболее значимых экологических факторов, определяющих новые условия существования и эволюции всей биоты, включая человека. С этих позиций важнейшим является вопрос о возможных последствиях для всего живого такого глобального и быстрого (с точки зрения биологической эволюции) изменения уровня техногенной нагрузки на биосферу. Результаты наших экспериментов и анализ литературных данных свидетельствуют о существенном ускорении мутационного и рекомбинационного процессов в подвергшихся внешнему воздействию популяциях растений и животных, увеличении генетического груза. Опыт изучения генетических последствий радиационных аварий на Южном Урале и в Чернобыле позволяет заключить, что перечисленные явления служат отражением происходящих на загрязненных территориях сложных адаптационных процессов, результатом которых является перестройка генетической структуры популяций. Фактическое отсутствие научно обоснованных экологических нормативов и весьма смутное представление о том, где и в какой мере превышен допустимый уровень воздействия, ведущего к разрушению экосистем и снижению биоразнообразия, делает актуальным анализ закономерностей формирования и разработку количественных методов оценки генетических эффектов, индуцированных малыми дозами ионизирующего излучения и других техногенных токсикантов.

Анализ причин полученных в независимых исследованиях 20-30-кратных расхождений в оценках медицинских последствий аварии на Чернобыльской АЭС показал, что они не могут быть следствием относительно небольших отклонений в оценке ожидаемой коллективной дозы, а обусловлены главным образом различиями в оценке выхода генетических и канцерогенных нарушений в области малых значений экспозиции. Таким образом, оценка генетических последствий крупных радиационных аварий и, в частности, аварии на Чернобыльской АЭС, существенным образом зависит от того, какой концепции в отношении биологического действия малых доз ионизирующего излучения придерживается автор.

Решение практических задач охраны окружающей среды невозможно без создания прочной научной основы для оценки биологических эффектов комбинированных воздействий факторов разной природы и разработки соответствующих количественных критериев, которые носили бы по возможности универсальный характер. Сложные, разнонаправленные процессы, индуцируемые в клетке комбинированным воздействием факторов разной природы, включающие, в частности, как индукцию систем репарации, так и подавление их работы, способны, в зависимости от их соотношения, формировать самые разные ответные реакции - от антагонизма до синергизма. Подтверждением этого являются многочисленные примеры нелинейного изменения величины и характера отклика биологической системы при изменении порядка, уровней и времени воздействия. Поэтому ре-

зультирующий отклик биологической системы на комбинированное воздействие нельзя предвидеть исходя только из информации об эффектах раздельного действия каждого из факторов.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось выявление закономерностей формирования цитогенетических эффектов малых доз ионизирующего излучения.

В числе основных задач исследования рассматривались:

1. Формулировка и обоснование концепции биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки.

2. Изучение закономерностей индукции малыми дозами ионизирующих излучение цитогенетических повреждений в корневой меристеме облученных семян и проростков, г также в листовой интеркалярной меристеме сельскохозяйственных растений.

3. Изучение закономерностей формирования цитогенетических эффектов в условиях комбинированного действия малых доз ионизирующего излучения и малых концентраций мутагенов химической природы (тяжелые металлы).

4. Изучение цитогенетических последствий аварии на Чернобыльской АЭС на примере растительных компонентов аграрных экологических систем.

Научная новизна. В результате экспериментальных исследований и теоретических обобщений выявлены новые закономерности формирования цитогенетических эффектов малых доз ионизирующего излучения в условиях раздельного и комбинированного с химическими мутагенами воздействия, имеющие принципиальное значение для понимания механизмов биологического действия низкодозового облучения. Впервые показано, что закономерности выхода цитогенетических нарушений в области малых доз характеризуются ярко выраженной нелинейностью и имеют универсальный характер, различаясь для разных объектов значениями доз, при которых происходит изменение характера зависимости. Дан анализ экспериментально наблюдаемых реакций клеток на облучение в низких дозах и рассмотрены возможные молекулярно-клеточные механизмы формирования их ответной реакции на низкодозовое облучение. Показано, что используемые для оценки генетического риска малых доз модели, основанные на линейной беспороговой концепции, носят экстраполяционный характер, не имеют прочного биологического обоснования и входят в противоречие с имеющимися экспериментальными данными. Предложена концепция биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки. Дан анализ проблемы индуцированной внешним воздействием нестабильности генома и предложена стохастическая модель этого процесса. Экспериментально изучены закономерности индукции малыми дозами ионизирующего излучения структурных мутаций в корневой меристеме проростков и семян, а также в листовой интеркалярной меристеме сельскохозяйственных растений. Экспериментально изучены закономерности формирования цитогенетических эффектов в условиях комбинированного воздействия ионизирующего излучения и тяжелых металлов и показано, что синергические эффекты индуцируются преимущественно в условиях сочетанного действия малых экспозиций поережда-

ющих агентов. На примере растительных компонентов аграрных экологических систем дан анализ цитогенетических последствий аварии на Чернобыльской АЭС.

На защиту выносятся следующие группы результатов:

-концепция биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки;

-закономерности формирования цитогенетических эффектов малых доз ионизирующего излучения в условиях раздельного и комбинированного с химическими мутагенами воздействия;

-результаты анализа цитогенетических последствий аварии на Чернобыльской АЭС на примере растительных компонентов аграрных экологических систем.

Теоретическая и практическая значимость. В радиобиологии давно назрела проблема принципиального пересмотра взглядов на характер радиационного воздействия на клетки. Регистрируемые в экспериментах ответные реакции на облучение являются отражением определенных принципов организации и функционирования эукариотической клетки. С этих позиций закономерности выхода цитогенетических повреждений представляют собой эпифеномен индуцированных ниэкодозовым облучением глобальных структурных и функциональных перестроек генома. Неспецифический характер анализируемых закономерностей и широкий спектр объектов, на которых они наблюдаются, свидетельствует о том, что мы имеем дело с общебиологическим феноменом. В основе этого типа реакций клеток лежат фундаментальные механизмы, появившиеся задолго до дифференциации высших многоклеточных организмов и отражающие эволюционно закрепленный комплекс адаптивных реакций клетки на внешнее воздействие. С этих позиций повышенная генетическая эффективность низкодозового облучения имеет простое и естественное объяснение как одно из проявлений процессов цитогенетической адаптации, происходящих в популяциях живых организмов в ответ на стрессовое воздействие. Так же, как открытое радиобиологами явление репарации молекул ДНК переросло масштабы этой науки и имеет несомненное общебиологическое значение, так и установленные в радиобиологических исследованиях закономерности биологического действия малых доз ионизирующего излучения являются не артефактом или какой-то экзотической "аномальной" реакцией, а служат одним из естественных проявлений лежащих в основе жизни фундаментальных механизмов обеспечения устойчивости живых систем, что позволяет с иных позиций оценить место радиобиологии в системе естественных наук.

Дальнейшее теоретическое и экспериментальное развитие сформулированных в настоящей работе представлений должно привести к смене доминирующей сегодня научной парадигмы в отношении закономерностей биологического действия малых доз ионизирующего излучения, природы радиационной надежности живых организмов и, в качестве нового теоретического базиса, может быть использовано для оценки генетического риска низкодозового облучения на фоне антропогенного загрязнения среды. Результаты выполненных в ходе подготовки диссертационной работы исследований и разработанные подходы использовались при оценке биологических последствий аварии на Черно-

быльской АЭС (программа TF-5 Международного союза радиоэкологов), при подготовке Национального доклада Российской Федерации "Десять лет после аварии на Чернобыльской АЭС" и научного приложения к докладу НКДАР Генеральной Ассамблее ООН за 1996 г. "Effects of radiation on the environment". В настоящее время разработанные в ходе выполнения диссертационной работы методические подходы используются для оценки воздействия предприятия по переработке и хранению радиоактивных отходов ЛСК "Радон" на растительные компоненты природных экологических систем (Проект МНТЦ N 535).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международном совещании "Генетическое действие корпускулярных излучений" (Дубна, 1988), III симпозиуме по современным проблемам биологии, посвященном памяти Н.В.Тимофеева-Ресовского (Нор-Амберд,1989), 1 Всесоюзном съезде радиобиологов (Москва, 1989), III Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной радиологии (Обнинск, 1990), Конференции "Радиобиологические последствия аварии на Чернобыльской АЭС" (Минск,1991), XV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Обнинск,1993), II Международной конференции "Радиобиологические последствия аварий на атомных электростанциях" (Москва,1994), Конференции "Экологические проблемы сельскохозяйственного производства" (Воронеж,1994), Рабочем совещании "Биологическое действие малых доз" (Дубна, 1995), X Международном конгрессе по радиационным исследованиям (Вюрцбург.1995), Международном симпозиуме "Protection of the Natural Environment" (Стокгольм,1996), IV Международном симпозиуме по радиационной безопасности (Обнинск,1996), Конференции "Научные основы ведения агропромышленного производства в условиях крупных радиационных аварий" (Обнинск,1996), Конференции "Хромосомы и радиация", посвященной памяти Н.В.Лучника (Обнинск,1997), Международной конференции "Health Effects of Low Dose Radiation: Challenges for the XXI Century" (Стредфорд-на-Эйвоне,1997), III съезде по радиационным исследованиям (Москва,1997), Международной конференции "Low Doses of lonizing Radiation: Biological Effects and Regulatory Control" (Севилья,1997), Международной конференции по биодозиметрии (Обнинск, 1998).

Публикации. Основные результаты исследований изложены в 86 публикациях, в том числе в монографии "Генетические основы радиорезистентности и эволюция" и в 42 статьях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, заключения, приложения и списка литературы. Работа изложена на го* страницах машинописного текста, включает 26 таблиц и 31 рисунок. Список литературы содержит 210 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. ПРОБЛЕМА ОЦЕНКИ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ

1.1. Анализ экспериментально наблюдаемых реакций клеток на низкодозовое |блучение. Важным этапом оценки последствий облучения в малых дозах является дентификация истинной формы дозовой зависимости, с помощью которой осу-дествляется экстраполяция в область, недоступную для непосредственных наблюдений. 1аиболее распространенным способом решения этой задачи является линейная экстра-галяция эффектов с больших доз, где закономерности лучевого поражения хорошо аучены, на малые. Теоретической базой этого подхода является линейная беспороговая онцепция, постулирующая безусловную опасность любых уровней облучения, в том чис-|е и не превышающих естественного радиационного фона (ЕРФ). Однако линейная зави-имость, справедливая для индукции первичных повреждений в молекулах ДНК, не обя-ательно должна приводить к аналогичной зависимости по выходу генетических наруше-:ий. Клетка - живая, сложно организованная система, поэтому ее ответная реакция на нешнее радиационное воздействие в диапазоне сублетальных доз может иметь более ложный характер.

К настоящему времени накопилось достаточно много фактов, свидетельствующих пользу нелинейного характера дозовой зависимости в области малых значений экспо-иции. Наиболее репрезентативная информация имеется в отношении частоты аберра-ий хромосом, индуцируемых в лимфоцитах периферической крови человека низкодозо-ой радиацией. Именно на этом объекте были выполнены наиболее масштабные иссле-ования формы дозовой зависимости. Анализ многочисленных работ разных авторов ло-воляет выделить два участка, в пределах которых дозовая зависимость отклоняется от жидаемой линейной. Существенные отклонения были выявлены в области доз ниже 5 Гр. На рис.1 и 2 представлены данные исследовательских групп, возглавляемых [ж.Поль-Релинг (1983) и Д.Ллойдом (1992), которыми были выполнены наиболее тща-ельные исследования дозовой зависимости в этом диапазоне. Анализ полученных в тих экспериментах результатов показал, что фиксируемая при дозах до 4 сГр частота ицентриков не превышает достоверно контрольного уровня. Более того, все шесть поученных в трех независимых экспериментах точек в диапазоне 0.3-1.0 сГр лежат ниже 1НОгда статистически достоверно) соответствующего контроля.

Второй интервал, в котором наблюдается существенное изменение наклона дозо-ой зависимости, варьирует у разных авторов в диапазоне 10-50 сГр. На рис.3 представ-ены сведенные воедино А.В.Севанькаевым и Н.В.Лучником (1977) данные разных ис-педователей из которых следует, что частота фиксируемых в этом диапазоне аберра-ий нелинейно зависит от величины дозы. Еще одной особенностью, присущей представ-енным на рис.3 эмпирическим зависимостям, является наличие дозонезависимого уча-гка (плато). Поскольку сходные зависимости воспроизводятся с удивительным постоян-

ством в независимых исследованиях разных авторов (Севанькаев,1991; Спиков-ский,1992), можно полагать, что такое поведение кривой доза-эффект определяется не случайными флукгуациями, а отражает качественные особенности ответной реакции клетки на облучение в этом диапазоне.

I 0.004-

0.0040.0030.002 0.001 -0.000

0.003-

0.002

0.001

0.000

-fil-

0 10 20 30 40 50 Рис. 1. Частота выхода дицентриков в культуре лимфоцитов человека при действии низких доз ионизирующего излучения. Данные РоМ-ЯиПпд е1 а1.,1983.

По оси абцисс - доза облучения мГр; по оси ординат - число аберраций на 100 клеток

Рис. 2. Частота выхода дицентри-ков в культуре лимфоцитов человека при действии низких доз ионизирующего излучения. Данные Lloyd et al.,1992. По оси абцисс -доза облучения мГр; по оси ординат • число аберраций на 100 клеток

Аналогичные зависимости были получены и на других объектах. На рис.4 представлены данные С.И.Заичкиной с сотр. (1992) о зависимости выхода цитогенетических повреждений у фибробластов китайского хомячка и проростков Vicia faba от дозы у-облуче-ния. Видно, что для этих объектов, принадлежащих к разным царствам живой природы, так же, как и для лимфоцитов человека, характерно наличие плато на дозовой кривой, а различие в значениях доз, при которых происходит изменение характера зависимости обусловлено разной чувствительностью исследуемых объектов к внешнему воздействию. Аналогичная по форме дозовая зависимость была получена нами (см. главу 2) при анализе выхода цитогенетических повреждений в облученных проростках ячменя - тест-системе, сопоставимой по чувствительности с лимфоцитами человека. Сопоставление экспериментальных данных, полученных разными исследователями на разных объектах, позволяет сделать важный вывод о том, что закономерности выхода генетических нарушений в области малых доз характеризуются ярко выраженной нелинейностью и имеют универсальный характер.

Определим, какие же дозы следует считать малыми? Интуитивно ясно, что малая доза - это такая доза, эффект которой еще может быть достоверно зафиксирован с помощью используемых в эксперименте биологических тест-систем. Поскольку определенные таким образом дозы для разных биологических эффектов и тест-систем будут сильно различаться, а само определение не затрагивает природу и механизмы действия низких

уровней радиации, необходим физический критерий, который, задавая минимально возможное количество действующего начала, позволил бы определить малые дозы объективным образом. Такой критерий существует с 1976 г., когда А.М.Келлерер определил малую дозу как дозу, соответствующую одному событию пролета частицы сквозь заданный чувствительный объем.

I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I 1 I ■ I ■ I

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 Рис. 3. Зависимость выхода аберраций Рис. 4. Зависимость цитогенетического хромосом в культуре лимфоцитов че- повреждения фибробластов китайского ловека при облучении низкими дозами, хомячка (1) и проростков конских бобов Данные Севанькаева, Лучника,1977. (2) от дозы у-облучения. Данные Заич-По оси абцисс - доза облучения, сГр; киной и др,1992.

по оси ординат - число аберраций на По оси абцисс - доза облучения, Гр; по 100 клеток оси ординат • число микроядер на 100

клеток

Из определения следует, что во всем диапазоне малых доз от фоновых значений чо его верхней границы, число актов передачи энергии чувствительному объему остается постоянным. Поэтому механизмы формирования ответных реакций клеток едины для всего этого диапазона. В доступной нам литературе нет сведений о биологических эффе-стах, про которые можно с уверенностью заключить, что они индуцируются в клетке одиночным событием поглощения энергии у-кванта. Учитывая также, что генетическая эффективность облучения в этом диапазоне гораздо ниже скорости образования спонтанных ювреждений (Виленчик,1987), можно полагать, что даже увеличение доли клеток, под-зергшихся воздействию, никак не скажется на форме дозовой зависимости, а выход гене-"ических повреждений не будет отличаться от спонтанного уровня.

Для редкоионизирующего излучения и клеток млекопитающих граница диапазона /алых доз по данным разных авторов в зависимости от ЛПЭ лежит в пределах от сотых ;олей до единиц сГр. Превышение этой границы выводит клетки за пределы фонового ;иапазона. С физической точки зрения это означает, что на клетку приходится более од-юго (а, значит, 2, 3 и более) события поглощения энергии излучения. Такое увеличение 1нтенсивности внешнего воздействия уже, по-видимому, не может оставаться незамечен-(ым и должно вызывать ответную реакцию. Действительно, экспериментально показано, гго сопредельные с малыми дозы индуцируют а клетке процессы, приводящие к актива-

ции генома и сопровождающиеся появлением новых генных продуктов, в том числе бел ков, которые в интактных клетках обнаружены не были. Низкодозовое облучение приво дит к триггерному включению экспрессии генов, продукты которых имеют отношение к ре парации ДНК и регуляции клеточного цикла (Воо^тап е\. а1.,1993).

В основе ответной реакции клетки на облучение в этом диапазоне, который, п< данным (Филиппович,1991; Спитковский,1992) для клеток млекопитающих простираете) от десятых долей до 10 сГр, лежит активация системы адаптивного ответа, результате!, функционирования которой является снижение выхода мутаций (Жестяников,1985) Твердо установленная (БЬасИеу,У\Лепске, 1989) зависимость индукции и степени выражен ности адаптивного ответа от мощности дозы является серьезным аргументом в польз; того, что эта реакция активируется за пределом диапазона малых доз. Существование нижнего порога доз, инициирующих реакцию адаптивного ответа, было показано недавн< (1кизНта,1989) в прямом эксперименте. Именно функционированием репарационных си стем адаптивного ответа может быть объяснено экспериментально наблюдаемое иногдг (РоМ-ЯиПпд а1.,1983; Митрофанов, 1994) в этом диапазоне снижение выхода генетичес ких повреждений. Необходимо отметить, что такая ответная реакция не является специ фичной для облучения и может быть индуцирована самыми разными внешними воздей степями, в том числе и не способными по своей природе вызывать нарушения первичное структуры ДНК (дефицит по витамину Е, статическое и переменное электромагнитное по ле, нейтральные соли, тепловой шок и т.д.) (Ре!пеп<1едеп е1 а1.,1988; Спитковский,1992).

Дальнейшее увеличение интенсивности внешнего воздействия приводит к триггер ному переключению клетки в иной режим функционирования, для которого характереь повышенный выход генетических повреждений. При интерпретации этого участка дозо вой зависимости следует иметь в виду, что ионизирующее излучение способно индуцирО' вать в клетке несколько различных репарационных систем. При этом, в отличие от систем адаптивного ответа и конститутивной репликативной репарации, имеющих антимутагенный характер, репрессированная в нормальных условиях система БОБ-ответа обеспечивает восстановление жизнеспособности клеток ценой повышенного выхода генетических повреждений (Жестяников,1985; Льюин,1987). О различии пусковых механизмов систем адаптивного и БОЭ-ответа свидетельствуют результаты работы (Спитковский к др., 1994), в которой показано, что облучение лимфоцитов дозой 2-3 сГр инициирует перестройку структуры хроматина, необходимую для изменения активности генов, специфичных для адаптивного ответа, а дозой 10 сГр - конденсацию хроматина и активацию репарационных систем, отличных от адаптивного ответа. В области относительно малых доз, когда вклад излучения в индукцию первичных повреждений молекул ДНК невелик, инициация мутагенной ветви репарации должна приводить к увеличению выхода генетических повреждений. Регистрируемое в этом диапазоне плато на дозовой зависимости служит своеобразным маркером перехода облученных клеток в качественно иной режим функционирования. Репарационную природу плато подтверждают эксперименты, в ходе которых показано (Заичкина и др.,1992), что использование ингибитора репарации кофеина приводит к исчезновению дозонезависимого участка. Для лимфоцитов человека фа-

ницы плато лежат в пределах 10-50 сГр (Севанькаев,1991; Спитковский,1992), фибробла-стов китайского хомячка - 50-100 сГр (Заичкина и др., 1992), эритроцитов костного мозга мышей - 20-35 сГр (Заичкина и др.,1998), проростков Vicia faba - 30-100 сГр (Заичкина и др.,1992), проростков ячменя - 5-50 сГр (наши данные, см. главу 2).

Отметим, что столь сложный, нелинейный характер дозовой зависимости наблюдается на фоне монотонного роста числа индуцируемых ионизирующим излучением первичных повреждений молекул ДНК (в пределах экспериментально регистрируемого на лимфоцитах человека плато среднее число треков на клеточное ядро изменяется с 32 до 158 (Гофман, 1994)). Поэтому выход цитогенетических повреждений в этих условиях определяется не внешним воздействием (индукция первичных повреждений квантами излучения), а режимом функционирования клетки. В пользу того, что наблюдаемые в области малых доз генетические эффекты обусловлены не столько повреждающим действием ионизирующего излучения либо иных агентов физической или химической природы, сколько особенностями реализации ответной реакции клетки на слабые внешние воздействия, свидетельствует установленное в (Спитковский и др.,1994) снижение активности систем репарации с увеличением дозы облучения, а, значит, и числа индуцируемых излучением первичных повреждений на участке между дозами, инициирующими активность адаптивного и SOS-ответа. Сходные закономерности наблюдали и мы (Geraskin et al.,1997) при анализе зависимости интенсивности репарационных процессов от дозы у проростков ячменя. И, наконец, последний участок дозовой зависимости обусловлен переходом клетки в аварийный режим работы, когда мощности систем репарации оказывается недостаточно для эффективного устранения индуцируемых внешним фактором повреждений молекул ДНК. При этом приращение отклика следует за увеличением интенсивности воздействия индуцирующих повреждения факторов, т.е. кривая доза-эффект в этом диапазоне является монотонно возрастающей.

Т.о., наблюдаемые в области малых и сопредельных с ними доз биологические эффекты являются результатом сложной цепочки событий, пусковым механизмом которых является взаимодействие квантов ионизирующего излучения с компонентами клетки, а результатом - перестройка режима ее функционирования. Поэтому для корректной интерпретации этих явлений необходимо ясное понимание молекулярно-клеточных механизмов формирования ответной реакции клетки на облучение в малых дозах.

Один из возможных механизмов переключения клеток в новый режим функционирования связан с индуцированными малыми дозами изменениями в структуре хроматина (Спитковский, 1992). Поскольку хроматин может принимать фиксированное число конфор-мационных состояний, такие скоординированные преобразования пространственной структуры не могут не приводить к изменению модели генной экспрессии. При этом каждому стационарному состоянию соответствует свой спектр транскрибируемых генов. Каков же пусковой механизм такого переключения? Основой процесса самоорганизации хроматина являются слабые взаимодействия его базовых структурных компонентов -элементов фибриллы ДНП. Такие взаимодействия эффективны, если заряды на макроионах в основном подавлены, что и имеет место в нормально функционирующей клетке

(Спитковский и др.,1992). Вместе с тем даже небольшое изменение числа низкомолеку лярных противоионов критично для процессов нейтрализации и, тем самым, для конфор мации определенных участков хроматина. Изменение количества и качества низкомоле кулярных противоионов в клетке определяется процессами активного и пассивного и: транспорта через мембраны. Поэтому изменение проницаемости мембран может явитьа инициирующим событием, обуславливающим переход хроматина в новое стационарно! состояние с включением соответствующей генетической программы. То, что облучение I относительно малых дозах (5-10 сГр) приводит к качественной реорганизации процессо! пассивного и активного транспорта ионов через мембраны, продемонстрировано в пря мом эксперименте (Гераськин и др.,1993). В другой серии экспериментальных рабо' (Талызина, Спитковский,1991) показано, что на облучение в малых дозах лимфоциты от вечают изменением внутриядерной организации, выражающейся в кооперативных пере стройках структуры хроматина. Причем в диапазоне 0-50 сГр выявлено два интервала (2 3 и 15-20 сГр), в которых структурные преобразования хроматина качественно различны.

Триггерный, пороговый характер реакции клетки на облучение может быть такж< связан с индуцированной внешним воздействием дупликативной транспозицией мобиль ных генетических элементов (МГЭ), которые представляют собой подвижную часть эука риотического генома и составляют (по данным, полученным на ОгоэорМа те!аподаз(ег (Васильева и др.,1997) до 10% его величины. МГЭ выполняют в геноме роль оператив ных систем управления. Стрессовая индукция транспозиций МГЭ осуществляется чере: молекулярные механизмы системы теплового шока. Причем сравнительный анализ спек тров транспозиций (Васильева и др.,1997), индуцированных тепловым шоком, 7-излуче тем и изогенезацией, выявил их сходство, что свидетельствует о единстве молекуляр ных механизмов, обеспечивающих выбор сайтов-мишеней, доступных для транспозици онных инсерций. Генетический анализ показал (Ратнер,Васильева,1992), что МГЭ содер жат мотивы знаков пунктуации и управления основных генетических процессов - транс крипции, репликации, рекомбинации, процессинга и т.д., поэтому массовое и скоордини рованное внедрение МГЭ в регуляторные зоны генов способно кардинально и быстро из менить модель генной экспрессии.

Важным свойством многих классов МГЭ является существование у них регулятор ных сайтов, реагирующих на изменения окружающей (внутриклеточной) среды. Наличие таких сайтов позволяет существенно изменять интенсивность молекулярно-генетически; процессов в условиях экстремального воздействия. Фактически транспозиция МГЭ может быть вызвана любым стрессовым фактором, увеличивающим концентрацию дефектны; глобулярных белков в клетке. В этом смысле МГЭ являются своеобразными внутриклето чными рецепторами, обеспечивающими формирование адекватной ответной реакцм клетки на внешнее воздействие. К сожалению сведения о закономерностях индукци!-транспозиций МГЭ ионизирующим излучением весьма ограничены - обычно в исследова ниях такого рода использовались другие стрессовые воздействия (тепловой шок, дисген ное скрещивание и др.), что не позволяет нам уверенно оценить диапазон доз, иницииру ющих массовую транспозицию МГЭ. В то же время косвенные данные позволяют предпо

ложить, что массовая транспозиция МГЭ происходит при облучении в дозах, инициирующих перестройку клетки для вОв-ответа, поскольку основной механизм исключения и встраивания транспозонов предусматривает (Льюин,1987) участие гес-А зависимой системы рекомбинации. В (Спитковский и др.,1994) было показано, что облучение лимфоцитов дозой, активирующей системы репарации, отличные от адаптивного ответа, сопровождается качественной реорганизацией конформационной структуры хроматина, одним из следствий которой является исчезновение многих корреляций между структурными элементами хроматина, характерных для нативного клеточного ядра. Одной из возможных причин столь существенных изменений в ядре клетки может служить индуцированная облучением дупликативная транспозиция МГЭ. С учетом мощного регуляторного потенциала МГЭ и наличия у них сайтов, реагирующих на изменения внутриклеточной среды, становятся гораздо более понятными механизмы той весьма существенной перестройки работы клетки, которой сопровождается переход ее в режим БОЗ-ответа.

Чтобы представить всю грандиозность происходящих при этом изменений, необходимо подчеркнуть, что переход клетки в режим вОв-ответа отнюдь не сводится лишь к индукции вОв-репарации, как бы ни был важен ее вклад в обеспечение жизнеспособности. Клетка реагирует на слабые воздействия внешних факторов как единая сложная иерархически организованная система. Прекрасной иллюстрацией этого положения служит работа (Инге-Вечтомов и др.,1994), в которой показано существование у эукариот специальной системы ЗОЭ-трансляции, включение которой в неблагоприятных условиях существования позволяет проводить синтез белка хотя и менее точно, зато более экономно (без затраты дополнительных молекул ГТФ на рибосомальную коррекцию). С учетом предложенного С.Г.Инге-Вечтомовым (1976) принципа поливариантности матричных процессов, следует ожидать в ближайшем будущем обнаружения БОБ-вариантов и других основных матричных генетических процессов, которые в совокупности являются компонентами единого ответа клетки на неблагоприятные внешние воздействия.

Предпринятый анализ экспериментально наблюдаемых реакций клетки на низко-дозовое облучение и возможных молекулярно-клеточных механизмов их формирования позволяет сделать ряд выводов как фундаментального (биологический смысл и эволюционное значение сложного, нелинейного характера ответной реакции клетки на слабое внешнее воздействие), так и прикладного характера (биологическая дозиметрия, генетический риск низкодозового облучения).

Биологический смысл и эволюционное значение сложной, нелинейной ответной реакции клетки на слабое внешнее воздействие. Поскольку закономерности выхода индуцированных структурных мутаций являются отражением определенных принципов организации и функционирования эукариотического генома, наблюдаемая в эксперименте повышенная чувствительность клеток к слабым воздействиям ряда физических и химических агентов представляется очень странной с учетом присущей эукариотам (Сарапульцев, Гераськин,1993) высокой надежности генетического аппарата. Подобная неустойчивость по отношению к слабым возмущениям параметров среды, являясь следствием принципиальной нелинейности ответной реакции клетки, может стать важнейшим

источником наследственной изменчивости. С этих позиций наблюдаемое а эксперименте плато на дозовой зависимости служит своеобразным маркером перехода популяции клеток в динамическое состояние, когда в огромной степени возрастает ее адаптивный потенциал, позволяя во многих случаях приспособиться к новым, непривычным условиям существования.

Впервые на этот аспект проблемы обратил внимание Д.М.Спитковский (1994), постулировавший, что такая реакция характерна для малой чувствительной субпопуляции клеток и является эволюционно закрепленным способом увеличения генетической изменчивости. Нам представляется (Гераськин,1995), что такая реакция присуща всем клеткам, подвергнутым воздействию в этом диапазоне. Но в любом случае аномальнс высокая с точки зрения надежности их генома чувствительность клеток к слабым внешним воздействиям оказалась серьезным эволюционным преимуществом, поскольку дала возможность менять в зависимости от интенсивности внешнего воздействия адаптивную стратегию, а, значит, адекватно отвечать на изменение условий внешней среды.

Анализируемый феномен был бы интересен и сам по себе, однако ряд данны> (Акифьев идр.,1996; Спитковский и др.,1994) позволяет заключить, что проблема гораздо шире, поскольку аберрации хромосом являются лишь эпифеноменом глобальных структурных и функциональных перестроек генома, индуцированных слабым внешним воздействием. Особо в этом контексте следует отметить способность острого или хронического облучения в относительно малых дозах индуцировать реплицирующуюся в поколениях нестабильность генома (Бычковская,1986; Дубинин, 1978; Пелевина и др.,1996). Подробнее эти вопросы будут рассмотрены в главе II, однако здесь для нас важно само наличие в клетке системы восприятия стрессовых сигналов из внешней среды, которая запускает вспышки наследственной изменчивости в критические периоды эволюции популяций.

Эволюционные преимущества такой стратегии очевидны - повышенная генетическая изменчивость способствует ускорению поиска обладающих селективным преимуществом в новых условиях существования генотипов и сдвигу популяционного среднего в сторону повышения устойчивости к действующему фактору. С этих позиций индуцируемая низкодозовым облучением дестабилизация генома является механизмом перехода от стабилизирующего отбора к направленному. О том, что именно такая стратегия выхода из критических ситуаций характерна для живого мира, свидетельствуют данные палеонтологии (Красилов.1986) о резком увеличении числа макромутантов и всевозможных уродцев в эпохи биосферных кризисов. Результаты изучения генетических последствий антропогенных катастроф (Кальченко и др.,1995; Пелевина и др.,1994; Позолотина,1996; Шевченко и др.,1992,1996) также свидетельствуют о увеличении размаха генетической изменчивости в подвергшихся воздействию популяциях. В популяциях растений и животных, находящихся в условиях надфонового облучения, обнаружены (Кальченко и др.,1995; В1ау!оск е! а!.,1996) различия между наблюдаемыми и ожидаемыми исходя из закона Харди-Вайнберга численностями генотипов и повышенная гетерозиготность, причем изменение генетической структуры происходит за счет увеличения частоты редко встречающихся аллелей.

Резкие изменения окружающей среды, помимо формирования новых экологических ниш, являются пусковым механизмом экспрессии молчащей генетической информации. Именно способность диплоидных клеток аккумулировать под покровом адаптивной нормы (дикого типа) скрытую (не проявляющуюся в фенотипе) генетическую изменчивость, дающую широкий спектр фенотипов при выходе ситуации за рамки исторически типичной могла послужить одной из причин (помимо указанных нами ранее (Сарапульцев, Герась-кин, 1993)) смены в ходе эволюции гаплоидной формы организации генома на диплоидную. С этой точки зрения "генетический груз" в виде плейотропных рецессивных мутаций в диплоидном эукариотическом геноме способен играть важную роль в биологической эволюции.

Принципиальная нелинейность ответной реакции клетки позволяет в силу ее универсального (в отношении объектов воздействия) и неспецифического (в отношении действующего фактора) характера объяснить неравномерность темпов эволюционного процесса и понять, по чему именно для эпох биосферных кризисов характерно его резкое ускорение. Проведенный анализ позволяет выделить по крайней мере две адаптивных стратегии, определяющие ответную реакцию клетки на внешнее воздействие - "пассивная" и "активная". "Пассивная"'стратегия направлена на поддержание динамического равновесия испытавшей воздействие клетки и заключается в активации систем адаптивного ответа. При этом изменение внешних условий в определенном диапазоне компенсируется внутренними возможностями клетки. "Активная" стратегия, наряду с выполнением функций по поддержанию динамического равновесия генетических структур, создает предпосылки к увеличению пула изменчивости в подвергшейся воздействию популяции клеток и заключается в активации мутагенных систем БОЭ-ответа, а также дупликативной транспозиции МГЭ. (Способность низкодозового облучения приводить к массовым транспозициям МГЭ была недавно (1997) экспериментально продемонстрирована В.Г.Зайнул-линым). Такое опосредуемое внешними факторами переключение стратегий поведения создает генетические предпосылки перехода от стабилизирующего отбора к направленному. С этих позиций нелинейность дозовой зависимости является математическим выражением способности клетки осуществлять выбор между этими стратегиями в зависимости от интенсивности внешнего воздействия.

Наличие в клетке системы восприятия стрессовых сигналов из внешней среды, инициирующей вспышки наследственной изменчивости в критические периоды эволюции популяций, позволяет снять противоречие между чрезвычайно высокой надежностью генома эукариотических клеток (Сарапульцев, Гераськин,1993) и необходимостью увеличения генетической изменчивости при выходе ситуации за рамки исторически типичной. Именно сочетание функционирования мутагенных систем БОЗ-ответа с дупликативной транспозицией МГЭ создает благоприятные предпосылки для быстрой адаптации популяции к новым условиям существования. Описанное в (Гвоздев,Кайданов,1986) явление скоординированных транспозиций МГЭ, коррелирующих с резким изменением приспособленности, свидетельствует в пользу существования отличного от предполагаемого в рамках СТЭ постепенного накопления точковых мутаций и гораздо более эффективного мо-

пекулярного механизма, обеспечивающего быстрое увеличение приспособленности. Благодаря системе адаптивных транспозиций направленно изменяется функциональная организация целого ряда районов генома, обеспечивая благоприятный генетический фон, на котором, в условиях скачкообразного увеличения приспособленности, будут возникать, закрепляться и распространяться в популяции новые генетические варианты, индуцированные в ходе функционирования систем БОБ-ответа. При этом геномы высших эу-кариот, состоящие из протяженных участков нетранскрибируемой ДНК и относитепьно небольших экзонов, представляют благодатную почву для интеграции и исключения МГЭ. Поскольку паттерны инсерции МГЭ распределены по геному неслучайным образом и расположены, как правило, в области сателлитной ДНК (Ратнер,Васильева,1994), можно ожидать, что возникающие при транспозициях изменения генома окажут влияние главным образом на экспрессию генов. Как знать, может быть именно те широкие возможности увеличения эволюционной пластичности, которые придает геному присутствие в нем МГЭ и сателлитной ДНК и является их основным предназначением? С этих позиций наличие в геноме протяженных участков нетранскрибируемой ДНК и различных классов МГЭ воспринимается уже не с позиций паразитизма на генетическом уровне, а оправдывается той важнейшей ролью, которую они играют в биологической эволюции.

В отношении биологической дозиметрии. Проведенный анализ со всей очевидностью демонстрирует неправомерность линейной экстраполяции наблюдаемых при дозах выше 50 сГр эффектов в область более низких доз. Поскольку выход цитогенетических повреждений в этом диапазоне подчиняется немонотонному закону с дозонезависимым участком, их частота в этом, наиболее важном с точки зрения практических приложений случае, не может быть использована в качестве биологического дозиметра для оценки индивидуальных доз. К сходным выводам, основываясь на собственных экспериментальных данных, пришли и другие исследователи (Севанькаев и др. ,1994). Вместе с тем поскольку повышенный выход аберраций хромосом служит мерой общей дестабилизации генома, основанные на частоте цитогенетических повреждений показатели информативны и имеют важнейшее значение при выделении групп риска в отношении отдаленных последствий облучения (диапазон малых доз и адаптивного ответа - отсутствие дополнительного риска, диапазон БОБ-ответа - зона повышенного риска, диапазон "аварийного" ответа - монотонное увеличение риска с дозой).

В отношении оценки канцерогенного риска. Низкодозовое облучение не вызывает отклонений от физиологической нормы на уровне организма и всех его систем и не порождает в тканях компенсирующих репопуляционных процессов (Филюшкин и др.,1989). Поэтому канцерогенное действие низкодозового облучения сводится к индукции прекан-церогенных эффектов в отдельных клетках в соответствии с обоснованной нами формой дозовой зависимости. Несмотря на многостадийный характер канцерогенеза и важнейшую роль, которую играют в его реализации имунная и другие системы организменного уровня, надлинейная форма кривой доза-частота канцерогенеза, порожденная нелинейной реакцией на облучение клеток, явно следует (Гофман, 1994) из результатов трех последовательных серий обследования лиц, переживших атомную бомбардировку (1950-

1974; 1950-1978; 1950-1982). Причем зависимость доза-эффект в этом, наиболее надежном эпидемиологическом исследовании влияния облучения в малых дозах на выход раковых заболеваний, оказывается надлинейной независимо от способа оценки данных - в различных дозиметрических системах (T65DR или DS86), при исследовании мужчин и женщин вместе и раздельно, при оценке смертности от рака на 10000 человек или на 10000 человеко-лет. Интересно отметить, что первое достоверное превышение выхода раковых заболеваний по сравнению с контролем обнаружено (Гофман,1994) при средней дозе облучения всего организма 11 сЗв (или 15 сЗв в системе DS86), что находится в удивительно хорошем соответствии с обсуждавшимися выше результатами, полученными на лимфоцитах человека в экспериментах in vitro (Севанькаев,1991; Спитков-ский,1992) и при цитогенетическом обследовании населения радиоактивно загрязненных в результате аварии на ЧАЭС районов Брянской области (Севанькаев и др., 1995).

Нежелание признать надлинейный характер зависимости доза-эффект приводит к существенной недооценке канцерогенного риска, если для оценки опасности низкодозо-вого облучения используются высокие дозы и линейная зависимость доза-эффект. Этот вывод находится в резком противоречии с убеждением многих экспертов в том, что линейная экстраполяция с высоких доз является консервативной оценкой и способна лишь завышать оценку риска в диапазоне малых. Из представленных результатов следует неправомерность использования линейной беспороговой концепции для оценки генетического и канцерогенного риска низкодозового облучения, как не имеющей прочного биологического обоснования и вступающей в противоречие с имеющимися экспериментальными (Lefrankois et al.,1989; 0ftendal,1990) и эпидемиологическими (Гофман,1994; Wei et al., 1990) данными. В зависимости от участка дозовой кривой при основанной на ЛБК оценке возможно как завышение (диапазоны малых доз и адаптивного ответа), так и занижение (диапазон SOS-ответа) реального генетического риска. Для вытекающей из наших теоретических рассмотрений и подтверждаемой экспериментальными и наиболее надежными эпидемиологическими данными нелинейной формы дозовой зависимости лишаются смысла и все основанные на ЛБК расчетные показатели - коллективная доза как мера риска для контингента лиц (люди с индивидуальной дозой вплоть до верхней границы зоны адаптивного ответа не увеличивают, а, может быть даже уменьшают (Кеирим-Маркус,1995) коллективный риск). По той же причине становится непригодной эффективная доза как мера общего риска для человека от облучения отдельных органов разной дозой. Требуется внести существенные коррективы и в расчеты эффективности мероприятий по методике "затраты-выгода". Наличие на дозовой кривой достаточно протяженного участка, в пределах которого доза изменяется в несколько раз, а индуцируемый эффект остается практически постоянным, делает необходимым рассмотрение других, экономически более целесообразных и обеспечивающих больший выигрыш для здоровья людей и состояния окружающей среды альтернатив.

1.2. Формулировка концепции биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки. Проведенный анализ позволяет нам акцентировать внимание на ряде принципиальных особенностей, определяющих основные черты ответной реакции клетки на воздействие малых доз ионизирующего излучения и некоторых других факторов физической, химической и биологической природы:

1. В основе ответной реакции клетки на облучение в низких дозах и слабые внешние воздействия некоторых других факторов лежат фундаментальные эволюционно консервативные механизмы обеспечения устойчивости живых систем и возможности их адаптации к изменяющимся условиям внешней среды.

2. Наблюдаемые в области малых и сопредельных с ними доз генетические эффекты обусловлены не столько повреждающим действием ионизирующего излучения либо иных факторов физической или химической природы, сколько особенностями реализации ответной реакции клетки на слабое внешнее воздействие и являются результатом развертывания во времени генетической программы, выбор конкретного варианта которой определяется интенсивностью и характером внешнего воздействия.

3. Закономерности выхода генетических нарушений в области малых доз характеризуются ярко выраженной нелинейностью и имеют универсальный характер, различаясь для разных объектов значениями доз, при которых происходит изменение характера зависимости и которые определяются их чувствительностью к внешним воздействиям.

4. В зависимости от интенсивности внешнего воздействия существует четыре качественно различных типа ответной реакции клетки и соответствующие им участки кривой доза-зффект. При увеличении дозы от фоновых значений до предела, ограничивающего диапазон малых доз, дозозависимой величиной является число подвергшихся воздействию клеток, а не среднее число повреждений в каждой клетке, которое в этом диапазоне не зависит от дозы. Поэтому механизмы формирования ответных реакций клеток едины для всего диапазона малых доз, а выход генетических повреждений не будет отличаться от спонтанного уровня. Превышение предела, ограничивающего диапазон малых доз, активирует в клетке зависящую от мощности дозы реакцию адаптивного ответа. Именно функционированием репарационных систем адаптивного ответа может быть объяснено наблюдаемое в этом дозовом диапазоне уменьшение выхода генетических повреждений. Дальнейшее увеличение интенсивности внешнего воздействия приводит к триггерному переключению клетки в иной режим функционирования, для которого характерен повышенный выход генетических повреждений, обусловленный работой систем БОБ-ответа. Регистрируемое в этом диапазоне плато на доэовой зависимости служит своеобразным маркером перехода облученных клеток в качественно иной режим функционирования. Последний участок дозовой зависимости обусловлен переходом клетки в аварийный режим работы, когда мощности систем репарации оказывается недостаточно для эффективного устранения индуцируемых внешним фактором повреждений молекул ДНК. При этом приращение отклика следует за увеличением интенсивности воздействия индуциру-

ющих повреждения факторов, т.е. кривая доза-эффект в этом диапазоне является монотонно возрастающей.

5. Принципиальная нелинейность ответной реакции клетки на слабые внешние воздействия позволяет в силу ее универсального (в отношении объектов воздействия) и неспецифического (в отношении действующего фактора) характера, объяснить неравномерность темпов эволюционного процесса и понять, почему именно для эпох биосферных кризисов характерно его резкое ускорение. Проведенный анализ позволяет выделить по крайней мере две адаптивные стратегии, определяющие ответную реакцию клетки на внешнее воздействие. "Пассивная" стратегия направлена на поддержание динамического равновесия испытавшей воздействие клетки и заключается в активации систем адаптивного ответа. При этом изменение внешних условий в определенном диапазоне компенсируется внутренними возможностями клетки. "Активная" стратегия, наряду с выполнением функций по поддержанию динамического равновесия генетических структур, создает предпосылки к увеличению пула изменчивости в подвергшейся воздействию популяции клеток и заключается в активации мутагенных систем БОБ-ответа, а также дуп-ликативной транспозиции МГЭ. Такое опосредуемое внешними факторами переключение стратегий поведения создает генетические предпосылки перехода от стабилизирующего отбора к направленному. С этих позиций нелинейность дозовой зависимости является математическим выражением способности клетки осуществлять выбор между этими стратегиями в зависимости от интенсивности внешнего воздействия.

Таким образом, в рамках развиваемой концепции находят свое объяснение имеющиеся в нашем распоряжении факты о закономерностях индукции генетических эффектов малыми дозами ионизирующих излучений, а именно:

-принципиальное различие биологических эффектов, индуцируемых облучением в больших и малых дозах;

-малая величина дозы, вызывающей вскоре после облучения увеличение метаболической активности в клетках разного типа;

-нелинейность формы дозовой зависимости; -существование нижнего порога эффектов по дозе; -зависимость эффекта от мощности дозы;

-неслецифичность в отношении природы инициирующих агентов, в т.ч. нерадиационных и негенотоксических.

Неспецифический характер закономерностей и широкий спектр объектов, на которых они наблюдаются, свидетельствует о том, что мы имеем дело с общебиологическим феноменом. В основе этого типа реакций клеток лежат фундаментальные механизмы, появившиеся задолго до дифференциации высших многоклеточных организмов и отражающие эволюционно закрепленный комплекс адаптивных реакций клетки на внешнее воздействие. Так же, как открытое радиобиологами явление репарации молекул ДНК переросло масштабы этой науки и имеет несомненное общебиологическое значение, так и установленные в радиобиологических исследованиях закономерности биологического действия малых доз ионизирующего излучения имеют общебиологический характер как

отражение фундаментальных механизмов обеспечения устойчивости живых систем и возможности их адаптации к изменяющимся условиям внешней среды. Такой подход к пониманию механизмов и биологической сущности выявленного в радиобиологических экспериментах феномена качественно различной реакции клетки на облучение в больших и малых дозах открывает новые возможности исследования адаптивных реакций клеток на внешнее воздействие и позволяет с иных позиций оценить место радиобиологии в системе естественных наук.

Глава II. ВЕРИФИКАЦИЯ КОНЦЕПЦИИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА КЛЕТКИ

2.1. Анализ феномена индуцированной нестабильности генома. Одним из наиболее интригующих и до конца не познанных феноменов в радиобиологии несомненно является индукция как хроническим, так и острым облучением в относительно малых дозах наследуемой дестабилизации генетических структур. Именно эта особенность ответной реакции клетки на низкодозовое облучение (в совокупности с рассмотренными в предыдущей главе эффектами в подвергшихся непосредственному воздействию клетках) определяет специфичность биологического действия малых доз. В исследованиях разных авторов на разных объектах было обнаружено явление "памяти" в ряду поколений об однократном (остром или хроническом) воздействии на клетку факторов разной природы, в том числе и не способных вызывать нарушения первичной структуры ДНК. Конкретные проявления этого феномена могут быть различны и касаться частоты гибели клеток (Бычковская,1986), индукции генных и хромосомных мутаций (Дубинин,1978; Жлоба, Севанькаев,1991; Сидоров, 1992), формирования нестабильных по морфологии колоний (Корогодин и др., 1977; Надсон,Филлипов,1925). колониеобразующей способности и числа клеток с микроядрами (Тапонайнен и др., 1987), продолжительности жизни (Измайлов и др., 1990) или трансзиготного синергизма (увеличения канцерогенного риска в потомстве облученных организмов) (Москалев,1991; Gardner et al.,1990).

Если сформулированные в главе I представления о эволюционном значении сложного, нелинейного характера ответной реакции клетки на слабое внешнее воздействие верны, то форма дозовой зависимости в отношении индукции наследуемой генетической нестабильности должна подчиняться тем же закономерностям, что и в отношении выхода цитогенетических повреждений, а именно - диапазон малых доз и адаптивного ответа -отсутствие феномена; диапазон SOS-ответа - повышенный, достоверно отличающийся от контроля и практически не зависящий от дозы уровень генетической нестабильности; диапазон "аварийного" ответа - монотоннное увеличение уровня генетической нестабильности с дозой.

Ответ на вопрос о характере дозовой зависимости был получен в исследованиях И.Б.Бычковской (1986) с большой тщательностью выполненных на одноклеточных организмах (амебы, инфузории, дрожжи, водоросли). Амеб облучали в широком диапазоне доз, при этом использовали не только летальные или близкие к ним дозы (LD» для

Amoeba proteus штамм С составляет 1700 Гр), вызывающие у амеб репродуктивную гибель и летальное секторирование, но и относительно малые, отличающиеся от летальных в десятки и сотни раз. Полученные И.Б.Бычковской зависимости время-эффект при разных дозах позволили нам построить кривые выживаемости на разные сроки после облучения амеб (рис.5).

Рис.5. Дозо-вые зависимости гибели индивидуальных линий Amoeba proteus в ряду поколений: 1 -на 10-е, 2 - на 30-е и 3 - на 50-е сутки

\а

III

i I I 34 5

—1-1-1—

100 200 <00

100S 2000

Доза облучении, Гр

Видно, что форма кривой доза-эффект инвариантна относительно времени, прошедшего после облучения, и характеризуется ярко выраженной нелинейностью. При этом четко выявляются три принципиально различающиеся по закономерностям выживания амеб диапазона доз: менее 4 Гр, 5-400 Гр и более 400 Гр. В диапазоне относительно малых (менее 4 Гр) доз частота гибели независимо от срока регистрации достоверно не отличается от контрольного уровня. Увеличение дозы с 4 до 5 Гр приводит к резкому (примерно 8-кратному относительно контроля) повышению частоты гибели амеб. Наблюдаемый экспериментально эффект сальтационного перехода линий амеб на другой уровень генетической изменчивости при минимальном изменении дозы представляет с нашей точки зрения исключительный интерес. Дальнейшее увеличение дозы в широком диапазоне (5-400 Гр) не приводит к изменению частоты гибели амеб, т.е. здесь наблюдается ярко выраженное плато. Верхний предел доз, индуцирующих стабильное наследственное повышение частоты гибели клеток, не ограничивается 400 Гр. При более высоких дозах это явление также имеет место, но маскируется увеличением числа зависящих от дозы нарушений. Аналогичные результаты были получены и при анализе выживаемости в ряду поколений других объектов, различия заключаются лишь в величине эффективной дозы и частоты гибели. И.Б.Бычковской (1986) было показано, что возобновление пула клеток на любом этапе эксперимента дает потомство, характеризующееся одной и той же частотой гибели, т.е. индуцированные однократным облучением наследственные изменения затрагивают практически все клетки популяции.

Хотя в настоящее время нет ясного понимания механизмов, ответственных за формирование отдаленных генетических эффектов, накопленных знаний достаточно для создания вероятностной модели, способной на феноменологическом уровне описывать процессы пострадиационной дестабилизации генома в ряду поколений и оценивать на этой основе отдаленные последствия облучения. Выбранный класс моделей отражает наше сегодняшнее понимание природы моделируемого явления. Подробное описание модели, а также методов ее параметризации, выбора структуры и проверки адекватности представлено в специальной публикации (Гераськин,Сарапульцев,1995). На рис.6 представлены эмпирическая и расчитанная по модели интегральные функции распределения времени жизни индивидуальных линий амеб при облучении в дозе 10 Гр. Анализ рис.6 и значений количественных критериев, предназначенных для сравнения близости эмпирических и расчетных кривых, свидетельствует о хорошем совпадении экспериментальных данных с расчетами по модели. Аналогичные результаты получены и для других доз облучения.

Рис.6. Эмпирическая (пунктирная кривая) и рассчитанная по модели (сплошная кривая) интегральные функции распределения времени жизни индивидуальных линий Amoeba proteus при облучении в дозе

Число ммт«м» 10 Гр

В целом, предпринятый анализ имеющихся экспериментальных данных о индукции реплицирующейся нестабильности генома у организмов, принадлежащих к разным царствам живого мира, свидетельствует о том, что они не противоречат сформулированным в главе I представлениям о закономерностях биологического действия низкодозового облучения и их эволюционным следствиям, а построенная на основе вытекающих из предложенной нами концепции постулатах стохастическая модель адекватно описывает анализируемый феномен и может быть использована для оценки отдаленных генетических последствий радиационного воздействия. Именно проанализированный в настоящем разделе феномен (наряду с рассмотренными в главе I эффектами в подвергшихся непосредственному воздействию клетках) определяет специфичность и эволюционное значение биологического действия малых доз. В отличие от облучения в достаточно высоких дозах, когда биологический эффект монотонно зависит от поглощенной дозы и полностью определяется ее величиной, наблюдаемые в области малых и сопредельных с ними доз биологические эффекты обусловлены не столько повреждающим действием ионизирующего излучения, сколько особенностями реализации ответной реакции клетки на слабое внешнее воздействие и являются результатом изменения модели генной экспрессии. Поэтому любая экстраполяция биологических эффектов из области относительно больших доз в область мальос не имеет под собой биологического обоснования и, следова-

тельно, некорректна. Рассмотренный в настоящем разделе феномен реплицирующейся в поколениях дестабилизации генома делает это различие наиболее наглядным, поскольку, в отличие от облучения в относительно больших дозах, эффекты которых проявляются главным образом в подвергшихся непосредственному воздействию клетках, а их величина монотонно зависит от дозы, частота наблюдаемых в области относительно малых доз биологических эффектов нелинейно зависит от дозы, а их реализация происходит в ряду потомков облученной клетки.

2.2. Верификация концепции на данных об индукции ионизирующим излучением цитогенетических повреждений у сельскохозяйственных растений. Одним из следствий изложенной в главе I концепции биологического действия ионизирующего излучения на клетки является утверждение о нелинейном и универсальном характере зависимости выхода цитогенетических повреждений в диапазоне малых доз. Наиболее полные данные о форме дозовой зависимости в области малых доз были получены на лимфоцитах человека и именно на них мы опирались главным образом при построении своей концепции. Целью настоящего раздела является экспериментальная проверка следствий концепции на независимом материале - насколько нам известно, эксперименты по восстановлению формы дозовой зависимости в диапазоне малых доз на семенах и проростках сельскохозяйственных растений никогда не проводились.

2.2.1. Закономерности индукции структурных мутаций в корневой меристеме облученных семян гексаплоидной пшеницы. Поскольку семена более радиорезистентны по сравнению с вегетируюицими растениями или лимфоцитами периферической крови человека, область малых доз сдвигается для них в сторону больших абсолютных значений поглощенной дозы, что делает их удобным в методическом плане объектом. Воздушно-сухие семена яровой пшеницы облучали у-квантами "'Со. При выборе дозово-го диапазона принималось во внимание, что покоящиеся семена - наиболее радиорезистентная фаза онтогенеза высших растений. Так, для класса Однодольные (типичным представителем которых являются злаки) радиорезистентность в фазе покоящихся семян в 4.8-5.5 раз выше, чем в фазе вегетации (Сарапульцев,Гераськин,1993). Спустя 24 часа после облучения семена проращивали в чашках Петри. Генотоксичность оценивали по выходу структурных мутаций, для чего образцы по 20-40 корешков на вариант, достигших длины 5-10 мм, фиксировали в ацетоуксусном спирте (3:1). Временные давленые препараты готовили из апикальной меристемы главного корня и окрашивали ацетоорсеи-ном. В каждом препарате анализировали все ана-телофазные клетки и учитывали долю клеток с аберрациями хромосом.

При планировании эксперимента и интерпретации данных применялась разработанная нами (Гераськин и др.,1994) методика статистического анализа эмпирических распределений, позволяющая, в частности, определить оптимальный объем выборки, необходимый для получения оценок изучаемых параметров с фиксированной относительной вероятностной погрешностью при заданной доверительной вероятности.

Зависимость частоты аберрантных клеток от дозы облучения представлена на рис.7. Результаты статистического анализа с использованием нескольких различных тестов свидетельствуют об отсутствии в диапазоне 0-1 Гр зависимости частоты выхода аберрантных клеток от дозы облучения.

Рис.7. Изменение частоты аберрантных клеток в корневой меристеме об- лученных семян гекса-I плоидной пшеницы г и

I ..

1.«

Дозя облучения, Гр

—I— 10.1

Отметим, что полученные результаты входят в противоречие как с положениями предложенной нами в главе I концепции, так и с экспериментальными данными ряда авторов, полученными на лимфоцитах периферической крови человека (Севанькаев,1991; Спитковский,1992), а также на фибробластах китайского хомячка и проростках Vicia faba (Заичкина и др.,1992). Более того, в выполненном после опубликования представленных в настоящем разделе результатов исследовании на семенах Vicia faba (Zaichkina et al.,1996) также было обнаружено плато в диапазоне 8-32 Гр, что прекрасно укладывается в рамки предложенной концепции, но вступает в противоречие с представленными в настоящем разделе экспериментальными результатами. Отсутствие в наших экспериментах достоверно регистрируемого плато, по-видимому, обусловлено спецификой объекта исследования. Действительно, в отличие от объектов, использовавшихся в цитированных работах, хотя и принадлежащих к разным царствам живой природы, но являющихся диплоидами и характеризующихся низким уровнем спонтанного мутагенеза, геном мягкой пшеницы состоит из трех элементарных геномов А, В и С, что обуславливает более сложную организацию генетического материала и, вероятно, является одной из причин повышенного уровня спонтанного мутагенеза. Именно это обстоятельство, по нашему мнению, не позволяет выявить достоверно отличающееся от контроля плато в условиях нашего эксперимента. Если, как это следует из предложенной нами концепции, нелинейность дозовой зависимости является универсальной закономерностью, а отсутствие в нашем эксперименте достоверно регистрируемого плато обусловлено спецификой объекта исследования, то при облучении семян других сельскохозяйственных культур, характеризующихся меньшим уровнем спонтанного мутагенеза, плато по выходу цитоге-нетических нарушений может быть обнаружено. Экспериментальной проверке этой гипотезы на семенах ячменя посвящен следующий раздел настоящей работы.

2.2.2. Закономерности выхода структурных мутаций в корневой меристеме облученных ионизирующим излучением семян ячменя. Для проверки справедливости высказанной в предыдущем разделе гипотезы были изучены закономерности выхода

а.«

0.1

100.0

структурных мутаций в корневой меристеме семян ячменя Hordeum vulgare L., сорт За-зерский. На рис.8 представлены данные о выходе аберрантных клеток в корневой меристеме семян ячменя в зависимости от дозы облучения, статистический анализ которых подтверждают гипотезу о наличии в диапазоне 1-10 Гр дозонезависимого участка: выход аберраций, индуцированных дозами 1,5 и 10 Гр, достоверно превышает спонтанный уровень, оставаясь практически постоянным в пределах плато. Отсутствие достоверных различий между точками, соответствующими дозам 1-10 Гр, подтверждается и сравнением доверительных интервалов. Начиная с дозы 25 Гр наблюдается резкое увеличение частоты генетических повреждений, выход которых далее пропорционален величине поглощенной дозы. Полученные результаты позволяют снять противоречия, возникшие в ходе анализа закономерностей выхода цитогенетических повреждений в корневой меристеме облученных семян гексаплоидной пшеницы и подтверждают высказанную в предыдущем разделе гипотезу о универсальном характере формы дозовой зависимости в области относительно малых доз.

2.2.3. Закономерности индукции малыми дозами ионизирующего излучения цитогенетических повреждений в корневой меристеме проростков ячменя. Объектом исследования служили проростки ярового ячменя Hordeum vulgare L. сорт Зазерский 85. Семена замачивали в дистиллированной воде на сутки при температуре 0°С для синхронизации деления клеток и проращивали 12-16 часов при температуре 24°С после чего облучали гамма-излучением 137Cs при мощности дозы 0.5 Гр/час.

Оценим диапазон малых доз для тест-системы и условий облучения, использовавшихся в нашем эксперименте. Поглощенная в микрообъеме доза одиночного события (ДОС) попадания Одх составит

где 1_ - ЛПЭ излучения, б - диаметр чувствительного микрообъема, р - удельная плотность вещества (для мягкой биологической ткани обычно принимается р = 1 г/см3). Размер чувствительного объема (ядра) клеток корневой меристемы ячменя оценивался путем прямых измерений, результат которых (с1 = 9.00±1.03 мкм) свидетельствует о том, что искомый параметр немного превышает средний размер ядра лимфоцитов человека -

Рис.8. Изменение частоты аберрантных клеток в корневой меристеме семян ячменя в зависимости от дозы облучения

Доза.Гр

классической тест-системы, используемой для анализа цитогенетических последствий действия малых доз ионизирующего излучения. Гамма-излучение 137Cs, которым проводили облучение проростков, создает в мягкой биологической ткани вторичное электронное излучение, точный расчет ЛПЭ которого предполагает учет энергетического и частотного распределения вторичных электронов и их ЛПЭ-спектров. Принимая, что L может меняться в диапазоне 0.2-100 кэВ/мкм со средним значением 5 кэВ/мкм (Иванов и др.,1986), и подставляя полученную путем прямого измерения оценку d в (1), получим, что среднее значение границы малых доз для клеток меристемы ячменя равно 1.26 сГр. Проведенные в работах (Спитковский и др.,1994; Booz,Feinendegen,1988) расчеты показали, что для микрообъемов с диаметром 8 мкм (характерный размер ядер лимфоцитов человека) средняя доза одиночного события для у-лучей "Со, 137Cs и рентгеновского излучения находится в диапазоне от десятых долей до единиц сГр, что хорошо соответствует полученным результатам.

Если исходить из полученной оценки, то наиболее вероятное значение границы диапазона малых доз для клеток меристемы ячменя лежит в районе 1-2 сГр. Превышение этого предела активирует в клетке зависящую от мощности дозы реакцию адаптивного ответа. Наши возможности не позволяют с достаточной точностью исследовать форму дозовой зависимости в области первого и второго участков, т.к. для этого необходимо обеспечить маленький шаг по дозе и огромную (чем ближе к уровню ЕРФ, тем больше) выборку экспериментальных данных. Однако, исходя из известного нам соотношения чувствительных объемов клеток меристемы ячменя и лимфоцитов человека и имеющихся оценок границ диапазона адаптивного ответа для клеток млекопитающих, можно ожидать, что для условий нашего эксперимента верхняя граница диапазона адаптивного ответа лежит в пределах 4-8 сГр. Т.о., если наши представления верны, в районе 4-8 сГр мы должны обнаружить резкое увеличение выхода аберрантных клеток и начало дозоне-зависимого участка с отличающимся от спонтанного уровнем выхода цитогенетических повреждений. Посмотрим, насколько соответствуют нашим теоретическим представлениям эмпирические данные.

Из табл.1, в которой представлены оцененные классическим и бутстреп-методом средние значения частоты аберрантных клеток в зависимости от дозы облучения, видно, что диапазон доз естественным образом делится на три участка, закономерности выхода цитогенетических повреждений в пределах которых существенно различаются. Проведенный по полной выборке регрессионный анализ показал, что в диапазоне III (30-100 сГр) существует высокодостоверная зависимость от дозы, в то время как на участке II (530 сГр) она отсутствует. Значение свободного члена линейной зависимости в дозовом диапазоне II достоверно превышает величину спонтанного выхода аберрантных клеток, что подтверждает наличие дозонезависимого плато. Т.о., вывод о нелинейном характере дозовой зависимости в этом диапазоне основан исключительно на экспериментальных данных и не опирается на какие-либо гипотезы или экстраполяционные модели. В то же время результаты цитогенетического анализа находятся в прекрасном соответствии с сформулированными выше теоретическими предсказаниями и служат весомым аргумен-

том в пользу предложенной нами концепции биологического действия малых доз ионизирующего излучения, на основе которой эти предсказания делались.

Таблица 1

Частота аберрантных клеток в корневой меристеме проростков ячменя в зависимости от дозы облучения

Доза, сГр Частота АК, %

Классический Бутстреп-метод

метод среднее 95%-ный ДИ

К 0.57±0.25 0.592*0.003 0.542-5-0.642

1 0.74±0.26 0.729±0.003 0.675+0.783 1 участок

5 1.41 ±0.25 1.427±0.003 1.378-5-1.476

10 1.49±0.29 1.495±0.003 1.441+1.549

15 1.58±0.27 1.590±0.003 1.537+1.643 ¿участок

20 1.42±0.26 1.423±0.003 1.370+1.477 (плато)

30 1.44±0.22 1.42210.002 1.374+1.470

50 1.76±0.47 1.755±0.005 1.658+1.853

75 2.97±0.66 3.015±0.006 2.899+3.131 3 участок

100 4.53±0.56 4.617±0.005 4.511+4.723 ' -

Выход цитогенетических повреждений в исследованном диапазоне в первом приближении может быть описан кусочно-линейной функцией F(D):

at+iaraOrtVDt, D<Oi;

а2, D,<D<D2; (2)

a3+(a2-a3)/D2*D, D>D2,

где D, и D2 - границы плато, а, - спонтанный уровень цитогенетических повреждений, а2 -частота цитогенетических повреждений в районе плато.

Сопоставим качество аппроксимации данных о выходе цитогенетических нарушений в диапазоне малых доз с помощью линейной и кусочно-линейной модели (2). Оценка параметров линейной модели проводилась на основе классических процедур линейного регрессионного анализа, кусочно-линейной - путем минимизации методом покоординатного спуска функционала

£/(в,,а2,вз,Я, ,D2)= £ (Fj(D)-F(D))2->mm, (3)

представляющего собой сумму квадратов разностей экспериментальных данных и заданного параметрического семейства кусочно-линейных кривых. Численные эксперименты

показали, что решение задачи оптимизации (3) является устойчивым и, вне зависимости от начального приближения, сходится к одной и той же точке функционального пространства. Согласно расчетам, дозонезависимый участок находится в пределах 5.6-46.7 сГр, а оцененный по модели спонтанный уровень цитогенетических повреждений а,=0.56 достоверно отличается от уровня плато а2=1.52.

Известно, что прогностическая ценность модели при прочих равных условиях снижается с увеличением числа свободных параметров. Поэтому линейная модель имеет априорное преимущество как одна из наиболее простых. Именно в этих, чисто математических свойствах линейной функции, и заключается, как нам представляется, основное преимущество получившей широкое распространение линейной беспороговой концепции, т.к. биологические ее основы являются весьма спорными (Яои1,1997). Из рис.9, на котором представлены результаты аппроксимации экспериментальных данных линейной и кусочно-линейной моделью даже без использования точных количественных критериев очевидно, что модель (2) существенно лучше аппроксимирует имеющиеся данные. Важно (и это подтверждает расчет значений критерия структурной идентификации Т (Гераськин,Сарапульцев,1993), включающего в явном виде штраф за сложность), что улучшение качества аппроксимации достигается не столько за счет усложнения модели, сколько потому, что на множестве кусочно-линейных функций удается достигнуть взаимного соответствия (функционального изоморфизма) биологического явления и его математической модели. Об этом же свидетельствуют (табл.2) и результаты сопоставления качества аппроксимации экспериментальных данных моделями разной сложности с помощью наиболее распространенных количественных критериев.

Рис.9. Сопоставление качества аппроксимации экспериментальных данных о выходе цитогенетических нарушений в корневой меристеме проростков ячменя в диапазоне малых доз с помощью линейной и кусочно-линейной моделей.

40 50 60 Доза, сГр

Сопоставление качества аппроксимации экспериментальных данных с помощью моделей разной сложности

Модель S * F R2, % Т. Hayek

Линейная 1.35 62.7 88.7 0.34

Кусочно-линейная 0.03 1829.3 99.7 0.03 14.232

Квадратичная 0.87 88.5 92.7 0.37 1.951

Кубическая 0.49 139.2 95.9 0.33 3.23

Полином 4 степени 0.14 435.8 98.9 0.14 6.699

Полином 5 степени 4.25 7.2 64.3 6.37 1.653

Глава III. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ И МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ МАЛЫХ ДОЗ И КОНЦЕНТРАЦИЙ ФАКТОРОВ РАЗНОЙ ПРИРОДЫ

Проведенный в главе III сравнительный анализ мутагенной эффективности наиболее распространенных поллютантов позволяет заключить, что из всего многообразия факторов техногенного происхождения, способных индуцировать повреждения генетического материала и его дестабилизацию, наибольшую опасность представляет возрастание в окружающей среде содержания пестицидов, тяжелых металлов и радиоактивных изотопов. Поэтому для экспериментального изучения закономерностей формирования цитогенетических эффектов раздельного и комбинированного действия факторов разной природы были выбраны типичные и широко распространенные стрессоры - ионизирующее излучение и тяжелые металлы.

В качестве объекта исследования выбран яровой ячмень Hordeum vulgare L, сорт Московский 2. Растения выращивали в условиях вегетационного опыта с почвенной культурой по общепринятой методике. Почва - дерново-подзолистая, среднесугли-нистая. Повторность опыта четырехкратная. Свинец и кадмий вносили в виде азотнокислых солей - Pb(N03h и Cd(N03)2*4H20 при набивке сосудов почвой вместе с питательными солями. В каждый вегетационный сосуд помещали 4.5 кг абсолютно сухой почвы. Плотность посева -13 растений на сосуд. Облучение растений проводили на у-установке "ГУР-120" в фазе выхода в трубку (наиболее радиочувствительный этап органогенеза злаков). В качестве показателя, характеризующего повреждающее действие внешних факторов, была использована частота выхода аберрантных клеток в ин-теркалярной меристеме листьев. Пробы интеркалярной меристемы листьев отбирали через двое суток после облучения и фиксировали в уксусном алкоголе (1:3). Цитогене-тический анализ проводили в ана-телофазах на временных давленых микроскопических препаратах, окрашенных ацетоорсеином. Учитывали частоту клеток с хромосомны-

ми нарушениями и число аберраций на клетку. В каждом варианте анализировали по 500 ана-телофаз.

На рис. 10-12 представлены зависимости выхода цитогенетических повреждений от дозы (концентрации) для каждого из изученных в эксперименте факторов. С увеличением дозы ионизирующих излучений или концентрации тяжелых металлов частота выхода аберрантных клеток закономерно возрастает. Несмотря на качественно различающийся характер эмпирических зависимостей, они гораздо лучше описываются логарифмической функцией, чем линейной. Это, в частности, свидетельствует о том, что при действии малых доз исследуемых факторов выход цитогенетических повреждений растет быстрее, чем при больших.

25 20 15 10 5 О

12 10" 8' б" 4 2" О -Г

1210 8 6 4 2-\ 0 -2

Ьт

10 15 20 100 1000

100

200

300

—1— 400

500

—I— 60

—I— 80

100

Рис.10. Зависимость выхода аберрантных клеток в листовой меристеме ячменя от дозы у-облу-чения.

По оси абцисс -доза облучения, сГр; по оси ординат - частота аберрантных клеток %

Рис.11. Зависимость выхода аберрантных клеток в листовой меристеме ячменя от концентрации свинца в почве

По оси абцисс -концентрация нитрата свинца мг/кг; по оси ординат - частота аберрантных клеток %

Рис.12. Зависимость выхода аберрантных клеток в листовой меристеме ячменя от концентрации кадмия в почве

По оси абцисс -концентрация нитрата кадмия мг/кг; по оси ординат - частота аберрантных клеток %

0 20 40

Проверка с помощью статистических критериев показала, что начиная с минимальной использованной в эксперименте дозы облучения, имеет место достоверное

отличие частоты выхода аберрантных клеток от спонтанного уровня. Причем характер эмпирической зависимости может быть расценен как аргумент в пользу гипотезы о существовании при дозах, превышающих 4 сГр, дозонезависимого участка на кривой выхода цитогенетических нарушений и хорошо корреспондирует с полученными нами (глава II) и другими авторами (Севанькаев, 1991; Заичкина и др.,1992) на разных объектах и генетических тест-системах результатами, свидетельствующими о нарушении линейного характера дозовой зависимости в области малых значений экспозиции. Из полученных результатов также следует, что использованная в настоящей работе цито-генетическая тест-система по своей чувствительности к действию ионизирующего излучения (позволяет достоверно регистрировать индуцированные структурные мутации при дозах порядка единиц сГр) сравнима с классическим тестом "частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека" (Севанькаев,1991).

Для свинца и кадмия характерным является качественно иной тип зависимости выхода цитогенетических нарушений от интенсивности внешнего воздействия, что связано с принципиальным различием механизмов биологического действия ионизирующего излучения и химических мутагенов. Высокая чувствительность интеркалярной меристемы листьев подтвердилась и при исследовании тяжелых металлов. Так, при уровне загрязнения почвы свинцом 40 мг/кг, практически совпадающем с ПДК для этого металла, частота аберрантных клеток (рис.11) возрастает в 1.4 раза по сравнению с контролем. Если же ориентироваться на ПДК, принятый в Германии (100 мг/кг), то двукратное его превышение приводит к двукратному же возрастанию выхода аберрантных клеток. Загрязнение почвы кадмием на уровне ПДК (4 мг/кг) приводит к незначительному и статистически недостоверному приросту цитогенетических нарушений (рис.12), однако пятикратное его увеличение ведет к двукратному возрастанию частоты мутирования по сравнению с контролем. Т.о., интеркалярная меристема листьев полностью отвечает требованиям по чувствительности и информативности, предъявляемым к биологическим тест-системам, предназначенным для индикации слабых воздействий повреждающих факторов разной природы.

Выход цитогенетических повреждений при загрязнении почвы свинцом хорошо описывается логарифмической функцией (рис.11) и характеризуется резким ростом частоты аберрантных клеток при малых уровнях загрязнения (40-50 мг/кг почвы) с последующей стабилизацией на уровне, в два раза превышающем спонтанный (при концентрациях 200-500 мг/кг частота аберрантных клеток остается практически постоянной). Такой характер эмпирической зависимости заставляет с осторожностью относиться к выбору предельно допустимых уровней загрязнения почвы свинцом, поскольку даже небольшое его увеличение ведет к непропорционально высокому росту генетических нарушений. В случае кадмия уровень "насыщения" также достигается (10-20 мг/кг) и, более того, ярко выражено снижение выхода аберрантных клеток при максимальном загрязнении почвы (что, возможно, связано с цитотоксическим (Ваулина и др., 1978) и радиопротекторным (Привезенцев,1998) действием этого металла). Причем уменьше-

ние выхода аберрантных клеток настолько сильно, что их количество при уровне загрязнения почвы 100 мг/кг достоверно не отличается от такового в контроле (рис.12).

В табл.3 представлены данные о частоте аберрантных клеток в листовой меристеме ячменя для всех исследованных сочетаний воздействующих факторов, а в табл.4 - данные о распределении повреждений по клеткам.

Ионизирующее излучение и кадмий. Уже при сочетании наименьших экспозиций (4 сГр х 4 мг/кг) частота аберрантных клеток достоверно отличается от спонтанного уровня. Другие комбинации исследуемых агентов также приводят к достоверному увеличению этого показателя. Из табл.3 также следует, что комбинированное действие у-облучения и загрязнения почвы солями кадмия приводит к индукции нелинейных эффектов, наличие которых невозможно предсказать, исходя только из закономерностей раздельного действия этих факторов. Причем сочетание малых (на уровне ПДК) концентраций кадмия с ионизирующим излучением приводит к повышенному выходу цито-генетических повреждений.

Нагруженность клеток повреждениями несколько увеличивается лишь с ростом концентрации кадмия в почве и не зависит в исследованных пределах от дозы облучения. Причем сочетание обеих испытанных концентраций кадмия с дозой 20 сГр ведет к снижению нагруженности клеток повреждениями. Отметим, что уменьшение значений этого показателя происходит на фоне значительного увеличения выхода аберрантных клеток и числа повреждений на клетку, причем регистрируемые экспериментально значения последнего показателя практически для всех исследованных комбинаций факторов статистически достоверно (табл.4) превышают соответствующие значения поврежденное™ в отсутствии воздействия.

Формально оценка отклика биологической системы на комбинированное воздействие сводится к сравнению положения в пространстве поверхностей реального и аддитивного откликов для изучаемой области напряженности факторов. При этом смещение точек реального отклика относительно аддитивной поверхности будет указывать на характер взаимодействия. При классификации эффектов комбинированного действия по группам: аддитовность, синергизм, антагонизм, хорошие результаты дает использование коэффициента взаимодействия К», который определяется как отношение инкремента ответной реакции системы на комбинированное действие к сумме инкрементов эффекта при раздельном действии каждого из факторов: к АА(Г,ТМ)

АА(0,ТМ)+АА(у,0У ()

где А4(ДГ,}') = А(Х,У)~ А(0,0) - инкремент (превышение индуцированного стрессорами уровня над спонтанным) выхода цитогенетических повреждений при дозе ионизирующих излучений X и концентрации тяжелых металлов У.

Частота выхода аберрантных клеток и значения коэффициента взаимодействия для всех исследованных сочетаний ионизирующего _излучения и тяжелых металлов_

Вариант Доза, сГ р Концентрация, мг/кг Частота аберрантных клеток, % Коэффициенет взаимодействия, К„ Р

К К 0,00±2,02

4 К 6,07±2,36

Г 8 К 4,17±2,25

10 К 9,00±2,66

20 К 9,97±2,54

100 К 15,30±2,88

1000 К 24,00±3,07

К 4 1,47±2,07

4 4 5,87±2,35 0,79 0,45

8 4 13,53+2,71 2,40* 0,98

20 4 25,27+3,03 2,21" 0,99

К 10 10,80+2,73

10 10 18,80±2,97 0,95 0,26

100 10 16,00±2,90 0,61* 0,98

CdxY 1000 10 28,00+3,12 0,80 0,93

К 20 10,61±2,56

4 20 11,32±2,60 0,68 0,93

8 20 13,53±2,71 0,92 0,34

20 20 25,63+3,03 1,25 0,91

К 100 3,80+2,42

10 100 6,00+2,53 0,47 0,94

100 100 19,60±2,98 1,03 0,13

1000 100 25,00+3,08 0,90 0,62

К 40 4,33±2,26

4 40 2,17±2,12 0,21" 0,99

8 40 12,47±2,66 1,47 0,84

20 40 21,87±2,96 1,53* 0,97

К 50 6,40±2,55

10 50 14,00±2,84 0,91 0,36

100 50 16,40+2,91 0,76 0,87

PbxY 1000 50 25,60+3,09 0,84 0,84

К 200 9,47+2,54

4 200 7,47±2,44 0,48* 0,98

8 200 16,27±2,81 1,19 0,62

20 200 28,27±3,08 1,45 0,98

К 500 10,20+2,71

10 500 19,00±2,97 0,99 0,05

100 500 24,20+3,07 0,95 0,32

1000 500 30,80±3,14 0,90 0,70

Нелинейные эффекты достоверны: * - при (1-Р) < 0.05; " - при (1-Р) < 0.01

Распределение повреждений по клеткам и нагруженность аберрантных клеток для некоторых сочетаний доз ионизирующего излучения и концентраций тяжелых металлов

Ва- Доза, Концен Все- Из них с числом Число Нагружен-

ри- сГр трация, го аберраций поврежде- ность

ант мг/кг кле- нии абер-

ток на клетку, рантных

0 1 2 3 4 5 клеток

Г К К 498 455 29 9 5 12.44 1.44

4 К 498 427 51 19 1 18.47 1.30

8 К 489 418 51 18 1 1 19.22 1.32

20 К 493 407 53 31 2 24.54* 1.41

Сс1ху К 4 498 437 34 23 3 1 18.67 1.53

4 4 489 423 43 8 15 21.26 1.58

8 4 493 392 46 44 11 33.87* 1.65

20 4 489 340 77 53 19 49.07* 1.61

К 20 490 414 37 34 5 24.48 1.58

4 20 500 406 44 39 11 31.00* 1.65

8 20 494 397 33 54 10 34.61* 1.76

20 20 489 342 73 71 3 45.80* 152

РЬх7 К 40 499 439 38 20 2 16.83 1.40

4 40 497 432 35 26 4 19.91 1.52

8 40 495 390 53 45 7 33.13* 1.56

20 40 484 347 60 65 12 46.69* 1.65

К 200 495 408 40 30 10 31.91 1.82

4 200 497 396 60 34 7 29.97* 1.48

8 200 489 373 65 49 2 34.56* 1.46

20 200 488 343 54 60 25 5 1 56.14* 1.89

* - различие с контролем достоверно при (1-Р) < 0.05

Поскольку уровень экспериментально наблюдаемого эффекта является случайной величиной и имеет вероятностное распределение, значение коэффициента взаимодействия К» - также случайная величина. Поэтому для классификации отклика биологической системы на комбинированное воздействие по названным группам необходимо произвести проверку статистической гипотезы о равенстве К„ единице. При этом если К„ — 1, то результат комбинированного действия классифицируют как аддитивный; если К„ достоверно меньше 1, то имеет место антагонизм; если К» достоверно больше 1, то эффект комбинированного действия классифицируется как синергичес-кий.

В табл.3 представлены расчитанные по формуле (4) значения коэффициента взаимодействия К* и оценка достоверности их отличия от единицы для всех комбинаций изученных факторов. Полученные результаты подтверждают сделанный нами вы-

вод о существовании достоверных синергических эффектов взаимодействия малых концентраций кадмия и ионизирующего излучения. Обнаружение в нашем исследовании достоверных синергических эффектов сочетанного действия ионизирующего излучения и допустимого по действующим нормам загрязнения почвы солями кадмия заставляет с осторожностью относиться к принятым в настоящее время нормам, устанавливающим пределы техногенного загрязнения и свидетельствует о необходимости учета нелинейных эффектов комбинированного действия факторов разной природы при нормировании техногенной нагрузки на природные и аграрные экологические системы.

Ионизирующее излучение и свинец. При наименьшей из тестированных доз облучения (4 сГр) наблюдается ослабление эффекта тяжелого металла (коэффициент взаимодействия достоверно меньше единицы), причем, в отличие от кадмия, выход аберрантных клеток оказывается даже ниже, чем в отсутствии облучения (табл.3). Напротив, сочетание дозы 20 сГр с загрязнением 40 мг/кг почвы приводит к достоверному синергическому эффекту. Ослабление мутагенного эффекта свинца малыми дозами ионизирующего излучения сказывается не только на общем снижении выхода аберрантных клеток, но и на степени их поврежденности. Так, сочетание малых доз ионизирующего излучения (4 и 8 сГр) с загрязнением почвы 200 мг/кг приводит (табл.4) к существенному снижению нагруженности клеток повреждениями. При этом в отсутствии облучения и в сочетании с дозой 20 сГр, нагруженность клеток повреждениями растет вместе с концентрацией свинца.

Для получения точных количественных оценок характера отклика биологической системы на комбинированное воздействие обратимся к помощи дисперсионного анализа. Представленные в табл.5 результаты позволяют сделать обоснованный вывод о существовании достоверной связи мехзду уровнем экспозиции повреждающих агентов и выходом аберрантных клеток, а также о наличии достоверных нелинейных эффектов. Дисперсионный анализ позволяет также оценить вклад изучаемых в эксперименте факторов в наблюдаемую цитогенетическую изменчивость. Согласно теории (Айвазян и др., 1985), вклад фактора в наблюдаемую изменчивость соответствует доле среднего квадрата объясняемой им дисперсии в общей дисперсии исследуемого показателя. Представленные в табл.5 и на рис.13 (а) результаты свидетельствуют о том, что изучаемые в эксперименте факторы вносят приблизительно разный вклад в индукцию аберрантных клеток. Вместе с тем анализ данных о нагруженности клеток повреждениями (см. рис.13 (б)) свидетельствует о значительно большем вкладе тяжелых металлов в формирование клеток, характеризующихся одновременным наличием нескольких аберрантных хромосом, и существенном различии механизмов биологического действия ионизирующего излучения и тяжелых металлов. В пользу этого утверждения также свидетельствует (см.табл.4) факт снижения по сравнению с контролем нагруженности клеток повреждениями при облучении в отсутствии тяжелых металлов на фоне достоверного увеличения выхода аберрантных клеток и среднего числа повреждений.

Результаты дисперсионного анализа влияния облучения и загрязнения почвы тяжелыми металлами на выход аберрантных клеток.

Источник вариации Сумма квадратов Степени свободы Средний квадрат Значения Р-критерия Уровень значимости

Облучение 3186.44 6 531.07 29.61 0.0000

Кадмий 1325.99 4 331.50 18.48 0.0000

ВзаимодействиеУхСс! 466.87 12 38.91 2.17 0.0256

Ошибка 1040.26 58 j 17.94

Облучение 2944.14 6 479.59 62.86 0.0000

Свинец 1013.21 4 251.41 32.45 0.0000

ВзаимодействиеТхРЬ 368.87 12 30.05 3.94 0.0003

Ошибка 398.09 51 97.83

Рис.13. Относи- а б

тельный вклад ионизирующего излучения и тяжелых металлов в наблюдаемую цитоге-нетическую изменчивость. а - выход аберрантных клеток; б -нагруженность клеток повреждениями. 1 - ионизирующее излучение; 2 - тяжелый металл; 3 - Сс1 44 52 85 1 6 "^Чг 9 \ /

взаимодействие.

□1Ш213 51 30

РЬ 42 ( 58 12

Из анализа табл.3 следует, что нелинейные эффекты синергического типа имеют место при сочетании малой концентрации кадмия (4 мг/кг) с облучением в дозах 8 и 20 сГр, а антагонистического типа - при концентрации кадмия 10 мг/кг и дозы облучения 1 Гр. Следовательно на характер отклика биологической системы (синергизм или антагонизм) в этом случае решающее влияние оказывает концентрация тяжелого металла. При анализе комбинированного действия ионизирующего излучения и загрязнения почвы свинцом проявляются другие закономерности, решающую роль в формировании которых играет доза ионизирующего излучения: малые дозы облучения (4 сГр) в сочетании с разными концентрациями свинца вызывают антагонистические эффекты, а доза 20 сГр в этих же условиях приводит к синергизму. Отметим, что аналогичные закономерности были обнаружены при изучении комбинированного действия хронического у-облучения и загрязнения почвы нитратом свинца на выход waxy-мутэций у ячменя (Шершунова и др.,1990), а также при изучении (Витвицкий и др.,1996) влияния солей свинца и острого y-облучения на выход микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей. Достоверный синергический эффект при сочетанном действии ионизирующего излучения и нитрата свинца был также показан в работах (Динева и др., 1993; Reddy,Vaidyanath,1978). Хотя, как следует из результатов наших экспериментов, свинец и не определяет тип нелинейности при комбинированном действии с облучением, недооценивать его опасность нельзя, поскольку с увеличением дозы ослабление эффекта (при 4 сГр К„=0.21-0.48) быстро сменяется усилением (при 20 сГр К*= 1.45-1.53), в отличие от кадмия, с увеличением концентрации которого си-нергические эффекты сменяются антагонистическими. Полученные экспериментальные результаты служат прекрасным подтверждением сделанных нами на основе теоретического анализа выводов о повышенной вероятности возникновения синергичес-ких и антагонистических эффектов в области малых значений экспозиции.

Каковы же причины и молекулярные механизмы формирования наблюдаемых в нашем эксперименте нелинейных эффектов комбинированного действия? И почему представленные в (Гераськин и др., 1993) результаты аналогичного эксперимента (лишь уровни действующих факторов были смещены в область больших значений) носили в основном аддитивный характер? По нашему мнению столь необычный характер формирования цитогенетических эффектов во многом определяется биохимическими свойствами тяжелых металлов. В самом деле, хорошо известно, что ионы свинца способны оказывать воздействие на клетку сразу по нескольким механизмам: 1 )вступая в непосредственное взаимодействие с ДНК и индуцируя мутации (Реутова,Шевченко, 1992; Reichmayr-Lais,Kirchgessner,1984); 2)снижая эффективность функционирования систем репарации (Спитковский и др.,1992; Hartwig et al.,1990) и увеличивая выход мутаций за счет части спонтанных и индуцированных повреходений молекул ДНК, репари-ровавшихся в норме; 3)оказывая общее токсическое действие вследствие образования устойчивых комплексов с аминокислотами (Динева и др., 1993; Venugopal, Luckey, 1978). Именно способностью свинца подавлять работу систем репа-

рации и объясняется, по-видимому, та картина нелинейных эффектов, которая наблюдалась в нашем исследовании и работах других авторов. Действительно, если присутствие избыточного количества ионов РЬ2* в клетке способно снижать эффктивность работы систем мутагенной репарации, индуцируемых относительно малыми дозами ионизирующего излучения, то совместное действие ионов свинца и ионизирующего излучения должно приводить к антагонистическим эффектам в области малых доз (вследствие подавления мутагенной ветви репарации, обеспечивающей повышенный выход генетических повреждений в области малых доз) и, одновременно, к синергическим эффектам в области средних доз (вследствие подавления мутагенной ветви репарации, обеспечивающей в этом дозовом диапазоне эффективное устранение множественных генетических повреждений).

В отличие от свинца, в основе токсичности и мутагенности кадмия лежит его денатурирующее действие на метаболически важные белки, что, по-видимому, и определяет наблюдаемую нами в эксперименте картину нелинейных эффектов. Действительно, если небольшие, близкие к ПДК концентрации кадмия оказывают преимущественно мутагенное действие, что в сочетании с ионизирующим излучением приводит к синергизму, то большие концентрации кадмия, вызывая серьезные нарушения плоидности и летальные поражения клеток, практически не увеличивают частоту аберраций, что обуславливает преимущественно аддитивный и даже антагонистический характер выхода генетических эффектов совместного действия ионизирующего излучения и солей кадмия в токсических концентрациях. Отсутствие достоверного увеличения частоты аберраций хромосом при исследовании биологического действия солей кадмия в токсических концентрациях отмечалось в опытах на клетках млекопитающих (Привезенцев, 1998) и Crépis capillaris (Ваулина и др., 1978). Таким образом, качественное различие наблюдаемых нелинейных эффектов взаимодействия кадмия и свинца с ионизирующим излучением обусловлено принципиальным отличием механизмов биологического действия этих тяжелых металлов.

Глава IV. АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОСЛЕДСТВИЙ АВАРИИ НА ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ АЭС НА ПРИМЕРЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ АГРАРНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ

Авария на Чернобыльской АЭС не имеет аналогов как по площади радиоактивного загрязнения, так и по величине поглощенных объектами живой природы доз. Сложная зависимость от времени радионуклидного состава выброса и изменчивые метеорологические условия в течение 10 дней активной эмиссии привели к чрезвычайно негомогенной картине выпадений. Неоднородное распределение радионуклидов в среде обусловило большой разброс дозовых нагрузок на объекты живой природы, который в ряде случаев даже на небольших участках выходил за пределы порядка. Наибольшему радиационному воздействию подверглись природные и аграрные экологиче-

ские системы в 30-километровой зоне ЧАЭС, на значительной части которой радиоактивное загрязнение в 1986 г. достигло нескольких тысяч Ки/км2. Чернобыльская авария произошла в конце апреля - период ускоренного роста и формирования репродуктивных органов, когда растительные сообщества наиболее радиочувствительны. Максимальное радиационное воздействие на объекты живой природы пришлось на первые 10-20 дней с момента аварии, когда значительный вклад в поглощенную дозу вносили короткоживущие изотопы. Вторая фаза включала лето и раннюю осень 1986 года, в течение которых мощность дозы на поверхности почвы упала до 20-25% первоначальной величины (Козубов,Таскаев,1994). Теперь, когда с момента чернобыльской катастрофы прошло более десяти лет, очевиден уникальный характер данных, полученных в первую, наиболее острую фазу радиационного воздействия, анализу которых посвящен раздел 4.1.

4.1. Цитогенетические последствия загрязнения посевов озимой ржи радиоактивными выпадениями Чернобыльской АЭС в 1986 г. Семена озимой ржи районированного сорта Белта собраны 4-6 августа 1986 года в 30-км зоне ЧАЭС с участков площадью 5 м2 пяти различных по мощности экспозиционной дозы ^-излучения полей с 50-100 главных колосков на участок; в качестве контроля взяты семена из зернохранилища. Для определения суммарной плотности радиоактивного загрязнения и поглощенных растениями доз в мае, июне и августе 1986 г. на каждом из пяти экспериментальных полей с участков площадью 5 м2 методом "конверта" отбирали пробы почвы с последующей ^-спектрометрией образцов поверхностного слоя (0-2 см); повтор-ность 5-кратная, коэффициент вариации - 30-40%. Собранные семена проращивали в чашках Петри в термостате при 25-26° С, фиксацию проростков осуществляли в ацето-алкоголе (1:3); на каждую точку брали 10-15 растений. Одновременно измеряли длину главных корешков. Всхожесть семян первого года хранения в лабораторных условиях определяли по ускоренному методу (Степанов, 1969).

Расчет дозовых нагрузок проводился по методике, предложенной Е.В. Спириным (1997) и основывался на данных о радионуклидном составе выпадений и приближениях, описывающих рост злаковых растений и миграцию радионуклидов по профилю почвы. В табл.6 дана радиологическая характеристика экспериментальных участков на момент сбора семян. Видно, что такие базовые характеристики, как суммарная плотность радиоактивного загрязнения поверхностного слоя почвы и поглощенная за вегетационный период критическими органами растений доза различаются почти на порядок. Согласно классификации зон хронического действия ионизирующего излучения на природные популяции (Поликарпов,Цыцугина,1995), по крайней мере на двух экспериментальных участках, характеризующихся наибольшими уровнями радиоактивного загрязнения, индуцированные излучением биологические эффекты должны доминировать над действием других экологических факторов. Вклад р-излучения в суммарную поглощенную дозу различен для каждого участка, но во всех случаях в 6-9 раз выше вклада у-излучения, что хорошо согласуется с результатами расчета доз в опытах по

загрязнению посевов сельскохозяйственных культур продуктами ядерного деления (Лристер и др.,1982) и подтверждает сделанный в ходе анализа последствий Кыштым-ской аварии вывод о том, что суммарные поглощенные растениями дозы при загрязнении среды радиоактивными выпадениями могут в 10 и более раз превышать дозу внешнего у-облучения (Тихомиров, Романов,1993).

Таблица б

Радиологическая характеристика экспериментальных участков

Вариант о, О.Гр

опыта Ки/км2

Контроль — — — —

1. Кожушки 530 0.18 1.15 1.33

2. Чамков 1570 0.33 2.80 3.13

3. Радин 1650 0.58 3.40 3.98

4. Борщевка 3500 1.20 6.50 7.70

5. Красно 7130 1.15 10.80 11.95

Примечание: о [Ки/км2] - суммарная плотность загрязнения почвы в слое 0-2 см на 4-6 августа 1986 год;

0„ Ор, ОпР [Гр] - поглощенные критическими органами растений дозы за вегетационный период.

При анализе частоты аберраций хромосом в меристеме корня проростков семян регистрируются нарушения, возникшие в период времени от образования гамет до созревания и сбора семян, поскольку практически все хромосомные перестройки, возникшие на вегетативной стадии роста (до цветения) элиминируются в мейозе за исключением симметричных транслокаций и инверсий, которые не регистрируются анафазным методом. Представленные в табл.7 результаты цитогенетического анализа корневых меристем проростков семян озимой ржи, собранных на участках с разным уровнем радиоактивного загрязнения однозначно свидетельствуют в пользу радиационной природы наблюдаемых изменений. Статистический анализ представленных данных свидетельствует о том, что уже поглощенная растениями доза 3.1 Гр приводит к достоверному увеличению выхода аберрантных клеток. Уместно напомнить, что в наших экспериментах по изучению индукции цитогенетических эффектов в корневой меристеме других сельскохозяйственных культур (см. разделы 2.2.1 и 2.2.2), достоверное увеличение частоты аберрантных клеток наблюдалось при сопоставимых дозах острого у-об-лучения семян. Представленные в табл.7 оценки частоты выхода аберрантных клеток на единицу дозы указывают на большую генетическую эффективность низкоинтенсивного излучения и хорошо согласуются с имеющимися результатами наблюдений, за биологическими эффектами в хронически облучающихся природных популяциях и аг-роценозах (Пристер и др.,1982; Шевченко и др., 1992).

Частота аберрантных клеток в корневой меристеме проростков семян озимой ржи, собранных на участках с разным уровнем радиоактивного загрязнения

Доза, Гр ВК АК Частота аберрантных клеток, % Выход АК на 1 Гр,»10г

К 952 40 4.20±0.65 —

1.3 749 33 4.41±0.75 3.29

3.1 1402 101 7.20±0.69* 2.92

4.0 787 51 6.4810.88 2.16

7.7 447 49 10.96±1.48" 1.95

12.0 668 95 14.22±1.35"* 1.80

Примечание: ВК - количество ана-телофазных клеток; АК - количество аберрантных

клеток; * - различие с контролем значимо, р<0.05; ** - р<0.01, "* - р<0.001.

При анализе всхожести семян выявлены статистически достоверные эффекты стимуляции при дозах 1.3-4.0 Гр. При дозе 12 Гр наблюдалось существенное и статистически достоверное угнетение. При поглощенных дозах 1.3-7.7 Гр наблюдалась статистически недостоверная тенденция к стимуляции роста главного корня, а при дозе 12 Гр - угнетение. Обращает на себя внимание сопряженность изменения с дозой этих морфометрических показателей, характеризующих жизнеспособность проростков на ранних этапах онтогенеза. Следует также отметить тот факт, что стимуляция всхожести проростков наблюдается на фоне существенного (в 2.6 раза) и высокодостоверного прироста цитогенетических нарушений. Продемонстрированный в нашем исследовании феномен служит прекрасной иллюстрацией относительности понятия "стимуляция" и свидетельствует о том, что этот термин нельзя считать синонимом полезности или даже безвредности воздействия, поскольку восприятие его результатов с точки зрения хозяйственной деятельности может оказаться весьма далеким от биологической сущности явления.

4.2. Цитогенетические последствия хронического низкодозового облучения сельскохозяйственных культур в 30-километровой зоне ЧАЭС в 1987-1989 гт. Выбор экспериментальных участков осуществлялся с учетом уровня радиоактивного загрязнения местности, ландшафта и хозяйственного использования угодий до аварии. Для получения сопоставимых результатов были выбраны две пары участков, имеющих сходный тип почвы (1,2 - дерново-подзолистые супесчаные; 3,4 - торфянисто-пере-гнойно-глеевые), но разные плотности радиоактивного загрязнения. Посев озимых (рожь и пшеница) и яровых (ячмень и овес) культур проводили с соблюдением соответствующей агротехники и норм высева. Повторность опыта четырехкратная, площадь делянок варьировала от 5 до 25 мг. Пробы листовой интеркалярной меристемы ярового ячменя и овса отбирали через 2-3 недели после появления всходов, когда зачаточный колос достигал высоты 5 см над поверхностью земли, а озимых ржи и пшеницы - осенью - через 3-4 недели и весной на десятые сутки после начала отрастания.

Оценку поглощенных доз в листовой меристеме проводили по методике, разработанной Е.В.Спириным (1997).

Яровые культуры. Эксперименты на яровых культурах (ячмень, овес) проводились только в 1988 г. В табл.8 представлены данные о частоте аберрантных клеток в листовой меристеме ячменя и овса, выращенного на участках, почти в 40 раз различающихся по плотности радиоактивного загрязнения. Видно, что с увеличением поглощенной растениями дозы выход аберрантных клеток возрастает, что свидетельствует в пользу радиационной природы наблюдаемых изменений.

Таблица 8

Частота аберрантных клеток в листовой меристеме яровых культур,

выращенных на участках с разным уровнем радиоактивного загрязнения

Участок Доза, сГр ЯЧМЕНЬ ОВЕС

Nak Частота АК, % Nak Частота АК, %

1 2.05 142 28.4±2.0 203 40.6±2.2

2 12.09 181 36.212.1 161 32.212.1

3 17.90 156 31.2±2.1 274 54.812.2*

4 78.46 261 52.212.2* 271 54.212.2*

Примечание. Ыах - количество аберрантных клеток; * - отличие от участка 1 достоверно

с доверительной вероятностью 95%

Обращает на себя внимание неожиданно высокий по сравнению с результатами наших экспериментов по острому (см. главу 111) и хроническому (неопубликованные данные) у-облучению вегетирующих растений ячменя уровень цитогенетических повреждений. По нашим данным (Гераськин и др.,1993; Гераськин и др.,1996), спонтанный выход аберрантных клеток в листовой меристеме ячменя составляет 10-14%. Если исходить из этой оценки, то даже на участках, характеризующихся небольшой величиной поглощенной критическими органами растений дозы, выход цитогенетических повреждений в 2-3 раза превышал спонтанный. Следует также отметить, что, в отличие от обсуждаемых результатов, в 1986 г. (см. раздел 4.1), в период наиболее острого радиационного воздействия, поражение посевов сельскохозяйственных культур по основным цитогенетическим тестам напоминало эффект, вызываемый острым у-облуче-нием в сопоставимых дозах. Несоответствие данных дозиметрии и наблюдаемых генетических эффектов отмечали и другие авторы, проводившие исследования в зоне аварии (Абрамов и др., 1995).

Озимые культуры. При оценке последствий произрастания озимых культур в условиях радиоактивного загрязнения следует учитывать, что они подвергаются более длительному по сравнению с яровыми облучению. При этом в период зимнего покоя растения находятся в непосредственной близости от верхнего, наиболее загрязненного радиоактивными выпадениями, слоя почвы.

Эксперименты на озимых культурах (пшеница, рожь) проводились с осени 1987 г. по осень 1989 г. Поэтому на основе имеющихся данных можно делать выводы не

только о зависимости частоты цитогенетических повреждений от уровня радиоактивного загрязнения местности, но и о том, как менялась реакция растений вместе с обусловленным радиоактивным распадом и миграцией радионуклидов снижением поглощенной дозы во времени. Анализ представленных в табл.9 данных о частоте аберрантных клеток в листовой меристеме озимых ржи и пшеницы, выращенных на участках с разным уровнем радиоактивного загрязнения, свидетельствует о наличии тенденции к снижению выхода цитогенетических повреждений со временем, прошедшим после аварии. Вместе с тем, скорость снижения цитогенетической поврежденности растений значительно отстает от уменьшения радиоактивного загрязнения местности. Этот феномен отмечали и другие авторы, проводившие исследования в зоне аварии (Шевченко и др., 1996).

Таблица 9

Частота аберрантных клеток в листовой меристеме озимых культур, выращенных на участках с разным уровнем радиоактивного загрязнения

Участок Доза, сГр РОЖЬ ПШЕНИЦА

Ыдк Частота АК, % Ыдк Частота АК, %

1987 осень

1 3.88 95 19.011.8 162 32.412.1

3 23.15 101 20.2±1.8 120 24.011.9*

2 33.50 162 32.4±2.1* 167 33.412.1

4 148.78 226 45.212.2* 198 39.612.2

1988 весна

1 17.94 130 26.0+2.0 266 53.212.2

3 106.50 164 32.8±2.1 173 34.612.1*

2 155.75 298 59.612.2* 343 68.612.1*

4 687.20 237 47.412.2* 209 41.812.2

1988 осень

1 1.99 107 21.4±1.8 115 23.011.9

3 11.67 127 25.4И.9 124 24.811.9

2 17.48 121 24.2±1.9 128 25.612.0

4 76.14 133 26.612.0 138 27.612.0

1989 весна

1 10.26 102 20.411.8 116 23.211.9

3 59.74 110 22.011.9 120 24.011.9

2 90.63 123 24.611.9 123 24.611.9

4 392.49 149 29.812.0* 149 29.812.0

1989 осень

1 1.03 101 20.211.8 90 18.011.7

3 5.81 117 23.411.9 106 21.211.8

2 9.36 103 20.6+1.8 103 20.611.8

4 39.60 114 22.811.9 129 25.812.0*

Примечание. Ыак - количество аберрантных клеток; * - отличие от участка 1 достоверно с доверительной вероятностью 95%

Регрессионный анализ показал, что в пределах одного года с увеличением поглощенной растениями дозы частота выхода аберрантных клеток, как правило, достоверно возрастает, свидетельствуя в пользу радиационной природы наблюдаемых изменений. Интересно, что для обеих культур осенью коэффициент наклона регрессионной прямой выше (и, как правило, статистически достоверно), чем весной следующего года. Т.е. осенью выход аберрантных клеток теснее связан с поглощенной растениями дозой. Весной же, когда процесс формирования дозы растянут во времени, выход ци-тогенетических повреждений в меньшей степени зависит от дозы, и на его величину существенное влияние оказывают другие факторы.

Изменчивость в поколениях. На протяжении всего времени исследования (осень 1987 - осень 1989) часть собранных семян высаживалась вновь на тех же участках, что позволило провести анализ цитогенетической изменчивости в трех последовательных поколениях озимых ржи и пшеницы. При этом доза на конус нарастания за вегетационный период 1987-1988 гг. на разных участках изменялась в пределах 18-717 сГр, а за вегетационный период 1988-1989 гг. - в пределах 11-417 сГр. Из представленных на рис.14 данных следует, что осенью 1989 г. частота аберрантных клеток в листовой меристеме ржи во втором и третьем поколениях достоверно превышала этот же показатель для первого поколения на участках 2 и 4, характеризующихся наибольшим уровнем радиоактивного загрязнения. Причем в отличие от результатов, полученных в работе (Кальченко и др.,1981), в нашем исследовании (см. рис.14) в третьем поколении уровень генетической изменчивости не снижается, а даже несколько увеличивается, хотя результаты статистического анализа говорят об отсутствии достоверных различий между выходом аберрантных клеток во втором и третьем поколениях. В то же время наши результаты хорошо корреспондируют с данными В.И.Абрамова с соавт. (1995), которые в первые 2-3 года после аварии наблюдали увеличение мутационного груза в популяциях арабидопсиса при всех уровнях радиоактивного загрязнения. У пшеницы эта тенденция выражена еще более ярко. Осенью 1989 г. достоверное увеличение частоты аберрантных клеток во втором и третьем поколении наблюдали на 3-х из четырех участков (рис.15). Различия между цитогенетическими показателями, полученными для 2-ого и З-Ого поколений, малы и статистически недостоверны.

Одно из возможных объяснений выявленного феномена связано с дестабилизацией генома растений, выращенных из подвергшихся радиационному воздействию семян. О том, что хроническое облучение в районах, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской АЭС, способно приводить к наследуемой дестабилизации генетических структур, выражающейся, в частности, в увеличении выхода цитогенетических повреждений и кариотипической изменчивости у потомков облученных организмов, свидетельствуют результаты многочисленных экспериментов, проведенных на представителях разных царств живого мира (Пелевина и др.,1996; Шевченко и др.,1995). С этих позиций полученные в наших экспериментах результаты, свидетельствующие в пользу порогового характера индукции генетической нестабильности, являются отражением

первого этапа процесса цитогенетической адаптации (Чережанова,Алексахин,1975; Шевченко и др.,1992), т.е. хроническое низкодозовое облучение выступает в этом случае как экологический фактор, изменяющий генетическую структуру популяции. Такая реакция на действие внешних повреждающих агентов, заключающаяся в создании предпосылок к увеличению пула изменчивости с последующим отбором наиболее приспособленных форм, является одним из проявлений (см. гл.1) фундаментальных механизмов обеспечения устойчивости живых систем и возможности их адаптации к изменяющимся условиям внешней среды.

40—1

35'

30-

25-

20-

■Ч-

—I— 20

—I—

—1 40

35-

30-

25-

______-Ч

—I— 10

—г~ 20

—г~ 30

—I

Рис.14. Изменение частоты аберрантных клеток в листовой меристеме озимой ржи в зависимости от поглощенной дозы и поколения растений, выращенных в условиях радиоактивного загрязнения (1, 2, 3 - номер поколения) По оси абцисс - доза облучения, сГр; по оси ординат - частота выхода аберрантных клеток, %

Рис.15. Изменение частоты аберрантных клеток в листовой меристеме озимой пшеницы в зависимости от поглощенной дозы и поколения растений, выращенных в условиях радиоаю-ивного загрязнения (1, 2,3 - номер поколения) По оси абцисс - доза облучения, сГр; по оси ординат - частота выхода аберрантных клеток, %

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Установленные в радиобиологических исследованиях закономерности биологического действия малых доз ионизирующего излучения имеют общебиологическое значение и являются одним из естественных проявлений фундаментальных механизмов обеспечения устойчивости живых систем и возможности их адаптации к меняющимся условиям внешней среды. Такой подход к пониманию механизмов и биологической сущности выявленного в радиобиологических экспериментах феномена качественно различной реакции клетки на облучение в больших и малых дозах открывает новые возможности исследования адаптивных реакций клеток на внешнее воздействие и позволяет с иных позиций оценить место радиобиологии в системе естественных наук.

2. В настоящее время не существует единой общепризнанной концепции биологического действия малых доз ионизирующих излучений. Используемые для оценки биологических эффектов малых доз модели, основанные на линейной беспороговой концепции, носят экстраполяционный характер, не имеют прочного биологического обоснования и входят в противоречие с имеющимися экспериментальными и эпидемиологическими данными.

3. Наблюдаемые в области малых и сопредельных с ними доз генетические эффекты обусловлены не столько повреждающим действием ионизирующего излучения либо иных факторов физической или химической природы, сколько особенностями реализации ответной реакции клетки на слабое внешнее воздействие и являются результатом развертывания во времени генетической программы, выбор конкретного варианта которой определяется интенсивностью и характером внешнего воздействия.

4. Закономерности выхода индуцированных низкодозовым облучением цитоге-нетических нарушений характеризуются ярко выраженной нелинейностью и имеют универсальный характер, различаясь для разных объектов значениями доз, при которых происходит изменение характера зависимости и которые определяются их чувствительностью к внешним воздействиям.

5. В зависимости от интенсивности внешнего воздействия существует четыре качественно различных типа ответной реакции клетки и соответствующие им участки кривой доза-эффект. При увеличении дозы от фоновых значений до предела, ограничивающего диапазон малых доз, дозозависимой величиной является число подвергшихся воздействию клеток, а не среднее число повреждений в каждой клетке, которое в этом диапазоне не зависит от дозы. Поэтому механизмы формирования ответных реакций клеток едины для всего диапазона малых доз, а выход генетических повреждений не будет отличаться от спонтанного уровня. Превышение предела, ограничивающего диапазон малых доз, активирует в клетке зависящую от мощности дозы реакцию адаптивного ответа. Именно функционированием репарационных систем адаптивного ответа может быть объяснено иногда наблюдаемое в этом дозовом диапазоне уменьшение выхода генетических повреждений. Дальнейшее увеличение интенсивности внешнего воздействия приводит к триггерному переключению клетки в иной режим

функционирования, для которого характерен повышенный выход генетических повреждений, обусловленный работой систем БОБ-ответа. Регистрируемое в этом диапазоне плато на дозовой зависимости служит своеобразным маркером перехода облученных клеток в качественно иной режим функционирования. Последний участок дозовой зависимости обусловлен переходом клетки в аварийный режим работы, когда мощности систем репарации оказывается недостаточно для эффективного устранения индуцируемых внешним фактором повреждений молекул ДНК. При этом приращение отклика следует за увеличением интенсивности воздействия индуцирующих повреждения факторов, т. е. кривая доза-эффект в этом диапазоне является монотонно возрастающей.

6. Принципиальная нелинейность ответной реакции клетки на слабые внешние воздействия позволяет в силу ее универсального (в отношении объектов воздействия) и неспецифического (в отношении действующего фактора) характера объяснить неравномерность темпов эволюционного процесса и понять, почему именно для эпох биосферных кризисов характерно его резкое ускорение. Проведенный анализ позволяет выделить по крайней мере две адаптивных стратегии, определяющие ответную реакцию клетки на внешнее воздействие - "пассивная" и "активная". "Пассивная" стратегия направлена на поддержание динамического равновесия испытавшей воздействие клетки и заключается в активации систем адаптивного ответа. При этом изменение внешних условий в определенном диапазоне компенсируется внутренними возможностями клетки. "Активная" стратегия создает предпосылки к увеличению пула изменчивости в подвергшейся воздействию популяции клеток и заключается в активации мутагенных систем вОЗ-ответа, а также дупликативной транспозиции МГЭ. Такое опосредуемое внешними факторами переключение стратегий поведения создает генетические предпосылки перехода от стабилизирующего отбора к направленному. С этих позиций нелинейность дозовой зависимости является математическим выражением способности клетки осуществлять выбор между этими стратегиями в зависимости от интенсивности внешнего воздействия.

7. Представленные в настоящей работе экспериментальные результаты и теоретические обобщения свидетельствуют о неправомерности линейной экстраполяции наблюдаемых при высоких и средних дозах биологических эффектов в область более низких доз. Поскольку выход цитогенетических повреждений в рассматриваемом диапазоне подчиняется нелинейному закону с дозонезависимым участком, их частота в этом, наиболее важном с точки зрения практических приложений случае, не может быть использована в качестве биологического дозиметра для оценки индивидуальных доз. Вместе с тем поскольку повышенный выход аберраций хромосом служит мерой общей дестабилизации генома, основанные на частоте цитогенетических повреждений показатели информативны и имеют важнейшее значение при выделении групп риска в отношении отдаленных последствий облучения (диапазон малых доз и адаптивного ответа - отсутствие дополнительного риска, диапазон БОБ-ответа - зона повышенного риска, диапазон "аварийного" ответа - монотонное увеличение риска с дозой).

8. В отличие от облучения в относительно больших дозах, биологический эффект которого проявляется главным образом в подвергшихся непосредственному воздействию клетках, монотонно зависит от дозы и полностью определяется ее величиной, частота наблюдаемых в области относительно малых доз биологических эффектов нелинейно зависит от дозы, а их реализация происходит в ряду потомков облученной клетки. Предпринятый анализ имеющихся экспериментальных данных о закономерностях индукции реплицирующейся нестабильности генома свидетельствует о том, что они не противоречат сформулированным представлениям о закономерностях биологического действия низкодозового облучения и их эволюционным следствиям, а построенная на основе вытекающих из предложенной нами концепции стохастическая модель адекватно описывает анализируемый феномен и может быть использована для оценки отдаленных генетических последствий радиационного воздействия.

9. Результаты экспериментального изучения закономерностей индукции аберраций хромосом в корневой меристеме облученных семян гексаплоидной пшеницы и ячменя свидетельствуют в пользу нелинейного характера дозовой зависимости 8 изученном интервале доз. При исследовании ячменя выявлен участок дозовой зависимости (1-10 Гр), в пределах которого частота аберрантных клеток статистически достоверно превышает спонтанный уровень и не зависит от величины дозы.

10. Оценен диапазон малых доз для проростков ячменя. Показано, что выход ци-тогенетических повреждений в области малых и сопредельных с ними доз носит нелинейный характер и характеризуется наличием статистически достоверно отличающегося от спонтанного уровня дозонезависимого плато в диапазоне 5.6-46.7 сГр. Результаты сопоставления качества аппроксимации экспериментальных данных с помощью математических моделей разной сложности свидетельствуют о том, что основанная на предложенной нами концепции биологического действия малых доз ионизирующего излучения кусочно-линейная модель достоверно лучше линейной и полиномиальных моделей описывает экспериментальные данные о выходе цитогенетических повреждений в области малых значений экспозиции.

11. Цитогенетический тест "частота аберрантных клеток в интеркалярной меристеме листьев" полностью отвечает требованиям по чувствительности и информативности, предъявляемым к биологическим тест-системам, предназначенным для индикации слабых воздействий повреждающих факторов разной природы. В частности, по чувствительности к действию ионизирующего излучения (позволяет достоверно регистрировать возрастание цитогенетических повреждений при дозах порядка единиц сГр) он сопоставим с классическим тестом "частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека".

12. В ходе проведения серии вегетационных экспериментов по изучению комбинированного действия ионизирующего излучения и солей тяжелых металлов (свинец, кадмий) на выход цитогенетических повреждений в интеркалярной меристеме ячменя показано, что если индукция аберрантных клеток в равной мере зависит от уровня исследованных факторов, то тяжесть их поражения определяется главным образом дей-

ствием тяжелых металлов. Синергические и антагонистические эффекты совместного действия индуцируются главным образом в области малых значений экспозиции исследованных агентов. Обнаружение в нашем исследовании достоверных синергиче-ских и антагонистических эффектов сочетанного действия, а также повышенного (на единицу дозы) выхода цитогенетических эффектов в области малых значений экспозиции исследованных агентов заставляет с осторожностью относиться к принятым в настоящее время нормам, устанавливающим пределы техногенного загрязнения и свидетельствует о необходимости учета нелинейных эффектов комбинированного действия факторов разной природы при нормировании техногенной нагрузки на природные и аграрные экологические системы.

13. Проведенные в 10-км зоне ЧАЭС эксперименты на сельскохозяйственных растениях наглядно продемонстрировали основные черты, характерные для ответной реакции биоты в условиях крупных радиационных аварий, а именно:

• в первый, наиболее острый период (в условиях чернобыльской катастрофы это весна-осень 1986 г.) радиационное поражение растений по основным цитогенетическим тестам напоминало эффект, вызываемый острым у-облучением в сопоставимых дозах;

• после стабилизации радиационной обстановки, несмотря на явно выраженную тенденцию к снижению со временем, в течение нескольких лет наблюдался повышенный и зависящий от степени радиоактивного загрязнения выход цитогенетических повреждений, причем скорость снижения их уровня значительно отставала от уменьшения радиоактивного загрязнения местности;

• хроническое низкодозовое облучение в районах, подвергшихся радиоактивному загрязнению в результате крупных радиационных катастроф, способно приводить к наследуемой дестабилизации генетических структур, выражающейся, в частности, в увеличении выхода цитогенетических повреждений и кариотипической изменчивости у потомков облученных организмов, что является отражением процессов цитогене-тической адаптации, происходящих в популяциях растений и животных под воздействием хронического низкодозового облучения.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. Сарапульцеа Б.И., Гераськин С.А. Генетическая природа феномена радиационной устойчивости клетки//Радиобиология. 1991.Т.31.Вып.4.С.593-599.

2. Гераськин С.А., Гайеоронский Э.В., Саралульцев Б.И. Концепция структурной минимизации риска в анализе радиационного и биохимического полиморфизма гекса-плоидной пшеницы//Генетика.1991.Т.27.№ 10.С.1860-1871.

3. Гераськин С.А., Сарапульцев Б.И. Автоматическая классификация биологических объектов по уровню радиационной устойчивости//Автоматика и телемехани-ка.1993.№ 2.С.182-189.

4. Гераськин С.А., Зяблицкая Е.Я., Удалова A.A., Бабчаник Л.Н. Генетические эффекты у растений в условиях комбинированного радиоактивного и техногенного загрязнения 30-километровой зоны ЧАЭС/В кн.: Проблема смягчения последствий чернобыльской катастрофы. Брянск, 1993.С. 360-363.

5. Козьмин Г.В., Ипатова А.Г., Гераськин С.А. и др. Сравнительная оценка воздействия на природные и аграрные экологические системы ионизирующих излучений и других физических факторов антропогенного происхождения/В кн.: Ядерная энергия и безопасность человека. Нижний Новгород,1993.С.106-108.

6. Гераськин С.А. Принципы эколото-генетического мониторинга загрязнения почв ксенобиотиками/В кн.: Мониторинг загрязнения почв ксенобиотиками и адсорбционные методы детоксикации. Краснодар,1993.С.7-10.

7. Гераськин С.А., Зяблицкая Е.Я., Удалова A.A. Статистический анализ мутагенной эффективности хронического облучения в малых дозах на фоне техногенного загрязнения среды//Генетика.1993.Т.29.№ 11.С.1901-1913.

8. Гераськин С.А., Дикарев В.Г., Дикарева Н.С. и др. Индукция аберраций хромосом в листовой меристеме при комбинированном воздействии облучения и тяжелых металлов. Исследование поверхности отклика многофакторного эксперимента// Радиационная биология.Радиоэкология. 1993.T.33.Вып.З(б). С.890-899.

9. Сарапульцев Б.И., Гераськин С.А. Генетические основы радиорезистентности и эволюция.М.: Энергоатомиздат,1983. 208 с.

10. Гераськин С.А., Фесенко C.B., Черняева Л.Г., Санжарова Н.И. Статистические методы анализа эмпирических распределений коэффициентов накопления радионуклидов растениями//Сельскохозяйственная биология. 1994.№ 1.С.130-137.

11. Гераськин С.А. Принципы и методы эколого-генетического мониторинга агро-экосистем/В кн.: Экологические проблемы сельскохозяйственного производства. Воронеж, 1994. С. 14-16.

12. Гераськин С.А., Зяблицкая Е.Я., Удалова A.A. Закономерности индукции у-радиацией структурных мутаций в корневой меристеме проростков семян гексаплоид-ной пшеницы//Радиационная биология.Радиоэкология.1995.Т.35. Вып.2.С.137-149.

13. Гераськин С.А., Сарапульцеэ Б.И. Стохастическая модель индуцированной нестабильности генома//Радиационная биология.Радиоэкология.1995.Т.35.Вып.4. С. 451-462.

14. Гераськин С.А., Дикарев В.Г., Удалова А.А. и др. Закономерности индукции структурных мутаций в листовой меристеме ячменя в условиях комбинированного действия ионизирующего излучения и тяжелых металлов// Доклады Академии Наук. Общая биология. 1995. Т.343. № 6. С.844-847.

15. Гераськин С.А. Критический анализ современных концепций и подходов к оценке биологического действия малых доз ионизирующего излучения// Радиационная биология. Радиоэкология. 1995.Т.35.Вып.5.С.563-571.

16. Гераськин С.А. Концепция биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки//Радиационная биология.Радиоэкология. 1995. Т.35. Вып.5. С.571-580.

17. Гераськин С.А., Козьмин Г. В. Оценка последствий воздействия физических факторов на природные и аграрные экологические системы//3кология. 1995.№ 6.С.419-423.

18. Гераськин С.А., Дикарев В.Г., Дикарева Н.С., Удалова А.А. Влияние раздельного действия ионизирующего излучения и солей тяжелых металлов на частоту хромосомных аберраций в листовой меристеме ярового ячменя// Генетика. 1996,Т.32.№ 2.С.272-278.

19. Гераськин С.А., Дикарев В.Г., Удалова А.А., Дикарева Н.С. Влияние комбинированного действия ионизирующего излучения и солей тяжелых металлов на частоту хромосомных аберраций в листовой меристеме ярового ячменя //Генетика. 1996.Т.32.№ 2.С.279-288.

20. Зяблицкая Е.Я., Гераськин С.А., Удалова А.А., Спирин Е.В. Анализ генетических последствий загрязнения посевов озимой ржи радиоактивными выпадениями Чернобыльской АЭС//Радиационная биология.Радиоэкология.1996. Т.36.Вып.4.С.498-505.

21. Гераськин С.А., Дикарев В.Г., Зяблицкая Е.Я. Оценка биологических последствий техногенного загрязнения природных и аграрных экологических систем//Вестник РАСХН.1996.№ 4.С.27-28.

22. Geraskin S.A., Alexakhin R.M., Dikarev V.G. et al. Biiological effects in agricultural plants induced by radiation: experimental results and theoretical analysis/ In: International Symposium on Ionising Radiation.Proceedings V.I.Stockholm,1996. P.136-141.

23. Alexakhin R.M., Geraskin S.A., Fesenko S.V. The accident at the Chernobyl nuclear power plant and the problem of estimating the consequences of radioactive contamination of natural and agricultural ecological systems/ In: International Symposium on Ionising Radiation.Proceedings V.2.Stockholm,1996. P.516-521.

24. Гераськин C.A., Севанькаев A.B. Цитогенетические эффекты малых доз: результаты Н.В.Лучника и современное состояние вопроса//Радиационная биоло-гия.Радиоэкология.1996.Т.36.Вып.6.С.860-864.

25. Geraskin S.A. Problem of estimating genetic consequences of low-doss irradiation/In; Proceedings of International Symposium on Radiation Safety.Obninsk Russia, 1996.P.302-309.

26. Гераськин C.A., Зяблицкая Е.Я., Удалова A.A. Закономерности выхода струк турных мутаций в корневой меристеме облученных ионизирующим излучением семяь ячменя//Радиационная биология. Радиоэкология. 1997. Т.37. Вып.1.С. 82-90.

27. Geraskin S.A., Dikarev V.G., Zyablitzkaya E.Ya., Oudalova A.A. Regularities о cytogenetic induction by low doses of radiatioon/ln: Health effects of low dose radiation London,UK: BNES,1997.P.40-43.

28. Geraskin S.A., Dikarev V.G., Oudalova A.A., Alexakhin R.M. Problem of correc assessment of cytogenetic effect indust by low doses of ionising radiation/In: Low doses о ionizing radiation: biological effects and regulatory control.Contributed papers. Seville Spain,1997. P.687-690.

29. Гераськин C.A., Дикарев В.Г., Удалова A.A. и др. Анализ цитогенетически) последствий хронического облучения в малых дозах посевов сельскохозяйственны; культур//Радиационная биология.Радиоэкология.1998.Т.38.Вып.З. С.367-374.

30. Гераськин С.А., Дикарев В.Г., Удалова АА, Дикарева Н.С. Закономерности, индукции малыми дозами ионизирующего излучения цитогенетических повреждений е корневой меристеме проростков ячменя//Радиационная биология. Радиоэкология 1998. Т.38.Вып.6, в печати.

31. Гераськин С.А., Севанькаев А.В. Универсальный характер закономерностей индукции цитогенетических повреждений низкодозовым облучением и проблема оценки генетического рискаЯРадиационная биология. Радиоэкология.1999.Т.39.Вып.1, в пе чати.

32. Geraskin S.A., Dikarev V.G., Dikareva N.S., Vasiliev D.V. Common trends in the formation of cytogenetic damage at low doses and the problem of bioindication of low leve radiation exposure//Applied Radiation and Isotopes, in press.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Гераськин, Станислав Алексеевич, Обнинск

л ; /

/ /

¡; Президиум ВАК России

¡1 (решение от " А, " С У г., № ^/¿7

| присудил ученую степень,

аеах рукописи

Гераськин Станислав Алексеевич

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ

Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.01 - Радиобиология

Научный консультант доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН P.M. Алексахин

Обнинск - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................. 6

ГЛАВА I. Проблема оценки цитогенетических эффектов малых доз ионизирующего излучения............................................................................... 13

1.1. Критический анализ современных концепций и подходов к оценке биологического действия малых доз ионизирующего излучения........................................................................................................................................................................................................................13

1.2. Концепция биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки............................................................................... 23

1.2.1. Определение понятия "малые дозы" и анализ экспериментально наблюдаемых реакций клеток на низкодозовое облучение.......... 25

1.2.2. Молекулярно-клеточные механизмы формирования ответной

реакции клетки на облучение в малых дозах............................................... 31

1.2.3. Общебиологические и прикладные следствия.................................... 38

1.2.4. Формулировка концепции биологического действия малых

доз ионизирующего излучения на клетки..................................................... 49

ГЛАВА II. Верификация концепции биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки.............................................. 53

2.1. Исследование феномена индуцированной нестабильности генома..................................................................................................................... 53

2.1.1. Проблема индуцированной внешним воздействием дестабилизации генома.................................................................................................... 53

2.1.2. Стохастическая модель индуцированной нестабильности

генома.................................................................................................................. 59

2.1.3. Верификация модели и результаты численных экспериментов............. 63

2.2. Верификация концепции на данных об индукции ионизирующим излучением цитогенетических повреждений у сельскохозяйственных растений................................................................................................ 72

2.2.1. Закономерности индукции структурных мутаций в корневой меристеме проростков облученных семян

гексаплоидной пшеницы.................................................................................... 73

2.2.2. Закономерности выхода структурных мутаций в корневой меристеме проростков облученных ионизирующим излучением

семян ячменя....................................................................................................... 81

2.2.3. Закономерности индукции малыми дозами ионизирующего излучения цитогенетических повреждений в корневой меристеме проростков ячменя.............................................................................................. 85

2.2.3.1. Оценка диапазона малых доз для проростков ячменя и теоретическое (априорное) предсказание формы дозовой зависимости.................................................................................................................... 86

2.2.3.2. Эмпирические закономерности выхода цитогенетических повреждений в корневой меристеме облученных малыми дозами проростков ячменя.............................................................................................. 89

2.2.3.3. Восстановление формы дозовой зависимости в области

малых значений экспозиции............................................................................... 94

ГЛАВА III. Закономерности формирования и методы оценки генетических эффектов комбинированного действия малых доз и концентраций факторов разной природы............................................................ 98

3.1. Сравнительный анализ мутагенной эффективности наиболее распространенных стрессоров............................................................................ 98

3.2. Молекулярно-клеточные механизмы формирования нелинейных эффектов в условиях комбинированного

действия факторов разной природы................................................................. 108

3.3. Методы анализа поверхности отклика биологической

системы на комбинированное воздействие....................................................... 113

3.4. Индукция ионизирующим излучением и тяжелыми металлами цитогенетических повреждений в листовой меристеме ячменя...................... 126

3.4.1. Раздельное действие............

3.4.2. Комбинированное действие

126 137

ГЛАВА IV. Анализ генетических последствий аварии на Чернобыльской АЭС на примере растительных компонентов аграрных

экологических систем....................................................................................... 152

4.1. Цитогенетические последствия загрязнения посевов озимой

ржи радиоактивными выпадениями Чернобыльской АЭС в 1986 г................ 153

4.2. Цитогенетические последствия хронического низкодозового облучения сельскохозяйственных культур в 30-километровой

зоне ЧАЭС в 1987-1989 гг.................................................................................. 160

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................. 172

ВЫВОДЫ........................................................................................................... 176

ПРИЛОЖЕНИЕ. Методика оценки статистических характеристик эмпирических распределений............................................................................ 183

ЛИТЕРАТУРА................................................................................................... 193

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Рост населения и масштабы производственной деятельности человечества выдвинули антропогенное воздействие на природные процессы в число наиболее значимых экологических факторов, определяющих новые условия существования и эволюции всей биоты, включая человека. Люди оказались перед необходимостью строить свою деятельность с учетом параметров, определяющих устойчивость биосферы и, соответственно, границ этой устойчивости. С этих позиций важнейшим является вопрос о возможных последствиях для всего живого такого глобального и быстрого (с точки зрения биологической эволюции) изменения уровня техногенной нагрузки на биосферу. Результаты наших экспериментов и анализ литературных данных свидетельствуют о существенном ускорении мутационного и рекомбинационного процессов в подвергшихся внешнему воздействию популяциях растений и животных, увеличении генетического груза. Опыт изучения генетических последствий радиационных аварий на Южном Урале и в Чернобыле [168-170] позволяет заключить, что перечисленные явления служат отражением происходящих на загрязненных территориях сложных адаптационных процессов, результатом которых является перестройка генетической структуры популяций. Фактическое отсутствие научно обоснованных экологических нормативов и весьма смутное представление о том, где и в какой мере превышен допустимый уровень воздействия, ведущего к разрушению экосистем и снижению биоразнообразия, делает актуальным анализ закономерностей формирования и разработку количественных методов оценки генетических эффектов, индуцированных малыми дозами ионизирующего излучения и других техногенных токсикантов.

Анализ причин полученных в независимых исследованиях 20-30-кратных расхождений в оценках медицинских последствий аварии на Чернобыльской АЭС показал [44], что они не могут быть следствием относительно небольших отклонений в оценке ожидаемой коллективной дозы, а обусловлены главным образом различиями в оценке выхода генетических и канцерогенных нарушений в области малых значений экспозиции. Таким образом, оценка генетических последствий крупных радиационных аварий и, в частности, аварии на Чернобыльской АЭС, существенным образом зависит от того, какой концепции в отношении биологического действия малых доз ионизирующего излучения придерживается автор.

Решение практических задач охраны окружающей среды невозможно без создания прочной научной основы для оценки биологических эффектов комбинированных воздействий факторов разной природы и разработки соответствующих количественных критериев, которые носили бы по возможности универсальный характер. Сложные, разнонаправленные процессы, индуцируемые в клетке комбинированным воздействием факторов разной природы, включающие, в частности, как индукцию систем репарации, так и подавление их работы, способны, в зависимости от их соотношения, формировать самые разные ответные реакции - от антагонизма до синергизма. Подтверждением этого являются многочисленные примеры [26,68,104,116] нелинейного изменения величины и характера отклика биологической системы при изменении порядка, уровней и времени воздействия. Поэтому результирующий отклик биологической системы на комбинированное воздействие нельзя предвидеть исходя только из информации об эффектах раздельного действия каждого из факторов.

В числе основных задач исследования рассматривались:

2. Изучение закономерностей индукции малыми дозами ионизирующих излучений цитогенетических повреждений в корневой меристеме облученных семян и проростков, а также в листовой интеркалярной меристеме сельскохозяйственных растений.

-показано, что закономерности выхода цитогенетических нарушений в области малых доз характеризуются ярко выраженной нелинейностью и имеют универсальный характер, различаясь для разных объектов значениями доз, при которых происходит изменение характера зависимости;

-показано, что используемые для оценки генетического риска малых доз модели, основанные на линейной беспороговой концепции, носят экстраполяционный характер, не имеют прочного биологического обоснования и входят в противоречие с имеющимися экспериментальными данными;

-дан анализ экспериментально наблюдаемых реакций клеток на облучение в низких дозах и рассмотрены возможные молекулярно-клеточные механизмы формирования их ответной реакции на низкодозовое облучение;

-предложена концепция биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки;

-дан анализ проблемы индуцированной внешним воздействием нестабильности генома и предложена стохастическая модель этого процесса;

-экспериментально изучены закономерности индукции малыми дозами ионизирующего излучения структурных мутаций в корневой меристеме проростков и семян, а также в листовой интеркалярной меристеме сельскохозяйственных растений;

-экспериментально изучены закономерности формирования цитогенетических эффектов в листовой меристеме ячменя в условиях комбинированного воздействия ионизирующего излучения и тяжелых металлов;

-показано, что синергические эффекты индуцируются преимущественно в условиях сочетанного действия малых экспозиций повреждающих агентов;

-на примере растительных компонентов аграрных экологических систем дан анализ генетических последствий аварии на Чернобыльской АЭС.

На защиту выносятся следующие группы результатов:

-концепция биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки;

Теоретическая и практическая значимость. В радиобиологии давно назрела проблема принципиального пересмотра взглядов на характер радиационного воздействия на клетки. Регистрируемые в экспериментах ответные реакции на облучение являются отражением определенных принципов организации и функционирования эукариотической клетки. С этих позиций закономерности выхода цитогенетических повреждений представляют собой эпифеномен индуцированных низкодозовым облучением глобальных структурных и функциональных перестроек генома. Неспецифический характер анализируемых закономерностей и широкий спектр объектов, на которых они наблюдаются, свидетельствует о том, что мы имеем дело с общебиологическим феноменом. В основе этого типа реакций клеток лежат фундаментальные механизмы, появившиеся задолго до дифференциации высших многоклеточных организмов и отражающие эволюционно закрепленный комплекс адаптивных реакций клетки на внешнее воздействие. С этих позиций повышенная генетическая эффективность низкодозового облучения имеет простое и естественное объяснение как одно из проявлений процессов цитогенетической адаптации, происходящих в популяциях живых организмов в ответ на стрессовое воздействие. Так же, как открытое радиобиологами явление репарации молекул ДНК переросло масштабы этой науки и имеет несомненное общебиологическое значение, так и установленные в радиобиологических исследованиях закономерности биологического действия малых доз ионизирующего излучения являются не артефактом или какой-то экзотической "аномальной" реакцией, а служат одним из естественных проявлений лежащих в основе жизни фундаментальных механизмов обеспечения устойчивости живых систем, что позволяет с иных позиций оценить место радиобиологии в системе естественных наук.

зирующего излучения, природы радиационной надежности живых организмов и, в качестве нового теоретического базиса, может быть использовано для оценки генетического риска низкодозового облучения на фоне антропогенного загрязнения среды. Результаты выполненных в ходе подготовки диссертационной работы исследований и разработанные подходы использовались при оценке биологических последствий аварии на Чернобыльской АЭС (программа TF-5 Международного союза радиоэкологов), при подготовке Национального доклада Российской Федерации "Десять лет после аварии на Чернобыльской АЭС" и научного приложения к докладу НКДАР Генеральной Ассамблее ООН за 1996 г. "Effects of radiation on the environment". В настоящее время разработанные в ходе выполнения диссертационной работы методические подходы используются для оценки воздействия предприятия по переработке и хранению радиоактивных отходов JICK "Радон" на растительные компоненты природных экологических систем (Проект МНТЦ N 535).

сности (Обнинск, 1996), Конференции "Научные основы ведения агропромышленного производства в условиях крупных радиационных аварий" (Обнинск, 1996), Конференции "Хромосомы и радиация", посвященной памяти Н.В.Лучника (Обнинск, 1997), III Международной конференции "Health Effects of Low Dose Radiation: Challenges for the XXI Century" (Стредфорд-на-Эйвоне,1997), III съезде по радиационным исследованиям (Москва, 1997), Международной конференции "Low Doses of Ionizing Radiation: Biological Effects and Regulatory Control" (Севилья, 1997), Межд�

Информация о работе

Гераськин, Станислав Алексеевич
доктора биологических наук
Обнинск, 1998
ВАК 03.00.01

Диссертация

Закономерности формирования цитогенетических эффектов малых доз ионизирующего излучения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы