Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические эффекты хронического облучения малыми дозами ионизирующего излучения

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Генетические эффекты хронического облучения малыми дозами ионизирующего излучения"

г- -

с.о

мсх:ко лскии I осудагствш ш ый У1 т ш-геитпт

о> имени М.В.ЛОМОНОСОВА

г

г ^

СХ/

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЫЕТ

На правах рукописи УДК 575.224:595.773.4:614.876:621.039.58

ЗЛЙНУЛЛИН Владимир Габдуллович

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ МАЛЫМИ ДОЗАМИ ИОЮВИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ

03.00.01—радиобиология

ДИСС1:1'1ЛЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук п форме научного доклада -

МОСКВА 1997

Работа выполнена в Отделе радиоэкологам Института биолопш Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук В.А. Шевченко профессор, доктор биологических наук М.М. Асланян профессор, доктор химических наук A.M. Серебряный

Ведущее учреждение—Медицинский радиологический научный

центр РАМН, Обнинск

Защита состоится " гг^/^ $-г 1997 г. в ^ часов на заседании диссертационного Совета Д.053.05.74. в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, г.Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Отзывы просим направлять по адресу: 119899, г.Москва, ГСП, Ленинские горы, Биологический факультет, Диссертационный Совет Д.053.05.74.

Автореферат разослан " ^ " Сл-^/Л dps_[997 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор ^ О.РЖольс

Введение.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность нроблеиы. Проблематика действия малых доз радиации является весьма обширной и затрагивает вопросы развития жизни на нашей планете, с начала своего возникновения подверженной влиянию низких доз ионизирующей радиации в качестве возможного и существе! гного фактора эволюции. Существуют два аспекта проблемы малых доз: физический и биологический, причем физический аспект изучен гораздо лучше, чем биологический (Bond, Feinendegen, Booz, 1988; Booz, Feinendegen, 1988; Карпфель, Драшил, 1989).

В современной биологии авария на Чернобыльской АЭС акцентировала особое внимание на проблемах генетических последствий облучения как для человека, так и для остальных представителей животного и растительного мира. Без сомнения, до 1986 г., были получены интереснейшие результаты (Биологическое действие ионизирующих излучений, 1957; Scott, Evans, 1959; Ионизирующее излучение и наследственность, I960; Ли, 1963; Тимофеев-Ресовский, Иванов, Корогодин, 1968; Кузин, 1970,1973; Ганас-си 1976; Митрофанов, Олимпиенко, 1980; Шевченко, Померанцева, 1985 ), позволившие более быстро и более рационально подойти к интерпретации результатов, полученных при анализе данных биологических и медицинских исследований в зоне аварийна Чернобыльской АЭС (Пелевина, Рябов, Рябцев и др., 1991; Последствия Чернобыльской катастрофы: ЗдоровьеСре-ды.; Здоровье Человека, 1996а, б).

Первыерезулътаты анализа последствий аварии Чернобыльской АЭС определили особую значимость проблем модификации радиобиологических эффектов факторами окружающей среды (Виленчик, 1991). Однако не менее значимыми становятся проблемы биологической эффективности малых доз радиационного фактора. При принятии этих положений фазу же возникает еще одна проблема, не менее важная чем предыдущие, - проблема измерения дозы и ее определение как "низкая", "промежуточная", "высокая" и "очень или сверхвысокая". В соответствии с условиями, принятыми в докладе НКДАРООН за 1986 год (UNSCEAR, 1986) они равны 0-0.2; 0.2 - 2.0; 2.0 -10.0 исвыше 10 Гр. Придерживаясь того же принципа, можно указать, что низкие мощности дозы для всех видов излучения - это мощности < 0.05 мГр/мин, высокие мощности - это мощности > 0.05 Гр/мин, а промежуточные мощности дозы попадают в диапазон между этими двумя цифрами. Однако, эта классификация не обязательно отражает относительную биологическую эффективность, что может привести к некоторой нео-

днозначносги при интерпретации получаемых результатов, т.е. одна и та же доза по отношению к одним инициируемым радиацией эффектам будет малой, к другим-иной. Согласно Д .М.Спитковскому с соавторами величина малой дозы в основном определяется долей пораженных мишеней и варьирует для вдер лимфоцитов дня гамма-лучей "Со -0.13, для альфа частиц 4Мэв - 35 сГр (Спитковский, Зайцев, Талызина, 1994).

Крайне сложно определить величины малых доз радиации для условий аварийно (экспериментально) радиоактивно-загрязненных территорий как это случилось при аварии на Чернобыльской АЭС. Поэтому в нашей работе мы стараемся придерживаться формализованного подхода к определению "малых доз", предложенного НКДАР ООН. В этом случае, при анализе последствий аварии на Чернобыльской АЭС для биологических систем мы имеем дело, в большинстве случаев, с последствиями пролонгированных (в раде случаев хронических) облучений "малыми дозами", а именно облучением в дозах не превышающих 0.2 Гр при излучении с малой величиной линейной потери энергии (ЛПЭ) и 0.05 Гр при излучении с высокой ЛПЭ (ЦИБСЕЛЫ, 1986)..

При решении вопроса о генетической опасности малых доз ионизирующей радиации основным является принятие или непринятие "понятия" пороговой дозы, т.е. дозы не способной шщуцнровать мутации. Классической концепцией, основанной на данных многочисленных экспериментов с рядом организмов от микроорганизмов до человека, является признание следующих позиций:

- частота возникновения индуцированных радиацией хромосомных аберраций пропорциональна квадрату дозы облучения;

- частота индукции точковых мутаций находится в прямой линейной зависимости от величины дозы; причем для данного типа мутаций наблюдается кумулятивносгь мутагенного эффекта, т.е. получение при данной дозе одного и того же количества мутаций как при од новременном, так и при фракционированном облучении;

- с уменьшением дозы возрастает относительное значение точковых мутаций.

' . Из этих п оложений логически, на наш взгляд, следуют следующие выводы:

- отсутствие порога мутабильности: самые малые дозы ионизирующей радиации должны индуцировать мутации;

-пролонгированное (хроническое) облучение малыми дозами может в результате кумулирования эффекта действия оказывать существенное влияние на возрастание мутабильности;

- возрастание уровня мутабильности может привести к существенным микроэволюционным событиям.

Принятие этих выводов нацело исключает возможность признания какой-либо генетически безвредной дозы облучения и выдвигает необходимость разработки мер защиты от облучения даже крайне минимальными дозами.

Итак, проблема генетической опасности малых доз радиации приобретает два аспекта: это, во-первых, проблема изучения механизмов действия малых доз радиации. Разрешение этого вопроса, кроме решения множества прикладных задач, поможет лучшему пониманию процессов эволюции, процессов генотипической адаптации организмов к изменяющейся окружающей среде. Во-вторых, данная проблема обуславливает необходимость исследований направленных на поиск и изучение механизмов, снижающих генетическую опасность монтирующего излучения для организмов.

Цель исследований заключалась в выявлении закономерностей реакции генотипа животных организмов на хроническое действие малых доз радиации. Используя данные цитогенегаческого обследования контингента лиц, привлекавшегося к ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС, необходимо было оценить влияние малых доз ионизирующего излучения на генотип человека и корректность использования цитогенети-ческого метода в целях биологической дозиметрии при облучении in vivo. .

В задачи исследований входило изучение: ~ т

- последствий пролонгированного (хронического) облучения малыми дозами ионизирующих излучений для генотипа животных и человека;

- реакции "доза - эффект" животных и человека при облучении в диапазоне малых доз;

- динамики уровня мутабильносги природных популяций и лабораторных линий дрозофилы в условиях хронического облучения малыми дозами;

- динамики уровня цитогенетических нарушений мышевидных грызунов в условиях хронического облучения малыми дозами;

- уровня цитогенетических нарушений в клетках периферической крови человека, облучившегося при ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС.

Научная новизна. Впервые исследована реакция генотипа клеток периферической крови человека на кратковременное, фракционированное, пролонгированное и в комбинациях облучение in vivo. Показано, что облучение в зоне аварии на Чернобыльской АЭС привело.к достоверно значимому увеличению частоты хромосомных аберраций в клетках периферической крови людей. Решение уравнений зависимости "доза-эффект" по-

зволило определить величины " аппроксимирующих минимально действующих доз", колеблющихся в диапазоне 0.005 - 0.0007 сГр. Эффективность кратковременного облучения оказалась в 5 раз выше пролонгированного.

Впервые как для лабораторных животных, так и для природных популяций животных показан полимодальный характер зависимости в реакциях "доза - эффект". Можно обнаружить, по крайней мере, три "пика", объяснимых наличием трех механизмов утилизации повреждений, индуцированных ионизирующим излучением в разных дозах.

Обнаруживаемая зависимость универсальна и характерна практически для всех организмов, поскольку в основе ее лежат механизмы внутриклеточного реагирования, универсальность которых общеизвестна. Величина и характер зависимости "доза-эффект" может быть модифицирована практически любым, действующим на клетку фактором В диапазоне "малых доз", выявленные нами закономерности делают трудновыполнимыми любые прогностические оценки.

Для большинства обследованных видов животных выявлен надли-нейный характер зависимости "доза-эффект". Показаны различия в реакции соматических и половых клеток животных на хроническое облучение в малых дозах;

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты о реакции генотипа животных и человека на воздействие хронического облучения в малых дозах существенно дополнили наши представления о механизмах действия ионизирующего излучения. Показано, что облучение в малых дозах может приводил, к значимому изменению уровня мутабильнос-ти и цигогенетических нарушений. Предполагается, что в основе изменения величины генотипической изменчивости могут лежать механизмы дестабилизации генотипа, обеакчевшью индукцией эпиоомоподобных структур.Этот механизм реагирования живых организмов на действие ионизирующей радиации в малых дозах позволяет объяа игь неоднозначность при определении величин биологической эффективности действующего фактора

Резулыаты исследований позволяют дать объяснеше получаемым данным об "аномальных эффектах" при исследованиях биологической эффективности малых доз (концентраций) факторов окружающей среды, а также дополняют наши представления о механизмах адаптации организмов и микроэволюционных событий, происходящих в популяциях животных в измененных условиях окружающей среды.

Результаты исследований использовались при медицинских обследованиях участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС, при разработке прогнозов последствий аварии на Чернобыльской АЭС для флоры и фауны.

Личный вклад диссертанта в разработку научных результатов, выносимых на защиту. Автор работы принимал участие: в сборе материала (отлов и отбор животных образцов в зоне аварии га Чернобыльской АЭС; взятии периферической крови у "ликвидаторов" последствий аварии на Чернобыльской АЭС); в проведении экспериментальных работ (приготовление препаратов хромосом человека, мышевидных грызунов, гибридологический анализ дрозофилы). Самостоятельно выполнен анализ всего первичного материала, сформулированы положения и выводы работы.

Настоящая работа является частью исследований, проводимых Отделом радиоэкологии Коми научного центра Уральского отделения РАН в рамках комплексной программы по ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС (постановление Совета Министров СССР от 01.11.1986 г. "Влияние радиоактивного загрязнения на флору и фауну"; научно-иоследо-вательских тем "Влияние закономерностей сочетай юго действия факторов радиационной и нерадиационной природы на популяции животных и растений, обитающих в природных биогеоценозах"; "Комбинированное действие ионизирующей радиации и других факторов физической и химической природы на популяции животных и растений".

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались й обсуждались на XIU Международном генетическом конгрессе (Москва 1978); IU Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1979); Ш конференции по теоретическим вопросам мутагенеза (Вильнюс, 1980); IU съезде ВОГИС (Кишинев, 1981); Всесоюзной конференции Генетические аспекты проблемы "Человек и биосфера" (Ереван, 1987); U Международной конференции " Bioindicatóres deteriorisations regions"(Ceske Budejovice, 1988); Всесоюзном совещании "Генетический мониторинг населения промышленных городов в условиях загрязнения окружающей среды" (Кемерово, 1988); Всесоюзном совещании "Эколого-ге-нетические последствия воздействия на окружающую среду антропогенных факторов"(Сыкгывкар, 1989); I и II радиобиологических съездах Москва, 1989; Киев, 1993); Всесоюзных и международных совещаниях, конференциях, посвященных радиобиологическим последствиям аварии на Чернобыльской АЭС (Пущино, 1988,1990; Брянск, 1991; Москва, 1991,1994; Минск, 1991; Зеленый Мыс, 1990, 1996)

Публикации. Материалы и положения диссертации нашли свое отражение в 64 научных работах, в том числе в монографии "Генетические эффекты хронического облучения малыми дозами ионизирующего излучения" СПб: Наука. Общий объем публикаций, посвященных теме работы, около 30 печатныхлистов.

Положения, выносимые на защиту.

- Чувст вительность клеток периферической крови человека к кратковременному, фракционированному, пролонгированному облучению малыми дозами радиации in vivo.

- Генетическая изменчивость лабораторных линий дрозофилы, мышей, полевок-экономок и природных популяций дрозофилы и мышевидных грызунов в условиях хронического и пролонгированного облучения малыми дозами ионизирующего излучения.

- Общность действия малых доз ионизирующего излучения на клетки животных, насекомых и человека.

Глава 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ Ц ИТОГЕНЕТИ ЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ УЧАСТНИКОВ ЛИКВИДАЦИИ ПОСЛЕДСТВИЙ АВАРИИ НА ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ АЭС

Авария на Чернобыльской АЭС поставила перед цитогенетикой человека ряд вопросов - одним го них был вопрос о правомочное™ использования цигогенетического метода в качестве метода биологической дозиметрии. Из клеток организма наиболее перспективными для целей биологической дозиметрии являются лимфоциты периферической крови. Регистрируя индуцированные в них хромосомные аберрации, можно получить, как считалось, достаточно хорошее представление о полученной организмом дозе облучения.

К настоящему моменту в литературе имеется достаточно информации об эффектах ионизирующей радиации самых различных характеристик на лимфоциты пфифф! пеской крови, как in vivo, так и in vitro и об использовш ши щггогенешческого теста в целях биодозиметрии (Севанькаев, Насонов, 1978; Севанькаев, 1991;Evans, Lloyd, 1978; Ishihara, Sasaki, 1983; Lloyd, Purrot, 1981, IAEA, 1986; Мазник, 1987; Carrano, Natarajan, 1988; Pohl-Rulling, Fisher, Pohl, 1978; Pohl-Rulling et.al., 1990; Pohl-Rulling, 1990). Суммируя результаты этих исследований, можно сделать следующие выводы:

- аберрации хромосомного типа появляются строго в соответствии с превышением нормального, природного барьера дозовой нагрузки, с незначительным влиянием ЛПЭ;

- добавочное облучение дозами 0.3-5 сГр, полученное остро или накопленное за год, либо очень слабо влияет на частоту аберраций, либо вообще не влияет. Из данных, накопленных к настоящему времени, следует, что кривая дозового ответа имеет плато в этом диапазоне доз;

- второе отклонение от предполагаемого воздействия радиации (двух-компонентная теория), по-видимому, происходит при облучении в дозах свыше 5 сГр;

- при более высоких дозах, свыше 30 сГр, дозовая динамика соответствует общепринятой концепции действия радиации на биологические системы;

- плато, (см. п.2), было экспериментально объяснено существованием ферментов репарации, стимулирующихся определенными нарушениями ДНК, происходящими при определенных дозах.

Нами в исследованиях уровня цитогенетических нарушений у воинского контингента, участвовавшего в ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС, была изучена дозовая зависимость выхода хромосомных аберраций в зависимости от характера облучения с помощью математической модели разработанной ранее (Зайнуллин и др., 1988; Сусшжов и др., 1980) и несколько модифицированной сучетом особенностей настоящего исследования.

1.1. Материал и методы исследований. Радиационная обстановка на промплощадке Чернобыльской АЭС, где работали обследуемые в августе-сентябре 1986 г., характеризовалась большими колебаниями экспозиционных доз внешнего гамма-излучения на относительно небольших участках (от нескольких миллирентгенов до сотен рентгенов в час) и наличием высокоактивных точечных источников. Наиболее высокие значения мощности экспозиционных доз отмечались на крышах некоторых зданий, которые достигали в отдельных местах 1000 Р/ч. Внешнему гамма-излучению сопутствовало и внешнее бета-излучение со средней энергией 0,65 МэВ.

В зависимости от уровней излучения, кратности и длительности радиационного воздействия нами выделены пять наиболее характерных вариантов облучения персонала: кратковременное облучение; кратковременное облучение, которому предшествовало пролонгированное облучение; фракционированное облучение; состоящее из двух фракций кратковременного облучения, каждая из которых была не менее 5 Р; фракционированное облучение го 2-12 фракций кратковременного облучения, каждая из которых была не более 2 Р; пролонгированное облучение (доза за 4-6-8 часов работы не более 1Р).

Обследуемый контингент состоял из практически здоровых людей в возрасте от 27 до 45 лет. Лимфоциты периферической крови культивирова-

ли по несколько модифицированному методу (Методы анализа хромосомных аберраций у человека, 1975).

1.2. Результаты и обсуждение. Как мы уже отмечали, особую актуальность проблема малых доз ионизирующей радиации приобрела в связи с возникшей необходимостью оценки и прогнозирования неблагоприятных последствий аварии на Чернобыльской атомной станции для здоровья человека и популяции в целом. Существующие в настоящее время оценкириска негативных последствий действия малых доз облучения основаны, как известно, т экстраполяции эффектов с высоких доз на низкие. Одна из главных причин вынужденного использования эксграполяционного подхода к оценкам действия низких доз заключается в отсутствии в радиобиологических исследованиях четких количественных данных об их биологическом действии, а получаемые во многих лабораториях данные свидетель-' ствуют о том, что количественные закономерности формирования структурных повреждений хромосом в геноме соматических клеток человека в области низких доз отличают ся от действия высоких доз (Севанькаев, 1991).

Из таблицы 1 видно, что уровень хромосомных аберраций в клетках периферической крови гражданского населения тт. Припять и Чернобыль, облучившегося в результате аварии на Чернобыльской АЭС, значительно выше контрольных значений. Однако эти различия достоверны (р< 0.05) только для данных цитогенетического обследования 1986 года.

Таблица!

Уровень хромосомных аберраций у гражданского населения г.г. Припять, Чернобыль, подвергшихся облучению в результате аварии на Чернобыльской АЭС

Год Пал N Хромосомные Дицетрические

аберрации(%) хромосомы (%)

1986 м 51 1.1 0.45 + 0.08

ж 13 0.24 0.12 + 0.04

1987 м 8 0.99 0

ж 13 0.97 0.08± 0.04

контроль * 0.05

Примечание: * цит. по: Семов и др., 1994.

Следует отметить, что столь же существенное увеличение уровня цигогенетических нарушений у лиц подвергшихся радиоактивному загряз-

нению в результате аварии на Чернобыльской АЭС в 1986 году отмечено многими авторами (Stephan, Ocstreicher, 1988; Пилинская и др. 1991; Во-робцоваидр. 1994;Семовидр. 1994 и др.). Обращает на себя внимание тот факт,'что уровень дицентрических хромосом, индуцированных облучением в 1986 году выше у лиц мужского пола, что, по-видимому, можно объяс-шггб большей поглощенной дозой (табл. 1). Цитогенетическое обследова-inie фажданского населения той же профессиональной группы в 1987 году не выявил существенных отличий от контрольного уровня, что можно связать с резким снижением вероятности "непредусмотренного" облучешв!.

В 1986 году совместно со специалистами Министерства Обороны СССР и Министерства Здравоохранения СССР были проведены щтгогене-тическйе обследования воинского контингента, привлекавшегося к ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС.

' Как показал анализ препаратов хромосом, улиц, принимавших участий Й ликвидации последствий аварии, отмечались практически вое типы нарушений — от пробелов до дицентрических хромосом. В ряде случаев обнаруживались межхроматидные транслокациисучастиемдвух, трех хромосом. Для оценки дозовых характеристик, уровня радиационного поражения генотипа мы использовалитолько аберрации хромосомного типа.

Из таблицы 2 видно, что участие в работе по ликвидации последствий аварии в условиях различающихся ситуаций приводило к увеличению частоты хромосомных аберраций у обследуемых в 3 - 6 раз. Причем наибольший уровень нарушений был выявлен у лиц, подвергавшихся кратковременному облучению, что свидетельствует о.высокой биологической эффективности кратковременного (острого) облучения..

Таблица2

Уровень хромосомных аберраций (%) в клетках периферической крови у лиц, принимавших участие в ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС

Вариант облучения N Хромосомные аберрации (%) Дицешрические хромосомы (%)

Кошроль 25 0.3 0

Кратковретшое 36 1.5 0.62 ±0.05

Кратковремеш юе+ 9 1.7 0.70 ± 0.05

пролрнгироЕйШюе

Кратарвремяшое 6 1.3 0.80 ±0.07

двукратное •

Фракционированное 39 0.7 0.14 ±0.04

Пролонгированное 11 0.8 0.10 ±0.03

11

Подученные нами результаты щггогенегического обследования в некоторой степени коррелируют с результатами оценки концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови (табл. 3) проведенной у некоторых обследуемых.

Следует отметить, что содержание иммуноглобулина О, характеризующего в некоторой степени общее состояние иммунной системы, несколько ниже такового в контроле (р < 0.05). Однако тот факт, что в качестве кошроля использовали результаты медико-генетического обследования населения Сыктывкара, не позволяет сделать однозначный вывод об уровне изменения количества иммуноглобулина в. Тем не менее в пользу снижения концентрации на наш взгляд , свидетельствуют данные о концентрациях двух других типов иммуноглобулинов и, как видно го таблицы 3, соответствующих уровню в контроле.

Полученные нами результаты о состоянии иммунологической системы у облученных лиц, также подтверждаются результатами исследований сотрудников Института иммунолог™ АМН (Петров, Орадовская, 1991; Орадовская, 1996), которыми при выполнении работ в зоне аварии на Чернобыльской АЭС, было показана возможность супрессии пролонгированным облучением малыми дозами гуморального звена иммунного статуса, выражающегося в а шжении уров1 ет сывороточного иммуноглобулина (преимущественно ^ О).

Таблица3

Количество иммуноглобулинов (гУл) у лиц, принимавших участие в ликвидации последствий аварии на .Чернобыльской АЭС

Вариант облучения N | ДО 1еА

Контроль 11.6±0.61 2.010.31 05910.27

Кратковременное 36 9.010.31 2.510.14 0.9710.07

Кратковременвэе+ 8 9.010.54 2.910.52 1.0410.08

пролонгированное

Кратковременное. 6 8.310.59 2.010.43 1.0710.16

двукратное

Фракционированное . 28 8.810.17 2.5 + 0.18 1.04 + 0.09

Пролонгированное 9 9.6 + 0.55' 2.310.16 0.8210.17

Итак, нами обнаружено, что у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС при контакте с источниками ионизирующей радиации частота хромосомных аберраций выше, чем таковая в кошроле. Наряду с увеличением

уровня хромосомных нарушений в Т-лимфоцитах у обследуемых изменяется соотношение концентраций иммуноглобулинов по сравнению с контролем. Это подтверждает известные данные (Шубик, 1987; Ярилин, 1996; Орадовская 1996) о более высокой эффективности ионизирующей радиации повреждать способность В-лимфоцитов индуцировать иммуноглобулин в, чем иммуноглобулин М, что связывают с большей зависимостью ^О ответа от Т-лимфоцигов.

Национальный Комитет по Радиационной Защите устанавливает для стохастических эффектов (к таким относятся и хромосомные аберрации) беспороговость действия ионизирующей радиации, предполагая при этом возможность экстраполяции эффектов, измеренных при относительно высоких дозах радиации на область относительно малых доз с помощью монотонных кривых (например, линейной, квадратичной и экспоненциальной). В настоящее время имеются данные, свидетельствующие о том, что в области малых доз кривая "доза-эффект" может иметь более сложный, немонотонный характер (Кузин, 1980; РоЫ-11и1Нщ е1.а1., 1983 и др.). Поэтому мы посчитали уместным провести расчеты при условии, что параметр кривой (аппроксимируемая величина минимально действующей дозы) может пригашать любое положительное число, в том числе и ноль, и определить характер дозовойзависимости выхода хромосомных аберраций.

Было обнаружено, что кривые "доза - эффект" для аберраций хромосомного типа при разных вариантах облучения могут иметь несколько отличающийся друг от друга угол наклона. Эти кривые можно использовать, учитывая их вероятностный характер, как калибровочные кривые. А именно, для случаев кратковременного облучения кривая будет. описываться квадратичной функцией: " '

у =(0.5 ±0.3)хЮ-2 + (0.16±0.04) хЮ"3 Х+(0.6±0.4) хЮ-4 X2;

для фракционированного:

у =(0.46 ± 0.4)х10'2 + (0.65 ±0.1) х10"4Х+(0.15±0.1) хЮ4 X2;

для пролонп грота! п юго:

у =(0.6 ± 0.4)х10"2 + (0.95±0.6)х10;5 X2;

Как показали результаты аппроксимации моделью результатов цито-генегического обследования, модель хорошо описывает данные, так как степень соответствия равна 1, а величина коэффициента прямолинейной корреляции между результатами обследования и аппроксимирующими величинами составила 0.85. Наиболее тесная связь выявлена между значением дозы кратковременного облучения и ее аппроксимирующей величиной

(г=0.7). Значения коэффициента прямолинейной корреляции доя фракционированного и пролонгированного облучений оказались меньше и составили соответственно 0.4 и 0.2. В случаях совместного воздействия пролонгированного и кратковременного облучения соответствующее значение равнялось 0.44.

Анализ уравнений зависимостей "доза-эффект" при учете спонтанного уровня хромосомных аберраций показал, что аппроксимирующие величины минимально действующих доз оказались равными 0.00073 (0.000260.0042) сГр для кратковременного облучения, 0.003 (0.00066-0.134) сГр для фракционированного и 0.0046 (0.0027- 0.46) сГр для пролонгированного облучения. (Здесь в скобках даны нижний и верхний пределы изменения величин, полученных для 10 случаев моделирования "зашумленных" экспериментальных данных. Такое различие в аппроксимирующих величинах минимально действующих доз для трех различных вариантов облучения,' так же как и различие в их эффективности воздействия, по нашему мне! шю, обусловлено двумя причинами - влиянием мощности облучения и процессами восстановления.

Настоящий результат свидетельствует о проблематичности применения показателя "хромосомные аберрации" для целей биологической дозиметрии, в случае его использования необходимо учитывать эффект восстановления (и (или) эллиминации). Например, если в качестве калибровочной кривой используется зависимость, полученная в эксперименте с кратковременным облучением, то при предсказании дозы при пролонгированном облучении необходимо оцененную по калибровочной кривой дозу умножить на значение коэффициента перехода от кратковременного облучения к пролонгированному. Согласно результатам моделирования величина коэффициента составила около 5.

Еще в 1964 году на 3 Международной конференции ООН по использованию атомной энергии в мирных целях в докладе, посвященном генетическим эффектам малых доз ионизирующих излучений, Н.ГТ. Дубининым с соавторами в экспериментах на дрозофиле было показано, что при хронических воздействиях гамма - излучения низких интенсивностей в расчете ца'1 рад индуцируется в несколько раз больше рецессивных летальных мутаций, чем при высоких мощностях доз (Дубинин и др., 1964). В1957 году Н.В. Лучник в экспериментах по цитогенегическому анализу облучаемых семян гороха показал .возможность "аномальных реакций при малых дозах облучения" (Лучник, 1957), объясняя полученный результат предположением о том, "что чувствительность клетки претерпевает циклические изменения. При продолжительном воздействии большее число клеток облучается в сверхчувствительной стадии".

Важнейшим этапом в оценке эффективности малых доз ионизирующей радиации явилось открытие в 1971 году высокой эффективности воздействия малых доз радиации на искусственные мембраны (Petkau, 1971). Было показано, что облучение при низкой мощности (0.001 сГр/м, общая доза 0,7 сГр) вызывает такой же эффект, какой возникает при облучении в дозе 3500 сГр при мощности излучения 26 сГр/м. Такого рода эффекты были обнаружены и при изучении динамики онкологической заболеваемости (Gofman, 1994). Надлинейная зависимость выхода хромосомных аберраций в клетках периферической крови человека от дозы облучения (в диапазоне малых доз) показана в работах многочисленных авторов (Boyd et-al., 1967; Luchnik, Sevankaev, 1976; Pohl, Pohl-Rulling, 1977; Pohl-Rulling, Fisher, 1979; Lloyd, Purrott, Reeder, 1980; Блох, 1987;Мазник, 1987; Pohl-Rulling et.al., 1990a, Pohl-Rulling, 1990b; Шевченко, 1996).

На рис 1 представлены дашпие показывающие, что зависимость "доза - эффект" для кратковременного облучения носит надлинейный характер (аналогичный вывод можно сделать и для случаев пролонгированного и фракционированного облучения).

поглощенная доза (сГр)

Рис. 1. Динамика частоты хромосомных аберраций, индуцированных кратковременным облучением в клетках периферической крови "ликвидаторов" последствий аварии наЧернобыльской АЭС.

Такого рода зависимость можно объяснить, предположив возможность, во-первых, большей биологической эффективности малых доз радиации, что, по нашему мнению, маловероятно. Во-вторых, такого рода зависимости могут быть объяснены исходя го возможной гетерогенности биологического материала (Спитковский, 1992), в-третьих, надлинейный характер кривой "доза-эффект" можно объяснить, предполагая различия в механизмах индукции повреждений генетического материала "малыми" и "большими" дозами облучения.

Заключая рассмотрение полученных нами результатов можно сказать, что использование линейной концепции при оценке величин генетического риска облучения населения может приводить к существенным искажениям масштабов истинных последствий. Использование "рутинных" методов в практике биологической дозиметрии в большинстве случаев требует соответствующих поправочных коэффициентов и поэтому их использование требует большой осторожности (Севанькаев, 1991; Севанькаев, Моисеенко, Цыб, 1994; Шевченко, 1996; I Левченко, Снегирева, 1996). Более того," полученные нами результаты свидетельствуют о некоторых различиях в реакции генотипа на разные варианты облучения - было показано, что эффективность кратковременного облучения в 5 раз выше пролонгированного.

Итак, результаты цитогенетического обследования лиц, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской АЭС показали, что образовавшийся в результате аварии уровень радиоакшвного загрязнетшя существенно изменяет уровень хромосомных аберраций в клетках периферической крови человека. Зависимость "доза - эффект" с большей вероятностью соответствовала уравнению со степенной функцией и, практически для всех случаев облучения имела "надлинейный" характер.

Глава 2.

ДИНАМИКА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ У МЫШЕВИДНЫХ ГРЫЗУНОВ И У ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ

Изучение процессов генетической адаптации популяций животных, обитающих на территориях, подвергшихся техногенному загрязнению радионуклидами, всегда привлекало интерес биологов (Ильенко, 1967; 1968;

Дубинин и др., 1972; Ильенко и др., 1980; Шевченко, Померанцева, 1985; Шевченко, Печкуренков, Абрамов, 1992).

В настоящей главе представлены результаты цитогенетического обследования мышевидных грызунов, подвергшихся радиоактивному облучению малыми дозами в результате аварии на Чернобыльской АЭС и в результате экспериментальных исследований. Данные о радиоэкологическом состоянии стаций обитания мышевидных грызунов представлены в работах А.И. Таскаева и АГ. Кудяшевой с соавторами (Таскаев и др. 1988; Кудя-шеваидр. 1997).

В цитогенетических исследованиях из нелабораторных видов мыше-* видных грызунов наиболее удобным объектом, на наш взгляд, является полевка-экономка s 2N=30, удобный для анализа аберраций кариотип, разработанная система содержания живоп плх в условиях вивария, высокая плодовитость. Поэтому нами в дальнейших цитогенетических исследованиях большее внимание было уделено именно этому виду, хотя цитогенетичес-кий мониторинг велся практически за всеми отлавливаемыми в зоне аварии животными (Зайнуллин, Ракин, Таскаев, 1994). Кроме мышевидных грызунов из природных популяций из зоны аварии на Чернобыльской АЭС в работе использовались лабораторные линии мышей, их гибриды и полевки-экономки четвертого поколения виварного содержания.

2.1. Материал и методы исследований. Объектом исследований служили полевки-экономки, отловленные в разных районах зоны аварии на Чернобыльской АЭС. Препараты хромосом клеток костного мозга, эпителия роговицы глаза готовили по общепринятым методикам с некоторыми модификациями при окраске (МакГрегор, Варли, 1986). В среднем на одно животное анализировали не менее 100 метафаз при учете хромосомных аберраций и не менее 1000 клеток при учете митотической активности.

В экспериментальных исследованиях, в первой серии экспериментов были использованыполевки-экономки (самцы) в возрасте 3-4 месяца 5-ой генерации содержания в условиях стационарного вивария (г.Сыктывкар). Животные экспонировались в течение 30 д ней на экспериментальных площадках (м. Янов) при мощностях излучения 50 мР/ч, 70 мР/ч и 150 мР/ч. У животных определяли уровень хромосомных аберраций, микроядер в клетках костного моага.

Во второй серии экспериментов использовались самцы межлинейных гибридов (CBAxC57Bl)F) (предоставлены д.б.н. Пелевиной И.И., Москва). Животные экспонировались i ia экстериментальных площадках при мощности гамма-облучения 30 мР/ч и 60 мР/ч. Обе группы облучались в течение 30 дней. У животных определяли уровень хромосомных аберраций, реципрокных транслокаций, аномальных головок спермиев.

В третьей серии экспериментов матфиалом наследований служили сам цы мьшей линии СВА 3-5-месячного возраста (виварий Инсппута биологии ; г.Сыктывкар), экспонированные в различных вариантах: в непосредственно?

5л1сосгаотпромпиохцадкиЧфнобыльскойАЭС(м.Янов), животных содержали на точках с различной мощностью дозы (25,50 и 75 мР/час) в течение 15 дней (вариант 1); в лабораторных условиях при постоянной мощности дозы 2.5 мР/час в течение 30,60 и90 дней. В целом экспозиционные дозы для пер-i вого варианта составили 27-9 сГр, а для второго - 5.4-1.8 сГр. У облученных

животных определяли уровни доминантных легален (ДЛ) (до-, посгимгшан-тационные и суммарные) (Searle et.al., 1976), аномальных головок спермиев \ (Arc)(Soares, Sheridan, Segall, 1979),ре1щпрокньк'1рансяока1цш(РТ)всгео-

• ловых клетках спфматогониев (Evans, Brecon, Ford, 1964) и частоту микро-

' адф в клетках костного мозга (Heddle, 1973).

I Контрольных животных в пфвой, второй и третьей сфиях экспфи-

ментов содержали в условиях вивария научно-исследовательского стационара комтекшой радиоэкологической экспедиции Академии Наук (г.Чф-нобыль) при мощности гамма-фона 0.05 мР/ч.

; 2.2. Уровень хромосомных нарушений у полевок-экономок ю

i зоны аварии на Чернобыльской АЭС. В таблице 4 в обобщенном виде

представлены результаты цитогенетического анализа клеток костного мозга полевок - экономок, отловленных в сентябре 1986 г. на участках 4 и 6, а также животных этого вида из среднетаежной зоны Республики Коми. У животных, отловленных в 30-киломегровойзоне, частота нарушений по воем анализируемым типам нарушений достовфно выше, чем у звфьков среднетаежной зоны. Наиболее часто встречаемый тип нарушений - фрагменты. Для популяций животных с участка 4, где мощность дозы 4 мр/час, уровень фрагментов хромосомного и хроматидного типа был равен 2.8%, а на s участке 6 с мощностью дозы в 50 раз меньшей, чем на участке 4, он состав-

лял 2,4% (р > 0,05).

На участке 6 была выше частота встречаемости обменов. Этоттип нарушений, в отличие от разрывов и фрагментов, при своем образовании включает и этап "воссоединения", а наличие в этих перестройках центро-мерного района оставляет за ними некоторую вероятность наследования (для реципрокных сбалансированных транслокаций она достигает существенного значения). Отмеченное повышение обменов, если оно не случайно, может свидетельствовать о том, что частота индукции дицентриков и колец в популяции грызунов с участка 6 превышает таковую в популяции с участка 4 из-за большей величины биологической эффективности воздействующего фактора на пфвом из участков. В этом случае налицо несоот-

вегствие наблюдаемого биологического эффекта и уровня внешнего гамма-облучения.

Если у контрольных животных из среднегаежной зоны все обнаруженные аберрации представлены фрагментами, то в обеих популяциях из 30-километровой зоны примерно в одинаковых соотношениях встречаются хромосомные и хроматидные аберрации (60%) и полиплоидия (40%) .Необходимо отметить, что в популяции с участка 6 с меньшим уровнем радиоактивного загрязнения (меньше 0.1 мр/ч) геномных нарушений значительно больше, чем на территории, где уровень внешнего облучения равен 4 мр/ч, соответственно 41 и 18% от общего числа нарушений.

Таблица4

Уровень хромосомных аберраций в клетках костного мозга полевок-экономок отловленных в зоне аварии на Чернобыльской АЭС

Вариант Год Гамма-фон, мР/ч Чисио животных % хромосомных "Ахроматичных % геномных

Контроль 10 0.5±0.12 0.110.05 0

6 участок ¡986 0.01 12 1.410.34 1.010.28 1.610.35

1987 0.01 7 1.510.5 1.010.97 1.710.53

1988 0.01 4 2.010.69 1.510.6 2.210.73

4участок 1986 4.0 11 1.610.4 1.21.0.35 0.710.26

1987 1.2 19 2.110.33 1.110.25 1.510.28

1988 0.7- 6 1.81Т).54 0.71.0.33 0.810.36

Учитывая существенные различия в механизмах образования разрывов хромосом (хроматид) и, соответственно фрагментов и полиплоидных клеток, есть все основания считать, что территории участков 4 и 6 либо различаются по радионуклидному составу выпадений, либо по составу реагентов, использованных придезаетивациитерриторйй. Действительно, участок 6, несмотря на сравнительно низкий уровень радиоактивного загрязнения (мощность дозы внешнего гамма-облучения в сентябре 1986 г. не превышала 0.1 мР/ч), заметно выделялся среди 25 исследова! шых участков в 30-киломегровойзоне и по уровню генетических i ирушений у некоторых видов травянистой растительности (Попова, Таскаев, Фролова, 1992).

В большинстве случаев ионизирующее излучение индуцирует структурные нарушения хромосом и хроматид (Лучник, 1966,1976;Корогодин, 1966; Жестяшшков, 1979; Шевченко, Померанцева, 1985). В то же время явления, приводящие к нерасхождению хромосом, связывают, как правило, сдействием химических агентов (Sorsa, 1985). В частности, в работе бол-

гарских исследователей (Яиков и др., 1979) убедительно показано, что хроническая интоксикация свинцом приводит к значительному повышению уровня полиплоидов и анеуплоидов, а также структурных хромосомных перестроек на фоне нормальной клиники. Поэтому вполне возможно, что выявленное превышение уровня полиплоидных клеток в костном мозге полевок-экономок на участке 6 может бьпъ обусловлено в том числе и свинцовым загрязнением. В связи с этим дальнейшее использование данных с этого участка, как контрольных, было бы не вполне корректным.

Повторный аналго животных с участка 4, отловленных весной 1987 г., свидетельствует о том (табл.4), что уровень нарушений в клетках костного мозга у полевок-экономок за прошедшее время практически не изменился. Однако среди проанализированных животных 1987 г. появились особи с невстречающимися в 1986 г. типами нарушений—транслокации хрома-тидного типа. А у одного из зверьков 30% метафаз имели морфологически измененную хромосому первой пары (смещение центромеры или потеря верхнего плеча). Такого рода изменения в морфологии хромосомы возможны в случае образования перицентрической инверсии. Кроме того, были обнаружены множественные повреждения хромосом.

Если провести сравнение картины распределения уровня митотичес-кой активности и частоты хромосомных нарушений в клетках эпителия роговицы глаза (табл.5) и аберрантных клеток в костном мозге полевок-зко-номок из 30-километровой (участки 4 и 6) и среднетаежной зоны (контроль), то окажется, что качественно они одинаковы, но отличаются друг от друга по величине. Так уровень митотической активности и хромосомных аберраций у животных с участка 4 (соответственно 0,34 и 2,97%) осенью 1986 г. не отличался от контрольного уровня (0,37 и 2,52%), тогда каку животных с участка 6 он был достоверно выше (0,55 и 5,38%).

Таблида5

Уровень митотической активности и частота хромосомных нарушений в клетках эпителия роговицы глаза полевок- экономок

'. Вариант Число Мштаический Хромооомньв

животных ивдекс(%) аберрации (%)

Контроль 6 0,37 2,5

Участок б 13 0,55 5,4

Участок 4 10 0,34 3,0

Выявленные различия в количественном выходе аберраций хромосом в клетках костного мозга и эпителия роговицы можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, неодинаковой чувствительностью ис-

пользуемых методов анализа. Во-вторых, различиями в эффективности орга-низменного (физиологического) контроля мутационного процесса (Лоба-шев, 1948) в клетках эпителия роговицы глаза и костного мозга. Поскольку в клетках костного мозга I [ейрснуморальный контроль выражен более силь-■ но, то здесь и обнаруживается меньший уровень хромосомных аберраций. Более высокий уровень хромосомных аберраций в клетках эпителия роговицы глаза объясняется его "относительной физиологической автономностью", обусловленной анатомическим строением и функциональной значимостью органа. Именно из-за его относительной автономности индуцированные каким-либо фактором нарушения не компенсируются (не восстанавливаются) системой организма, обеспечивающей клеточный или над-клегочный гомеосгаз, в той мере, в какой она (компенсация) возможна при повреждении клеток костного мозга.

2.3. Индукция генетических повреждений у лабораторных линий мышей, их гибридов, полевок-экономок лабораторного содержания, подвергнутых гамма - облучению в различных режимах. Широко обсуждаемая в последние годы в радиобиологических исследованиях проблема действия на биологические объекты малых доз ионизирующего излучения подразумевает рассмотрение двух аспектов: поглощенная доза -эффект и время воздействия - эффект. Судя по всему такой подход является упрощенным исследованием сложной функции доза/время - эффект. 11еоб-ходимо отметить, что исследования этой закономерности в целом, в основном ограничиваются теоретическими разработками. В связи с этим определенный интерес представляет собой сопоставление цитогенетических результатов экспериментов по облучению млекопитающих в вариантах, различающихся по мощности дозы и срокам воздействия.

В таблице 6 и на рисунке 2 представлены данные цитогенетического анализа препаратов хромосом и микроядер в клетках костного мозга полевок-экономок. Очевидно, что наиболее эффективным оказалось экспонирование животных при мощности облучения 70 мР/ч. Следует отметить более резкое повышение уровня геномных нарушений. Аналогичная закономерность сохраняется и при оценке уровня микроядер (р < 0.05). Эти данные, в некоторой степени подтверждают полученные при анализе природных популяций мышевидных грызунов результаты (Зайнуллин, Ракин, Тас-каев 1994), а именно: несколько большая эффективность в индукции генетических нарушений "средних" мощностей доз, причем эта "аномальность" сохраняется при разных типах нарушали"!, механизмы образования которых могут различаться. Вероятно такое можно объяснить предположив общность первичных механизмов реакции клеток на воздействие ионизирующего излучения низких интенсивностей.

Таблица6

Уровень хромосомных аберраций и мнкроядср в клетках костного мозга полевок - экономок экспонированных при разных мощностях экспозиционных доз в зоне аварии на Чернобыльской АЭС

Контроль

50мР/ч

70мР/ч

150мР/ч

Чдаю животных 4 4 3 5

• % хромосомных 0,3 ±0,21 1,1±0Д1 3,8±0,98 1,9±0,31

%хроматвдных 0,6+0,26 1,1+0,22 1,3± 0,63 0,5±0,25

% геномных 0,3+0,21 1,4±0,48 14,6+1,99 3,9±0,73

%микроадер 1,0±0,14 3,3+0,33 7,8+1,55 5,2±0,29

Результаты цитогенетического анализа самцов межлинейных гибридов (СВА х С57131)Р1 несколько не соответствуют ранее высказанному нами предположению. То есть реакция межлинейных гибридов на пролонгированное в течение 30 суток облучение отличается от реакции полевок-экономок "виварского" происхождения. Такое несоответствие с ранее полученными результатами заставило нас предпринять следующий эксперимент с линейными мышами СВА.

нейтраль 60 ТО

вариант обгучаиия (мР/ч)

Рис.2. Динамика уровня цигогенегаческих нарушенийу шлевок-экономок, экспонированных приразньк мощностях экспозиционных'доз в зоне аварии на Чернобыльской АЭС.

Как видно из таблицы 7 наиболее четко прямая дозовая зависимость прослеживается при индукции доминантных деталей (ДЛ) в варианте 1 (г = 0.91; Р<0.001), однако при сопосгавла гаи уровней ранних и поздних деталей линейной корреляции дозы и эффекта не наблюдали. Анализ ДЛ в . варианте 2 не позволяет говорить о наличии прямой линейной зависимости; отмечалась, скорее, слабая отрицательная корреляция (г=- 0.46, Р>0.05).

Следует отмстить достоверно значимое превышение уровня посгип-лангационной (собственно доминантные летали) гибели животных, облученных минимальными дозами, над контрольным уровнем и уровнем нарушений у животных, облученных "средними" дозами. Несколько иная реакция на хроническое облучение обнаруживается при анализе ранних (доип-лангационных) эмбриональных деталей, являющихся в большей мере результатом "функциональных" повреждений клеток, не связанных с нарушением генотипа. Такие различия в реакциях "доза-эффект" вполне ожидаемы, поскольку механизмы доимплантационной и постимплантационной гибели существенно отличаются (ранние летали возникают за счет снижения оплодотворяющей способности спермиев (Шевченко и др., 1986; Мамина, Шейко, 1993), а поздние - являются непосредственно результатом генетических повреждений (Померанцева и др., 1987; Favor, Soares, Crenshaw, 1978)),.

Таблица7

Уровни доминантных леталей у мышей линии СВА экспонированных при разных вариантах облучения в зоне аварии на Чернобыльской АЭС и лаборатории

Доза облучения (сГр) Число Количество Доминантные летали (%)

самцов желтых резорб- эмбрш- ДО после суммарно

тел ций нэв имплантации

27 8 329 139 51 42.212.7* ' 42.212.7* 84.512.0*

18 10 381 ' 54 184 37.512.5* 14.211.8. 51.712.6*

9 6 357. 92 216 13.711.8* 25.812.3* 39.512.6*

Контроль 1 7 174 18 143 7.512.0 10.312.3 17.812.9

5,4 11 194 17' 141 18.612,8* 8.812,0 27.313.2*

3,6 8 165 20 130 9.112.2 12.112.5* 21.214.2'

1,8 10 208 55 110 20.712.8* 26.413.1* 47.113.5*

Контроль 2 6 123 8 104 8.912.3 6.512.2 15.413.3

Примечание: * р < 0.05.

Динамика нарушений в половых клетках при облучении в обоих вариантах эксперимента по критериям аномальных головок спермиев (А ГС) и реципрокных транслокаций (РТ) (табл.8, рис. 3) носила практически сходный характер: максимальные значения параметров выявлены при средних дозах облучения. Следует отметить, что если в варианте 1 достоверное пре-

Таблица8

Генетические нарушения в клетках облученных лабораторных мышей линии СБА (%)экспонированных при разных вариантах облучения в зоне аварии на Чернобыльской АЭС и лаборатории

Доза облучения (сГр) Число самцов АТС Траноюкации Микроядра

п х±ш и Х±П1 п х±т

'27 8 154 3.9Ю.29* 8 0.35Ю.12 48 0.6010.09*

18 10 210 4.2Ю.32* 12 0.52Ю.15* 44 0.44Ю.08*

9 6 93 3.1Ю.30* 11 0.47 ±0.14* 30 0.50Ю.08*

Контроль 7 57 1.9+0.25 5 0.23Ю.Ю 17 0.28+0.07

5,4 11 114 2.1+0.19 3 0.31 ±0.18 32 0.2910.05

3,6 8 159 4.010.29* 12 1.02Ю.29* 44 0.55Ю.07*

1,8 10 154 3.110.28* 6 0.46±0.19* 25 0.25Ю.05

Контроль 6 64 2.110.26 1 0.1010.10 19 0.32Ю.07

Примечание: * р < 0,05.

контроль -и

в 27

вариант облучения (сГр)

Рис.3. Динамика уровня цмгогенегических нарушений у лабораторных мышей линии СВА, экспонированных при разных мощностях экспозиционных доз в зоне аварии на Чернобыльской АЭС.

вышение уровней АГС по сравнению с контролем наблюдается при любом режиме экспозиции, то во втором случае лишь при среднем и минимальном времени облучения. При исследовании нарушений в соматических клетках (микровдра - МЛ) в обоих вариантах монотонных линейных зависимостей (дозовых или временных) не наблюдали. Тем не менее следует отметить, что в варианте 1 статистическое превышение частот МЯ было выявлено при максимальной и минимальной степени воздействия, а в варианте 2 -при средней.

Таким образом, несмотря на некоторое различие спектров доз облучения, а также различие характера излучений, уровни генетических нару? шений близки по абсолютному значению, что в целом не противоречит общепринятому мнению о том, что в области малых доз нет монотонной прямой функциональной зависимости выхода нарушений от мощности воздействующего фактора (Зайнуллин, 1988:Спигковский, 1992; Бурлакова, 1994).

Отсутствие строгой дозовой зависимости образования АГС в обоих вариантах облучения очевидно объясняется теми же причинами, что и нелинейность соотношения поздних и ранних Д JI. Крайне слабая корреляция доз и уровней АГС отмечалась ранее и другими авторами ( Померанцева и др., 1987; Pinon-Latailiade et.a!., 1991;Рябоконь, 1993). Однако отсутствие положительной или отрицательной корреляции может свидетельствовать и о "поливариантности" (неоднозначности) реакции организма (клетки) на действие стрессирующего фактора.

Наблюдаемый разброс частот реципрокных транслокаций также связан с неоднотначностыореакщш сперматогониев на различные варианты облучения в диапазоне малых доз (Шевченко, Померанцева, 1985; Померанцева и др., 1990; Brewen, Preston, Luipold, 1979).'

Уровень микроядер в клетках костного мозга - более д! гнамичный показатель степени повреждения генетического аппарата, чем предыдущие параметры, поскольку представляет собой эффект действия конкретнойдозы мутагена в течение одного клеточного цикла (24 часа) и неаккумулирую-щийся далее (Heddle, 1973;Natarajanet.al., 1976). В соответствии с этим утверждением можно было бы ожидать более или менее четкую "отрицательную" дозовую зависимость частот образующихся микроедер во втором варианте эксперимента, чего обнаружено не было. В этом случае можно предположить возможность "пролонгированного мутагенеза", механизмы которого неоднозначны (Дубинин, 1978).

Вероятнее всего индукция генетических нарушений в соматических клетках в большей степени связана синдивидуальной радиочувствительностью отдельных особей и особенностями реакции клеток на конкретные значения малых доз радиации (Пелевина и др., 1994). Тем не менее, повы-

шенные уровни генетических нарушений как половых, так и соматических клеток при действии малых доз гамма-излучения в обоих вариантах позволяют говорить о генетической эффективности исследуемых уровней облучения. Отсутствие же в большинстве случаев четких дозовых зависимостей вероятнее всего свидетельствует о неравнозначности механизма ответа систем организма на воздействие малых доз ионизирующей радиации в соматических и половых клетках. Соматические и половые клетки по-разному реагируют на воздействие одних и тех же доз мутагена, причем эти различия могут определяться отличиями в контроле и модификации механизмов утилизации первичных повреждений.

Не без основания можно говорить о различиях в процессах, определяющих уровень чувствительности в соматических и половых клетках - об этом свидетельствуют практически, накопленные на оегодняшний дейь, данные анализа механизмов мутагенеза (Baker et. al., 1976а, b; Ватт, Тихомирова, 1987). Каковы же возможные механизмы регуляции уровня генетической изменчивости? Общеизвестно, что мутации возникают не только под влиянием факторов внешней среды. Установлено, что мутационный процесс находится под генетическим контролем (Михельсон,1979; Bootsma, 1978; Green, 1978; Radman, 1988; Drake, 1991 и др.), причем по данным одних авторов уровень мутирования определяется, главным образ ом, ошибками репарации ДНК, по мнению других- ошибками ДНК-полимеразы. Рад авторов считает, что преимущественное значите в определении спонтанного уровня нарушений генотипа могут иметь перемещающиеся мобильные генетические элементы (Ананьев, 1984,1989; Дубинин,1984; Shapiro, Leach, 1990 и др.), играющие немаловажную, роль в обеспечении генетического разнообразия (Гришаева, Иващенко, 1997) и, как показано, активность которых может резко различаться в клетках разного происхождения, например, в половых и соматических клетках (Ананьев 1989; Ананьев, Чернышев 1989, Rio 1990; Woodruff, Nikitin 1995). В последнем случае, различия в активности мобильных элементов в соматических и половых клетках могут определять "дифферегщиальную мутабильность" этих клеток.

Итак, при исследовании реакции мышевидных грызунов на хроническое облучение в малых дозах показано, чгго в большинстве случаевха-рактер зависимости "доза-эффект" в исследованном диапазоне доз имеет -цадлинештыйхарактер. Характер зависимости "доза-эффект" во многом определяется генотипом животного. Так надлинейный характер зависимости уровня нарушений генотипа от величины дозы показан для животных со "стабильным" генотипом s полевки- экономки виварского содержания и лабораторные мыши линии СВА, мышевидные грызуны из зоны аварии на Чернобыльской АЭС. Иной характер зависимости "доза-эффект" показан

для гибридов I7, линейных мышей СВА и С57В1. Отличия в характере реакции на облучение в малых дозах у исследуемых гибридов (СВАхС57В1)Р, от других животных могут быть обусловлены возможнойдесгабилизацией генотипа, произошедшей в результате скрещивания двух линий мышей с различным генотипом (различаются по генетической формуле и основному локусу тканевой совместимости) и цитотипом (линия С57В1 не содержит фактор молока) (Медведев, 1964). Вполне вероятно, что именно в этом и лежит объяснение столь неоднозначнойреакщш генотипа животных на действие малых доз ионизирующего излучения, т.е. гибридизация животных привела к индукции механизмов, однотипных механизмам, индуцируемым в ответ на воздействие облучением.

Глава 3.

ДЕЙСТВИЕ МАЛЫХ ДОЗ РАДИАЦИИ НА ЛАБОРАТОРНЫЕ ЛИНИИ И ПРИРОДНЫЕ ПОПУЛЯЦИИ DROSOPHILA MELA NOG ASTER

Первые работы по генетике облученных популяций дрозофилы были выполнены еще в 1950 годах (Wallace, King, 1951; Wallace, 1956; 1957; 1958; 1959). Результаты анализа показали, что в облученных популяциях концентрация деталей была существенно выше, чем в котрольной. Причем, следует особо отметить, что это касается главным образом пролонгирование облучаемых популяций. Было показано, что средняя жизнеспособность ге-терозигот по индуцированным пролонгированным облучением (5.1 сГр/ч) мутациям в дозе 5 Гр несколько выше жизнеспособности необлученных гомозигот. Однако эти результаты не были подтверждены работами иных исследователей (Mulla-, Falk, 1961). Эти авторы, проанализировав около 60 изогенгоированных по 2 хромосоме линий D. melanogaster, после облучения в дозе 240 Гр (6 раз по 40 Гр с шпервалом в 5 дней) показали, что почти во всех случаях особи, гетерозиготные по облученной хромосоме 2, имели пониженную жизнеспособность по сравнению с контролем.

Авария на Чернобыльской АЭС заставила пересмотреть некоторые наши представления о механизмах радиочувствительности и радиопоража-емости в диапазоне малых доз. В сферу радиобиологических исследований последствий действия малых дот ионизирующего излучения были вовлечены объекты, считавшиеся ранее неперспективными в исследовании этой

проблемы. Особое внимание, было уделено дрозофиле, тем более что еще в 1962 году была показана возможность использования ВгояорЫ1а те1апо-gaster в изучении генетических эффектов малых доз радиации (Глембоц-кий и др., 1962).

3.1. Генетический анализ природных популяций и лабораторных линий ОгоздрЬНа теЬим^а^ег, облучаемых малыми дозами ионизирующей радиации. К настоящему времени стало очевидным, что загрязнение окружающей среды может наносить вред нетолько существующим поколе! ш-ям животных, растений, но и угрожать благополучию последующих поколений. Для оценки реальности такой опасности исследования проводятся, как правило, в трех направлениях: а) тестирование биологической активности факторов физической й химической природы; б) слежение за уровнеми спектром нарушений в обследуемых группах живот! алх и растений и в) определение величины генетического груза в обследуемых популяциях.

Для решения этой проблемы могут быть использованы в качестве тестовых систем природные популяции и лабораторные линии ОторМа те1аподаз1ег, уникальная способность которых позволяет получить 2-3 поколения за один месяц. Хорошо разработанные методы учета уровней мутаций и иных типов нарушений генотипа, а также относительная легкость содержания дрозофилы в лабораторных условиях позволяют достаточно быстро, в сравнении с другими видами животных, получать разнообразную информацию о генотипе популяций и его изменениях (АвЬЬишег, 1989).

3.1.1. Материал и методы исследований. В работе использованы природные популяции Ог. melanogaster, отловленные в зоне аварии наЧер-нобьшьской АЭС во второй декаде августа 1986 и 1987 гг. В 1986 г. был проведен учет частоты рецессивных летальных мутаций и доминантных деталей с помощью стандартных методик (Тихомирова, 1990) у дрозофилы из трех районов Киевской области с различным уровнем радиоактивного загрязнения: А - 80, В - 6, С - 0.2 мР/ч соответственно. Контролем для природных популяций служила популяция Д го коллекции Института генетики и цитологии АН Белоруссии (Моссэ, 1985).

В1987 г. анализ уровня доминантных деталей (ДЛ) и рецессивных, сцепленных с полом летальных мутаций (РСПЛМ) был проведен в популяции дрозофилы, отловленной в трех километрах от АЭС. Эксперимент был поставлен на сравнительно ограниченной территории в сходных биотопах, но с довольно резкими перепадами мощности экспозиционной дозы гамма-излучения: участок 1-10-15 мР/ч, участок 2 - 40-50, участок 3 - 90 -100, участок 4- 150- 170, участок 5 - 240 - 270 мР/ч. Расстояние на участках между ловушками, которыми послужили стеклянные банки, наполненные

черешней и вишней, не превышало 50 - 70 м. Ближайший фруктовый сад от опьгпшх участков находился на расстоянии более 1 км. Контролем служили мухи, отловленные в помещении, где мощность экспозиционной дозы по гамма-излучению составляла 0,05 мР/ч (участок 6).

3.1.2. Результаты и обсуждение. Как видно из приведенных данных, в популяции А уровень ДЛ был намного выше, чем в остальных группах насекомых (табл. 9). Статистическая обработка полученных результатов показала, что каждая из исследуемых популяций А, В, С достоверно отличается друг от друга и в каждой из них уровень ДЛ достоверно превышает такоюйв контрольной популяции Д.

Таблица9

Частота доминантных деталей и рецессивных, сцепленных с полом летальных мутаций в популяциях дрозофилы, отловленных в зоне аварии па Чернобыльской АЭС летом 1986 г. (%)

Мощность эксткшщионнойдозы

Показатель 80мР/ч | бмРАх 0.2мР/ч Контроль

ДП 14.7 ±1.4 9.3 ±1.3 6.2 ±1.2 4.3±0.4

РСПЛМ 0.64 ±0.32 0.36 ±0.18 0.27+0.16 0

Причиной выявленных отличий могут быть различия в уровнях радиационного фона на территориях отлова. Не исключено, тем не менее, что различия в уровнях доминантных деталей могут бьггь обусловлены различиями в генотипе.

Анализ частоты РСПЛМ в исследуемых популяциях показал, что по уровню " полных " леталей популяция А (мощность гамма-фона 80 мР/ч) достоверно отличается от популяций В и С, Однако в популяции В был выявлен значительный уровень " неполных " леталей (1 нормальный, дикий по фенотипу самец на 30-50 особей Р). С учетом их Частота РСПЛМ в популяции В достигала бы 1,1 % и значительно превосходила бы все выявленные во всех обследованных группах значения. Повторный анализ РСПЛМ, проведенный спустя два месяца, подтвердил результаты августовского обследования.

В 1987 г. анализ уровня ДЛ и РСПЛМ был проведен в популяции дрозофилы, отловленной в трех километрах от АЭС. Данные этого эксперимента представлены в таблице 10 из которой видно, что наибольший уровень ДЛ и РСПЛМ оказался у насекомых с участка 5, т.е. большему уровню радиоактивного загрязнения соответствует больший уровень нарушений генотипа. Сравнение данных таблиц 10 и 11 свидетельствует о том, что кон-

трольная популяция (участок 6) по своим характеристикам (уровень ДЛ и РСПЛМ) не отличаются от популяции Д, использованной в 1986 г. в качестве контроля.

Таблица 10

Частота доминантных деталей и рецессивных, сцепленных с полом летальных мутаций в популяциях дрозофилы в 1987 г., отловленных в зоне аварии на Чернобыльской АЭС

Мощность экспозиционной дозы (мР/ч)

Показатель Контроль 10 40 90 150 240

ДЛ 4.9±1.1 5.11Í.6 6.4±1.5 4.9±1.0 5.2±1.2 7.5±1.1

РСШМ 0.1810.10 0.33±0.23 - 0 0.43±0.16 1.1+0.41

Спонтанный уровень доминантных деталей в различных линиях дрозофилы колеблется от 1 - 5 до 10 -15 % (Ватта, Тихомирова, 1976). Следует отметить, что ДЛ представляют собой сборную группу. В нее входят не только развившиеся по причине повреждения генетического аппарата клеток зиготы, но и погибшие по другим причинам (King, 1952; Scriba, 1964). Сюда же относятся неошодотворенные яйца, которые могут составлять иногда существенную часть так называемых ДЛ. Причиной появления ДЛ могут быть негомологичное спаривание хромосом, полутранслокации и другие одао- и двуударные перестройки, а одной го причин образования рецессивных легалей могут быть микроперестройки. Таким образом, механизмы индукции ДЛ и РЛМ могут бьпь в какой-то мере одинаковыми (Ватта, Тихомирова, 1976). В этом случае можно объяснить выявленную корреляцию между уровнями ДЛ и РСПЛМ (табл. 9), когда большей дозе соответствует и большая величина нарушений.

Сравнение показателей ДЛ и РЛМ, полученных в эксперименте 1987 г., показало, что зависимость между ними и мощностью гамма-фона не обязательно монотонна. Если при относительно низком фоне 10-40 мР/ч обнаруживаются повышенные уровни как ДЛ, так и РСПЛМ, то в варианте .3.(90 -110 мР/ч) мухи проявили "аномальную инертность" - уровень ДЛ был неотличим от контрольного, а рецессивных мутаций не было обнаружено вообще (при п = 800) (табл. 10). Дальнейшее возрастание уровня радиоактивного загрязнения вновь приводило к увеличению частоты определяемых показателей.

На основании полученных в экспериментах 1986,1987-, 1989 гг. результатов можно сделать вывод о том, что исследованные уровни радиоактивного загрязнения местности после аварии на Чернобыльской АЭС приводят к увеличению в популяциях дрозофилы генетического груза, "раз-

мер" которого зависит от величины поглощенной дозы. Причем, величина поглощенной дозы излучения может определят величину "аномальной реакции" в характере дозовой зависимости, о которой еще в 1957 г. писал Н.В. Лучник (Лучник, 1957) и учитывая это, можно говорить о возможности "надлинейной" зависимости между уровнем мутационной изменчивости и величиной действующего фактора у природных популяций Drosophila melanogaster.

3.2. Генетический анализ лабораторных линий. Drosophila melanogaster, экспериментально облучаемых малыми дозами ионизирующей радиации. Повреждения генетического аппарата клетки является одним из наиболеезначимых эффектов биологического действия ионизирующего излучения (Лучник, 1968;Шалыюв, 1969; Дубинин, 1978; Петин, 1987; Севанькаев, 1987;Сарапульцев, Гераськин, 1993). Поскольку радиочувствительность по критерию образования разрывов во многих случаях одинакова для различающихся по общей чувствительности биологических объектов (Комар, Хансон, 1980), то биологические последствия разрывов ДНК в большей степени будут зависеть от состояния систем восстановления клепан. Это предположение подтверждается тем фактом, что чем выше радиоустойчивость линии (работа выполнена на дрозофиле), тем выше ее репарационные способности, т.е. не встречаются организмы, чувствительные к радиации и обладающие высоким уровнем ршарации (Тихомирова, 1980).

Основную роль в изучении и понимании механизмов процессов реакции генотипа на воздействие мутагенных факторов среды сыграли исследования с использованием мутантных, в частности по репарации, линий дрозофилы (Зайнуллин, Ватта, Михеев, 1990).

В данном разделе выполняемых работ, используя известные мутант-ныелиниии линии дикого типа дрозофилы (Canton-S, rad, mei - 9) пытались решить некоторые проблемы, связанные, на наш взгляд, спроблемами идентификации механизмов действия факторов малой интенсивности на биологические организмы, т.е. цельнастоящего исследования заключалась в оценке роли генотипа в определении характера и величины реакции организма (клетки) на действие малых доз ионизирующего излучения.

3.2.1. Материал и методы исследований. Эксперименты по оценке частоты рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций (РСПЛМ) и аутооомных рецессивных летальных мутаций (АРЛМ) проводили по стандартным схемам с использова! тем линий тестеров М-5; Cy,L/Pm;Cy,L/Pm D/Sb. Учитывали частоту летальных, полулетальных, супервигальных мутаций индуцированных в хромосомах 1,2 хроническим (в течение двух поколений) воздействие стрессирующего фактора: вариант 1 - низкофоновая камера (уро-

вень внешнего фона не превышал 5 мкр/ч), вариант 2 - контрольный вариант (уровень внешнего фона 12-15 мкр/ч), вариант 3 - 7 мр/ч, вариант 4 - 20 мр/ч (источником излучения в двух последних случаях служили почвенные пробы из зоны аварии наЧернобыльской АЭС, пробы 1986 г.)

3.2.2. Результаты и обсуждение. В таблице 11 представлены результаты анализа частоты рецессивных сцепленных с полом летальных и полулегальных мутаций у исследуемых линий дрозофилы. Наибольший уровень мутаций в контрольном варианте обнаружился у линии теь9 (0.8 ± 0.22 против 0.3 ± 0.11 и 0.4 ± 0.15 у линий Сап1оп-8 и гас! соответственно), что вполне объяснимо, учитывая мутаторные свойства л окуса ше!-9. Содержание в условиях низкофоновой камеры в теча ше двух поколений практичес-ки.не изменяло уровень РСП Л М (равно и полулегальных мутаций) у линий СапЮп-8 и те1-9. Существенно отличалась динамика частоты исследуемых мугацийулинии тай (рис4). Содержание в условиях низкофоновой камеры (уровень фона в 3-5 раз меньше внешнего) приводило к резкому увеличению частоты рецессивных летальных и полулетальных мутаций (1.2 и 2.2 против 0.4 и 1.3 соответственно).

Как нами уже отмечалось, линия гас! значительно отличается по своей радиочувствительности от линий СаШоп-Б ише(-9 и указанные свойства определяются рецессивной мутацией гас1(2)201а!. Вполне логично предположить, что именно эта мутация и приводит к обнаруженному нами эффекту, т.е. увеличению частоты рецессивных летальных мутаций в условиях низкого уровня внешнего гамма -фона. В то же время было бы некорректно объяснять полученные нами результаты только измененным гамма-фоном.

Таблица 11

Частота рецессивных летальных мутаций в хромосоме 1 лабораторных линий ИготркДа melanogaster

Вариант Число культур |_Летали_| Полулегали

СапЮп-Б

котроль .низкий фон

2701 2973

0.3 + 0.1 0.4+0.1

0.7 ±0.2 0.910.2

теь9а •

контроль низкий фон

1670 2026

0.810.2 0.810.2

1.410.3 1.310.3

гас!(2)201С1

котроль щи кий фон

1738 1340

0.410.2 1.210.3

1.310.32.210.4

2.5 2 1.5 1

0.5

fCantoa -~5~~|

LnuA - a~1

контроль

н.фоа

контроль

н.фон

контроль

афон

летали полудетали |

Рис.4. Динамика частоты рецессивных летальных и полулетальных мутаций в хромосоме 1 лабораторных линий Drosophila melanogasler.

t la пример, во многом частота мутаций может быть модифицирована также измененным внешним электромагнитным полем - низкофоновая камера представляет собой хорошо экранированное сооружение. О том, что такое возможно, свидетельствуют данные о влиянии внешнего электромагнитного поля на вторичную структуру ДНК (Семин и др. 1995). Вероятно возможной причиной индукции леталей являются изменения генотипа на фоне индуцированной в условиях хронического воздействия измененных радиационного и электромагнитного полей нестабильности генома.

В следующей серии экспериментов мы провели исследования динамики частоты рецессивных легальных мутаций, индуцированных в хромосоме 2 у линий Canton-S и rad, поскольку этот метод учета мутаций в этой хромосоме позволяет учитывать накопленные "de novo" нарушения генотипа. Как видно из данных табл. 12, уровень АРЛМ в линии Canton-S не изменяется в трех вариантах эксперимента и только в четвертом варианте отмечается увеличеште частоты мутаций.

Сходная реакция зависимости "доза-эффект" была показана и" для линии rad, за исключением того, что. "низкий фон" (вариант 1), равно и как в тесте на РСПЛМ, оказывается "мутагенным" д ля радиочувствительного мутанта и по тесту АРЛМ. Таким образом, учитывая разную мутабильность хромосом 1 и 2 у исследуемого мутанта и одинаковую реакцию на действие

"низкого фона" можно предположить, что реакция организма на действующий фактор во многом определяется общим состоянием клетки, организма, т.е. "низкий фон" приводит к существенным изменениям в состоянии генома, что и отражается на уровне летальных мутаций.

Таблица 12

Частота рецессивных летальных мутаций в хромосоме 2 лабораторных линий йгоьорЪйа melanogaster экспонированных в различных условиях радиационного фона

Вариант

Сахйоп-Б

низкий фон 891

контроль 1481

7.чр/ч 903

20мр/ч 1156

гас1(2)201О1

низкий фон 1471

кошроль 1560

7 мр/ч 862

20мр/ч 435

Летали

0.810.3 1.0±0.3 1.0±0.3 1.6±0.4

2.0+0.4 1.4±0.3 1.7+0.4 3.0±0.8

Полулстали I Супервитали

2.2± р.5 2.6± 0.4 3.210.6 2.3+ 0.4

3.310.5 2.710.4

3.310.5 3.010.4

4.9+0.7 4.110.7

10.011.4 5.311.1

Чжло культур

2.610.5 2.110.4

3.410.6 4.110.6

Хроническое облучение при мощности 20 мр/ч приводит к достоверному увеличению частоты полулегальных мутаций (у линии СатЛоп-Б в 2 раза, у линии гас! - в 3). Однако, при анализе частот супервигальных мутаций, индуцированных в этих же условиях, обнаруживается снижение до контрольного уровня исследуемого показателя у линии Сап1оп-8 и достоверное его увеличение у линии таб.

Итак, хроническое облучение малыми дозами приводит к заметному изменению величины генетического груза (уровня накопленных за два поколения мутаций). Наряду сувеличением частоты мутаций снижающих жизнеспособность (летальных, полулегальных), возможно увеличение доли супервитальных мутаций, причем такое увеличение уровга мутаций, приводящих к повышению жизнеспособности происходит одновременно со значительным снижением плодовитости (для линии гас1 в 3.5 раза). Если снижение плодовитости, рост частоты летальных и полулетальных мутаций сувеличением уровня накопленной дозы у линии гаё можно объяснить исходя из ее повышенной радиочувствителы юсти, то причины стабильного роста доли супервитальных мутаций объяснить действием мутации га<1(2)201С51 крайне сложно. Вероятно одной из причин такой реакции генотипа может быть его дестабилизация, на фоне которой и возможна столь

быстрая адаптация организма к воздействиям неблагоприятных факторов окружающей среды.

Причиной такой дестабилизации генотипа могут быть мобильные генетические элементы (МГЭ), играющие большую роль в процессах адаптации организмов к быстрою меняющимся условиям окружающей среды (Гвоздев, Кайданов 1986; Кайданов и др. 1994). Поэтому была предпринята попытка оценить вероятность "индукции МГЭ" хроническим облучением малой инга кивносш с помощью широкоиспользуемого при изучении "синдрома гибридного дасгенеза" (КлсЗи'еЦ 1983; СЬаг1еи'ог1Ь, Ьапн1еу 1989) теста на атрофию'гонад.

3.3. Мобильные генетические элементы и их роль в механизмах адаптации дрозофилы. Открытие мобильных генетических элементов (МГЭ) резко изменило представления о функционировании наследственного материала (Хесин, 1984; Кайданов,1991). В нормальных условиях частота перемещений МГЭ обычно не отличается от частот спонтанного мутирования (Хесин, 1984). Однако, при действии стрессирующих факторов способность МГЭ к транспозициям резко возрастает (Васильева и др., 1987; Гвоздев, Кайданов, 1990; Кайданов, 1991). Интересен факт, что при снятии давления отбора МГЭ с большой частотой возвращаются на прежние места локализации (Кайданов, 1991). На основе этих фактов выдвинуто предположение об адаптивном значении транспозиций МГЭ (Беляева и др., 1981; Паскжова и др., 1984; Гвоздев, Кайданов, 1986).

Возможно, что сходные мехашгзмы действуют и при формировании радиогенегических эффектов в диапазоне малых доз (Моссэ, 1990; Герась-кин, 1995). Например, было показано, что чувствительность эксперимен-талы гых популяций к мутагенному действию радиации снижается при повышении уровня облучения (№)Ше1,1987). Выявлено, что адаптация обусловлена возникновением факторов, которые, по мнению автора, являются транспозонами.

Таким образом, явление транспозиции МГЭ следует рассматривать, наряду с мутационным процессом и процессом рекомбинации, как еще один источник наследственной изменчивости, имеющий важное эволюционное значение.

3.3.1. Материал и методы исследований. В работе использовали следующие линии: линия СуД УРгп. Линия несет балансерную хромосому 2 (1п(2Ь+2К)Су4р,Су,Ь,сп2,Ып(21Л)Рт,а1ДО,5р). В дисгенных скрещиваниях использовали как тесгерную линию.

Линия СВ-39. Линия с активными Р-алеменгами. В дисгенных скрещиваниях использовали как тесгерную линию, имеющую Р-цитотип. Ли-

нии Canton-S (в дальнейшем C-S). По имеющимся данным свободна от Р - элементов. Сублинии GB-39 R и C-S R подвергали хроническому, в течение одного поколения, гамма-облучению. Мощность экототиционной дозы составила 250 мР/ч, поглощенная доза за поколение (14 дней) приблизительно равнялась 0,8 Гр. Для облучения использовали радиевый источник мощностью 50 Р/ч.

Скрещивания для оценки дисгенного потенциала линий ставили при t = 28° С для Р - М дисгенеза. Производили подсчет нормальных гонад, . гонад с односгорош юй и двусторонней атрофией яич! шков.

В экспериментах по определению продолжительности жизни (динамика смертности) использовались самцы линий C-S, C-S R, GB-39, GB-39 R. Все линии содержались при одинаковых температурных условиях 25° С, в режиме 12 часового освещения. Оценка продолжительности жизни Осуществлялась у одновозрастных самцов, получаемых от синхронной кладки (Хромых, 1977).

3.3.2. Результаты и обсуждение. Втабл. 13 представлены результаты анализа частоты атрофии гонад у дрозофилы разных вариантах скрещиваний. Анализ полученных результатов показал, что облучение в течение одного поколения повышает, недостоверно (t4 = 1.4), уровень атрофии гонад у линии Canton-S, тогда как у линии GB-39 R доля самок с атрофированными гонадами существенно выше, чем у интактных самок (ta = 3,2).

В следующей серии экспериментов мы провели обследование динамики смертности самцов обследуемых генотипов. Показано, что средняя продолжительность жизни самцов-имаго линий C-S и C-S R составляет соответственно: 26.5 ± 7.42 и 29.43 ± 8.45 суток, то есть средняя продолжительность жизни после облучения возросла на 10%. Для линий GB-39 и GB-39 R эта величина соответствует 25.2 ± 5.98 и 24.2 ± 6.79 суткам, таким образом средняя продолжительность жизни после облучения снизилась на 4%.

Таблица 13

Результаты теста на атрофию гонад в скрещиваниях облучаемых и необлучаемых линий Drosoptüla melanogaster

Тип скрещивания Число самок F, Частота атрофии

CyL/PmxC-S 51 21 ±4.0

CyUPmxC-SR 80 28 ±3.5

CyL/Pmx GB-39 97 4713.5

CyL/Pm x GB-39 R . 154 6,1 ±2.7

Данные рис. 5 и б показывают характер эффектов малых доз радиации, видно, что характер уровня смертности самцов дрозофилы у линий С-Б и ОВ-39 различается ( р<0.001). Показано, что при хроническом облучении малыми дозамирадиашпт линии СВ-39 достоверно уменьшается продолжительность жизни (р<0.05), в то время как для линии С-Б достоверно увеличение данного признака ( р<0.001).

-о- СапЮп-З —«— Сапи>р-5 я }

Рис.5. Динамика смертности самцов дрозофилы лабораторной линии Сатоп-Б после хронического облучения в течение одного поколения в дозе 0.8 Гр.

Данные, полученные при исследовании динамики смертности, свидетельствуют о том, что существует зависимость между продолжительностью жизни особей дрозофилы и хроническим облучением в исследованном диапазоне доз. Причем при облучении линии СВ-39 продолжительность жизни уменьшается, тогда как для линии С-Б показан обратный эффект.

Известно что продолжительность жизни характеризует динамику взаимодействия повреждающих и восстанавливающих процессов в организме (Фролькис, 1992; Гераськин, 1995). Изменение продолжительности жизни при облучалш радиацией в малых дозах отмечается рядом авторов .(Кузин, 1991; Москалев, 1991). Поскольку снижение ее рассматривается как неблагоприятный для популяции процесс, то увеличение продолжительности жизни под воздействием малых доз является компенсационным, свиде-

тельсгвующим о фшиологической адаптации к угнетающему действию радиации.

-»- СВ-38 —•— GB-39^'.

Рис.6. Динамика смертности самцов дрозофилы лабораторной линии GB-39 после хронического облучения в течение одного поколения в дозе 0.8 Гр.

Менее очевидна причина одновременного как уменьшения (для GB-39), так и увеличения (дня C-S) исследуемого показателя после облучения. Однако надо отметить, что подобная неоднозначность описана в литературе (Lints et. al., 1989; Измайлов и др., 1990; Обухова и др., 1991),вука-занных работах отрицается влияние какого бы то ни было постороннего физического фактора. Видимо, различия в характере динамики смертности между линиями GB-39 и C-S можно объяснить различиями в генотипе изучаемых линий.

Как нами уже отмечалось линии Canton-S и GB-39 отличаются по генотипу, точнее линия GB-39 отличается по циготипу, определяемому наличием, в отличии от линии Canton-S, Р- элемента. Наличие в генотипе линии GB-39 этого мобильного генетического элемента и может определять различия в реакции исследуемых линий на воздействие ионизирующего излучения по такому показателю как продолжительность жизни. На возможность такого объяснения указывают имеющиеся данные о том, что в

регуляции продолжшельносгн жизни могут принимать участие экстрахромосомные элементы (Murray, 1990; Романчиков, 1992; Lim, Simmons, 1994; Nikitin, Woodruff, 1995).

Итак, при анализе уровня мутабильности у природных популяций Drosophila melanogaster, обитающих в зоне аварии на Чернобыльской АЭС было обнаружено достоверное увеличение частоты рецессивных летальных мутаций и доминантных легален. Причем, как при исследовании природных популяций, так и в экспериментальных работах характер изучаемой зависимости величины эффектов от дозы облучения в большинстве случаев был немонотонным.

В экспериментах с радиочувствительным мутантом дрозофилы был выявлен факт одновременного увеличения частоты индуцированных рецессивных летальных мутаций и мутаций, повышающих жизнеспособность дрозофилы.

В последующих экспериментальных исследованиях генетических эффектов ионизирующего излученияс использованием лабораторных линий дрозофилы с различным цитотипом была показана роль мобильных генетических элементов в регуляции уровня радиоиндуцированных эффектов.

Именно существование этих эксграхромооомных факторов у дрозофилы обусловило развитие исследований, посвященных генетическому контролю мутабильности (Demerec 1926а,b; 1937; 1941). В дальнейшем, в связи с открытием структуры ДНК, все внимание было уделено изучению процессов метаболизма ДНК. Однако, в последние годы интерес к изучению мобильных генетических элементов значительно возрос и обусловлено зто тем, что их значение в регуляции многих жизненно важных процессов, таких как дифференцировка, деление, рост, апоптоз, сгарёние клетки оказалось более значимым, чем предполагалось ранее и, вероятно, именно эти элемегпы могут быть ответственными за регуляцию активности процессов адаптации оргашома к измененным условиям окружающей среды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема корректной оценки реакции организма на воздействие факторов окружающей среды является одной из самых сложных проблем в биологии. Сложность решения данной проблемы во многом определяется постановкой самой задачи - практически невозможно, даже в условиях экспе-римеита, решить проблему количественной оценки реакции биологической системы (будь то клетка или популяция) на воздействие фактора малой интенсивности. Причин, определяющих сложность решения этой проблемы, достаточно много: от сложности в определении величины действующего фактора, до выбора, соответствующего поставленной задаче, метода исследования.

Однако, решение практических задач энвайронментологии требует создание прочной теоретической основы для оценки величины экологического риска для живых систем от воздействия факторов окружающей среды действую! цих в природе во воевозмож! тых комбинациях. Поэтому разработка теоретических основ и критериев и методов оценки реакции организма(ов) навоздействиефакторов окружающей среды (как абиотической, так и биотической природы) является необходимой реальностью в биологических исследованиях.

Оценка величины реакции биологической системы на действие факторов окружающей среды малой интенсивности крайне сложна. Одна из проблем, с которой в первую очередь сталкивается экспериментатор - это проблема репрезентативности. Во многом решение этого вопроса определяется количеством изучаемых факторов, а именно: чем больше действующих агентов вовлекается в аналш, тем больше должна быть выборка в исследуемых вариантах эксперимента. И учитывая тот факт, что в экспериментах с малыми дозами (концетрациями) статистически достоверные заключения возможны только с использованием больших выборок (Конрадов, 1994), проблема определения требуемой величины выборки может быть практически неразрешимой. Более того, при выполнении экспериментов по изучению механизмов действия факторов среды малой интенсивности достаточно остро будет очерчиваться еще одна проблема - проблема идентификации "действующего" фактора - на фоне малых доз (концентраций) любой неучтенный экспер имег ггатором фактор может быть действующим.

Без сомнения, введение даже этих двух условий (выборка, идентификация фактора) в ранг проблем, однозначно, на наш взгляд , определяет некоторую "некорректность" заключений о конкретных механизмах действия определенного фактора малой интенсивности, за исключением тех случаев,

когда изучается специфическая реакция организма на какой-либо конкретный действующий агент. При изучении реакции организма на действие факторов среды, универсальность действия которых показана, например радиации, можно говорить, по-вцдимому, только о величине реакции на измененные условия содержания.

Ранее нами была предложена модель полимодальности в реакции биологических систем на действие радиации (Зайнуллин 1988). Одна из причин, приводящая к различиям в реакции организма на действие малых и "больших" доз, может быть связана с различиями в механизмах утилизации повреждений, приводящих к радиочувствительности и радиоиоражаемос-ти. Именно эти различия являются серьезным аргументом против неограниченного использования приема экстраполяции величин эффектов с больших доз на малые.

Как известно, при изучении механизмов радиочувствительности широко используется дрозофила. В ходе исследований накоплена обширная информации о радиочувствительности этого объекта, в частности, о зависимости выхода радиоиндуцированных мутаций от величины дозы. Анализ этой информации позволяет сделать следующие предположения относительно закономерностей в реализации биологического эффекта при облучении вразных дозах (рис.7).

Эффект У4=а<+Ь#

Рис. 7. Зависимость "доза-эффект". у, - реакция в пределах фоновых величин (норма реакции признака); у2- реакция в пределах "малых доз" (реакциягенотипа клетки на воздействие); у^ - реакшм обусловленная гетерогенностью клеточной популяции; у4 - зависимость "доза-эффект" основанная на эктраполяционной оценке эффектов, полученных при облучении большими дозами на малые.

Согласно нашим исследованиям, экспериментальные данные по изучению динамики выхода рецессивных легальных мутаций в условиях облучения "малыми дозами" (до 0.25 сГр) не согласуются с требованиями к прямо пропорциональной зависимости. При "сверхмалых", околофоновых, величинах доз облучения уровень рецессивных мутаций определяется величиной нормы реакции этого признака (у, = а,+в^). При увеличении дозы облучения характер реакции генотипа на воздействие будет зависеть отак-тивносги внутриклеточных систем восстановления (адаптивный ответ, репарация) и величина изменчивости генотипа будет определяться их восстановительными способностями (у2 =а:+ Ь2х2). Следующее отклонение от прямо пропорциональной зависимости реакции "доза - эффект" может быть обусловлено гегероштносгью клеточных популяций - гибели наиболее чув-сгвтпельной части клеток (у3 = а3+в^.

На основании экстраполяции эффектов, полученных при исследованиях последствий облучения большими дозами на диапазон малых доз зависимость "доза 5 эффект" может быть описана уравнением у4 = а4 + в4 х4 Выявленные нами возможности "надлинейной" зависимости эффектов от дозы облучения у человека, мышевидных грызунов, растений позволяют предположить универсальность этой модели.

По-видимому, основным ответом организма на воздействие факторов малой интенсивности (в околофоновых величинах), как мы предполагаем на основании наших результатов, полученных в экспериментах на дрозофиле, является изменение стабильности генома, проявляющееся в изменении функций некоторых элементов генома (например, мобильные элементы). На фоне такой дестабилизации генотипа возможны сколь угодно различные реакции организма на воздействие стрессирующего фактора -от гормезиса до гибели, что и было нами обнаружено при исследовании эффектов малых доз ионизирующего излучения.

Па последующих этапах утилизации шщупированных повреждений возможно вовлечение в процесс восстановления исходного генотипа систем адаптивного ответа клетки, процессов репарации. Эти оба процесса направлены только на исправление индуцированных факторами среды повреждений генотипа. Поэтому в большинстве случаев, особенно для процессов репарации, при исследованиях реакций генотипа на воздействия факторов среды в дозах, приводящих к индукции процессов адаптивного ответа клетки и репарации, обнаруживается изменение спонтанного уровня мутабиль-носга.

Общая схема реакции генотипа на воздействие фактора окружающей среды (радиации) в околофоновых и малых дозах может выглядеть следующим образом (рис. 8):

Воздействие

Модель реакции клетки (организма) па действие малых доз ионизирующей радиации

-действующий фактор приводит кизменению активности мобильных генетических элементов, приводящих к обратимым изменениям сгабиль-I юсга генома. Изменения в первич! юй, вторичной, третичной структуре ДИК могут приводить к индукции, в какой-то мере, процессов адаптивного ответа клетки и, в большей степени, механизмов репарации;

-в результате репарации может быть восстановлен исходный генотип. В случаях нетождественной репарации могут быть индуцированы легальные мутации, в последующем приводящие к гибели клетки или новые мутантные формы которые, в случае успешной конкуренции, могут дать начало новому генотипу.

К настоящему времени имеется достаточно много сведений об участии мобильных генетических элементов в процессах микроэволюции (Брес-лер, 1983; Пасюкова и др., 1984; Lim, Simmons 1994;Nikitin, Woodruff, 1995; Woodruff, Nikitin, 1995; Wright 1995 и др.). Естественно, что в основе всех предположений о вовлечении мобильных генетических элементов в микроэволюционные процессы лежит способность, с достаточно высокой часго-

той - для IS-элементов некоторых прокарнотических организмов частота спонтанных транспозиций может соответствовать 10"3- 10д (Прозоров 1989) - индуцировать повышение уровня мутабильносга.

Одновременно, с повышением уровня мутабильносги, мобильные генетические элементы, наличие которых показано практически для воех организмов s от бактерии до человека (Berg, Howe, 1989), могут приводить к достаточно широкому спектру эффектов, например, изменению продолжительности жизни (Nikitin, Woodruff, 1995; Woodruff, Nikitin, 1995). Кроме того, мы полагаем, что в основе гормезиса могут бьпъ также и механизмы транспозиции мобильных элементов и связанные с этим "эффекты положения генов" - некоторые данные, свидетельствующие о "стимулирующем эффекте" малых доз радиации были получены нами в экспериментах на дрозофиле, мышевидных грызунах (Башлыкова, Ермакова, Зайнуллин, 1987; Зайнуллин, Ракин, Таскаев, 1994), растениях (Шершунова, Зайнуллин 1990,1991,1995).

Итак, большинство имеющихся у нас данных свидетельствуют в пользу универсальности механизмов реакции клетки на воздействие иони-з ирующей радиации практически у всех организмов. Суммируя их (данные) и развивая предложенную в 1988 году гипотетическую модель реакции "доза-эффект" (Зайнуллин 1988), можно предложить следующую схему реакции клетки на действие ионизирующейрадиации:

- при действии околофоновых величин доз ионизирующей радиации индуцируются механизмы, приводящие к повышению нестабильности генома. Основным механизмом индукции нестабильности генома является изменение активности транспозиций мобильных генетических элементов. При исследовании величин эффектов после облучения в этих "дозах" возможно обнаружение эффектов стимулирования (аналогично системе адаптивного ответа клетки), величина обнаруживаемого эффекта может изменяться в пределах нормы реакции изучаемого признака;

- при повышении дозы облучения возможна индукция системы адаптивного ответа клетки. При повышении дозы облучения происходит активация механизмов индуцибельной системы репарации. Величина изучаемого признака может бьпъ существенно отличаться ст спонтанного уровня. Кроме этих механизмов в регулировании уровня генетических эффектов действия радиации в этом диапазоне доз могут принимать механизмы апоп-тоза (Thompson, 1995;Jacobson-Kramet.al., 1995; Wright, 1995 и др.), репродуктивной гибеликлеггок (Альферович, Готлиб, Пелевина 1995);

- дальнейшее повышение дозы облучения приводит к увеличению уровня интерфазной гибели клеток, механизмы которой могут быть весьма разнообразны.

Подводя итог рассмотренной Нами проблеме реакции генотипа на воздействие малых доз ионизирующей радиации можно сделать следующие выводы:

- в реакции "доза-эффект" обнаруживается полимодальная зависимость. Можно обнаружить, по крайней мере, три "пика", объяснимых наличием, по крайней мере, трех механизмов утилизации повреждений, индуцированных ионизирующим излучением в разных дозах;

- обнаруживаемая зависимость универсальна и характерна практически для всех организмов, поскольку в основе ее лежат механизмы внутриклеточного реагирования, универсальность которых общеизвестна. Величина и характер зависимости "доза-эффект" может бьпъ модифицирована практически любым, действующим на клетку фактором;

- в диапазоне "малых доз", выявленные нами закономерности делают трудновыполнимыми любые прогностические оценки, поскольку любое, сколь угодно малое, изменение в состоянии окружающей среды может привести к значимым изменениям генотипа;

- облучение в условиях аварии на атомной станции приводит к достоверно значимому увеличению частоты нарушений кариотипа у человека. Эффективность кратковременного облучения приблизительно в 5 раз эффективнее пролонгированного. С использованием математической модели установлено, что величины аппрош ширующих минимально действующих доз при облучении in vivo колеблются в диапазоне 0.005 - 0.0007 сГр. Зависимость "доза-эффект" в диапазоне исследованных доз имеет надлинейный характер;

- для большинства обследованных видов мышевидных грызунов выявлен надлинейный характер зависимости "доза-эффект". Зависимость "доза - эффект" у природных популяций Drosophila melanogaster определяется мощностью экспозиционной дозы (в мониторинговых исследованиях 1986 г. обнаружена прямо пропорциональная зависимость, в 1987 г. - со снижением уровня радиационного фона - зависимость имела.немонотонный характер) ;

- в экспериментах с облучением малыми дозами ионизирующего излучения на лабораторных линиях дрозофилы показано, что характер зависимости "доза-эффект" определяется генотипом линии. Важную роль в определении величины изменчивости генотипа в результате облучения малыми дозами играет щтготип клетки.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

За^шуллин В.Г. Анализ мутабилъносга сперматоцитов радиочувствительного мутанта дрозофилы // Вестник ЛГУ. 1979. № 21. С. 105-107.

Зайнуллин В Т., Тихомирова М.М. Характеристика некоторых ферментов у линий дрозофилы различающихся по радиочувствительности // Исследование роли биологически активных факторов в экспериментальном мутагенезе. Саранск. 1979. С. 43-45.

Зайнуллин ВТ., Цапыгина Р.И. Анализ динамики индукции хромосомных аберраций в клетках костного мозга лабораторных мышей//Радиобиология. 1987. Т.27. № 1. С. 130 -132.

Башлыкова Л. А., Ермакова О.В., Зайнуллин В.Г. Эмбриональная смертность полевки-экономки, как показатель влияния малых доз радиоактивности на генетические процессы в популяциях// Радиобиология: 1987. Т.27.№ 1. С. 126-128.

Башлыкова Л .Д., Зайнуллин ВТ. Особенности действия повышенного фона радиации на размножение потомства облучавшихся животных// Экологические Mexai гизмы преобразования популяций животных при антропогенных воздействиях. Инф. материалы. Свердловск. 1987.С.8-9.

Зайнуллин В.Г.,Ракин А.О., Таскаев А.И., Шевченко В.А. Частота рецессивных легальных мутаций в природных популяциях Dr.melanogaster, отловленных в районах аварии на Чернобыльской АЭС. Сыктывкар. 1987. 17С. (Сер. препринтов "Науч.докл." АН СССР. КомиНЩ '

Зайнуллин В.Г., Таскаев А.И., Башлыкова Л.А. и др. Генетические последствия аварии на ЧАЭС для природных популяций мышевидных грызунов и дрозофилы. Сыктывкар. 1988.24 С. (Сер.препрштгов "Науч.докл." АН СССР. Коми НЦ)

Zainuffin V.G-, Bashlykova LA., Serditov N.P. Genetical changes in plants (Ranimculaceae) and anumals (Microtus) caused by natural radioactive impacts / IU internetional conférence" Bioindicatores deteriorisations régions". Ceske Budejoviœ. May 23-27. Ahstracts. 1988. P. 109.

Зайнуллин В.Г. "Доза-эффект" в исследовании эффектов малых доз радиации//ТрудыКНЦУрО АН СССР.№97. Сыктывкар. 1988. С.93-97.

Зайнуллин В.Г,, Сусликов В.Й., Бородат П. А. и др. Эффект снижения числа анеуплоидных клеток у лиц, длительное время контактировав-шихс источниками ионизирующего излучения II Генетический мониторинг населения промышленных городов в условиях загрязнения окружающей среды. Кемерово. 1988. С.88-93.

Шевченко В.А., Акаева Э.А.... Зайнуллин В.Г. и др. Цш огенетическое обследование населения в целях биологической дозиметрии в связи с аварией на ЧАЭС// Доклады I -го Всесоюзного научно-технического совещания по итогам ликвадацйн последствий аварии на Чернобыльской АЭС. Т.З. Ч .1. Прогнозы изменения радиационной обстановки и дозовых нагрузок в зоне аварии. Чернобыль. 1989. С.225 - 243.

Зайнуллин ВТ., Ватта К.В., Михеев B.C. Анализ частоты спонтанных и индуцированных аутосомных летальных мутаций в оогенезе радиочувствительного мутанта rad(2)201G1 Drosophila melanogaster// Генетика. 1990. T.26. С. 1320-1323.

Зайнуллин В.Г., Петров О.Н., Скалецкий Ю.Н. и др. Цитогенегги-ческие последствия аварии на Чернобыльской АЭС для человека. Сыктывкар. 1990.38 С. (Сер.препринтов "Науч. докл." АН СССР. Коми НЦ. спецработа).

Зайнуллин В.Г., Таскаев А.И., Шевченко В А., Башлыкова Л А. Ци-тогенетические последствия аварии на Чернобыльской АЭС для природных популяций мышевидных грызунов// Проблемы экологического мониторинга. Материалы Росагйской радиобиологической научно-пракпгаеской конференции. Брянск. 1991.4.1. С.86-87.

Шевченко В.А., Акаева Э А....Зайнуллин В.Г. и др. Цигогенетичес-кое обследование населения в целях биологической дозиметрии в связи с аварией на ЧАЭС// 1-ый научно-технический семинар по основным результатам ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС. Сб.тези-сов. МАЭ СССР. ПО "Комбинат". НПО "Энергия". Чернобыль. 1988 (спецработа).

Мяснянкина Е.Н., Генералова М.В., Зайнуллин В.Г., Шевченко В. А., Ракин А.О. Влияние повышенного радиационного фона на частоту мутаций в популяциях дрозофилы, обитающих в зоне ЧАЭС // Обз. инф. "Проблемы окр. среды и природных ресурсов. ВИНИТИ АН СССР. 1991. № 5. С.45-46.

Zainullin V.G., Shevchenko V A., Mjasnjankina E.N., Generalova M.V., Rakin А.О. The mutation frequency ofDrosophila melanogasterpopulations living under conditions of increased background radiation due to Chernobyl accident// The Science of the Total environment. 1992. v. 112. P.37-44.

Зайнуллин В J"., Бородкин П. А., Черняк СИ. и др. Результаты цито-генетического обследования лиц, принимавших участие в ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС// Радиобиология. 1992. Т32. Вып. 5. С.668-672.

Шершунова В.И., Зайнуллин В.Г., Таскаев А.И. Анализ частоты хло-рофилльных мутаций в природных популяциях Dactylis glomerata L., произрастающих в 30-километровой зоне аварии на Чернобыльской АЭС. // Ра-

диоэкологические исследования в 30-киломегровойзоне аварии на Чернобыльской АЭС. Сыктывкар. 1993. С. 82-88. (Тр. Коми научного центра УрО РАН. №127).

Зайнуллип В.Г., Ракин А.О., Мяснянкина E.H., Шевченко В А. Мутагенез Drosophila melanogaster в условиях пролонгированного воздействия малых, доз радиации II Радиоэкологические исследования в 30-километровой зоне аварии на Чернобыльской АЭС. Сыктывкар. 1993. С. 53-59. (Тр. Коми научного центра УрО РАН. № 127).

Шершунова В.И. Зайнуллин ВТ. ВиленскийЕ.Р. Мутабильносгъ семян овсяницы луговой (Festuca pratensis Huds.) в условиях хронического гамма-облучения// Рад иоэкологический мониторинг природных экосистем. Сыктывкар. 1993. С. 80-87. (Тр. Коми научного цешраУрОРАН, № 130).

Зайнуллин В.Г., Ракин А.О., Таскаев А.И. Мяснянкина E.HS Генералова М.В., Шевченко В А. Частота рецессивных летальных мутаций в природных популяциях Drosophila melanogaster// Труды 1 Всес. конф. "Радиационные аспекты Чернобыльской аварии". Санкт-Петербург. 1993. Т.2. С.80-84.

Зайнуллин ВТ., Ракин А.О. Таскаев А.И. Динамика частоты онтогенетических нарушений в микропопуляциях мышевидных грызунов, обитающих в районе аварии на Чернобыльской АЭС// Радиационная биология. Радиоэкология. 1994. Т.34. № 6. С.852 - 857. j

Шершунова В Л., Зайнуллин ВТ. Мониторинг природных популяций Dactylis glomerata в зоне аварии на ЧАЭС// Радиационная биология. Радиоэкология. 1995. Т.35. Вып. 5. С.690-695'.

Зайнуллин В.Г. Мутабильносгъ лабораторных линий дрозофилы в условиях хронического облучения малыми дозами радиации// Воздействие радиоактивного загрязнения в зоне аварии на Чернобыльской АЭС (1986-1996). Сыктывкар. 1996. С.132-138. (Тр.Коми научного центра УрО РАН.№ 145).

Зайнуллин В.Г. Генетические эффекты малых доз радиации. Сыктывкар. 1996.20С. (Сер.препршггов "Науч. докл." РАН. Вып.377).

Зайнуллин В.Г. Мутабильносгъ природных популяций и лабораторных, линий дрозофилы в условиях хронического облучения в малых дозах низкой интенсивности// Радиационная биология. Радиоэкология. 1996. Т36. Вып. 4. С.561 - 566.

Зайнуллин ВТ1. Генетические эффекты хронического облучения низкой интенсивности // Радиационная биология. Радиоэкология. 1997. Т.37. Вып. 4. С. 555-559.

Зайнуллин В.Г. Генетические эффекты хронического облучения малыми дозами ионизирующего излучения. Спб.: Наука. 1998. (в печати)

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Зайнуллин, Владимир Габдуллович, Москва



/

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На нравах рукописи УДК 575.224:595.773.4:614.876:621.039.58

3 АЙНУЛЛИН Владимир Габдуллович

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ МАЛЫМИ ДОЗАМИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ

03.00.01—радиобиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических щук в формеяйучного доклада

-г-п^о степень А1-*-

/м

Работа выполнена в Отделе радиоэкологии Института биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук И.И. Пелевина профессор, доктор биологических наук М.М. Асланян профессор, доктор химических наук A.M. Серебряный

Ведущее учреждение—Медицинский радиологический научный

центр РАМН, Обнинск

Защита состоится 9 октября- 1997 г. в ^

___часов на заседании

ком государственном уни-Москва, ГСП, Ленинс-

диссертавдонного Совета Р верситете им. М.ВЛомо кие горы, МГУ, биолоп:

С диссертациеь

же биологического

факультета МГУ. Отз? ГСП, Ленинские горы, Д.053.05.74.

су: 119899, г.Москва, чсхзфтационный Совет

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационногосовета доктор биологических нау

Введение.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуалыюсть проблемы. Проблематика действия малых доз радиации является весьма обширной и затрагивает вопросы развития жизни на нашей планете, с начала своего возникновения подверженной влиянию низких доз ионизирующей радиации в качестве возможного и существенного фактора эволюции. Существуют два аспекта проблемы малых доз: физический и биологический, причем физический аспект изучен гораздо лучше, чем биологический (Boad, Feinendegen, Booz, 1988; Booz, Feinendegen, 1988; Карпфель, Драшил, 1989).

В современной биологии авария на Чернобыльской АЭС акцентировала особое внимание на проблемах генетических последствий облучения как для человека, так и для остальных представителей животного и растительного мира. Без сомнения, до 1986 г., были получены интереснейшие результаты (Биологическое действие ионизирующих излучений, 1957; Scott, Evans, 1959; Ионизирующее излучение и наследственность, I960; Ли, 1963; Тимофеев-Ресовский, Иванов, Корогодин, 1968; Кузин, 1970,1973;Ганас-си 1976; Митрофанов, Олимпиенко, 1980; Шевченко, Померанцева, 1985), позволившие более быстро и более рационально подойти к интерпретации результатов, полученных при анализе данных биологических и медицинских исследований в зоне аварии на Чернобыльской АЭС (Пелевина, Рябов, Рябцевидр., 1991; Последствия Чернобыльской катастрофы: ЗдоровьеСре-ды.; Здоровье Человека, 1996а, б). ~

Пфвь1ерезул1»татыаналит последствий аварииЧфнобьшьской АЭС определили особую значимость проблем модификации радиобиологических эффектов факторами окружающей среды (Виленчик, 19915. Однако не менее значимыми становятся проблемы биологической эффективности малых доз радиационного фактора. При принятии этих положений фазу же возникает еще одна проблема, не менее важная чем предыдущие, - проблема измерения дозы и ее определение как "низкая", "промежуточная", "высокая" и "очень или сверхвысокая". В соответствии с условиями, принятыми в докладе НКДАРООН за 1986 год (UNSCEAR, 1986) ониравныО - 0.2; ; 0.2 - 2.0; 2.0 -10.0 и свыше 10 Гр. Придерживаясь того же принципа, можно указать, что низкие мощности дозы для всех видов излучения - это мощно-' у сш < 0.05 мГр/мин, высокие мощности - это мощности > 0.05 Гр/мин, а промежуточные мощности дозы попадают в диапазон между этими двумя цифрами. Однако, зга классификация не обязательно отражает откоситеяь-; ную биологическую эффективность, что может привести к некоторой нео-

днозначносги при интерпретации получаемых результатов, т.е. одна и та же доза по отношению к одним инициируемым радиацией эффектам будет малой, к другим- иной. Согласно Д.М.Спитковекому ссоавторами величина малой дозы в основном определяется долей пораженных мишеней и варьирует для адер лимфоцитов дня гамма-лучей '"Со -0.13, дня альфа частиц 4Мэв - 35 сГр (Сгштковский, Зайцев, Талызина, 1994).

Крайне а южно определить величины малых доз радиации для условий аварийно (экспериментально) радишктивно-загрязненшк территорий как это случилось при аварии на Чернобыльской АЭС. Поэтому в нашей работе мы стараемся придерживаться формализованного подхода к определению "малых доз", предложенного НКДАР ООН. В этом случае, при анализе последствий аварии на Чернобыльской АЭС для биологических систем мы имеем дело, в большинстве случаев, с последствиями пролонгированных (в ряде случаев хронических) облучений "малыми дозами", а именно облучением в дозах не превышающих 0.2 Гр при излучении с малой величиной линейной потери энергии (ШТЭ) и 0.05 Гр при излучении с высокой ЛПЭ (ШБСЕАЕ, 1986)..

При решении вопроса о генетической опасности малых доз ионизирующей радиации основным является принятие или непринятие "понятия" пороговой дозы, т.е. дозы не способной индуцировать мутации. Классической концепцией, основанной на данных многочисленных экспериментов с рядом организмов от микроорганизмов до человека, является признание следующих позиций:

- частота возникновения индуцированных радиацией хромосомных аберраций пропорциональна квадрату дозы облучения;

- частота индукции точковых мутаций находится в прямой линейной зависимости от величины дозы; причем для данного типа мутаций наблюдается кумулягавносгь мутагенного эффекта, т.е. получение при данной дозе одного и того же количества мутаций как при одновременном, так и при фракционированном облучении;

- с уменьшением дозы возрастает относительное значение точковых мутаций.

" Из этих положений логически, на наш взгляд, следуют следующие выводы:

- отсутствие порога мутабильности: самые малые дозы ионизирующей радиации должны индуцировать мутации;

- пролонгированное (хроническое) облучение малыми дозами может в результате кумулирования эффекта действия оказывать существенное влияние на возраста! ше мутабильности;

- возрастание уровня мутабильности может привести к существенным микроэволюционным событиям.

Принятие этих выводов нацело исключает возможность признания какой-либо генетически безвредной дозы облучения и выдвигает необходимость разработки мер защиты от облучения даже крайне минимальными дозами.

Итак, проблема генетической опасности малых доз радиации приобретает два аспекта: это, во-первых, проблема изучения механизмов действия малых доз радиации. Разрешение этого вопроса, кроме решения множества прикладных задач, поможет лучшему пониманию процессов эволюции, процессов генопгипической адаптации организмов к изменяющейся окружающей среде. Во-вторых, данная проблема обуславливает необходимость исследований направленных на поиск и изучение механизмов, снижающих генетическую опасность ионизирующего излучения для организмов.

Цель исследований заключалась в выявлении закономерностей реакции генотипа животных организмов на хроническое действие малых доз радиации. Используя данные цитогенегического обследования контингента лиц, привлекавшегося кликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС, необходимо было оценить влияние малых доз ионизирующего излучения на генотип человека и корректность использования цитогенегического метода в целях биологической дозиметрии при облучения in vivo.

л

В задачи исследований входило изучение: " *

- последствий пролонгированного (хронического) облучения малыми дозами ионизирующих излучений для генотипа животных и человека;

- реакции "доза - эффект" животных и человека при облучении в диапазоне малых доз;

- динамики уровня мутабильности природных популяций и лабораторных линий дрозофилы в условиях хронического облучения малыми дозами;

- динамики уровня цитогенетичоских нарушений мышевидных хры-зунов в условиях хронического облучения малыми дозами;

- уровня цитогенетических нарушений в клетках периферической крови человека, облучившегося при ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС. '

Научная новизна. Впервые исследована реакция генотипа клеток периферической крови человека на кратковременное, фракционированное, пролонгированное и в комбинациях облучение in vivo. Показано, что облучение в зоне аварии на Чернобыльской АЭС привело.к достоверно значимому увеличению частоты хромосомных аберраций в клетках периферической крови людей. Решение уравнений зависимости "доза-эффект" по-

зволшю определить величины " аппроксимирующих минимально действующих доз", колеблющихся в диапазоне 0.005 - 0.0007 сГр. Эффективность кратковременного облучения оказалась в 5 раз выше пролонгированного.

Впервые как для лабораторных животных, так и для природных популяций животных показан полимодальный характер зависимости в реакциях "доза - эффект". Можно обнаружить, по крайней мере, три "пика", объяснимых наличием трех механизмов утилизации повреждений, индуцированных ионизирующим излучением в разных дозах.

Обнаруживаемая зависимость универсальна и характерна пракгачес-ки дня всех организмов, поскольку в основе ее лежат механизмы внутриклеточного реагирования, универсальность которых общеизвестна. Величина и характер зависимости "доза-эффект" может быть модифицирована практически любым, действующим на клетку фактором В диапазоне "малых доз", выявленные нами закономерности делают трудаовыполнимыми любые прогностические оценки.

Для большинства обследованных видов животных выявлен надли-нейный характер зависимости "доза-эффект". Показаны различия в реакции соматических и половых клеток животных на хроническое облучение в малых дозах;

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты о реакции генотипа животных и человека на воздействие хронического обручения в малых дозах существенно дополнили наши представления о механизмах действия ионизирующего излучения. Показано, что облучение в малых дозах может приводить к значимому изменению уровня мутабшьнос-ти и цигогенепических нарушений. Предполагается, что в основе изменения величины генотипической изменчивости могут лежать механизмы дестабилизации генотипа, обеспеченные индукцией эписомоподобных структур. Этот механизм реагирования живых организмов на действие ионизирующей радиации в малых дозах позволяет объяснять неоднозначность при определении величин биологической эффективности действующего фактора.

Резужтаьшсхждоваштйпшр^юктгда'тъ^ ным об "аномальных эффектах" при исследованиях биологической эффективности малых доз (концентраций) факторов окружающей среды, а также дополняют наши представления о механизмах адаптации организмов и микроэволюционных событий, происходящих в популяциях животных в гоменен-ных условиях окружающей среды.

Результаты исследований использовались при медицинских обследованиях участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС, приразработке прогнозов последствий аварии на Чернобыльской А ЭС доя флорыифауны.

Личный вклад диссертанта в разработку научных результатов, выносимых на защиту. Автор работы принимал участие: в сборе материала (отлов и отбор животных образцов в зоне аварии на Чернобыльской АЭС; взятии периферической крови у "ликвццаторов" последствий аварии на Чернобыльской АЭС"); в проведении экспериментальных работ (приготовление препаратов хромосом человека, мышевидных грызунов, гибридологический анализ дрозофилы). Самостоятельно выполнен анализ всего первичного материала, сформулированы положения и выводы работы.

Настоящая работа является частью исследований, проводимых Отделом радиоэкологии Коми научного центра Уральского отделения РАН в рамках комплексной программы по ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС (постановление Совета Министров СССР от 01.11Л986 г. " Влияние радиоактивного загрязнения на флору и фауну"; научно-исследовательских тем "Влияние закономерностей сочеганного действия факторов радиационной и нерадиационной природы на популяции животных и растений, обитающих в природных биогеоценозах"; "Комбинированное действие ионизирующей радиации и других факторов физической и химической природы на популяции животных и растений".

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на ХШ Международном генетическом конгрессе (Москва 1978); Ш Всесоюзном симпозиуме"Молекулярнь1е механизмы генетических процессов" (Москва, 1979); Ш конференции по теоретическим вопросаммута-генеза (Вильнюс, 1980); Ш съезде ВОГИС (Кишинев, 1981); Всесоюзной конференции Генетические аспекты проблемы "Человек и биосфера" (Ереван, 1987); и Международной конференции " Вют&ЦогеБ с!е1епог1чайот геЕют'ЧСезке Вискдсисе, 1988); Всесоюзном совещании "Генетический мониторинг населения промышленных городов в условиях загрязнения окружающей среды" (Кемерово, 1988); Всесоюзном совещании "Эколого-ге-нетические последствия воздействия на окружающую среду антропогенных факторов"(Сыктывкар, 1989); I и II радиобиологических съездах Москва, 1989; Киев, 1993); Всесоюзных и международных совещаниях, конференциях, посвященных радиобиологическим последствиям аварии на Чернобыльской АЭС (Пущино, 1988,1990; Брянск, 1991; Москва, 1991,1994; Минск, 1991; Зеленый Мыс, 1990,1996)

Публикации. Материалы и положения диссертации нашли свое отражение в 64 научных работах, в том числе в монографии "Генетические эффекты хронического облучения малыми дозами ионизирующего излучения" СПб: Наука. Общий объем публикаций, посвященных темеработы, около 30 печатных листов.

Положения, выносимые на защиту.

- Чувствительность клеток периферической крови человека к кратковременному, фракционированному, пролонгированному облучению малыми дозами радиации in vivo.

- Генетическая изменчивость лабораторных линий дрозофилы, мышей, полевок-экономок и природных популяций дрозофилы и мышевидных грызунов в условиях хронического и пролонгированного облучения малыми дозами ионизирующего излучения.

- Общность действия малых доз ионизирующего излучения на клетки животных, насекомых и человека.

Глава 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ УЧАСТНИКОВ ЛИКВИДАЦИИ

ПОСЛЕДСТВИЙ АВАРИИ НА ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ АЭС

Авария на Чернобыльской АЭС поставила перед цитогенегакой человека ряд вопросов - одним из них был вопрос о правомочности использования цигогенетического метода в качестве метода биологической дозиметрии. Из клеток организма наиболее перспективными для целей биологической дозиметрии являются лимфоциты периферической крови. Регистрируя индуцированные в них хромосомные аберрации, можно получить, как считалось, достаточно хорошее представление о полученной организмом дозе облучения.

К настоящему моменту в литературе имеется достаточно информации об эффектах ионизиру ющей радиации самых различных характеристик на лимфоциты 11фифер№кхжой крови, как in vivo, так и in vitro и об использовании цитогенегического теста в целях биодозимегрии (Севанькаев, Насонов, 1978; Севанькаев, 1991;Evans, Lloyd, 1978;Ishihara, Sasaki, 1983;Lloyd, Purrot, 1981, IAEA, 1986; Мазник, 1987; Camino, Natarajan, 1988; Pohl-Ruliing, Fisher, Pohl, 1978; Pohl-Rulling et.al., 1990; Pohl-Rulling, 1990). Суммируя результаты этих исследований, можно сделать следующие выводы:

- аберрации хромосомного типа появляются строго в соответствии с превышением нормального, природного барьера дозовой нагрузки, с незначительным влиянием ЛПЭ;

- добавочное облучение дозами 0.3-5 сГр, полученное остро или накопленное за год, либо очень слабо влияет на частоту аберраций, либо вообще не влияет. Из данных, накопленных к настоящему времени, следует, что кривая дозового ответа имеет плато в этом диапазоне доз;

- второе отклонение от предполагаемого воздействия радиации (двух-компонентная теория), по-видимому, происходит при облучении в дозах свыше 5 сГр;

- при более высоких дозах, свыше 30 сГр, дозовая динамика соответствует общепринятой концепции действия радиации на биологические системы;

- плато, (см. п.2), было экспериментально объяснено существованием ферментов репарации, стимулирующихся определенными нарушениями ДНК, происходящими при определенных дозах.

Нами в исследованиях уровня цитогенетичееких нарушений у воинского контингента, участвовавшего в ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС, была изучена дозовая зависимость выхода хромосомных аберраций в зависимости от характера облучения с помощью математической модели разработанной ранее (Зайнуллин и др., 1988; Сусликов и др., 1980) и несколько модифицированной с учетом особенностей настоящего исследования.

1.1. Материал и методы исследований. Радиационная обстановка на промттощадкеЧфнобьшьской АЭС, где работали обследуемые в августе-сентябре 1986 г., характфизовалась большими колебаниями экспозиционных доз внешнего гамма-излучения на относительно небольших участках (от нескольких миллирентгенов до сотен рентгенов в час) и наличием высокоактивных точечных источник�