Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальное обоснование использования интерлейкина-1β при различных вариантах радиационного воздействия

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное обоснование использования интерлейкина-1β при различных вариантах радиационного воздействия"

На правах рукописи

АКСЕНОВА Наталия Владимировна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-10 ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ РАДИАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

03.00.01 -радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ- ПЕТЕРБУРГ 2004

Работа выполнена в Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова

Научный руководитель -

доктор медицинских наук профессор

Гребенюк Александр Николаевич.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор

Легеза Владимир Иванович,

доктор медицинских наук профессор

Баринов Владимир Александрович.

Ведущее учреждение - Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС России.

Защита диссертации состоится " марта 2004 года

в часов на заседании диссертационного совета

Д 215.002.11 при Военно-медицинской академии имени СМ. Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, дом 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова.

Автореферат разослан « » февраля 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор

Ищенко Борис Ионович

Актуальность. Использование источников ионизирующих излучений в различных сферах жизнедеятельности человека стало неотъемлемой частью существования современного общества и необходимым условием дальнейшего научно-технического прогресса. Однако, наряду с очевидными положительными сторонами, в результате не только увеличиваются радиационные нагрузки на население, но и создаются предпосылки для возрастания риска возникновения радиационных аварий и, как следствие этого, возможного облучения в высоких дозах значительных контингентов людей [Ильин Л.Л. и др., 1996; Nenot J.C., 1990]. Кроме того, несмотря на международные соглашения, сохраняется возможность применения ядерного оружия в современных войнах и локальных конфликтах, а угроза ядерного терроризма в последние годы неуклонно возрастает [Куценко С.А. и др., 2001; Cirincione J. el al., 2002]. Все это позволяет утверждать, что в настоящее время имеется настоятельная потребность в эффективных медицинских средствах противорадиационной защиты, а их дальнейшее совершенствование является одной из актуальных проблем современной радиобиологии и военной медицины.

К сожалению, в решении этой важной задачи существуют определенные трудности. Традиционные радиопротекторы обладают высокой эффективностью для защиты организма при радиационных воздействиях, но действуют они лишь в условиях острого облучения в смертельных дозах, проявляют свой радиозащитный эффект в течение короткого промежутка времени, могут применяться только с профилактическими целями [Владимиров В.Г. и др., 1989, 1994; Giambarresi L.J., Walker R.J., 1989; Landauer M.R. et al., 1992]. Средства комплексной терапии острой лучевой болезни в полном объеме могут быть использованы только в условиях специализированного стационара, лечение требует продолжительного времени и наличия высококвалифицированного персонала [Селидовкин Г.Д., 1995; Гуськова А.К., 1997]. Однако при возникновении массовых радиационных поражений в результате применения ядерного оружия или аварий на атомных энергетических установках такие условия будут вряд ли выполнимыми [Бутомо Н.В., Смирнов Н.А., 1991: Владимиров В.Г. и др., 1997].

В связи с этим, в течение последнего десятилетия усилия исследователей, работающих в этой области, направлены на изыскание препаратов, одновременно обладающих как профилактическим, так и лечебным действием [Легеза В.И. и др., 2001; Akiyama M, Nakamura N., 1991]. Эти средства долж-

«

ны быть эффективны не только при остром радиационном воздействии, но и при пролонгированном облучении, при внутреннем облучении, вызванном инкорпорацией продуктов ядерного деления, при местных, сочетанных и комбинированных радиационных поражениях. Их радиозащитное действие должно проявляться в условиях однократного применения и сохраняться в течение достаточно длительного времени. Такие препараты получили название "средств, повышающих радиорезистентность организма" [Легеза В.И., Владимиров В.Г., 1998] или "средств биологической защиты" [Васин М.В., 2001]. Показано, что высокой противолучевой лечебно-профилактической эффективностью при различных вариантах радиационных воздействий обладают иммуномодуляторы, и, в частности, шлокины [Антушевич А.Е. и др., 1992; Кетлинский С.А. и др., 1992, 1995; Будагов Р.С. и др., 1997; Neta R., 1988, 1997; Testa N.G., 1991; Dalmau S.R. et al., 1993].

К числу наиболее перспективных противолучевых средств из группы цитокинов относят интерлейкин-1. В многочисленных экспериментальных исследованиях, проведенных на различных видах лабораторных животных, показано, что препараты интерлейкина-1 при их использовании за 20-24 ч до внешнего облучения с высокой мощностью дозы обладают свойствами радиопротекторов [Neta R. et al., 1986, 1991, 1994; Schwarts G.N. et al., 1990; Constine L.S. et al., 1991]. Установлено также, что при однократном применении в течение 1 ч после острого радиационного воздействия в поражающих дозах интерлейкин-1 выступает в качестве весьма эффективного средства ранней патогенетической терапии лучевых поражений [Чигарева Н.Г. и др., 1993, 2000; Рогачева С.А. и др., 1994,1997; Рождественский Л.М., 1995, 2001; Neta R., Oppenheim J.J., 1988].

В то же время в доступной нам литературе не удалось обнаружить сведений о проявлениях радиозащитной активности ннтерлейкина-1 при внешнем облучении с низкой мощностью дозы и целесообразности его применения для профилактики и лечения сочетанных радиационных поражений, формирующихся в результате действия внешнего пролонгированного облучения и внутреннего облучения, вызванного инкорпорацией продуктов ядерного деления. Такие варианты радиационных воздействий на организм человека весьма возможны не только при ликвидации последствий ядерных взрывов и радиационных аварий, но и, особенно, при длительном нахождении людей на радиоактивно-загрязненной местности. Кроме того, полученные до настояше-

го времени данные не позволяют четко сформулировать представления о конкретных путях реализации радиозащитного эффекта интерлейкнна-1 как на уровне костномозгового компартмента кроветворения, так и на уровне зрелых клеток периферической крови. В то же время, все эти сведения совершенно необходимы для решения вопроса о возможности и целесообразности использования интерлейкина-1 в качестве средства профилактики и терапии лучевых поражений, формирующихся при различных вариантах радиационных воздействии.

Целью исследования явилась экспериментальная оценка радиозащитной эффективности и механизмов противолучевого действия интерлсйкина-1р при различных вариантах радиационных воздействий.

Для реализации поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Оценить эффективность использования ннтерлейкина- 1|3 в качестве средства повышения устойчивости организма к внешнему радиационному воздействию с высокой и низкой мощностью дозы, сочетанному внешнему и внутреннему облучению.

2. Исследовать влияние интерлейкина- 1Р на динамику постлучевых изменений костномозгового кроветворения.

3. Изучить модифицирующее действие интерлейкина- 1Р на количество лейкоцитов и функциональное состояние нейтрофилов периферической крови при различных вариантах радиационных воздействий.

Научная новизна. Впервые обоснована целесообразность использования рекомбинантного интерлейкина- в качестве средства профилактики и ранней терапии радиационных поражений, формирующихся при внешнем у-облучении с низкой мощностью дозы, а также при сочетанном воздействии внешнего пролонгированного и внутреннего облучения.

Показано, что интерлейкин- 1)3 при профилактическом (за 24 ч до облучения) и раннем терапевтическом (через 1 ч после радиационного воздействия) способах применения повышает выживаемость лабораторных животных при внешнем пролонгированном облучении в поражающих дозах, и этот • эффект сопоставим с радиопротекторной и лечебной эффективностью препарата в условиях острого радиационного воздействия. Установлено, что радиозащитное действие интерлейкина- проявляется при сочетанных лучевых

поражениях, формирующихся при внешнем пролонгированном у-облучении и поступлении внутрь организма радионуклидов.

Выявлено, что введение интерлейкина- 1Р за 24 ч до или через 1 ч после облучения способствует снижению выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения и увеличению пролиферативной активности гемопоэтических клеток. Получены новые данные о необходимости участия рецептора к интерлейкину-1 для реализации механизма его раднозашитного действия в отношении клеток-предшественников гемопоэза.

Обнаружено позитивное влияние интерлейкина- 1Р на лейкопоэз и функциональное состояние зрелых нейтрофилов периферической крови при различных вариантах внешнего и внутреннего облучения. Показано, что при внешнем пролонгированном у-облучении, а также при сочетанном внешнем и внутреннем облучении в дозах профилактическое и раннее лечебное

применение интерлейкина- способствует ускорению восстановления общего числа лейкоцитов, абсолютного количества и относительного содержания нейтрофилов и лимфоцитов, стимуляции функционально-метаболической активности зрелых нейтрофилов периферической крови.

Практическая значимость. Разработаны методические подходы к оценке профилактической и лечебной эффективности интерлейкнна- при различных вариантах радиационных воздействий: внешнем облучении с высокой и низкой мощностью дозы, внутреннем облучении, сочетанном внешнем пролонгированном облучении в поражающей дозе и внутреннем облучении от инкорпорированных радионуклидов l37Cs и^г в количествах, не вызывающих острых эффектов поражения.

Предложена схема экспериментальной оценки радиозащитнон эффективности цитокинов, включающая последовательное изучение критериев выживаемости облученных животных, параметров радиочувствительности ге-мопоэтических клеток костного мозга, количества лейкоцитов циркулирующего пула и показателей функционально-метаболического статуса нейтрофн-лов периферической крови.

Экспериментально обоснована возможность и целесообразность использования интерлейкина- в качестве средства профилактики и раннего лечения лучевых поражений, формирующихся при внешнем облучении с высокой и низкой мощностью дозы, а также при сочетанном радиационном воздействии, вызванном внешним и внутренним облучением.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Интерленкин-1р при профилактическом (за 24 ч до облучения) и раннем лечебном (через 1 ч после воздействия) способах применения увеличивает выживаемость животных не только при остром облучении с высокой мощностью дозы, но и при пролонгированном радиационном воздействии, а также при сочетанном лучевом поражении от внешнего и внутреннего облучения.

2. Введение интерлейкина-10 способствует повышению радиорезистентности системы гемопоэза, что проявляется в снижении выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения, увеличении проли-фератнвной активности гемопоэтических клеток, ускорении восстановления количества лейкоцитов циркулирующего пула, стимуляции функциональной и метаболической активности зрелых нейтрофилов периферической крови.

Реализация результатов исследования. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ Военно-медицинской академии, его результаты реализованы в отчете по теме НИР № 4.01.030.п2 шифр "Беталейкин" (СПб.: ВМедА, 2001, 52 с.) и отчете по теме НИР № 4.01.034.п2 шифр "Протектор" (СПб.: ВМедА, 2003,115 с).

Результаты исследования использовались при подготовке методических указаний МУ 2.6.1. - 001 - 2001 "Цитокины. Экспериментальное и клиническое изучение в качестве средств терапии радиационных поражений" (М.: ФУ "Медбиоэкстрем" при МЗ РФ, ГВМУ МО РФ, 2001, 16 с).

Рекомендации, разработанные на основании полученных в диссертационном исследовании результатов, используются в научной работе и учебном процессе на кафедре военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии, ГНЦ-НИИ особо чистых биопрепаратов, НИИЦ (медико-биологической защиты) ГНИИИ военной медицины МО РФ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на Юбилейной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 200-летию Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 1998), на межвузовской научно-практической конференции "Военная и экстремхпь-ная медицина в чрезвычайных- ситуациях" (Санкт-Петербург, 2000), на научно-практической конференции Северо-Западного региона России "Чернобыль - 15 лет спустя" (Санкт-Петербург, 2001), на Российской научной конференции "Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности"

(Санкт-Петербург, 2001), на IV съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001), на международной научно-практической школе-конференции "Цнтокины и воспаление" (Санкт-Петербург, 2002), на Всеармейской научно-практической конференции "Терапевтическая помощь в экстремальных ситуациях" (Санкт-Петербург, 2003), на III съезде радиационных достижений (Киев, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации представлены 21 таблица и 6 рисунков. Список литературы содержит 230 библиографических источников, из них 99 отечественных и 131 иностранных публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования выполнены на 1816 мышах-самцах (1444 белых беспородных, 124 линии БАЬБ/с, 248 гибридах СВА х С57В1 первого поколения) массой 18-20 г и 180 белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г. Животные были выращены в питомнике РАМН "Рапполо-во" и в ходе исследования находились на обычном виварном режиме.

Радиобиологические эксперименты, связанные с облучением лабораторных животных, проводили в рентгеновском кабинете кафедры военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова, в отделе моделирования радиационных поражений 1 научно-исследовательского управления Научно-исследовательского испытательного центра (медико-биологической защиты) ГНИИИ военной медицины МО РФ (Санкт-Петербург) и в медико-биологическом отделе научно-испытательного управления войсковой части 99795 (Прнозерск, Ленинградской области).

Общее относительно равномерное рентгеновское облучение мышей осуществляли на рентгенотерапевтической установке РУМ-17 при следующих условиях: напряжение 180 кВ, сила тока 15 мА, фильтр 0,5 мм Си + 1,0 мм А1, мощность дозы 0,292 мА/кг (54 Р/мин), кожно-фокусное расстояние 50 см, облучение одностороннее, направление облучения: спина-грудь.

Внешнее у-облучение мышей осуществляли на установке ИГУ1М. Источником у-облучения в установке служил '"Се, мощность экспозиционной лозы составляла 0,703 мА/кг (130 Р/мин), кожно-фокусное расстояние 1 м, облучение двухстороннее боковое.

Внешнее у-облучение крыс проводилось с помощью у-установки с источником лСо, расположенном на расстоянии 161 см от поверхности тела лабораторных животных. За 16 ч экспозиции с мощностью экспозиционной дозы 0.005 мА/кг (1 Р/мин) животные получали поглощенную дозу в 10 Гр. Данная доза облучения, вызвавшая в предварительном эксперименте 70 %-ную гибель животных в течение 30 сут после воздействия соответ-

ствует методическим рекомендациям по экспериментальному и клиническому изучению радиозащитных препаратов.

Моделирование внутреннего облучения осуществлялось путем внутри-брюшинного введения крысам 0,8-1,0 мл рабочей смеси, содержащей растворенные в физиологическом растворе соли """Ри (нитрат плутония), "7С$ (хлорид цезия) и ,0Бг (хлорид стронция). Удельная активность вводившихся животным радионуклидов составила, соответственно, 5,28 х 10л Бк/кг для 23,Ри, 2,08 х 10* Бк/кг для '37С8 и 4,48 х 10* Бк/кг для "Бг, что позволило обеспечить формирование к 30 сут опыта дозы внутреннего облучения крыс 2 Гр.

Сочетанное внешнее и внутреннее радиационное воздействие моделировалось путем инкорпорации крысам смеси радионуклидов 219Ри, !37С$ и '"'Бг непосредственно после окончания внешнего у-облучення в дозе 8 Гр (мощность дозы 1 Р/мин, время экспозиции 13 ч 20 мин). Учитывая вклад внешнего (80 %) и внутреннего (20 %) радиационного воздействия суммарная доза сочетанного облучения за 30 сут эксперимента составила 10 Гр (СДто-здяп).

В работе использовался стандартный фармакопейный препарат "Бста-лейкин" (ГНЦ - НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург), представляющий собой ампулированный лиофинизироваиный рекомбинантный интерлейкин- человека с добавлением в качестве стабилизатора человеческого сывороточного альбумина. Препарат, разведенный в 0,2 мл физиологического раствора, вводился однократно внутрибрюшннно мышам в дозе 50 мкт/кг (1 мкг/особь), а крысам в дозе 1 мкт/кг (200 нг/особь). Животные контрольных групп вместо интерлейкина- получали физиологический раствор.

Для изучения радиопротекторной эффективности интерлейкина- при всех используемых моделях облучения препарат вводился за 24 ч (1 сут) до начала радиационного воздействия. Для изучения терапевтической эффек-

тивностн интерлейкина- 1Р препарат вводился через 1 ч после окончания внешнего радиационного воздействия, а в случае моделирования внутреннего и сочетанного (внешнего и внутреннего) облучения - через 1 ч после окончания внутрибрюшинного введения крысам рабочей смеси радионуклидов.

Оценка эффективности применения интерлейкнна- 1 р в качестве средства профилактики и ранней патогенетической терапии лучевых поражений проводилась путем анализа 30-ти суточной выживаемости и средней продолжительности жизни подвергшихся различным вариантам радиационного воздействия мышей и крыс, определением числа сохранивших жизнеспособность гемопоэтических клеток, а также по изучению гематологических и цитохимических показателей периферической крови облученных животных.

Влияние интерлеикина- 1р на динамику постлучевых изменений костномозгового кроветворения оценивали в методиках эндогенного и экзогенного колониеобразования, разработанных J.E. Till, Е.А. McCulloch (1961), в модификации Н.В. Бутомо (1992). Количество выросших на селезенках мышей колониеобразующих единиц подсчитывали на 9 сут после облучения.

Общее количество лейкоцитов определяли меланжерным методом с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Для исследования лейкоцитарной формулы применяли способ быстрой окраски мазков кропи крзской Романовского по Н.Г. Алексееву (1956).

Суммарное содержание в иейтрофилах катиониых белкой оценивали с помощью лизосомально-катионного теста, предложенного В.Е. Пигаревским (1988). Цитохимическое определение миелопероксидазы проводили с помощью бензидина и перекиси водорода по методу R.K. Root, T.P. Stossel (1974), в модификации А.Н. Гребенюка с соавторами (1999). Интрацеллюлярнос выявление щелочной фосфатазы осуществляли методом азосочетания, предложенного L.S. Kaplow (1955), заменив а-нафтилфосфат натрия на нафтил-AS-BS-фосфат, а диазоль синий UO" - на прочный синий RR.

Микроскопирование окрашенных мазков крови проводилось в световом микроскопе при увеличении х 1000 (объектив 100/1,25; окуляр 10 х), желтом светофильтре, с использованием в качестве иммерсии кедрового масла.

Обследование экспериментальных животных с оценкой гематологических и цитохимических показателен проводили до облучения (дважды), а также через 3, 5, 7 сут, а далее каждые 5-е сут в течение 30 сут после окончания моделирования различных вариантов радиационного воздействия.

Полученные в ходе проведенных исследований данные подвергали стандартной статистической обработке с расчетом среднего значения, ошибки средней и среднего квадратического отклонения. Оценку1 раханчий средних значений проводили с помощью 1-критерия Стьюдента, вероятность р < 0,05 и выше считали достаточной для вывода о статистической достоверности различий полученных данных. Обработку результатов осуществляли на персональном компьютере с использованием программы '^аИвИса^" для операционной среды ""Мпёошв-ХР". Данные в таблицах представлены в виде X ± тч.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенных исследований было установлено, что при профилактическом (за 24 ч до облучения) и раннем лечебном (через 1 ч после воздействия) способах применения интерлейкин- увеличивает выживаемость животных при остром облучении с высокой мощностью дозы, при пролонгированном радиационном воздействии, а также при сочетанном лучевом поражении от внешнего и внутреннего облучения.

В частности, в условиях внешнего у-облучения с мощностью дозы 130 Р/мин как при профилактическом, так и при раннем лечебном применении рекомбинантный интерлейкин- проявлял радиозащитное действие в отношении показателей выживаемости облученных мышей и практически не оказывал влияния на среднюю продолжительность жизни погибших животных.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, при облучении в дозе 5,5 Гр выживаемость животных при профилактическом применении интер-лейкина- 1)3 увеличивалась на 16,7 %, а при его использовании в качестве средства ранней терапии — на 5,6 %. Прирост выживаемости облученных в дозе 6,0 Гр мышей составил 27,8 % при применении препарата в качестве радиопротектора и 5,5 % при его использовании с лечебной целью. Радиопротекторный эффект интерлейкина- 1Р при облучении в дозах 6,5; 7,0 и 7,5 Гр проявлялся в увеличении выживаемости более чем на 20 %, а его лечебная эффективность особенно высока была при радиационном воздействии в дозах выживаемость животных при облучении в дозе 7,0 Гр увеличивалась в 2 раза, в дозе 7,5 Гр — в 4 раза. Следует отметить и то, что как при профилактическом, так и при раннем терапевтическом использовании интерлей-кина-ф защищал более 10 % мышей, подвергнутых облучению в дозе 8,0 Гр, вызывающей в контроле гибель 100 % животных в течение 12 сут.

'1аблмиа I

Выживаемость (%) и средняя продолжительность жизни (сут) белых беспородных мышей-самцов при профилактическом (за 24 ч до облучения) и лечебном (через 1 ч после облучения) применении интерлейкина-]р в дозе 50 мкг/кг в условиях внешнего у-облучения с мощностью дозы 130 Р/мнн

Группа Доза облучения, Гр

5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0

выживаемость СПЖ выживаемость СПЖ выживаемость СПЖ выживаемость СПЖ выживаемость СПЖ выживаемость СПЖ 9,1 ± 2,9

контроль 77,8 ± 7,5 15,3 ± 3,9 66,7 ± 2,3 16,8 ± 3,8 50,0 ± 5,0 11,4 ± 2,5 33,3 ± 5,7 10,5 ± 2,9 11,1 ± 2,5 10,3 ± 3,9 0

ИЛ-1 за 24 ч до облучения 94,5 10,0 94,5 6,0 72,2 ± 6,2 * 9,2 ± 2,2 55,6 ± 5,1 * 9,1 ± 2,6 33,3 ± 5,0 * 10,5 ± 2,1 16,7 ± 1,8 * 10,0± 1,9

ИЛ-1 через 1 ч после облучения 83,4 ± 6,6 11,0± 2,6 72,2 ± 5,0 12,2 ± 2,1 66,7 ± 4,3 ♦ 9,5 ± 1,9 66,7 ± 7,5 * 11,5 ± 2,2 44,5 ± 6,2* 6,4 ± 1,7 11,1 ± 1,5 * 10.3± 2,8

11римечание: * - р < 0,05 по сравнению с контролем (облучением); число животных в каждой группе п = 18.

Средняя продолжительность жизни погибших животных, получавших интерлейкин- при большинстве изученных доз облучения имела тенденцию к снижению. Этот эффект может быть следствием того, что в течение выбранного срока наблюдения за животными не погибали мыши, которые без зашиты погибли бы в сравнительно более поздние сроки и, тем самым, увеличили бы величину средней продолжительности жизни павших животных.

Полученные в ходе исследования данные позволили рассчитать показатель радиозащитной эффективности интерлейкина- в условиях внешнего облучения с мощностью дозы 130 Р/мин: ФИД препарата при его применении в качестве радиопротектора составлял 1,13, а при использовании в качестве средства ранней патогенетической терапии радиационных поражений - 1,12. Судя по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных животных радиозащитными свойствами как при профилактическом, так и при лечебном применении интерлейкин- обладал и в условиях рентгеновского воздействия с мощностью дозы 54 Р/мин (табл. 2).

Так, при облучении в дозе 5,5 Гр гибель животных контрольной группы составила 80 %, а средняя продолжительность жизни 13,5 ± 2,5 сут. Как профилактическое, так и лечебное использование препарата позволяло увеличить выживаемость облученных мышей до 90 %, существенно не сказываясь на средней продолжительности жизни погибших животных. Применение интер-лейкина- 1р за 24 ч до облучения в дозе 6,5 Гр увеличивало выживаемость мышей на 17,5 %, а его введение через 1 ч после радиационного воздействия защищало от лучевой гибели на 7,5 % больше животных, чем в контроле.

Наибольшей радиозащитной эффективностью интерлейкин- обладал при лучевом воздействии в дозах на уровне СД70.90/30 (7,5 и 8,5 Гр). Так, при облучении в дозе 7,5 Гр профилактическое применение препарата позволяло спасти от лучевой гибели почти в 3 раза больше животных и в 2 раза увеличить среднюю продолжительность жизни погибших мышей, а эффективность его лечебного использования проявлялась в 2-х кратном увеличении выживаемости. При облучении в дозе 8,5 Гр выживаемость в контроле составила лишь 2,5 %, а в опытных группах - 20 % при применении интерлеикина- за 24 ч до облучения и 15 % при его использовании через 1 ч после облучения.

Расчетное значение ФИД при интерлейкина- 1Р в условиях рентгеновского воздействия с мощностью дозы 54 Р/мин составило 1,15 для радиопро-тскторного эффекта препарата и 1,14 для его лечебной активности.

Таблица 2

Выживаемость (%) и средняя продолжительность жизни (сут) белых беспородных мышей-самцов при профилактическом (за 24 ч до облучения) и лечебном (через 1 ч после облучения) применении ннтерлейкнна-1 р в дозе 50 мкг/кг в условиях внешнего рентгеновского облучения с мощностью дозы 54 Р/мин

Группы Доза облучения, Гр

5,5 6,5 7,5 8,5

выживаемость СПЖ выживаемость СПЖ выживаемость СПЖ выживаемость СПЖ

Контроль 80,0 ± 5,0 13,5 ±2,5 57,5 ±4,5 15,5 ±2,7 22,5 ± 2,5 9,5 ± 1,6 2,5 ± 0,5 8,5 ± 1.5 8,5 ± 1,7

И.) 1-1 за 24 ч до облучения 90,0 ± 6,0 8,5 ± 2,9 75,0 ± 3,5* 13,0 ±2,3 60,0 ± 7,5* 15,0 ± 3,5 20,0 ± 2,5*

ИЛ-1 через 1 ч после облучения 90,0 ±2,5 11,0 ±2,0 65,0 ±7,5 11,5 ±2,9 45,0 ± 5,0* 9,5 ±2,1 15,0 ± 1,5* 8,0 ± 1,6

Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с контролем (облучением); число животных в опытных группах п = 20, в контрольных группах п = 40.

Полученные нами данные о высокой лечебно-профилактической радио-зашитной активности ннтерлейкина- 1р в условиях внешнего острого у- или рентгеновского облучения с высокой мощностью дозы полностью совпадают с данными других исследователей [Легеза В.И. и др., 1995, 2000; Рогачева С.А. и др., 1994, 1997; Dalmau S.R. et al., 1997; Neta R. el al., 1986, 1993]. В то же время, сведений о противолучевой эффективности интерлейкина- 1Р при пролонгированном облучении и при сочетанном внешнем и внутреннем радиационном воздействии в доступной нам литературе найти не удалось, что и послужило основанием для выполнения последующих экспериментов.

В результате проведенных исследований было установлено, что как при профилактическом, так и при лечебном использовании интерлейкин- 1Р повышал выживаемость животных, подвергнутых внешнему пролонгированному облучению, и этот эффект сопоставим с радиопротекторной и лечебной эффективностью препарата в условиях острого радиационного воздействия.

Таблица 3

Выживаемость (%) и средняя продолжительность жизни (сут) белых беспородных крыс-самцов при профилактическом (за 24 ч до облучения) и лечебном (через 1 ч после облучения) применении интерлейкина-1р в дозе 5 мкг/кг в условиях внешнего пролонгированного и сочетанного облучения в дозах СДто/.ю

Группы Условия радиационного воздействия

Внешнее у-облучение с мощностью дозы 1 Р/мин в дозе 10 Гр Сочетанное облучение в суммарной дозе 10 Гр (внешнее у-облучение в дозе 8 Гр + внутреннее облучение в дозе 2 Гр)

выживаемость СПЖ выживаемость СПЖ

Контроль 30 16,6 ± 1,6 30 19,6 ±2,1

ИЛ-1 за 24 ч ло облучения 90 25,0 70 27,6 ± 1.6

I1JI-I через 1ч после облучения 80 27.5 ± 0.8 80 28,0 ± 1.0 ■

Примечание: число животных в каждой группе п = 10.

Как видно из данных, приведенных в таблице 3, внешнее пролонгированное у-облучение в дозе 10 Гр вызывало гибель 70 % крыс в контрольной группе. При применении интерлейкина- ф за 24 ч до облучения смертность облученных крыс составила 10 %, а при использовании препарата через 1 ч после лучевого воздействия - 20 %. Кроме того, препарат не только существенно повышал выживаемость облученных животных, но и увеличивал среднюю продолжительность жизни погибших животных: на 8,4 сут при профилактическом применении и на 10,9 сут при раннем лечебном использовании.

Радиозащитное действие интерлеикина- IР проявлялось также при соче-танном радиационном воздействии, вызванном внешним пролонгированным облучением в дозе 8 Гр и поступлением внутрь организма радионуклидов :39Pu, 137Cs и wSr, формирующих за 30 сут дозу внутреннего облучения 2 Гр (табл. 3). Учитывая вклад внешнего (80 %) и внутреннего (20 %) облучения, суммарная доза сочетанного облучения составила 10 Гр.

Установлено, в частности, что в условиях сочетанного радиационного воздействия профилактическое применение интерлеикина- 1Р на 40 % снижало показатели смертности облученных животных и на 8 сут увеличивало среднюю продолжительность жизни погибших крыс. Еще более эффективным было использование препарата в качестве средства ранней терапии: выживаемость облученных животных увеличивалась на 50 %, а средняя продолжительность жизни погибших особей возрастала на 8,4 сут.

Таким образом, радиозащитное и лечебное действие интерленкина-1Р проявляется не только при остром облучении с высокой мощностью дозы, но и при пролонгированном радиационном воздействии, а также в условиях, когда наряду с внешним -облучением в поражающей дозе имеет место поступление внутрь организма радиоактивных веществ в количествах, не вызывающих острых проявлений.

Однако, несмотря на обилие экспериментальных данных, подтверждающих сравнительно высокую радиопротекторную и раннюю терапевтическую эффективность интерлеикина-1 при облучении, конкретные механизмы радиозащитного действия данного цитокина до настоящего времени не определены. Предполагается, что реализация противолучевого действия большинства проявляющих радиозащитную активность цитокинов происходит за счет ускорения пролиферации гемопоэтических клеток, изменения направления дифференцировки потомков стволовых клеток, стимуляции функциональной активности зрелых клеток крови и иммунитета [Кетлинский С.А., 1993; Рождественский Л.М., 1997; Dinarello C.A., 1994; Neta R., 1997].

В связи с этим, с целью уточнения механизмов радиозащитного действия интерлейкина- на следующем этапе работы изучалось его влияние на динамику постлучевых изменении костномозгового кроветворения.

В результате проведенных исследований установлено, что введение ин-терлейкина- за 24 ч до или через 1 ч после облучения способствует снижению выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения и увеличению пролиферативной активности гемопоэтических клеток.

Таблица 4

Количество эндогенных КОЕ-С9 на селезенке белых беспородных мышей при профилактическом (за 24 ч до облучения) и лечебном (через 1 ч после облучения) применении интерлейкина-1 р в дозе 50 мкг/кг в условиях внешнего рентгеновского облучения

Доза Условия Применение Применение

облучения, эксперимента ИЛ-1 р за 24 ч ИЛ-1 Р через 1 ч

Гр до облучения после облучения

5,5 облучение 7,3 ± 1,7 7,9 ± 1,4

ИЛ-1 р + облучение 10,8 ±2,4 11,0± 1,6

6,0 облучение 5,3 ± 1,0 6,7 ± 1,2

ИЛ-1 Р + облучение 6,0 ± 1,8 8,3 ± 1,1

6,5 облучение 4,6 ±0,9 4,6 ±2.6

ИЛ-1Р + облучение 5,5 ± 0,8 6,7 ± 0,8

7,0 облучение 2,1 ±0,7 4,1 ±0,7

ИЛ-1р + облучение 5,3 ±1,2* 6,0 ±0,7*

7.5 облучение 1,8 ±0,6 2,0 ± 0,5

ИЛ-1 Р + облучение 3,2 ± 0,7 * 5,6 ±1,1 *

8,0 облучение - 0,8 ±0,5

ИЛ-1 р + облучение 2,2 ± 1,2 3,8 ± 0,9 *

8,5 облучение - -

ИЛ-1Р + облучение 2,0 ± 1,0 1,7 ±0.6

Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с контролем (облучением).

Как видно из данных, представленных в таблице 4, в условиях профилактического (за 24 ч до радиационного воздействия) применения при всех изученных дозах облучения рекомбинантныи интерлеикин- предотвращал

снижение количества эндогенных КОЕ-О, у облученных мышеи. Статистически значимых отличий по сравнению с контролем данный показатель достигал при облучении животных в дозах 7,0 и 7,5 Гр (СД7мипо)» а при действии доз 8,0 и 8,5 Гр - только предварительное введение препарата по-

зволяло обнаружить рост колоний на селезенках облученных мышей.

Высокую радиозащитную активность по показателям эндогенного колон иеобразования интерлейкин- 1Р проявлял и при его лечебном применении через 1 ч после радиационного воздействия в дозах от 5,5 до 8,5 Гр (табл. 4). При всех изученных дозах облучения рекомбинантный интерлейкин- предотвращал снижение числа эндогенных КОЕ-Су у облученных мышей, однако достоверные различия этого показателя по сравнению с контролем регистрировались только после радиационного воздействия в дозах от 7,0 до 8,0 Гр. Так, число КОЕ-С9 при лечебном применении препарата превышало аналогичные значения группы сравнения при облучении в дозе 7,0 Гр почти в 1,5 раза, при облучении в дозе 7,5 Гр - в 2,6 раза, при облучении в дозе 8,0 Гр - в 4,75 раза. Следует отметить, что, в отличие от контроля, при лечебном применении интерлейкина- эндогенные колонии обнаруживались и на селезенках мышей, подвергнутых радиационному воздействию в дозе 8,5 Гр.

Показатель ФИД препарата, рассчитанный по числу эндогенных колоний, составил 1,15 для профилактического применения и 1,12 для лечебного.

Данные, приведенные в таблице 5, свидетельствуют о том, что введение иитерлейкина- за 24 ч до радиационного воздействия позволяет в значительной степени предотвратить постлучевое снижение числа КОЕ-С,, определяемых у облученных мышей в методике экзогенного колониеобразовання, а радиозащитный эффект препарата в отношении клеток-предшественников проявляется вне зависимости от линейной радиочувствительности мышей. Так, у мышей линии БАЬБ/с, получавших интерлейкин- 1Р в качестве радиопротектора, количество колоний по сравнению с незащищенными облученными животными выросло в 2,8 раза и составило 42 % от уровня интактных животных, а у мышей-гибридов {СБА х С57Б1) увеличилось в 4,3 раза и составило 29 % от уровня интактных животных. Интересно и то, что уже само по себе введение интерлейкина- существенным образом стимулировало рост колоний на селезенках интактных, то есть не подвергавшихся облучению, мышей. Особенно сильно это было выражено у наиболее радиочувствительных животных - мышей линии БАЬБ/с: под влиянием препарата число экзогенных КОЕ-С, у них выросло более чем в 4 раза.

Таблица 5

Число миелокариоцнтов и количество экзогенных КОЕ-Су на селезенке мышей линии ВАЬВ/с и мышей-гибридов первого поколения СВА х С57В1 при профилактическом применении интерлейкина-ф в дозе 50 мкг/кг за 24 ч до внешнего рентгеновского облучения

Условия эксперимента Линия мышей

BALB/c F, (СВА х С57В1)

Число Число КОЕ-С9 Число Число КОЕ-С»

ил-ip облу- миелока- на 10" миелока- на 10''

чение риоцнтов, в 1 бедре миелока- риоцнтов, в 1 бедре миелока-

х106/бедро риоцнтов х106/бедро риоцнтов

- - 18,5 80 + 8 4,1+0,5 21,0 358 ± 19 18,0 ± 1.1

- + , 18,2 11 + 1 0,6 ± 0,2 20.5 38 + 8 1,2 ±0,2

+ + 18,5 32±3 * 1,7+0,3 * 20,0 107±12* 5,2 ± 0,3 *

+ - 18,0 320 ±34 17,7 ±2,0 19,3 404 ±21 22,5 ± 0,2

Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с контролем (облучением).

Стимулирующее влияние ИЛ-1 на пролиферативную и миграционную активность гемопоэтических клеток-предшественникоп и, как следствие этого, увеличение их числа в костном мозге и периферических органах кроветворения после радиационного воздействия было также обнаружено в исследованиях С. Casparetto et al. (1989), L.S. Constine et al. (1991), J.R. Zucali et a]. (1994). Этот эффект ИЛ-1 может реализоваться как прямым активирующим действием на гемопоэтические клетки, так и опосредованным путем: посредством стимуляции продукции всех типов колониестимулирующих факторов различными клетками, в частности, фибробластами и макрофагами, и последующей активации пролиферативной и миграционной активности стволовых кроветворных клеток под влиянием этих колониестимулирующих факторов [W.E. Fibbe et al., 1988; М.А. Moore et al., 1990; K. Hestdal et al., 1992]. Радиопротекторные эффекты ИЛ-1 могут быть также связаны с индукцией под его влиянием выхода стволовых кроветворных клеток из Go-фазы клеточного цикла с их позиционированием к моменту облучения в наиболее радиорези-стентнон стадии - второй половине S-фазы [R. Neta et al., 1987, 1996; S.R. Dalmau et al., 1997]. а также с прямой защитой стволовых клеток от раднаци-онно-индуцнрованного апоптоза {R. Neta et al., 1993; С. Rodriguez et al.. 1996].

В ходе изучения функции экзогенного колониеобразования > облученных мышей-гибридов первого поколения СВА х С57В1, было также установлено, что предварительное (за 20-30 мин до применения интерлеикина-1 р) введение животным рецепторного антагониста интерлейкина-1 полностью отменяет проявления защитного действия рекомбинантного ннтерленкина-1 р в отношении клеток-предшественников гемопоэза. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости участия рецепторов к интерленкин\-1 в механизмах реализации радиопротекторной активности данного цитокина.

Следующей задачей исследования было изучение модифицирующего действия интерлейкина- на количество лейкоцитов и функциональное состояние нейтрофилов периферической крови при различных вариантах радиационных воздействий. Для реализации этой задачи выполнены экспериментальные исследования на белых беспородных крысах-самцах, подвергавшихся внешнему пролонгированному у-облучению в дозе 10 Гр и сочетанно-му радиационному воздействию, которое осуществляли путем внешнего пролонгированного у-облучения животных в дозе 8 Гр с последующим внутри-брюшинным введением крысам радионуклидов в количест-

вах, обеспечивающих накопление за 30 сут дозы внутреннего облучения 2 Гр. Выбранные дозы внешнего пролонгированного и сочетанного облучения вызывали гибель 70 % животных контрольной группы в течение 30 сут после радиационного воздействия, что соответствует дозам, рекомендуемым для оценки радиозащитной эффективности фармакологических препаратов.

В результате проведенных на этом этапе работы исследований было установлено, что в условиях внешнего пролонгированного и сочетанного (внешнего и внутреннего) облучения в дозах СД70/30 интерлейкин- 1Р, введенный за 24 ч до или через 1 ч после радиационного воздействия, позволяет уменьшить выраженность ранней постлучевой лейко-, лимфо- и нейтрофнло-пении и увеличить темп восстановления количества клеток белой крови.

Так, внешнее облучение в дозе 10 Гр с мощностью дозы 1 Р/мин приводило к резкому снижению общего числа лейкоцитов в периферической крови крыс в ранние сроки после радиационного воздействия: через 1 сут число лейкоцитов у облученных животных снижалось до 18 %, а к 5 сут опыта падало до 12 % от исходного уровня. Начиная с 7 сут, отмечалось постепенное восстановление уровня лейкоцитов, через 17-22 сут после облучения регистрировался гпперленкоцнтоз, а нормализация данного показателя происходила лишь к 30 сут наблюдения.

Применение интерлейкина- 1Р за 24 ч до радиационного воздействия позволяло уменьшить глубину постлучевого снижения общего числа лейкоцитов в периферической крови крыс в ранние сроки после облучения. Так, через 1 сут после облучения общее число лейкоцитов у животных, получивших интерлейкин- 1Р, было в 2,5 раза больше, чем у незащищенных крыс, а через 5 сут уровень лейкоцитов почти в 1,5 раза превышал значения аналогичного показателя в контрольной группе. Восстановление числа лейкоцитов до нормы у крыс, защищенных интерлейкином- 1(5, происходило уже к 17 сут эксперимента, а развития гиперлейкоцитоза у этих животных не отмечалось.

Позитивное влияние на содержание лейкоцитов препарат оказывал и при его введении через 1 ч после радиационного воздействия. Так, лечебное применение интерлейкина- 1 р предотвращало снижение уровня лейкоцитов в ранние сроки после радиационного воздействия: через 5 сут после облучения значения этого показателя у леченных крыс были.на 86 % выше, чем у неле-ченных животных. Восстановление числа лейкоцитов происходило, начиная с 17 сут наблюдения, при этом так же, как и в случае профилактического применения препарата, отсутствовала фаза гиперлейкоцитоза, развивавшегося и животных контрольной группы (только облучение) на 17-22 сут опыта.

Динамика содержания нейтрофилов (рис. 1) и лимфоцитов (рис. 2) в периферической крови облученных животных, получавших с профилактической или лечебной целью интерлейкин- 1р, практически полностью повторяла изменения, регистрировавшиеся при изучении общего числа лейкоцитов.

сроки исследования, с>

—□—контроль ■ Л- -ИЛ облучение —О—облучение ИЛ

Рис. 1. Динамика абсолютного количества нейтрофилов периферической крови белых беспородных крыс-самцов при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через I ч) применении интерлейкина-1р в дозе 1 мкг/кг при внешнем пролонгированном у-облучении в дозе 10 Гр, х Юч/л

сроки исследования, сут

—□—контроль - Л-. 'ИЛ облучение -О—облучение ИЛ

Рис. 2. Динамика абсолютного количества лимфоцитов периферической крови белых беспородных крыс-самцов при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1 ч) применении интерлейкина-ф в дозе 1 мкг/кг при внешнем пролонгированном у-облучении в дозе 10 Гр, х 10*/л

Наряду с предотвращением постлучевых изменений количества лейкоцитов интерлейкин- 1Р, введенный за 24 ч до или через 1 ч после внешнего у-облучения в дозе 10 Гр, оказывал позитивное влияние и на функциональное состояние нейтрофилов, оцененное по содержанию в этих клетках лизосо-мальных катионных белков, миелопероксидазы и щелочной фосфатазы.

Как видно из данных, представленных в таблице 6, внешнее облучение в дозе 10 Гр вызывало уменьшение содержания катионных белков в нейтро-филах периферической крови крыс, наиболее выраженное в промежуток с 3 по 17 сут после лучевого воздействия, а профилактическое и лечебное применение интерлейкина- ф способствовало предотвращению радиационно обусловленного снижения показателей лизосомально-катионного теста.

Действие внешнего пролонгированного у-облучения приводило к увеличению в нейтрофилах активности щелочной фосфатазы, наиболее выраженному на 5-7 сут наблюдения. Как профилактическое, так и лечебное использование интерлейкина- способствовало еще большей активации щелочной фосфатазы в нейтрофилах периферической крови облученных крыс. Однако, статистически значимые отличия содержания данного фермента в нейтрофилах по сравнению с контролем регистрировались лишь через 7 и 12 сут после облучения, когда активность щелочной фосфатазы у нелеченных животных уже восстанавливалась до нормы, а у крыс, получавших интерлей-кин-1р, активность фермента все еще оставалась повышенной (табл. 6).

1 аГ>лнца 6

Динамика содержания катионных белков и активности щелочной фосфатазы в нейтрофнлах периферической кропи белых беспородных крыс-самцов при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через I ч) применении интерлейкина-ф в дозе I мкг/кгпри внешнем пролонгированном у-облучешш в дозе 10 Гр, усл. сл.

Группа Показатель До облучения Сроки после облучения, сут

3 5 7 . 12 17 22 30 1.34 + 0.04

Контроль (облучение) Катионные белки 1,34 ±0,06 1,10± 0,02 1,05 ± 0,03 1,08 ± 0,01 1,14 ± 0,06 1,19 ± 0,03 1,32 ± 0,03

Щелочная фосфатаза 1,16 + 0,02 1,22 ± 0,01 1,39 ± 0,02 1,31 + 0,02 1,22 ± 0,07 1,21 ± 0,05 1,18 ± 0.03 1.16 ± 0.02

ИЛ-1 за 24 ч до облучения Катионные белки 1,34 + 0,02 1,32 + 0,02* 1,26 + 0,03 * 1,20 ± 0,03 * 1,27 + 0,03 1,27 ± 0,03 1.37 ± 0.05 1,40 ± 0,01 1.22 ± 0.04 1,37 + 0.01

Щелочная фосфатаза 1,17 + 0,03 1,39 ± 0,08 1,45 ± 0,05 1,39 ± 0,06 1,39 ± 0,02 * 1,30 + 0,04 1.22 ± 0.05

ИЛ-1 через 1 ч после облучения Катионные белки 1,29 ±0,02 1,34 ± 0,02* 1,27 + 0,03 * 1,24 ± 0,04* 1,38 ± 0,07 * 1,35 ± 0,03 * 1.40 + 0.04

Щелочная фосфатаза 1,19 ±0,03 1,36 ± 0,04 1,35 ± 0,08 1,51 ± 0,03 * 1,49 ± 0,03 * 1,32 + 0,04 1,28 + 0.05 1.20 + 0.04

11римсчанне: * - р < 0,05 по сравнению с соответствующим контролем; число животных в каждой фуппс п = 10.

Содержание миелопероксидазы в нейтрофилах периферической крови крыс в ранние сроки после внешнего у-облучения в дозе 10 Гр с мощностью дозы 1 Р/мин было пониженным. Максимальное угнетение активности фермента регистрировалось через 5 сут после окончания облучения, а восстановление данного показателя до уровня необлученных животных происходило на 22-30 сут наблюдения. Профилактическое применение интерлейкнна- 1(3 не отменяло раннего постлучевого ингибирования миелопероксидазы, но способствовало более быстрой нормализации активности данного фермента. Лечебное использование интерлейкина- 1|3 позволяло практически полностью предотвратить вызванное радиацией снижение содержания миелопероксида-зы в нейтрофилах, а начиная с 7 сут активность данного фермента у получавших препарат крыс восстанавливалась до уровня биологического контроля.

Профилактическое и раннее лечебное применение интерлейкина-1Р способствовало ускорению восстановления общего числа лейкоцитов, абсолютного количества и относительного содержания нейтрофилов и лимфоцитов, стимуляции функционально-метаболической активности зрелых нейтро-филов периферической крови и у животных, подвергнутых сочетанному воздействию внешнего пролонгированного у-облучения в дозе 8 Гр и внутреннего облучения от инкорпорации радионуклидов в количествах, не вызывающих острых эффектов поражения.

Так, в течение первых 12 сут после сочетанного облучения в дозе СД70/30 общее число лейкоцитов, абсолютное количество нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови крыс было пониженным (табл. 7). Восстановление их числа начиналось с 17 сут, а значений биологического контроля этот показатель достигал через 22-30 сут после облучения. Интерлейкин-10, введенный за 24 ч до или через 1 ч после сочетанного радиационного воздействия, снижал выраженность ранней постлучевой лейко-, лимфо- и нейтрофи-лопении, и увеличивал темп восстановления количества клеток белой крови.

Стимулирующий эффект интерлейкина- проявлялся и в отношении показателей, характеризующих функционально-метаболический статус зрелых нейтрофнлов периферической крови.

Так, через 3 и 5 сут после сочетанного радиационного воздействия в нейтрофилах крыс обнаруживалось существенное (более чем на 20 % от исходного уровня) снижение количества катионных белков, а профилактического и лечебное использование интерлейкина- практически полностью отменяло эти эффекты облучения. Интерлейкин- 1Р, введенный за 24 ч до или через 1 ч после сочетанного облучения, не только предотвращал раннее постлучевое ингибирование миелопероксидазы, но и значительно ускорял восстановление уровня этого фермента в нейтрофилах облученных крыс (табл. 7).

Таблица 7

Динамика общего числа лейкоцитов периферической крови и активности мнелопероксидазы в псГирофнлах

белых беспородных крыс-самцов при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1 ч) применении интерлейкина-1р в дозе 1 мкг/кг при сочетанием внешнем и внутреннем облучении в суммарной дозе 10 Гр

Группа Показатель До облучения Сроки после облучения, сут

3 5 7 12 17 22 30

Контроль (облучение) Лейкоциты, х Ю'/л 11,3 ±0,4 3,1 ± 0,2 2,5 ±0,3 4,3 ± 0,4 3,5 ±0,2 9,2 ± 0,6 10,5 ±0,4 10,6 ±0,1

Миелопе-роксидаза, усл. ед. 1,39 ± 0,04 1,15± 0,02 1,16 ± 0,03 1,18 ± 0,03 1,14 ± 0,05 1,20 ± 0,03 1,27 + 0,03 1,23 ± 0.03

ИЛ-1 за 24 ч до облучения Лейкоциты, х 109/л 10,2 ±0,3 2,4 ± 0,3 4,9 ± 0,3» 4,2 ± 0,2 7,0 ± 0,2* 11,2±0,5* 12,0 ±0,6 11,2 ±0,7

Миелопе-роксидаза, усл. ед. 1,39 + 0,04 1,20 ± 0,03 1,23 ± 0,03 1,28 + 0,04 1,32 ± 0,04* 1,36 ± 0,07 1,37 ± 0,03 * 1,30 + 0,03 *

ИЛ-1 через 1 ч после облучения Лейкоциты, х Ю'/л • 10,5 ±0,3 2,1 ± 0,4 5,2 ±0,5* 3,8 ± 0,2 5,7 ±0,5* 9,3 ± 0,4 12,3±0,3* 11,6 + 0,5

Миелопе-рокендаза, усл. ед. 1,37 ± 0,04 1,24 ± 0,03 * 1,25 ± 0,04 1,28 ± 0,04 1,38 + 0,04* 1,29 + 0,07 1,30 ± 0,03 1.38 + 0,03*

Примечание: * — р <0,05 по сравнению с соответствующим контролем; число животных в каждой группе п = 10.

Результаты изучения активности шелочной фосфатазы в нейтрофилах подвергшихся сочетанному облучению животных также свидетельствуют о стимулирующем влиянии интерлейкнна- ip как зрелые формы нейтрофилов, так и на их костномозговых предшественников. Известно, что закладка шелочной фосфатазы в специфические гранулы нейтрофилов происходит на стадии миелоцита, а время прохождения клеток от стадии миелоцита до ней-трофила циркулирующего пула составляет 3-5 сут [Гребенюк А.Н. и др., 1998; Kaplow L.S., 1968]. Как раз в эти сроки у крыс, получавших за 24 ч до или через 1 ч после сочетанного облучения интерлейкин- ip, и регистрировалось наибольшее увеличение содержания данного фермента в нейтрофилах.

Обсуждая полученные нами результаты, необходимо отметить, что в большинстве выполненных ранее исследований была показана высокая лечебно-профилактическая эффективность применения интерлейкина- при внешнем облучении с высокой мощностью дозы [Чигарева Н.Г. и др., 1993, 2000; Рогачева С.А. и др., 1994; Neta R. et al., 1986, 1996; Wu D.D. et a!., I994J. Данные наших исследований свидетельствуют о том, что интерлейкин- ф при его использовании за 24 ч до или через 1 ч после радиационного воздействия увеличивает выживаемость животных не только при остром облучении с высокой мощностью дозы, но и при пролонгированном облучении, а также при сочетанном лучевом поражении от внешнего и внутреннего облучения.

Несмотря на обилие экспериментальных данных, подтверждающих сравнительно высокую радиопротекторную и раннюю терапевтическую эффективность интерлейкина- при внешнем облучении, конкретные механизмы проявления радиозащитной активности данного цитокина до настоящего времени не определены. Предполагается, что противолучевое действие ин-терлейкина- осуществляется за счет стимуляции костномозгового компар-тмента кроветворения, активации факторов антиоксидантной защиты и системы неспецифической резистентности организма, стимуляции репаративных процессов в клетках и тканях и другими путями [Рогачева С.А., 1998; Легеза В.И. и др., 2000; Рождественский Л.М., 2001; Dalmau S. R. et al., 1993; Estagatc J. et al., 1993; Rodriguez C. et al., 1996; Neta R., 1997]. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что механизм рздиозащитного действия интер-лейкина- может реализоваться путем повышения радиорезистентности системы гемопоэза, которое проявляется в снижении выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения, увеличении пролиферативной активности гемопоэтических клеток, ускорении восстановления количества лейкоцитов циркулирующего пула, стимуляции функциональной и метаболической активности зрелых нейтрофнлов периферической крови.

ВЫВОДЫ

1. В условиях внешнего радиационного воздействия с высокой мощностью дозы рекомбинантный интерлейкин- является эффективным медицинским средством противорадиационной защиты, позволяющим увеличить выживаемость облученных животных: ФИД препарата составляет 1,13-1,15 при его применении за 24 ч до радиационного воздействия и 1,12-1,14 при его использовании через 1 ч после облучения. Радиозащитный эффект препарата при внешнем облучении в дозе СД70/30 с мощностью дозы 1 Р/мнн проявляется в повышении выживаемости облученных животных на 50-60 %.

2. Профилактическое (за 24 ч до радиационного воздействия) и лечебное (через 1 ч после окончания облучения) использование интерлейкнна-позволяет на 40-50 % увеличить выживаемость животных, подвергнутых со-четанному радиационному воздействию в суммарной дозе СД70/30 формирующейся при действии внешнего пролонгированного облучения в дозе 8 Гр и внутреннего облучения от инкорпорации радионуклидов 219Ри, '"Се и

в количествах, не вызывающих острых эффектов поражения.

3. Введение интерлейкииа- за 24 ч до или через 1 ч после облучения способствует снижению выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения и увеличению пролиферативной активности гемопо-этических клеток. Предварительная фармакологическая блокада рецепторов к интерлейкину-1 полностью отменяет проявления радиопротекторной активности интерлейкина- 1Р в отношении клеток-предшественников гемопоэза.

4. В условиях внешнего пролонгированного и сочетанного (внешнего и внутреннего) облучения в дозах СД70/30 интерлейкин- IР, введенный за 24 ч до или через 1 ч после радиационного воздействия, позволяет уменьшить выраженность ранней постлучевой лейко-, лимфо- и нейтрофилопении и увеличить темп восстановления количества клеток белой крови.

5. Стимулирующий эффект интерлейкина- в отношении показателей функционально-метаболического статуса нейтрофилов, измененных в результате внешнего облучения с низкой мощностью дозы или сочетанного внешнего и внутреннего радиационного воздействия, проявляется увеличением внутриклеточного содержания катионных белков, повышением активности в клетках миелопероксидазы и щелочной фосфатазы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При оценке профилактической и лечебной эффективности противолучевых средств рекомендуется использовать модели внешнего или рентгеновского облучения с высокой и низкой мощностью дозы, а также сочетан-ного радиационного воздействия, вызванного внешним пролонгированным у-облучением в поражающей дозе и внутренним облучением от инкорпорированных радионуклидов ~'9Ри, "'Се и '"Бг в количествах, не вызывающих острых эффектов поражения.

2. Разработанная и апробированная на примере интерлейкина-10 схема, включающая последовательное изучение критериев выживаемости облученных животных, параметров радиочувствительности гемопоэтических клеток костного мозга, количества лейкоцитов циркулирующего пула и показателей функционально-метаболического статуса нейтрофилов периферической крови, может быть рекомендована для экспериментальной оценки радиозащитной эффективности цитокинов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Экспериментально-теоретическое обоснование возможности применения рекомбинантного интерлейкина- в качестве средства ранней коррекции гематологического синдрома радиационной этиологии // Современные проблемы медицинской науки и практики: Сб. науч. статей. - СПб., 1998. - С. 38-39 (соавт.: Гребенюк А.Н., Сидоров Д.А., Симбирцев А.С. и др.).

2. Экспериментальная оценка рекомбинантного интерлейкина-1Р как средства ранней терапии гематологического синдрома радиационной этиологии // Юбилейная конф. молодых ученых и специалистов, посвященная 200-летию Военно-медицинской академии: Тез. докл. - СПб., 1998. - С. 117-118 (соавт.: Сидоров Д.А., Давыдова Е.В., Гребенюк А.Н.).

3. Изучение перспектив использования препарата "Беталейкин" для профилактики и лечения радиационных и химических поражений в сублетальных дозах // Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии и медицн-

ны: Материалы Юбилейной науч.-техн. конф. - СПб., 2000. - С. 29 (соавт.: Гребенюк А.Н., Сидоров Д.А., Куленко С.А., Симбириев А.С).

4. Сравнительное изучение противолучевой эффективности рекомбинант-ных препаратов интерлейкина-ip и супероксиддисмутазы // Военная и экстремальная медицина в чрезвычайных ситуациях: Материалы межвуз. науч.-практ. конф. - СПб., 2000. - С. 22-24 (соавт.: Кетлинский С.А., Снмбнрцев А.С., Чурилова И.В. и др.).

5. The role of IL-ip, IL-lra and superoxide dismutase (SOD) in modulation of host reaction to X-ray irradiation // Eur. Cytokine Netw. - 2000. - Vol. 11, Special issue 1CR/ISICR. - P. 143 (with: Ketlinsky S.A., Sidorov D.A., Grebenuyk A. N.. Churilova I.V.).

6. Экспериментальная оценка эффективности рекомбинантного препарата интерлейкина- человека при радиационных поражениях организма, формирующихся при радиационных авариях // Чернобыль - 15 лет спустя: Материалы науч.-лракт. конф. Северо-Западного региона России. - Ч. I. - СПб., 2001. - С. 41-43 (соавт.: Поморянскнй В.М., Микова Л.А., Верведа А.Б. и др.).

7. Радиопротекторная эффективность препаратов интерлейкина-1 // Морской медицинский журнал. - 2001. - Т. 8, № 4. - С. 6-10 (соавт.: Гребенюк А.Н., Сидоров Д.А., Тимошевский А.А.).

8. Оценка радио протекторной эффективности интерлейкина- I р в методике экзогенного колонисобразования // Сохранение репродуктивного потенциала подростков: Тез. докл. межвуз. науч.-практ. конф. - СПб., 2001. - С. 123-124.

9. К вопросу о механизмах радиозащитного действия интерлейкина- в отношении различных по степени дифференцировки клеток кроветворной системы // Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности: Материалы Рос. науч. конф. - СПб., 2001. - С. 43-45.

10. Экспериментальная оценка эффективности интерлейкина- при его использовании для профилактики и раннего лечения сочетанного (внешнего и внутреннего) радиационного поражения // Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности: Материхпы Рос. науч. конф. - СПб.. 2001. -С. 458-460 (соавт.: Микова Л.А., Поморянскнй В.М., Арсеньеи Ф.В. и др.).

11. Противолучевая активность препзрата "Беталейкин" // Тез. докл. итоговой конф. военно-научного общества слушателей 1 факультета и клинических ординаторов ВМедА.- СПб.,200К-С S5 (соавт.: Семенчукова И.Г.).

12. Состояние нейтрофилов периферической крови при различных вариантах радиационных воздействий // IV съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность): Тез. докл. - Т. I. -М.,2001.-С.142 (соавт.: Антушевич А.Е., Арсеньев Ф.Б., Гребенюк А.Ы. и др.)

13. Комплексная оценка радиозащитной эффективности рекомбинантного интерлейкина- // IV съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность): Тез. докл. - Т. II. - М., 2001. - С. 415 (соавт.: Гребенюк А.Н., Кетлинский С.А., Конев В.В. и др.)

14. Перспективы применения рекомбинантных препаратов интерлейкина- ] ß в качестве медицинских средств защиты // Военная профилактическая медицина. Проблемы и перспективы: Сборник трудов I съезда военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ. - СПб, 2002. - С. 174-175 (соавт.: Гребенюк А.Н., Сидоров Д.А., Конев В.В., Тимошевский А.А.).

15. Экспериментальное изучение радиозащнтного действия интерлейкина-10 на гемопоэз и выживаемость животных при различных вариантах лучевого воздействия // Цитокины и воспаление: Материалы междунар. науч.-практ. школы-конференции. - СПб., 2002. - С. 85.

16. Исследование радиозащитной активности интерлейкина- 1 ß при инкорпорации радионуклидов в экспериментах на крысах // Терапевтическая помощь в экстремальных ситуациях: Материалы Всеарм. науч.-практ. конф. - СПб., 2003. - С. 167-168 (соавт.: Гребенюк А.Н., Арсеньев Ф.Г., Верведа А.В.).

17. Влияние интерлейкина-1 на состояние нейтрофилов в условиях острого, пролонгированного, фракционированного и сочетанного (внешнего и внутреннего) облучения // III зМзд з рад1ацшних дослщжень (радюбюлопя i pa-дюеколопя): Тез. докл. - Кшв, 2003. - С. 143 (соавт.: Гребенюк А.Н., Конев В.В., Тимошевский А.А.).

Подписано в печать г б.сл.с *. Формат 60x84 '/,

Объем пл._Тираж ioe экз._Заказ № гзь

Типография ВМедА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6

>-4410