Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение частоты мутантных клеток по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора с целью формирования групп риска в отношении развития рака щитовидной железы

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Определение частоты мутантных клеток по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора с целью формирования групп риска в отношении развития рака щитовидной железы"

На правах рукописи

Ч

Верещагина Анна Олеговна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧАСТОТЫ МУТАНТНЫХ КЛЕТОК ПО ЛОКУСАМ ГЛИКОФОРИНА А И Т-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА С ЦЕЛЬЮ ФОРМИРОВАНИЯ ГРУПП РИСКА В ОТНОШЕНИИ РАЗВИТИЯ РАКА ЩИТОВИДНОЙ

ЖЕЛЕЗЫ

03.00.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск - 2006

Работа выполнена в Государственном учреждении «Медицинский Радиологический Научный Центр РАМН»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук

Саенко Александр Семенович Медведев Виктор Степанович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Петин Владислав Георгиевич Пелевина Ирина Ивановна

Ведущая организация:

Институт биохимической физики им. Н. М. Эмануэля РАН

Защита состоится «12» сентября 2006 г. в 11 ч на заседании диссертационного совета Д 001.011.01 в ГУ «Медицинский Радиологический Научный Центр РАМН» (249036, Калужская обл., г. Обнинск, ул. Королева, 4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Медицинский Радиологический Научный Центр РАМН».

Автореферат разослан июля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Палыга Г.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Одним из последствий техногенных катастроф является загрязнение долгоживущими радиоизотопами огромных по масштабам территорий, постоянные жители которых в той или иной степени подвергаются постоянному хроническому радиационному воздействию. Поэтому одной из задач современной радиобиологии является оценка риска для здоровья человека от воздействия ионизирующего излучения (ИИ) в диапазоне малых доз. Одно из самых неблагоприятных последствий воздействия радиации — индукция злокачественных новообразований. В последние годы на территориях, загрязненных радионуклидами после аварии на ЧАЭС, возросла заболеваемость раком щитовидной железы (РЩЖ) особенно среди тех лиц, кто находился в детском возрасте на момент аварии. Как известно, радиочувствительность щитовидной железы (ЩЖ) особенно высока у детей младшего возраста. Поскольку только у небольшой части лиц развиваются такие последствия, проблема выявления групп повышенного канцерогенного риска является одной из самых актуальных. Как известно, в основе злокачественной трансформации клеток лежит мутационный процесс. Поэтому оценку интенсивности соматического мутагенеза можно рассматривать в качестве перспективного подхода для выявления групп повышенного канцерогенного риска (Hagmar е1 а1, 1994, Аклуата е1 а1, 1995). В связи с обнаружением феномена радиационно-индуцированной нестабильности генома у потомков облученных клеток использование этого подхода становится еще более обоснованным для выявления групп канцерогенного риска, а исследование его применимости для постоянных жителей территорий, загрязненных вследствие Чернобыльской аварии, становится особенно актуальным. Среди существующих методов определения генных мутаций наиболее перспективными следует считать проточноцитометрические методы выявления клеток, мутантных по локусу Т-клеточного рецептора (ТСЯ -тест) и по локусу гликофорина А (ОРА -тест) в связи с возможностью их использования для обследования больших

контингентов облученных лиц (Langlois et al., 1985; Kyoizumi et al., 1990). В настоящее время доказано, что облучение ЩЖ ионизирующим излучением приводит к увеличению частоты как злокачественных, так и доброкачественных заболеваний ЩЖ (Schneider et al., 1993; Jacob et al., 1999; Ivanov et al., 2003). Как известно, доброкачественные узловые новообразования в ЩЖ часто ведут к злокачественной трансформации, т.е. лица с такой патологией составляют группу риска в отношении развития РЩЖ. Поэтому исследование уровня генных мутаций в соматических клетках у людей с выявленной узловой патологией ЩЖ и проживающих на загрязненных радионуклидами территориях, представляет особый интерес в целях подтверждения возможности применения результатов определения генных мутаций для формирования групп повышенного риска развития РЩЖ, в том числе и в результате облучения.

Цель исследования

Целью настоящей работы являлось определение частоты клеток с соматическими мутациями по отдельным генным локусам (Т-клеточного рецептора и гликофорина А) у людей, подвергающихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию в малых дозах, и у пациентов с опухолями щитовидной железы для выяснения перспективности использования показателей генного соматического мутагенеза для формирования групп риска в отношении развития РЩЖ.

Задачи исследования

1. Провести сравнительное исследование частоты мутантных клеток по локусам Т-клеточного рецептора (TCR) и гликофорина A (GPA) у жителей ряда районов, в разной степени загрязненных в результате аварии на ЧАЭС.

2. Установить, существует ли зависимость между дозой, поглощенной щитовидной железой, и частотой мутантных клеток по указанным генным локусам у жителей загрязненных в результате аварии на ЧАЭС районов.

3. Провести сравнительное исследование частоты мутантных клеток по указанным локусам у жителей загрязненных территорий с доброкачественной узловой патологией щитовидной железы и без таковой.

4. Провести сравнительное исследование частоты мутантных клеток по указанным локусам у больных раком щитовидной железы до лечения и у здоровых лиц.

5. Оценить возможность использования указанных показателей для формирования групп риска в отношении возникновения РЩЖ.

Научная новизна работы

В результате проведенных исследований показано, что у жителей загрязненных территорий, подвергающихся хроническому облучению в малых дозах, средняя частота клеток с генными мутациями по ТСЯ- и по СРА-локусам статистически значимо превышает контрольный уровень. Однако для всех обследованных лиц не установлено прямой зависимости выхода этих мутантных клеток от степени загрязнения радионуклидами различных районов. Показано, что у постоянных жителей загрязненных территорий Орловской области с доброкачественной узловой патологией щитовидной железы средняя частота клеток с генными мутациями по ТСЯ-локусу статистически значимо превышает не только контрольный уровень, но и этот показатель у жителей Орловской области без такой патологии. В результате исследования впервые были получены данные о частоте мутантных клеток по ТС К- и по СРА-локусам у больных раком щитовидной железы до начала специфического лечения.

Практическая значимость работы Результаты обследования жителей радиоактивно загрязненных территорий с доброкачественной узловой патологией ЩЖ, а также пациентов со злокачественными новообразованиями ЩЖ свидетельствуют о возможности выявления лиц, в том числе среди подвергшихся действию ионизирующих излучений в малых дозах, с повышенным риском развития РЩЖ, основываясь на показателях соматического генного мутагенеза в разных локусах (прежде всего, по ТСЯ-локусу).

Основные положения, выносимые на защиту

1. У жителей Орловской области, подвергающихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию в малых дозах (плотность загрязненности по Cs137 6,6 — 213 кБк/м2) наблюдается высокая частота клеток с генными мутациями по разным локусам.

2. В отдаленные сроки после облучения в малых дозах выход клеток с генными мутациями прямо не зависит от величины дозовой нагрузки на щитовидную железу в диапазоне доз 0,41-641 мГр.

3. Лица с доброкачественной узловой патологией щитовидной железы и больные раком щитовидной железы имеют более высокие частоты клеток с мутациями по локусу Т-клеточного рецептора. Вероятно, повышенный уровень частоты клеток с генными мутациями может являться критерием для формирования группы лиц с высоким риском развития РЩЖ.

Апробация работы По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях:

Международный конгресс «Энергетика 3000 (энергетика и человек)», 2001г., Обнинск; Международная школа - конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", 2003 г., Пущино; III съезд по радиационным исследованиям (радиобиология и радиоэкология), 2003 г., Киев; V съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность), 2006 г., Москва; International summer school "Molecular mechanisms in homeostasis and disease", 2003 г., Greece; Cancer immunology and immunotherapy summer school, 2003 г., Greece; 35* Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society, 2005 г., Kos, Greece.

Диссертация апробирована на научной конференции экспериментального радиологического сектора ГУ МРНЦ РАМН «20» апреля 2006 г.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 таблицами, 13 рисунками. Работа состоит из введения, четырех глав «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», выводов, списка литературы, включающего 113 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалом исследования являлись клетки периферической крови, которые выделяли из венозной крови контрольных доноров, онкологических больных, а также лиц, проживающих в радиоактивно загрязненных районах Орловской области.

Были обследованы жители четырех районов Орловской области, в различной степени загрязненных радионуклидами в результате аварии на ЧАЭС (Урицкий, Волховский, Мценский, Колпнянский). В эту группу исследования вошли 232 человека, которым на момент Чернобыльской аварии было от 0 до 14 лет. Из них у 111 человек с помощью УЗИ выявлены узловые новообразования в щитовидной железе. Каждому такому случаю в качестве контроля были подобраны 1-2 лица сходного возраста, пола и места жительства, которые и составили остальные 121 человек. Сведения о средней плотности загрязнения этих районов по цезию-137 и о средней дозе, поглощенной щитовидной железой, были предоставлены сотрудниками Российского государственного медико-дозиметрического регистра (РГМДР).

Группу онкологических больных составили 51 пациент с диагнозом РЩЖ в возрасте от 13 до 64 лет (медиана 38 лет). Все пациенты были госпитализированы в отделение радиохирургического лечения закрытыми радионуклидами МРНЦ РАМН в период с 2001 - 2003 г. Взятие материала произведено до начала специфического лечения. Диагноз был верифицирован и подтвержден морфологически. У 44 больных выявлен папиллярный рак

щитовидной железы (ПРЩЖ), у 4 - медуллярный рак (МРЩЖ), у 3 -фолликулярный (ФРЩЖ).

Группу контроля составили практически здоровые лица, проживающие на незагрязненных радионуклидами территориях и не подвергавшиеся ранее генотоксическому воздействию. У всех контрольных доноров было получено согласие на проведение данного исследования. Всего было обследовано 223 контрольных донора. В дальнейшем эти лица служили основой для формирования групп контроля, соответствующего по возрасту исследуемым группам.

Определение частоты клеток с мутациями по GPA-локусу

Для анализа подходят только гетерозиготные MN доноры, что составляет примерно 50% населения. Поэтому на первом этапе работы определяли группу крови по системе MN антигенов. Для этого проводили прямую реакцию гемагглютинации на плоскости с использованием антител к M и N антигенам (ТОО «ГЕМАТОЛОГ», Россия). Определение мутантных клеток проводили по BR6-cnoco6y, описанному в работе Langlois et al., 1990. Отобранную кровь гетерозиготных доноров фиксировали в формальдегиде. Для выявления различных форм гликофорина А использовали моноклональные антитела к N-форме (клон BRIC 157), меченные ФИТЦ, и М-форме гликофорина А (клон 6А7, "International Blood Group Reference Laboratory", UK). Вторые предварительно биотинилировали по стандартному протоколу. В ходе проточноцитометрического анализа определяли число эритроцитов, потерявших способность связывать одно из антител вследствие мутации в соответствующем аллеле гена. Окрашенные образцы анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Vantage ("BDIS", США) оборудованном 488 нм лазером (Enterprise 621, Coherent Inc., USA) со скоростью (1,5 — 2)х103 клеток/с. Мощность лазера составляла 60 мВт. Для измерения флуоресценции ФЭ использовали узкополосный фильтр 575/26 нм, ФИТЦа - 530/30 нм. Компьютерную обработку проводили с использованием программы Lysis II ("BDIS", США).

Определение частоты клеток с мутациями по TCR-локусу

Метод выявления мутаций по локусу Т-клеточного рецептора (Т-се11 receptor-TCR) был предложен в 90-х годах прошлого века японскими учеными (Kyoizumi et al., 1992). Метод основан на использовании пары моноклональных антител к CD3, CD4 — антигенам, меченных разными флуорохромами. Как известно, на поверхности Т-лимфоцитов экспрессируется комплекс Т-клеточного рецептора и CD3- антигена. Если в таких клетках происходит мутация в локусе, кодирующем TCR, то СБЗ-маркер исчезает с клеточной поверхности. Таким образом, TCR-мутантные клетки имеют необычный фенотип: они экспрессируют CD4, но не СОЗ-маркер. С помощью проточной цитометрии анализируют фенотип каждой клетки и по отсутствию СБЗ-маркера на поверхности С04-положительных клеток выявляют TCR-мутантные лимфоциты. Для анализа у каждого донора брали от 1 до 3 мл венозной крови во флаконы с гепарином. Лимфоциты выделяли с помощью центрифугирования крови в градиенте плотности урографин-фикола (ПанЭко, Москва, плотность 1,077). Для анализа отбирали (1,0 - 1,5)х106 клеток из каждого образца. Окрашивание выделенных лимфоцитов проводили с использованием моноклональных антител к CD3, CD4 — антигенам, меченных разными флуорохромами ("Becton Dickinson Immunocytometry Systems" (BDIS), США). Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Vantage ("BDIS", США), оборудованном 488 нм лазером (Enterprise 621, Coherent Inc., USA), не позднее, чем через 24 ч после окрашивания. В каждом образце анализировали (1-3)х106 клеток со скоростью (1,5 — 2)х10э клеток/с. Компьютерную обработку проводили с использованием программы Lysis II ("BDIS", США).

При обработке экспериментальных данных использовали стандартные методы статистического анализа. Для сравнения различий средних значений выборок применяли критерий Стьюдента в случае нормального распределения и критерий Манн-Уитни в случае отклонения от нормального распределения. Соответствие нормальному распределению оценивали с помощью критериев

Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. При исследовании связи между двумя признаками моделью служила линейная регрессия У=А+ВХ. О степени связи между признаками судили по значению коэффициента корреляции.

Таблица 1.

Количество лиц, обследованных с помощью двух методов.

Группы сравнения Количество обследованных лиц

всего с помощью

ТСЯ- теста СРА-теста

Жители Орловской области 232 220 104

Онкологические больные 51 46 28

Контроль 223 186 52

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Частота мутантных клеток у контрольных доноров

Для корректной оценки показателей соматического мутагенеза необходимо знание контрольного уровня. Поэтому на первом этапе работы была поставлена задача по формированию адекватных контрольных групп. Известно, что с увеличением возраста происходит повышение частоты клеток с мутациями в разных генах. Чтобы учесть влияние возраста на результаты исследования частоты мутантных клеток у облученных лиц была установлена зависимость частоты мутантных лимфоцитов от возраста у контрольных лиц. Зависимость между этими двумя параметрами описывается уравнением линейной регрессии (табл.2). Для вариантных эритроцитов не выявлено статистически

достоверной возрастной зависимости.

Таблица 2.

Параметры линейной зависимости частоты вРА - и ТСК -мутантных клеток от возраста контрольных доноров

Параметры линейной регрессии У=А+ВХ Диапазон возраста Я Р

А± ЭБ В± ББ

МО-вариантные эритроциты (14,6±1,3) • 10"6 (0,1 ±0,03)- 10"6 14-70 0,8 0,05

ТСЯ-мутантные лимфоциты (2,3±0,3)- 10"4 (0,03±0,01)- Ю"4 14-68 0,9 0,03

Анализ частоты мутантных клеток по ТС Я- и СРА-локусам у жителей

Орловской области В 2002-2003 годах проведен анализ генных мутаций по вРА- и ТСЯ-локусам у жителей 4-х районов Орловской (N=232) области, в различной степени загрязненных радионуклидами. Возраст всех обследованных лиц на момент Чернобыльской аварии колебался от 0 до 17 лет. Все лица постоянно проживали на загрязненной территории вплоть до момента анализа. Для этих лиц сотрудниками Радиационно-эпидемиологического сектора МРНЦ РАМН была предоставлена информация о плотности загрязнения Сб137, эффективной дозе, накопленной к моменту анализа, и индивидуальных дозах, поглощенных щитовидной железой (табл.3). В целом по Орловской области плотность загрязненности по 137Сз варьировала в диапазоне 6,6 — 213 кБк/м2, доза, поглощенная щитовидной железой, - от 0,41 до 641 мГр. Из четырех обследованных районов Орловской области Волховский район был наиболее загрязненным.

Результаты определения частоты ТСЯ- и вРА- мутантных клеток у жителей Орловской области представлены в таблице 3.

Средняя частота мутантных клеток у жителей Орловской области

Таблица 3.

К)

Место жительства Плотность загрязненности по Сэ137, кБк/м2 среднее ± 80 Доза, поглощенная ЩЖ, мГр среднее ± БО Средняя частота мутантных клеток ± ББ

ТСЯ, х 10"4 N0, х 10"6 Ш, х 10"6

Орловская область по 4 районам 73,9 ± 70,6 44,1 ± 76,6 4,0±2,2* 42,7±35,9* 25,5±19,0*

Волховский район 198,3 ±46,0 102,1 ± 136,6 4,4±2,8* 39,8±25,4* 18,3±18,3

Урицкий район 56,1 ±34,6 36,1 ±47,1 4,1±2,Г 43,5±46,0* 27,6±16,5*

Мценекий район 38,0 ±9,9 24,3 ±36,1 3,5±1,6* 42,0±30,3* 29,2±23,2*

Колпнянский район 9,3 ± 1,7 18,8 ±24,7 4,0±2,3* 45,6±37,5* 24±14,2*

Контроль (незагрязненные территории РФ) 2,9 ±1,2 17,9± 13,5 14,1 ± 10,0

По данным TCR-метода частота мутантных клеток в целом по Орловской области статистически значимо превышала контрольный уровень в 1,4 раза. Наиболее высокая средняя частота TCR - мутантных клеток отмечалась у жителей Волховского района — как уже говорилось выше, наиболее загрязненного изотопами йода-131 и цезия-137.

По результатам GPA-анализа установлено статистически значимое повышение частоты NO- и NN- вариантных эритроцитов как в целом по Орловской области, так и по отдельным районам по сравнению с контролем.

Обнаруженное в нашей работе повышение по сравнению с контролем частоты TCR-мутантных лимфоцитов в периферической крови жителей Орловской области хорошо согласуется с рядом работ по исследованию цитогенетических изменений и соматических генных мутаций у людей, подвергшихся хроническому радиационному воздействию в малых дозах (Севанькаев и др., 1995,2000; Аклеев и др., 1998; Thomas et al., 1999).

Таким образом, результаты анализа генных мутаций по GPA- и TCR-локусам у жителей 4-х районов Орловской области свидетельствуют о повышении уровня соматического мутагенеза через 17 лет после начала радиационного воздействия.

Влияние интенсивности радиационного воздействия на частоту TCR- и GPA-мутантных клеток у жителей Орловской области В нашей работе была исследована зависимость "доза-эффект" в отношении TCR- и GPA-мутантных клеток у лиц, хронически облученных в малых дозах в результате проживания в загрязненных районах Орловской области. Несмотря на то, что облучение обследованных лиц продолжалось вплоть до момента анализа, большая часть дозы на ЩЖ была сформирована в первые дни после выпадения радионуклидов вследствие быстрого распада изотопов йода, в дальнейшем мощность дозы значительно снизилась. При исследовании возможной связи интенсивности радиационного воздействия с частотой TCR- и GPA-мутантных клеток не установлено статистически

значимой корреляции ни с одним из показателей радиационного воздействия (табл.4).

Таблица 4.

Результаты корреляционного анализа частоты мутантных клеток и интенсивности радиационного воздействия на жителей Орловской области

—----Ыастота мутантных клеток Сопоставляемые параметры-------- Коэффициент линейной корреляции, Я

ТСЯ N0 NN

Плотность загрязнения места проживания 137Сз 0,12 0,01 -0,2

Накопленная эффективная доза 0,11 0,1 -0,2

Доза, поглощенная ЩЖ 0,05 0,16 -0,1

В качестве критерия повышенной частоты мутантных клеток приняли превышение верхней границы 95% доверительного интервала, установленного для необлученных (контрольных) лиц с учетом возрастной зависимости.

Установлено, что 19,5% жителей Орловской области (43 человека) имеют повышенные частоты ТСК-мутантных клеток, 31,7% (33 человек) -повышенные частоты МО-вариантных эритроцитов, 17,3% (18 человека) - NN1-вариантных эритроцитов. Показано, что при исключении из анализа лиц с повышенными частотами средние частоты ТСЯ-мутантных лимфоцитов, N0- и ЬШ-вариантных эритроцитов у оставшихся лиц (N=177, N=71 и N=86, соответственно) статистически значимо не отличаются от соответствующего контроля (р>0,05 во всех случаях) (табл.5).

При этом лица с повышенными частотами ТСЯ- и ОРА-мутантных клеток мало отличались от остальных лиц по интенсивности радиационного воздействия. Частота мутантных клеток не коррелировала ни с одним из показателей интенсивности радиационного воздействия как в группе лиц с повышенной, так и с нормальной частотой мутантных клеток (данные не приведены).

Таким образом, высокие частоты ТСЯ- и вРА-мутантных клеток, полученные в нашей работе, могут быть объяснены наличием в популяции индивидуумов с высокой радиочувствительностью, хотя возможны также и другие объяснения.

Таблица 5.

Показатели интенсивности радиационного воздействия у лиц с нормальной и

повышенной частотой мутантных клеток.

Лица с повышенной частотой мутантных клеток Лица с нормальной частотой мутантных клеток Контрольные лица

Средняя частота ТСЯ-мутантных клеток ± БО, х 10"4 7,3 ±2,6 3,2 ± 1,0 2,9 ± 1,2

Средняя частота N0-вариантных эритроцитов ± ББ, х 10"6 80,8 ± 24,9 22,1 ±9,9 17,9± 13,5

Средняя частота N>4-вариантных эритроцитов ± БЭ.х 10"6 57,6 ± 23,3 18,8 ±8,2 14,1 ± 10,0

Плотность загрязненности по Се137, кБк/м\ среднее ± БО 85,9 ±71,5 71,5 ±70,0 ------

Доза, поглощенная ЩЖ, мГр среднее ± ББ 59,8 ± 103,2 40,3 ± 67,5

Частота мутантных клеток у жителей Орловской области в зависимости от

наличия патологии ЩЖ

Если считать обоснованным предположение, что у человека и животных повышенная частота клеток с мутациями в генах, даже не связанных напрямую с канцерогенезом, может свидетельствовать о повышенном риске развития

злокачественных заболеваний, тогда у лиц с доброкачественной узловой патологией ЩЖ, которые, несомненно, составляют группу риска в отношении развития злокачественных новообразований ЩЖ, можно было бы ожидать увеличения количества клеток с соматическими мутациями.

Поэтому особый интерес представлял сравнительный анализ частоты мутантных клеток по указанным локусам у жителей Орловской области с выявленной доброкачественной узловой патологией ЩЖ и без таковой.

При определении частоты ТС Я - мутантных клеток установлено, что в подгруппе лиц с выявленными доброкачественными узловыми новообразованиями в щитовидной железе средняя величина этого показателя была статистически значимо выше (р<0,05), чем среди лиц без такой патологии (рис.1).

р ы

Е— 00

II

и

СИ лица с узлами ЩЖ контрольные лица

ЕЗлица без узловой патологии ЩЖ

N=49

N=55

«¡Ё «я

Рис.1 Средняя частота ТСЯ- и вРА- мутантных клеток у жителей Орловской области в зависимости от наличия узловой патологии ЩЖ

• - р<0,05 по сравнению с группой лиц без узловой патологии ЩЖ

В подгруппе с выявленной узловой патологией ЩЖ нами не установлено статистически значимого увеличения средней частоты ЫО-вариантных эритроцитов по сравнению с таковой у лиц без патологии ЩЖ, однако, как видно из рис.1, все же можно говорить о тенденции увеличения данного показателя (р=0,1). В целом по всей Орловской области в подгруппе с узловой патологией ЩЖ выявлена тенденция к увеличению доли лиц с повышенной частотой ЫО-вариантных эритроцитов.

При этом лица с узловой патологией ЩЖ, проживающие в более загрязненных районах, имели тенденцию к увеличению частоты ТСЯ-мутантных клеток (г=0,73, р>0,05) (рис.2). Эти данные свидетельствуют о более выраженной реакции на одинаковое радиационное воздействие в группе, включающей лиц с узловой патологией, по сравнению с группой лиц без узловой патологии ЩЖ и проживающих в тех же районах.

■ лица с узловой патологией ЩЖ о лица без узловой патологии ЩЖ

ос о

4,0-

4,3

40 60 80 100

Доза, поглощенная ЩЖ, мГр

Рис.2 Сопоставление средней дозы на ЩЖ и средней частоты ТСЛ- мутантных клеток у жителей четырех обследованных районов Орловской области в зависимости от наличия узловой патологии ЩЖ. 1- Волховский район, 2 — Урицкий район, 3 — Мценский район, 4 — Колпнянский район.

Частота мутантных клеток у лиц со злокачественными новообразованиями ЩЖ

Частота ТСЯ-мутантных клеток определена у 46 из 51 больных РЩЖ. Установлено, что средняя частота (± ¿>£>) мутантных клеток в контрольной группе составляет (3,4 ± 1,4), а у онкологических больных (6,3 ± 3,0). Расчеты по критерию Манн-Уитни показали, что частота мутантных по ТСЯ-локусу клеток у онкологических больных статистически значимо выше, чем у здоровых лиц (р<0,01).

У 37% онкологических больных частота ТСЯ—мутантных лимфоцитов превышает 95% доверительный интервал, установленный для контрольной группы. Если из группы онкологических больных и контрольной группы исключить лиц с повышенными частотами, то у оставшихся лиц в группе больных РЩЖ среднее значение частоты ТСЯ-мутантных клеток статистически значимо превышает контрольный уровень, соответственно 4,4 ± 1,0 и 3,2 ± 1,2 (р<0,01). Следовательно, повышенный уровень частоты ТСЯ-мутантных лимфоцитов наблюдается практически у всех онкологических больных и не зависит от присутствия отдельных лиц с высокими частотами.

Частота вРА-мутантных клеток была определена у 28 онкологических больных и 37 контрольных здоровых лиц сходного возраста. Расчеты по критерию Манн-Уитни показали, что в группе больных РЩЖ частота СРА-мутаций статистически значимо не отличалась от таковой в контроле. Вместе с тем, у онкологических больных выявлена тенденция к повышению частот мутантных клеток (р=0,08).

больные РЩЖ п=46

частота ТС^мутангных лимфоцитов (х 10"*)

Рис.2. Распределение частоты ТСЯ-мутантных лимфоцитов в группах здоровых доноров и больных раком щитовидной железы. Вертикальная линия показывает верхнюю границу 95% доверительного интервала, установленного для контрольной группы.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о связи уровня соматического генного мутагенеза в разных локусах (прежде всего, по локусу Т клеточного рецептора) с вероятностью возникновения РЩЖ, в том числе в результате облучения. Учитывая данные литературы о наличии аналогичных закономерностей при обследовании облученных лиц, лиц с рядом наследственных заболеваний и онкологических больных, можно полагать, что повышенный уровень соматических генных мутаций связан с более высокой вероятностью возникновения злокачественных опухолей многих других локализаций. Соответственно, возможно считать, что результаты определения частоты мутантных клеток по локусам Т-клеточного рецептора и гликофорина А перспективны для формирования групп повышенного канцерогенного риска.

выводы

1. У жителей Орловской области, облученных в малых дозах вследствие проживания на загрязненных радионуклидами территориях, выявлено статистически значимое увеличение средней частоты клеток, мутантных по локусам Т-клеточного рецептора (ТСЯ) и гликофорина А (О РА). Доля лиц с повышенной частотой мутантных клеток по обоим исследованным локусам также повышена по сравнению с соответствующим контролем.

2. Не установлено прямой зависимости от дозы частоты ТСЯ- и СРА-мутантных клеток у жителей 4-х районов в различной степени загрязненных радионуклидами, хотя у жителей наиболее загрязненного Волховского района наблюдались самые высокие частоты ТСЯ- и СРА- мутантных клеток.

3. У лиц с доброкачественной узловой патологией щитовидной железы средняя частота ТСЯ-мутантных клеток и доля лиц с повышенной частотой мутантных по ТСЯ-локусу клеток была статистически значимо выше, чем у обследованных без такой патологии. По средней частоте СРА- мутантных эритроцитов не выявлено статистически значимых различий между этими группами, однако имеется тенденция к увеличению доли лиц с повышенной частотой МО-вариантных эритроцитов в группе с узловой патологией щитовидной железы.

4. У больных раком щитовидной железы до начала специфического лечения установлено статистически достоверное повышение частоты ТСЯ-мутантных клеток по сравнению со здоровыми лицами.

5. Высокий уровень частоты ТСЯ-мутантных клеток в группе жителей Орловской области выявлен только у части лиц, тогда как в группе больных раком щитовидной железы этот показатель увеличен во всей группе и не определяется присутствием отдельных лиц с высокими частотами.

6. Проведенные исследования позволяют считать, что частоту мутантных клеток по локусам Т-клеточного рецептора и гликофорина А можно

рассматривать в качестве потенциального критерия для формирования групп

риска в отношении развития рака щитовидной железы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Верещагина А.О., Замулаева И. А., Саенко A.C. Корреляционная зависимость частоты мутантных по локусу гликофорина А клеток от поглощенной дозы облучения щитовидной железы// Сб. материалов конференции «Энергетика - 3000». - Обнинск, 2001. - С.132-136.

2. Верещагина А.О., Замулаева И.А., Смирнова С.Г., Орлова Н.В., Саенко A.C. Повышение частоты лимфоцитов с мутациями по локусу Т-клеточного рецептора у жителей загрязненных радионуклидами районов Орловской области// Сб. тезисов 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века». — Пущино, 2003. — С. 12.

3. Селиванова Е.И., Замулаева И.А., Смирнова С.Г., Орлова Н.В., Верещагина

A.О., Саенко A.C. Повышение частоты соматических клеток с генными мутациями у жителей загрязненных радионуклидами районов Орловской области// Сб. тезисов «III съезд по радиационным исследованиям». — Киев, 2003. -С.111.

4. Саенко A.C., Замулаева И.А., Смирнова С.Г., Орлова Н.В., Селиванова Е.И., Верещагина А.О. Частота соматических клеток с генными мутациями у лиц, проживающих в загрязненных радионуклидами районах Орловской области// Радиация и риск. - 2003. - Спец. выпуск. - С.75-86.

5. Саенко A.C., Замулаева И.А., Орлова Н.В., Смирнова С.Г., Селиванова Е.И., Верещагина А.О., Матвеева Н.П., Каплан М.А. Закономерности и механизмы возникновения генетических эффектов действия ионизирующего излучения в малых дозах на соматические клетки человека// В сб.: Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. Калуга, 2004, Вып.б, С. 382-388.

6. Верещагина А.О., Замулаева И.А., Орлова Н.В., Смирнова С.Г., Медведев

B.C., Саенко A.C. Частота лимфоцитов, мутантных по генам Т-клеточного

рецептора, как возможный критерий для формирования группы повышенного риска развития опухолей щитовидной железы у облученных и необлученных лиц // Радиационная биология, Радиоэкология. - 2005. - Т.45, №5. - С.581-586.

7. Севанькаев А.В., Замулаева И.А., Михайлова Г.Ф., Потетня О.И., Цепенко В.В., Хвостунов И.К., Голуб Е.В., Пятенко B.C., Поздышкина О.В., Смирнова С.Г., Верещагина А.О., Орлова Н.В., Саенко А.С. Сравнительный анализ генных и структурных мутаций у жителей загрязненных радионуклидами районов Орловской области после аварии на ЧАЭС// Сб. тезисов «V съезд по радиационным исследованиям». - Москва, 2006. — T.l. — С.93.

8. Selivanova Е., Zamulaeva I., Vereschagina A., Parshin V., Chekin S., Saenko A. Somatic mutagenesis at glicophorin A locus in residents of radiation contaminated territories of Orel region // In: Abstracts of the 35th European Environmental Mutagen Society. — Greece, 2005. -P.l00.

Заказ № 236 от 15.07.06 г. Тираж 100 экз. Бумага офсетная. Отпечатано на цифровом дубликаторе. Типография «ОГИЦ — полиграфия»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Верещагина, Анна Олеговна

ВВЕДЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Изменения генетического материала соматических 12 клеток при воздействии ионизирующего излучения.

1.1.1. Индукция соматического мутагенеза (механизмы 12 формирования структурных и генных мутаций).

1.1.2. Индукция нестабильности генома.

1.2 Ключевая роль мутаций в канцерогенезе.

1.3 Радиационно-индуцированный канцерогенез.

1.4 Методы оценки мутагенеза в соматических клетках по отдельным генным локусам и возможность их применения в популяционных исследованиях.

1.5. Высокий уровень соматического мутагенеза, как 30 показатель повышенного риска развития онкопатологии.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика обследованных групп.

2.1.1. Характеристика группы лиц, обследованных с помощью GPA-теста.

2.1.2. Характеристика группы лиц, обследованных с помощью TCR-теста.

2.2. Подготовка проточного цитометра к работе.

2.3. Определение частоты GPA-мутантных клеток.

2.3.1. Фенотипирование крови доноров.

2.3.2. Фиксация и окрашивание клеток.

2.3.3. Биотинилирование антител к М-форме гликофорина А.

2.4. Определение частоты TCR -мутантных клеток.

2.5. Статистический анализ полученных результатов.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Частота мутантных клеток в группах контрольных необлученных лиц.

3.1.1. Частота мутантных по TCR-локусу клеток у контрольных доноров.

3.1.2. Частота GPA-мутантных клеток у контрольных лиц.

3.2. Частота клеток с генными мутациями у жителей радиационно-загрязненных территорий Орловской области.

3.2.1. Частота GPA-мутантных клеток.

3.2.2. Частота TCR-мутантных клеток.

3.3. Частота клеток с генными мутациями у жителей радиационно-загрязненных территорий Орловской области в зависимости от возраста на момент начала радиационного воздействия.

3.3.1. Частота GPA-мутантных эритроцитов.

3.3.2. Частота TCR -мутантных клеток.

3.4. Частота мутантных клеток у лиц со злокачественными новообразованиями ЩЖ.

3.4.1. Частота TCR -мутантных клеток.

3.4.2. Частота GPA-мутантных клеток.

ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Частота мутантных клеток у контрольных доноров.

4.2. Влияние хронического облучения в малых дозах на уровень мутантных клеток по TCR- и GPA-локусам.

4.2.1. Влияние хронического облучения в малых дозах на уровень мутантных клеток по локусу гликофорина А.

4.2.2. Влияние малых доз хронического облучения на уровень мутантных клеток по TCR-локусу.

4.3. Повышенная частота мутантных клеток как критерий для формирования группы риска развития онкологических заболеваний.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Определение частоты мутантных клеток по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора с целью формирования групп риска в отношении развития рака щитовидной железы"

На протяжении последних десятилетий радиобиологи активно стараются оценить риск для здоровья человека от воздействия ионизирующего излучения (ИИ) (особенно интересен диапазон малых доз). В отличие от воздействия ИИ в больших дозах, которое может вызывать существенные нарушения здоровья, в том числе лучевую болезнь и гибель организма, ИИ в малых дозах не всегда вызывает видимые морфофункциональные изменения у живых организмов. Тем не менее, многочисленные литературные данные показывают, что ИИ в малых дозах индуцирует комплекс цитогенетических, биохимических и биофизических изменений в клетках организма животных и человека (Бурлакова и др., 1996, 1999; Пелевина и др., 2003; Mothersill and Seymour, 2003). Хотя механизмы действия малых доз ИИ все еще остаются недостаточно изученными, можно предположить, что с обнаружением феномена радиационно-индуцированной нестабильности генома у потомков облученных клеток, большую значимость приобретают исследования изменений генетического материала, особенно интересно изучение проявлений этого явления на генном уровне при облучении человека в диапазоне малых доз. В связи с этим представляет интерес исследование генных мутаций в соматических клетках людей, подвергающихся низкоинтенсивному радиационному воздействию в малых дозах вследствие проживания на загрязненной радионуклидами территории.

Одно из самых неблагоприятных последствий воздействия радиации -индукция злокачественных новообразований. Радиационное воздействие играет роль пускового механизма в канцерогенезе, а дальнейшее развитие событий зависит от состояния репарационной, иммунной, эндокринной и других систем организма, ответственных за реакцию организма на повреждающее воздействие. При обследовании людей, облученных в малых дозах вследствие проживания на загрязненных территориях, показано, что только у части лиц развиваются вредные последствия. С 1992 г. имеет местс драматический рост числа заболевших РЩЖ, особенно среди тех лиц, кто находился в детском возрасте на момент аварии, поскольку радиочувствительность ЩЖ особенно высока у детей младшего возраста. В настоящее время в Брянской и Орловской областях показатель заболеваемости РЩЖ для лиц, облученных в детском возрасте, в 3-5 раз превышает аналогичный по стране в целом. В связи с этим проблема выявления групп повышенного канцерогенного риска является одной из самых актуальных.

Поскольку известно, что мутации играют ключевую роль в канцерогенезе, то подход для выявления групп повышенного канцерогенного риска, основанный на оценке уровня соматического мутагенеза в организме, можно рассматривать как один из наиболее перспективных. Правомерность такого подхода следует из представления, что возникновение мутаций, как правило, является стохастическим процессом, поэтому можно предположить, что количество клеток с мутациями в любом гене (в том числе и не имеющем прямого отношения к канцерогенезу) отражает общий уровень соматического мутагенеза в организме. В таком случае, лица с высокой частотой мутаций в генах, даже непосредственно не связанных со злокачественной трансформацией, будут составлять группу риска в отношении развития опухолей. Известные к настоящему времени факты (Hagmar et al., 1994; Akiyama et al., 1995, b; Grant et al., 1999; Замулаева и др., 2001; Орлова, 2002), подтверждают эту гипотезу.

Таким образом, не вызывает сомнений актуальность исследования соматического мутагенеза в отдельных генных локусах после радиационного воздействия. Среди существующих методов определения генных мутаций наиболее перспективными следует считать проточноцитометрические методы выявления клеток, мутантных по локусу Т-клеточного рецептора (TCR -тест) и по локусу гликофорина A (GPA -тест). До недавнего времени эти тесты использовались наряду с традиционными методами определения структурных мутаций для ретроспективной дозиметрии (Langlois R.G. et al,

1987; Akiyama M et al, 1991; Саенко и др., 1998, 2000). В отношении использования этих методов для выявления лиц с высоким уровнем соматического мутагенеза в литературе имеется всего несколько публикаций (Akiyama et al., 1995; Замулаева и др., 2001), однако они свидетельствуют о перспективности применения этих методов для формирования групп повышенного риска развития онкологических заболеваний ряда локализаций. В отношении патологии щитовидной железы (ЩЖ) подобных исследований не проводилось. Поэтому исследование потенциальной возможности использования оценки уровня соматических генных мутаций у больных РЩЖ, проживающих в загрязненных радионуклидами районах, представляет особый интерес в связи с повышенной частотой заболеваний ЩЖ и с тем, что РЩЖ у части таких больных обусловлен радиационным воздействием. В настоящее время доказано, что облучение ЩЖ ионизирующим излучением приводит к увеличению частоты как злокачественных, так и доброкачественных заболеваний ЩЖ. Поскольку доброкачественные узловые новообразования в ЩЖ часто ведут к злокачественной трансформации, то исследование уровня генных мутаций в соматических клетках у лиц с выявленной узловой патологией ЩЖ и проживающих н?. загрязненных радионуклидами территориях, позволит судить о возможности использования методов определения генных мутаций для формирования групп повышенного риска развития РЩЖ.

Таким образом, целью данной работы являлось выяснение нескольких вопросов. Первый из них - действительно ли у лиц, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях, и больных РЩЖ наблюдаются повышенные частоты клеток с генными мутациями. Второй - является ли применение GPA- и TCR-тестов перспективным для формирования групп риска в отношении возникновения РЩЖ. Интерес представляла также оценка информативности указанных тестов для биодозиметрии при разных дозах облучения щитовидной железы.

Для достижения данной цели предполагалось решить следующие задачи:

1) провести сравнительное исследование частоты мутантных клеток по TCR-и GPA-локусам у жителей загрязненных в результате аварии на ЧАЭС районов и необлученных контрольных лиц;

2) установить, существует ли зависимость между дозой, поглощенной ЩЖ, и частотой мутантных клеток по GPA- и TCR-локусам у жителей загрязненных в результате аварии на ЧАЭС районов (на примере жителей Орловской области);

3) провести сравнительное исследование частоты мутантных клеток по 2 указанным локусам у жителей Орловской области с выявленной доброкачественной узловой патологией ЩЖ и без таковой;

4) провести сравнительное исследование частоты мутантных клеток по 2 указанным локусам у больных РЩЖ до лечения и у здоровых лиц;

5) оценить возможность использования данных тестов для формирования групп риска в отношении возникновения РЩЖ;

Научная новизна работы

В результате проведенных исследований показано, что у жителей загрязненных территорий, подвергающихся хроническому облучению в малых дозах, средняя частота клеток с генными мутациями по TCR- и по GPA-локусам статистически значимо превышает контрольный уровень. Однако для всех обследованных лиц не установлено прямой зависимости выхода этих мутантных клеток от степени загрязнения радионуклидами различных районов. Показано, что у постоянных жителей загрязненных территорий Орловской области с доброкачественной узловой патологией щитовидной железы средняя частота клеток с генными мутациями по TCR-локусу статистически значимо превышает не только контрольный уровень, но и этот показатель у жителей Орловской области без такой патологии. В результате исследования впервые были получены данные о частоте мутантных клеток по TCR- и по GPA-локусам у больных раком щитовидной железы до начала специфического лечения.

Практическая значимость работы

Результаты обследования жителей радиоактивно загрязненных территорий с доброкачественной узловой патологией ЩЖ, а также пациентов со злокачественными новообразованиями ЩЖ свидетельствуют о возможности выявления лиц, в том числе среди подвергшихся действию ионизирующих излучений в малых дозах, с повышенным риском развития РЩЖ, основываясь на показателях соматического генного мутагенеза в разных локусах (прежде всего, по TCR-локусу).

Основные положения, выносимые на защиту

1. У жителей Орловской области, подвергающихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию в малых дозах

1 "ХП О плотность загрязненности по Cs 6,6-213 кБк/м ) наблюдается высокая частота клеток с генными мутациями по разным локусам.

2. В отдаленные сроки после облучения в малых дозах выход клеток с генными мутациями прямо не зависит от величины дозовой нагрузки на щитовидную железу в диапазоне доз 0,41-641 мГр.

3. Лица с доброкачественной узловой патологией щитовидной железы и больные раком щитовидной железы имеют более высокие частоты клеток с мутациями по локусу Т-клеточного рецептора. Вероятно, повышенный уровень частоты клеток с генными мутациями может являться критерием для формирования группы лиц с высоким риском развития РЩЖ.

Апробация работы По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях:

• Международный конгресс «Энергетика 3000 (энергетика и человек)», 2001г., Обнинск; Международная школа - конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", 2003 г., Пущино; III съезд по радиационным исследованиям (радиобиология и радиоэкология), 2003 г., Киев; V съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность), 2006 г., Москва; International summer school "Molecular mechanisms in homeostasis and disease", 2003r., Greece; Cancel immunology and immunotherapy summer school, 2003 г., Greece; 35th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society, 2005 г., Kos, Greece.

Диссертация апробирована на научной конференции экспериментального радиологического сектора ГУ-МРНЦ РАМН «20» апреля 2006 г.

Структура и объем диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Верещагина, Анна Олеговна

ВЫВОДЫ

1. У жителей Орловской области, облученных в малых дозах вследствие проживания на загрязненных радионуклидами территориях, выявлено статистически значимое увеличение средней частоты клеток, мутантных по локусам Т-клеточного рецептора (TCR) и гликофорина A (GPA). Доля лиц с повышенной частотой мутантных клеток по обоим исследованным локусам также повышена по сравнению с соответствующим контролем.

2. Не установлено прямой зависимости от дозы частоты TCR- и GPA-мутантных клеток у жителей 4-х районов в различной степени загрязненных радионуклидами, хотя у жителей наиболее загрязненного Волховского района наблюдались самые высокие частоты TCR- и GPA-мутантных клеток.

3. У лиц с доброкачественной узловой патологией щитовидной железы средняя частота TCR-мутантных клеток и доля лиц с повышенной частотой мутантных по TCR-локусу клеток была статистически значимо выше, чем у обследованных без такой патологии. По средней частоте GPA- мутантных эритроцитов не выявлено статистически значимых различий между этими группами, однако имеется тенденция к увеличению доли лиц с повышенной частотой NO-вариантных эритроцитов в группе с узловой патологией щитовидной железы.

4. У больных раком щитовидной железы до начала специфического лечения установлено статистически достоверное повышение частоты TCR-мутантных клеток по сравнению со здоровыми лицами.

5. Высокий уровень частоты TCR-мутантных клеток в группе жителей Орловской области выявлен только у части лиц, тогда как в группе больных раком щитовидной железы этот показатель увеличен во всей группе и не определяется присутствием отдельных лиц с высокими частотами.

6. Проведенные исследования позволяют считать, что частоту мутантных клеток по локусам Т-клеточного рецептора и гликофорина А можно рассматривать в качестве потенциального критерия для формирования групп риска в отношении развития рака щитовидной железы.

А ■

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Верещагина, Анна Олеговна, Обнинск

1. Аклеев А.В., Алещенко А.В., Антощина М.М.Цитогенетические последствия облучения жителей Южного Урала // Радиационная биология. Радиоэкология.- 2002.- Т. 42.- № 6. С. 696-699.

2. Аклеев А.В., Веремеева Г.А., Киоизуми С. Влияние хронического радиационного воздействия на уровень соматических мутаций б клетках периферической крови людей в отдаленные сроки // Радиационная биология. Радиоэкология.- 1998.- Т. 38,- В. 4. С. 573585.

3. Ахматуллина Н.Б. Отдаленные последствия действия радиации и индуцированная нестабильность генома// Радиационная биология. Радиоэкология.- 2005.- Т. 45.- № 6. С. 680-687.

4. Бондарчук И.А. Анализ роли репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апаптоза в радиационно-индуцированном адаптивном ответе клеток млекопитающих// Радиационная биология. Радиоэкология.-2003.- Т. 43.-№ 1.- С. 19-28.

5. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Горбунова Н.В. и др. Особенности биологического действия малых доз облучения// Радиационная биология. Радиоэкология.- 1996.- Т. 36.- В. 4.- С. 610-631.

6. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Жижина Г.Н., Конрадов А.А. Новые аспекты закономерностей действия низко интенсивного облучения б малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология.- 1999.- Т. 39.-№1.-С. 26-35.

7. Бурлакова Е.Б., Михайлов В.Ф., Мазурик В.К. Система окислительно-восстановительного гомеостаза при радиационно-индуцированной нестабильности генома // Радиационная биология. Радиоэкология.-2001.- Т. 41.-№5.- С. 489-499.

8. Бычковская И.Б., Степанов Р.П., Федорцева Р.Ф. Особые долговременные изменения клеток при воздействии радиации в малых дозах //Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. - Т. 42. - № 1С. 20-35.

9. Ю.Веремеева Г.А. Влияние хронического радиационного воздействия на уровень соматических мутаций в клетках периферической крови людей в отдаленные сроки: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1996. -26с.

10. П.Власов О.В., Щукина Н.В., Годько A.M. Дозы облучения щитовидной железы от инкорпорированного I для населения Орловской области // Радиация и риск. 2003. - Специальный выпуск. - С.6-19.

11. Газиев А.И. Повреждение ДНК в клетках под действием ионизирующей радиации // Радиационная биология. Радиоэкология.-1999. Т. 39. - № 6. - С. 630-638.

12. З.Галактионов В.Г. Иммунология. -М.: Издательство МГУ, 1998. 420с.

13. М.Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Изд. Дом «Практика», 1999. -459 с.

14. Иванов В.К., Цыб А.Ф. Медицинские радиологические последствия Чернобыля для населения России: оценка радиационных рисков. -М.: Медицина, 2002.-389 с.

15. Израэль Ю.А., Стукин Е.Д., Назаров И.М., Квасникова Е.В. Радтоактивное загрязнение природных сред после чернобыльской аварии. Радиационный мониторинг. Чернобыль: 15 лет спустя / Под ред. Н.В.Герасимовой. -М.: Контакт-культура, 2001. - С.82.

16. Имянитов Е.Н., Князев П.Г. Роль антионкогенов в опухолевом процессе // Экспериментальная онкология 1992. -Т. 14. -№ 5. -С. 318.

17. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию механизмов канцерогенеза // Биохимия. 2000. - Т. 65.-№1.-С. 5-33.

18. Кузьмина Н.С., Сусков И.И. Экспрессирование геномной нестабильности в лимфоцитах детей, проживающих в условиях длительного действия радиационного фактора // Радиационная биология. Радиоэкология.- 2002. Т. 42. - № 6. - С. 735-739.

19. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. Радиационно-индуцируемая нестабильность генома: феномен, молекулярные механизмы, патогенетическое значение // Радиационная биология. Радиоэкология,-2001. Т. 41. -№ 3. - С. 272-289.

20. Мазурик В.К., Мороз Б.Б. Проблемы радиобиологии и белок р53 // Радиационная биология. Радиоэкология.- 2001. Т. 41. -№ 5. - С. 548572.

21. Пелевина И.И., Николаев В.А., Готлиб В.Я. и др., Адаптивная реакция лимфоцитов крови людей, подвергшихся хроническому воздействию радиации в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология.-1994. Т. 34. - Вып. 6. - С. 805-817.

22. ПелевинаИ.И., Алещенко А.В, Антощина М.М. Реакция популяции клеток на облучение в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003.-Т. 43.-№5.-С. 161-166.

23. Пилинская М.А., Шеметун A.M., Дыбский С.С. Цитогенетический эффект в лимфоцитах периферической крови как индикатор действия на человека факторов Чернобыльской аварии // Радиобиология.- 1992. -Т. 32.-Вып. 5.-С. 632-639.

24. Рождественский JI.M., Окладников Н.Д., Смирнова Т.Н. и др. Оценка уровня мутаций в локусе гликофорина А у лиц, подвергавшихся хроническому воздействию ионизирующей радиации // Радиационная биология. Радиоэкология. 1998. - Т. 38. -№ 3. - С. 443-450.

25. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология.- М.: Мир, 2000. 560 с.

26. Саенко А.С., Замулаева И.А., Смирнова С.Г. и др. Определение частоты мутаций по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора: информативность для биологической дозиметрии острого ипролонгированного облучения// Радиационная биология.

27. Радиоэкология.- 1998.-Т. 38.-№2.-С. 181-190.

28. Саенко А.С., Замулаева И.А., Смирнова С.Г. и др. Определение частоты мутаций по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора: обследование ликвидаторов аварии на ЧАЭС// Радиационная биология. Радиоэкология. 1998. - Т. 38. - № 2. - С. 171-180.

29. Севанькаев А.В. Некоторые итоги цитогенетических исследований в связи с оценкой последствий Чернобыльской аварии // Радиационная биология. Радиоэкология.- 2000. Т. 40. - № 5. - С. 589-595.

30. Сусков И.И., Кузьмина Н.С. Проблема индуцированной геномной нестабильности в детском организме в условиях длительного действия малых доз радиации // Радиационная биология. Радиоэкология,- 2001. -Т. 41. -№ 5. С. 606-614.

31. Татосян А.Г. Онкогены // Канцерогенез/ Под ред. проф. Д.Г. Заридзе. -М.: Научный мир, 2000 С. 57-74.

32. Урбах В.Ю. Биометрические методы. М.: Наука, 1964. - 247 с.

33. Цыб А.Ф., Поверенный A.M. Повреждения щитовидной железы в период чернобыльской аварии: вероятные последствия// Последствия Чернобыльской катастрофы: Здоровье человека/ под ред. Бурлаковой Е.Б. М.: Центр экологической политики России, 1996. - С.219-228.

34. Цыб А.Ф. Радиация и патология. М.: Тровант, 2003. - 309с.

35. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью//

36. Биохимия. 2000. - Т.65. - №1. - С. 34-47.

37. Akiyama М., Nakamura N., Yakoda М. et al. Somatic cell mutation in atomic bomb survivors //Radiat.Res. 1991. - V.32. - Suppl. 1. - P.278-282.

38. Akiyama M., Kyoizumi S., Hirai Y. et al. Mutation frequency in human blood cells increases with age //Mutat. Res. 1995, a. - V.338. - P. 141-149.

39. Akiyama M., Umeki S., Kusunoki Y. et al. Somatic-cell mutation as a possible predictor of cancer risk // Health Phys.-1995,b. -V.68. P. 643-649.

40. Akiyama M., Kyoizumi S., Kusunoki Y. et al. Monitoring exposure to atomic bomb radiation by somatic mutation // Environ. Health Perspect. -1996. V.104. - №3. - P.493-496.

41. Albertini R.J., Castle K.L., Borchering W.R. T-cell cloning to detect the mutant 6-thioguanine resistant lymphocytes present in human peripheral blood//Proc. Natl. Acad. Sci. 1982.- V.79.-P.6617-6621.

42. Albertini R.J. HPRT mutations in humans: biomarkers for mechanistic studies//Mutat. Res. 2001. - V.489. - P.l-16.

43. Baverstock K. Radiation-induced genomic instability: a paradigm-breaking phenomenon and its relevance to environmentally induced cancer// Mutat. Res. 2000. - V.454. - P.89-109.

44. Bigbee W.L., Langlois R.G., Swift M., Jensen R.H. Evidence for an elevated frequency of in vivo somatic cell mutations in ataxia teleangiectasia // Am. J. Hum. Genet. 1989. - V.44. - № 3. - P.402-408.

45. Cole J. and Scopek T.R. Somatic mutant frequency, mutation rates and mutational spectra in the human population in vivo // Mutat. Res. 1994. -V.304. -P.33-105.

46. Grant B.W., Trombley L.M., Hunter T.C. et al. HPRT mutations in vivo in human CD 34+ hematopoietic stem cells // Mutat. Res. 1999. - V.431. -P.183-198.

47. Grant S.G., Bigbee W.L. In vivo somatic mutation and segregation at the human glycophorin A (GPA) locus: Phenotypic variation encompassing both gene-specific and chromosomal mechanisms // Mutat. Res. 1993. - V.288. -P.163-172.

48. Grosovsky A.J., Parks K.K., Giver C., Nelson S. Clonal analysis of delayed kariotypic abnormalities and gene mutations in radiation-induced genetic instability// Molecular and Cellular Biology. 1996. - V.16. - N.ll. -P.6252-6262.

49. Hagmar L., Brogger A., Hansteen I.L. et al. Cancer risk in humans predicted by increased levels of chromosomal aberrations in lymphocytes: Nordic study group on the health risk of chromosome damage // Cancer Res. -1994. V.54. - P.2919-2922.

50. Harms-Ringdahl M. Some aspects on radiation induced transmissible genomic instability // Mutat. Res. 1998. - V.404. - P.27-33.

51. Ivanov V.K., Gorski A.I., Maksioutov M.A. et al. Thyroid cancer incidence among adolescents and adults in the Bryansk region of Russia following the Chernobyl accident // Haelth Physics. 2003. - V.84. -N1. - P.46-60.

52. Iwamoto K.S., Hirai Y., Umeki S. et al. A positive correlation between T cell receptor mutant frequencies and dicentric chromosome frequencies in lymphocytes from radiotherapy patients // J. Radiat. Res. 1994. - V.35. -P.92-103.

53. Jacob P., Kenigsberg J., Zvonova I. et al Childhood exposure due to the Chernobyl accident and thyroid cancer risk in contaminated areas of Belarus and Russia // Br. J. Cancer. 1999. - V.80. - P. 1461-1469.

54. Jamali M., Trott K.P. Persistent increase in the rates of apoptosis and dicentric chromosomes in surviving V79 cells after X-irradiation // Int. J. Radiat. Biol. 1996. - V.70.- N.6. - P.705-709.

55. Jensen R.H., Langlois R.G., Bigbee W.L. et al. Elevated frequency of glycophorin A mutations in erythrocytes from Chernobyl accident victims // Radiat. Res. 1995. - V. 141. - P.129-135.

56. Kadhim M.A., Macdonald D.A., Goodhead D.T. et al. Transmission of chromosomal instability after plutonium a-particle irradiation// Nature. -1992. V.355. - P.738-740.

57. Kadhim M.A., Moore S.R., Goodwin E.H. Interrelationships amongst radiation-induced genomic instability, bystander effects, and the adaptive response // Mutat. Res. 2004. - V.568. - P.21-32.

58. Kushiro J., Hirai Y., Kusunoki Y. et al. Development of a flow-cytometric HLA-A locus mutation assay for human peripheral blood lymphocytes // Mutat. Res. 1992. - V.272. - P. 17-29.

59. Kusunoki Y., Kyoizumi S., Kubo Y. et al. Possible role of natural killer cells in negative selectionn of mutant lymphocytes that fail to express the human leukocyte antigen-A2 allele // Mutat. Res. 2001. - V.476. - P. 123132.

60. Kyoizumi S., Nakamura N., Takebe H. et al. Frequency of variant erythrocytes at the glycophorin A locus in two Bloom's syndrome patients // Mutat. Res. 1989. - V.214. - P.215-222.

61. Kyoizumi S., Akiyama M., Hirai Y.et al. Spontaneous loss alteration of antigen receptor expression in mature CD4+ T-cells // J. Exp. Med. 1990. - V.171. -P.1981-1999.

62. Kyoizumi S., Akiyama M., Umeki S. et al. Frequency of mutant T lymphocyted defective in the expression of the T-cell antigen receptor gene among radiation-exposed people // Mutat. Res. 1992. - V.265. - P. 173180.

63. Kyoizumi S., Akiyama M., Cologne J.B. et al.Somatic cell mutations at the glycophorin A locus in erythrocytes of atomic bomb survivors: implications for radiation carcinogenesis// Radiat. Res. 1996. - V. 146. - P. 43-52.

64. Kyoizumi S., Kusunoki Y., Seyma T. et al. In vivo somatic mutations in Werner's syndrome //Hum. Genet. 1998. - V.103. -N. 4. - P. 405-410.

65. Langlois R.G., Bigbee W.L., Jensen R.H. Flow cytometric characterization of normal and variant cells with monoclonal antibodies specific for glycophorin A // J.Immunol. 1985. -V.134. - P.4009-4017.

66. Langlois R.G., Bigbee W.L., Jensen R.H. et al. Evidence for increased in vivo mutation and somatic recombination in Blooms syndrome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. -V.86. -P.670-674.

67. Langlois R.G., Nisbet B.A., Bigbee W.L. et al. An improved flow cytometric assay for somatic mutation at the Glycophorin A locus in humans // Cytometry. 1990. - V.l 1. -P.513-521.

68. Langlois R.G., Akiyama M., Kusunoki Y. et al. Analysis of somatic cell mutations at the Glycophorin A locus in atomic bomb survivors: a comparative study of assay methods // Radiat. Res. -1993. V.l 36 - P.l 11117.

69. Lee J.M., Abrahamson J.L., Kandel R. et al. Susceptibility to radiation-carcinogenesis and accumulation of chromosomal breakage in p53 deficient mice // Oncogene. 1994. - V.9. - P.3731-3736.

70. Lichtarev I.A., Sobolev B.G., Kairo I.A. et al. Thyroid cancer in the Ukraine// Nature. 1995. - V. 365. - P.365.

71. Lin Y.W., Kubota M., Hirota H. et al. Somatic cell mutation frequency at the HPRT, T-cell antigen receptor and glycophorin A loci in Cockayne syndrome // Mutat. Res. 1995. - V.337. - P.49-55.

72. Little J.B. Radiation-induced genomic instability // Int. J. Radiat. Biol. -1998. V.l A. - N.6. - P.663-671.

73. Little J.B. Radiation carcinogenesis // Carcinogenesis. 2000. - V.21. -N.3. -P.397- 404.

74. Menichini P., Abbondandolo A. Somatic cell mutation in humans // New Horizons in Biological Dosimetry. New York: Wiley-Liss, Inc., 1991. -P.267-279.

75. Morley A.A., Grist S.A., Turner D.R. et al. Molecular nature of in vivo mutations in human cells at the autosomal HLA-A locus // Cancer Res. -1990. V.50. - P.4584-4587.

76. Mothersill C. and Seymour C.B. Mechanisms and implications of genomic instability and other delayed effects of ionizing radiation exposure // Mutagenesis. 1998. - V.13. - N.5. - P. 421-426.

77. Mothersill C. and Seymour C.B. Radiation-induced bystander effectcs, carcinogenesis and models // Oncogene. 2003. - V.22. - N. 451. - P.7028-7033.

78. Moysich K.B., Menezes R.J., Michalec A.M. Chernobyl-related ionizing radiation exposure and cancer risk: an epidemiological review // Lancet Oncol. 2002. - V.3. - N.5. - P. 269-279.

79. Nagataki Sh. Delayed effects of atomic bomb radiation on the thyroid // Radiation and Thyroid/ Ed. Nagataki Sh. Excerpta Medica: Amsterdam-Tokyo, 1989.-P. 1-10.

80. Rached E., Schindler R., Beer K.T. No predictive value of the micronucleus assay for patients with severe acute reaction of normal tissue after radiotherapy // European J. of Cancer. 1998. - V.34. -N.3. - P.378-383.

81. Renan M.J. How many mutations are required for tumorogenesis? Implications from human cancer data // Mol. Carcinogenesis. 1993. - V.7. -P.139-146.

82. Robbins J., Adam W.H. Radiation effects in the Marshall Islands // Radiation and Thyroid/ Ed. Nagataki Sh. Excerpta Medica: Amsterdam-Tokyo, 1989.-P.l 1-16.

83. Ron E., Modan В.,Preston D. et al. Thyroid neoplasia following low-dose radiation in childhood // Radiat.Res. 1989. - V. 120. - P.516-527.

84. Schneider A.B. Radiation-related thyroid cancer// A fundamentall and clinical text, 5th ed., Ingbar S.H. Braverman L.E., eds. Philadelphia: J.B. Lippincott, 1986. - P.801-806.

85. Tates A.D., Bernini L.F., Natajaran A.T. et al. Detection of somatic mutations in man: HPRT mutations in lymphocytes and hemoglobin mutations in erythrocytes // Mutat. Res. 1989. - V.213. - P.73-82.

86. Trott K.R., Jamali M., Manti L., Teibe A. Manifestation and mechanisms of radiation-induced genome instability in V79 Chinese hamster cells // Int. J. Radiat. Biol. 1998. - V.74. - N.6. - P.787-791.

87. Tucker J.D., Tawn E.J., Holdsworth D. Biological dosimetry of radiation workers at the Sellafild nuclear facility// Radiat. Res. 1997. -V. 148.-P.216-226.

88. Ullrich R.L., Ponnaiya B. Radiation-induced instability and its relation to radiation carcinogenesis// Int. J. Radiat. Biol. 1998. - V.74. - N.6. -P.747-754.

89. Vershenya S., Biko J., Drozd V. et al. Dose response for T-cell receptor (TCR) mutants in patients repeatedly treated with 1311 for thyroid cancer // Mutat. Res. 2004. - V.548. - P.27-33.

90. Wishkerman V.Y., Quastel M.R., Douvdevani A. et al Somatic mutations at the glycophorin A (GPA) locus measured in red cells of Chernobyl liquidators who immigrated to Israel // Environ. Health Perspectives. 1997.-V. 105. - Suppl.6. -P.1451-1454.

91. Wong F.L., Boice JD Jr, Abramson D.H. et al. Cancer incidence after retinoblastoma: radiation dose and sarcoma risk// JAMA. 1997. - V.278. -P. 1262 -1267.

92. Wright E.G. Radiation-induced genomic instability in haemopoietk cells // Health effects of low dose radiation. London: ENES, 1997. - P.27-32.