Генные мутации в соматических клетках человека IN VIVO: радиобиологические закономерности

Замулаева, Ирина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генные мутации в соматических клетках человека IN VIVO: радиобиологические закономерности
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Генные мутации в соматических клетках человека IN VIVO: радиобиологические закономерности"

На правах рукописи

ЗАМУЛАЕВА Ирина Александровна

ГЕННЫЕ МУТАЦИИ В СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА Ш УУО: РАДИОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ

03.00.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Обнинск - 2004 г.

Работа выполнена в ГУ Медицинском радиологическом научном центре Российской академии медицинских наук.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Саенко А.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Коноплянников А. Г. доктор биологических наук, профессор Пелевина И.И. доктор биологических наук, профессор Спитковский Д.М.

Ведущая организация: Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, 117977 Москва, ул. Косыгина, д. 4.

Защита состоится 2004г. в II00 час.

на заседании совета Д001.011.01 в ГУ Медицинском радиологическом научном центре РАМН (0249036, Калужская область, г. Обнинск, ул. Королева, д. 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Медицинского радиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

В.А. Куликов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Достигнутые в прошлом веке успехи в исследовании радиационно-индуцированного мутагенеза в соматических клетках человека in vivo были сделаны, главным образом, благодаря изучению структурных мутаций в лимфоцитах периферической крови. За многолетний период использования цитогенетических методов накоплен огромный материал об индукции хромосомных аберраций в разнообразных радиационных ситуациях и их последующей элиминации. Как свидетельствует анализ данных литературы, генные мутации исследованы в этом отношении несравненно хуже. Следует отметить недостаточность или отсутствие сведений об основных радиобиологических закономерностях возникновения генных мутаций в соматических клетках облученных лиц - о зависимости доза-эффект, о влиянии мощности радиационного воздействия, о возможных эффектах малых доз ионизирующих излучений, о возможном формировании нестабильности генома в отдаленные сроки после облучения. В то же время выяснение этих вопросов представляется весьма актуальным для радиобиологии и радиационной медицины в силу, по крайней мере, нескольких причин.

Во-первых, существуют известные различия в механизмах формирования генных и структурных мутаций. Поэтому наши представления о соматическом мутагенезе вообще, и радиационном в частности, были бы неполны без знания радиобиологических закономерностей возникновения и элиминации генных мутаций. Во-вторых, анализ генных мутаций делает возможными регистрацию и количественную оценку небольших по размеру изменений ДНК. Исследование именно таких мутаций приобретает в последнее время все большее значение в связи с обнаружением феномена нестабильности генома потомков облученных клеток, который характеризуется, главным образом, небольшими по размеру изменениями ДНК (в отличие от мутаций, обусловленных непосредственным действием радиации). При этом следует отметить, что возможное проявление этого феномена на генном уровне при облучении человека практически не исследовано. В-третьих, существующие в настоящее время методы позволяют провести раздельный анализ генных мутаций в разных популяциях клеток и тем самым существенно расширить представления о соматическом мутагенезе in vivo.

Кроме того, имеются основания полагать, что исследование соматического мутагенеза в отдельных генных локусах имеет не только теоретическое, но и практическое значение — для биологической дозиметрии и выявления лиц с повышенным канцерогенным риском.

Методические возможности изучения генных мутаций в соматических клетках человека были до недавнего времени сильно ограничены сложностью, трудоемкостью, недостаточной воспроизводимостью^^ нео^нозгачностью

БИБЛИОТЕКА I С.Петербург 09 ЮОулшг(0$ >

интерпретации результатов, что связано, главным образом, с низкой частотой мутаций по отдельным локусам. Эти проблемы удалось в значительной мере преодолеть с внедрением полуавтоматических методов проточной цитометрии, которые позволяют анализировать сотни тысяч клеток за относительно небольшое время и, в конечном счете, обследовать значительные контингенты людей (Langlois et al., 1985; Kyoizumi et al., 1990). К их числу относятся методы определения частоты клеток с генными мутациями по локусам гликофорина A (glycophorin A , GPA) и Т-клеточного рецептора (Т-се11 receptor, TCR), использованные в данной работе.

Как показывают экспериментальные исследования, количество мутантных клеток в многоклеточном организме зависит не только от физических характеристик радиационного воздействия (дозы, мощности дозы, ЛПЭ и т.д.), но и - от биологических особенностей самого организма - эффективности репарации поврежденной ДНК, положительной и отрицательной селекции мутантных клеток и т. д. Есть основания полагать, что эффективность элиминации поврежденных клеток путем апоптоза также является важным фактором, определяющим количество мутантных клеток в облученном организме (Crompton et al., 2002). Однако это предположение пока не подвергалось проверке в случаях облучения человекам. В связи с этим в данной диссертационной работе проведен анализ роли апоптотической элиминации клеток с поврежденной ДНК как одного из механизмов поддержания генетической стабильности клеточных популяций после радиационного воздействия на организм человека in vivo.

Цель работы - исследование закономерностей и некоторых механизмов формирования генных мутаций в соматических клетках человека после радиационного воздействия in vivo. Основные задачи:

1. Проанализировать зависимость частоты GPA- мутантных клеток от дозы острого и пролонгированного радиационного воздействия.

2. Определить зависимость частоты TCR-мутантных клеток, от дозы пролонгированного и хронического облучения в ближайшие и отдаленные сроки после воздействия, а также возможные изменения этого показателя во времени на индивидуальном уровне (по результатам повторных обследований).

3. Оценить информативность GPA- и TCR- методов для биологической дозиметрии радиационного воздействия в различных ситуациях.

4. Провести сравнительное исследование частоты клеток с мутациями по двум указанным локусам у необлученных контрольных доноров и лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения в малых дозах,

включая» жителей загрязненных радионуклидами территорий РФ и ликвидаторов аварии на ЧАЭС, облученных в дозах до 0,25 Гр.

5. Исследовать влияние возраста в момент радиационного воздействия на частоту TCR-мутантных клеток у ликвидаторов аварии на ЧАЭС и жителей загрязненных радионуклидами территорий РФ.

6. Оценить возможность использования показателей соматического мутагенеза (частоты GPA- и TCR-мутантных клеток) в целях формирования группы лиц с повышенным риском возникновения злокачественных новообразований.

7. Провести сравнительное исследование частоты TCR-мутантных клеток и индивидуального уровня апоптоза лимфоцитов после облучения in vitro у лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения в малых дозах.

Научная новизна. Полученные в работе результаты и сделанные на их основе выводы существенно расширяют представления о генетических последствиях действия ионизирующих излучений на соматические клетки человека. Ряд радиобиологических закономерностей соматического мутагенеза в клетках человека in vivo установлен в работе впервые. В частности, при исследовании генных мутаций получены новые данные о зависимости доза — эффект радиационного воздействия с разной мощностью, о генотоксическом действии радиации в малых дозах, о влиянии возраста в момент облучения на количество мутантных клеток.

В работе впервые проанализирован характер колебаний во времени частоты TCR-мутантных клеток у лиц, подвергшихся облучению в малых дозах, а также проведено сопоставление частоты клеток, несущих мутации по разным локусам, и уровня апоптотической гибели поврежденных клеток. Это позволило изучить ряд закономерностей и возможные причины изменения количества мутантных клеток в отдаленные сроки после облучения, включая феномен нестабильности генома потомков облученных клеток. Практическая значимость. Полученные в работе результаты позволяют оценить информативность двух методов определения генных мутаций для биологической дозиметрии в разные сроки и после разных типов радиационных воздействий. Проведенные исследования выявили ряд ограничений, связанных с возможным их применением с целью дозиметрии. В частности, установлена низкая информативность GPA-теста при пролонгированном облучении. Определены временные рамки возможного использования TCR-метода для дозиметрии - в течение не более 4-х лет после облучения и другие ограничения. Установленные рамки применения имеют важное значение для корректного использования указанных методов для биодозиметрии в дальнейшем.

Результаты обследования пациентов с доброкачественными и злокачественными новообразованиями подтвердили предположение о возможности и перспективности выявления лиц с повышенным канцерогенным риском, основываясь на высокой частоте клеток с генными мутациями по GPA-и TCR-локусам. Учет исследованных в работе показателей соматического мутагенеза имеет важное практическое значение для целенаправленного проведения профилактических мероприятий и раннего выявления онкологических заболеваний среди лиц, подвергшихся действию ионизирующих излучений, в том числе в малых дозах. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение частоты клеток с генными мутациями на единицу дозы зависит от режима (острый/пролонгированный) радиационного воздействия на организм человека. Проведение биологической дозиметрии на основе анализа генных мутаций возможно после облучения в достаточно высоких дозах и более эффективно в случае острого воздействия.

2. Динамика проявления радиационно-индуцированных мутаций по разным локусам различается.

3. В отдаленные сроки после действия радиации в малых дозах отмечается высокая частота клеток с генными мутациями, что, вероятно, свидетельствует о нестабильности генома соматических клеток. Признаки генетической нестабильности наблюдаются не у всех облученных лиц и не во всех популяциях соматических клеток.

4. Повышение частоты клеток с генными мутациями у ликвидаторов аварии на ЧАЭС, облученных в дозах до 0,25 Гр, не связано с нарушением элиминации поврежденных клеток путем апоптоза.

5. Частота соматических клеток с генными мутациями, вероятно, может являться критерием для формирования группы лиц с повышенным канцерогенным риском.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы отражены в 31 публикации и доложены на International conference on biodosimetry and 5th International symposium on ESP dosimetry and application (Moscow-Obninsk, 1998); Международном конгрессе "Энергетика- 3000" (Обнинск, 1998г.); V Всероссийском онкологическом съезде (Казань, 2000г.); III и IV съездах по радиационным исследованиям (Москва, 1997, 2001г.); Международном научном форуме «Онкология на рубеже XXI века. Возможности и перспективы» (Москва, 1999); Международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций» (Москва, 2002); III съезде по радиационным исследованиям (Киев, 2003 г.); The first Nagasaki Symposium

of International Consortium for Médical Care of Hibakusha and Radiation Life Science (Nagasaki, 2003).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав «Обзор литературы», «Материалы- и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов исследования», заключения, выводов и списка литературы, включающего 366 источников. Работа изложена на 282 страницах, включая 40 рисунков и 31 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования являлись клетки периферической крови контрольных доноров, лиц, подвергшихся действию ионизирующих излучений в различных ситуациях, и онкологических больных.

Группу контроля составили практически здоровые лица, не подвергавшиеся зарегистрированным генотоксическим воздействиям, включая радиационное, вследствие выполнения профессиональных обязанностей или проживания на радиационно-загрязненной территории. С помощью TCR-метода обследовано 188 контрольных лиц, с помощью GPA - 55. Указанные лица являлись основой для формирования нескольких подгрупп возрастного контроля.

После радиационного воздействия частота мутантных клеток по TCR-локусу определена у 538 лиц, по GPA-локусу - у 251. Причины облучения были разнообразны - участие в ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, выполнение профессиональных обязанностей на предприятиях атомной промышленности, случайное облучение и проживание на радиационно-загрязненных территориях РФ. Для части лиц были известны индивидуальные дозы радиационного воздействия, любезно предоставленные сотрудниками клиники №6 Федерального научного центра - Института биофизики (г. Москва), Российского государственного медико-дозиметрического регистра (РГМДР, г. Обнинск), ГНЦ Физико-энергетического института (г. Обнинск). Дозы облучения большинства ликвидаторов аварии на ЧАЭС были выяснены по справкам, выданным дозиметрической службой «Укрытие».

Частота мутантных клеток определена также у больных раком гортани и гортаноглотки до лечения: у 83 человек - с помощью TCR-метода, у 25 - с помощью GPA-теста. Пациенты были госпитализированы в отделение лучевого и хирургического лечения заболеваний верхних дыхательных путей МРНЦ РАМН в период с 1996 по 1998 г. Диагноз был подтвержден морфологически у всех больных.

Таким образом, у 331 лица определена частота GPA-вариантных эритроцитов, у 809 лиц - частота TCR- мутантных лимфоцитов. У 123 лиц оба

показателя определены одновременно. Общая численность лиц, обследованных нами с помощью указанных тестов, составила 1017 человек.

Для идентификации мутантных клеток и определения их частоты использованы методы проточной цитометрии, основанные на выявлении изменений белковых продуктов вследствие мутаций в соответствующих генах. Выявленные клетки часто называют «вариантными», подчеркивая тем самым то, что их идентификация основана на анализе фенотипа, а не генотипа. В литературе встречается также и термин «мутантные» клетки, поскольку во многих случаях получены доказательства изменения ДНК в соответствующих локусах таких клеток. В данной диссертационной работе используется и тот, и другой термин.

Определение частоты клеток с мутациями по TCR - локусу TCR-метод основан на использовании моноклональных антител, меченных разными флуор охр омами, к CD3 и СD4-антигенам. Как известно, на поверхности Т-лимфоцитов экспрессирован комплекс Т-клеточного рецептора и СD3-антигена. Так как TCR-гены функционально гемизиготны, на поверхности лимфоцитов представлены продукты только одного аллеля. Мутация в функционирующем аллеле приводит к тому, что CD3 комплекс не экспрессируется на поверхности Т-лимфоцита.

Частоту мутантных клеток определяли с помощью проточной цитометрии как отношение числа клеток с фенотипом CD3-CD4+ к числу CD3+CD4+клеток по методике Kyoizumi S. et al., 1992, с небольшими модификациями. В работе использовали соответствующие моноклональные антитела производства «Becton Dickinson Immunocytometry Systems» - "BDIS", США. Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Vantage ("BDIS", США), оборудованном 488 нм лазером (Enterprise 621, Coherent Inc., США) со скоростью 1000-2000 кл/сек. Мощность лазера составляла 60 мВт. Компьютерную обработку проводили с использованием профаммы Lysys II ("BDIS", США).

Определение частоты клеток с мутациями по GPA- локусу Для проведения анализа пригодны образцы крови только гетерозиготных по этому локусу доноров, которые составляют около 50% популяции. На поверхности эритроцитов гетерозиготных доноров представлены обе аллельные формы гликофорина А - М и N. В настоящее время разработаны методы получения антител к указанным формам гликофорина А и последующего их выявления с помощью флуоресцентных красителей. Принято считать, что мутации в генах, кодирующих гликофорин А, приводят к потере представительства соответствующего гликопротеина на поверхности эритроцитов. В случае мутации N-аллеля на поверхности клетки будет обнаруживаться только гликофорин М и наоборот. Проточноцитометрический

анализ позволяет определять число эритроцитов, потерявших способность связывать одно из антител вследствие мутации в соответствующем аллеле гена, и, таким образом, оценивать частоту мутантных клеток.

В данной работе использовали так называемый BR-6 метод,

разработанный в 1990 году Langlois et al. и позволяющий определять потерю экспрессии М-формы гликофорина А. При этом были идентифицированы фенотипически различные варианты: гемизиготные N0 и гомозиготные NN клетки, различающиеся по интенсивности связывания антител к N-форме гликофорина А. Частоту вариантных эритроцитов определяли как отношение количества N 0 - или NN-клеток к количеству клеток с фенотипом M N.

В работе были использованы моноклональные антитела к N-форме (клон BRIC 157) и М-форме гликофорина А (клон 6А7, «International Blood Group Reference Laboratory», UK). Первые предварительно конъгировали с флуоресцеинизотиоционатом, вторые - биотинилировали по стандартным протоколам. Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре FACS Vantage ("BDIS", США), оборудованном 488 нм лазером (Enterprise 621, Coherent Inc., США) со скоростью 2000-2500 кл/сек. Мощность лазера составляла 100 мВт. Компьютерную обработку проводили с использованием программы Lysys II ("BDIS", США).

Определение апоптотической гибели лимфоцитов после гамма-облучения in vitro

Метод основан на том, что в клетках, подвергающихся апоптотической гибели, появляется фрагментированная ДНК, которая удаляется из клеток путем экстракции раствором НС1. Затем оставшуюся в клетках ДНК окрашивают иодистым пропидием и определяют поклеточное содержание ДНК. Апоптотическую гибель клеток оценивают по доле клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК.

В данной работе выделенные с помощью центрифугирования лимфоциты культивировали в течение 24ч в полной среде RPMI-1640 («Панэко», РФ), затем облучали гамма-лучами 60Со в разных дозах (0,5-5,0 Гр), культивировали еще 24 ч, фиксировали в 70% этаноле, обрабатывали 0,6 М НС1, окрашивали раствором иодистого пропидия (Sigma, США) в конечной концентрации 50 мкг/мл. С помощью проточной цитометрии анализировали поклеточное содержание ДНК и определяли долю клеток без признаков апоптотической гибели. Далее определяли зависимость этого показателя от дозы облучения, вычисляя параметры линейной регрессии: ln(P)=a+bD,

где D - доза облучения, Гр; Р - доля клеток без признаков апоптоза при облучении в соответствующей дозе; а и b - коэффициенты уравнения регрессии, определяемые методом наименьших квадратов. Значение коэффициента /b/

характеризует радиочувствительность изучаемых клеток, т.е. способность облучения вызывать апоптоз лимфоцитов в течение 24 часов инкубации в питательной среде: Параметры линейной регрессии были вычислены отдельно для каждого обследованного.

Статистическая обработка результатов выполнена стандартными методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Частота мутантных клеток в контрольной группе Частота ТСЯ-мутантных лимфоцитов исследована у 188 контрольных лиц в возрасте от 14 до 68 лет. Установлена статистически значимая корреляция этого показателя с возрастом (рис.1).

Частота ОРЛ-мутантных клеток, определенная у 55 контрольных лиц в возрасте от 13 до 70 лет, также прямо пропорционально возрастала с возрастом (Я=0,34, р=0,01 для, КО-эритроцитов; Я=0,35, р=0,01 для КК-клеток). Зависимость между частотой КО-мутантных клеток и возрастом может быть описана уравнением линейной регрессии У= 7,91+0,25Х, где У -

частота мутантных клеток, хЮ"*; X - возраст доноров (число лет). Таким образом, увеличение частоты мутантных клеток по исследованным локусам составляет примерно 3% в год от исходного значения.

Анализ частоты мутантных клеток в зависимости от дозы, мощности дозы и сроков радиационного воздействия Частота GPA-мутантных эритроцитов определена у 12 лиц, подвергшихся острому облучению в различных ситуациях (при испытании ядерного оружия, в результате аварий на подводных лодках и предприятиях атомной промышленности в 1969-1986 годах), и сопоставлена с дозой воздействия. Установлена высокая корреляция между дозой острого облучения и частотой N0- вариантных эритроцитов, что подтверждает данные других авторов, исследовавших случаи острого облучения во время бомбардировки Хиросимы и ликвидации аварии на ЧАЭС (рис.2).

Из представленных на рисунке результатов можно заключить, что прирост частоты NO-вариантных клеток на единицу дозы был близок во всех исследованиях, несмотря на относительно небольшое число лиц,

обследованных в каждом их них. Это свидетельствует о высокой надежности и воспроизводимости метода. Кроме того, наше исследование подтвердило существовавшее ранее представление о способности радиационно-индуцированных GPA(NO)-мутаций сохраняться в организме длительное время, поскольку в разные сроки после облучения (от 7 лет в исследовании Jensen et al. до 40 лет в работе Kyoizumi et al.) выход мутантных клеток на единицу дозы был примерно одинаков, как и в нашем исследовании (где анализ был проведен через 9-27 лет после воздействия).

В отношении NN-вариантных клеток зависимости «доза-эффект» не установлено ни в нашей, ни в других работах, что, по всей видимости, связано с различиями в механизмах формирования N0- и NN-вариантных клеток.

Выданной работе показано также, что частота NO-вариантных эритроцитов статистически значимо возрастает с дозой пролонгированного облучения, а частота NN-клеток, как и следовало - ожидать, с дозой не коррелирует. В частности, в обследованной нами группе 92 лиц, подвергшихся внешнему облучению при выполнении профессиональных обязанностей, ликвидации аварий на предприятиях атомной промышленности или случайно, частота NO-вариантных клеток увеличивается на 9,4'10 клеток/Гр, что примерно в три раза меньше, чем при остром облучении (рис.3).

Таким образом, полученные результаты соответствуют хорошо известной радиобиологической закономерности о влиянии мощности дозы радиационного воздействия на выход хромосомных и генных мутаций (UNSCEAR, 2000; Шевченко, 1997).

Нами были обследованы жители Жиздринского района Калужской области, которые подверглись смешанному внешнему и внутреннему радиационному воздействию вследствие проживания на загрязненной радионуклидами территории (в момент Чернобыльской аварии их возраст составлял от 0 до 8 лет, исследование выполнено в 1994 году). По оценкам, проведенным сотрудниками РГМДР, дозы облучения щитовидной железы составляли до 0,38 Гр (основная часть подверглась облучению в дозах до 0,2 Гр). Дозы были рассчитаны по методике, разработанной в РГМДР, на основе прямых измерений радиоактивности щитовидной железы, выполненных сотрудниками МРНЦ РАМН в мае 1986 года. Выход NO-вариантных клеток на единицу дозы был очень высок, составляя 36,6 10-6 клеток/Гр, что соответствует приросту количества NO-клеток при остром воздействии и более чем в 3 раза выше по сравнению с пролонгированным облучением взрослых лиц (рис.4).

С целью изучения зависимости частоты TCR-мутантных клеток от дозы облучения обследовано 255 человек, подвергшихся различным типам радиационного воздействия. Время после окончания радиационного воздействия варьировало от 0 до 40 лет. Сопоставление частоты мутантных клеток с дозой проводилось с учетом времени, прошедшего от окончания воздействия до момента анализа. Для этого все указанные лица были разделены на 5 групп в зависимости от типа, мощности радиационного воздействия и времени от его окончания до анализа.

Результаты сопоставления частоты TCR-мугантных клеток в дозой внешнего острого и пролонгированного облучения представлены в таблице 1. В отдаленные сроки (более 4-х лет) после радиационного воздействия частота мутантных лимфоцитов не коррелировала с дозой. Если время между окончанием воздействия и моментом проведения исследования не превышало 4-х лет, наблюдалось статистически значимое увеличение частоты мутантных клеток с дозой. Установлено, что выход TCR-мутантных клеток зависит от длительности радиационного воздействия. В частности, доза, удваивающая количество TCR-мутантных клеток, составляла 3,5 Гр для лиц, облучавшихся в среднем в течение 14,2 лет перед проведением анализа, и только 1,4 Гр, если радиационное воздействие продолжалось в среднем 7,6 лет. При длительном облучении в течение нескольких лет необходимо учитывать, что частота мутантных по данному локусу лимфоцитов определяется двумя процессами: возникновением новых мутантных клеток под действием радиации и элиминацией уже существующих.

Таблица 1. Результаты корреляционного анализа частоты ТСЯ-мутантных клеток и дозы внешнего радиационного воздействия в трех группах облученных лиц. _____________,_

№ груп пы Характер облучения Время от окончания облучения до анализа Доза, Гр Частота ТСЯ-мутантных клеток, х104 Число лиц Я Р

1 острое 9-40 лет 0,5-9,0 2,3-13,2 23 0,08 0,71

2 пролонги- >4 лет 0,01-4,0 0,6-20,0 116 0,07 0,46

3 рованное 0-4 года 0,02-10,0 1,9-23,9 27 0,79 <0,001

Остальные две группы составили лица, подвергшиеся смешанному внешнему и внутреннему радиационному воздействию в различных дозах и с разным распределением дозы во времени. Так. у 27 лиц, работавших на радиационно-химических предприятиях в Томске и Челябинске и являющихся носителями 239Ри, облучение было достаточно равномерным во времени вплоть до момента анализа, что обусловлено длительным - периодом полураспада этого изотопа. В указанной группе лиц частота ТСК-мутантных клеток коррелировала с содержанием радиоактивного плутония в организме (К=0,52, р=0,005). У 62 лиц, являющихся жителями Жиздринского района Калужской области и обследованных нами в 1995 году, максимальная мощность дозы облучения наблюдалась в первые дни-недели после аварии на ЧАЭС в связи с поглощением и быстрым распадом изотопов иода. В дальнейшем мощность дозы снизилась до уровня, обусловленного распадом других радиоактивных изотопов. Частоты ТСК-мутантных клеток в этой группе были сопоставлены с дозами облучения щитовидной железы, предоставленными сотрудниками РГМДР. Статистически значимой корреляции частоты ТСК-мутантных клеток с дозой облучения щитовидной железы не установлено (К=0,20, р=0,12).

Таким образом, в отдаленные сроки после окончания воздействия частота ТСК-мутантных клеток не коррелировала с дозой ни в одной группе обследованных лиц. При этом не имело значения, было ли радиационное воздействие только внешним или смешанным (внешним и внутренним). Полученные нами результаты подтверждают известный из литературы факт достаточно быстрой элиминации ТСК-мутантных клеток (АУуаша й а1., 1992; Г^ашоШ й а1., 1994), что обусловливает наличие корреляции этого показателя соматического мутагенеза с дозой облучения и с частотой GPA(NO)-вариантных эритроцитов только в близкие сроки после воздействия (рис. 5).

С разработкой методов определения генных мутаций в соматических клетках человека были предприняты попытки оценить их информативность для биодозиметрии. Как и при определении структурных мутаций, практическое использование таких методов требует точной оценки параметров калибровочной зависимости «доза-эффект» для случаев облучения с разной мощностью дозы. Кроме того, крайне важно иметь точную информацию о возможной элиминации мутантных клеток со временем после воздействия и, в соответствии с этим, корректно применять тот или другой метод в разные сроки после облучения. Данные, полученные в диссертационной работе, проясняют ряд вопросов, связанных с возможным применением ТСК- GPA-методов в целях биодозиметрии.

btf

0 I-

<0 fc

t> пз IT

Частота-TCR мутантных клеток, хЮ"4

Рис. 5. Корреляция данных двух методов определения мутантных клеток у лиц в близкие сроки после окончания радиационного воздействия (4 и менее лет) или при продолжающемся на момент исследования облучении.

Принято считать, что мутации по локусу Т-клеточного рецептора, регистрируемые в СВ4+клетках периферической крови по отсутствию связывания антител к CD3 поверхностному маркеру, возникают в зрелых лимфоцитах, прошедших дифференцировку в тимусе. Из-за естественного обновления популяции лимфоцитов время жизни мутантных клеток в организме ограничено (Umeki et al., 1992). Как показано в данной работе, количество TCR-мутантных клеток коррелирует с дозой в течение не более 4-х лет после окончания пролонгированного облучения. Поэтому TCR-метод может быть полезен для оценки дозы облучения только в ближайшие сроки после воздействия. Кроме того, выход TCR-мутантных клеток на единицу дозы зависит от длительности радиационного воздействия. Последнее обстоятельство сильно затрудняет использование этого метода для биодозиметрии, поскольку делает необходимым учет многих параметров облучения, которые зачастую неизвестны.

В отличие от TCR-метода, GPA-тест основан на оценке селективно нейтральных мутаций в долгоживущих клетках стволового типа (Cole, Skopek,

1994; АМуаша й а1., 1995). Как показано в нашем и ряде других исследований с дозой коррелирует только частота КО-вариантных клеток. Поэтому в принципе только этот показатель и можно использовать для биодозиметрии. Результаты, полученные в диссертационной работе, подтверждают надежность вРА-метода и свидетельствуют о возможности его использования для биодозиметрии острого облучения как в ближайшие, так и в отдаленные сроки после воздействия. По нашим данным порог чувствительности этого метода составляет примерно 0,5 Гр при проведении групповой дозиметрии острого облучения. Индивидуальная дозиметрия возможна при облучении в дозах более 1 Гр. В случае пролонгированного облучения, как отмечалось выше, выход вРА(КО)-вариантных клеток на единицу дозы примерно в три раза меньше, чем при остром воздействии. При наличии достаточно выраженной индивидуальной вариабельности, это приводит к снижению чувствительности метода. По всей видимости, он может быть использован только при групповой дозиметрии пролонгированного облучения в дозах больше 1,0-1,5 Гр.

Оценка влияния ионизирующего излучения в малых дозах на частоту клеток с генными мутациями Обследованию подвергались два основных контингента: ликвидаторы аварии на ЧАЭС (дозы облучения до 0,25 Гр) и жители нескольких загрязненных радионуклидами областей России. Причем первые были обследованы спустя 9-17лет после радиационного воздействия, вторые - через 8-16 лет постоянного проживания на загрязненной в результате Чернобыльской аварии территории.

Частота вРА-вариантных эритроцитов определена у 224 лиц, подвергшихся облучению в различных ситуациях. Как показано в таблице 2, были исследованы образцы крови взрослых и детей до 18 лет на момент анализа, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях Калужской, Брянской и Тульской областей. Ни в одной группе средняя частота N0- и КК-вариантных клеток не отличалась от таковой в соответствующем возрастном контроле (р>0,05 по 1- критерию).

В то же время частота ТСК-мутантных клеток была статистически значимо повышена по сравнению с соответствующим контролем во всех обследованных нами группах лиц, подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах. При этом следует отметить, что эти группы отличались друг от друга по многим параметрам: и по средней дозе, и по мощности дозы радиационного воздействия, и по времени с момента его прекращения до проведения нашего исследования, и по возрасту облученных лиц. Обследованные после облучения

Таблица 2. Частота вариантных эритроцитов у лиц, подвергшихся дейсгвию ионизирующего излучения в дозах до 0,25 Гр.__

Обследованные лица Число лиц Средняя доза облучения ± SD, Гр Средний возраст на момент обследования ±SD, лет Средняя частота вариантных клеток ±SD, хЮ"6

NO NN

Контрольная . группа 33 - 42,2 + 14,4 18,8 ±15,6 13,6 ±9,1

Жители Клинцовского р-на Брянской области 68 * 39,7 ± 8,8 19,5 ±14,1 15,8 ± 12,3

Ликвидаторы аварии на ЧАЭС 71 0,13 ±0,08 46,7 ± 8,2 21,3 ±23,2 12,5 ±18,7

Сотрудники ГНЦ ФЭИ 12 0,08 ±0,04 40,2 ± 7,0 18,7 ± 12,2 19,3 ± 13,5

Контрольная группа 22 - 14,8 ±1,4 11,4 ±7,2 9,1 ± 5,8

Жители загрязненных территорий 73 »* 13,4 ±2,8 12,3 ±7,1 8,2 ± 10,1

* Средняя доза, накопленная жителями этого района за период с 1986 по 2000 год, составляет 11,8мГр (по данным Иванова В.К., Цыба А.Ф., 2002). ** Плотность загрязнения места проживания 137 Cs составляет 91-855КБк/м2 (по данным справочника под ред. М.И.Балонова, И.А.Звоновой, 2002, с учетом конкретных населенных пунктов, где проживали обследованные лица).

в малых дозах лица (N= 391) были разделены на 3 группы, как более подробно описано ниже.

В 2001-2003 годах исследована частота клеток с мутациями по TCR-локусу у 108 постоянных жителей Жиздринского района Калужской области, подвергшихся радиационному воздействию in utero в первые дни-месяцы после Чернобыльской аварии, а затем и в постнатальном периоде. Контрольную группу составили 43 донора сходного возраста, которые проживали на незагрязненной радионуклидами территории РФ и не имели зарегистрированного контакта с генотоксическими факторами. Средняя частота (±SD) TCR-мугантных клеток в группе жителей Жиздринского района составила (4,0±2,0) 10"4, что статистически значимо выше этого показателя у контрольных лиц - (2,7±1,2) 10"4 (р=0,03). При этом в 22% образцов крови

жителей Жиздринского района частота TCR-муташтшых клеток превышала 95% доверительный интервал, установленный для данной контрольной группы.

С помощью TCR-метода были исследованы также образцы крови 99 жителей Клинцовского района Брянской области (возраст в момент обследования в 2002 году составлял в среднем 41 год) и 86 контрольных лиц. (средний возраст 40 лет). Показано статистически значимое увеличение средней частоты ТСЯ-мутантных клеток в первой группе: (4,4±2,3)'10"4 Ув (3,б±1,5)'Ю"4 соответственно (р=0,01). У 11% лиц частота TCR-муташтшых клеток была повышена, т.е. превышала 95% доверительный интервал, установленный для данной контрольной группы.

Третью группу составили 184 ликвидатора аварии на ЧАЭС через 9-17 лет после радиационного воздействия в дозах до 0,25 Гр (среднее значение 0,12 Гр). Контрольная группа была сформирована из 126 необлученных лиц сходного возраста, обследованных в тот же промежуток времени, что ликвидаторы, т.е. в период с 1995 по 2003 год. Средняя частота (± 8Б) ТСЯ-мутантных клеток составила в группе ликвидаторов в контрольной группе -

(3,8±1,4) 1<Г4 (рис.6).

Расчеты по критериям Манн-Уитни и Стьюдента свидетельствуют о статистически значимом увеличении частоты ТСЯ-мутантных клеток в группе ликвидаторов по сравнению с контролем (р<0,01). У 31 из 184 (16,8%) ликвидаторов отмечена повышенная частота ТСЯ-мутантных клеток, превышающая 95% доверительный интервал, установленный для данной контрольной группы, т.е. выше 6,5 10"4. Если лиц с повышенными частотами исключить из группы ликвидаторов и контрольной группы, то среднее значение частоты ТСЯ-мутантных клеток составит (3,8±1,2) 10"4 и (3,6±1,3) 10"4 соответственно (р>0,05 по любому критерию). Следовательно, повышение частоты ТСЯ-мутантных клеток в общей группе ликвидаторов объясняется наличием лиц с высокими значениями этого показателя.

Далее был проведен анализ стабильности полученных результатов во времени. При этом использовали два подхода. Во-первых, проведено сравнение частоты ТСЯ-мутантных клеток в подгруппах ликвидаторов, обследованных через 9-11, 12-14 и 15-17 лет после радиационного воздействия, с контрольным уровнем. Установлено, что средняя частота мутантных клеток в указанных подгруппах ликвидаторов выше в 1,4, 1,3 и 1,4 раза соответственно, чем в группах контрольных лиц сходного возраста, обследованных в то же самое время, т.е. в течение 1995-1997, 1998-2000, 2001-2003 годов. Количество лиц с повышенными частотами ТСЯ-мутантных клеток было также примерно одинаково в подгруппах ликвидаторов, обследованных в разные сроки после облучения, и составило 16,8,15,3 и 21,6% соответственно.

Во-вторых, проанализировано возможное изменение частоты ТСЯ-мутантных клеток на индивидуальном уровне по результатам многократного обследования одних и тех же лиц на протяжении 9 лет. Установлено, что у большинства ликвидаторов частота мутантных клеток не изменялась или несколько увеличивалась (рис.7).

1_| увеличение со временем

сохранение на одном уровне уменьшение со временем I I разнонаправленные изменения

27%

Рис. 7. Результаты многократного исследования частоты ТСЛ-мутантных клеток у ликвидаторов аварии на ЧАЭС: распределение обследованных лиц по характеру изменений изучаемого показателя соматического мутагенеза.

Таким образом, выполненный двумя способами анализ возможных изменений частоты TCR-мутантных клеток у ликвидаторов Чернобыльской аварии со временем после воздействия свидетельствует о стабильности изучаемого показателя соматического мутагенеза в течение 9-17 лет после облучения.

Установлено отсутствие монотонной зависимости частоты TCR-мутантных клеток от дозы облучения ликвидаторов (рис.8) и корреляции с мощностью дозы радиационного воздействия (данные не показаны).

В работе проанализировано влияние возраста при радиационном воздействии в малых дозах на частоту TCR-мутантных клеток. Ниже приведены данные, полученные для ликвидаторов (рис.9). Из 184 обследованных 173 человека находились в возрасте 20-60 лет в момент радиационного воздействия. В соответствии с возрастом они были разделены на четыре подгруппы с 10-летним интервалом (средние дозы облучения в этих подгруппах статистически значимо не отличались). Средняя частота TCR-мутантных клеток в группе наиболее молодых ликвидаторов была статистически значимо выше таковой в соответствующем возрастном контроле.

20-30 лет 31-40 лет 41-50 лет 51-60 лет Возраст ликвидаторов в момент радиационного воздействия

Рис. 9. Средняя частота ТСЯ-мутантных клеток в подгруппах ликвидаторов аварии на ЧАЭС, различающихся по возрасту в момент радиационного воздействия, и контрольных лиц сходного (в момент обследования) возраста. *р=0,03 по сравнению с контролем (по ^критерию).

Другие подгруппы ликвидаторов не отличались по этому показателю от контроля. Обращает на себя внимание, что доля ликвидаторов с повышенной частотой мутантных клеток уменьшается с увеличением возраста на момент облучения. Так, в подгруппе ликвидаторов, подвергшихся радиационному воздействию в возрасте 20-30 лет, было выявлено около 19% лиц с повышенной частотой мутантных клеток, а в подгруппе «51-60 лет» - только 9%.

С нашей точки зрения, результаты TCR-обследования ликвидаторов аварии на ЧАЭС (через много лет после прекращения радиационного воздействия) допускают достаточно однозначную интерпретацию. Учитывая:

1) особенности формирования TCR-мутаций, выявляемых с помощью использованного метода, в популяции лимфоцитов, прошедших дифференцировку в тимусе,

2) данные о достаточно быстрой элиминации клеток с радиационно-индуцированными TCR-мутациями вследствие естественного обновления популяции зрелых лимфоцитов,

3) продолжительность времени, прошедшего с момента облучения (9-17 лет),

4) несоответствие очень высокой частоты мутантных клеток, обнаруженной у части ликвидаторов, с дозой облучения до 0,25 Гр,

можно сделать заключение, что повышение частоты TCR-мутантных клеток у ликвидаторов не является следствием непосредственного действия радиации на лимфоциты во время облучения. По всей видимости, наблюдаемые нами мутантные клетки сформированы de novo в отдаленные сроки после воздействия вследствие нестабильности генома, возникшей под действием ионизирующего излучения у потомков облученных клеток.

В работе выявлены следующие закономерности проявления этого феномена в отдаленные сроки после облучения в малых дозах:

-селективный характер в отношении разных клеток организма: повышение частоты мутантных лимфоцитов и сохранение на уровне контроля количества мутантных гемопоэтических клеток стволового типа, о котором судили по количеству NO-вариантных эритроцитов;

-отсутствие монотонной зависимости эффекта от дозы и мощности дозы радиационного воздействия;

-сохранение эффекта (повышенной частоты TCR-мутантных лимфоцитов) на стабильном уровне в течение 9-17 лет после радиационного воздействия; -проявление этого феномена только у части облученных лиц;

-зависимость проявлений феномена генетической нестабильности от возраста в момент облучения.

Исследование апоптотической элиминации поврежденных лимфоцитов и влияния этого процесса на количество TCR-мутантных клеток Повышенная частота мутантных клеток в отдаленные сроки после облучения может быть обусловлена как высокой частотой мутаций вследствие нестабильности генома, возникшей у потомков облученных клеток, так и нарушением механизмов элиминации клеток с поврежденной ДНК. В данной диссертационной работе исследована также реальность второго объяснения. С этой целью проведено сопоставление абсолютного значения коэффициента /b/, характеризующего радиочувствительность лимфоцитов в отношении апоптоза, с частотой TCR-мутантных клеток у 38 ликвидаторов аварии на ЧАЭС через 15-17 лет после облучения. Данные лица были поделены на две группы в зависимости от значения коэффициента /Ь/ (таблица 3). В результате

сравнительного анализа установлено, что из 7 ликвидаторов с низкой величиной /Ь/ у пяти наблюдаются частоты мутантных клеток, превышающие 95% доверительный интервал, установленный для контрольной группы. Повышенные частоты мутантных клеток встречались статистически значимо чаще среди лиц с низким уровнем апоптоза клеток в ответ на радиационное повреждение, чем с более высоким.

Таблица 3. Сопоставление частоты TCR-мутантных клеток и апоптотической гибели лимфоцитов после облучения in vitro у ликвидаторов, получивших малые дозы облучения.

Абсолютное значение коэффициента !Ы Частота мутантных клеток (хЮ"4) Р

более 6,5 менее 6,5

более 0,038 7 24 0,02

менее 0,038 5 2

* (в таблице указано число обследованных)

Следует также отметить, что из 12 ликвидаторов с высокой частотой ТСЯ-мутантных клеток низкий уровень апоптоза имели только пять человек. Таким образом, у большинства ликвидаторов повышение частоты клеток с генными мутациями не связано со снижением апоптотической элиминации поврежденных клеток. В целом, наши результаты свидетельствуют о том, что низкий уровень апоптоза поврежденных клеток может являться фактором увеличения количества ТСЯ-мутантных лимфоцитов у некоторой части ликвидаторов, что согласуется с представлениями о важной роли апоптоза как механизма поддержания генетической стабильности клеточных популяций. Однако у большинства лиц повышение частоты лимфоцитов с генными мутациями не связано со снижением эффективности процесса апоптоза, а обусловлено другими причинами, что еще раз подтверждает сделанное нами заключение об индукции генетической нестабильности в этих клетках.

Высокая частота мутантных клеток как показатель повышенного риска возникновения онкологических заболеваний У подавляющего большинства исследователей не вызывает сомнений, что мутации играют ключевую роль в канцерогенезе. Имеющиеся в литературе данные позволили предположить, что повышенная частота клеток с мутациями

в генах, даже не связанных с канцерогенезом, может указывать на увеличение риска развития злокачественных новообразований. С целью косвенной проверки этого предположения в данной работе проведен сравнительный анализ частоты клеток, несущих мутации по TCR- и GPA-локусам, у пациентов с доброкачественными или злокачественными новообразованиями до лечения и здоровых лиц сходного возраста.

С помощью TCR-теста обследовано 83 больных раком гортани и гортаноглотки (средний возраст 53,0 года), а также 82 здорового лица (средний возраст 51,8 лет). Расчеты по критерию Вилкоксона показали, что частота TCR-мутантных клеток у онкологических больных статистически значимо выше, чем у контрольных здоровых лиц (р<0,01; рис. 10).

При этом у 33% больных частота TCR-мутантных клеток превышала верхнюю границу 95% доверительного интервала, установленного для контрольной группы. Аналогичные данные получены в отношении частоты GPA(NO)-вариантных клеток в группах больных раком гортани и гортаноглотки (N=25) и здоровых лиц (N=25) (р=0,01). Частота NN-вариантных клеток в сравниваемых-группах статистически значимо не отличалась.

Увеличение частоты клеток, несущих мутацию в генах, не связанных непосредственно с канцерогенезом, у онкологических больных по сравнению со здоровыми лицами, очевидно, может быть обусловлено несколькими причинами. Повышенное количество мутантных клеток может свидетельствовать о генотоксическом воздействии на организм пациента в прошлом, что является важным фактором увеличения канцерогенного риска, поскольку большинство мутагенов является также и канцерогенами. С другой-стороны, повышенная частота мутаций может быть обусловлена наследственными особенностями, приводящими к нестабильности генома, что хорошо продемонстрировано при исследовании больных атаксией телеангиектазией, синдромом Блума и Вернера, анемией Фанкони (Kyoizumi et al., 1990; Akiyama й al., 1995; Kyoizumi а al., 1998).

В диссертационной работе проведено также исследование частоты TCR-мутантных клеток у лиц, имеющих повышенный риск возникновения злокачественных новообразований. Эту группу составили 29 жительниц Клинцовского района Брянской области, у которых были выявлены доброкачественные новообразования различных локализаций (в основном в молочной железе, матке и щитовидной железе) по результатам обследования, проведенного сотрудниками клинического сектора МРНЦ РАМН. Установлено увеличение средней частоты мутантных по данному локусу клеток по сравнению с таковой у здоровых лиц, проживающих в том же районе (N=61) или на незагрязненной радионуклидами территории (N=86). Этот показатель (+8Б) составил (4,6+2,5) 10"4, (4,2+2,4) 10"4 и (3,6±1,5)'Ю"4 соответственно в указанных группах. Увеличение частоты мутантных клеток, наблюдаемое у лиц с доброкачественными новообразованиями, было не таким выраженным как в группе больных раком гортани и гортаноглотки, но статистически значимым по сравнению с возрастным контролем (р<0,05).

Установленное нами статистически значимое увеличение показателей соматического мутагенеза в группах лиц с доброкачественными и злокачественными новообразованиями свидетельствует о потенциальной возможности использования GPA- и TCR-методов для формирования группы повышенного канцерогенного риска.

ВЫВОДЫ:

1. Установлена прямая корреляция частоты GРА(NО)-мутантных эритроцитов и дозы радиационного воздействия. Выход мутантных клеток на единицу дозы зависит от мощности дозы облучения: при пролонгированном воздействии он примерно в три раза меньше, чем при остром.

2. Частота TCR-мутантных клеток статистически значимо коррелирует с дозой радиационного воздействия в течение не более 4-х лет после его окончания. При пролонгированном облучении выход TCR-мутантных клеток на единицу дозы зависит от длительности радиационного воздействия: с уменьшением длительности последнего, выход мутантных клеток увеличивается.

3. В близкие сроки после радиационного воздействия наблюдается прямая корреляция частоты TCR-и GРА(NO)-мутантных клеток. Частоты N0- и NN-вариантных эритроцитов не коррелируют у лиц, подвергшихся облучению в достаточно высоких дозах, вследствие разных механизмов их формирования.

4. Подтверждена возможность использования GPA-метода в целях биологической дозиметрии острого облучения как в близкие, так и в отдаленные сроки после радиационного воздействия. Установлена низкая информативность этого метода при пролонгированном, облучении, что обусловлено небольшим выходом NO-вариантных эритроцитов на единицу дозы при достаточно широкой индивидуальной вариабельности.

5. Частота GPA(NO)-мутантных клеток у лиц, подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах (до 0,25 Гр), соответствует контрольному уровню.

6. Во всех группах лиц, обследованных в отдаленные сроки после облучения в малых дозах, частота TCR-мутантных лимфоцитов статистически значимо выше таковой в группах соответствующего возрастного контроля. Имеющиеся данные позволяют расценивать этот факт как следствие радиационно-индуцированной генетической нестабильности лимфоцитов.

7. Феномен генетической нестабильности в отдаленные сроки после облучения в малых дозах характеризуется селективностью в отношении

разных клеток организма, немонотонной зависимостью от дозы и мощности дозы воздействия, стабильностью количественных проявлений феномена в течение 9-17 лет после облучения, проявлением феномена только у части облученных лиц, зависимостью развития генетический нестабильности от возраста в момент облучения.

8. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли апоптоза поврежденных клеток как механизма поддержания генетической стабильности на уровне клеточных популяций. Повышение частоты TCR-мутантных клеток у ликвидаторов аварии на ЧАЭС, подвергшихся облучению в дозах до 0,25 Гр, в большинстве случаев не связано со снижением эффективности этого процесса.

9. Статистически значимое увеличение показателей соматического мутагенеза в группах лиц с злокачественными и доброкачественными новообразованиями различных локализаций (по сравнению с соответствующим контролем) указывает на возможность использования GPA- и TCR-методов для формирования группы повышенного канцерогенного риска.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Замулаева И.А., Паршин B.C., Саенко А.С. Сравнительная оценка частоты соматических мутаций по локусу гликофорина А у жителей загрязненных радионуклидами территорий и контрольных лил// Тезисы докладов II Обнинского симпозиума по радиоэкологии. - Обнинск, 1996. - С. 215-216.

2. Замулаева И. А., Селиванова Е. И., Нугис В. Ю., Надежина Н. М., Матвеева Н.П., Каплан М. А., Саенко А. С. Использование метода определения мутаций по локусу гликофорина А для биологической дозиметрии острого и пролонгированного облучения// Тез. докладов III съезда по радиационным исследованиям. - Пущино, 1997. - Т. 2. - С. 49-50.

3. Саенко А. С, Замулаева И. А., Смирнова С. Г., Орлова Н. В., Селиванова Е. И., Матвеева Н.П., Каплан М. А., Цыб А. Ф. Определение частоты мутаций по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора: обследование ликвидаторов аварии на ЧАЭС// Радиобиология и Радиоэкология. - 1998. -Т.38.-№2.-С. 171-180.

4. Саенко А. С, Замулаева И. А., Смирнова С. Г., Орлова Н. В., Селиванова Е. И., Нугис В. Ю., Надежина Н. М. Определение частоты мутаций по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора: информативность для

биологической дозиметрии острого и пролонгированного облучения// Радиобиология и Радиоэкология. -1998. - Т.38. - №2. - С.181-190.

5. Saenko A. S., Zamulaeva I.A., Smirnova S. G., Orlova N. V., Selivanova E. I., Matveeva N.P., Kaplan M.F., Nugus V.Y., Tsyb A.F. Determination of somatic mutation frequencies of glycophorin A and T-cell receptor loci for biodosimetry of acute and prolonged irradiation// Abstracts of International conference on biodosimetry and 5 International symposium on ESP dosimetry and application. -Moscow-Obninsk, 1998. - P. 76.

6. Saenko A. S., Zamulaeva I.A., Smirnova S. G., Orlova N. V., Selivanova E. I., Matveeva N.P., Kaplan M.F., Nugis V.Y., Tsyb A.F. Determination of somatic mutation frequencies of Glycophorin A and T-cell receptor loci for biodosimetry ofprolonged irradiation// Int J. of Radiation Biology. - 1998. - V. 73. - №6. - P. 613-618.

7. Замулаева И. А., Смирнова С. Г., Орлова Н. В., Селиванова Е. И., Саенко А. С. Выявление лиц с повышенной частотой мутаций в соматических клетках как возможный способ отбора лиц, непригодных к работе, связанной с профессиональным облучением// Тезизы международного конгресса "Энергетика -3000". - Обнинск, 1998. - С.70.

8. Замулаева И.А, Виноградова Ю.Э., Орлова Н.В., Селиванова Е.И., Смирнова С.Г., Андреев В.Г., Карякин О.Б., Саенко А.С. Использование проточной цитометрии для диагностики, прогнозирования течения и эффективности лечения онкологических заболеваний// Материалы Международного научного форума «Онкология на рубеже XXI века. Возможности и перспективы». -Москва, 1999.-С. 129-130.

9. Saenko A. S., Zamulaeva I.A., Smirnova S. G., Orlova N. V., Selivanova E. I., Matveeva N.P., Kaplan M.F., Nugis V.Y., Nadezhina N.M., Tsyb A.F. Determination of somatic mutant frequencies at glycophorin A and T-cell receptor loci for biodosimetry of acute and prolonged irradiation// Applied Radiation and Isotopes. - 2000. - V.52. - P. 1145-1148.

10. Саенко А.С, Замулаева-И. А., Смирнова С.Г., Орлова Н..В., Селиванова Е.И. Механизм адаптивного повышения - резистентности лимфоцитов к апоптозу и некрозу// Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. - Калуга: «Эйдос», 2000. - С.280-289.

11. Орлова Н.В., Смирнова С.Г., Замулаева И.А., Селиванова Е.И., Андреев В.Г., Саенко А.С Уровень мутагенеза и радиационного апоптоза в соматических клетках больных раком гортани и гортаноглотки// Материалы V Всероссийского съезда онкологов «Высокие технологии в онкологии». - Казань, 2000. - Т. 1. - С.200-201.

12. Саенко А.С., Замулаева И.А Результаты и перспективы использования методов определения частоты мутантных клеток по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора для оценки генотоксического действия ионизирующих излучений в отдаленные сроки после воздействия// Радиационная биология. Радиоэкология. - 2000. - Т. 40. - №5. - С. 549-553.

13. Орлова Н.В., Смирнова С.Г., Замулаева И.А, Андреев В.Г., Рябченко Н.И., Саенко А.С. Апоптоз лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и больных раком гортани и гортаноглотки после воздействия у-излучения in vitro // Радиационная биология. Радиоэкология. -2001. -Т.41. -С.366-372.

14. Замулаева И.А., Смирнова С.Г., Орлова Н. В., Селиванова Е.И., Андреев В.Г., Саенко А.С. Повышенная частота мутантных по локусам Т-клеточного рецептора и гликофорина А клеток как возможный критерий для формирования группы риска онкологических заболеваний// Российский онкологический журнал. - 2001.-№1. - С.23-25.

15. Орлова Н.В., Смирнова С.Г., Замулаева И.А., Андреев В.Г., Рябченко Н.И., Саенко А.С. Апоптоз лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и больных раком гортани после гамма-облучения in vitro// Тезисы IV съезда по радиационным исследованиям. — Москва, 2001. — С.304.

16. Саенко А.С, Замулаева И.А, Смирнова С.Г., Орлова Н.В., Селиванова Е.И. Регуляция апоптоза и некроза лимфоцитов человека: адаптивный ответ// Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. - Калуга: "Эйдос", 2001. - С. 414-422.

17. Смирнова С.Г., Орлова Н.В., Замулаева И.А, Матвеева Н.П., Каплан М.А.. Саенко А. С. Повышение частоты TCR-мутантных лимфоцитов у ликвидаторов аварии на ЧАЭС — следствие нестабильности генома в отдаленные сроки после облучения?// Тез. докл. IV съезда по радиационным исследованиям. - Москва: Изд-во РУДН. - 2001. - Т.1. - С. 108.

18. Замулаева И.А., Орлова Н.В., Смирнова С.Г., Саенко А.С. Отсутствие адаптивного ответа в отношении апоптотической гибели облученных лимфоцитов человека// Тезисы докладов IV съезда по радиационным исследованиям. - Москва: Изд-во РУДН. -2001. - Т.1. - С. 292.

19. Верещагина А.О., Замулаева И.А., Саенко А.С. Корреляционная зависимость частоты мутантных по локусу гликофорина А клеток от поглощенной дозы облучения щитовидной железы// Сб. материалов конференции «Энергетика-3000». -Обнинск, 2001. - С. 132-136.

20. Смирнова С.Г., Орлова Н.В., Замулаева И.А, Саенко А.С. Мутации по локусу Т-клеточного рецептора у людей в отдаленные сроки после острого

и пролонгированного облучения// Тез. докл. международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций». -Москва: Изд-во РУДН, 2002. - С. 109-110.

21. Смирнова С.Г., Орлова Н.В.. Замулаева И.А.. Саенко А.С. Мутации по локусу Т-клеточного рецептора у людей в отдаленные сроки после острого и пролонгированного облучения// Радиационная биология. Радиоэкология. - 2002. - Т.42. - №6. - С. 624-627.

22. Ivanov V., Tsyb A., Chekin S.., Parshin V., Maksioutov M., Saenko A., Sevankaev A., Zamulaeva L, Khvostunov I., Gorski A., Kaidalov O., Vlasov O. Risk of radiogenic malignant and benign thyroid diseases for the population of the oryol oblast after the Chernobyl accident: outcome of large-scale epidemiological studies// Abstracts of "The first Nagasaki Symposium of International Consortium for Medical Care of Hibakusha and Radiation Life Science".-Nagasaki, 2003. - P. 25-27.

23. Saenko A., Zamulaeva I. Distinctive features of somatic gene mutagenesis and apoptosis in radiation exposed individuals and cancer patients// Abstracts of "The first Nagasaki Symposium of International Consortium for Medical Care of Hibakusha and Radiation Life Science". - Nagasaki, 2003. - P. 29-31.

24. Замулаева И.А. Обоснование и методология оценки радиационно-индуцированного канцерогенного риска на основе анализа соматических мутаций// Лекции школы по радиационной биологии в "Галактике"/ Под ред. проф. А.С.Саенко. - Обнинск, 2003. - С. 114-136.

25. Верещагина А. О., Замулаева И. А., Смирнова С. Г., Орлова Н. В., Саенко А. С. Повышение частоты лимфоцитов с мутациями по локусу Т-клеточного рецептора у жителей загрязненных радионуклидами районов Орловской области// Сборник тезисов 7-ой Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология- наука XXI века". - Пущино, 2003.-С. 12.

26. Орлова Н.В., Смирнова С.Г., Замулаева И.А., Матвеева Н.П., Каштан М.А., Саенко А.С. Повышенные частоты лимфоцитов, мутантных по локусу Т-клеточного рецептора, в отдаленные сроки после облучения в малых дозах и возможные причины этого явления// Сб. тезисов "III съезд по радиационным исследованиям". - Киев, 2003. - С. 104.

27. Селиванова Е.И., Замулаева И.А., Смирнова С.Г., Орлова Н.В., Верещагина А.О., Саенко А.С. Повышение частоты соматических клеток с генными мутациями у жителей загрязненных радионуклидами районов Орловской области// Сб. тезисов "III съезд по радиационным исследованиям". - Киев, 2003. - С .111.

28. Саенко А.С., Замулаева И.А., Смирнова. С.Г., Орлова Н.В., Селиванова Е.И., Матвеева Н. П., Каплан М. А. Соматический мутагенез у облученных в малых дозах лиц в отдаленные сроки после воздействия// Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. -Вып. 4. - Калуга: «Эйдос», 2003. - С. 233-237.

29. Севанькаев А. В., Замулаева И. А., Потетня О. И., Голуб Е. В., Михайлова Г. Ф., Пятенко В. С, Цепенко В. В., Шкаврова Т. Г., Смирнова С. Г., Орлова Н.В., Хвостунов И. К., Боровикова; М.-П., Омасхабова Н. О. Сравнительное изучение частоты генных и структурных соматических мутаций в лимфоцитах крови детей и подростков, подвергшихся радиационному воздействию при Чернобыльской аварии на разных стадиях онтогенеза// Труды регионального конкурса, научных проектов в области естественных наук. - Вып. 5. - Калуга: «Эйдос», 2003. - С.244-248.

30. Saenko A., Zamulaeva I. Regularities of somatic gene mutagenesis in radiation exposed individuals// International. Congress Series. - 2003. - V. 1258. - P. 8185.

31. Zamulaeva I., Saenko A.. Comparative investigation of somatic gene mutagenesis and apoptosis in patients with benign, malignant tumors and healthy individuals// International Congress Series. -2003. - V.1258. - P. 137-141.

Заказ №899 от 15.01.04 г., Тираж 100 экз. 249037 Россия, Калужская обл., г. Обнинск, ул. Красных Зорь, 26 "Печатный салон", тел.: (08439) 69041, 91284

* ~ 2568

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Замулаева, Ирина Александровна

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Причины, определяющие актуальность исследования генных мутаций в соматических клетках человека, с 14 радиобиологической точки зрения.

1.1.1. Различие механизмов формирования генных и 15 структурных мутаций в близкие сроки после радиационного воздействия.

1.1.2. Индукция нестабильности генома потомков 21 облученных клеток.

1.1.3. Ключевая роль генных и структурных мутаций в 31 радиационно-индуцированном канцерогенезе.

1.2. Возможности и перспективы изучения мутагенеза в 38 соматических клетках человека на уровне отдельных генных локусов.

1.2.1. HPRT-тест.

1.2.2. HLA-тест.

1.2.3. TCR-тест.

1.2.3.1. Принцип метода определения TCR- 45 мутантных лимфоцитов.

1.2.3.2. Результаты оценки частоты TCR-мутантных 49 клеток в группах контрольных и облученных лиц.

1.2.4. GPA-тест.

1.2.4.1. Принцип и различные способы определения 56 мутантных по локусу гликофорина А клеток.

1.2.4.2. Частота GPA-мутантных клеток у 63 контрольных доноров.

1.2.4.3. Влияние радиационного воздействия разной 66 интенсивности на частоту GPA-мутантных клеток.

1.2.5. Hb-тест.

1.3. Практическое значение исследования генных мутаций в 75 соматических клетках облученных лиц.

1.3.1. Оценка количества клеток с генными мутациями как 75 метод биологической дозиметрии.

1.3.2. Увеличение уровня соматического мутагенеза как 81 показатель повышенного канцерогенного риска. 1.4. Эффективность апоптотической гибели поврежденных клеток — важный фактор, определяющий количество мутантных клеток.

1.4.1. Апоптоз и его роль в поддержании генетической стабильности клеточных популяций.

1.4.2. Вариабельность индивидуального уровня апоптотической гибели клеток человека после повреждающего воздействия.

Глава II. Материалы и методы.

2.1. Характеристика групп исследования показателей 102 соматического мутагенеза.

2.1.2. Группы лиц, обследованных с помощью GPA- теста.

2.1.2. Группы лиц, обследованных с помощью TCR-теста.

2.2. Подготовка проточного цитометра к анализу и сортировке 115 клеток.

2.3. Методика определения частоты GPA-вариантных клеток.

2.3.1. Процедура фиксации и окрашивания клеток.

2.3.2. Предварительная работа по приготовлению меченных 120 антител к разным формам гликофорина А.

2.4. Определение частоты TCR-мутантных клеток.

2.5. Методы определения радиационно-индуцированного 123 апоптоза лимфоцитов.

2.5.1. Определение доли клеток с гиподиплоидным 126 содержанием ДНК.

2.5.2. Определение доли клеток, связывающих аннексии V, 128 в разных субпопуляциях лимфоцитов.

2.5.3. Морфологический анализ апоптоза.

2.6. Определение субпопуляционного состава лимфоцитов.

2.7. Статистический анализ.

Глава III. Результаты исследования.

3.1. Анализ частоты мутантных клеток в группах контрольных необлученных лиц.

3.1.1. Воспроизводимость результатов многократного определения изучаемых показателей.

3.1.2. Частота TCR-мутантных клеток у контрольных лиц 133 разного возраста, пола и образа жизни.

3.1.3. Влияние возраста на частоту GPA-мутантных клеток с 137 разным фенотипом.

3.2. Зависимость частоты GPA-мутантных клеток от дозы 138 облучения.

3.2.1. Частота N0- и NN-вариантных клеток у лиц, 138 подвергшихся острому облучению в разных дозах.

3.2.2. Увеличение частоты GPA-мутантных клеток в 139 зависимости от дозы пролонгированного воздействия.

3.3. Сопоставление частоты TCR-мутантных клеток с дозой в 145 разные сроки после облучения.

3.3.1. Влияние внешнего облучения на частоту лимфоцитов 145 мутантных по TCR-локусу.

3.3.2. Частота TCR-мутантных клеток после смешанного 147 внешнего и внутреннего радиационного воздействия в различных дозах.

3.4. Оценка эффектов действия ионизирующего излучения в 150 малых дозах на частоту клеток с генными мутациями.

3.4.1. Частота GPA-мутантных клеток после радиационного 150 воздействия в малых дозах.

3.4.2. Повышение частоты TCR-мутантных клеток у лиц, 154 подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах.

3.4.2.1. Результаты обследования ликвидаторов 155 аварии на ЧАЭС через 9-17 лет облучения

3.4.2.2. Результаты обследования жителей 160 загрязненных радионуклидами территорий.

3.4.2.3. Оценка влияния возраста при радиационном 162 воздействии в малых дозах на частоту TCR-мутантных клеток.

3.5. Сравнительное исследование частоты мутантных клеток у 165 пациентов со злокачественными, доброкачественными новообразованиями и здоровых лиц.

3.6. Сравнительный анализ данных, полученных при 171 одновременном использовании GPA- и TCR-методов.

3.7. Исследование апоптотической элиминации поврежденных 177 лимфоцитов и влияния этого процесса на количество TCR-мутантных клеток.

3.7.1. Гибель лимфоцитов путем апоптоза после гамма- 178 облучения in vitro.

3.7.1.1. Подбор оптимальных условий исследования 178 апоптотической гибели с помощью метода проточной цитометрии.

3.7.1.2. Зависимость апоптотической гибели 181 лимфоцитов от дозы облучения in vitro у контрольных доноров.

3.7.1.3. Отсутствие влияния субпопуляционного 183 состава лимфоцитов на радиочувствительность в отношении апоптоза.

3.7.1.4. Уровень апоптотической гибели лимфоцитов 187 после облучения in vitro у ликвидаторов аварии на ЧАЭС в сравнении с контрольными лицами.

3.7.2. Сопоставление уровня радиационно-индуцированного 188 апоптоза лимфоцитов и частоты TCR-мутантных клеток.

Глава IV. Обсуждение результатов исследования.

4.1. Частота мутантных клеток в контрольной группе.

4.2. Количество радиационно-индуцированных мутаций в разных 194 локусах в зависимости от дозы, мощности дозы и сроков радиационного воздействия.

4.2.1. Зависимость «доза-эффект» в отношении GPA- 194 мутантных клеток при остром и пролонгированном облучении.

4.2.2. Анализ частоты TCR-мутантных клеток после 198 радиационного воздействия.

4.2.3. Возможности использования методов определения 201 TCR- и GPA-мутантных клеток в целях биологической дозиметрии.

4.3. Влияние ионизирующего излучения в малых дозах на 204 показатели соматического мутагенеза в отдельных генных локусах.

4.3.1. Повышение частоты TCR-мутантных клеток у облученных в малых дозах лиц как следствие радиационно-индуцированной нестабильности генома

4.3.2. Отсутствие признаков генетической нестабильности в 212 кроветворных клетках стволового типа по данным GPA-обследования лиц, облученных в малых дозах.

4.3.3. Закономерности проявления генетической 214 нестабильности после радиационного воздействия в малых дозах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генные мутации в соматических клетках человека IN VIVO: радиобиологические закономерности"

Достигнутые в прошлом веке успехи в изучении радиационно-индуцированного мутагенеза в соматических клетках человека in vivo были сделаны, главным образом, благодаря анализу структурных мутаций в лимфоцитах периферической крови. За более чем 40-летний период использования цитогенетических методов определения хромосомных аберраций накоплен огромный массив данных о закономерностях индукции этих мутаций в разнообразных радиационных ситуациях и их последующей элиминации. Генные мутации исследованы в этом отношении несравненно хуже, что было связано, прежде всего, с отсутствием надежных и удобных методов их определения. В то же время изучение генных мутаций представляется весьма актуальным для радиобиологии и радиационной медицины в силу, по крайней мере, нескольких причин.

Во-первых, существуют известные различия в механизмах формирования генных и структурных мутаций, о чем свидетельствуют многочисленные данные об индукции и репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК в клетках разнообразных биологических объектов in vivo и in vitro. Поэтому наши представления о соматическом мутагенезе вообще, и радиационном в частности, были бы неполны без знания радиобиологических закономерностей возникновения и элиминации генных мутаций.

Во-вторых, анализ генных мутаций делает возможными регистрацию и количественную оценку небольших по размеру изменений ДНК. Исследование именно таких мутаций приобретает в последнее время все большее значение в связи с обнаружением феномена нестабильности генома у потомков облученных клеток, которая характеризуется, главным образом, небольшими по размеру изменениями ДНК в отличие от мутаций, обусловленных непосредственным действием радиации. При этом следует отметить, что возможное проявление этого феномена на генном уровне при облучении человека практически не исследовано.

В-третьих, механизмы и уровень мутагенеза в клетках с разной степенью дифференцировки, вероятно, отличаются, как можно полагать на основании немногочисленных пока исследований процессов репарации радиационных повреждений ДНК и апоптотической гибели в клетках стволового типа. Существующие в настоящее время методы клеточной и молекулярной биологии позволяют провести раздельный анализ генных мутаций в высоко-и низко дифференцированных клетках и тем самым существенно расширить представления о соматическом мутагенезе.

В-четвертых, имеются основания полагать, что изучение соматического мутагенеза на уровне отдельных генных локусов имеет не только теоретическое, но и практическое значение. С одной стороны, как показано для хромосомных аберраций нестабильного типа, по количеству мутаций в клетках периферической крови можно судить о дозе радиационного воздействия в близкие сроки после его окончания. Однако из-за естественного обновления популяции лимфоцитов количество традиционных маркеров радиационного воздействия - дицентрических хромосом — постепенно снижается со временем после облучения, делая невозможным проведение биологической дозиметрии в отдаленные сроки. Одним из подходов к решению проблемы ретроспективной дозиметрии могло бы стать использование методов определения генных соматических мутаций в долгоживущих клетках стволового типа. Однако информативность таких методов изучена пока недостаточно, особенно для случаев пролонгированного действия радиации. С другой стороны, одним из основных отдаленных последствий действия ионизирующего излучения на соматические клетки является повышение канцерогенного риска. Как известно, спектр изменений генетического материала при злокачественной трансформации не исчерпывается структурными мутациями. Молекулярно-биологические исследования канцерогенеза показывают, что генные мутации имеют не меньшее, если не большее значение. Поэтому можно полагать, что изучение генных соматических мутаций у облученных лиц имеет важное значение для выяснения механизмов радиационного канцерогенеза, оценки канцерогенного риска (особенно при воздействии в малых дозах) и, наконец, для формирования группы повышенного риска возникновения онкологических заболеваний.

Таким образом, необходимость исследования соматического мутагенеза в отдельных генных локусах после радиационного воздействия не вызывает сомнений. Однако методические возможности изучения генных мутаций в соматических клетках человека были до недавнего времени сильно ограничены сложностью, трудоемкостью, недостаточной воспроизводимостью и неоднозначностью интерпретации результатов, что связано, главным образом, с низкой частотой мутаций по отдельным локусам. Эти проблемы удалось в значительной мере преодолеть с внедрением полуавтоматических методов проточной цитометрии, позволяющей анализировать сотни тысяч клеток за относительно небольшое время и, в конечном, счете обследовать значительные контингента людей. В настоящее время известно несколько методов, позволяющих при массовом обследовании определять частоту клеток с генными мутациями по отдельным локусам. Практически все методы основаны на иммунофлуоресцентном анализе белковых продуктов соответствующих генов, а не на исследовании самой ДНК. При этом по наличию или отсутствию нормального продукта немутировавшего гена оценивают частоту клеток с вариантным (мутантным) иммунофенотипом. В данной работе использованы методы оценки генных мутаций по двум локусам -гликофорина A (glycophorin А , GPA) и Т-клеточного рецептора (Т-се11 receptor, TCR)- в клетках периферической крови.

Несмотря на то, что оба метода разработаны более 10 лет тому назад, они интенсивно используются только в ограниченном числе лабораторий за пределами РФ. По всей видимости, это является главной причиной недостаточности данных об основных радиобиологических закономерностях в отношении указанных генных мутаций: о зависимости доза - эффект радиационного воздействия с разной мощностью, о влиянии возраста в момент облучения на количество мутантных клеток, о возможных эффектах малых доз и т.д. Результаты, полученные в данной диссертационной работе, в значительной мере восполняют указанные пробелы.

По современным представлениям о мутагенезе, частота мутантных клеток определяется как скоростью возникновения мутаций (которая зависит от дозы и мощности дозы генотоксического воздействия, эффективности репарации повреждений ДНК и т.д.), так и скоростью элиминации мутантных клеток различными способами, в том числе путем апоптоза. Несмотря на интенсивные исследования апоптоза, известны лишь единичные данные об индивидуальной вариабельности апоптотической гибели нормальных клеток человека (Crompton, 1998). Тем более неясно, существует ли корреляция между индивидуальным уровнем апоптоза в ответ на повреждение ДНК и частотой мутантных клеток у человека in vivo. Хотя отдельные данные, полученные при обследовании лиц с синдромом Ли-Фраумеии, позволяют предполагать наличие такой корреляции. В связи с этим в данной диссертационной работе проведен анализ роли апоптотической элиминации клеток с поврежденной ДНК как одного из механизмов поддержания генетической стабильности клеточных популяций после радиационного воздействия на организм человека in vivo.

Таким образом, целью данной работы является исследование закономерностей и некоторых механизмов формирования генных мутаций в соматических клетках человека после радиационного воздействия in vivo.

При этом поставлены следующие задачи:

1. проанализировать зависимость частоты GPA- мутантных клеток от дозы острого и пролонгированного радиационного воздействия; определить зависимость частоты TCR-мутантных клеток от дозы пролонгированного и хронического облучения в ближайшие и отдаленные сроки после воздействия, а также возможные изменения этого показателя на индивидуальном уровне (по результатам повторных обследований); оценить информативность GPA- и TCR- методов для биологической дозиметрии радиационного воздействия в различных ситуациях; провести сравнительное исследование частоты клеток с мутациями по 2-м указанным локусам у необлученных контрольных доноров и лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения в малых дозах, включая ликвидаторов аварии на ЧАЭС, облученных в дозах до 0,25 сГр, и жителей загрязненных радионуклидами территорий РФ; исследовать влияние возраста в момент радиационного воздействия на частоту TCR-мутантных клеток у ликвидаторов аварии на ЧАЭС и жителей загрязненных радионуклидами территорий РФ; оценить возможность использования показателей соматического мутагенеза (частоты GPA- и TCR-мутантных клеток) в целях формирования группы лиц с повышенным риском возникновения злокачественных новообразований; провести сравнительное исследование частоты TCR-мутантных клеток и индивидуального уровня апоптоза лимфоцитов после облучения in vitro у лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения в малых дозах.

Положения, выносимые на защиту:

Увеличение частоты клеток с генными мутациями на единицу дозы зависит от режима (острый/пролонгированный) радиационного воздействия на организм человека. Проведение биологической дозиметрии на основе анализа генных мутаций возможно после облучения в достаточно высоких дозах и более эффективно в случае острого воздействия;

Динамика проявления радиационно-индуцированных мутаций по разным локусам различается;

В отдаленные сроки после действия радиации в малых дозах отмечается высокая частота клеток с генными мутациями, что, вероятно, свидетельствует о нестабильности генома соматических клеток. Признаки генетической нестабильности наблюдаются не у всех облученных лиц и не во всех популяциях соматических клеток;

Повышение частоты клеток с генными мутациями у ликвидаторов аварии на ЧАЭС, облученных в дозах до 0,25 Гр, не связано с нарушением элиминации поврежденных клеток путем апоптоза;

Частота соматических клеток с генными мутациями, вероятно, может являться критерием для формирования группы лиц с повышенным канцерогенным риском.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Замулаева, Ирина Александровна

Выводы:

1. Установлена прямая корреляция частоты ОРА(ЫО)-мутантных эритроцитов и дозы радиационного воздействия. Выход мутантных клеток на единицу дозы зависит от мощности дозы облучения: при пролонгированном воздействии он примерно в три раза меньше, чем при остром.

3. В близкие сроки после радиационного воздействия наблюдается прямая корреляция частоты TCR-и ОРА(ЫО)-мутантных клеток. Частоты N0- и NN-вариантных эритроцитов не коррелируют у лиц, подвергшихся облучению в достаточно высоких дозах, вследствие разных механизмов их формирования.

4. Подтверждена возможность использования GPA-метода в целях биологической дозиметрии острого облучения как в близкие, так и в отдаленные сроки после радиационного воздействия. Установлена низкая информативность этого метода при пролонгированном облучении, что обусловлено небольшим выходом NO-вариантных эритроцитов на единицу дозы при достаточно широкой индивидуальной вариабельности.

5. Частота GPA(NO)-MyTaHTHbix клеток у лиц, подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах (до 0,25 Гр), соответствует контрольному уровню.

7. Феномен генетической нестабильности в отдаленные сроки после облучения в малых дозах характеризуется селективностью в отношении разных клеток организма, немонотонной зависимостью от дозы и мощности дозы воздействия, стабильностью количественных проявлений феномена в течение 9-17 лет после облучения, проявлением феномена только у части облученных лиц, зависимостью развития генетический нестабильности от возраста в момент облучения.

Заключение

Диссертационная работа посвящена исследованию радиационно-индуцированных изменений генетического материала в соматических клетках человека in vivo на уровне двух генных локусов: гликофорина А (glycophorin А - GPA) и Т-клеточного рецептора (T-cell receptor - TCR). Изучена частота мутантных клеток в различные сроки • после радиационных воздействий разного типа: внешнего и внутреннего; острого, пролонгированного и хронического. Идентификация мутантных клеток осуществлялась с помощью проточной цитометрии на основе анализа иммунофенотипа клеток периферической крови в соответствии с ранее разработанными методиками (Kyoizumi et al., 1990; Langlois et al., 1990) с небольшими модификациями.

Полученные в работе результаты подтверждают существовавшее ранее представление о способности радиационно-индуцированных СРА(ЫО)-мутаций сохраняться в организме длительное время, сравнимое с продолжительностью жизни человека. Установлено, что при остром облучении частота СРА(ЫО)-вариантных клеток линейно увеличивается с дозой на 33,4'Ю'6/Гр. Сопоставление выхода NO-вариантных клеток на единицу дозы с данными литературы свидетельствует о высокой надежности, воспроизводимости GPA-метода и о возможности его использования для биодозиметрии острого облучения как в ближайшие, так и в отдаленные сроки после воздействия. По нашим оценкам порог чувствительности метода составляет около 0,5 Гр при остром облучении.

В работе впервые получены статистически достоверные данные о влиянии мощности дозы облучения на количество клеток с генными мутациями (при действии радиации на организм человека). Установлено, что при пролонгированном облучении частота NO-вариантных клеток увеличивается на 9,4'Ю"6 клеток/Гр, что примерно в три раза меньше, чем при остром облучении. При наличии достаточно выраженной индивидуальной вариабельности, это приводит к снижению чувствительности метода. По всей видимости, он может быть использован при групповой дозиметрии пролонгированного облучения в дозах больше 1-1,5 Гр.

Частота TCR-мутантных клеток статистически значимо коррелировала с дозой радиационного воздействия (как и с частотой GPA (ЫО)-вариантных клеток) только в близкие сроки после облучения. Эти результаты подтверждают известный из литературы факт достаточно быстрой элиминации радиационно-индуцированных TCR-мутантных клеток. Впервые нами представлены данные о количестве таких клеток после тотального (пролонгированного) облучения людей. Показано, что выход TCR-мутантных клеток зависит от длительности радиационного воздействия. Учитывая полученные нами результаты и данные литературы, можно полагать, что наиболее целесообразным является использование TCR- теста для биодозиметрии острого облучения в близкие сроки - в течение не более 4-х лет с момента его окончания.

Таким образом, в работе изучены закономерности возникновения и элиминации соматических клеток с генными мутациями по отдельным локусам в зависимости от дозы и мощности дозы радиационного воздействия на организм человека. Полученные результаты, расширяя наши представления о мутагенезе в соматических клетках человека при облучении in vivo, имеют не только теоретическое, но и практическое значение. Проведенные исследования позволили оценить информативность двух методов определения генных мутаций для биологической дозиметрии радиационных воздействий. В частности, был выявлен ряд ограничений, связанных с возможным применением этих методов с целью дозиметрии: 1 Остановлена низкая информативность GPA-теста при пролонгированном облучении;

2)показаны сложности, связанные с использованием TCR-метода. Установленные ограничения имеют важное значение для корректного применения указанных методов для биодозиметрии в случае необходимости в дальнейшем.

Отдельному изучению подвергнуты возможные эффекты генотоксического действия ионизирующих излучений в малых дозах. Для этого проведено обследование ликвидаторов аварии на ЧАЭС через 9-17 лет после облучения и постоянных жителей ряда областей РФ, загрязненных радионуклидами. Полученные данные о частоте TCR- и СРА(КО)-вариантных клеток сравнивали с соответствующими показателями в группах контрольных лиц сходного возраста. Во всех обследованных группах обнаружено статистически значимое увеличение частоты TCR-мутантных клеток после радиационного воздействия в малых дозах по сравнению с контролем. В то же время частота GPA (ЫО)-вариантных клеток не отличалась от контрольного уровня (также во всех группах). Учитывая известные особенности формирования мутаций по указанным локусам, дозы и сроки облучения, имеются основания расценивать эти факты как проявление (на генном уровне) радиационно-индуцированной нестабильности генетического материала лимфоцитов. В работе выявлены следующие закономерности проявления этого феномена в отдаленные сроки после облучения в малых дозах:

- селективный характер в отношении разных клеток организма: повышение частоты мутантных лимфоцитов и сохранение на уровне контроля количества мутантных гемопоэтических клеток стволового типа, о котором судили по количеству NO-вариантных эритроцитов;

- отсутствие монотонной зависимости эффекта от дозы и мощности дозы радиационного воздействия;

- сохранение эффекта (повышенной частоты TCR-мутантных лимфоцитов) на стабильном уровне в течение 9-17 лет после радиационного воздействия;

- проявление этого феномена только у части облученных лиц;

- зависимость проявлений феномена генетической нестабильности от возраста в момент облучения.

Повышенная частота мутантных клеток в отдаленные сроки после облучения может быть обусловлена как высокой частотой мутаций вследствие нестабильности генома, возникшей у потомков облученных клеток, так и нарушением механизмов элиминации клеток с поврежденной ДНК. В данной диссертационной работе исследована также реальность второго объяснения. С этой целью частота TCR-мутантных клеток у ликвидаторов аварии на ЧАЭС была сопоставлена с уровнем апоптотической гибели лимфоцитов этих же лиц после облучения in vitro. В целом, наши результаты свидетельствуют о том, что низкий уровень апоптоза поврежденных клеток может являться фактором увеличения количества TCR-мутантных лимфоцитов у части ликвидаторов, что согласуется с представлениями о важной роли апоптоза как механизма поддержания генетической стабильности клеточных популяций. Однако у большинства ликвидаторов с высокой частотой TCR-мутантных клеток наблюдался нормальный уровень апоптотической элиминации поврежденных клеток. Таким образом, у большинства лиц повышение частоты лимфоцитов с генными мутациями не связано со снижением эффективности процесса апоптоза, а обусловлено другими причинами, что еще раз подтверждает сделанное нами заключение об индукции генетической нестабильности в этих клетках.

Имеющиеся в литературе данные о существовании причинно-следственных связей между процессами мутагенеза и канцерогенеза позволили предположить, что лица с высокой частотой TCR- и GPAвариантных клеток могут иметь повышенный риск возникновения злокачественных новообразований. Для проверки этого предположения в настоящей работе был проведен анализ частоты клеток с мутациями по указанным локусам у лиц с злокачественными и доброкачественными новообразованиями. Установленное нами статистически значимое увеличение показателей соматического мутагенеза и в той и в другой группе (по сравнению с контролем) свидетельствует о потенциальной возможности использования GPA- и TCR-методов для формирования группы повышенного канцерогенного риска.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Замулаева, Ирина Александровна, Обнинск

1. Аклеев А.В., Веремеева Г.А., Киоизуми С. Влияние хронического радиационного воздействия на уровень соматических мутаций в клетках периферической крови людей в отдаленные сроки // Радиационная биология. Радиоэкология.- 1998,- Т. 38.- В. 4.- С. 573585.

2. Аклеев А.В., Алещенко А.В., Антощина М.М. Цитогенетические последствия облучения жителей Южного Урала//Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. - Т.42. - № 6. - С. 696-699.

3. Алферович А.А., Готлиб В.Я., Конрадов А.А. и др. Воздействие малых доз ионизирующего излучения не клетки млекопитающих// Известия Академии наук СССР. Серия биологическая. 1992. - № 1. — С. 127130.

4. Ауэрбах LLI. Проблемы мутагенеза.- Москва. «Мир».- 1978.- 463 С.

5. Безлепкин В.Г., Газиев А.И. Индуцированная нестабильность генома половых клеток животных по мини- и микросателлитным последовательностям // Радиац. биология. Радиоэкология.- 2001.- Т. 41 .-N. 5. С. 475- 488.

6. Белоусова Ф.К. Загадки гена опухолевого супрессора // Экспериментальная онкология.-1996.- Т. 18.- С. 197-207.

7. Бочков Н.П. Цитогенетические эффекты облучения у человека // Автореф. дис. д- ра. мед. наук.- Москва.- 1969.

8. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Горбунова Н.В. и др. Особенностибиологического действия малых доз облучения//Радиационная биология. Радиоэкология. 1996. -Т.36. - Вып. 4. - С. 610-631.

9. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Жижина Г.Н., Конрадов А. А. Новые аспекты закономерностей действия низко интенсивного облучения в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология . 1999. - Т.39. -N1. - С.26-35.

10. Бурлакова Е.Б., Михайлов В.Ф., Мазурик В.К. Система окислительно-восстановительного гомеостаза при радиационно-индуцированной нестабильности генома // Радиационная биология. Радиоэкология.-2001. Т.41. - №5. - С. 489-499.

11. Бычковская И.Б., Очинская Г.К. Независимость летального повреждения в потомстве облученных клеток от темпа их размножения (Опыты на Amoeba proteus) // Радиобиология. — 1974. — Т. 14. — Вып. 6. -С. 852-854.

12. Бычковская И.Б., Очинская Г.К. О значении токсического действия облученной среды в пострадиационной гибели клеток // Радиобиология. 1973. - Т. 13. - Вып. 5. - С. 680-685.

13. Бычковская И.Б., Очинская Г.К., Ерохина Г.М. О разных типах наследственных изменений жизнедеятельности клеток, вызванных рентгеновскими лучами при различных уровнях доз (Опыты на Amoeba proteus)//Радиобиология. 1976.-Т. 16. - Вып. 3. - С. 390-394.

14. Бычковская И.Б., Очинская Г.К., Рюмцева А.И. О значении токсического действия облученной среды в пострадиационной гибели клеток. Сообщение I. Опыты на Amoeba proteus// Радиобиология. -1971. Т. 11. - Вып. 2. - С. 235-238.

15. Бычковская И.Б., Станжевская Т.Н. О стойком эффекте отмирания в потомстве облученных дрожжевых клеток. Сообщение 3. Новый способ регистрации эффекта // Радиобиология. 1980. - Т. 20. - Вып. 2. - С. 189-193.

16. Бычковская И.Б., Степанов Р.П., Федорцева Р.Ф. Особые долговременные изменения клеток при воздействии радиации в малых дозах//Радиационная биология. Радиоэкология. — 2002. Т.42. - № 1. -С. 20-35.

17. Вартанян JI. С., Гуревич С.М., Козаченко А.И. и др. Отдаленные послдствия влияния малых доз ионизирующей радиации на состояние ферментной антиоксидантной системы людей// Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. - Т .43. - № 2. - С. 203-205.

18. Веремеева Г.А. Влияние хронического радиационного воздействия на уровень соматических мутаций в клетках периферической крови людей в отдаленные сроки: Автореф. дис. канд. биол. наук.- М.; 1996. 26 с.

19. Воробцова И.Е., Михельсон В.М., Воробьева М.В. с соавт. Результаты цитогенетического обследования ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС, проведенного в разные годы // Радиационная биология. Радиоэкология.- 1994,- Т. 34.- В. 6.- С. 798- 804.

20. Воробцова И.Е., Дженсен Р., Евстратов И.Е. и др. Биологическая дозиметрия и реконструкция доз облучения: реальность и перспектива // Вестник новых медицинских технологий.-1996.-T.3.-N 2. -С.9-22.

21. Воробьева М.В. Исследование радиочувствительности хромосом детей облученных родителей // Автореф. дис. канд. биол. наук.- СПб.; 1995. -25 с.

22. Газиев А.И. Повреждение ДНК в клетках под действием ионизирующей радиации//Радиационная биология. Радиоэкология. -1999. Т. 39. - № 6. - С. 630-638.

23. Галактионов В.Г. Иммунология. М.: Издательство МГУ, 1998. - 420 с.

24. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Изд. дом «Практика», 1999.-459 с.

25. Гончарова Р.И., Рябоконь Н.И., Слуквин A.M. Динамика мутабильности соматических и половых клеток животных, населяющих районы выпадения радиоактивных осадков/ЛДитология и генетика. — 1996. -Т.30. — № 4. С. 35-41.

26. Гончарова Р.И., Смолич И.И. Генетическая эффективность малых доз ионизирующей радиации при хроническом облучении мелких млекопитающих//Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. -Т.42. - №6 - С. 654-660.

27. Готлиб В.Я., Тапонайнен Н.Я., Пелевина И.И. Длительно существующие повреждениея ДНК и выживаемость клеток млекопитающих//Радиобиология. 1985.-Т. 15. - Вып. 4.-С. 435-443.

28. Готлиб В.Я., Пелевина И.И., Конопля Е.Ф. и др. Некоторые аспекты биологического действия малых доз радиации// Радиобиология. 1991. - Т. 31. - Вып. 3. - С. 318-325.

29. Гофман Д. Рак, вызываемый облучением в малых дозах: независимый анализ проблемы. Перевод с английского под редакцией Бурлаковой Е.Б., Лысцова В.Н. Т. 1, 2.- М.: Социально-экологический союз, 1994. -540 с.

30. Елисеева И.М., Иофа Э.Л., Стоян У.Ф., Шевченко В.А. Анализ аберраций хромосом и СХО у детей из радиационно-загрязненных районов Украины//Радиационная биология. Радиоэкология. — 1994. -Т.34. №2. - С. 163-171.

31. Иванов В.К., Цыб А.Ф. Медицинские радиологические последствия Чернобыля для населения России: оценка радиационных рисков. — М.: Медицина, 2002. 389 с.

32. Имянитов Е.Н., Князев П.Г. Роль антионкогенов в опухолевом процессе //Экспериментальная онкология.- 1992. -Т.14.-№5. С. 3-18.

33. Имянитов Е.Н., Калиновский В.П., Князев П.Г. и соавт. Молекулярная генетика опухолей человека//Вопросы онкологии. 1997. - Т.43. - №1. -С. 95-101.

34. Комарова Е.А., Гудков А.В. Супрессия р53:Новый подход к преодолению побочных эффектов противоопухолевой терапии // Биохимия.- 2000.- Т.65.-№1.-С.48-56.

35. Коноплянников А.Г. Радиобиология стволовых клеток. — М.: Энергоатомиздат, 1984. 120 с.

36. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию механизмов канцерогенеза // Биохимия.-2000, а. -Т.65.- №1- С.5-33.

37. Копнин Б.П. Опухолевые супрессоры и мутаторные гены//Канцерогенез/Под ред. проф. Д.Г. Заридзе. М.: Научный мир, 2000, б.-С. 75-91.

38. Кузьмина Н.С., Сусков И.И. Экспрессирование геномной нестабильности в лимфоцитах детей, проживающих в условиях длительного действия радиационного фактора//Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. - Т.42. - № 6. - С. 735-739.

39. Лихтенштейн А.В., Шапот B.C. Опухолевый рост: ткани, клетки, молекулы // Патол. физиология и эксперим. терапия.- 1998.-№3.-С.25-44.

40. Лукьянова Н.Ю., Кулик Г.И., Чехун В.Х. Роль генов р53 и bcl-2 в апоптозе и лекарственной резистентности опухолей // Вопросы онкологии. -2000. -Т.46. -№2. -С. 121-128.

41. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз) / М.: Медицина, 2001.- 192 с.

42. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. О некоторых молекулярных механизмах основных радиобиологических последствий действия ионизирующих излучений на организм млекопитающих // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999.- Т.39.-№1.- С.89-96.

43. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. Радиационно-индуцируемая нестабильность генома: феномен, молекулярные механизмы, патогенетическое значение // Радиационная, биология. Радиоэкология.-2001.- Т. 41.- № 3.- С. 272- 289.

44. Мазурик В.К., Мороз Б.Б. Проблемы радиобиологии и белок р53 // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001.- Т.41.- №5.- С.548 -572.

45. Моссэ И.Б. Современные проблемы биодозимерии// Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. - Т.42. — № 6. — С. 661 -664.

46. Напалков Н.П. Общая онкология. М.: Медицина, 1989.- 648 с.

47. Новик А.А., Камилова Т.А., Цыган В.Н. Генетика в клинической медицине. СПб.: ВмедАб, 2001.-219 с.

48. Нейфах Е.А., Алимбекова А.И., Сусков И.И. Биохимические механизмы радиогенных цитогенетических и соматических нарушений у детей-резидентов загрязненных радионуклидами регионов//Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. - Т.42. - № 6. - С. 615-623.

49. Нейфах Е.А. Большие радиопатогенные нагрузки детей от «малых доз» техногенной хронической радиации//Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. - Т.43. - № 2. - С. 193-196.

50. Орлова Н.В. Частота клеток с мутациями в локусе Т- клеточного рецептора и радиационно-индуцированный апоптоз лимфоцитов как возможные показатели повышенного канцерогенного риска: Автореф. дис. канд. биол. наук. Обнинск, 2002. - 21 с.

51. Пелевина И.И., Рябов И.Н., Рябцев И.А. и др. Итоги экспериментальных радиобиологических исследований в 10-километровой зоне аварии на ЧАЭС// Радиобиология. 1991. - Т. 31. -Вып. 4.-С. 467-480.

52. Пелевина И.И., Николаев В.А., Готлиб В.Я. и др. Адаптивная реакция лимфоцитов крови людей, подвергшихся хроническому воздействию радиации в малых дозах//Радиационная биология. Радиоэкология. -1994. Т.34. - Вып. 6. - С. 805-817.

53. Пелевина И.И. Алещенко А.В., Афанасьев Г.Г. и др. Феномен повышения радиочувствительности после облучения лимфоцитов в малых адаптирующих дозах//Радиационная биология. Радиоэкология. — 2000. Т. 40. - № 5. - С. 544-548.

54. Пелевина И.И. Алещенко А.В., Антощина М.М. Реакция популяцииклеток на облучение в малых дозах//Радиационная биология. Радиоэкология.-2003.-Т.43.-№ 5.- С. 161-166.

55. Пилинская М.А., Шеметун A.M., Дыбский С.С. Цитогенетический эффект в лимфоцитах периферической крови как индикатор действия на человека факторов Чернобыльской аварии//Радиобиология. -1992. -Т.32. Вып. 5. - С.632-639.

56. Програмированная клеточная гибель / под ред. B.C. Новикова.- СПб.: Наука, 1996.-276 с.

57. Ременник J1.B., Старинский В.В. Эпидемиология злокачественных новообразований//Избранные лекции по клинической онкологии/Под ред. Чиссова В.И., Дарьяловой C.JI. М., 2000. - С.35.

58. Рождественский J1.M., Окладникова Н.Д., Смирнова Т. Н. и др. Оценка уровня мутаций в локусе гликофорина А у лиц, подвергавшихся хроническому воздействию ионизирующей радиации // Радиационная биология. Радиоэкология. 1998. - Т.38. - N3. - С. 443-450.

59. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология.- М.: Мир, 2000. 560 с.

60. Саенко А.С., Габай B.JI. Биохимия апоптоза (молекулярные процессы при апоптозе)//Гибель клетки. М.: Медицина, 2001. - С. 81-109.

61. Севанькаев А.В., Бочков Н.П. Влияние гамма- облучения на хромосомы человека. I. Зависимость частоты хромосомных аберраций от дозы при облучении in vitro // Генетика. 1968.- Т. 4.- № 5.- С. 130- 137.

62. Севанькаев А.В., Насонов А.П. Применение анализа хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека для биологической дозиметрии // Радиация и организм.- Обнинск, 1975.- С.93. 94.

63. Севанькаев А.В., Насонов А.П. Калибровочные дозовые кривые хромосомных аберраций лимфоцитов человека // Мед. радиология.-1978.- Т. 23.- №6.- С. 26-33.

64. Севанькаев А.В., Саенко А.С. Соматический мутагенез как биологический дозиметр радиационного воздействия // Радиационная биология. Радиоэкология.- 1997. Т.37.- № 4.- С.-560-564.

65. Севанькаев А.В. Некоторые итоги цитогенетических исследований в связи с оценкой последствий Чернобыльской аварии // Радиационнаябиология. Радиоэкология. 2000.- Т.40. - № 5. - С. 589 - 595.

66. Слозина Н.М. Неронова Е.Г., Линская М.Н., Никифоров A.M. О некоторых сложностях в оценке радиационно-индуцированных эффектов у человека//Радиационная биология. Радиоэкология. — 2002. — Т.42.-№6.- С. 684-686.

67. Спитковский Д.М. Концепция действия малых доз ионизирующих излучений на клетки и ее возможные приложения к трактовке медико-биологических последствий//Радиобиология. 1992. - Т. 32. - Вып. 3. — С. 382-400.

68. Степанова Е.И., Мишарина Ж.А., Вдовенко В.Ю. Отдаленные цитогенетические эффекты у детей, облученных внутриутробно в результате аварии на Чернобыльской АЭС//Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. - Т.42. - № 6. - С. 700-703.

69. Сусков И.И., Кузьмина Н.С. Проблема индуцированной геномной нестабильности в детском организме в условиях длительного действия малых доз радиации // Радиац. биология. Радиоэкология.- 2001.- Т.41.-№5.- С. 606-614.

70. Сусков И.И., Кузьмина Н.С. Полигеномная реализация мутагенных эффектов в организме людей, подвергающихся воздействию радиации вмалых дозах//Радиационная биология. Радиоэкология. — 2003. — Т.43. — №5,- С. 157-152.

71. Талызииа Т.А., Спитковский Д.М. Структурные изменения ядер лимфоцитов человека при действии ионизирующих излучений в диапазоне доз, вызывающих адаптивный ответ// Радиобиология. — 1991. -Т. 31.-Вып. 4.-С. 606-611.

72. Тапонайнен Н.Я., Готлиб В.Я., Пелевина И.И. Чувствительность к воздействию ингибиторов пострадиационной репарации и повторного облучения потомков облученных клеток // Радиобиология. — 1986. Т. 16.-Вып. 6.-С. 755-760.

73. Тапонайнен Н.Я., Готлиб В.Я., Конрадов А.А., Пелевина И.И. Пролиферативная активность, синтез ДНК и репродуктивная гибель ближайших и отдаленных потомков облученных клеток// Радиобиология.- 1987.-Т. 17.-Вып. 1.-С. 30-36.

74. Татосян А.Г. Онкогены//Канцерогенез/Под ред. проф. Д.Г.Заридзе. — М.: Научный мир, 2000. С. 57-74.

75. Уманский С.П. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы // Молекулярная биология.- 1996.- Т.ЗО. №3. - С.487-498.

76. Урбах В.Ю. Биометрические методы. — М.: Наука, 1964.- 247 с.

77. Фильченков А.А., Стойка Р.С. Апоптоз: краткая история, молекулярные механизмы, методы выявления и возможное значение в онкологии // Экспериментальная онкология. 1996.- Т. 18. - С.435-448.

78. ФЬгель Ф., Мотульски А. Генетика человека // Проблемы и подходы / Под ред. Алтухова Ю.П., Гиндилиса В.М.- М.: Мир. 1990. - Т 2. -С.142-277.

79. Чиссов В.И., Дарьялова СЛ. Избранные лекции по клинической онкологии. Москва, 2000. -736 с.

80. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью // Биохимия.-2000.- Т.65. -№1. -С.34-47.

81. Шевченко В.А. Интегральная оценка генетических эффектов ионизирующей радиации//Радиационная биология. Радиоэкология. -1997. -Т.37.-№ 5.— С. 569-576.

82. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. 1996.- №6. -С. 10-23.

83. Ярилин А.А. Апоптоз: природа феномена и его роль в целостном организме // Патол. физиология и эксперим. терапия.- 1998. №2.- С.26-42.

84. Akiyama М., Kyoizumi S, Hirai Y et al. Studes on chromosome aberrations and HPRT mutations in lymphocytes and GPA mutation in erythrocytes of atomic bomb survivors // Mut. and the Envir.-1990.- part С P.69-80.

85. Akiyama M., Nakamura N., Yakoda M. Somatic cell mutations in atomic bomb survivors//Radiat. Res.- 1991. -V. 32.- Suppl. 1.- P. 278- 282.

86. Akiyama M., Kyoizumi S., Hirai Y. et al. Mutation frequency in human blood cells increases with age // Mutat. Res.- 1995, a. V. 338. - P. 141-149.

87. Akiyama M, Umeki S, Kusunoki Y. et al. Somatic-cell mutation as a possible predictor of cancer risk // Health Phys.-1995, b. -V. 68. -P.643-649.

88. Akleyev A.V., Kossenko M.M., Silkina et al. Health effects of radiation incidents in the Southern Urals // Stem cells. -1995. -V.13, Suppl.- P.58-68.

89. Albertini R.J., De Mars R. Mosaicism of peripheral blood lymphocyte populations in females heterozygous for the Lesch-Nyhan mutation// Biochem. Genet. 1974. - V. 11. - P. 397-411.

90. Albertini R.J., Castle K.L., Borchering W.R. T-cell cloning to detect the mutant 6- thioguanine resistant lymphocytes present in human peripheral blood //Proc. Natl. Acad. Sci. -1982.- V. 79.- P. 6617- 6621.

91. Albertini R.J., Sullivan L. M., Berman J.K.et al. Mutagenicity monitoring in humans by autoradiographic assay for mutant T lymphocytes // Mutation Res.-1988. -V.204. -P.481-492.

92. Albertini R.J., Gennet I.N., Lambert B. et al. Mutation at the hprt locus. Report of a workshop// Mutation Res. -1989. V. 216. -P. 65-68.

93. Ames В., Gold L.S. Mitogenesis, mutagenesis and animal cancer tests//ChemicalIy induced cell proliferation: implications for risk assessment. -New York: Wiley-Liss, Inc., 1991. P. 1-20.

94. Ames B.N., Shigenagan M.K., Gold L.S. DNA lesions, inducible DNA repair, and cell division: Three key factors in mutagenesis and carcinogenesis // Environ. Health Perspect. Suppl.- 1993. V. 101. - P.35-44.

95. Ammenheuser M.N., Ward J.B., Whorton E.B. et al. Elevated frequencies of 6-thioguanine resistent lymphocytes in multiple sclerosis patients treated with cyclophosphamide// Mutat. Res. 1988. - V. 204. - P. 509-520.

96. Ammenheuser M.N., Au W.W., Whorton E.B. et al. Comparison of hprt variant frequencies and chromosome aberration frequencies in lymphocytes from radiotherapy and chemotherapy patients. A prospective study //

97. Environ. Mol. Mutagen.- 1991.- V. 18.- P. 126- 135.

98. Anstee D.J. Blood group MNS-active sialoglycoproteins of the human erythrocyte membrane// Immunobiology of erythrocyte/ Ed. by Sandler S.G., Nusbacher J., Schanfield M.S.- New York, 1980. P. 67.

99. Arlett C. F., Lehmann A. R. Human disorders showing increased sensitivity to the induction of genetic damage // Annu. Rev. Genet.- 1987.-V.12.- P.95-115.

100. Awa A. A, Neriishi S., Honda T. et al. Chromosome aberration frequency in cultured blood-cells in relation to radiation dose of A-bomb survivors // Lancet. -1971. V.2. - P. 903-905.

101. Awa A.A., Sofuni Т., Honda T. et al. Relationship between the radiation dose and chromosome aberrations in atomic bomb survivors of Hiroshima and Nagasaki //J. Radiat. Res.- 1978. V. 19. - P. 126-140.

102. Awa A. A., Ohtaki K., Iton M. et al. Chromosome aberration data for A-bomb dosimetry reassessment // New Dosimetry at Hiroshima and Nagasaki and Its Implications for Risk Estimates. 1988. - N 9. - P. 185-202.

103. Azzam E., deToledo S.M., Gooding Т., Little J. Intercellular communication is involved in the bystander regulation of gene expression in human cells exposed to very low fluencies of alpha particles// Radiation Res. 1998. - V. 150.-P. 497-504.

104. Baek K.H., Shin H.J., Yoo J.K. et al. p53 deficiency and defective mitotic checkpoint in proliferating T lymphocytes increase chromosomal instability through aberrant exit from mitotic arrest// J. Leukoc. Biol. — 2003. -V. 73.-N.6.-P. 850-861.

105. Bakalkin G., Yakovleva Т., Selivanova G. et al. p53 binds single-stranded DNA ends and catalyzes DNA renaturation and strand transfer// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1994. - V.91. - N 1. - P. 413-417.

106. Baverstock К. Radiation-induced genomic instability: a paradigm-breaking phenomenon and its relevance to environmentally induced cancer// Mutation Res. 2000. - V. 454. - P. 89-109.

107. Bender M.A., Gooch P.C. Types and rates of X-ray-induced chromosome aberrations in human blood irradiated in vitro // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.-1962. V. 48. -N4. - P.522-532.

108. Bender M.A. Biological dosimetry: chromosomal aberration analysis for dose assessment // Vienna: IAEA. 1986. - P. 1- 69.

109. Bender M.A., Awa A.A., Brooks A.L. et al. Current status of cytogenetic procedures to detect and quantify previous exposures to radiation // Mutat. Res.- 1988. V. 196. - P. 103-159.

110. Berchuk A. Biomarkers in the ovary // J.Cell. Biochem. -1995. V.23. — P. 223-226.

111. Bergh J. Importance of p53 in the diagnosis and treatment of cancer // 23 ESMO congress. 1998. - P. 179-186.

112. Bernini L.F., Natarajan A.T., Schreuder- Rotteveel A.H.M. et al. Assay for somatic mutation of human hemoglobins// Mutation and the Environment, Part С / Ed. by Mortimer M.L. and Albertini R.J.- New York : Wiley-Liss, Inc., 1990. P. 57- 67.

113. Bigbee W.L., Langlois R.G., Swift M., Jensen R.H. Evidence for an elevated frequency of in vivo somatic cell mutations in ataxia teleangiectasia // Am. J. Hum. Genet. 1989. - V.44. - №3. - P.402-408.

114. BigbeeW.L., Langlois R.G., Stanker L.H. et al. Flow cytometric analysis of erythrocyte populations in Tn syndrome blood using monoclonal antibodies to glycophorin A and Tn antigen // Cytometry.-1990.-V.11.-P.261-271.

115. Bigbee W.L., Jensen R.H., Veidebaum T. et al. Glycophorin A biodosimetry in Chernobyl cleanup workers from the Baltic countries // В M J.-1996.- V. 312. P. 1078-1079.

116. Bigbee W.L., Jensen R.H., Veidebaum T et al. Biodosimetry of Chernobyl cleanup workers from Estonia and Latvia using the glycophorin A in vivo somatic cell mutation assay // Radiat. Research. -1997. -V.147. -P.215-224.

117. Boreham D.R., Gale K.L., Mavca S.R. et al. Radiation-induced apoptosis lymphocytes: potential as a biological dosimeter // Heals Physics. 1996. -V.71. - №5. - P. 685-691.

118. Bouffler S.D., Hofland N., Cox R., Fodde R. Evidence for Msh2 haploinsufficiency in mice revealed by MNU-induced sister-chromatid exchange analysis//Br. J. Cancer. -2000.- V. 83.-N. 10.-P. 1291-1294.

119. Bowersox J. Research gain insight into cellular delay // J. Nat. Cancer Inst.- 1992. -V.84. -P. 1859-1860.

120. Brenner M.B., MeLean J., Dialynas D.P. et al. Identification of a putative second T- cell receptor//Nature (Lond.). 1986.- V. 332. - P. 145.

121. Bryant P.E. DNA damage, repair and chromosomal damage// Int. J. Radiat. Biol. 1997. - V. 71. -N. 6. - P. 675-680.

122. Bunz F., Fauth C., Spcichcr M.R. Targeted inactivation of p53 in human cells does not result in aneuploidy// Cancer Res. 2002. - V.62. - N. 4. - P. 1129-1133.

123. Buschfort-Papewalis C., Moritz Т., Lidert В., Thomale J. Down-regulation of DNA repair in human CD34(+) progenitor cells corresponds to increased drug sensitivity and apoptotic response//Blood. 2002. — V. 100. -N3.-P. 845-853.

124. Cairns J. Somatic stem cells and kinetics of mutagenesis and carcinogenesis// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99. - N 16. - P. 10567-10570.

125. Caggana M., Liber H.L., Mauch P.M. et al. In vivo somatic mutation in the lymphocytes of Hodgkin's disease patients//Environ. Mol. Mutagen. -1991.-V. 18. — P. 6-13.

126. Callahan R. p53 mutations, another breast cancer prognostic factor // J. Nat. Cancer Inst. 1992. -V.84. -P.826-827.

127. Camplejohn R.S., Perry P., Hodgson S.V. et al. A possible test for inherited p53-related defects based on the apoptotic response of peripheral blood lymphocytes to DNA damage // British J. of Cancer. -1995. -V.72. -P.654-662.

128. Cheung A.M., Hande M.P. Jalali F. et al. Loss of BRCA2 and p53 synergistically promotes genomic instability and deregulation of T-cell apoptosis// Cancer Res. 2002. - V. 62. -N. 21. -P. 6194-6204.

129. Chumak A.A., Bazyka D.A., Beliaeva N.V. et al. Immunological effects in acute radiation sickness reconvalescents results of thirteen years of follow-up// Int. J. Radiation Medicine. - 2000. - V.l. - N 5. - P.65-82.

130. Cleary M.L., Sklar J. Nucleotide sequence of t (14; 18) chromosomal breakpoint cluster region near a transcriotionally active locus on chromosome 18 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V.82. - P.7439-7443.

131. Clevers H., Alarcon В., Wileman Т., Terhost C. The T cell receptor / CD3complex: a dynamic protein ensemble // Annu. Rev. Immunol.- 1988.- V. 6.-P. 629- 662.

132. Coffino P., and Scharff M.P. Rate of somatic mutation in immunoglobulin production by mouse myeloma cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1971.-V. 68.- P. 219

133. Cole J., Arlett C.F., Norris P.G. et al. Elevated hprt mutant frequency in circulating T-lymphocytes of xeroderma pigmentosum patients//Mutation Res. 1992.-V. 273.-P. 171-178.

134. Cole J. and Scopek T.R. Somatic mutant frequency, mutation rates and mutational spectra in the human population in vivo // Mutat. Res.-1994. -V.304. -P.33-105.

135. Coleman W.B., Tsongalis G.J. Role of genomic instability in human carcinogensis//Anticancer Research. 1999. - V. 19. — P. 4645-4664.

136. Crawford L.V., Pim D.E., Gurney E.D. et al. Detection of common feature in several human tumor cell lines 53000 dalton protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1981. -V.78. -P.41-45.

137. Crompton N.E.A., Ozasahin M. A versatile and rapid radiosensitiviti assay of peripheral blood leukocytes based on DNA and surface marker assessment of cytotoxity // Radiat. Research. -1997. -V.147. -P.55-60.

138. Crompton N.E.A Programmed Cellular Response in Radiation Oncology // Acta Oncologica Suppl. 1998, a. - V. 11.-P. 1-49.

139. Crompton N.E.A. Programmed cellular response to ionizing radiation damage//Acta Oncologica. 1998, b. - V.37. -№2. - P. 129-142.

140. Crompton N.E., Shi Y.Q., Wuergler F., Blattmann H. A single dose of X-rays induces high frequencies of genetic instability (aneuploidy) and heritable damage (apoptosis), dependent on cell type and p53 status// Mutat. Res. 2002. - V. 517. - P. 173-186.

141. Darzynkiewicz Z., Bruno S., Del Bino G. et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry // Cytometry. -1992. -V.13. P. 795-808.

142. Deiry V.S., Tokino Т., Wilson S.J. et al. WAF-1, a potent mediator of p53 tumor suppression//Cell. 1993. - V.75. - P.817-825.

143. Devi P.U., Hossain M. Induction of chromosomal instability in mouse hemopoietic cells by fetal irradiation// Mutation Res. 2000. - V. 456. - P. 33-37.

144. Donehower L., Bradley A. The tumor suppressor p53/A Biochimica et Biophysica Acta.- 1993.- V. 1155.-P. 181-205.

145. Down J.D., Boudewijn A., van Os R. et al. Variation in radiation sensitivity and repair among different hematopoietic stem cell subsets following fractionated irradiation// Blood. 1995. - V. 86. - N 1. - P. 122127.

146. Du Pont B.R., Grant S.G., Oto S.H. et al. Molecular characterization of glycophorin A transcripts in human erythroid cells using RT-PCR, allele-specific restriction, and sequencing// Vox Sang. 1995. - V. 68. - P. 121129.

147. Dubrova Y.E., Plumb M., Brown J., Jeffreys A.J. Radiation- induced germline instability at minisatellite loci // Int. J. Radiat. Biol.- 1998. V. 74.-N. 6.- P. 689- 696.

148. Ekblom M., Gahmberg G.G., Anderson L.C. Late expression of M and N antigens on glycophorin A during erythroid differentiation // Blood. 1985. -V.66. - P. 233-236.

149. El-Hizavi S., Lagowski J.P., Kulesz-Martin M., Albor A. Induction of gene amplification as a gain-of-function phenotype of mutant p53 proteins// Cancer Res. 2002. - V. 62. - N. 11. - P. 3264-3270.

150. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. Recent advances in the polymerase chain reaction//Science. -1991. V.252. - P. 1643-1651.

151. Eshleman J.R., Lang E.Z., Bowerfind G.K. et al. Increased mutational rate at the HPRT locus accompanies micro-satellite instability in colon cancer//Oncogene. -1995. V.10. - P.33-37.

152. Fan S., el-Deiry W.S., Bae I. et al. P53 gene mutations are associated with decreased sensitivity of human lymphoma cells to DNA damaging agents//Cancer Res. —1994. V. 54. - N 22. - P. 5824-5830.

153. Fergusson D.O., Sekiguchi J.A.M., Chang S. Et al. The nongomologous end-joining pathway of DNA repair is required for genomic stability and the suppression of translocation//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. -N 12.-P. 6630-6633.

154. Freiberg Т., Friend S.H. The importance of p53 alterations in human cancer, is there more than circumstantial evidence // J. Natl. Cancer Inst. -1993.-V.85.-P.1554-1557.

155. Fukuchi К., Tanaka K., Kumahara Y. et al. Increased frequency of 6-thioguanine-resistant peripheral blood lymphocytes in Werner syndrome patients // Hum. Genet. 1990. -V.84. -P.249-252.

156. Furthmayr H. Structural comparison of glycophorins and immunochemical analysis of genetic variants // Nature.-1978.-V.271.-P.519-526.

157. Giver C.R., Nelson S.L., Cha M.Y. et al. Mutational spectrum of X-ray induced TK-6 human cell mutants// Carcinogenesis. 1995. - V. 16. — N2. — P. 267-275.

158. Goh K. Total-body irradiation and human chromosome: cytogenetic studies of the peripheral blood and bone marrow leukocytes seven years after total-body irradiation//Radiation Res. 1968.-V. 35. - P. 155-170.

159. Goh K., Sumner H. Breaks in normal human chromosomes: are they induced by a transferable substance in the plasma of persons exposed to total-body irradiation? //Radiation Res. 1968. - V. 35. - P. 155-170.

160. Gottesman M.M. Molecular basis of cancer therapy // J. Nat. Cancer Inst. 1994.-V.86.-P.1277-1286.

161. Grant S.G, Bigbee W.L. In vivo somatic mutation and segregation at the human glycophorin A (GPA) locus: Phenotypic variation encompassing bothgene-specific and chromosomal mechanisms // Mutation Res.-1993.-V.288.-P. 163-172.

162. Green D.R., McGahon A. Martin F.M. Regulation apoptosis by oncogenes//J. Cell Biochem. -1996. -V.60. -P.33-38.

163. Grist S.A., McCarron M., Kutlaca A. et al. In vivo human somatic mutation: frequency and spectrum with age // Mutat. Res.- 1992. V. 266.- P. 189- 196.

164. Grosovsky A.J., Drobetsky E.A., deJong P.J., Glickman B.W. Southern analysis of genomic alterations in gamma-ray-induced aprt-hamster cell mutants// Genetics. 1986. - V. 113. -N 2. - P. 405-415.

165. Grosovsky A.J., Parks K.K., Giver C., Nelson S. Clonal analysis of delayed kariotypic abnormalities and gene mutations in radiation-induced genetic instability// Molecular and Cellular Biology. 1996. - V. 16. - N. 11.-P. 6252-6262.

166. Gui H.X., Cheng W.Y. Detection of the variant frequency in human erythrocytes using glycophorin A locus mutation assay // Radiat. Prot. Dosimetry. 1998. - V.77. - N1/2. - P.37-41.

167. Ha M., Yoo K.Y., Cho S.H. Glycophorin A mutant frequency in radiation workers at the nuclear power plants and a hospital// Mutat. Res. -2002.-V. 501.-P. 45-56.

168. Hagmar L., Brogger A., Hansteen I.L. et al. // Cancer risk in humans predicted by increased levels of chromosomal aberrations in lymphocytes: Nordic study group on the health risk of cromosome damage // Cancer Research.- 1994.- V.54.- P.2919-2922.

169. Hakoda M., Akiyama M., Kyoizumi S. Increased somatic cell mutant frequency in atomic bomb survivors // Mutat. Res.- 1988. V. 201.- P. 3948.

170. Hall A.G. The relationship between bcl-2 expression and response to chemotherapy in acute leukemia // Leukemia. -1995. V.9. - P.530.

171. Harms- Ringdahl M. Some aspects on radiation induced transmissible genomic instability // Mutat. Res.- 1998. V. 404.- P. 27- 33.

172. Harris C. Structure and functions of the p53 tumor suppressor gene: Clues for rational cancer therapeutic strategies // J. Nat. Cancer Inst.- 1996. V.88. - P.1442-1455.

173. Harvey A.N., Savage J.R. Investigating the nature of chromatid breaks produced by restriction endonucleases// Int. J. Radiat. Biol. 1997. -V. 71. -N. 1.-p. 21-28.

174. Havre P.A., Yuan J., Hedrick L.et al. p53 inactivation by HPV16E6 results in increased mutagenesis in human cells// Cancer Res. — 1995. V/ 55. -N. 19. P. 4420-4424.

175. Henderson L., Cole H., Cole J. et al. Detection of somatic mutation in man, evaluation of the microtiter cloning assay for T-lymphocytes//Mutagenesis.- 1986.-V. l.-P. 195-200.

176. Hess P., Aquilina G., Dogliotti E. Et al. Spontaneous mutations at aprt locus in a mammalian cell line defective in mismatch recognition//Somat. Cell Mol. Genet. 1994 V. 20. - P. 409-421.

177. Hewitt M., Mott M.G. The assessment of in vivo somatic mutations in survivors of childhood malignancy// Br. J. Cancer. 1992. - V. 66. - P. 143147.

178. Hirota H., Kubota M., Adachi S. et al. Somatic mutations at T-cell antigen receptor and glycophorin A loci in pediatric leukemia patients following chemotherapy: comparison with HPRT locus mutation// Mutat. Res.- 1994.-V. 315.- P. 95-103.

179. Hlatky L., Sachs R.K., Vazquez M., Cornforth M.N. Radiation-induced chromosome aberrations: insights gained from biophysical modeling// Bioessays. 2002. - V. 24. - N. 8. - P. 714-723.

180. Holmberg K., Mcijcr A.E., Harms-Ringdahl M., Lambert B.Chromosomal instability in human lymphocytes after low dose rategamma-irradiation and delayed mitogen stimulation// Int. J. Radiat. Biol. -1998.-V.73.-P. 21-34.

181. Ishioka N., Umeki S., Hirai Y. et al. Stimulated rapid expression in vitro for early detection of in T- cell receptor mutations induced by radiation exposure //Mutat. Ras.- 1997.- V. 390.- P. 269- 282.

182. Iwamoto K.S., Hirai Y. Umeki S. et al. Л positive correlation between T cell receptor mutant frequencies and dicentric chromosome frequencies in lymphocytes from radiotherapy patients // J. Radiat. Res.- 1994.- V. 35.- P. 92-103.

183. Jamali M., Trott K.P. Persistent increase in the rates of apoptosis and dicentric chromosomes in surviving V79 cells after X-irradiation// Int. J. Radiat. Biol. 1996. - V.70. - N6. - P. 705-709.

184. Janatipour M., Trainor K.J., Kutlaca R. et al. Mutations in human lymphocytes studied by an HLA selection system // Mutat. Res.- 1988. V. 198.- P. 221-226.

185. Jeffreys A.J., Neumann R. Somatic processes at a human minisatellite//Human Molecular Genetics. 1997. - V. 6. - N 1. - P. 129136.

186. Jensen R. H., Bigbee W., Branscomb E.E. Somatic mutations detected by immunofluorescence and flow cytometry// Bilogica dosimetry/ Ed. by W.G. Eisert and M.L. Mendelsohn . Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1984. -P.161-170.

187. Jensen R.H., Langlois R.G., Bigbee W.et al. Laser-based flow cytometric analysis of genotocity of human exposed to ionising radiation during the Chernobyl accident // SPIE, Laser applications in life sciences.-1990, a.-V.1403.-P.372-380.

188. Jensen R.H., Leary J.F. Mutagenesis as measured by flow cytometry and cell sorting // Flow cytometry and sorting. New York: Wiley-Liss, Inc., 1990, b. - P.553-562.

189. Jensen R.H., Langlois R.G., Begbee W.L. et al. Elevated frequency of glycophorin A mutations in erythrocytes from Chernobyl accident victims // Radiat. Res.- 1995.-V. 141.-P. 129- 135.

190. Jensen R.H., Bigbee W.L. Direct immunofluorescence labeling provides an improved method for the glycophorin A somatic cell mutation assay // Cytometry. -1996. V.23. - P.337-343.

191. Jensen R.H., Reynolds J.C., Robbins J. et al. Glycophorin A as a biological dosimeter for radiation dose to the bone marrow from iodine-131// radiation Res. 1997. - V. 147. - P. 747-752.

192. Jensen R.H., Moore D.H. Evolution of the glycophorin A assay for measuring biological effects of radiation on humans// Effects of ionizing radiation: atomic bomb survivors and their children/National Academy Press, 1998.-P. 271-280.

193. Jones I.M., Thomas C.B., Tucker B. et al. Impact of age and environment on somatic mutation at the hprt gene of T lymphocytes in humans// Mutat. Res.- 1995.-V 338.-P. 129-139.

194. Jones I.M., Galick H., Kato P. et al. Three somatic genetic biomarkers and covariates in radiation-exposed Russian cleanup workers of the Chernobyl nuclear reactor 6-13 years after exposure// Radiation Res. — 2002. — V. 158.— N. 4. P. 424-442.

195. Josefsen D., Myklebust J.H., Lynch D.H. et al. Fas ligand promotes cell survival of immature human bone marrow CD34+CD38- hematopoietic progenitor cells by suppressing apoptosis// Experimental hematology. 1999. -V. 27.-P. 1451-1459.

196. Kadhim M.A., Macdonald D.A., Goodhead D.T. et al. Transmission of chromosomal instability after plutonium a-particle irradiation// Nature. — 1992.-V. 355. -P. 738-740.

197. Kadhim M.A., Lorimore S.A., Hepburn M.D. et al. Alpha-particle-induced chromosomal instability in human bone marrow cells// Lancet. —1994.- V.344.- P. 987-988.

198. Kadhim M.A., Lorimore S.A., Townscnd K.M. et al. Radiation-induced genomic instability: delayed cytogenetic aberrations and apoptosis in primary human bone marrow cells// Int J Radiat Biol. 1995. - V. 67. - P. 287-293.

199. Kaghim M.A., Wright E.G. Radiation-induced transmissable chromosomal instability in haemopoietic stem cells// Adv. Space Res. -1998. V. 22. - N. 4. - 587-596.

200. Kastan M.B., Oniekwere O., Sitransky D. ct al. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage // Cancer Res.- 1991. -V.51. -P.6304-6311.

201. Kastan M.B. and Kuerbitz S.J. Control of Gi arrest after DNA damage // Environ. Health Perspect Suppl.- 1993. V. 101. - P.55-58.

202. Kastan M.B. Signalling to p53: Were does it all start?// Bioessays. -1996. -V. 18.-P. 617-619.

203. Kerr J.F.R. et al. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics //Br. J. Cancer. -1972. V.26. -P.239-257.

204. Kerr F.R., Winterford C.M., Harmon B.V. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy// Cancer. 1994. - V.73. - P.2013-2026.

205. Kern P., Keilholz L., Forster C. et al. In vivo apoptosis in peripheral blood mononuclear cells induced by low-dose radiotherapy displays a discontinuous dose-dependence // Int. J. Radiat. Biol.- 1999. V.75. - №8. -P.995-1003.

206. Ко L.J., Prives С. P53: puzzle and paradigm// Gen. Dev. 1996. - V. 10. -P. 1054-1072.

207. Kodama Y., Kushiro J., Hirai Y. et al. Frequent involvement of visible chromosomal deletion in X-ray- induced mutants at the HLA-A locus in human T-lymphocytes //Mutat. Res.- 1994.- V. 309.- P. 63- 72.

208. Kolesnikova A.I., Konoplyannikov A.G., Hendry J.H. Differentialsensitivity of two predominant stromal progenitor cell subpopulations in bone marrow to single and fractionated radiation doses// Radiat. Res.- 1995. V. 144. N 3. - P. 342-345.

209. Kotova N., Grawe J. Flow cytometric determination of HPRT-variants in human peripheral blood lymphocytes//Mutat. Res. 2002. - V. 499. -N 1. -P. 63-71.

210. Kroemer G. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis // Nature Medicine. 1997. - V.3. - №6. - P. 614-620.

211. Kuerbitz S.J., Plunkett B.S., Walsh W.V. et al. Wild type p53 is a cellular checkpoint determinant following irradiation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1992.- V.89.-P.7491-7495.

212. Kushiro J., Hirai Y., Kusunoki Y. et al. Development of a flow-cytometric HLA-A locus mutation assay for human peripheral blood lymphocytes // Mutat. Res.- 1992.- V. 272.- P. 17-29.

213. Kusunoki Y., Kyoizumi S., Kubo Y. et al. Possible role of natural killer cells in negative selection of mutant lymphocytes that fail to express the human leukocyte antigen-A2 allele//Mutation Res. 2001.- V. 476. - P. 123-132.

214. Kyoizumi S., Nakamura N., Takebe H. et al. Frequency of variant erythrocytes at the glycophorin-A locus in two Bloom's syndrome patients // Mutat. Res. 1989, a. - V.214. - P.215-222.

215. Kyoizumi S., Nakamure N., Hakoda M. et al. Detection of somatic mutations at the glycophorin A locus in erythrocytes of atomic bomb survivors using a single beam flow sorter // Cancer Res.- 1989, b. V. 49. -P. 581- 588.

216. Kyoizumi S., Akiyama M., Hirai Y. et al. Spontaneous loss and alteration of antigen receptor expression in mature CD4+ T cells // J. Exp. Med. 1990. - V.171. -P.1981-1999.

217. Kyoizumi S., Akiyama M., Umeki S., Hirai Y. et al. Frequency of mutant T lymphocytes defective in the expression of the T-cell antigen receptor gene among radiation-exposed people // Mutat. Res. -1992. V.265. - P. 173-180.

218. Kyoizumi S., Akiyama M., Cologne J.B. et al. Somatic cell mutations at the glycophorin A locus in erythrocytes of atomic bomb survivors: implications for radiation carcinogenesis // Radiat. Res.- 1996. V. 146. - P. 43- 52.

219. Kyoizumi S., Kusunoki Y., Seyma T. et al. In vivo somatic mutations in Werner's syndrome // Hum Genet. 1998. - V.103. - №4. - P. 405-410.

220. Lane D.P., Crawford LV. T-antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells//Nature. 1979. - V. 278. - P.261-263.

221. Lane D.P. Cancer. P53, guardian of the genome // Nature. -1991. V.358. -P. 15-16.

222. Langlois R.G., Bigbee W.L., Jensen R.H. Flow cytometric characterization of normal and variant cells with monoclonal antibodies specific for glycophorin A//J. Immunol.- 1985.-V.134.-P.4009-4017.

223. Langlois R.G., Bigbee W.L., Jensen R.H. Measurement of the frequency of human erythrocytes with gene expression loss phenotypes at the glycophorin A locus // Hum. Genet.- 1986.- V. 74.- P. 353- 362.

224. Langlois R.G., Bigbee W.L., Kyoizumi S. et al. Evidence for increased somatic mutations at the glycophorin A locus in atomic bomb survivors // Science. 1987. - V. 236. - P. 445- 448.

225. Langlois R.G., Bigbee W.L., Jensen R.H., German J. Evidence for increased in vivo mutation and somatic recombination in Blooms syndrome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V.86. - P. 670-674.

226. Langlois R.G., Nisbet B.A., Bigbee W.L. et al. An improved flow cytometric assay for somatic mutation at the Glycoforin A locus in humans // Cytometry. 1990. -V.l 1. - P.513-521.

227. Langlois R.G., Akiyama M., Kusunoki M. et al. Analysis of somatic cell mutations at the Glycophorin A locus in Atomic bomb survivorsra comparative study of assay methods // Radiat. Res.- 1993. -V.136. P.l 11117.

228. Lee J.M., Abrahamson J.L., Kandel R. et al. Susceptibility to radiation-carcinogenesis and accumulation of chromosomal breakage in p53 deficient mice // Oncogene. 1994. - V.9. - P.3731 -3736.

229. Levine A.J., Momand Y., Finlay C.A. The p53 tumor suppressor gene // Nature. 1991. - V.35I. -P.453-456.

230. Li F., Fraumeni J.Jr. Soft-tissue sarcomas, breast cancer and other neoplasms: a fammilian syndrome // Ann. Int. Med.- 1969. -V.71. -P.747-53.

231. Li C.Y., Yandell D.W., Little J.B. Molecular mechanisms of spontaneous and induced loss of heterozygosity in human cells in vitro//Somat. Cell. Mol. Genet. 1992. - V. 18. -N 1. - P. 77-87.

232. Li C. Q., Trudel L.J., Wogan G.N. Nitric oxide-induced genotoxity, mitochondrial damage, and apoptosis in human lymphoblastoid cells expressing wild-type and mutant p53// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. -V. 99.-N 16.-P. 10363-10369.

233. Liang L., Shao C., Deng L. et al. Radiation-induced genetic instability in vivo depends on p53 status// Mutat. Res. 2002. - V. 502. - P. 69-80.

234. Lim D.S., Hasty P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53// Mol. Cell. Biol. — 1996- V. 16.-P. 7133-7143.

235. Limoli C.L., Ponnaiya В., Corcoran J.J. Chromosomal instability induced by heavy ion irradiation// Int. J. Radiat. Biol. 2000. - V. 76. - P.1599-1606.

236. Lips J., Kaina B. DNA double-strand breaks trigger apoptosis in p53-deficient fibroblasts //Carcinogenesis. -2001.- V. 22. N 4. - P. 579-585.

237. Little J. DNA damage, recombination and mutation//Molecular mechanisms in radiation mutagenesis and carcinogenesis/Ed. by K.H. Chadwick et al. European Commission, Brussels, 1994. - P. 123-129.

238. Little J.B. Radiation-induced genomic instability // Int. J. Radiat. Biol. -1998. V.74. - №6. - P.663-671.

239. Livingstone L.R., White A., Sprouse J. et al. Altered cell cycle arrest and gene amplification potential accompany loss of wild-type p53// Cell. 1992. -V. 70.-N. 6.-P. 923-935.

240. Lloyd D.C., Purrott R.J., Dolphin G.W.et al. The relationship between chromosome aberrations and low LET radiation dose to human lymphocytes // Int. J. Radiat. Biol.-1975. V.28. - P. 75-90.

241. Lloyd D.C., Purrott R.J., Reeder E.J. The incidence of unstable chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes from unirradiated and occupationally exposed people // Mutat. Res.- 1980. V. 72.- P. 523532.

242. Loken M.R., Shah V.O., Dattilio K.L., Civin С. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow. I. Normal erythroid development // Blood. -1987.-V.69.-P.255-263.

243. Lothe R.O., Fossel Т., Danielson E. et al. Molecular genetic studies of tumor suppressor gene regions on chromosomes 13 and 17 in colorectal tumor // J. Nat. Cancer Inst.- 1992. V. 84. -P. 1100-1108.

244. Luchnik N.V., Sevan'kaev A.V. Radiation-induced chromosomal aberrations in human lymphocytes. I. Dependence on the dose of gamma-rays and anomaly at low doses//Mutat. Res. 1976. - V. 36. - P. 363-378.

245. MacDonald D., Boulton E., Pocock D. et al. Evidence of genetic instability in 3 Gy X-ray-induced mouse leukaemias and 3 Gy X-irradiatcdhaemopoietic stem cells// Int. J. Radiat. Biol. 2001. - V. 77. - N. 10. - P. 1023-1031.

246. Maher V.M., McCormick J.J. Role of DNA lesions and excision repair in carcinogen-induced mutagnesis and transformation in human cells//Biochemical basis of chemical carcinogenesis/Ed. by H. Greim et al. -New York: Raven Press, 1984. P.143-158.

247. Marmorstein L.Y., Ouchi Т., Aaronson S.A. The BRCA2 gene product functionally interacts with p53 and Rad51// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998.-V. 95.-N23.-P. 13869-13874.

248. Marolleau J.P.,Fondel J.D., Malissen M., et al. The joining of germline Va to Ja genes replaces the preexisting Va Ja complexes in а T cell receptor a, P positive T cell line // Cell. - 1983.- V. 55.- P. 291.

249. Martin M., Ogburn C.E., Colgin L.M. et al. Somatic mutations are frequent and increase with age in human kidney epithelial cells // Human Molecular Genetics. -1996. V.5. - №2. - P.215-221.

250. McCarron M.A., Kutlaca A. and Morley A.A. The HLA-A mutation assay: improved technique and normal results // Mutat. Res.- 1989. V. 225.-P. 189- 193.

251. Menichini P., Abbondandolo A. Somatic gene mutation in humans // New Horizons in Biological Dosimetry. New York: Wiley-Liss, Inc., 1991. - P. 267-279.

252. Miles C., Meuth M. DNA sequence determination of gamma-radiation-induced mutations of the hamster aprt locus// Mutat. Res. 1989. - V. 227. -P. 97-102.

253. Mombaerts P., Clark A.R., Rudnicki M.A. et al. Mutations in the T- cell antigen receptor alpha and beta block thymocyte development at different stages // Nature. 1992.- V. 360.- P. 225- 231.

254. Moore D.H., Tucker J.D., Jones I.M. et al. A study of the effects of exposure on cleanup workers at the Chernobyl nuclear reactor accident usingmultiple end points // Radiat. Res.- 1997. V. 148.- P. 463- 475.

255. Morley A.A., Cox S., Wigmore D. et al. Enumeration of thioguanine-resistent lymphocytes using autoradiography// Mutation Res. 1982. - V. 95.-P. 363-375.

256. Morley A.A., Trainor K.J., Seshadri R., Ryall R.B. Measurement of in vivo mutations in human lymphocytes // Nature. 1983. - V. 302.- P. 155156.

257. Morley A.A., Grist S.A., Turner D.R. et al. Molecular nature of in vivo mutations in human cells at the autosomal HLA-A locus // Cancer Res.-1990.- V. 50.- P. 4584-4587.

258. Morley A. A. The somatic mutation theory of ageing //Mutat. Res. 1995. -V. 338.-P. 19-23.

259. Mothersill C. and Seymour C. Radiation- induced bystander effects: past history and future directions // Radiat. Res.- 2001. V. 155.- P. 759- 767.

260. Myllyperkio M.H., Vilpo J. A. Increased DNA single-strand break joining activity in UV-irradiated CD34+ versus CD34- bone marrow cells//Mutat. Res. 1999.-V. 425.-N l.-P. 169-176.

261. Nelson S.L., Giver C.R., Grosovsky A.J. Spectrum of X- ray- induced mutations in the human hprt gene // Carcinogenesis.- 1994.- V. 15.- № 3.- P. 495-502.

262. Nicklas J.A., Falta M.T., Hunter T.C. et al. Molecular analysis of in vivohprt mutations in human T lymphocytes. V. Effects of total body irradiation secondary to radioimmunoglobulin therapy (RIT)// Mutagenesis. 1990. -V. 5. - N. 5.-P. 461-468.

263. Nicklas J.A., O'Neill J.P., Hunter T.C. et al. In vivo ionizing irradiations produce deletions in the hprt gene of human T-lymphocytes// Mutat Res. -1991.-V. 250.-P. 383-396.

264. Norman A., Sasaki M.S., Ottoman R.E., Fingerhut A.G. Elimination of chromosome aberrations from human lymphocytes // Blood. 1966.- V. 27.-P. 706-714.

265. Ochi-Lohmann Т.Н., Okazaki K., Madruga M.R. et al. Radiosensitivity of blood lymphocytes from basocellular carcinoma patients, as detected by the micronucleus assay // Mutat. Res. 1996. - V.357. - P.97-106.

266. Olsen L.S., Nielsen L.R., Nexo B.A., Wassermann K. Somatic mutation detection in human biomonitoring// Pharmacology&Toxicology. — 1996. -V/78.-P. 364-373.

267. Ostrosky- Wegman P., Montero R., Gomez M. and C. Cortinas De Nova 6- Thioguanine resistant T- lymphocyte determination as a possible indicator of radiation exposure // Environ. Mutagen.- 1987.- V. 9.- P. 81.

268. Otter W.D., Koten J.W.A 4-mutation model of carcinogenesis for tumor suppressor genes// Anticancer Research. 1999. - V. 19. - P. 4845-44852.

269. Ozsahin M., Ozsahin H., Shi Y. et al. Rapid assay of intrinsic radiosensitivity based on apoptosis in human CD4 and CD8 T-lymphocytes // Int. J. Radiat. Oncol. Phys.- 1997. V.38. - №2. - P.429-440.

270. Padovan E., Casorati G., Dellabona P. Et al. Expression of two T cell receptor л chains: dual receptor T cells // Science. 1993. - V. 262.- P. 422424.

271. Paquette В., Little J.B. In vivo enhancement of genomic instability in minisatellite sequences of mouse C3H/10T1/2 cells transformed in vitro by X-rays//Cancer Res. 1994. - V.54. - N12. - P. 3173-3178.

272. Pelevina 1.1., Afanasiev G.G., Gotlib V.Ya. et al. Exposure of cultured cells and animals (mice) within the 10-km zone of Chernobyl accident. Effect on sensitivity to subsequent irradiation//Radiat. Biol. Ecol. 1993. - V.33. -P. 85-92.

273. Pfeiffer P, Goedecke W, Obe G. Mechanisms of DNA double-strand break repair and their potential to induce chromosomal aberrations//Mutagenesis. 2000. - V. 5.- -N. 4. - P. 289-302.

274. Pfeiffer P., Gottlich В., Reichenberger S. DNA lesions and repair// Mutat. Res. 1996. - V. 366. P. 69-80.

275. Philippe J., Louagie H., Thierens H. et al. Quantification of apoptosis in lymphocyte subsets and effect of apoptosis on apparent expression of membrane antigens // Cytometry. -1997. -V.3 -P.241-249.

276. Plunkett W. Apoptosis. Oxford: CBC, 1995. - 35 p.

277. Ponnaiya В., Cornforth M.N., Ulrich R.L. Induction of chromosomal instability in human mammary cells by neutrons and gamma-rays// Radiat. Res. 1997. - V. 147. - P. 288-294.

278. Ponnaiya В., Limoli C.L., Corcoran J et al. The evolution of chromosomal instability in Chinese hamster cells: a changing picture?//Int. J. Radiat. Biol. 1998. - V.74. - N6. - P.765-770.

279. Potten C.S., Owen G., Booth D. Intestinal stem cells protect their genome by selective segregation of template DNA strands//J. Cell Sci. 2002. - V. 115. -P. 2381-2388.

280. Prost S., Bellamy C.O., Clarke A.R. et al. P53-independent DNA repair and cell cycle arrest in embrionic stem celIs//FEBS Lett. 1998. - V. 425. -P. 499-504.

281. Rached E., Schindler R., Beer K.T. No predictive value of the micronucleus assay for patients with severe acute reaction of normal tissue afler radiotherapy // European J. of Cancer. 1998. -V.34. -№3. -P.378 -383.

282. Reed J.C. Double 1 identity for proteins of the Bcl-2 family // Nature. -1997. -V387. -№19. -P.773-776.

283. Renan M.J. How many mutations are required for tumorigenesis? Implications from human cancer data // Mol Carcinogenesis. -1993. -V.7. -P.139-146.

284. Riches A.C., Bryant P.E., Steel C.M. et al. Chromosomal radiosensitivity in G2-phase lymphocytes identifies breast cancer patients with distinctive tumour characteristics// Br. J. Cancer. 2001. - V. 85. - N 8. - P. 11571161.

285. Rowan S., Fisher D.E. Mechanisms of apoptotic cell death // Leukemia. -1997.-V. 11.-P. 457-465.

286. Roy K., Kodama S., Suzuki K. et al. Delayed cell death, giant cell formation and chromosome instability induced by X-irradiation in human embrio cells// J. Radiat. Res. 1999. - V. 40. - P. 311-322.

287. Roy K., Kodama S., Suzuki K. et al. Hypoxia relieves X-ray-induced delayed effects in normal human embryo cells// Radiat. Res. 2000. - V. 154. - N. 6.-P. 659-666.

288. Rubin H. Cell damage, aging and transformation: a multilevel analysis of carcinogenesis// Anticancer Research. — 1999. V. 19. - P. 4877-4886.

289. Russo G., Isobe M., Pegoraro L., et al. Molecular analysis of a t(7; 14) (q35;q32) chromosome translocation in a T cell leukemia of a patient with ataxia telangiectasia // Cell.- 1988.- V. 53.- P. 137

290. Ryabchenko N., Nasonova V., Antoschina M et al. Persistence of chromosome aberrations in peripheral lymphocytes from Hodgkin's lymphoma remission patients//Int. J .Radiat. Biol. 2003. - V. 79. - N 4. -P. 251-257.

291. Sala-Trepat M., Boyese J., Richard P. et al. Frequency of HPRT-lymphocytes and glycophorin A variants erythrocytes in Fanconi anemia patients, their parents and control donors // Mutation Res.- 1993.-V.289.-P.l 15-126.

292. Samali A., Gorman A.M., Cotter N.G. Apoptosis the Story so far.// Experientia. -1996. -V.52. -№10-11. -P.933-941.

293. Sanderson B.J.S., Dempsy J.L., Morley A.A. Mutation in human lymphocytes: effect of X- and UV- irradiation // Mutat. Res.- 1984.- V. 140.-P. 223- 227.

294. Sasaki M.S., Takatsuj'i Т., Ejima Y. et al. Chromosome aberration frequency and rediation dose to lymphocytes by alpha- particles from internal deposit of Thorotrast // Radiat. Environ. Biophys.- 1987.- V. 26.- P. 227-238.

295. Savage J.R. A brief survey of aberration origin theories// Mutat. Res. — 1998. -V. 404.-P. 139-147.

296. Schmutte C., Fishel R. Genomic instability: first step to carcinogenesis//Anticancer Research. 1999. - V. 19. - P. 4665-4696.

297. Schwartz J.L., Jordan R., Evans H.H. et al. The p53 dependence of radiation-induced chromosome instability in human lymphoblastoid cells// Radiat. Res. 2003. - V. 159. - N. 6. - P. 730-736.

298. Scott D. Chromosomal radiosensitivity, cancer predisposition and response to radiotherapy // Strahlenther. Oncol. 2000. - V.176. -№5. -P.229-234.

299. Seifert A.M., Bradley W.C. and Messimg K. Exposure of nuclear medicine patients to ionising radiation is associated with rises in HPRT mutation frequency in peripheral T- lymphocytes // Mutat. Res.- 1987.- V. 191.- P. 57- 63.

300. Sevan'kaev A.V., Lloyd D.C., Edwards A.A. et al. High exposures to radiation received by workers inside the Chernobyl sarcophagus// Radiation Protection Dosimetry.- 1995.- V. 59.-N2.- P. 85-91.

301. Sevan'kaev A.V., Lloyd D.C., Edwards A.A. et al. Protracted overexposure to a I37Cs source: I. Dose reconstruction // Radiation Protection Dosimetry. 1999. - V. 81.- N 2.- P. 85- 90.

302. Shaw P.H. The role of p53 in cell cycle regulation// Pathology Research and Practice. 1996. - V. 192. - P. 669-675.

303. Simpson J.G. The natural somatic mutation frequency and human carcinogenesis // Cancer Research. -1997. P.209-240.

304. Srivastava S., Zou Z., Pirello K. et al. Germ-line transmission of mutated p53 gene in a cancer prone family with Li-Fraumeni syndrome // Nature. -1990. -V.243. -P.747-749.

305. Steen H. B. The origin of oncogenic mutations: where is the primary damage?//Carcinogenesis. 2000. - V. 21. - N 10.-P. 1773-1776.

306. Sterzbecher H.W., Donzelmann В., Henning W. et al. P53 is linked directly to homologous recombination processes via RAD51/RecA protein interaction// EMBO J. 1996. - V. 15. - N 8. - P. 1992-2002.

307. Straume Т., Langlois R.G., Lucas J.et al. Novel biodosimetry methods applied to victims of the Goiania accident // Health Physics.-1991.-V.60.-P.71-76.

308. Strauss G.H. and Albertini R.J. 6- Thioguanine resistant lymphocytes inhuman blood// Progress in Genetic Toxicology/ Ed. by D. Scott, B.A. Bridges and F.H. Sobels. Amsterdam: Elsevier Press, 1977. - P. 327- 334.

309. Strom S.S., Gu Y., Sigurdson A.J. et al. Chromosome breaks and sister chromatid exchange as predictors of second cancers in Hodgkin s disease // Leukemia and Lymphoma. 1998. - V.28. - P.561 -566.

310. Taga M., Shiraishi K., Shimura T. et al. Increased frequencies of gene and chromosome mutations after X-irradiation in mouse embryonal carcinoma cells transfected with the bcl-2 gene // Japanese Journal of Cancer Research. -2000. V.10.-P.994-1000.

311. Tang W., Willers H., Powell S.N. p53 directly enhances rejoining of DNA double-strand breaks with cohesive ends in gamma-irradiated mouse fibroblasts// Cancer Res. 1999. - V. 59. - N 11. - P. 2562-2565.

312. Tates A.D., Bernini L.F., Natajaran A.T. et al. Detection of somatic mutations in man: HPRT mutations in lymphocytes and hemoglobin mutations in erythrocytes // Mutat. Res.- 1989. V. 213. - P. 73- 82.

313. Tawn E.J., Daniel C.P., Whitehouse C.A. et al. Advances in the approach to the study of somatic mutations in workers occupationally exposed to ionising radiation // Health effects of low dose radiation. — BNES, London. -1997.-P. 16-21.

314. Thor A., Moore D.H.I., Adgerstan S.M. et al. Accumulation of p53 tumor suppressor gene protein an independent marker of prognosis in breast cancer //J. Nat. Cancer Inst. -1992. V.84. -P.845-855.

315. Tofilon P.J., Meyn R.E. reduction in DNA repair capacity following differentiation of murine proadipocytes//Exp. Cell Res. 1988. - V.174. -N 2.-P. 502-510.

316. Tomita M, Furthmayr H., Marchesi V.I. Primary structure of human erythrocyte glycophorin A. Isolation and characterization of peptides and complete amino acid sequence // Biochemistry. -1978. V. 17. - P. 47564770.

317. Trosko J., Chang C.-C. Relationship between mutagenesis and carcinogenesis// Photochemistry and photobiology. 1978. -V. 28. - P. 157168.

318. Trott K.R., Jamali M., Manti L., Teibe A. Manifestation and mechanisms of radiation-induced genome instability in V79 Chinese hamster cells// Int. J. Radiat. Biol. 1998. - V.74. - N6. - P. 787-791.

319. Tsuzuki Т., Fujii Y., Sakumi K. Et al. Targeted disruption of the Rad51 gene leads to lethality in embryonic mice// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. -1996.-V. 93.-N. 13.- 6236-6240.

320. Tucker J.D., Tawn E.J., Holdsworth D. Biological dosimetry of radiation workers at the Sellafild nuclear facility // Radiation Reseach.- 1997.-V.148.-P.216-226.

321. Turner D.R., Morley A.A. Human somatic mutation at the autosomal HLA-A locus // Prog. Clin. Biol. Res. 1990. - V. 340.- P. 37- 46.

322. Ullrich R.L., Ponnaiya B. Radiation-induced instability and its relation to radiation carcinogenesis // Int. J. Radiat. Biol. 1998. - V. 74. - N 6.- P. 747754.

323. Umeki S., Kusunoki Y., Endo K. et al. Somatic mutation at the TCR locias a biological dosimeter of radiation- exposed people // Proc. Int. Conf. Rad. Effects and Protection, Mito, Japan, Japan Atomic Energy Research Institute, Tokyo.-1992.-P. 151-154.

324. Umeki S., Suzuki Т., Kusunoki Y. et al. Development of a mouse model for studying in vitro T-cell receptor gene mutation // Mutat. Res. 1997. - V. 393.-N. 1-2.-P. 37-46.

325. UNSCEAR: United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation. Fifty-first session. Epigenetic effects of exposure to ionizing radiation. Vienna, 2003. - 24 p.

326. Vermes I., Haanen C. Apoptosis and programed cell death in health and disease // Adv. Clin. Chem. -1994. -V.31. -P. 177-246.

327. Vijayalaxmi A., Wunder E., Schroeder T.M. Spontaneous 6-thioguanine-resistant lymphocytes in Fanconi anemia patients and their heterozygous parents// Human Genet. 1985. - V. 70. - P. 264-270.

328. Wang X. W. Role p53 and Apoptosis in Cancerogenesis// Anticancer Research. 1999. -V.19. - P.4759-4771.

329. Watson G.E., Lorimore S.A., Clutton S.M. Genetic factors influencing alpha-particle-induced chromosomal instability// Int. J. Radiat. Biol.-1997. -V.71.-P. 497-503.

330. Watson G.E., Pocock D.A., Papworth D. et al. In vivo chromosomal instability and transmissible aberations in the progeny of haemopoietic stemcells induced by high- and low-LET radiation// Int. J. Radiat. Biol. 2001. -V. 77.-N.4.-P. 409-417.

331. Williams J.R., Frank J. Induced hypermutability: A newly observed cellular effect of x- rays which may be important in carcinogenesis // Radiat. Res.- 1982.- V. 91.- N 2.- P. 368- 371.

332. Wright E.G. Radiation-induced genomic instability in haemopoietic cells// Health effects of low dose radiation. London: ENES, 1997. — P. 2732.

333. Wyllie A. Clues in the p53 murder mystery// Nature. 1997. - V. 389. -P. 237-238.

334. Yin Y., Tainsky M.A., Bischoff F.Z. et al. Wild-type p53 restores cell cycle control and inhibits gene amplification in cells with mutant p53 alleles// Cell. 1992. - V. 70. -N. 6. - P. 937-938.

335. Yonish-Rouach E. The p53 tumour supressor gene: a mediator of a Gj growth arrest of apoptosis // Experientia. 1996. -V.52. - №10-11. - P. 10011007.

336. Zorning M., Hueber A.O., Baum W., Evan G. Apoptosis regulators and their role in tumorigenesis// Biochemica et Biophysica Acta. — 2001. — V. 1551. — P. F1-F37.

Информация о работе

Замулаева, Ирина Александровна
доктора биологических наук
Обнинск, 2003
ВАК 03.00.01

Диссертация

Генные мутации в соматических клетках человека IN VIVO: радиобиологические закономерности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы