Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Быстрые изменения внеклеточного рН, связанные с синаптической передачей в срезах мозга

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Быстрые изменения внеклеточного рН, связанные с синаптической передачей в срезах мозга"

Ордена Ленина Аквденил Наук УССР Ордена Трудового Красного Знамени Институт Физиологии ии.А.А.Богомольца

на правах рукописи ВЫСОЦКАЯ Татьяна Николаевна

БЫСТРЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОГО рН. СВЯЗАННЫЕ С СИНАПТИЧЕСКОИ ПЕРЕДАЧЕЙ В СРЕЗАХ МОЗГА..

специальность 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КИЕЗ-1990

Работа выполнена в Институте физиологии ин.Л.А.Бого-нольца АН УССР.

' Научный руководитель -член-корреспондент АН СССР профессор 0.А.Крышталь.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Селянко А.А..

кандидат биологических наук Пархоненко Н.Т.

Ведущее учереждение: Киевский государственный

университет ин.Т.Г.Шевченко

Защита диссертации состоится «е^« декабря 1990 на заседании специализированного совета Д-016.15.01 при Институте физиологии ин. А.А.Богомольца АН УССР СКиев, ул. Богонольца.О.

С диссертацией нохно ознакониться в библиотеке Института Физиологии ин. А.А.Богонольца АН УССР.

Автореферат разослан «с^"« ноября 1990.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

3. А.Сорокина-Марина

ОБЩАЯ ХАРАХТЕРИСТЖА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Важнейшин Фактором гоиеостаза является постоянство кислотно-щелочного равновесия в органиэнс Внеклеточные изненення рН не только отражают амортизационные процессы,связанные с удаленней из клетки кислых метаболитов но, и характеризуют ее Функциональную активность. Однако, изменения внеклеточного рН, связанные с функциональной активностью нейронов изучены недостаточно. Обычно, в таких работах используются ионселехтивныэ электроды, что сразу ограничивает область исследований, как по временному разрешэник>, так и по чувствительности. Из-за этого большинство сходных по тенатике работ посвящено исследованию патологически? состояний нозга, таких как распространяющаяся депрессия или ишения, где процессы характеризуются большей анплитудой и развиваются сравнительно недленио. Однако и тут инеются серьезные расхождения, как в экспериментальных результатах,так и в гипотезах относительно природы исследуеных феноменов.

Теи врененен, общеизвестно, что даге ■ малые иэненения рН оказывают существенное влияние на зффективн9ст сина-тической передачи,' на работу пре- и постсинаптической мембраны. Хгтя эти влияния обычно рассматриваются как модулирующие, существует' экспериментально обоснованная гипотеза /Thomas Roer, 1987), утверадаюп т, что изменения рН во внеклеточном принрчбр шон пространстве являются важнейшим неханизном, опосредующим действие торнозных медиаторов.

Нужно отметить и ряд экспериментально обнаруженых феноменов, функциональная роль которых пока остается неизвестной. Так, в 'последнее время появилось большое количество работ, посвященных водородным каналан в нейрональных мембране^. В 1980 г. 0. Крыпгалем . и В.Пидопличко в мембране сенсорных нейронов, & затеи и е нейронах ЦНС СС.В.Врублевский и др.,1983? была обнаружена Н+ - г .тивнруемая селективная натриевая проводиность, исследования которой

продолжаются в нескольких лабораториях.

Таким образом, есть иного косвенных свидетельств наличия различных механизмов очень четко и специфически регулирующих рН во вреня Функциональной активности нервных клеток. Их изучению и посвящена данная работа. Цель и основные задачи:

1. Разработать высокочувствительный метод иэнерения рН в межклеточном пространстве, позволяющий регистрировать быстрые изненения данного паранетра С в миллисекунднон диапазоне времени).

2. С помощью разработанного нетода исследовать изненения рН, происходящие при синаптической передаче в срезах гиппокампа.

Изучить фармакологические свойства маблюдаеных изменений. Научная новизну. 3 данной работе разработан и впервые применен метод оптической регистрации быстрых сверхслабых изменений рН в срезах нозга.

Впервые описаны и исследованы быстрые изменения рН, во вреня вызванной электрофизиологической активности срезов нозга.

Показано, что они связаны с синаптическини процессами и развиваются только в зоне синаптических контактов, причеи развитие этих изменений коррелирует с развитием ВПСП и другини Физиологическими параметрами синаптической передачи. Динаника, а также избирательное действие фармакологических агентов на первую и вторую Фазы изменений рН, позволяет говорить о различной локализации этих процессов. Подавление первой фазы ы-конотоксином -блокатором высокопороговых Са-каналов и-типа, отвечающих за выброс медиатора, а также Нд и глутанатом позволяет считать, что она сопровождает процесс выброса иедиатора. Вторая фаза является результатом нескольких процессов, происходящих в синаптической щели и мембранах глиальных клеток. Она рпрс ;еляется активацией работы таких фгрнентов как карбоаигид[.^за, ацетилхолинэстераза и очнсоз АН'-аза. Наибольший вклад в амплитуду щелочной Фазы вносит работа

eis НСОЗ насоса, в то время как качн обмен, согласно экспериментальна данным, не участвует в ее -Joрнирооашш. Практическая ценность. Исследование представляет интерес для Физиологов и Фармакологов, поскольку касается таких нарукенк:'! работы мозга, как распространявшаяся депрессия и ишения . Q работе такге исследовано действие препаратов, прикеняемих в недицинско.1 практике.

Разработанный метод регистрации быгтрнх изменении кислотно-склочного равновесии в ткани попет Ci ь использован npi. испытаниях нович лекарственных средств.

АпроОашш работа. Осиовнш положения работы бмлч поедстазленм 1»л

семинарах секции «!1эПро'1изиолсгии«Инстнтута Физиологии и:;. Д. Л. Богомольна AI! УССР СКиев, 19П6-19905, семинаре в Институте биохимии ЦЕН Ali СССР СПур'чно,19233, кон?еренш!Ях полодкх ученк. г. Киева СКиев,19?35 м Киевского отделен!:? МП'Н Cf,ney,i9"~j. Всесоюзно!) конференции но ме/Зронаукап пос. 100-летт-? ¡'орошгам СКиев, 1S365 И Konferenz dsr Klinischen nrwi Siporiunntellen !!~iro Wissenüohaftnn, Спо программе «ИнтернозгО Clla8d<>b"rfl.19835 . ООьеп и структура диссертации. Диссертация состоит из вселения, I глав, посвяшеншк: обзору литературы, описании методики, ггг-перннентальным результатам и их обсуждению, сиаолоз и гписха лчт:-ратуры,содержащего 110 наименования. Работа пзлокепа на ИМ '"грт-ницзх наиинописного текста,иллюстрирована 2 схемами л И рисунксх"

МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ. Четкая морфологнческгя.гнстологнческая структура, хором? изученные связи и особенности организации синаптических контактов определили выбор гиппоканпа как основного объекта исслсдозгл«!:',. Часть контрольных и иллюстративных з-сперинентов была ирог ^дема на зубчатой Фасции и мозжечке.

Для достизения целей нашего исследования ..еобходимо било

з

■объединить нетод электро}изиологических изнерений в переживающих срезах нозга и разработанную нани методику регистрации быстрых сверхслабых оптических сигналов СКрышталь O.A., Осипчук Ю.В., Шелест, Т. Н.СВысоцкая), 19865,.

Нетод работы с переживаюиини срезами описан во нкожестве работ Ced. Kerkut O.A., H.V.Wheal, 1961, ed. Dingledin, 1S84, Отнахов И др., 19865, с успехом и широко применяется в различных модификациях. Мной использовался один из стандартных его вариантов.

Суть метода регистрации быстрых сверхслабых оптических сигналов заключается в следующем!.

' В месклеточнон пространстве среза находится непонимающий краситель, имеющий различные максинуны поглощения для протонированной и непротонированной форны. Если происходят изменения pH- меняется светопропускание среза. Мы направляем пучок света через исследуеную зону среза на фотодиод и изнеряен изменение светового потока, как во вреня стимуляции проводящих путей, так и в ее отсутствие. Т.е.эксперимент выглядит следующим образон: в одной цикле,длительностью 2 сек одиночным инпульсон при стимуляции Шафферовских коллатералеб, одновременно регистрируется популяционный спайк и изнеряется поток света через срез; за ник • следует такой se контрольный цикл только без стимуляции. Но так как изменения потока в измерительном и контрольной цикле налы и сравнимы с оумани, для повышения соотношения сигнал\шун применяется методика синхронного накопления т.е. происходит пропорциональная суннация достаточно большого количества таких двойных циклов синхронизированных с началом стимуляции.

Аппаратно нетод был реализован в следующей виде: Источником света служила галогенонаполненная лампа накаливания мощностью 150 Вт. Свет от л^мпы пр :одил через тепловой фильтр и,с помощью короткого конически/о световода с' диаметрон кончика 200 мкн, прижатого вплотную к. верхней поверхности среза, направлялся на

выбранный участок.

Прошедший через срез световой поток., с поношью 100-кратного объектива инвертированного никроскопа Снасляная инне{ ия, числовая аппертура 1,33 проецировался, через абсорбционный стеклянный фильтр с максимумом пропускания на длине волны 560 ни Свах для непротонированной формы красителя Э на площадку Фотодиода СВР-34 ФРГЭ со следуювяни характеристиками:чувствительность- 70 нА/лкс, среднеквадратичный шун в полосе до 1МГц - ЗпА. Сигнал с фотодиода подавался на преобразователь ток-напрязение с сопротивлением обратной связи 50 МОн, после чего усиливался в 1000 раз и поступал на вход другого канала АЦП.

Для устранения больших по амплитуде, но несенных изменений оптического сигнала использовалась схема цифровой коррекции нуля. Для устранения высокочастотной составляющей использовалась подпрограмма цифровой фильтрации сиги ла, работаюямя по формуле Хзннинга СРебинер, Гоулд, 1978Э.

В качестве индикатора pH приненялся феноловый красный,в концентрации 200 нкноль.

Методика обладает очень высокой чувствительного» и быстродействием по сравнению, с применяемыми ранее методикани использующими pH- чувствительные никрчзлектроды. Совместно с финскими ;оллегами Dr. к. Kai la u J.voipio из Хегси: .-кого университета, мы провели сравнение обоих методик, подтвердившее технические достоинства описывагчой методики,а также ряд совместных экспериментов и дополнительную калибровку наших измерений.

#

Ркс.1. Блох-схена установки:

/.- срез мозга; В- стимулируьсшй элгхтрод С-отводякий электрод В,Е- подача раствора Г- дно каперы

0-пластиковыА световод И- конденсор

3- иинерсионный объектив микроскопа

1- абсорБцнонний фильтр К-фотодиод

Ь -преобразователь ток-напрязсгние

М- усилитель МХ-аналоговый мультиплексор; АВС-аналого-Цифрово й преобразователь; ПАСг-цнфро-аналогов преобразователь для стинуляшш; ВАС1-ЦАП для схемы

коррекции нуля; РС-персоиальрап ЭВМ.

•Д.

V,

500т»

Рк;.2. Трехфазные изменения рН: диэлектрическое отееденме Моимхронмая оптическая регистрация сЗразвитие 1-Я и 2-А Ф'Чч .другой масштаб вренени <13все три фазы изненениИ рК при высокочастотной стимуляции

П

. РЕЗУЛЬТАТУ ИССПЕЮПАПЧ.

1. Трехфазные изменения p!¡ d гнплскрппэ.

Описание феномена. С срезах гнппоканпа взросли:: крыс пм-стинуляции Шзфферогаских коллатералей одиночным импульсом, более чеа в 200 опытах мы н&блядат синхронные с снналтической передачей трехфазные бьетрые изменения рН Срис.1) s области депонтов пирамидных клеток. Анплитуда 1-й фазы - быстрого закисления составляла 2-3 х 10-3 ед рН и длительность ее соответствовала длительности популяционкого ОПСП. За нею следе-чл пзлочной слзиг С 2-я фаза), анплитудг. которого сярьирсвзла 1-2 х Ю-z рК и длительность достигала 600-700 мсек. Эти дэе $азн, зарегистрирован!».!? кани впервые при вызванной злектрофизиологческой активности а срезах нозга и составили предмет дальнейшего исследования. Им такие наблюдали длительное заклсдение С 3-я Фаза), воэтхактэе после сзлочного сдвига и з ряде опытов контролировали и его изменения.

Такие se изменения рН зарегистрированы и в других отязлзх нозга, в частности: в зубчатой извилине -при стннуляшш пер{о-рантного пути; в нозгечке - при стимуляции параллельных волокон.

Повышение температуры до Э5 С, а такге изменение возраста животных от нескольких дней до несяцев - не внесло каких-либо качественных изменений в исследуеное явление.

2.'Доказательства синаптической природы эффекта .

Для проверки синаптической природы эффекта С 1-й и 2-й фазы) световод устанавливался и в других зонах гиппокампа- а границей синаптических контактов Шафферовских коллатералей. В слоях ориенс и ■альвеус, т.е. в зоне базальньк дендритов и- аксонов пирамидных клеток, ни одна из описанных фаз зафиксирована не была.

Исходя из этого мы предположили,' что инеем дело с изменением рН не во всем объеме межклеточного пространства, а только з зоне синаптической щели и ближайшей окрестности.

Антидромная стимуляция пирамидных нейронов гиппоканпа не вызывала изменений рН ни в одном из слоев , даже при увеличении количества накоплений до 1000. Из чего следует, что прохождение потенциала действия в соне нейрона или волокнах не является причиной возникновения изменений рН.

Латентный период, синхронность с ВПСП, зависимость от стимуляции и величины популяционного спайка.Как видно Сна рис.12 быстрое зачисление- 1-я фаза, имеет задержку, соответствующую латентному периоду синаптической передачи и синхронна с отрицательным изменением потенциала, что соответствует внеклеточно регистрируемому возбуядающему постсинаптическону потенциалу СВПСПЭ. Нувно отметить что нининальное значение быстрой фазы закисления коррелирует с пиком популяционного ВПСП.

Используя эффект физиологического облегчения и подавая следующий импульс через короткий пронеауток времени СЗО мсек.Э, мы получали увеличение анплитуды п-ВПСП и популяционного спайка. В таких условиях анплитуда 1-й фазы - быстрого закисления, и 2-й фазы - заиелачивания , возросла пропорционально .

Длительная стимуляция с частотой 80 Гц и следующая за ней длительная постетаническая потенцнация приводили к удлинению 1-й Фазы подкисления. Анплитуда яе 2-й щелочной и 3-й Фазы возростала не линейно при ДЯТП,

3. Блокирование и модуляция синаптической

передачи и их влияние на быстрые изменения рН.

о.) Ионами Не. Как'известно, двухвалентные катионы обратимо блокируют синаптическую передачу. В наших экспериментах обе фазы -и быстрое закисление, и защелачевание - полностью исчезали вместе с п-ВПСП и популяционным спайком при добавлении в рабочий раствор ионов Мд в концентрации 10 мМ.'

Так как конкурентный блок обратим , то при отмывке нормальный раствором ухе через 5-10 мин. Соколо 2 мин. - время диффузии в

в

срезе} синаптичесхая передача полностью восстанавливалась, а с' нею вместе востанавливались и изменения pH сохраняя ту se форму и амплитуду .

в) Синтетический w-конотокснн (oonotoxin). В работе ÍMcCleaky В.И., 1887) показано, чт^ w-конотоксин блокирует н и L-типы потенциалзависииых Са-каналов, причем именно Н-канал, согласно исследованиям (H.Kaniya et all, 1988), отвечает за высвобождение недиатора Св срезах гиппокампаэ и дахе в очень низких С100 пМЭ концентрациях блокирует синаптическую передачу.

При добавлени w-конотоксина в концентрации S юМ в рабочий раствор, уненьшался, а затеи и исчезал, популяционный спайк, что вело к исчезновению обоих фаз - как кислотной, так и в?лочноЙ.

в) Действие аденозина. Считается, что аденогин является синаптическим нодуляторон (Lunch, Shuber, 19S0). В работах (Clonchen, 197; Niz, 1978; Harns, 1978) показано, ЧТО OH подавляет высвобовдение недиатора через потенциалзазисиные Са-каналы пресинаптической нембраны. В мальк концентрациях аденозин уменшает как спонтанные , таг. и вызванные синаптические потенциалы, что сопровождается гиперполяризацней без каких-либо существенных изненений сопротивления клетки (М.Williams 1984).В более ранних работах (Segal м. 1982) с использованием методики внутриклеточного отведения показано постсинаптическое действие аденозина,' связанное • с изменением К+ проводимости. Таким образом, аденозин действует на обе пре- и постсинаптическую стадии процесса, однако в разных врененных и концентрационных диапазонах.

В наших экспериментах при подавлении синаптической передачи •большими концентрациями - 20 нкМ - исчезновение обеих фаз . Эффект действия аденозина полностью обратим. Однако нугно отметить что при неполной подавлении ответа ¿концентрация аденозина 2-3 мкМЭ наблюдалось более быстрое уменьшение кислой фазы. Этот Факт можно рассматривать ,как косвенное доказательство разлив .эй локализации

1-й и 2-й фазы.

г) Подавление синаптнческой активности высокими концентрациями глутамата. Как известно. возбуждающие аиинокислоты ногут присутствоэать ö нозгу в довольно высоких концентрациях, что часто связывают с их неспецифическин выделением нзглиальных клеток и другими не синаптическини процессами . Ломимо того, действуь на внесинаптические рецепторы, они могут повышать или понижать секрецию Медиатора (Levi О., Gallo 1881Э.

Высокие концентрации глутамата оказывали угнетающее действие на амплитуду фокального потенциала сон и деидритов пирамидных кле-токСАртеменко,Герасимов 1965) вплоть до полного подавления ответа . Однако, как показано в работе СКрышгаль и др. 19873, через некоторое время синаптическая передача в присутствийи глутамата восстанавливалась частично меняя свои фармакологические свойства.

В наши* экспериментах, при добавлении к раствору 2 сМ L-Giu, электрическая активность в срезе полностью подавляласи обе фазы иэненений pH - и быстрая кислая, и щелочная - исчезали. Однако, щелочная фаза исчезала быстрее.

При.восстановлении ответа («перестройке»), восстанавливались обе фазы и' популяционный спайк, Так же как и спайк, они пропорционально уменьшались по амплитуде.

При отнывке нормальный раствором, как до «перестройки», т.е. через 5-10 нин., и после «перестройки» - через 40-60 нин..величина ВПСП н попспайка полностью восстанавливалась,так же, как и амплитуды кислой и щелочной фазы . Единственное различие заключалось в той. что щелочная фаза была более лабильна. Так при аппликации относительно налых доз от 0,23 до 0.5 нМ L-Glu первым исчезал постсинаптический компонент полевого потенциала и вместе с нин, но не полностью, исчезала вторая фаза.

Такая динамика указыв'-гт на то, что 2-я фаза, по-видинону, больше обусловлена постсинаптическими процессами и включает в себя

несколько неханизнов, в отличие от первой. Хстя, ни та, ни другая не связаны с систеной обратного захвата глутаниновой кислоты, т.к. большие концентрации - 2-3 п1 Ь-С1и, которые .несонненно, существенно дестабилизируют ее работу, не нешают при «восстановлении» ответа наблюдать обе фазы.

4. Изучение путем фармакологического скрининга возкоязт • механизмов возникновения быстрых изменения рН.

1) Действие ингибиторов ацст.члхси .пэстеразы; атропина.

Задолго до начала изучения ацетилхолинэстеразы, как фермента участвующего в синаптической передаче С1932г.3 она была обн^ругена в крсви, плазме, кишечнике, плаценте и тд. Позже было показано наличие двух типов этого фермента - специфическая и неспецифическая холинэстеразы. Однако и специфическая АСЬЕ связывается не только с холинэргической систеной и как правило присутствует в систенах с другим типон недиатора.

С другой стороны, несмотря на пробленатичность норфологнческих доказательств пряных контактов холинергических волокон •с пирамидными нейронани гиппоканпа, ряд . Физиологических данных указывает, что существует возногность постсинаптических холинергических влияний на эти нейроны.

В результате действия этого фермента на .цетилхолин образуется холин и уксусная кислота.

Таким образон, ны не ногли обойти вниманиен хо..инергиче-кую .систему гиппоканпа, а иненно отрицать участие ацетилхолипостераз'ы в возникновении изменений рН.

Добавление в рабочий раствор необратимого блокатора ацетилхолиностеразы -фосфокола в концентрации 10 мкМ, не 'лияло на Фазу быстрого закисления, однако частично подавляло С^-ЗО^Э фазу защелачевания . При этой, вызванный стинуляц .ай Шафферовских

*оллатералей популяционыя спайк, практически не менялся.

Аналогичная картина наблюдалась и при воздействии другого блокатора ацетилхолиностеразы -армина, в концентрации 1 мкМ .

Такии образон, отсутствие воздействия на первую фазу позволяет не связывать ее с разложением ацетилхолина Сдо уксусной кислоты), вызвг'ныи пресинаптическим влиянием ацетилхолина на синаптическую передачу- Снаприиер, через подавление возвратного торможения (Робинсон, Рейсин, 1932)5.Подавление же второй фазы защелачивания объяснить значительно сложнее. В литературе отмечаются лишь незначительные пряные постсинаптические влияния АХ, которые осуществляются либо через дендритные синапсы, либо через соматическое действие при диффузии АХ.

Однако, опираясь на дальнейший опыт работы, автор склоняется к мнению, что действие. блокаторов ацетилхолиностерозы на щелочную фазу инеет неспецифический характер.

2) Действие ингибитора карСоангидразы - ацетозоламида.

Карбоангидраза катализирует образование угольной кислоты из COz и Н'О и обладает высокой специфичностью. Она представляет собой хорошо изученный иеталлофернент. присутствующий практически ео всех частях тела. В крови различают две его форны. Вторая в ненбранносвязаннон виде, в основной, и представление в нозгу Cv. S&pirstein 1884,). Она обладает более высокой скоростью реакции и большей эстеразной активностью. Гистологическими, иммунологическими И эволюционными иетоданн показано, что локализован он в глиальных клетках.

Ацетозоланид является . широкораспространенным в клинике и хорошо изученным ингибитором карбоангкдразы. Связываясь с цинком и имидозольныи азотон, он образует тройной конплекс закрывающий активный центр фермента.

Поскольку основная буферная емкость внеклеточной жидкости

определяется НС0»-СС* буферной счстеной, ингибирование картбоангидраэы должно влиять на внеклеточное рН.

Нуано отнетить разницу в результатах при исследованиях во и ишении. Согласно однин исследованиям (К1-а1в, 1983) ацетозоланид существенно, в несколько раз, увеличивает анплитуду и длительность как фазы защелачивания, так и , следующего за ней длительного кислотного сдвига, и при отон не влияет ка концентрации калия. Матч и Хансен в своей работе утверждают, что увеличивая щелочной сдвиг, ацетозоланид никак не влияет на третью кислую Фазу.

Интересны клинические наблюдения при применении диагарба Сацетозоланида). В связи с усилением выделения бикарбоната уненьшается щелочной резерв крови, нозет развится ацидоз.Понижается содержание СО* в крови. Увеличивается выделэние так«е и ионов К+. Уненьшается образование спинонозговой жидкости. Применяется при лечении эпилепсии СМашковский, 1Р83Э.

В наших опытах, при добавлении э раствор, днакарб в концентрации 10 нМ не оказывал какого-либо влияния на первую фазу быстрого закисления и уменьиал на 30--40Я амплитуду щелочного сдвига. При этой он не оказывал никакого токсического действия на срез: эффект был полностью •обратин. Так как зарегистрированный эффект противоположен результатам других авторов (при ишемии и БП), были проведены дополнительные эксперименты. В срезах с поиоиьй короткого периода аноксии вызывалась зпилептофорннья ¡активность. При этом щелочной сдвиг увеличивался по сравнению с норной. При добавлении в рабочий раствор диькарба обратимо снималась эпилептофорнная активность и уменьшалась величина щелочного сдвига. ■ Таким образом, ны видим что диакарб влияет на буферную енкость, однако, это изменение буферной емкости не является единственной причиной возникновения ' щелочной Фазы. Разно как й изменения концентрации НСОз, вызванные работой карбсакгндрагы либо блокадой этого фернеята. Противоположный знак эффекта дмахербг. по

сравнению с результатами для SD, может объясняться различной работой транспортных механизмов CHC0>sci обмен, СОг транспорт} в норне и патологии Ccrandall et al 11Q80.

з) Замена буферной системы НСОэ-СОг на HEPEs.

Подтверждением того, что исследуемый механизн не определяется свойствами бикарбонатного буфера и давлениен СОг. являются эксперименты с заменой этой буферной систены в рабочей растворе на ЕОнМ буфера HEPEs,а газовой смеси на кислород. Наблюдались обе фазыС 1-я и 2-я 3 исследуемого явления, без каких либо существенных изменений динаники и амплитуды.

В работе (Chesler,Chan 1988) на мозжечке проделана аналогичная замена, при изучении щелочного сдвига, с тем же эффектом.

Таким образом, результаты экспериментов свидетельствуют, что природа описанных Феноменов С1-я и 2-я фазьО не определяется ни фи-зико-хиническими свойствами буферных систем мозга СНе рассматривалась нн»-систена, но по литературным данным ее вклад, если и есть то, несущественный в данной временном диапазоне (Kraig Couper 198S -прямые измерения кн«));.ни с химизмом недиаторов Сразложе-ние, обратный захват}. Поэтому следующим естественный вагон было .рассмотреть ток ионов H+,NH«+ либо ОН", НСОа- по хено или электро-управляемым каналам в направлении их электрохимического градиента.

•О Эндогенный НСОз. НСОз проводимость через Ci ГАШС- активкруемие каналы. Действие Сикукулина.

Для тел и дендритов пирамидных нейронов гиппоканпа показано наличие ГАИК. рецепторов, контролируюгчх хлорную проводимость и блокирующихся бикукулинон CAiger et all 1982, Герасимов .Артеменко 19063 . С другой стороны, в работе С К Kalla J Voipio 19863 утверждается, что постсина'птические изменения рН внутри и на поверхности скелетных иывд речного рака вызваны НСО» проводимостью через ГАКК- активируемый хлорный канал.

В такой случае , если вовремя работы ГАМК- активируемых хлорных каналов через них по градиенту выходит НСО», то заблокировав их бикукулинон, ны, как мининум, должны увидеть уменьшение щелочного сдвига.

Бикукулин является конкурентный антагонистом различных, бикукулинчувствительных ГАБА рецепторов. Однако, он также является конкурентный блокатсром ацетилхолинэстеразы, что тоже привело бы к уменьшению щелочного сдвига.

Приненяя бикукулин в концентрации 0,03 мМ.'мы получили эффект пряно противоположный такой гипотезе, однако прекрасно согласующийся с предыдущини наблюденияни. А иненно,- вследствие уменьшения торнозного влияния ГАМК, в срезе под действием бикукулина, увеличивался ортодроиный ответ Споявлялаь эгшлептифорнная активность), а с нин и вторая, и третья фазы оптического ответа. На первую фазу букукулин не влиял. Однако его действие на вторую и особенно на третью фазу - длительное медленное закисление, было значительным и превышало то значение, которое ногло бы быть вызванно увеличением амплитуды электрического ответа. А разное действие бикукулина на 1-ю и 2-ю фазу, еще раз,4 хоть и косвенно свидетельствует, что эти фазы имеют разное происхождение. Так вызванное бикукулинон расторножеиие, коррелирует с увеличением щелочной фазы, тогда как первая Фаза остается неизненной.

Блокирование хлорной проводимости, поннмо описаного,могло вызвать эффекты второго порядка, а иненно- изменение С1/НС0а обмена. Поэтому дальше мы исследовали действие блокатора этого обнена.

•О Действие блокаторов сяМЮСН < анионного) оСмена: мтэ^тэ. •

После диффузии СОг в Сглиальную) клетку он разлагается тан с понощью карбоангидразы на Н+ и НСО«-. Увеличение внутриклеточного НСО* приводит к усилению выброса НСО» в обмен на

, внеклеточный Сх. И .наоборот, повышение концентрации НСО», либо другие факторы, такие как -деполяризация или изменения pH, могут обращать хлорный обмен. Характерные времена этого процесса С100 неек) - близки к пвлочной фазе.

Способность производных стильбен дисульфоновой кислоты: 4.4-диизо- тиоцианостилбено-2.2дисульфочовой кислоты - cdits> и 4-ацет- амид-4-нзотиоцианостибено-2,2-дисульфсн09ой кислоты-СБ1та> йнгибировать pH -регулирующий неханизн, была впервые показана для нейронов улитки стен r.and K»ntipiy 1Q78Ï. Его действие как высокоспецифического экстраклеточного ингибитора Cl/HCOa обмена в клетках млекопитающих описана б работе (Pàssow н and ail îeai).

Блокаторы, хотя и применяясь в высоких концентрациях - 0.3 нМ, . однако не оказывали вырахеного токсического действия на срез. Так, dits не влиял на 1-ю фазу быстрого закисления и существенно в 2 раза увеличивал щелочной сдвиг.

• Наличие С1\НС0» обмена , который ингибируется DITS и его .производными, показано для глиальных клеток (Bourke etall 1978,Ahmad et all 1982). Повидимону кы наблюдаен обращение хлорного обмена в глиальных клетках, связанное, с их деполяризацией, блокирование которого н приводит к увеличению защелачивания. , Подобное допущение подтверждается и данными CChecier, Krale 19373 о парадоксальном заиела-шванни глиальных клеток СастроцитовЭ во время высокочастотной стимуляции коры головного нозга крыс.

6) Действие ингибитора SaMi оРмеяа - амнлорнда.

Участие NavH постоянного обмена в быстрых изменениях первой

фазы казалось маловероятным, однако его участие во второй Фазе проверить было необходимо. Не только потому, что эти процессы совпадали по временный характеристикам но и потону, что в работах, изучающих подобные изменения при распространяющейся депрессии, экспериментальные данные противоречили друг другу. Так в работах (Chesiei-, 1968; Со1оз, 1936) анилорид не сказывал никакого

• IG

влияния на щелочной сдвиг, а в работе (Миьсь, 1884) он возрастал при добавлении анилорида в рабочий раствор.

В наших экспериментах (более 10) анилорид ' не оказывал никакого влияния ни на одну гз фаз (1-ю или 2-ю).

ОБСУЖДЕНИЕ.

Приведен некоторые общие сображения о тон, какие фнэико-хинические и Физиологические процессы ногли бы привести к изменениям рН в такой систене - пространство синаптической пели, отделенное от внутриклеточного пространства нейрональныни - пост-, пресинаптическими и глиальными мембранами , и происходить в интересующем нас диапазоне времени - до 1сек.

Из опытов на сравнительно простых ненбранах - митохондрий, липосон и тд., известно, что выравнивание концентраций протонов при приложении протонного эквивалента - кислоты или щелочи,ииеет полупериод порядка минут, что значительно меньше, чен для одновалентных ионов натрия или калия. С другой стороны, концентрация протонов в биологических систенах Ю-», а одновалентных ионов - 10-», следовательно,- проницаемость иенбран для протонов должна быть на несколько порядков выше. Для этого существуют,по крайней нере.три возможности, связанные со свойствами нативных ненбран: 1)- механизн перемещения протонного эквивалента за счет транспортных процессов: на\н и СИ'^нсо» обмена; 2)- наличие в нембране жирных кислот или каких либо других компонентов (лекарственные и патологические состояния), ногущих повысить приницаеность мембраны для протонов; 3)- протекание протонного эквивалента во вреня Функционирования синапса по хено- или электровозбудинын каналам и 4)-Повышенная проницаемость липидного бислоя для протонов. И кроне того, вс.жожности, связанные с физико-хиническнни се Чствани буфер, х систен, изменением объема межклеточного пространства, хнниэмон иедиаторов и быстрыми

метаболическими процессами.

Учитывая все эти возможности, автор, по иере сил, экспериментально проверила те из них, которые казались наиболее вероятныни.

Изненения рН, подобные последний двум фазан, обнаруженных нами трех фазных изменений рН, описаны при исследованиях таких патологических состояний,как распространяющаяся депрессия и ишения мозга. Совпадая по временным характеристикан они в несколько раз Св разных работах приводятся различные значения) больше по анплитуде. И также, как и в нашей случае, наблюдаются в разных отделах нозгаСв trope,мозжечке,гиппокампе) <Hutch et all,1984, Krelg 1983 ets>

Кроме того, в литературе описано возникновение защелачивания Сг-я Фаза)в синаптических контактах различной эргичности, в частности, для ацетилхолиновой передачи СВгоип, 1987), а также при высокочастотной стимуляции вагусного нерва CEnders 1988). Световая стинУляция срезов сетчатки рабочей пчелы также вызывает щелочной .сдвиг около 0,3 ед.рН,зарегистрированный С iacoiei etaii.iseeD.

Таким образон, этот феномен является широко распространенный и наблюдается,не только в патологической состоянии,но и при нормальной функционировании различных отделов нервной систены.

Согласно нашим данным, первая и вторая фазы исследуе1^г явления И" :осредствен"о-связаны с синаптк эской передачей. Так, напрйиер.при перемещении световода из зоны синаптических контактов подобные изменения не фиксировались.Аналогичные результаты ОТНОСИТе.;: НО БЛОЧНОГО СДВИГа ПОЛуЧИЛа И Группа С Chesler, Chant 1988J при переиещении рН-чувствительного электрода. ■ Совпадение таких фг иологических параметров синаптической передачи и исследуемого явления .как наличие латентного периода,синхронность-первой фазы с полевым ВПСП, зависимость от частоты стимуляции и величины популяционного спайка, коррелляция аиплитуд при физиологическом облегчении, ДТПТ и отсутствие изменений рН при

антидронной стимуляции, несонненно свидетельствуют в пользу приведенного утверждения.

Естественно возникает вопрос,с какими синаптическини процессани связаны эти изнеигчия рН,принимают ли в них участие только нервные клетки или глиальные также и каковы механизмы этого-участия? Для ответа на первый вопрос использовались Фармакологические вещества, блокирующие или модулирующие синаптическую передачу. Ионы Mq обратино блокируют синаптическую передачу. w -конотоксин обладает большей специфичностью и блокирует находящийся на пресинапсе н-тип высокопороговых Са каналов, предотвращая, такин образом, Са-эависимый выброс медиатора. Оба эти вещества подавляют 1-ю и 2-ю фаз, изменений рН, причем эффект магния полностью обратин.

В работах, исследующих щелочной сдвиг при распространяющейся депрессии и ивении, результаты неоднозначны. Две группы исследователей CKraig юаэ and chasiar teas i описывают полное подавление защелачивания. Hutch С«ов4Э,-утверждает, что двухвалентные ионны никак не влияют на 2-ю фазу. Подобно, расхождение-трудно объяснить, тен более что и другие вещества .блокирующие синаптическую передачу через Са зависимый неханизн Сы-конотоксин, аденозин) подавляют вторую фазу.

После всего сказанного о первой фа:е, вполне естественно предположить что быстрое зачисление связанно с выделениен глутаминовой кислоты во время работы синапса.Однако даже очень приблизительные оценки делают такое предположение маловероятный. В этой случае изменения происходят только о синаптичеСкой щели и .ич величину нужно умножить на отношение объена синаптических щелей к обьену межклеточного пространств!!, что составляеет порядка 10* и более.Тогда изменение рН в синаптическо щели будут равны 2-Зх10"3Сед рНЭхЮ3-2-" ед рН. Кри1 .я титрования бикарбонатного буфера глутаминовой кислотой- свидетельствует что такие изменения не

ногут быть вызваны миллимолярными контрацияни глутаната.

Что касается кислого содержиного синаптических пузырьков,то его рН составляет 3,3-6,8 ед для разных объектов т.е. концентрация ионов Н+-Зх10-йМ. А для того чтобы изменить рН раствора на 2 ед. в присутствии бикарбонатного буфера требуется ЮимолейСКГ'МЭ сильной кислоты НС1, не говоря ухе об отношении объемов дели и пузырьков.

Дальше мы рассматривали вопрос .какие неханизны ногут участвовать в появлении второй фазы. Согласно нашим результатам, система обратного захвата глутаниновой кислоты не участвует в этой процессе,т.к.большие концентрации - 2-5 ниллиноль Ь-С1и, которые, несомненно, суиественно дестабилизируют ее работу, не невают. при «восстановлении» ответа наблюдать обе фазы.

. Щелочная фаза могла явиться и следствием каких-либо других биохимических процессов,актизируеных работой синапса или деполяризацией ненбраны. Так,направление и характерные времена На/к обмена совпадали со щелочным сдвигом. .Во многих работах Сен .напринер, обзор з кокко 19865 показано что выделение клеткани кислоты, образованной в процессах метаболизма, опосредовано через На\Н обнен. Поэтому, однин .из механизмов защелачивания могло бы быть ингибирование выделения кислоты. Наши эксперименты не подтверждают эту гипотезу. Применение блокатора ыа/н обнена - анило-рида, не влияло ни на одну из фаз. Экспериментальные результаты действия амилорида в работах по ^ и ишении опять отличаются друг от друга. Анилорид либо не влияет, либо увеличивает щелочной сдвиг , хотя увеличение не значительно. А щелочной сдвиг, вызванный в сетчатке световой стимуляцией, не чувствителен к амилориду.

Работа,такого Фермента как ацетил-олинэстераза, пр влекла наше внкнание не только потону что его активность высока и в не Ась активир, эмых синапсах , но и из-за того, что ряд физиологических данных указывает на возмоялость пост - синаптических холинергических влиянии на пирамидные нейроны гиг.поканпа. Действие Слокаторс-

, '¿а

ацетилхолинэстеразы частично подавляло С 405Ö фазу зашелачивания. . По-видинону, работа этого фернента не являсь причиной ее возникновения все же ь.юсит свой вклад в анплитуду.

Вторын фернентон,который может существенно повлиять ка кислотно-щелочное равновесие и буферную енкость внеклеточной. жидкости .определяющуюся HC0»-C0z буферон, является карбоангидраза. Этот фернент присутствует почти везде. В нозгу он представлен ненбранносвязанной формой и локализуется, в основной, в глиальных клетках. Мы исследовали, действие блокатора карбоангидраэы -ацетозоланида, кирокоприменяеного в медицинской практике. Результаты эксперимента на первый взгляд казались парадоксальньми-анплитуда щелочного сдвига уненьшалась. Однако, пре. лрат проявлял в экспериментальных условиях характерную для его клинического применения антиэпилептофорнную активность , причем возвращал к норне увеличившуюся щелочную фазу. Это и привело автора к низли. что уменьшение селочного сдвига, а данной случае, результат не одного, а нескольких разнонаправленных процессов, в которых участвуют ионы НСО». Причем эти процессы, по-видиному, происходили- не только на нейрональных менбранах ,а и .при. участии глиальных клеток. Тем более, что еще об однон парадоксальном закелачивании в глиальных клетках при высокочастотной стимуляции коры нозга, нне было известно по работе С ehester 10375.

Из экспериментов по действию диакарба можно сделать и второй вывод: изменения буферной енкости не являются причиной возникновения щелочной "азы. Это хе подтвердилось и в опытах с заненой'буферной системы псоз-со! на готм hepes. Результаты действия диакарб» евд раз подтвердили и раздельное происхогдене первой и второй фазы

Отличие действия ацетозоламйда при SD и исеиии, по-видннону, характеризует разницу норнального и патологического состояния и объясняется различно? работой тра: .-портных неханизмов CHC0»nci обнен, COz транспорт) в норме и патологии Co-andaii ot au leai).

Таким образон, ни Физико-хинические свойства буферных систен Свклад кн»-систены по литературный данный при SD если и есть то 'несущественный (Kraig Cooper 1968 -пряные измерения нн»))> ни концентрация НСО», ии давление РСОэ СВ работе < r.raig Cooper 1988) проведены пряные измерения РСОг- не коррелируют по врененп со полочной фазой. 3 не определяют природу зацглачиванил.

Поэтону, следующим естественный шагон было рассмотреть ток протонного эквивалента по хено- или электроуправляенын каналам в направлении их электрохимического градиента и в первую счередь НСОэ. Существуют работы С К Kaila and J Yoipio 1987. ,т. Roger, 1687),в которых показано, что по ГАБА-активируемым С1- проводящим каналам могут протекать ионы НСОз, приводя к существенным изменениям внутриклеточного и приповерхностного рН.

Применяя блокатор ГАБА рецепторов - бикукулин, нь: получили существенное увеличение щелочной Фазы. Экспериментальные результаты указызали но то, что его действие опосредовано через civhco3 обнен.

Наличие меибранновстроенного белка,отвечающего за хлор-би-карбонатный обмен, показано в нозге, в основной, для глиальных клеток. Более того,деполяризация ненбраны и понижение внеклеточного рН, приводят к существенный j-шфорнационнын изменениям jtc¡1 АТР-азы р^лоть до обращения направления о'чена С Иващенко 1982, siman в. 1S8Q, Bonting s 10833. Применение dits,sits существенно изненяло анплитуду щелочной Фазы .Исходя из вышеизложенного нохно сделать -\тог о том.что работа этого насоса может являться определяющий механизмом при формировании анплитуды щелочной фазы.

Отностельно функциональной роли описываеных изменений рН пока можно высказывать только предположения. Как было показано СКрьшггаль и др 19853 у значительной части изолированных нейронов мозга крысы при быстром изменении внешнего рН развивается деполяризация менбраны, вызванная изненением Ks-проводиности. Свойства этой

протон-актиеируеной проводимости совпадают с описанными для сенсорных нейронов. Быстрые сдвиги внеклеточного рН изучаете в данной работе ногут активировать Слибо десенситизироватьЭ «И+-рецептор«,и таким образом г юсят свой вклад в нежнейронную коммуникации.

ВЫВОДЫ.

1. В данной работе разработан и впервые применен нетод оптической регистрации быстрых сверхслабых изменений рН в срезах мозга. 3. Обнаружены и исследованы быстрые СдвухфазпыеЗизненения рН, вызванные стимуляцией проводящих путей в срезах мозга.

3. Показано, что первая Сбьктрое закислениеЗ и вторая Сьелочной сдвиг) фазы этих изненений непосредственно связаны с синаптической передачей и наблюдаются только в зоне сннаптнческих контактов.

4. Эксперименталные факты свидетельствуют что;

аЭ развитие изменений рН коррелирует с развитиен ВПСП, и другими Физиологическими параметрами синаптической передачи, такими как латентный период, Физиологическое облегчение, длительная посттетаническая потекциацкя;

63 быстрые • изненения рН не наблюдаются ни при антидромной стинуляции, ни при регистрации оптического ответа от волокон; вЗ воздействие веакстванн, обратимо и необратимо блокирующими сннаптическую передачу, приводит, соответственно,к оСратимону или необратимону блоку быстрых изменений рН;

и служат доказательством синаптической природы исследуемого явления.

5. Под1В.|<:'Н!!е первой фазы ы-конотоксином - блокатором высокопороговых Са-каналов »-тина, отвечаюзшх за выброс медиатора, Са также Ид и глутанатомЗ и ее вмененное течение поэвалпет считать, что она сопровоапает процесс выбрЪса медиатора.

6. Показано что блокаторы ацетилхолинэстер зы - фосфакол, армии и блокатир карбоангидра 1 -диакарб > эньшают анплнтуду щелочного сдвига, а блокатор ГАМХ-активирует« каналов -бикукулнн и блокаторы

НС0»\С1 обмена - dits, sits.- увеличивают. На быстрое закисление эти вещества не влияют. Амилорид -блокатор На\Н обмена не действует ни на одну из фаз быстрых изменений pH.

7. Эти экспериментальные данные позволяют считать, что вторая фаза .является результатом нескольких процессов, происходящих в синаптической щели и нембранах глиальных клеток и определяется . активацией таких ферментов как карбоангидраза, ацетилхолинэстераза и С1ЧНСО» АТФ-аза. Наибольший вклад в амплитуду щелочной фазы вносит работа схч НСО» насоса, в то время как мачн обмен, не участвует в ef формировании.

Список раОот, опубликованных по теме диссертации.

1. 0. А. Крдаталь.Ю. В. Осипчук.Т.Н. Шелест СВысоцкая) Быстрые иэненения pH, связанные с синаптической передачей в изолированных срезах гиппокаипа нлекопитающих.\\Бюллетень экспериментальной биологии и недицины, 1986,Н 6, 843-645.

2. "0.А.Крышталь.Ю.В.Осипчук,Т.Н.Шелест СВысоцкая) Исследование

механизмов бьстрых изненекия pH в срезах нозга.\\ Всесоюзная конференция по нейрснаукам пос. 100-летию Воронцова. Киев, декабрь 1986г Тезисы докладов.

3. 0. А. Крыпггаль.Ю.В.Осипчук, Т.Н. Шелест СВысоцкая) Исследование протон-активируеной проводиности нейронов.\\ Всесоюзная Конференция по нейронаукаи пос. 100-летию Воронцова, Киев, декабрь 1986г Тезисы докладов.

' 4. Т.Н.КЧпест СВысоцкая) Механизмы бмгтрьг изменения pH в срезах ,нозга.\\ 1-я Конференция Киевского отделения МФТИ" 1986, Тезисы докладов.

3. O.A.Krishtal,Y.V.Oeipchuk,T.H.Selest (Visotskaya) Rapid

extr'ctl1 llar pH transiente related to synaptic transnission in rat hippocampal sllcea.\\6raln Researoh, 416,1987. 6. Visotskaya Т.Н. Rapid pH transiente releted to synaptic tränt isslon and ita pharnacology.\\ Korif erenzmaterialien Konferenz der Klinischen una Experlnentellen Neuro • Wissenschaften, 30.11-02.12 1988,Magdeburg.

Работа выполнена в Институте Физиологии ин.А.А.Бого-нольца АН УССР.

Научный руководитель -член-корреспондент АН СССР профессор 0. А.Крышталь.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Селянко А.А..

кандидат биологических наук Пархоненко Н.Т.

Ведущее учереждение: Киевский государственный

университет им.Т.Г.Шегченко

Защита диссертации состоится « « декабря 1990 на заседании специализированного совета Д-016.13.01 при' Институте физиологии им. А.А.Богомольца АН УССР СКиев, ул.Богомольца,45.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии ин. А.А.Богомольца АН УССР.

Автореферат разослан « « ноября 1990.

УченыЯ секретарь ... • '

специализированного совета

доктор биологических наук З.А.Сорокина-Марина

».

•

Отпечатано в отдела ОяВП ин-та ' кргнпроаодхоэ*

Заказ И 669 Тираж 100 а».

252035, "и««, ул.Урицкого 45. 1990 г.