Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Быстрые изменения внеклеточногно Ph, связанные с синаптической передачей в срезах мозга

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Быстрые изменения внеклеточногно Ph, связанные с синаптической передачей в срезах мозга"

Ордена Ленина Академия Наук УССР Ордена Трудового Красного Знамени Институт Физиологии ин.А. А.Богомольца

на правах рукописи

ВЫСОЦКАЯ Татьяна Николаевна

БЫСТРЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОГО рН, СВЯЗАННЫЕ С СЙНАПТИЧЕСКОИ ПЕРЕДАЧЕЙ В СРЕЗАХ МОЗГА.

специальность 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации ив соискание ученой степени кандидат

Работа выполнена в Институте физиологии ин.А.А.Бого-нольца АН УССР.

' Научный руководитель -член-корреспондент АН СССР профессор 0.А.Крыиталь,

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Селянко A.A..

кандидат биологических наук Пархоменко Н.Т.

Ведущее учережденне: Киевский государственный

университет ин.Т.Г.Шевченко

Зашита диссертации состритсп декабря 1990

на заседании специализированного совета Д-016.13.01 при Институте физиологии ин. А.А.Богомольца АН УССР СКиев, ул. Богонольца.О.

С диссертацией ножно ознакомиться в библиотеке Институт« физиологии ин. А.А.Богонольаа АН УССР.

Автореферат разослан ноября 1990.

Учений секретарь специализированного совете доктор биологических наук

3. А. Сорокина-Марина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Важнейшин факторон гонеостаза является постоянство кислотно-щелочного равновесия в организме Внекле'эчные изменения рН не только отрагают амортизационные процессы,связанные с удалением из клетки кислых метаболитов но, и характеризуют ее Функциональную активность. Однако, изменения внеклеточного рН, связанные с Функциональной активностью нейронов изучены недостаточно. Обычно, в таких работах используются ионселективныэ электрода, что сразу ограничивает область исследований, как по временному разрешению, так и по чувствительности. Из-за этого большинство сходных по тематике работ посвящено исследованию патологически}: состояний нозга, таких как распространяющаяся депрессия или ишемия, где процессы характеризуются большей анплитудой и развиваются сравнительно недленно. Однако и тут имеются серьезные расхождения, как в экспериментальных результатах,так и в гипотезах относительно природы исследуемых феноменов.

Теи временем, общеизвестно, что лаге ■ малые изменения рН оказывают существенное влияние на зФФективнрст сина-тической передачи,' на работу пре- и постсияаптической ненбраны. Х^тя эти влияния обычно рассматриваются как модулирующие, существует экспериментально обоснованная гипотеза /Thomas Ro.er, 1987), утверждают ч, что изменения рН во внеклеточном примечбр шон пространстве являются важнейшим механизмом, опосредующий действие тормозных медиаторов.

Нухяо отметить и ряд экспериментально обнаругеных феноненов. Функциональная роль которых пока остается неизвестной. Так, в 'последнее вреня появилось большое количество работ, посвященных зодородныи каналаи в нейрональных менбранэч. В 1980 г. 0. Крьшгалем , и В.Пидопличко в мембране сенсорных нейронов, а затеи и t нейронах ЦНС СС. В.Врублевский и др. ,1985) была обнаружена Н+ - i .тивируемая селективная натриевая проводимость, исследования которой

продолгаются в нескольких лабораториях.

Такин образом, есть кного косвенных свидетельств наличия различных механизмов очень четко и специфически регулирующих рН во вреня Функциональной активности нервных клеток. Их изучению и посвящена данная работа. Цель и осюзные задачи:

1. Разработать высокочувствительный метод измерения рН в нежлеточнон пространстве, ■ позволяющий регистрировать быстрые изменения данного параметра С в ниллисекунднон диапазоне времени}.

2. С поношыо разработанного метода исследовать изменения' рН, происходящие при синаптической передаче в срезах гиппокампа.

Изучить фармакологические свойства наблюдаемых изменений. Научная новизна. В данной работе разработан и впервые применен метод оптической регистрации быстрых сверхслабых изменений рН в срезах мозга. •

Впервые описаны и исследованы быстрые изменения рН, во вреня вызванной электрофизиологической активности срезов мозга.

Показано, что они связаны с синаптическини процессами и развиваются только в зоне синаптических контактов, причем развитие этих изменений коррелирует с развитиен ВПСП и другими физиологическими параметрами синаптической передачи. Динаника, а такае избирательное действие Фармакологических агентов на первую и вторую фазы изненений рН, позволяет говорить о различной локализации этих процессов. Подавление первой фазы и-конотоксинон -блокатором высокопороговьк Са-каналов и-типа, отвечающих за выброс медиатора, а также Из и глутанатон позволяет считать, что она сопровождает процесс выброса медиатора. Вторая фаза является результатом нескольких процессов, происходящих в синаптической щели и мембранах глиальных клеток. Она опрс :еляется активацией работы таких ферментов как карбоангидр-за, ацетилхолинэстераза и ы\нсоэ АТФ-аза. Наибольший вклад в амплитуду щелочной фазы вносит работа

civ НСОЗ насоса, в то вренп как нахн обиеи, согласно экспериментальный данный, не участвует в es формировании. Практическая ценность. Исследование представляет интерес для физиологов и Фармакологов, поскольку касается таких нарушен!!!! работы нозга. как распрост нанявшаяся депрессия и иигмия . В роботе такие исследовано действие препаратов, прияеняенкх в кедацлног.ой практике.

Разработанный метод регистрация быстрых изменений кислотно -щелочного равновесия в ткани hobst 6i ь попользован npt. испытаниях новых лек.рствепньи средств.

Апробация работы. Основные полоаеикя работы Sum пролетавлшш па семинарах секции «ИеПрофизиологии«Института фигиолопге иа. А.А.Богомольца АН УССР СКиев,1986-1990}, семинаре в Институт г биохюши ЦБН АН СССР СПушино, 19803, конференциях колоде: учмшй г.Киева СКне»,198в) м Киевского одолешя ' НИК СКнзв, 19085, Всесоюзной конференции по иейронаукаи пос. 100-летию Рордашова

СКиев, 1986Э и Konferenz der Klinischen und JJxporineriteilen 'Iruix-IflsBsrmchaf ton, CriO программе «ИитерноэгО CHsScbbnrg, 19395 . ООьем я структура диссертации. Диссертация состоит яэ введений, 4-;. глав, посвяаенных: обзору литературы, описания методики, экспериментальный результата» и пх обсуждению, выводов г поиске литературы, содержащего 110 наиненоваиий. Работа изложив im 104 •"•границах нашинописного текста,иллюстрирована 2 схемам п 1С рисупка);п.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Четкая морфологическая,гистологическая структура, хорошо изученные связи и особенности организации сииаптическьх контактов определили выбор гиппоканпа как основного объекте исследования. Часть контрольных и иллюстративных экспериментов была прог Mieim на зубчатой фасции и нозкечке.

Для достижения целей нашего исследования ..еобходимо было

•объединить метод электрофизиологических измерений в переживающих срезах нозга и разработанную нами методику регистрации быстрых сверхслабых оптических сигналов СКрышталь О.А., Осипчук Ю. В., Шелест.Т. Н.СВысощсаяЭ, 19865..

Метод работы с переживающими срезани описан во нножестве работ Ced. Kerkut 4О.А. , H.V.Wheal, 1881, ed. Dlngledln, 1884, Отмахов И др., 19865, с успехом и широко применяется в различных кодификациях. Мной использовался один из стандартных его вариантов.

Суть метода регистрации быстрых сверхслабых оптических сигналов заключается в следу теш .

" В межклеточной пространстве среза находится непоникающий краситель, имеющий различные максимумы поглощения для протоннрованной и непротонированной формы. Если происходят изменения рН- неняется светопропускание среза. Мы направляен пучок света через исследуемую зону среза на фотодиод и измеряем изменение светового потока, как во время стимуляции проводящих путей, так и в ее отсутствие. Т.е.эксперимент выглядит следующим образом; в одной цикле,длительностью 2 сек одиночным импульсом при стимуляции Шафферогских коллатералей, одновременно регистрируется популяционный спайк и измеряется поток света через срез; за ник • следует такой *е контрольный цикл только без стинуляции. Но так как изменения потока в измерительном и контрольном цикле налы и сравнимы с шумани. для повышения соотношения сигнал\щун применяется методика синхронного накопления т.е. происходит пропорциональная сукнация достаточно большого количества таких двойных циклов синхронизированных с началом стимуляции.

Аппаратно нетод был реализован в следующем виде;

Источником света служила галогенонаполненная ланпа накаливания нощность» ISO Вт. Свет от лаипц пр :одил через тепловой фильтр и,с ■помощью короткого конического световода с диаметром кончика 200 вкк, прижатого вплотную к верхней поверхности среза, направлялся на

выбранный участок.

Прошедший через срез световой поток, с помощью 100-кратного объектива инвертированного микроскопа Смасляная инмег 'ия, числовая аппертура 1,33 проецировался, через абсорбционный стеклянный фильтр с максимумом пропускания на длине волны 560 нм Стаж для кепротонированной формы красителя 5 на пловадку фотодиода СВР-34 ФРГЭ со следующий» характеристиками:чувствительность- 70 нАлякс, среднеквадратичный иун в полосе до 1№ц - 5пА. Сигнал с Фотодиода подавался на преобразователь ток-напрягение с сопротивлением обратной связи 50 КОн, после чего усиливался в 1000 раз и поступал на вход другого канала АЦП.

Для устранения больных по анплитуде, ¡¡о не/ценных изменений оптического сигнала использовалась схема цифровой коррекции нуля. Для устранения высокочастотной . составляющей использовалась подпрограмма цифровой Фильтрации снгн ла, работающая по фор.чулэ Хзмнинга СРебинер, Гоулд, 1978D.

В качестве индикатора рН приненялся 'феноловый красный,в концентрации 200 нкноль.

Методика обладает очень высокой чувствительнос-ью и быстродействием по сравнению, с применяемым ранее нетодикани нспользущини рН- чувствительные микрчэлектроды. Совместно с финскими .оллегани Dr. K.Kaila u J.Voipio из Хег си; жого университета, иы провели сравнение обоих методик, 'подтвердившее технические достоинства описьгвагчой методики,а такке ряд совместных экспериментов и дополнительную калибровку наших измерений.

о

Ркс.1. Блок-схема установки

А- срез иоэга; В- стимулирующий электрод С-отводящий электрод С, Е- подача раствора Г- дно камеры

0-пластиковыЯ световод Н- конденсор

3- кнкэрсионный оЕъектив кикросКопа

1- абсорбционный Фильтр К-фотодиод

Ь -преобразователь ток-напрягенив

М- усилитель ИХ-аналоговый мультиплексор; АСС-аналого-цифрово й преобразователь; ОАС2-цифро-аналогов ый преобразователь для стинуляции; 0АС1-ЦАП для схемы

коррекции нуля; РС-персоиальрая ЭВМ.

-Л.

л |ту

Ь 5М0%

1 X (

5'10 рН

:-ю'2рн|

500 т)

г1к«Гте

Р1\с. '¿. Трехфазные изменения рН: аЭэлектрическое отьедание ЬЗсннхрониая оптическая регистрация сЗразвитие 1-й и 2-й фаз , ¿¡ругой касштаб вренени «13все три фазы нэнеиеннП рН при высокочастотной стимуляции

г,

. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Трехфазные изменения рН в гиппох?чпе.

Описание феномена. В срезах гиппокампа взрослых крыс при стинуляции Шафферовских коллатералей одиночным импульсом, более чей в 200-опытах мы наблюдали синхронные с синоптической передачей трехфазные быстрые изменения рН Срис.1? в области дендритоз пирамидных клеток. Амплитуда 1-й фазы - быстрого закислениа составляла 2-3 х 10-3 ед рН и длительность ее соответствовала длительности популяционного ВПСП. За нею следсчл щелочной сдвиг С 2-я фаза}, анплитудг. которого варьировала 1-2 х 10-г рК и длительность достигала 600-700 нсек. Эти две фазы, зарегистрированные нами впервые при вызванной злектрофизиологческой активно1™™ в срезах мозга и составили предмет дальнейпего исследования. Мы также наблюдали длительное закисление С3-я Фаза?, возникающее после иелочного сдвига и в ряде опытов контролировали и его изненения.

Такие не изменения рН зарегистрированы и в других отделзх мозга, в частности: в зубчатой извилине -при стинуляции перфо-рантного пути; в мозжечке - при стинуляции параллельных волокон.

Повышение температуры до 33 С, а такяе изменение возраста животных от нескольких дней до месяцев - не внесло каких-либо качественных изменений в исследуеное явление.

2.'Доказательства синаптическоЯ природа эффекта .

Для проверки синаптической природы эффекта С 1-Я и 2-Й фазы? световод устанавливался и в других зонах гиппоканпа- а границей синаптических контактов Шафферовских коллатералей, В слоях ориенс и альвеус, т.е. в зоне базальных дендритов и аксонов пирамидных клеток, ни одна из описанных фаз зафиксирована не была.

Исходя из этого мы предположили,' что имеен дело с изменением рН не во всем объеме межклеточного пространства, а только в зоне синаптической щели и блияаЯшей окрестности.

Антидромная стимуляция пирамидных нейронов гиппоканпа не вызывала изменений рН ни в одной из слоев , даЕе при увеличении количества накоплений до 1000. Из чего следует, что прохождение потенциала действия в соне нейрона или волокнах не является причиной возникновения изменений рН.

Латентный период, синхронность с ВПСП, зависимость от стимуляции и величины популяциошюго спайка.Как видно Сна рис. 13 быстрое зачисление- 1-я фаза, инеет задержку, соответствующую латентному периоду синаптической передачи и синхронна с отрицательным изменением потенциала, что соответствует внеклеточно регистрируемому возбуждающему постсинаптическону потенциалу СВПСП5. Нуето отметить что минимальное значение быстрой фазы закислення коррелирует с пикон популяционного ВПСП.

Используя эффект физиологического облегчения и подавая следующий иипуль? через короткий промежуток времени СЗО мсек.Э, ни получали увеличение амплитуды п-ВПСП и популяционного спайка. В таких условиях амплитуда 1-й фазы - быстрого закисления, и 2-й фазы - защелачивания , возросла пропорционально .

Длительная стимуляция с частотой 80 Гц и следующая за ней длительная постетаническая потенциация приводили к удлинению 1-й фазы подкислеиия. Амплитуда же 2-й щелочной и 3-й фазы возростала не линейно при ДПТП.

3. Блокирование и модуляция синаптической

передани и их влияние на быстрые изменения рН.

а> Ионами не. Как'известно, двухвалентные катионы обратиио блокируют синаптическую передачу. В наших экспериментах обе фазы -и быстрое закисление,. и защелачевание - полностью исчезали внесте с п-ВПСП и лопуляционным слайкон при добавлении в рабочий раствор ионов Ив в концентрации 10 иМ.'

Так как конкурентный блок обратим , то при отмывке нормальны!! раствором ухе через 5-10 мин. Соколо 2 мин. - вреия диффузии в

срезеЭ синаптическая передача полностью восстьлавливалась, а с' нею внесте востанавливались и изменения рИ сохраняя ту se форму и амплитуду .

С> Синтетический w-коаотокснн (conotoxin). В работе (McClesky B.W., 1987) показано, чт> w-конотоксин блокирует Н и L-типы потенциалзависимых Са-каналов, причем именно Н-канал, согласно исследованиям (H.Kaaiya etail, 198Э), отвечает за высвобождение медиатора Св срезах гиппокампаЭ и даге в очень низких С100 пЮ концентрациях блокирует синаптическую передачу.

При добавлени w-конотоксина в концентрации S шМ в рабочий раствор, уненьшался, а затем и исчезал, популпционный спайк, что велс к исчезновений обоих фаз - как кислотной, так. и щелочной.

в) Действие аденозина. Считается, что аденозин является синаптическим нодуляторон (Lunch, Shuber, 1SS0). В работах (Clonchen, 19?; Niz, 1976; Harns, 197В) показано, ЧТО ОН подавляет высвобождение недиатора через поте.чциалэавнсииые Са-каиалы пресинаптической нембраны. В малых концентрациях аденозин уиеншает как спонтанные , так и вызванные синаптические потенциалы, что сопровождается гиперполяризацней без каких-либо существенных изненений сопротивления клетки (И.Williams 1984).В более ранних работа* (Segal м. 1982) с использованием методики внутриклеточного отведения показано постсинапгическое действие аденозина,' связанное -с изменением К+ проводимости. Таким образом,. аденозин действует на обе пре- и постсинаптическую стадии процесса, однако я разных временных и концентрационных диапазонах.

В наших экспериментах при подавлении синаптической передачи ■большими концентрациями - 20 мкМ - исчезновение обеих фаз . Эффект действия аденозина полностью обратим. Однако нуамо отметить что при неполном подавлении ответа Сконцентрация аденозина 2-3 мкМЭ наблюдалось более быстрое уменьшение кислой фазы. Этот г&ахт можно рассматривать ,как косвенное доказательство разлив' .ой локализации

1-й и 2-й фазы.

г) Подавление синаптической активности высокими концентрациями глутамата. Как известно, возбуждающие аиинокислоты ногут присутствовать в нозгу в довольно высоких концентрациях, что часто связывают с их неспецифическин выделением изглиальных клеток и другими не синаптическини процессами . Помимо того, действу* на внесинаптнческие рецепторы, они ногут повышать или понижать секрецию медиатора (Levi о., Gallo laeiD.

Высокие концентрации глутамата оказывали угнетающее действие на амплитуду фокального потенциала сом и деидритов пирамидных кле-токСАртененко,Герасимов 19853 вплоть до полного подавления ответа . Однако, как показано в работе С.Крыиталь и др.19873, через некоторое время синаптическая передача в присутствии^ глутамата восстанавливалась частично меняя свои фармакологические свойства.

В наши* экспериментах, при добавлении к раствору 2 юМ L-Glu, электрическая активность в срезе полностью подавляласи обе фазы изменения pH - и быстрая кислая, и щелочная - исчезали. Однако, щелочная фаза исчезала быстрее.

При .восстановлении ответа («перестройке»), восстанавливались обе фазы и' полуляиионный спайк, Так же как и спайк, они _пропорционально уменьшались до амплитуде.

При отмывке нормальный раствором, как до «перестройки», т.е. через 5-10 инн., и после «перестройки» - через 40-60 нин..величина ВЛСП н пояспайк» полностью восстанавливалась,так же, как и амплитуды кислой и вепочной Фазы . Единственное различие заключалось в тон, что щелочная фаза была более лабильна. Так при аппликации относительно палых доз от 0,25 до 0,5 нМ L-Glu первый исчезал постсинаптический компонент полевого потенциала и внесте с нин, но. не полностью, исчезала вторая Фаза.

Такая динамика указывгг на то, что 2-я Фаза, по-видимому, больсе обусловлена поетсинаптическими процессами и включает в себя

несколько механизмов, в отличие от первой. Хотя, ни та, ни другая не связаны с системой обратного захвата глутаминовой кислоты, т.к. большие концентрации - 2-3 ю1 1,-01и, которые .несонненно, существенно дестабилизируют ее работу, не мешают при «восстановлении» ответа наблюдать обе Фазы.

4. Изучение путем фармакологического скрининга оозгаяззвк ■ механизмов возникновения Оыстрых изменений рН.

1) Действие ингибиторов ацетилхо; нэстсразы; атропин?.

Задолго до начала изучения ацетилХолинэстеразы, как фернента участвующего в синаптической передаче С1932г.? она была обн-рузена в крсви, плазме, кишечнике, плаценте и тд. Позже было показано наличие двух типов этого Фернента - специфическая и неспецифическая холииэстеразы. Однакп и специфическая АСЬЕ связывается не только с холинзргической системой и как правило . присутствует в системах с другим типом недиатора.

С другой стороны, неснотря на проблематичность морфологических доказательств прямых контактов холинергических волокон •с пирамидными нейронами гиппоканпа, ряд . физиологических данных указывает, что существует возмовность постсинаптических холинергических влияний на эти нейроны.

В результате действия этого Фернента на .цетилхолин образуется холин и уксусная кислота.

Таким образом, мы не могли обойти вниманием хо..инергиче.кую систему гиппоканпа, а именно отрицать участие ацетилхолипостеразы в ■ возникновении изменений рН.

Добавление в рабочий раствор необратимого блокатора ацетилхолиностеразы -фосфокола в концентрации 10 нкМ, не 'лияло на фазу быстрого эакисления, однако частично подавляло С4П-5050 Фазу защелачевания . При этой, вызванный стинуляц ¿й Шафферовских

•коллатералей популяционыи спай»., практически не менялся.

Аналогичная картина наблюдалась и при воздействии другого i блокатора ацетилхолиностеразы -арнина, в концентрации 1 нкМ .

Такин образом, отсутствие воздействия на первую Фазу позволяет не связывать ее с разложением ацетилхолина Сдо уксусной кислотыЭ, ' вызвг'нын пресинаптическим влиянием ацетилхолина на синаптическую передачу Снапринер, через подавление возвратного торножения СРобинсон, Рейсин, 198230.Подавление же второй фазы защелачивания объяснить значительно сложнее.В литературе отмечаются лишь незначительные пряные постсинаптические влияния АХ, которые осуществляются либо через дендритные синапсы, либо через соматическое действие при диффузии АХ.

Однако, опираясь на дальнейший опыт работы, автор склоняется к имению, что действие. блокаторов ацетилхолиностерозы на щелочную Фазу имеет неспецифический характер.

2) Действие ингибитора карбоангидразы - ац&тозоламида.

Карбоангидраза катализирует образование угольной кислоты из COz и Н?С и обладает высокой специфичностью. Она представляет собой хорошо изученный неталлофермент, присутствующий практически • во всех частях тела. В крови различают две его форны. Вторая в ненбранносвязаннои виде, в основной, и представление в мозгу Cv. Sapirotein 1884,). Она обладает более высокой скоростью реакции и большей эстеразной активность». Гистологическим, иммунологическими и эволюционными методами показано, что локализован он в глиальных клетках.

Ацетозолаиид является . широкораспространенным в клинике и хорошо изученным ингибиторон карбоангидразы. Связываясь с цинком и имидозольныи азотом, он образует тройной конплекс закрывающий активный центр фермента.

Поскольку основная буферная емкость внеклеточной жидкости

определяется НСОз-СО* буферной счстеной, ингибирование. картбоангидразы должно влиять на внеклеточное рН.

Нуаа/о отметить разницу е результатах при исследованиях бэ и ишении. Согласно одним исследования« Ш-а1д, 1983) ацетозоланид суиественно, в несколько раз, увеличивает амплитуду и длительность как фазы защелачивания, так и , следующего за ней длительного кислотного сдвига, и при этон не влияет ка концентрации калия. Матч и Хансен в своей работе утверждают, что увеличивая щелочной сдвиг, ацетозоланид никак не влияет на третью кислую фазу.

Интересны клинические наблюдения при применении диакарба Сацетозоланида). Э связи с усилением выделения бикарбоната уменьшается щелочной резерв крови, может развится ацидоз.Понижается содержание СОг в крови. Увеличивается выделение такге и иснсэ К+. Уменьшается образование спинонозговой жидкости. Применяется при лечении эпилепсии СМашковский, 19833.

В наших опытах, лри добавлении в раствор, диакарб В . концентрации 10 нМ не оказывал какого-либо влияния на первую фазу быстрого закисления и уменьиал на 30--40"4 амплитуду щелочного сдвига. При этон он не оказывал никакого токсического действия на срез: эффект был полностью ■обратим. Так как зарегистрированный эффект противоположен результатам других авторов (при ишении и БЧ), были проведены дополнительные эксперименты. В срезах с поиоиьй короткого периода анохсии вызывалась зпилептофоркнья активность. При этон иелочной сдвиг увеличивался по сравнению с нормой. При добавлении в рабочий раствор диакарба обратимо снималась эпилептоформная активность и уменьшалась величина иелочного сдвига.• Такин образок, мы видим что диакарб влияет на буферную енкость, однако,, это изменение буферной емкости не является единственной причиной возникновения щелочной Фазы. Разно как и изненения концентрации НССЬ, вызванные работой карбсангидразы либо блокадой этого фермента. Противоположный знак эффекта днахарбь по

сравнению с результатами для so, мохет объясняться различной работой транспортных механизмов CHCOsnci обмен, СО« транспорт? в норне И патологии СCrandall et alHQ80.

з) Замена буферной системы НССЬ-СО* на HEPEs.

Подтверждение« того, что исследуемый механизм не определяется свойствами бикарбонатного буфера и давлением СОг. являются эксперименты с заменой этой буферной систены в рабочей растворе на 20нМ буфера HEPES.a газовой смеси на кислород. Наблюдались обе фазыС 1-я и 2-я ? исследуемого явления, без каких либо существенных изменений динаники и амплитуды.

В работе (Chesier.Chan 1938) на мозжечке проделана аналогичная замена, при изучении щелочного сдвига, с тем ¡te эффектом.

Таким образом, результаты экспериментов свидетельствуют, что природа описанных феноменов Cl-я и 2-я фазьй не определяется ни физико-химическим свойствами буферных систем нозга СНе рассматривалась кн»-систеиа, но по литературным данным ее вклад, если и есть то, несущественный в данной временном диапазоне (Kraig Couper 1983 -прямые изнерения кНа));-ни с химизкон медиаторов Сразлоие-ние, обратный захват). Поэтому следующим естественным шагон было .рассмотреть ток ионов Н+,НН«+ либо ОН", НСОа" по хемо или электро-управляемын каналам в направлении их электрохимического градиента.

Эндогенный НСОа. НСОа проводимость через Ci ГАШС- актнвируемне каналы. Действие Онкукулина.

Для тел и дендритов пирамидных нейронов гиппоканпа показано наличие ГАМК. рецепторов, контролируипх хлорную проводимость и блокирующихся • бикукулином CAiger et ell 1982, Герасиков .Артеменко 1986Э . С другой стороны, в работе С к Ralla J Voipio 198б> утверадается, что постсиналтические и?иенения рН внутри и на поверхности скелетных иышц речного рака вызваны НСОэ проводимостью через ГА.КК- антивирусный хлорный канал.

В такой случае , если вовремя работы ГАМК- ахтивируеных хлорных каналов через них по градиенту выходит НСО». то заблокировав их бикукулинон, ны, как мининун, должны увидеть уменьшение щелочного сдвига.

Бикукулин является конкурентным ! антагонистон различных, бикукулинчувствительных ГАБА рецепторов. Однако, он также является конкурентный блокатсрон ацетилхолинэстеразы, что тоже привело бы к уменьшению щелочного сдвига.

Приненяя бикукулин в концентрации 0,03 нИ 'мы получили эффект прямо противоположный такой гипотезе, однако прекрасно согласующийся с предыдущими наблюдениями. А именно,- вследствие уменьшения тормозного влияния ГАМК, в срезе под действием бикукулина, увеличивался ортодронный ответ Споявлялаь эпилептифориная активность?, а с нин и вторая, и третья фазы оптического ответа. На первую фазу букукулин не влиял. Однако его действие на вторую и особенно на третью фазу - длительное медленное закисление, было значительнын и превышало то значение, которое могло бы быть вызванно увеличением амплитуды электрического ответа. А разное действие бикукулина на 1-ю и 2-ю фазу, еще раз, хоть и косвенно свидетельствует, что эти фазы имеют разное происхождение. Так вызванное бикукулинон расторможение, коррелирует с увеличением щелочной фазы, тогда как первая фаза остается неизменной.

Блокирование хлорной проводимости, помимо описаного.ногло вызвать эффекты второго порядка, а именно- изменение С1/НС0» обмена. Поэтону дальше мы исследовали действие блокатора этого обмена.

4) Действие блокаторов сгчНСО* < анионного) обмена:

DITS,SITS.

После диффузии СО* в СглиальнукО клетку он разлагается тан с помощью карбоангидразы на Н+ и НСО»-. Увеличение внутриклеточного НСОэ приводит к усилению выброса НС0= в обмен на

¡внеклеточный Ci. И .наоборот, повышение концентрации HCOs, либо другие факторы, такие как -деполяризация или изменения pH, ногут обращать хлорный обнен. Характерные времена этого процесса С100 НсекЭ - близки к вдлочной фазе.

Способность производных стильбен дисульфоновой кислоты: 4.4-диизо- тиоцианостилбено-2.2днсульфочовой кислоты - cdttsï и 4-ацет- анид-4-изотиоцианостибено-2,2-дисуль$сновоЙ Кислоты-CSITSD йнгибировать pH -регулирующий механизм, была впервые показана для нейронов улитки cTeii к. and Maniiply 1Э7Ю. Его действие как высокоспецифического зкстраклеточного ингибитора С1/НС0э обмена в клетках млекопитающих описана б работе (pàseow н and all îeai).

Блокаторы, хотя и применяясь в высоких концентрациях - 0.3 мМ, однако не оказывали вырахеного токсического действия на срез. Так, dits не влиял на 1-ю фазу быстрого закисления и существенно в 2 раза увеличивал щелочной сдвиг.

• Наличие С1\НС0а обнена , который ингибируется DITS и его .производными, показано для глиальных клеток (Bourke etall 1876,Ahmad et ail 1382). Повидимону ны наблидаен обращение хлорного обмена в глиальных клетках, связанное с их деполяризацией, блокирование которого и приводит к увеличению защелачивания. , Подобное допущение подтверждается и данныни CChecler, Kraig 1987) о парадоксальной защелачиванин глиальных клеток СастроцитовЭ во ереия высокочастотной стимуляции коры головного мозга крьк.

6) Действие ингибитора NavH оРмеяа - анилорнда.

Участие HaMi постоянного обмена в быстрых изменениях первой

Фазы казалось налсеероятным, однако его участие во второй Фазе проверить было необходимо. Не только потону, что зги процессы совпадали по временным характеристикам, но и потому, что в работах, изучающих подобные изменения при распространяющейся депрессии,.экспериментальные данные противоречили друг другу. Так в работах cchesler, 1968; Colos, 1956) а.чилорид не сказывал никакого

• ■ - ie

влияния на щелочной сдвиг, а в работе (Hutch, 1884) он возрастал при добавлении анилорида в рабочий раствор.

В наших экспериментах Сболее 103 анилорид * не оказывал никакого влияния ни на одну гэ фаз С1-ю или 2-ю).

ОБСУЖДЕНИЕ.

Приведен некоторые общие сображения о том, какие физико-хинические и физиологические процессы ногли бы привести к изменениям рН в такой системе - пространство синаптической вели, отделенное от внутриклеточного пространства нейрональными - пост-, пресинаптическини и глиальныни менбранани , и происходить в интересующен нас диапазоне времени - до 1сек.

Из опытов на сравнительно простых мембранах - митохондрий, липосон и тд., известно, что выравнивание концентраций протонов при приложении протонного зкриеалента - кислоты или щелочи,имеет полупериод порядка нинут, что значительно меньше, чен для одновалентных ионов натрия или калия. С другой стороны, концентрация протонов в биологических системах 10-7, j одновалентных ионов - 10-». следовательно,- проницаеность менбран для протонов должна быть на несколько порядков выше. Для этого существуют,по крайней нере.три возможности, связанные со свойствами нативных ненбран: 13- механизм перемещения протонного эквивалента за счет транспортных процессов: Нлчл и Очнсо» обмена; 23- наличие в нембране жирных кислот или каких либо других компонентов Слекарствякньа и патологические состоянияЭ, могущих повысить приницаеность ненбраны для протонов; 33- протекание протонного эквивалента во вреня Функционирования синапса по хено- или злектро'возбудимым каналам и 43-жовышенная проницаеность липидного бислоя для протонов. И кроме того, всложности, связанные с физико-хиничесг.ини св Чствани буфер, х систем, изненением объема межклеточного пространства, хиниэнон медиаторов и быстрыни

метаболическими процессами.

Учитывая все эти возможности, автор, по мере сил, экспериментально проверила те из них, которые казались наиболее вероятными.

Изменения рН, подобные последний двум фазан, обнаруженных нани трех фазных изменений рН, описаны при исследованиях таких патологических состояний,как распространяющаяся депрессия и ишемия иозга. Совпадая по врененным характеристикам они в несколько раз Св разных работах приводятся различные значения} больше по амплитуде. И также, как и в нашей случае, наблюдаются в разных отделах иозгаСв коре,мозжечке,гиппокампеэ CMutch et all, 1984, Kreig 1983 ets5

Кроме того, в литературе описано возникновение защелачивания Сг-я Фаза>в синаптических контактах различной эргичности, в частности, для ацетилхолиновой передачи СВгонп, 1987), а также при высокочастотной стимуляции вагусного нерва CEnders 198ВЭ. Световая стинУляиия срезов сетчатки рабочей пчелы также вызывает щелочной .сдвиг около 0,3 ед. рН,зарегистрированный С lacoies et all,lese}.

Таким образом, этот феномен является широко распространенным и наблюдается,не только в патологическом состоянии,но и при нормальной Функционировании различных отделов нервной системы.

Согласно нашим данным, первая и вторая фазы исследуемjro явления Н' посредственно связаны с синапти зской передачей. Так, например«при перемещении световода из зоны синаптических контактов подобные изменения не фиксировались.Аналогичные результаты

ОТНОСИТе;; НО БЛОЧНОГО СДВИГа ПОЛуЧИЛа И Группа С Chesler, Chant

19883 при перемещении рН-чувствительного электрода. Совпадение таких Фг миологических параметров синаптической передачи и исследуемого явления ,как наличие латентного периода,синхронность-первой фазы с полевым ВПСП, зависимость от частоты стимуляции и величины популяционного спайка, коррелляция амплитуд при Физиологическом облегчении, ДТПТ и отсутствие изменений рН при

антидронной стимуляции, несомненно свидетельствуют в пользу приведенного утверждения.

Естественно возникает вопрос,с какини синаптическини процессами связаны эти изменгчия рН,принимают ли в них участие только нервные клетки или глиальные также и каковы механизмы этого-участия? Для ответа на первый вопрос использовались Фармакологические вещества, блокирующие или нодулируюцие синаптическую передачу. Ионы Мд обратино блокируют синаптическую передачу. w -конотоксин обладает большей специфичностью и . блокирует находящийся на пресинапсе n-тип высокопороговых Са каналов, предотвращая, таким образом, Са-зависимый выброс медиатора. Оба эти вещества подавляют 1-ю и 2-ю фаг,, изменений рН. причем эффект нагния полностью обратин.

В работах, исследующих щелочной сдвиг при распространяющейся депрессии и ишении, результаты неоднозначны. Две группы исследователей С Kraig 1 ваз *nd chesier юва } описывают полное подавление заделачивания. Mutch Ciee«},-утверждает, что двухвалентные ионны никак не влияют на 2-ю фазу. Подобно., расхождение-трудно объяснить, тем более что и другие вещества .блокирующие синаптическую передачу через Са зависимый механизм Сы-конотоксин, аденозинЭ подавляют вторую фазу.

После всего сказанного о первой фаге, вполне естественно предположить что бьстрое закисление связанно с выделением глутаминовой кислоты во время работы синапса.Однако даже очень приблизительной оценки делают такое предположение Маловероятным. В этой случае изненения происходят только в синаптической вели и ,ич величину нужно умножить на отношение объема синаптических далей к объему нежклеточного пространства, что составляеет порядка 10* й более.Тогда изменение рН в синаптическо. щели будут равны 2-Зх10~3Сед plDxl03-2-^ ед рН. Кри1. .я титрования бикарбонатного буфера глутаминовой кислотой свидетельствует что такие изменения не

ногут быть вызваны миллимолярныни контрациями глутаната.

Что касается кислого содержимого синаптических пузьфьков.то его pH составляет 3,5-6,8 ед для разных объектов т.е. концентрация ионов Н+-Зх10_вМ. А для того чтобы изменить pH раствора на 2 ед. в присутствии бикарбонатного буфера требуется ЮнмолейСКГ*!!) сильной кислоты HCl, не говоря уже об отношении объемов щели и пузырьков.

Дальне мы рассматривали вопрос .какие механизмы ногут участвовать в появлении второй фазы. Согласно нашим результатам, система обратного захвата глутаниновой кислоты не участвует в этон процессе,т. к.бзльшие концентрации - 2-3 ниллииоль L-Giu, которые, несомненно, существенно дестабилизируют ее работу, не нешают. при «восстановлении» ответа наблюдать обе фазы.

. ¡¡¡елочная фаза могла явиться и следствием каких-либо других биохимических процессов,активируемых работой синапса или деполяризацией менбраны. Так,направление и характерные времена Na^H обмена совпадали со щелочным сдвигом. .Во многих, работах Сси .например, обзор J Kokko 1936? показано что выделение клетками кислоты, образованной в процессах метаболизма, опосредовано через на\н обмен. Поэтому, олиин из механизмов защелачивания могло бы быть ингнбирование выделения кислоты. Наши эксперименты не подтверждают эту гипотезу. Применение блокатора Na/n обмена - амило-рида, не влияло ни на одну из фаз. Экспериментальные результаты действия амилорида в работах по s^» и ишемии опять отличаются друг от друга, Амилорид либо не влияет, либо увеличивает щелочной сдвиг , хотя увеличение не значительно. А щелочной сдвиг, вызванный в сетчатке световой стимуляцией, не чувствителен к амилориду.

Работа,такого фермента как ацетил 'олинэстераза, пр влекла наше внимание не только потому что его активность высока и в не Ach активир, змых синапсах , но и из-за того, что ряд физиологических данных указывает на возможность пост - синаптических холинергических влиянии на пирамидные нейроны гиппокаипа. Действие блокаторс"

ацетилхолинэстеразы частично подавляло С 40'«$) фазу защелачивания. , По-видинону, работа этого Фермента не являсь причиной ее возникновения все же ь.юсит свой вклад в анплитуду.

Вторым Фернентон,который ножет существенно повлиять на кислотно-щелочное равновесие и буферную енкость внеклеточной. жидкости .определяющуюся HCOs-COi буфером, является карбоангидраза. Этот фермент присутствует почти везде. В нозгу он представлен ненбранносвязанной форной и локализуется, в основной, в глиальных клетках. Мы исследовали, действие блокатора карбоангидразы -ацетозоланида, широкоприменяеного в медицинской практике. Результаты эксперимента на первый взгляд казались парадоксальньш-амплитуда делочного сдвига уменьшалась. Однако, пре.зраг проявлял в эксперинентальных условиях характерную для его клинического применения антиэпилептофорнную активность , причем возвращал к норне увеличившуюся щелочную фазу. Это и привело автора к нысли, что уненьшение щелочного сдвига, в данной случае, результат не одного, а нескольких разнонаправленных процессов, в которых участвуют ионы НС0>. Причен эти процессы, по-видинону, происходили- не только на нейрональных ненбранах ,а и при. участии глиальных клеток. Тем более, что еве об однон парадоксальной защелачивании в глиальных клетках при высокочастотной стимуляции коры ноэга, нне было известно по работе С chesier 19an.

Из экспериментов по действию диакарба ноено сделать и второй вывод: изменения буферной емкости не являются причиной возникновения целочкой Фазы. Это же подтвердилось и в опытах с заменой 'буферной системы нсоз-сог на готм hepes. Результаты действия диакарб* евд раз подтвердили н раздельное происхождене первой и второй Фазы

Отличие действия ацето'золанйда при so и ишемии, по-видинону, характеризует разницу нормального и патологического состояния и объясняется различно? работой Tpai. ;портных механизмов CHCOavei обнен, СО» транспорт) в норне и патологии Ccrandaii bt ail iem).

: Такин образок, ни физико-хинические свойства буферных систен -, Свклад KHe-сиетены по литературный данным при SD если и есть то ! несущественный (Kraig cooper 1866 -пряные измерения ни»)), ни концентрация НСО», ни давление PCO» СВ работе < Eraig Cooper гвав) проведены пряные измерения PCO»- не коррелируют по времени со щелочной Фазой.Э не определяют природу защелачиванил.

Поэтому, следующий естественным шагон было рассмотреть ток протонного эквивалента по хено- или электроуправляемын каналам в направлении их электрохинического градиента и в первую очередь НСОэ. Существуют работы С к ши and J Voiplo 1987. ,т. Roger, 10875,в которых показано, что по ГАЕА-активируемын Cl- проводящим каналам могут протекать ионы НСОз, приводя к суиественным измеиенияи внутриклеточного и приповерхностного pH.

Применяя блокатор ГАБА рецепторов - бикукулин, нь; получили существенное увеличение щелочной фазы. Экспериментальные результаты указывали на то, что его действие опосредовано через ciчнсоз обмен.

Наличие неибранновстроенного белка,отвечающего за хлор-би-карбонатный обмен, показано в нозге, в основной, для глиальных клеток. Более того,деполяризация мембраны и понижение внеклеточного pH, приводят к существенный |^нфорнационнын изменениям jtc/I АТР-азы р^лоть до обращения направления сечена С Иващенко 1982, sino» в. leso,Bonting s losa?.Применение dits,sits существенно изменяло амплитуду щелочной фазы .Исходя из вышеизложенного можно сделать -\во/- о тон,что работа этого насоса может являться определяющим иеханнзмои при формировании амплитуды щелочной фазы.

Отностельно *ункциональной роли описываемых изменений pH пока ножно высказывать только предположения. Как было показано СКрышталь и др 19853 у значительной части изолированных нейронов мозга крысы при быстрой изменении внешнего pH развивается деполяризация мембрани, вызванная изменением На-проводимости. Свойства этой

протон-актиаируемой проводиности совпадают с описанныни для сенсорных нейронов. Быстрые сдвиги внеклеточного рН изучаемые в данной работе могут активировать Слибо десемситизироватьЭ «Н+-рецептср»,и таким образон г гасят свой вклад в межнейронну» коммуникацию.

выводи.

1. В данной работе разработан и впервые применен метод оптической регистрации быстрых сверхслабых измененнй рН в срезах мозга.

2. Обнаружены и исследованы быстрые СдвухфазяыеЭизменения рН, вызванные стимуляцией проводящих путей в срезах нозга.

3. Показано, что первая Сбыстрое закисление5 к вторая Скелочной сдвиг) Фазы этих изменений непосредственно связаны с синаптическсй передачей и наблюдаются только в зоне сннаптических контактов.

4. Эксперииенталные факты свидетельствуют что:

а) развитие изменений рН коррелирует с развитием ВПСЛ, и другими физиологическими параметрами синаптической передачи, такими как латентный период. Физиологическое облегчение, длительная посттетаническая потенциация;

63 быстрые • изменения рН не наблюдаются ни при антидрокиой стимуляции, ни при регистрации оптического ответа от волокон; вЭ воздействие веществани, обратимо и необратимо блокирующими синаптическую передачу, приводит, соответственно,к оСратимсну или необратимому блоку быстрых изменений рН;

и служат доказательством синаптической природы исследуемого явления.

5. Подавление первой фазы ы-конотоксиьом - блокаторок высокопороговьк Са-каналов м-типа, отвечающих за выброс медиатора, Са также Мд н глутанатомЗ и ее временное течение позваляет считать, что она сопровождает процесс выбрЬса медиатора.

6. Показано что блокаторы ацетилхолинзстер зы - фосфакол, армии и блокатор карбоангидра I -диакарб ) эньшавт амплитуду селочного сдвига, а блокатор ГАМК-активируеных каналов -бикукулин и блокаторы

нс0а\с1 обмена - dits, sits- увеличивают. На быстрое закисление эти вещества не влияют. Амилорид -блокатор Нв\И обиена не действует ни на одну из фаз быстрых изменений pH.

7. Эти экспериментальные данные позволяют считать, что вторая фаза . является результатом нескольких процессов, происходящих в синаптической щели и мембранах глнальных клеток и определяется активацией таких ферментов как карбоангидрага, аиетилхолинзстераза н «Micos АТФ-аэа. Наибольший вклад в амплитуду щелочной фазы вносит работа сг>. НСОэ насоса, в то время как начн обиен, не участвует в er формировании.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. 0. А. Крышталь.Ю.В. Осипчук,Т.Н.Шелест СВысоцкаяЭ Быстрые изменения pH, связанные с синаптической передачей в изолированных срезах гиппокаила млекопитающих. \\Бюллетень зксперииентальной биологии и медицины, 1986,к 6, 643-645.

2. -О.А.Кръшггаль.Ю.В.Осипчук.Т.Н.Шелест СВысоцкаяЭ Исследование механизмов быстрых изменения pH в срезах иозга.\\ Всесоюзная конференция по нейрснаукам лос. 100-летию Воронцова, Киев, декабрь 1986г Тезисы докладов.

3. 0. к. Крышгаль.Ю. В. Осипчук.Т.Н.Шелест СВысоцкая) Исследование протон-активируемой проводимости нейронов.\\ Всесоюзная конференция ло нейронаукам пос. 100-летию Воронцова, Киев, декабрь 1986г Тезисы докладов.

1 4. Т.Н.СЧлест СВысоцкая) Механизмы быстры* изменения pH в срезах .мозга.\\ 1-я Конференция Киевского отделения МФТИ'1986, Тезисы докладов.

3. О. А. Кг is tita I,У.V.Osipchuk.T.N.Seiest (Visotskaya) Rapid

extr-ctl1 llar pH transients related to synaptic transmission in rat hippocanpal slices.WBrain Research, 416,1987. 6. Visotskaya Т.Н. Rapid pH transients releted to synaptio träne ission and its pharmacology,\\ Konferenzaaterialien Konferenz der Klinischen una Experieentellen Neuro • Wissenschaften, 30.11-02.12 1989,Magdeburg.

Работа выполнена в Институте Физиологии ии.Д. А.Богомольца АН УССР.

Научный руководитель -член-корреспондент АН СССР профессор 0. А.Крыжаль.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Селянко А. А..

кандидат биологических наук Пархоменко Н.Т.

Ведущее учереадение: Киевский государственный

университет ин.Т.Г. Вепенко

Завита диссертации состоится « « декабря 1990 на заседании специализированного совета Д-016.13.01 при Институте Физиологии ин. А.А.Богомольца АН УССР СКиев. ул.Богонольца,4Э.

С диссертацией кояио ознакомиться в библиотеке Института физиологии ин. А.А.Богомольца АН УССР.

Автореферат разослан « « ноября 1990.

Ученый секретарь . • '

специализированного совета

доктор биологических наук З.А.Сорокина-Марина

i. •

Отпечатано в отделе ОнВП нн-та * кргвпроаопхоз*

Заказ № 669 Тнраж 100 »а.

252035, ''пев, уя.Урицкого 15. 19D0 г.