Болезнь Ауески: иммунологическая характеристика гликопротеинов gE и gB вируса и разработка методов серологической диагностики болезни и контроля "маркированных" вакцин

Моренков, Олег Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Болезнь Ауески: иммунологическая характеристика гликопротеинов gE и gB вируса и разработка методов серологической диагностики болезни и контроля "маркированных" вакцин
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Болезнь Ауески: иммунологическая характеристика гликопротеинов gE и gB вируса и разработка методов серологической диагностики болезни и контроля "маркированных" вакцин"

На правах рукописи

ргб ОД

1 8 ¿¿К ?1П

МОРЕНКОВ ОЛЕГ СЕРГЕЕВИЧ

БОЛЕЗНЬ АУЕСКИ: ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛИКОПРОТЕИНОВ gE И gB ВИРУСА И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ И КОНТРОЛЯ «МАРКИРОВАННЫХ« ВАКЦИН

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2000 г.

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РСФСР В.А. Сергеев

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор В.И. Уласов

доктор биологических паук A.A. Кущ

доктор ветеринарных наук, профессор В.А. Бурлаков

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН

CJ С -о

Защита состоится « -Ч/С « декабря 2000 г. в /к,- часов на заседании

Диссертационного совета Д. 120.85.01. во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ.

Автореферат разослан

ноября 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Заслуженный ветеринарный врач РФ, кандидат ветеринарных наук

Ю.А. Козырев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Болезнь Ауески (БА, псевдобешенство) является одним из наиболее распространенных вирусных заболеваний различных сельскохозяйственных и диких животных и наносит значительный ущерб странам с развитым свиноводством. Заболевание вызывается вирусом БА (ВБА, Suid Herpesvirus I), относящимся к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae. Летальный исход болезни в естественных условиях наблюдают у молодых поросят и реже у животных других видов. Инфицирование взрослых свиней обычно не приводит к гибели животных, но сопровождается установлением длительного или пожизненного носительства вируса. Традиционная вакцинация свиней, используемая для профилактики заболевания, существенно снижает клиническое проявление заболевания и сдерживает распространение инфекции, однако не способна полностью предотвратить инфицирование животных и решить проблему искоренения БА (Wittman G. 1991).

Основой программ контроля и искоренения БА является выявление инфицированных свиней с помощью серологических методов и их выбраковка. В хозяйствах, где вакцинация животных не проводится, выявление инфицированных свиней осуществляют, в основном, с помощью скрининговых ИФА, основанных на обнаружении антител против цельных вирионов ВБА или против гликопротеина gB (Snyder et al., 1977; Briaire et al., 1979; Sorensen et al., 1986; Quist et al., 1989; Grom et al, 1992). В хозяйствах с высоким уровнем инфицированности, для сдерживания инфекции используют "маркированные" вакцины против БА. Среди "маркированных" вакцин наиболее широкое распространение получили gE-негативные вакцины, у которых отсутствует гликопротеин gE (Quint et al., 1987; Moonnann et al., 1990). Широко используются как живые, так и инактивированные "маркированные" вакцины. У свиней, иммунизированных такими вакцинами, отсутствуют антитела против "маркерного" гликопротеина. Инфицирование вакцинированных животных полевыми вирусами, имеющими весь набор гликопротеинов, индуцирует образование антител против gE. По наличию или отсутствию gE-специфических антител можно дифференцировать инфекционный и вакцинальный иммунитет, то есть выявлять инфицированных животных среди вакцинированного поголовья. Дискриминирующие тесты, выявляющие gE-специфические антитела, нашли широкое применение для дифференциации вакцинированных и инфицированных животных, и их разработке и совершенствованию уделяется особое внимание (Eloit et al., 1988; Van Oirshot et al., 1988; Mellencamp et al., 1989; Tonelli Q.J., 1991; Grom et al., 1992; Kimman et al., 1996).

Разработка эффективных средств серологической диагностики и профилактики БА в настоящее время остается актуальной задачей. Особое значение с точки зрения создания диагностических тестов имеют глико-протеины gE и gB ВБА, так как серологическая диагностика БА в подавляющем большинстве случаев основана на выявлении gE- и gB-

специфических антител. Гликопротеин §В, кроме того, имеет важное значение с точки зрения разработки вакцин нового поколения, так как является важнейшим иммуногеном ВБА и считается реальным кандидатом ш включение в состав субъединичных и ДНК-вакцин против БА (Такас1а А. Юс1а Н. 1995; Хиап е1 а1., 1995). Фундаментальной основой для разработки эффективных диагностических и зВ-тестов и вакцин нового поколения против БА является изучение а1ггигешюй структуры gE и gB ВБА I закономерностей формирования противовирусного иммунитета на эта гликопротеины. В настоящее время указанные вопросы остаются недостаточно неисследованными.

Создание современных эффективных диагностических тест-систем кроме изучения упомянутых выше фундаментальных вопросов, включай в себя важный этап разработки, оптимизации и сравнительной оцены различных диагностических методов и отбор тестов, наиболее перепек тивных для использования в практике. Кроме того, разработка диагно стических тест-систем, ориентированных на широкое практическое при менение, предполагает решение комплекса практических вопросов, свя занных с изготовлением тест-систем. К ним относятся: разработка мето дов технологического контроля и стандартизации изготовления тест систем, разработка и оптимизация технологии изготовления отдельны; компонентов тест-систем, оптимизация разработанных тест-систем, опре деление их диагностической ценности. Разработка методов технологиче ского контроля изготовления и стандартизации "маркированных" вакцш против Б А также является необходимым условием создания эффективны) вакцин.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучении антигенной структуры гликопротеинов gE и gB ВБА, их роли в индукцш противовирусного иммунитета и разработка на основе полученных дан ных методов серологической диагностики БА и контроля изготовлешь gE-нeгaтивныx "маркированных" вакцин против БА.

В задачи исследования входило:

1. Получить представительные панели моноклональных ангите.] (мкАТ) к гликопротеинам gE и gB ВБА, а также набор рекомбинантньс фрагментов, соответствующих различным участкам аминокислотной по следовательности гликопротеинов.

2. С помощью полученных и gB-cпeцифичecкиx мкАТ и рекомби нантных фрагментов определить топографическую эпитопную структур; §Е и §В и локализацию эпитопов относительно аминокислотной последо ватсльности гликопротеинов.

3. Исследовать роль отдельных эпитопов и областей гликопротеино) §Е и §В в индукции гуморального иммунитета при инфицировании и им мунизации животных.

4. Определить роль отдельных эпитопов и областей гликопротеина в индукции защитного иммунитета.

5. Разработать эффективную иммуноферментную дискриминирующун диагностическую тест-систему для дифференциации вакцинированных ]

инфицированных свиней, основанную на выявлении антител к гликопро-теину gE ВБА.

6. Разработать эффективную иммуноферментную скрининговую диагностическую тест-систему для выявления инфицированных свиней среди невакцинированного поголовья, основанную на определении антител к гликопротеину gB ВБА.

7. Разработать технологию изготовления и методы контроля диагностических gE- и gB-тест-систем.

8. Разработать методы технологического контроля изготовления инак-тивированных gE-негативных "маркированных" вакцин против БА.

Научная новизна работы.

- Получены панели мкАТ, специфичных к гликопротеинам gE и gB ВБА, а также набор рекомбинангных фрагментов, соответствующих различным участкам аминокислотной последовательности гликопротеинов.

- С использованием полученных мкАТ построены топографические эпитопные карты гликопротеинов gB и gE. Установлена важная роль ди-сульфидных связей в формировании антигенных структур gE и gB.

- В N-концевой области гликопротеина gE ВБА выявлен высокоантигенный район, включающий в себя кластер линейных эпитопов и участвующий в формировании отдельных конформационных эпитопов gE.

- В структуре гликопротеина gB ВБА выявлены две топологически и структурно различные антигенные области. Одна область расположена в N-концевом участке gBb субъединицы и состоит из линейных эпитопов; другая - локализована в эктодоменном участке gBc субъединицы и включает в себя кластер взаимоперекрывающихся конформационых эпитопов.

- Показана высокая консервативность антигенных структур гликопротеинов gE и gB ВБА.

- Показано, что конформационные эпитопы гликопротеинов gE и gB ВБА играют центральную роль в индукции гуморального иммунного ответа. На гликопротеинах gE и gB выявлены группы конформационных иммунодоминантных эпитопов.

- Установлено, что при многократных иммунизациях животных роль линейных эпитопов в гуморальном иммунном ответе возрастает. Среди линейных эпитопов, эпитопам N-концевых областей гликопротеинов gE и gB принадлежит наиболее значительная роль в индукции гуморального иммунного ответа.

- Показано, что антигенные области гликопротеина gB в N-концевом участке gBb субъединицы и в эктодоменном участке gBc участвуют в формировании защитного иммунитета.

- Проведена сравнительная оценка четырех вариантов скрининговых gB-ИФА и пяти вариантов дискриминирующих gE-ИФА для выявления свиней, инфицированных ВБА и вакцинированных gE-негативной "маркированной" вакциной против БА. Показаны преимущества использования прямых блокирующих gB-ИФА и gE-ИФА для серологической диагностики БА.

Практическая значимость работы.

- Разработана иммуноферментная дискриминирующая gE-тсст-система для выявления инфицированных животных среди поголовья свиней, вакцинированных gE-негативной "маркированной" вакциной. Разработана иммуноферментная скрининговая gB-тест-система для выявления инфицированных животных среди невакцинированного поголовья свиней. Диагностические тест-системы по своим характеристикам на уступают аналогичным зарубежным gE- и gB-тестам. Разработаны технология, методы контроля и НД на изготовление диагностических gE- и gB-тест-систем.

- Разработаны методы технологического контроля изготовления инак-тивированных gE-негативных "маркированных" вакцин против БА. Методы использованы для оптимизации, стандартизации и контроля технологии изготовления "маркированных" вакцин против БА.

- Полученные данные могут служить основой для разработки субъединичных вакцин с использованием gB-антигена и для проведения дальнейших структурно-функциональных исследований gE и gB ВБА.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на IV-ом совещании "Культивирование клеток животных и человека" (Пущино, 1994), всероссийской научно-практической конференции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных" (Владимир, 1995), международной научной конференции "Общая эпизоотология: иммунологические и методологические проблемы" (Харьков, 1995), городской научной конференции молодых учёных г. Пущино (Пущино, 1996), международной конференции "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных" (Владимир. 1997), Ii-ом международном конгрессе "Вакцины и иммунизация" (Льеж, Бельгия, 2000), международном конгрессе IPVS (Мельбурн, Австралия, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликована 31 научная работа.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и списка литературы, содержащего 17 отечественных и 375 зарубежных источников. Диссертация изложена на 254 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 таблицами и 30 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИСЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Вирусные штаммы. В работе использовали gE-положителыше штаммы ВБА (Ka, Phylaxia, К, BUK 628, Арский и ВГНКИ), gE-отрицательные штаммы (Bartha К61, NIA-4, Begonia и 77/3) и 10 ^охарактеризованных полевых изолятов ВБА из хозяйств Украины. Вирусные штаммы и изоляты были получены из коллекций Ветеринарного Медицинского Института (Будапешт, Венгрия) и Института ветеринарной медицины (Киев, Украина). Вирусы культивировали на клетках ВНК-21/13. Очистку вирионов осуществляли как описано (Ben-Porat al., 1974).

Сыворотки и антитела. Сыворотки свиней, использованпые в работе (более 6000 сывороток), были получены из коллекций Института ветеринарной медицины (Киев, Украина), Ценгрального ветеринарного инстшута (Будапешт, Венгрия), Национального ветеринарного исследовательского института (Пулава, Польша) и Института POURQUŒR (Монпелье, Франция). Все сыворотки исследовали на наличие gE- и gB-специфических антител в gE-ELISA (IDEXX) и gB-ELISA (Svanova Biotech), которые рассматривались в качестве референтных тестов.

мкАТ против белков ВБА получали с помощью гибридомной технологии (Goding, J.W. 1980). Для иммунизации использовали очищенные инактивиро-ванные формалином препараты ВБА (штаммы К и Phylaxya) и гликопротеин gB ВБА. Скрининг гибридом на продукцию вирус-специфических мкАТ проводили методом иммунопероксидазного окрашивания клеток, инфицированных ВБА (штамм К), с использованием метода пероксидаза-антипероксидаза (ПАП-метод). Для приготовления ПАП-комплекса нами были получены мкАТ к пероксидазе хрена. мкАТ 1/14, 3/6 и 4/4, направленные к gE ВБА (Lukâcs et al., 1985) любезно предоставила доктор Н. Лукач (Дюссельдорфский Университет, Германия).

Получение, экспрессия и очистка рекомбинантных фрагментов gE и gB. Последовательности, соответствующие фрагментам gE и gB, клонировали из ДНК ВБА (штамм Ка) используя стандартные молекулярно-биологические методики. Для экспрессии в E.coli использовали экспрессируюгций вектор pGEX-3X. Индукцию синтеза рекомбинантных белков проводили с помощью IPTG. Растворимые рекомбинантшле белки выделяли хроматографией на глютатион-сефарозе. Белки, экспрессируемые в виде нерастворимых телец включения, очищали с помощью центрифугирования.

Фрагмент гена, кодирующий N-концевые аминокислоты gE, клонировали в эукариотический экспрессирующий вектор pWS4 (Sheay et al., 1993) под промотором немедленно-раннего гена цитомегаловируса. Клетки ВНК-21/13 трансфецировали полученной плазмидой с использованием липофектиновой системы трансфекции и оценивали транзиентную экспрессию рекомбинант-ного фрагмента с помощью мкАТ методом иммунопероксидазного окрашивания клеток.

Очистка гликопротеинов gE и gB с помощью аффинной хроматографии. Аффинные сорбенты получали как описано (Stults et al., 1989), используя gB-специфическое антитело 34/2 и gE-специфическое антитело 75/7. Гликопро-теины gB и gE выделяли из инфицированных ВБА клеток или из очищенных вирионов как о mica но (Li et al., 1995).

2-иентровые gE- и gB-специфические "сендвич" ИФА. Лунки 96-луночных планшетов сенсибилизировали препаратами очищенных gE-специфических мкАТ 75/7 (в "сендвич" gE-ИФА) или gB-специфических мкАТ 11/5 (в "сендвич" gB-ИФА). В лунках инкубировали исследуемый вирусный материал, обработанный 1% тритона Х-100, в различных разведениях. Лунки отмывали, инкубировали с пероксидазными конъюгатами gE-специфических мкАТ 101/9 (в "сендвич" gE-ИФА) или gB-специфических мкАТ 34/2 (в "сендвич" gB-ИФА), промывали и проявляли реакцию с помощью орто-фенилендиамина. Оптическую плотность в лунках регистрировали при 492 нм.

Прямые блокирующие gB- и gE-ИФА. Лунки 96-луночных планшетов сенсибилизировали ВБА-ангагеном штамма К. После этого, в лунках инкубировали исследуемые сыворотки, разведенные 1:1 в ФСБ-Т-М (150 мМ NaCl; 30 мМ №-фосфатный буфер, рН 7,5; 0,05% твина 20; 2% сухого молока). После промывки, в лунках инкубировали кот>югаты gE-специфических мкАТ 101/9 (для 6n-gE-HOA) или gB-cпeщIфичecкиx мкАТ 26/33 (доя 6n-gB-№I>A). Лунки отмывали и проявляли реакцию как описано выше.

Непрямые блокирующие gB- и gE-ИФА. Лунки 96-луночных планшетов сенсибилизировали ВБА-ангигеном и инкубировали с исследуемыми сыворотками как описано для прямого блокирующего ИФА. После промывки в лунках инкубировали gE-специфические мкАТ 101/9 (для Gn-gE-ИФЛ) или gB-специфические мкАТ 26/33 (для бн-цВ-ИФА). Лунки отмывали, инкубировали с пероксидазным коньюгатом кроличьих антител против IgG мыши, снова отмывали и проявляли реакцию как описано выше.

2-центровые блокирующие "сендеич " gE- и gB-ИФА. Лунки 96-луночных планшетов сенсибилизировали препаратами очищенных gE-специфических мкАТ 75/7 (для oc-gE-ИФА) или gB-специфических мкАТ 11/5 (для бс-gB-ИФА). В отдельных несенсибилизировашгых лупках смешивали 40 мкл исследуемых сывороток и 80 мкл ВБА, лизировашюго тритоном Х-100, в оптимальном разведении. После инкубации, 70 мкл преинкубировашюй смеси и 30 мкл коньюгатов gE-специфичсских мкАТ 101/9 (для 6c-gE-I№A) или gB-спещ1фических мкАТ 34/2 (для бс-®В-ИФА) смешивали и инкубировали в сенсибилизировашшх лунках. Лунки отмывали и проявляли реакцию как описано выше.

Непрямые ИФА для выявления ВБА-спиифических антител. Лунки 96-луночных планшетов сенсибилизировали препаратами аффишю-очищенных gE (для аффи^Н-ИФА) или gB (для аффи-^В-ИФА), рекомбинантным фраг-MeirroM gE (для peK-gE-ИФА) или очищенным антигеном ВБА (вир-ИФА). В лунках инкубировали исследуемые сыворотки или мкАТ, затем лунки отмывали и инкубировали с пероксидазным коньюгатом против IgG свиней (при исследовании свиных сывороток) или с пероксидазным коньюгатом против IgG мышей (при исследовании мышиных сывороток и мкАТ). Лунки отмывали и проявляли реакцию как описано выше.

Оценка влияния антител на развитие вирусной инфекции in vitro. Вирус-нейтрализующую активность антител исследовали стандартным методом вирус-нейтрализации и методом с инактивацией экстраклеточного вируса (Highlander et al., 1984) . Влияние антител на проникновение вируса внутрь клеток и на распространение вируса от клетки к клетке оценивали как описано (Highlander et al., 1984). Использовали штамм Ка ВБА. Фокусы инфекции выявляли с помощью иммунопероксидазнош окрашивания клеток gB-специфической поликлональной сывороткой ПАП-методом.

Активная и пассивная иммунизация мышей. Для экспериментов использовали самцов мышей линии BALB/c (3-4 недели). Для активной иммунизации, антигены (очищенный gB, рекомбинантные фрагменты gB, инактивиро-ванный формалином ВБА) эмульгировали в полном адьюванте Фрейнда (при первой иммунизации) или в неполном адьюванте Фрейнда (при повторных иммунизациях). Мышей иммунизировали трижды gB-ангигеном и рекомби-нантными фрагментами gB, внутрибрюшинно, с интервалом 2 недели. Коли-

чество вводимых антигенов на одну иммунизацию составляло: рекомбинант-ные белки- 20 мкг белка/мышь; очищенный gB- 10 мкг/мышь. ВБА-антигеном иммунизировали однократно. Контрольное инфицирование вирусом (штамм К) проводили на 10-й день после последней иммунизации посредством внутримышечного введения ЗхЛД100 ВБА. После инфицирования, животных наблюдали в течение двух недель.

В экспериментах по пассивной иммунизации очищенные мкАТ вводили мышам внутрибрюшинно (1 мг/мышь). Контрольное инфицирование вирусом проводили через 24 ч как описано выше.

Остальные иммунохимические, биохимические и вирусологические исследования проводили по стандартным методикам.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Получение яЕ- и gB-специфических моноклональных антител

Первый этап работы был посвящен получению панелей мкАТ против gE и gB ВБА, которые по спектру специфичности были бы максимально приближены к поликлональной сыворотке. С целью увеличения разнообразия ВБА-специфических мкАТ было проведено несколько иммуниза-ций мышей вирусом (штаммы К и Phylaxya) и гликопротеином gB ВБА и слияний лимфоцитов иммунных мышей с миеломными клетками. Для бустерной иммунизации использовали как инактивированный, так и живой вирус. При первичном скрининге отбирали все гибридомные клоны, продуцирующие ВБА-специфические мкАТ, независимо от их аффинности. В результате проведешюй работы было получено более 80 гибридом-ных клонов, продуцирую щи х мкАТ против белков ВБА.

Четырнадцать мкАТ из полученной панели антител обладали сходными групповыми характеристиками: 1) окрашивали в иммунопероксидаз-ном методе клетки, инфицированные gE-положительными штаммами ВБА, но не реагировали с клетками, инфицированными gE-отрица-гельными штаммами; 2) реагировали с вирусным белком, который локализовался в вирусной оболочке и специфически связывался с конканава-лин А-сефарозой, что свидетельствовало о гликопротеиновой природе ан-гигена; 3) иммунопреципитировали белок, меченный [35S]-mcthohhhom, имеющий молекулярную массу 120-130 кДа в восстанавливающих и не-восстанавнивающих условиях электрофореза (Рис. 1); 4) два мкАТ (80/10 и 106/27) реагировали в иммуноблоттинге с белковой полосой с молекулярной массой 120-130 кДа после электрофореза белков ВБА в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Одно мкАТ (4/20) реагировало в иммуноблоттинге с белком той же молекулярной массы только при проведении электрофореза в невосстанавливающих условиях. Реактивность этих мкАТ с вирусными белками в иммуноблоттинге не отличаюсь от реактивности мкАТ 1/14, 3/6 и 4/4 с известной специфичностью к гликопротеину gE (Lukâcs et al., 1985). С учетом литературных данных Tiampl et al., 1984; Lukâcs et al., 1985), полученные совокупные результаты позволили заключить, что мкАТ данной группы направлены к gE ВБА.

Рис. 1. Реактивность ВБА-специфических мкАТ в реакции иммунопре-ципигации вирус-специфических белков, меченых 338-метионином (А) и в иммуноблотганге (Б). Электрофорез проводили в восстанавливающих (полосы 1, 2, 3, 4, 5, 11, 12, 13, 14, 15) или в невосстанавливающих (полосы 6, 7, 8, 9, 10) условиях. После электрофореза, гели с 35S-mc4chlimh белками ВБА подвергали радиоавтографии (А). Немеченые белки ВБА переносили на мембраны и проводили иммунные реакции с полученными мкАТ (Б). Номера треков соответствуют следующим мкАТ: 1, б, 11 - gD-специфическое мкАТ 42/11; 2, 7, 12 - мкАТ 106/27 (представляет группу из 14 gE-специфических мкАТ); 3, 8, 13 и 4, 9, 14 - мкАТ, соответственно, 79/9 и 34/2 (представляют группу из 27 gB-специфических мкАТ); 5, 10, 15 - негативное мкЛТ к 5-бром-2'-дезоксиуридину. Слева указаны молекулярные массы маркерных белков.

Среди полученных ВБА-специфических антител 27 мкАТ также обнаружили одинаковую групповую специфичность: 1) окрашивали в имму-нопероксидазном методе клетки, инфицированные gE-положигельными и gE-отрицательными штаммами ВБА; 2) реагировали с антигеном, имеющим гликопротеиновую природу; 3) иммунопреципитировали вирусный гликопротеин, меченный [ 58]-мегионином, который имел молекулярную массу около 160-180 кДа в невосстанавливающих условиях электрофореза и диссоциировал на три белка с молекулярными массами 115-125 кДа, 67-70 кДа и 58 кДа при восстановлении препарата (Рис. 1); 4) реагировали в иммуноблоттинге с белковой полосой с молекулярной массой 160180 кДа при электрофорезе в невосстанавливающих условиях. После восстановления препарата, 22 мкАТ выявляли белковые полосы 115-125 кДа

и 58 кДа; пять мкАТ реагировали с белковыми полосами 115-125 кДа и 67-70 кДа (Рис. 1). На основании данных литературы (Нашр1 е1 а1., 1984; Ьикасэ й а!., 1985) мы заключили, что такие характеристики и такое поведение в различных условиях электрофореза характерно для гликопро-теина ВБА. При этом 22 мкАТ реагировали с §Вс субъединицей gB (58 кДа), в то время как 5 мкАТ связывались с gBb субъединицей (67-70 кДа). Все 27 §В-специфических мкАТ реагировали с §Ва субъединицей (115-125 кДа), которая включает в себя §Вс и йВЬ субъединицы.

Таким образом, в результате проведенной работы были получены широкие панели мкАТ, направленных против гликопротеинов gE и gB ВБА.

2.2.2. Изучение антигенной структуры гликопротеинов и ВБА

Топографическое эпитопное картирование яЕ и яВ ВБА

Топографическое картирование эпитопов gE и gB ВБА проводили с помощью трех иммуноферментных методов- 2-центрового "сендвич" ИФА, конкурентного ИФА и "аддитивного" ИФА. Результаты, полученные с помощью всех трех методов, между собой хорошо согласовывались, хотя конкурентный ИФА оказался наиболее эффективным методом топологического группирования эпитопов гликопротеинов.

На рис. 2 представлены данные конкурентных gE-ИФA и gB-ИФA. Все мкАТ ингибировали связывание гомологичных конъюгатов более чем на 50%. В связи с этим, мы принимали, что мкАТ1 и мкАТ2 направлены к одной эпитопной группе, если они ингибировали связывание, соответственно, конъюгатов мкАТ2 и мкАТ1, более чем на 50%. В большинстве случаев наблюдалась 2-сторонняя конкуренция между мкАТ. Топологические эпитопные карты gE и gB, построенные на основании данных конкурентных ИФА, представлены на рис. 3. На гликопротеине gE идентифицировано 11 топологически отличных эпитопов и антигенных доменов, представленных несколькими мкАТ, часть из которых перекрывались друг с другом (Рис. 3(А)). На gB выявлено 15 топологически различных эпитопов и антигенных доменов (Рис. 3(Б)). Только 5 эпитопов (К, Ь, М, N и Р), с которыми реагировали по одному мкАТ, были локализованы на gBb субъединице и не перекрывались между собой или с другими эпитопами £В. Эпитоп мкАТ 21/2 не выявлялся на вирион-ассоциированном gB, но обнаруживался в аффинно-очищенном На локализовались 10 топологически различных эпитопов и антигенных доменов, организованные в сложный кластер взаимоперекрывающихся эпитопов, с которыми связывались 22 мкАТ.

Характеристика эпитопов яЕ и яВ ВБА

Для характеристики эпитопов gE и gB ВБА исследовали реактивность мкАТ с гликопротеинами в ИФА после термальной денатурации очищенных вирионов или очищенных гликопротеинов в восстанавливающих и невоссганавливающих условиях. Среди полученных нами gE-специфических мкАТ, только мкАТ 106/27 не меняло реактивности при

Конкуренция > 50%, но < 805

Конкуренция > 80%

Рис. 2. Топографическое эпитопное картирование гликопротеииов ^ (А) и (Б) с помощью конкурентного ИФА. Все и вЕ-специфические мкАТ использовали в качестве конкурирующих антител во всех комбинациях с конъюгатами, соответствсшю, и gE-cпeцифичecкиx мкАТ. Для каждой пары рассчитывали процент ипгибировшшя связывания коныогатов с сорбировашсыми антигенами.

денатурации gE; эпитоп этого мкАТ был отнесен к линейным эпитопам, так как не зависел от нативной конформации gE (Табл. 1). Эпитопы остальных 13 §Е-специфичсских мкАТ оказались чувствительными к денатурирующим воздействиям и были отнесены к группе конформационных эпитопов, зависящих от нативной конформации. Эпитопы описанных ранее §Е-специфических мкАТ 3/6 и 4/4 (Ьикасв & а1., 1985) являлись линейными эпитопами; эпитоп мкАТ 1/14 являлся конформационным. Эпитопы gB - К, Ь, М, N и Р были отнесены к линейным эпитопам (Табл. 2). Эпитопы А, В, в, С, Б, Е, Б, Н, I и ] гликопротеина gB, представленных 22 мкАТ, были конформационными. Многие конформационные эпитопы были относительно устойчивы к температурной денатурации в невос-станавливающих условиях и теряли не более 30-60% реактивности с со-

О Е Р в 1<Л Ш)Льнаг\ Сш }(*/*)

Рис. 3. Топографические эпи-топные карты гликопротеинов ¡>Е (А) и gB (Б). Отдельные эпитопы и антигенные домены гликопротеинов представлены кружками. Внутри кружков указаны мкАТ, реагирующие с соответствующим эпитопами. На эпитопной карте gB, белыми кружками обозначены эпитопы и антигенные домены gBc субъединицы; заштрихованными кружками обозначены эпитопы §ВЬ субъедгашцы.

gBc-субъедмякиа йВЬ-суСмдиинца

ответствующими мкАТ после обработки gB при 100°С. Следует подчеркнуть, что все конформационные эпитопы gB локализовались на gBc субъ-едишще, в то время, как все выявленные линейные эпитопы были локализованы на gBb субъединице.

Конформационные эпитопы gE и gB обнаружили высокую чувствительность к восстанавливающим агентам (ДТТ и 2-МЭ), что свидетельствовало о важной роли дисульфидных связей в формировании антигенной структуры этих гликопротеинов (Табл: 1 и 2).

Определение локализации эпитопов gE с помощью рекомбинаитных фрагментов

Ранее было показано, что в N-терминальном участке gE локализованы ряд линейных эпитопов (Jacobs et al, 1990; Fuchs et al., 1990). С целью дальнейшего изучения антигенности этой области, мы клонировали в экспрессирующем векторе pGEX-3X фрагмент гена gE, кодирующий аминокислоты 1-125. Рекомбинантный белок являлся слитым белком, состоящим из аминокислот глутатион-Б-трансферазы из Schistosoma japonicum (GST) и 125 аминокислот N-терминальной части gE. Белок экспрессировался в E.coli в виде нерастворимых телец включения и имел молекулярную массу 42-43 кДа (Рис. 4), что согласовывалось с массой, предсказанной исходя из первичной последовательности gE-фрагмента и GST.

мкАТ 106/27, 3/6 и 4/4 реагировали с рекомбинангным фрагментом gE в иммуноблоттингс и непрямом ИФА (Рис. 4). Таким образом, все выявленные нами линейные эпитопы gE были локализованы в сегменте между аминокислотными остатками 22-125 gE, учитывая отщепление сигнального пептида (21 аминокислота).

(А)

CI С2 СЗ (

г2600/"ХвО/юг W(93/4) 83/25 Н45/6] . 75/7 V-/ 90/8

101/!

(Б)

м.

It.

Таблица 1. Реактивность gE-специфических мкАТ и сывороток с денатурированным глнкопротешгом gE в составе вирионов и аффиино-очтценным gE.

Аффиио-

Класс/ Вирионный gE * ОЧШЦСН-

Антитело/ подкласс Анти- ный gE*

сыворотка иммуно- генный

глобулина домен 80"C 100"C 37"C 80UC 100UC 100UC

+МЭ +МЭ +МЭ +МЭ

26/30 IgGl AI 0 0 6 0 0 0

61/7 IRGI AI 42 0 31 0 0 0

75/7 IgGl AI 20 0 49 7 0 0

93/4 IgGl A2 34 0 30 0 0 0

90/8 IgGl В 73 18 40 5 0 0

83/25 IgM В 42 13 47 8 0 0

59/4 IgGl В 43 3 51 0 0 0

45/6 IgGl C1 10 0 14 0 0 0

80/10 IgG2b C2 87 74 76 21 15 6

101/9 IgGl C2 23 0 37 0 0 0

7/10 IgG2b C3 65 15 58 3 0 0

4/20 IgG2a D 25 5 32 0 0 0

106/27 IgGl E 109 90 108 100 82 78

1/14 и.о. C2 66 40 36 2 0 0

3/6 и.о. F 100 97 117 103 87 84

4/4 HO. G 105 103 109 93 101 93

Сыворотки. #:

Группа 1 и.о. H.O. H.O. и.о. и.о. 10

Группа 2 H.O. и.о. и.о. H.O. и.о. 12

Группа 3 H.O. и.о. и.о. H.O. H.O. 15

Группа 4 и.о. и.о. H.O. H.O. и.о. 25

Группа 5 H.O. H.O. и.о. H.O. II.O. 27

* Представлены значения реактивности мкАТ и сывороток в непрямом ИФА с /итерированными антигенами, выраженные в процентах. Реактивность антител с неденатурирован-ным антигеном принимали за 100%; отклонение от среднего значения не превышало 15%; # Группы сывороток: 1 - инфицированных невакцшшрованих свиней; 2 - свиней, однократно вакцинированных инактивированной "немаркированной" вакциной против БА; 3 - мышей и кроликов, однократно иммунизированных антигеном ВБА (штамм К); 4 - свиней, многократно вакцинированных инактивированной "немаркированной" вакциной против БА; 5 -мышей и кроликов, многократно иммунизированных антигеном ВБА (штамм К). Для сывороток представлены средние значения для группы из 10-30 сывороток; МЭ - 3% 2-меркаптоэтанола: н.о. - не определяли.

Этот же фрагмент gE, транзиентно экспрессированный в эукариотиче-ской системе (клетки ВНК-21/13), выявлялся мкАТ 106/27, 3/6 и 4/4, которые реагировали с белком, экспрессированным в E.coli, а также выявлялся мкАТ 1/14, которое не реагировало с этим фрагментом, экспрессированным в E.coli (данные не приведены). По-видимому, в белке, экс-прессированном в E.coli, отсутствует нативная конформация, в связи с чем конформационный эпитоп мкАТ 1/14 не экспрессируется.

Ранее, последовательности, участвующие в формировании эпитопа мкАТ 1/14 были локализованы между аминокислотами 108-122 gE (Fuchs et al., 1990). Как мы показали (Рис. 3(А)), эпитоп мкАТ 1/14, локализован в топологическом антигенном домене СЗ, в который входит также эпитоп мкАТ 101/9 и который перекрывается с эпитопами С2 и С4. В связи с этим, данный участок в N-концевой области gE, возможно,

Таблица 2. Реактивность gB-специфических мкЛТ и сьшороток с разными формами gB-антигена.

Класс/ Субъединица Аффинно-очшценный

Антитело/ подкласс gB/тополо- Аффинно-очшценный gB* gB, обработанный

сыворотка иммуно- гичсский трипсином*

глобули- эпитоп 100UC 37"C 100UC Неденатури- 100UC

на +ДТТ +ДТТ рованныи +ДТТ

11/5 1вМ gBc/A 11 5 0 93 0

7 дога Л/А 20 4 0 101 0

11 ДО2а йВс/А 28 4 0 94 0

12 дога RHC/A 9 3 0 109 0

60/2 ДО1 gBc/B 38 7 0 95 0

б ДО1 RR/B 16 8 0 99 0

3/36 ДО2Ь gBc/C 52 5 0 94 0

89/11 ДО2Ь RlVD 74 39 0 95 0

1/7 1ЙМ glVE 21 3 0 98 0

46/7 догь fiBc/F 17 4 0 94 0

34/2 ДО1 gBc/G 30 6 0 91 0

1 дога rBc/G 13 5 0 93 0

2 дога RBc/G 18 4 0 99 0

3 ДО2Ь ñBc/G 6 6 0 102 0

4 дога RB./G 70 30 0 103 0

5 ДО1 gBc/G 96 58 0 94 0

8 дога RBc/G 77 29 0 94 0

9 дога rb,'g 12 62 0 93 0

10 ДО1 eBc/G 82 42 0 97 0

24/11 ДО2а rB,/H 75 13 0 96 0

26/33 ДО2Ь евл 51 8 0 98 0

28/7 и.о. rbc/j 28 23 0 100 0

13 ДО2а rbb/k 98 97 95 0 0

79/9 ДО2Ь glVb 86 78 77 0 0

86/15 ДОЗ gBt/M 89 95 92 0 0

21/2 н.о. gBt/N 93 90 90 98 94

11/6 и.о. йВьЯ» 90 92 88 0 0

Сыворотки//

Группа 1 gBb и gBc и.о. h.o. 26 87 23

Группа 2 gBb и gBc h.o. h.o. 28 92 21

Группа 3 gBb и gBc h.o. h.o. 22 82 21

Группа 4 gBb и gBc h.o. h.o. 58 63 8

# Группы сывороток: 1 - инфицированных невакцинированых свиней; 2 - свиней, однократно вакцинированных живой "маркированной" вакциной Bartha К61; 3 - мышей, одпо-кратно иммунизированных gB-антигеном; 4 - мышей, многократно иммунизированных gB-антигеном. ДТТ - 10 мМ дитаотреитола. Остальные обозначения указаны в подстрочнике к таблице 1.

принимает участие в формировании конформационных эпитопов мкАТ 101/9, 80/10, 151/8 и 7/10. Отсутствие реактивности этих мкАТ с реком-бинаптньш фрагментом, экспресс1фованным в эукариотической системе, возможно связано с тем, что не все аминокислотные остатки, которые необходимы для формирования этих эпитопов в нативном белке, присутствуют в данном фрагменте gE.

Обобщенная схема локализации эпитопов гликопротеина gE, построенная на основе полученных нами данных, представлена на рис. 5.

1 2 3 4 5 6 7 8

94- — 1:1 ®Й

67- s-. "' ■ ' V. -■

43-

tf >' . 1

• ЧГ

30- --- , .

20.1 -

ДСН-ПААГЭ ИММУНОБЛОТТИНГ

Рис. 4. Электрофорез и иммуноблоттинг рекомбинантного фрагмента gE ВБА, экспрессировашого в E.coli. 1 и 2 - ДСН-ПААГЭ маркерных белков и очищенного рекомбиншгшого фрагмента gE. Электрофорез проводили в восстанавливающих условиях. Слева указаны молекулярные массы маркерных белков. В иммуноблотшше мембраны инкубировали с сыворотками от инфицированных »¿вакцинированных свиней (3), неинфицированных невакцшшрованных свиней (4), неинфицировшшых свиней, вакцинированных gE-нсгативной вакциной (5), с gE-специфическими мкАТ 3/6 (6) и 106/27 (7) и с gB-специфическими негативными контрольными мкАТ 89/11 (8).

21 108 125

Рис. 5. Схематическая карта локализации эпитопов гликопротеина gE ВБА. Положение линейных эпитопов, указало элшшеом с горизонтальной штриховкой. Положение участков аминокислотной последовательности gE, участвующих в формировании конформационных эпитопов, указано эллипсом со сплошной штриховкой. В рамках указаны мкАТ, представляющие отдельные эпитопы. В рамке, отмеченной пунктирной линией, представлены мкАТ, составляющие эпитопов которых предположительно локализованы в указанной области gE. Шестиугольники показывают положение сайтов Ы-гликозилирования. СП-сигнапьный пептид; ТМ - трансмембранная область.

Определение локализации эпитопов еВ

Последовательности гена gB штамма Ка ВБА клонировали в экспрес-сирующем векторе pGEX-3X. На рис. 6(A) схематично представлены аминокислотная последовательность gB и последовательностей фрагментов, экспрессируемых в составе рекомбинантных белков. Полученные ре-комбинантные белки соответствовали полной аминокислотной последова-

(А)

gBb-субъединица | gPc-субъединица

РП-1-1-1-1-1--Г

1 100 200 300 400 500 600 700 800 900 (Б)

59 — 126 .....................................................................

86 — 115 .......................................................................

86 ———— 480

86 416 ................................

86 326 ...........................................

86 279 .................................................

86 214 .........................................................

428— 502

540 — 734 540 646

I ON CN1 гч СО

^ ^ ьо

(О N 8

Рис. 6. Схематическое представление последовательности гликопротеина §В ВБА и рекомбинантных фрагментов gB (А) и реактивность рекомбинантных фрагментов §В с £13-специфическими мкАТ в иммуноблотпшге (Б). Горизонтальные отрезки на рис. 6 (А) представляют полипептидные фрагменты gB. Цифры слева и справа от фрагментов gB указывают, соответственно, Ы- и С-концевые границы полипептидов. Место протеолишческого расщепления гликопротеина gB на £ВЬ и gBc отмечено черной вертикальной стрелкой. Остальные обозначения соответствуют обозначениям на рис. 5. Снизу на рис. 6 (Б) приведены обозначения £13-специфических мкАТ. мкАТ 86/15 представляет группу из трех мкАТ (11/6, 86/15 и 13); мкАТ 34/2 представляет группу из двух мкАТ (24/11 и 34/2); мкАТ 26/33 представляет группу из 20 мкАТ (с 1 до 12, 1/7, 3/36, 11/5, 26/33, 28/7, 46/7, 60/2 и 89/11). а-^В- мышиная поликлональная сыворотка против очищенного £В.

тельности процессированной gBb субъединицы; gBc была представлена двумя фрагментами (540-646 и 540-734), соответствующими значительной части экгодомена gBc. Фрагменты gB экспрессировались в виде белков, слитых с GST, и синтезировались, в основном, в виде телец включения. Только фрагменты GST-59-126 и GST-86-115 экспрессировались в виде растворимых белков. Все экспрессированные белки имели молекулярные массы, которые хорошо согласовывались с массами, предсказанными исходя из первичной последовательности фрагментов (Рис. 7).

V4 г^ i/j г—' iq г^ и j

Я <к ч2> vi) ^ ^ «М^тг U in сооо со со со со t [Д ю

94 67

43-

30-

20-1

Рис. 7. Электрофореграм-мы рекомбиншггаых фрагментов gB. Сверху указаны границы аминокислотных последовательностей реком-бинантных белков. GST -лизат индуцированных клеток E.coli, трансформированных pGEX-3X. Слева указаны молекулярные массы маркерных белков (кДа). Электрофорез проводили в восстанавливающих условиях.

Профили реактивности репрезентативных gB-специфических мкАТ с рекомбинантными фрагментами в иммуноблотганге показаны на рис. 6(Б). Результаты этих экспериментов можно суммировать следующим образом: 1) мкАТ 79/9, реагировало с единственным рекомбинантным фрагментом гликопротеина gB - ОБТ-59-126. Очевидно, что эгаггоп этого мкАТ локализован в районе первых 66 Ы-концевых аминокислот зрелого, полностью процесснрованного gB; 2) мкАТ 21/2 реагировало со всеми рекомбинантными белками, за исключением таковых, не содержащих аминокислоты 214-279. Это свидетельствовало, что эпитоп мкАТ 21/2 лежит между аминокислотами 214-279; 3) мкАТ 24/11 и 34/2 давали реакцию с двумя рекомбинантными фрагментами - С5Т-540-734 и СБТ-540-646. Таким образом, аминокислотные остатки, участвующие в формировании этих конформационных эпигопов, локализуются между аминокислотами 540-646 ¿Вс; 4) Двадцать мкАТ, представляющих 8 эпигопов и антигенных доменов gBc, реагировали с единственным рекомбинантным фрагментом, содержащим аминокислоты 540-734, но не реагировали с укороченным фрагментом, включающим аминокислоты 540646. Очевидно, что аминокислотные остатки из фрагмента 540-734 вовлечены в формирование этих конформационных эпитопов gBc субъединицы.

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1920 21 М $ зВТ дВ"Т М А Б

Рис. 8. Иммуноблотшнг (А) и электрофорез (Б) продуктов ограниченного трипсинолиза ¿3 (&В'Т, молярное соотношение §В:трипсин 100:1; вВ'Т, молярное соотношение £В:трипсин 30:1). Электрофорез проводили в восстанавливающих условиях. Реактивность (1-7), gB'T (8-14) и ^'Т (1521) с ^-специфическими мкАТ 11/6 (2, 9, 16), 21/2 (3, 10, 17), 79/9 (4, 11, 18), 86/15 (5, 12,19), 24/11 (6, 13, 20), ^-специфической антисывороткой (7, 14, 21) или с gE-специфическим контрольным негативным мкАТ 106/27 (1, 8, 15). М-положепие маркерных белков.

мкАТ 13, 11/6 и 86/15 не реагировали ни с одним из рекомбинантных белков. Картирование эпигопов этих мкАТ проводили анализируя их реактивность с фрагментами нативного gB, полученными в результате расщепления трипсином и бромцианом. Ограниченный протеолиз gB трипсином приводил к частичной деградации гликопротеина с появлением формы gB-T, относительно устойчивой к трипсинолизу (Рис. 8 (Б)). При этом, молекулярная масса gBb субъединицы снижалась до 53-51 кДа; масса gBc уменьшалась до 45 кДа. Укорочение gBb на 14-16 кДа сопровождалось потерей его реактивности с мкАТ 13, 86/15, 79/9 и 11/6 (Рис. 8 (А), табл. 2). Очевидно, что эпитопы мкАТ 13, 86/15 и 11/6 локализованы в И- и/или С-концевах сегментах gBb размером не более 15 кДа. Расщепление полипептидной цепи gB с помощью СШг приводило к появлению двух больших фрагментов размером 56-60 кДа и 37 кДа, которые реагировали с мкАТ 13, 86/15, 79/9 и 11/6 в иммуноблотгинге (Рис. 9). Учитывая локализацию эпитопа мкАТ 79/9 между аминокислотами 59-126, единственно возможным объяснением этих результатов является совместная локализация всех четырех эпигопов в Ы-концевой части gBb. Было также обнаружено, что в процессе хранения аффинно-очищенного gB в растворе наблюдалась постепенная деградация gB и появление фрагмента гликопротеина, который не реагировал с мкАТ 13, 86/15, 11/6 и 79/9. Последовательность потери эпигопов была следующей: эпитоп мкАТ 11/6, затем эпитопы мкАТ 13 и 86/15 и затем 79/9. Эпитопы мкАТ терялись из gBb и gBa субъединиц без видимого изменения молекулярной массы гликопротеинов, что было показано с помощью иммуноблоттинга (результаты не представлены). Полученные данные свидетельствовали,

что эпитопы мкАТ 13, 86/15 и 11/6 локализованы ближе к М-конну §ВЬ, чем эпитоп мкАТ 79/9, т.е. концентрируются на самом Ы-конце §ВЬ субъединицы.

Рис. 9. Реактивность gB-cne-цифических мкАТ с CNBr-фраг-менгами gB в иммуноблоттинге. 1-5 - нативный gB; 6-10 - CNBr-фрагменгы gB. 1 и 6- gE-cne-цифическое негативное контрольное мкАТ 75/7; 2 и 7 - мкАТ 13; 3 и 8- мкАТ 21/2; 4 и 9- мкАТ 79/9; 5 и 10- мкАТ 86/15. Электрофорез проводили в восстанавливающих условиях. Слева указаны молекулярные массы маркерных белков.

Таким образом, мы локализовали участки аминокислотной последовательности, участвующие в формировании 5 линейных и 22 конформаци-онных эпитопов gB. На рис. 10 показана схема локализации эпитопов gB ВБА.

Консервативность антигенных структур гликопротеинов gE и gB ВБА

В непрямом ИФА, все 26 gB-специфических мкАТ давали положительную реакцию с gB всех исследованных вирусных штаммов и изоля-тов (4 вирулентных лабораторных штамма, 6 вакцинных штаммов и 10 полевых изолятов). Все gE-специфическис мкАТ реагировали с gE всех gE-содержащих вирусных штаммов и изолятов. Полученные данные свидетельствовали о стабильном сохранении всех выявленных нами эпитопов на гликопротеинах gE и gB у различных штаммов ВБА.

Было также показано, что в сыворотках от инфицированных свиней из хозяйств России, Украины, Венгрии и Польши присутствовали антитела ко всем выявленным нами эпитопам gE и gB. Учитывая, что в этих хозяйствах, вероятно, распространены разные полевые штаммы ВБА, эти данные косвенно свидетельствуют о присутствии соответствующих эпитопов в gB и gE различных полевых изолятов ВБА из разных географических районов Европы. Таким образом, полученные совокупные данные

йВЬ-субъедипица

gBc-cyбъeдипнцa

N112

спО

-р соон

900

1 ^¡00 2001300 400

11/6, зш

13 Йб/15 79/9

24/11 1, 2, 3, 4, 34/2 5,6,7,8,

9, Ю, 11, 12,14,1/7, 3/36,11/5, 26/33, 46/7, 60/2, 89/11

Рис. 10. Схематическая карта локализации эпигонов гликопротеина ^ ВБА. Место протеолишческого расщепления гликопротеина gB на субъединицы gBb и йВс отмечено черной вертикальной стрелкой. Остальные обозначения указаны на рис. 5.

свидетельствовали о высокой консервативности антигенной структуры гликопротеинов gB и «Е ВБА.

2.2.3. Гуморальный иммунный ответ на гликопротеины gE и gB ВБА

Вклад конформационных и линейных эпитопов гликопротеинов кЕ и еВ в индукцию гуморального иммунного ответа

Превалирование в полученных нами панелях мкАТ антител к кон-формационным эпитопам gE и gB, в сравнен™ с мкАТ к линейным эпи-топам (13:1 у gE и 22:5 у gB), свидетельствовало о важной роли конформационных эпитопов этих гликопротеинов в индукции гуморального иммунного ответа при иммунизации мышей лшши ВАЬВ/с. которые использовались для получения гибридом. На следующем этапе важно было определить вклад конформациопных и линейных эпитопов в индукцию гуморального иммунного ответа на gE и gB при инфицировании и иммунизации свиней, естественного хозяина ВБА. Исследования проводили с помощью непрямого ИФА с применением аффинно-очищенных gE и gB. Денатурация очищенных gE и gB в восстанавливающих условиях приводила к полному разрушению конформационных эпитопов гликопротеинов, что можно было видеть по исчезновению реактивности мкАТ, направленных против конформационных эпитопов gE и gB (Табл. 1 и 2). При этом наблюдалось 3-12 кратное уменьшение сигналов, получаемых в ИФА, с сыворотками от инфицированных и иммунизированных животных. Результаты свидетельствовали, что в сыворотках животных, инфицированных или иммунизированных ВБА, антитела против конформаци-

онных эшггопов §Е и §В составляют значительную часть от всех и ^-специфических антител, соответственно.

Как мы отмечали, ограниченный протеолиз §В приводил к отщеплению высокоантигенной Й-концевой области и частичной деградации ¿*Вс субъединицы (Рис. 8); при этом кластер информационных эпитопов на §Вс сохранялся, что можно видеть по реактивности обработанного фрагмента gB (§В'Т) с мкАТ против информационных эпитопов §В (Табл. 2). У сывороток от инфицированных и однократно вакцинированных свиней, а также от мышей, однократно иммунизированных gB, реактивность с §В'Т уменьшалась незначительно (на 5-15%) в сравнении с исходным gB. Это свидетельствовало, что антитела, направленные к отщепляемым трипсином областям gB, в которые входил кластер линейных эпитопов Ы-кондевой области gB, составляли незначительную долю в пуле всех gB-cпcцифичecкиx антител в сыворотках иммунных животных. Денатурация gB'T приводила к резкому снижению его реактивности с этими сыворотками (на 75-80%). Остаточная реактивность денатурированного gB'T с сыворотками свидетельствовала о том, что линейные эпи-топы присутствуют не только в М-концевой области gB.

У сывороток от многократно иммунизированных животных наблюдалось менее выраженное снижение сигнала при денатурации gB и gE в сравнении с сыворотками от однократно иммунизированных или инфицированных животных (Табл. 1 и 2). Очевидно, что при многократной иммунизации наблюдался более сильный гуморальный иммунный ответ на линейные эпитопы gB и gE. Для таких сывороток было характерно более выраженное снижение реактивности при удалении трипсином Ы-концевой области gB (на 30-40%), а также очень значительное уменьшение реактивности (на 90-95%) при денатурации gBT. Эти результаты свидетельствовали, что при многократной иммунизации в индукции 1у-морального иммунитета возрастала роль И-концевой антигенной области gBb субъединицы гликопротеина gB.

Исследование аморального иммунного ответа на отдельные области гликопротеинов gB и с помощью рекомбинантных фрагментов

Все рекомбинантные фрагменты gB реагировали в методе иммуноб-лотгинга и непрямого ИФА с сыворотками от инфицированных животных; среди них белки СБТ-59-125 и СБТ-86-115 давали наиболее интенсивную реакцию (данные не приведены). Эти сыворотки также реагировали с рекомбинантным фрагментом gE, экспрессированным в Е.соИ (Рис. 4). Полученные данные подтвердили наши выводы о высокой анти-генности N-концевых областей §В и gE и о важной роли линейных эпитопов из этих областей гликопротеинов в индукции гуморального иммунитета при инфицировании и иммунизации животных.

Сыворотки от неинфицированных свиней, вакцинированных gE-негативной вакциной, не реагировали с рекомбинантным фрагментом gE (Рис. 4), т.е. полученный нами М-концевой рекомбинантный фрагмент gE позволял дифференцировать инфицированных и вакцинированных жи-

g-40 «g 30 r 20 s 10 0

ausoianinvooN^vt-см eo со о

Рис. 11. Репрезеитатишплй профиль эпитоп-спепифического гуморального иммунного ответа на гли-копротеины ¿Е (А) и {>В (Б) при инфицировании свиней ВБА. Представлено ингибирование связывания gE- и gB-CIIeцифичecкиx мкЛТ с антигеном сыворотками от инфицированных свиней в непрямом блокирующем ИФА. Титр эпитоп-специ-фических антител прямо пропорционален величине ингибирования связывания мкАТ с антигеном.

^ Cgoï

т- nrtlûrt Nlûr-

вотных и обладал потенциалом для использования в качестве антигена при разработке дискриминирующего gE-теста (см. ниже).

Эпитоп-специфический гхморальный иммунный ответ на gE и gB

Эпитоп-специфический гуморальный иммунный ответ на гликопротеины gE и gB ВБА изучали с помощью непрямого блокирующего ИФА с использованием мкАТ. Эпитоп-специфический гуморальный иммунный ответ на gE и gB варьировал в сыворотках от отдельных животных. Несмотря на это, большинство сывороток имели качественно сходные профили эпитоп-специфических антител (Рис. 11). Основываясь на полученных данных, на обоих гликопротеинах мы выделили 3 группы эпитопов в зависимости от их способности индуцировать образование антител. К иммунодоминантным эпитопам gE. индуцирующим при инфицировании животных образование антител в высоких титрах, относились эпитопы мкАТ 61/7, 83/25, 45/6, 101/9, 7/10 и 1/14. Среди остальных эпитопов gE следует выделить эпитопы мкАТ 80/10, 106/26, 3/6 и 4/4, индуцирующие антитела в особенно низких титрах при инфицировании свиней. У gB иммунодоминантными оказались эпитопы мкАТ 1, 2, 6, 7, 11, 3/36, 26/33, 34/2, 46/7 и 60/2. Наиболее низкие титры антител индуцировали эпитопы gB, соответствующие мкАТ 89/11, 1/7, 28/7, 13, 79/9, 86/15 и 11/6. Можно видеть, что в случае обоих гликопротеинов группа имунодоминантных эпитопов состояла исключительно из конформационных эпитопов; линейные эпитопы в большинстве случаев индуцировали антитела в более низких титрах в сравнении с конформационными эпитопами.

При исследовании профилей эпитоп-специфических антител к |>Е и в сыворотках свиней, иммунизированных инактивированным вирусом (данные не представлены), оказалось, что при многократных иммуниза-циях эпигопы, которые не относятся к иммунодоминантным (в первую очередь линейные эпитопы), стимулируют более сильный гуморальный иммунный ответ, чем при инфицировании животных, что согласуется с нашими данными, представленными выше.

2.2.4. Индукция защитного иммунитета гликопротеином gBBБA

Вирус-пейтрализующая активность еВ-специфическихмкАТ

При стандартном варианте постановки теста вирус-нейтрализации (ВН-1), у антисывороток против нативного наблюдали выраженную ВН-активность как в присутствии, так и в отсутствие комплемента (Табл. 3). Ни одно из §В-специфических мкАТ не обладало ВН-активностью без комплемента. Все мкАТ, за исключением мкАТ 11/5, нейтрализовали вирус в присутствии комплемента; титр инфекционное™ вируса снижался в 80-800 раз.

В другом методе оценки ВН-активности антител (ВН-2), после инкубации с препаратами антител в отсутствие комплемента вирус контактировал с клетками в течение короткого времени (1ч при 37°С), после чего адсорбированный вирус, который не успел проникнуть внутрь клеток, инакгавировали. Через 24 ч клетки фиксировали и выявляли вирусные бляшки методом иммунопероксидазного окрашивания клеток. В данном варианте анализа, антисыворотки против нативного и рекомбинант-ных фрагментов £В С8Т-59-126 и С5Т-86-115, а также большинство

-специфических мкАТ, замедляли проникновение вируса в клетки (Табл. 3). Среди мкАТ и анги-фрагментных сывороток максимальный ингибирующий эффект достигался в присутствии антител, направленных против эпитопов Ы-концсвой области gB (мкАТ 79/9 и 86/15, антисыворотки против СБТ-59-126 и С5Т-86-115), и в присутствии мкАТ 60/2, направленного против конформационного эпитопа ¿Вс. В целом, полученные результаты свидетельствовали, что способен индуцировать комплемент-зависимые и комплемент-независимые ВН-антитела. Эпигопы антител, нейтрализующих вирус в присутствии комплемента и замедляющих проникновение вируса в клетки, локализовались как в Ы-концевой области gBb, так и в выявленной антигенной области

Влияние цВ-специфических мкА Т на проникновение вируса в клетки

Замедление проникновения вируса в клетки может быть связано с ин-гибированием адсорбции вируса и/или ингибированием собственно проникновения вируса внутрь клеток. Для исследования этого вопроса, адсорбцию вируса на клетки, промывку клеточного монослоя и последующую инкубацию с антителами проводили при 4°С. В этих условиях вирус не способен проникать внутрь клеток. После этого, клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С, позволяя вирусу проникать внутрь клеток, и затем инактивировали непроникший внутрь клеток вирус. Через 24 ч клетки

фиксировали, выявляли вирусные бляшки с помощью иммуноперокси-дазного окрашивания инфицированных клеток. При данной постановке анализа антитела проявляли свое действие на вирус после его адсорбции на клетки, т.е. на этапе проникновения вируса.

Таблица 3. Влияние gB-спсцифических антител и антисывороток на развитие вирусной инфекции in vitro н in vivo.

к л я н d В < г а с е s @ S Нейтрализующая активность к S 1-1 о S |з =а it в 3 á a а

Н ВН-Г* ВН-2"*» "К с а я | = 1 1 § к я я i « К Я ta в) а ^ = св 5 С а

г: я о л я О о - Комн-лемент + Комплемент - Комплемент S «3

и/6 79/9 86/15 21/2 1/7 3/36 11/5 24/11 26/33 34/2 46/7 60/2 89/11 р L М N Е С А Н I G F В D gBt(59-126) gBt(59-126) gBb(59-126) gBb(214-279) gBc(540-734) gBc(540-734) gBc(540-734) gBc(540-646) gBc(540-646) gBc(540-734) gBc(540-734) gBc(540-734) gBc(540-734) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 н.о. н.о. 580 н.о. 80 80 1 90 393 726 637 127 824 37 93 97 38 20 22 42 4 24 46 9 89 39 Н.О. 3,7 33,3 Н.О. + + + + + + + + н.о. 40 80 20 40 40 20 50 70 20 30 0 60

a-gB gBb и gBt >100 >1000 98 1:1024 н.о.

В-32 1 1 0 - - 0

a-GST GST-59-126 GST-86-115 GST-86-480 GST-428-503 GST-540-733 gBb(59-126) g&(86-115) gBb(86-480) gBb(428-503) ^Bc(540-733) и.о. и.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. и.о. н.о. н.о. и.о. н.о. 0 98 98 32 23 1 1:128-1:512 1:256-1:512 и.о. н.о. и.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

™ мкАТ использовали в концентрации 1 мг/мл, антисыворотки - в разведении 1:20; * Представлено отношение исходного титра ннфекционности вируса к титру инфекциоиности вируса после нейтрализации в отсутствие и в присутствии комплемента; кроме приведенных мкАТ, все остальные gB-cпeцифичecкиe мкАТ пашей панели также не обладали ВН-активностью в отсутствие комплемента и ингибировали инфекциопность вируса в 100-1000 раз в присутствии комплемента; ** Приведены средние значения процента ннгибирования образования вирусных бляшек; отклонение от среднего значения не превышало 15-20%; М Указаны концентрации мкАТ (мкг/мл) или разведения антисывороток, при которых достигалось 50%-ное уменьшение количества бляшек; считали, что антитела не ингибировали проникновение вируса (-) если уменьшение количества бляшек не превышало 20% при максимальной концентрации мкАТ (100 мкг/мл) или наименьшем разведении антисыворотки (1:20); ## Антитела не влияют на размер бляшек (-), уменьшение размера бляшек не более 50% (+), уменьшение размера бляшек более 80% (+++); *** Представлен процент выживших животных (п=10); а^В - сыворотка мышей, многократно иммунизированных gB-aнтигeнoм; тс а^В сыворотка использовалась в разведении 1:500; н о. - не определяли.

Проникновение вируса внутрь клеток ингибировали поликлональная ^-специфическая сыворотка, мкАТ 79/9 и 86/15, а также антисывортки против С8Т-59-126 и С8Т-86-115 (Табл. 3). Блокирующий эффект остальных мкАТ и антисывороток против рекомбинантных белков не превышал 10-20%. Таким образом, этап проникновения вируса внутрь клеток подавляли §В-специфические мкАТ и антисыворотки, направленные

к эпигопам N-концевой области gB. Возможно, что указанный регион gB прямо или косвенно вовлечён в процесс проникновения вируса в клетку.

Влияние sB-специфических мкАТ на распространение ВБА от клетки к клетке

Гликопротеин gB ВБА необходим для распространения инфекции от клетки к клетке in vitro (Peeters et al., 1992). Поликлональная сыворотка против аффинно-очищенного gB уменьшала размер вирусных бляшек на 80-90% даже при разведсшш 1:500 (Табл. 3). Большинство gB-специфических мкАТ нашей панели также влияли на распространение вируса от клетки к клетке, уменьшая размер бляшек на 30^10%. Эпнтопы этих мкАТ находятся в составе обоих субъединиц gB, что указывает на участие в распространении вируса от клетки к клетке по крайней мере двух топологически различных областей gB.

Пассивная иммунизация мышей яВ-специфическими антителами

В экспериментах по пассивной иммунизации, большинство исследованных gB-специфических антител обладало защитным потенциалом (выживаемость мышей 20- 80%) (Табл. 3). Процент выживших после инфицирования животных был самым высоким в группах, пассивно иммунизированных мкАТ 86/15 и 26/33 (80% и 70%, соответственно). Эпи-топы защитных антител находились в составе gBb и gBc субъединиц, что указывает на важность обоих выявленных нами антигенных областей gB для формирования защитного гуморального иммунитета.

Защитная активная иммунизация мышей рекомбинантными фрагментами gB

В экспериментах по активной иммунизации, мышей имму низировали очищенными рекомбинантными фрагментами gB (GST-59-126, GST-86-480, GST-86-115, GST-428-502 и GST-540-734), очищенным гликопро-теином gB и инактивированным антигеном ВБА. Все рекомбинантные фрагменты индуцировали гуморальный иммунный gB-специфический иммунный ответ; при этом, наиболее высокие титры антител наблюдались в сыворотках мышей, иммунизированных фрагментами, соответствующими N-концевой области gBb (GST-59-126 и GST-86-115) (Табл. 4). Гуморальный ответ на очищенный gB превосходил ответ на рекомбинантные фрагменты.

Иммунизация рекомбинантными фрагментами gB GST-59-126 и GST-86-115 приводила к частичной защите животных от инфекции -80% животных выживало после контрольного инфицирования ВБА (Табл. 4). Иммунизация рекомбинантными белками GST-86-480, GST-428-502 и GST-540-734 не защищала мышей от летального исхода после инфицирования, несмотря на то, что индуцировала образование gB-специфических антител в титрах от 1:1000 до 1:5000. Все животные, иммунизированные очищенным gB и ВБА-антигеном, выжили.

Иммуноген Титр gB-специфических антител* Процент выживших животных (п=10)

GST - 0

GST-59-126 1:500-1:20000 80

GST-86-115 1:1000-1:20000 80

GST-86-480 1:200 - 1:5000 0

GST-^28-503 1:200- 1:2000 0

GST-540-733 1:100-1:4000 0

Нативный gB-антиген 1:4000- 1:80000 100

Антиген ВБА н.о. 100

* Титры антител определяли в непрямом ИФА на денатурированном gB-антигене; н о. -не определяли.

Таким образом, гликопротеии gB индуцировал защитный иммунитет при активной иммунизации мышей, что согласуется с данными других авторов (Marchioli et al., 1988; Matsuda et al., 1991). Последовательности из N-концевой области gBb субъсдиницы способны индуцировать защитный иммунитет при активной иммунизации мышей; среди рекомбинант-ных фрагментов gB эти белки также вызывали наиболее сильный гуморальный иммунный ответ.

2.2.5. Разработка средств серологической диагностики болезни Ауески

Разработка и оптимизация gE- и яВ-тестов

Исследования, проведенные на первом этапе работы, позволили нам установить принципиально важную роль конформационных эпитопов gE и gB ВБА в индукции гуморального иммунного ответа, а также выявить иммунологически важные области и эпитопы гликопротеинов, индуцирующие образование антител в высоких титрах при инфицировании животных. Тем самым были определены фундаментальные основы для целенаправленной разработки эффективных серологических диагностических тестов, способных выявлять животных, инфицированных ВБА. Исходя из полученных данных был сделан вывод, что для серологической диагностики БА наиболее перспективными являются тесты, выявляющие в сыворотках антитела против консервативных конформационных имму-нодоминантных эпитопов гликопротеинов. Этот вывод и определил стратегию разработки gE- и gB-специфических ИФА. В работе разрабатывались два принципиально разных типа gE- и gB-ИФА- блокирующие ИФА, основанные на gE- и gB-специфических мкАТ [блокирующие прямые ИФА (ön-gE-ИФА и ön-gB-ИФА), блокирующие непрямые ИФА (öh-gE-ИФА и öh-gB-ИФА) и блокирующие "сендвич" ИФА (oc-gE-ИФА и öc-gB-ИФА)], а также непрямые ИФА на основе аффинно-очищенных гликопротеинов gE и gB (аффи^Е-ИФА и аффи^-ИФА) и на основе N-концевого рекомбинантного фрагмента gE, экспрессированного в E.coli (pcK-gE-ИФА).

В основе блокирующих ИФА лежит принцип конкуренции антител сыворотки и мкАТ за связывание с антигеном. Для блокирующих и §В-ИФА наибольший потенциал имели мкАТ, направленные против им-мунодоминантных эгаггопов гликопротеинов. Полученные нами данные, касающиеся иммунодоминантности отдельных эшггопов gE и §В, позволили определить круг мкАТ, наиболее перспективных с точки зрения диагностики. Среди них, в серии экспериментов были отобраны мкАТ, конъюгаты мкАТ и пары [захватывающее мкАТ/конъюгат мкАТ], обеспечивающие максимальное ингибирование положительными сыворотками и минимальное неспсцифическое блокирование отрицательньши сыворотками в разных вариантах блокирующих gE- и gB-ИФA (данные не приведены). При исследовании большого количества сывороток от инфицированных животных из хозяйствах России, Украины, Польши и Венгрии было показано, что в подавляющем большинстве сывороток выявлялись антитела против эпигопов мкАТ, использованных в блокирующих ИФА.

Непрямые ИФА основывались на использовании в качестве антигенов аффинно-очищенных gE и gB и Ы-концевого рекомбинангного фрагмента gE, экспрессированного в Е.соИ, в котором, как мы показали, локализован кластер линейных эпитопов (см. выше). При разработке диагностических тестов были оптимизированы условия очистки gE и gB ВБА с помощью аффинной хроматографии, а также рекомбинангного фрагмента gE (данные не приведены). С помощью панели мкАТ к конформационным эпитопам gE и gB было показано, что аффинно-очищенные гликопротси-ны полностью сохраняли нативную антигенную структуру, то есть в аф-фи-gE-ИФA и aффи-gB-ИФA будет выявляться весь спектр сывороточных антител против gE и gB, включая антитела против иммунодоминант-ных конформационных эпитопов.

Для всех вариантов разрабатываемых тестов оптимизировали условия постановки реакций: время и температура инкубаций, разведения имму-нореагентов, состав буферов для разведения сывороток и др. С точки зрения чувствительности и специфичности, оптимальные результаты получали при исследовании сывороток в разведении 1:1-1:2 и 1:30, соответственно, в блокирующих и непрямых ИФА.

Сыворотки от различных групп животных, не содержащие ВБА-специфических антител, не проявляли блокирующего эффекта во всех блокирующих §Е- и £В-ИФА и не давали неспецифичсских реакций в непрямых gE- и gB-ИФA (Рис. 12). Инфицированные животные и животные, иммунизированные §Е-положительным ВБА-антигеном, были серо-положительными в gE-ИФA и gB-ИФA. Сыворотки от неинфицирован-ных свиней, вакцинированных gE-нeгaтивнoй вакциной, давали отрицательные результаты в gE-тecтax, но были положительны в gB-тecтax. Эти результаты свидетельствовали о специфичности выявления антител, направленных против gE и gB, во всех разработанных вариантах gE- и gB-ИФА. Все §Е-ИФА позволяли дискриминировать инфицированных и вакцинированных животных. В этих экспериментах были определены по-

100 -| — 90 Цво

| 70 5 60-§ 501-40 ЗзоЧ |аЧ

бн-дЕ-ИФА бп-дЕ-ИФА бс-дЕ-ИФА бн-дВ-ИФА бп-дВ-ИФА бс-дВ-ИФА

_г£3

9 8 7 6

О 4 3 -2 1 0

123456789 123456789 123456789 123456789 123456789 121456789

аффи-дВ-ИФА

аффи-дЕ-ИФА

рек-дЕ-ИФА

вир-ИФА

123567 123567 123567 123567

Рис. 12. Специфичность выявления антител против гликопротеинов и в различных £р.-ИФД и йВ-ИФА. Представлены значешм ингибирования реакции (для блокирующих ИФА) и значения С/Ф (для непрямых ИФА) для сывороток от: (1) неинфицированных невакцшшрованных свиней; (2) неинфицированных свиней, вакщшировашшх против классической чумы, парвовирусной болезни, энзоотического энцефаломиелита, (3) неинфицировашплх свиней, вакцинированных £Е-негатшшой вакцшгой; (4) неинфицировашплх неимиунизировашплх лабораторных животных (мьпни, кролики); (5) инфицированных невающ-шфованных свиней; (6) инфицированных свиней, вакцинированных 2Н-негативной пакциной; (7) свилей, вакцинированных £Е-положительной вакциной; (8) лабораторных животных, иммунизированных £П-положител1.ным штаммом ВБА (штамм К); (9) лабораторных животных, иммунизированных §Е-отрицательным штаммом ВБА (штамм ВагШа К61). Горизонтальными линиями представлены пороговые значешм ингибиронания для блокирующих ИФА и С/Ф для непрямых ИФА. Каждое значаше представляет среднее арифметическое значений, полученных с 10-30 сыворотками. вир-ИФА -непрямой ИФА на основе очищенного ВБА.

роговые значения ингибирования сигнала для блокирующих ИФА и пороговые значения С/Ф (отношение сигнала ИФА с исследуемыми сыворотками к фоновому сигналу со стандартными негативными сыворотками) для непрямых ИФА, дискриминирующие положительные и отрицательные сыворотки.

Сравнительная оценка яЕ-ИФА и яВ-ИФА

В таблице 5 представлены результаты сравнительной оценки разработанных и gB-тecтoв при исследовании сывороток от различных групп свиней. Среди дискриминирующих gE-тecтoв, все блокирующие £Е-ИФА

Таблица 5. Сравнительная оцецка различных вариантов разработанных дискриминирующих йЕ-ИФЛ и скршшиговых gB-ИФA.

Сыворотки от различных групп свиней (положительные результаты/отрицательные результаты)

Неинф., невакц. Неинф., вакд. против вирусных заболеваний свиней* Неинф., вакц. gE-негативной вакциной Вакц. "немаркированной" вакциной БАК Инф., невакц. Инф., вакц. gE-негативной вакциной Чувствительность Специфичность (%)#

К м бп^Е-ИФА 0/107 0/37 0/581 5/499 177/0 188/0 44/0 134/2 100 98 100 99

2 £ бн-вЕ-ИФА 0/107 0/37 0/581 174/3 188/0 42/2 97 100

бс-дЕ-ИФА 0/107 0/37 0/581 177/0 188/0 44/0 100 100

О 2 аффи-кЕ-ИФА 4/103 2/35 30/474 но. н.о. 132/4 97 94

peк-gE-ИФA 9/98 4/33 53/451 н.о. н.о. 123/13 80 90

2< бн-йВ-ИФА 0/111 0/19 154/1 н.о. 114/2 68/1 98 100

бп-дВ-ИФА 0/111 0/19 155/0 12/0 116/0 69/0 100 100

бс-йВ-ИФА 0/111 0/19 155/0 н.о. 116/0 69/0 100 100

9-2 аффи-дВ-ИФА 0/111 0/19 155/0 н.о. 116/0 69/0 100 100

о а вир-ИФА 8/103 2/17 145/10 н.о. 107/9 60/9 93 92

* Сыворотки от свиней, вакцинированных против классической чумы свиней, парвово-русной болезни, энзоотического энцефаломиелита; * Специфичность и чувствительность gE-тестов определяли исходя из результатов, полученных на панелях сывороток от неинфициро-ванных и инфицированных свиней, вакцинированных gE-нeraтивнoй вакциной. Для бп-&Е-ИФА чувствительность и специфичность определяли на двух панелях положительных и отрицательных сывороток. Специфичность и чувствительность йВ-тсстов и вир-ИФА определяли исходя из результатов, полученных на панелях сывороток от инфицированных и неинфи-цированных невакцинированных свиней; н.о. - не определяли.

показали одинаково высокую специфичность (99-100%); специфичность аффи^Е-ИФА составляла 94%, рек^Е-ИФА- 90%. Наиболее высокую чувствительность среди §Е-тестов продемонстрировали бп^Е-ИФА и бс-gE-ИФA (98-100%); чувствительность аффи^-ИФА, бн-gE-ИФA и рек-gE-ИФA составляла, соответственно 97%, 97% и 80%. Для всех блокирующих §В-ИФА и аффи^В-ИФА специфичность составляла 100%. Чувствительность бн^В-ИФА бьша 98%; бп^-ИФА, бc-gB-ИФA и аффи-§В-ИФА - 100%. Чувствительность и специфичность непрямого ИФА на основе очищенного ВБА (вир-ИФА, стандартный ИФА для выявления ВБА-специфических антител) была существенно ниже и составляла, соответственно, 93% и 92% (Табл. 5). Данные по чувствительности gE- и gB-тестов были подтверждены в экспериментах по титрованию сывороток от инфицированных свиней (Рис. 13 (А, Б)). Очевидно, что наиболее чувствительными и специфичными среди дискриминирующих gE-тecтoв были бп^Е-ИФА, бс-§Е-ИФА и аффи^Е-ИФА; среди скрининговых gB-ИФА - бп^-ИФА, бc-gB-ИФA и аффи^-ИФА. В бп^Е-ИФА и бп^-ИФА постановка реакции значительно проще в сравнении с бс^Е-ИФА и бc-gB-ИФA (отсутствует стадия предварительной инкубации иммунореа-гентов с сыворотками в отдельном, несенсибилизированном планшете) и

—бп-дВ-ИФА -О- бс-дВ-ИФА —■— бн-дВ-ИФА —Д— аффи-дВ-ИФА —А— вир-ИФА

Г 5 4

h § о

г5 4

Ь §

2 1

-1-1-1-1-1-1-1-г~

01234567 Количество шагов титрования

Рис. 13. Титроваше смеси сывороток от инфицированных свиней в различных {>Е-ИФА (А), §В-ИФА (Б) и в бп-^-ИФА, бп-оВ-ИФА и вирус-нейтрализации (В). Каждая точка представляет среднее арифметическое значение (3-5 определений) ингиби-роваши сигнала в блокирующих ИФА (А, Б, В), ингибирования образования вирусных бляшек в вирус-нейтрализации (В) и отношения С/Ф в непрямых ИФА (А, Б). Горизонтальной сплошной линией обозначено пороговое значите ингибирования (50%) для блокирующих ИФА и ВН. Горизонтальной пунктирной линией обозначено пороговое значение С/Ф для непрямых ИФА (3,0). Средняя квадратичная ошибка определений не превышала 15%.

в сравнении с аффи^Е-ИФА и аффи^В-ИФА (нет этапа предварительного разведения сывороток). Учитывая это, прямые блокирующие gE-ИФА и gB-ИФА были выбраны для дальнейшей оптимизации с целью разработки диагностических тест-систем, ориентированных на практическое использование. Тем не менее, в спорных случаях aффи-gE-ИФA и аффи^В-ИФА, основанные на другом принципе выявления антител, могут быть использованы в качестве дополнительных тестов для подгвер-ждсния результатов исследования сывороток в прямых блокирующих gE-и gB-ИФА.

Для выявления инфицированных животных среди невакцинированно-го поголовья могут применяться как бп^В-ИФА, так и en-gE-ИФА. Мы сравнили специфичность и чувствительность этих тестов в выявлении ВБА-специфических антител на одной панели сывороток от неинфициро-ванных (116 сывороток) и инфицированных (111 сывороток) невакцини-

100 -I

60 -I

ш ои" ?

ш 40 -| ш

а 20-] а

о ш

о -

т 20

100

Блокирование в бп-дВ-ИФА (%)

Рис. 14. Корреляция результатов тестирования сывороток от неинфицирован-ных и инфицированных евшей в бп-§Е-ИФА и бп-§В-ИФА. Пунктирными линиями обозначены пороговые значения ингибирования (40%).

рованных свиней. Наблюдалась хорошая корреляция между результатами, полученными в двух тестах (Рис. 14). Тем не менее, в бп^В-ИФА отличия между средними значениями ингибирования у положительных и отрицательных сывороток были более выражены, что позволяло бп-gB-ИФА более надежно дискриминировать инфицированных и нсинфициро-ванных свиней в сравнении с бп^Е-ИФА (Рис. 15). На данной панели сывороток, чувствительность и специфичность тестов в выявлении ВБА-специфических антител составляла 97% и 100%, соответственно, для бп-gE-ИФA, и 100% и 100%, соответственно для бп-gB-ИФA. Более высокая чувствительность gB-тecтa была подтверждена в экспериментах по титрованию смеси сывороток от инфицированных свиней (Рис. 13 (В)); титр gB-cпeцифичecкиx антител в 2-4 раз превосходил титр gE-cпcцифичecкиx антител. Титры антител, получаемые в бп^Е-ИФА и бп^В-ИФА, превосходили титры вирус-нейтрализующих антител в 4-8 раз, что свидетельствовало о более высокой чувствительности разработанных gE- и gB-тестов по сравнению с методом вирус-нейтрализации. Эти результаты были подтверждены при титровании сывороток от отдельных инфицированных животных. В совокупности, результаты свидетельствовали, что разработанный бп^В-ИФА являлся наиболее чувствительным и специфичным скрининговым тестом для выявления инфицированных свиней среди невакцинированного поголовья.

о 35 о

5-зо

о ш

л о

о ш ь

о 0) т

25 20 -15 -10 -5 -

бп-дВ-ИФА I

бп-дЕ-ИФА

О 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Ингибирование (%)

Рис. 15. Распределение сывороток от инфицированннах и неинфицированных невакцинироваиных свилей но уровню значений ингибирования сигнала в бп-§В-ИФА и бп-(>Е-ИФА. Пунктирными линиями указаны пороговые значения ингибирования.

Таким образом, в результате проведенных исследований, для выявления инфицированных свиней среди невакцинированного поголовья и поголовья, вакцинированного ^-негативной "маркированной" вакциной, были разработаны, соответственно, высокочувствительные и специфичные скрининговый прямой блокирующий §В-ИФА и дискриминирующий прямой блокирующий ^-ИФА.

2.2.6. Разработка технологии изготовления gE- и %В-тест-систем

Создание соответствующих диагностических §Е- и gB-тccт-cиcтeм, ориентированных на широкое практическое применение, предполагало выполнение комплекса работ по разработке технологии их изготовления, оптимизации тест-систем и определения их диагностической ценности.

Разработка технологии изготовления тест-систем, их оптимизация и стандартизация

Разработка технологии изготовления и §В-тест-систем включала в себя: выбор производственного вирусного штамма и системы его культивирования; отработку очистки антигенов и сравнительную оценку различных антигенов для сорбции; оптимизацию сенсибилизации полистироловых планшет антигенами; выбор пероксидазного хромогена; отработка условий изготовления §Е- и gB-cпeцифичecкиx пероксидазных конъюгатов, положительных и отрицательных контрольных сывороток, всех необходимых для анализа буферных растворов.

Первый этап этой работы был посвящен выбору штамма ВБА, дающего высокое накопление вирусного антигена в культуре клеток, и системы

его культивирования. Данная задача была особенно актуальной при изготовлении gE-тест-системы, так как gE является минорным компонентом вирусной оболочки. Сравнительная оценка пяти gE-положительных вирусных штаммов - К, Ка, BUK 628, Арский и ВГНКИ, показала, что относительное содержание gB было примерно одинаковым у всех вирусных штаммов. Содержание gE у различных вирусных штаммов варьировало и составляло 5-15% от содержания gB. Наиболее высокое содержание gE наблюдали в ВСЖ штаммов К и ВГНКИ. Штамм К показал более высокое накопление вирусного антигена и был выбран в качестве производственного штамма. В качестве системы культивирования вируса были выбраны клетки ВНК-21/13 и оптимизированы условия наработки и хранения вирусного материала (данные не приведены).

На следующем этапе оптимизировали очистку антигенов (ВБА-антигена и гликопротеинов gE и gB) для сенсибилизации планшетов. При очистке ВБА-антигена с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы потери составляли не менее 75-80%. По данным электрофореза, ВБА-антиген содержал множество примесных белков, качество препаратов очищенного ВБА-антигена значительно варьировало от партии к партии. Использование более сложных способов очистки вируса приводило к значительным потерям вирусного материала и было признано нетехнологичным. Гликопротеины gE и gB очищали с помощью аффинной хроматографии с использованием аффинных сорбентов, приготовленных на основе gE-специфического мкАТ 75/7 или gB-специфического мкАТ 34/2. Все этапы хроматографической очистки гликопротеинов были оптимизированы. В целом, при очистке gE и gB потери составляли 20-30%, что значительно меньше потерь вирусного материала при очистке вирионов. Препараты очищенных гликопротеинов практически не содержали примесных белков (электрофоретическая чистота 97-99%); качество препаратов от партии к партии варьировало незначительно. Очищенные гликопротеины хорошо сохраняли нативную антигенную структуру (оценивали по реактивности с мкАТ против конформационнах эпитопов гликопротеинов) и не обладали инфекционностью.

Для сенсибилизации были выбраны планшеты фирмы "Nunc", которые показали наиболее стабильные результаты в сорбции антигенов при их сравнении с планшетами производства других зарубежных и российских фирм-производителей. Оптимизированы условия сенсибилизации планшетов антигенами.

В таблице 6 представлены результаты сравнительной оценки планшетов, сенсибилизированных очищенным ВБА-антигеном и гликопротеина-ми gE и gB. Замена ВБА-антигена на очищенный gE в ön-gE-ИФА приводила к существенному повышению чувствительности и специфичности метода, а также предела выявления специфических антител. Высокая специфичность gE-теста при использовании очищенного gE, позволила тестировать сыворотки без разведения, при этом чувствительность метода возрастала при сохранении строгой специфичности. В gB-тесте, при применении очищенного gB и антигена ВБА получали примерно одинаковые

результаты с точки зрения чувствительности и специфичности. Преимущество использования очищенных |»Е и ¿В заключалось также в количестве получаемых антигенов и их стандартности. Так, из 1 л ВСЖ с тигром инфекционности 3-6х 108 ТЦД50/МЛ выход гликопротеинов был достаточным для сенсибилизации 40-60 или 200-300 96-луночных планшет, соответственно, для и gB-тccт-cиcтeм, что существенно превышало показатели для ВБА-антигена. Учитывая полученные результаты, очищенные gE и gB были выбраны в качестве антигенов для сенсибилизации планшетов в и §В-тест-системах.

Таблица б. Сравнительная оценка использования различных антигенов д ля сенсибилизации планшет в «Е- н йВ^тесгах.

Разведение Сыворотки

сывороток 1:1 без разведения Титр специ-

Сорбирова нный Чувстви- Специ- Чувстви- Специ- фических ан-

антиген тельность фичность тельность фичность тител*

(%)# (%)# (%)# (%)#

ВБА-антиген 95 97 98 92 1:64

бп-^Е-ИФА Гликопротеин гЕ 98 100 100 100 1:128

ВБА-антиген 99 100 100 99 1:512

бп-еВ-ИФА Гликопротеин кВ 99 100 100 100 1:512

И Специфичность и чувствительность ¡>Е- и еВ-тестов определяли на панелях сывороток, указанных в таблице 5; * Титры антител оценивали используя смесь 10 сывороток от инфицированных свиней.

Таблица 7. Влнгаше хромогена и соотношения [количество сорбированного антигеиа/концентрация конъюгата] на пороговую чувствительность выявления специфических антител в еЕ-тест-системе.

Разведение gE- Разведение gE- Оптическая Титр специфических

антигена для сен- коньюгата Хромоген# плотность* аптител **

сибилизации

1 200 1 4000 ТМБ 2,07 и.о.

1 200 1 4000 ОФД 1,27 но.

1 200 1 4000 АБТС 0,90 н.о.

I 200 1 4000 ТМБ 1,89 1:300

1 200 1 2000 ОФД 2,09 1:200

1 200 1 2000 АБТС 1,73 1:200

1 100 1 8000 ТМБ 2,05 1:400

1 200 1 4000 ТМБ 2,17 1:300

1 400 1 2000 ТМБ 1,89 1:200

1 800 1 1000 ТМБ 1,71 1:150

# - ТМБ - 3,3\5,5'-тетраметилбензидтг, ОФД - орто-фенилендиамнн; АВТС - 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота); * Приведена оптическая плотность в отсутствие сыворотки; ** - Титры антител оценивали используя смесь 10 сывороток от инфицированных свиней.

В таблице 7 приведены результаты оценки эффективности выявления специфических антител в §Е-тест-системе в зависимости от используемого хромогена и от соотношения - количество сорбированного антигена/концентрация конъюгата. Для §В-тест-системы получали сходные результаты. Среди испытанных хромогенов (ТМБ, ОФД и АБТС), ТМБ оказался наиболее чувствительным индикатором пероксидазной реакции.

Применение ТМБ позволило уменьшить концентрацию конъюгата, что приводило к повьппению пороговой чувствительности. ТМБ был отобран для комплектации тест-систем. Было показано, что с увеличением количества сорбированного антигена и соответственного уменьшения концентрации конъюгата также повышался предел выявления специфических антител (Табл. 7). Для производства тест-систем, количества сорбируемых и |рЗ-антигенов и концентрации конъюгатов были оптимизированы и стандартизированы.

При отработке технологии изготовления диагностических тест-систем были оптимизированы условия изготовления и ^-специфических пе-роксидазных конъюгатов (процедура конъюгирования мкАТ 26/33 и 101/9 с пероксидазой, лиофилизация конъюгатов, приготовление концентрированных растворов конъюгатов), положительных и отрицательных контрольных сывороток, всех необходимых для анализа буферных растворов (данные не приведены).

Важным этапом явилось определение диагностических пороговых значений ингибирования, дискриминирующих положительные и отрицательные сыворотки в и §В-тест-системах (Табл. 8). Пороговые значения определяли с использованием панелей сывороток, отобранных случайным образом от инфицированных и неинфицированных животных. С интервалом 5% все значения ингибирования принимали за пороговые значения и определяли чувствительность и специфичность тест-систем. При значении ингибирования 40% получали оптимальные результаты в обоих тест-системах: чувствительность методов составляла 98% для ИФА и 99% для gB-ИФA при достаточно высокой специфичности (98% для §Е-ИФА и 99% для §В-ИФА). 40% ингибирования было принято в качестве порогового значения ингибирования, дифференцирующего инфицированных и неинфицированных свиней в йЕ- и gB-тeст-cиcтeмax. Кроме этого, была введена зона сомнительных результатов, соответствующая 35-45% ингибирования. Сыворотки, ингибирующие сигнал на 35-45%, трудно отнести с высокой достоверностью к категории отрицательных или положительных из-за невысокой воспроизводимости результатов тестирования сывороток из этой области. Такие сыворотки необходимо исследовать повторно.

Полностью скомплектованные диагностические gE- и gB-тeст-cиcтeмы состоят из 8 компонентов. В тест-системах имеются все компоненты, необходимые для проведения анализа. В обоих тест-системах предусмотрено исследование сывороток в 1 повторе; сыворотки тестируют без разведения. На каждом планшете предусмотрена постановка реакции с положительной и отрицательной контрольными сыворотками (2 и 4 лунки, соответственно) и 90 испытуемыми сыворотками. Постановка анализа занимает 4-4,5 часа. Все иммунологические реакции проводят при 37°С. В тест-системах предусмотрено использование как визуального, так и приборного учета результатов. Визуальный учет результатов является менее надежным, однако в большинстве случаев позволял достоверно выявлять инфицированных животных с помощью и gB-тecт-систем.

Таблица 8. Определение диагностических пороговых значений ннгибироваиия в дискриминирующей gE-тест-снстеме и скринннговой gB-тест-системе.

Пороговое зна- gE-тест-система gB-тест-система

чение ингиби- Чувствитель- Специфич- Чувствитель- Специфич-

рования (%) ность (%)* ность (%)* ность (%)* ность (%)*

0 100 0 100 0

5 100 7 100 5

10 100 12 100 14

15 100 27 100 25

20 100 51 100 48

25 100 75 100 83

30 99 83 99 93

35 : 98 :: . :. 90 ::;■:;■■ 99 96

Ш W »Ж:',.:,98. rS>

45 , . 95 98: ••.... 98 99

50 92 99 97 99

55 87 99 95 100

60 71 99 88 100

65 60 100 80 100

70 51 100 73 100

75 43 100 60 100

80 31 100 51 100

85 22 100 42 100

90 17 100 30 100

95 10 100 14 100

100 0 100 0 100

* Чувствительность и специфичность дискриминирующих gE-тестов определяли на панели сывороток от инфицированных (140 сывороток) и неинфицированных (400 сывороток) свиней, вакцинированных gE-негативной вакциной Bartha К61. Чувствительность и специфичность афининговых gB-тестов определяли на панели сывороток от инфицированных (100 сывороток) и неинфицированных (230 сывороток) невакцинированпых свиней.

Отдельные компоненты gE- и gB-теет-систем, а также укомплектованные тест-системы, хорошо сохраняли свои свойства при хранении при +4-8°С в течение 12 месяцев со дня выпуска (данные не приведены). При этом, в готовых тест-системах интенсивность сигнала, получаемого с отрицательными сыворотками снижалась не более чем на 30-35%; блокирование сигнала положительными контрольными сыворотками снижалось не более чем на 15-20%; специфичность и чувствительность тест-систем не снижалась.

Определение параметров gE- и gB-тест-систем

Разработанные диагностические gE- и gB-тест-системы сравнивали по чувствительности и специфичности с аналогичными тестами от фирм-производителей IDEXX (США), Svanova Biotech (Швеция), Bommeli (Германия) и Rhone Merieux (Франция). Из данных таблицы 9 можно видеть, что по чувствительности и специфичности наши тест-системы не уступали, а в ряде случаев превосходили аналогичные тесты известных зарубежных фирм. Титрование положительных сывороток также показало, что пороговая чувствительность разработанных gE- и gB-тест-систем сопоставима с таковой аналогичных зарубежных тестов (Табл. 9).

Таблица 9. Сравнительная оценка разработанных gE- и gB-тест-систем с аналогичными зарубежными gE-ELISA и gB-ELISA.

Тип теста Наименование теста (фирма производитель) Результаты тестирования сывороток (ноложит./отрицат.) Специфичность (%)'* Чувствительность (%)" Титр специфических антител#

Положительные сыворотки Отрицательные сыворотки

gE-тесты I3S.2 2 98 1:512

Svanova Biotech 135/5 7/392 98 96 1:256

Boramcli 140/0 13/387 97 100 1:512

Rhone Merieux 139/1 12/388 97 99 1:512

IDEXX 140/0 0/400 100 100 1:512

gB-тесты еш^^ФА^ Ш99П :;í U1024

IDEXX 99/1 4/226 98 99 1:1024

Svanova Biotech 100/0 0/230 100 100 1:1024

* ôn-gE-ИФА и ôn-gB-ИФА - разработанные нами gE- и gB-тест-ситемы. ** Чувствительность и специфичность gE- и gB-тестов определяли на панелях сывороток, описанных в подстрочнике к таблице 8. Принимали, что референтные тесты - gE-ELISA IDEXX и gB-ELISA Svanova Biotech, имеют 100%-ную чувствительность и специфичность; # Титры антител оценивали используя смесь 10 сывороток от инфицированных свиней.

Разработанную gE-тест-систему проверяли на пороговую чувствительность с использованием сыворотки, принятой в качестве положительной референтной сыворотки для gE-тестов, применяемых в Европе (предоставлена доктором P. Pourquier, Institut Pourquier, Франция). Согласно требованиям, gE-тесты должны регистрировать антитела в данной сыворотке в титре не менее 1:4. Разработанная нами gE-тест-систсма выявляла gE-специфические антитела в положительной референтной сыворотке при разведении 1:16, также как и аналогичный тест ШЕХХ (Табл. 10). Очевидно, что пороговая чувствительность нашей gE-тсст-системы в 4 раза превышает пороговую чувствительность, установленную для gE-тестов, применяемых в Европе.

Ни одна из сывороток свиней, многократно вакцинированных живыми gE-негативными вакцинами на основе штаммов 778, Bartha К61, Begonia, или инактивированной gE-негативной вакциной, основанной на штамме 77/3, не давала неспецифического блокирующего эффекта в разработанной дискриминирующей gE-тест-системе (Табл. 10), что свидетельствовало о совместимости gE-тест-системы с инактивированной "маркированной" вакциной, а также с gE-негативными живыми вакцинами, наиболее широко используемыми в мире. Следует отметить, что в gE-ELISA IDEXX и Svanova Biotech, сыворотки свиней, многократно вакцинированных различными gE-негативными вакцинами, давали неспецифическое блокирование (15-25%), что является основной причиной ложно-положительных результатов (Van Oirschot J.T., Oei H.L., 1989).

Воспроизводимость результатов тестирований сывороток, составляла 97% для gE-тест-системы и 98% для gB-тест-системы. Воспроизводимость существенно зависела от величины ингибирования сигнала сыворотками; наименьшая воспроизводимость результатов наблюдалась у сы-

вороток с уровнем ннгибнрования 30-50%, т.е. вблизи порогового значения ингибирования. В параллельных экспериментах, gE-ELISA ШЕХХ и gB-ELISA Svanova Biotech показали воспроизводимость 98%, т.е. по воспроизводимости разработанные gE- и gB-тест-системы также не уступали референтным тестам.

Таблица 10. Пороговая чувствительность и совместимость с различными gE-негативиымн вакцинами разработанной gE-TCCTcncTei\n.i.

% ингибирования

Наименова- Разведения референтно? Сыворотки от свиней, многократно вак-

ние gE-теста положительной сыворотки цинированных различными

(фирма-произ- gE-негативными вакцинами^

водитель) б/р 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Bartha Кб 778 Begonia 77/3

óit-gErHOA* Х5: П: ¿.б/::' • 59 47: 33

ЮЕХХ 89 73 65 55 48 36 13 18 20 18

Svanova н.о. но. и.о. и.о. и.о. н.о. 23 17 25 14

Biotech

* 6n-gE-HC>A - разработанная нами gE-тест-система; # Сыворотки от свиней: 3-х кратно иммунизированных 10-кратными дозами живой вакцины на основе штамма Bartha К61; 4-х кратно иммунизированных 5-кратаыми дозами живой вакцины на основе штамма 778; 3-кратно вакцинированных 3-кратной дозой живой вакцины Begonia; 3-кратно вакцинированных концентрированной инактавированной вакциной на основе штамма 77/3.

Разработанные нами gE- и gB-тест-системы успешно прошли комиссионные испытания. Разработана нормативная документация на их изготовление, контроль и применение. Дискриминирующую gE-тест-систему, в комплексе с инактивированнымн gE-негативными вакцинами, использовали при ликвидации "вспышки" БА в крупном свиноводческом хозяйстве (Черниговская обл., Украина, 8279 голов). Поголовная вакцинация свиней "маркированной" вакциной и выявление инфицированных свиней разработанной дискриминирующей gE-тест-системой позволили ликвидировать заболевание и разработать систему мероприятий по оздоровлению хозяйства от БА.

2.2.7. Разработка методов контроля изготовления инактивирован-ных "маркированных" вакцин против БА и диагностических тест-систем

Важным фрагментом нашей работы была разработка методов технологического контроля и стандартизации изготовления gE-негативной "маркированной" инактавированной вакцины, основанной на gE-негативном штамме ВБА, и разработанных gE- и gB-тест-систем. Все методы основывались на полученных нами gE- и gB-специфических мкАТ. Для контроля изготовления вакцины были разработаны методы контроля:

1)"маркированности" производственного gE-негативного штамма ВБА;

2) "маркированности" наработанного вирусного сырья; 3) "маркированности" вакцины; 4) содержания вирусного антигена; 5) антигенно-сти вакцины. Для контроля изготовления диагностических тест-систем были разработаны методы контроля содержания gE- и gB-антигенов.

К "маркированным" вакцинам, наряду с эффективностью и безопасностью, предъявляется специфическое требование - они не должны вызывать образования gE-специфических антител у вакцинированных животных. Индукция gE-специфических антител "маркированной" вакциной может быть связана со случайной контаминацией вирусного сырья ви-рионами gE-положительного штамма ВБА из-за нарушения технологии подготовки и хранения музейного производственного "маркированного" штамма или из-за нарушения технологии наработки вирусного сырья. Кроме этого, отдельные компоненты вирусной вакцины (клеточный детрит, сывороточные белки и т.д.) потенциально могут индуцировать антитела, перекрестно реагирующие с gE. Животные, привитые такими вакцинами, будут выявляться gE-тестами как сероположительные, что может сделать невозможным проведение мероприятий по искоренению заболевания. Учитывая все вышесказанное, мы разработали комплекс методов, позволяющих контролировать "маркированность" вирусного материала на всех этапах изготовления gE-негативной вакцины против БА.

Для контроля "маркированности" производственного вакцинного gE-негативного штамма был разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток, инфицированных вирусом, с помощью gE- и gB-специфических мкАТ. Выявление мкАТ проводили ПАП-методом, основанным на полученных нами мкАТ к пероксидазе хрена. Оптимизированы условия проведения анализа. Клетки, инфицированные производственным штаммом ВБА (gE ) окрашивались gB-специфическими мкАТ, но не реагировали с gE-специфическими мкАТ. gE-положительные вирусы окрашивались gE- и gB-специфическими мкАТ. Экспериментально установлено, что метод позволял выявлять одну (gE4) вирусную частицу среди 104 (gE ) вирусных частиц. Метод использовали для контроля производственного gE-негативного штамма ВБА на "маркированность" при закладке в музей.

Для контроля "маркированности" наработанного вирусного сырья был разработан и оптимизирован метод 2-центрового "сендвич" gE-ИФА на основе gE-специфических мкАТ (захватывающее мкАТ 75/7 и конъюгат мкАТ 101/9), основанный на выявлении gE в растворе. Метод достоверно выявлял контаминацию производственного "маркированного" штамма ВБА при соотношении (gE ) вирусных частиц к (gE+) вирусным частицам 500:1-1000:1, и использовался для контроля каждой партии вирусного сырья при изготовлении вакцины.

Контроль "маркированности" изготовленной gE-негативной вакцины является заключительным контролем аутентичности готового препарата вакцины. Мы разработали метод контроля "маркированности" вакцины, основанный на определении антител против gE с помощью прямого блокирующего ИФА в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных вакциной. Экспериментально установлено, что даже при незначительной контаминациии gE-негатнвного производственного штамма gE-no-ложительным вирусным штаммом (соотношение инфекционных вирусных частиц до инактивации 500:1), 3-х кратной иммунизации концешри-

рованной или неконцентрированной вакциной оказалось достаточно для достоверного выявления ¿^-специфических антител. Даже 4-кратная иммунизация концентрированной инактивированной §Е-негативной вакциной морских свинок не приводила к образованию антител против gE. Это подтверждало, что компоненты инактивированной "маркированной" вакцины не вызывали образования антител, которые перекрестно реагируют с антигеном.

Для контроля содержания вирусного антигена при изготовлении "маркированной" вакцины был разработан 2-центровый "сендвич" ИФА на основе ^-специфических мкАТ (захватывающие мкАТ 11/5 и конъюгаты мкАТ 1/7 или 34/2). Метод основан на определении в вирусном материале содержания гликопротеина ВБА, являющегося основным компонентом вирусной оболочки всех штаммов ВБА, в том числе и "маркированных" штаммов, и адекватно отражающим общее содержание вирусного антигена (Натр1 & а1., 1984; ЬикасБ Й а1., 1985). Мы наблюдали четкую корреляцию между тигром инфекционности вируса и результатами "сендвич" §В-ИФА (данные не представлены). Метод позволял определять содержание яВ после инактивации вирусного препарата формальдегидом или аминоэтилэтиленимином. При оптимизации технологии изготовления "маркированной" вакцины, разработанный 2-центровый "сендвич" §В-ИФА использовали для оценки содержания вирусного антигена: 1) при выборе производственного "маркированного" штамма ВБА и клеточной системы культивирования вируса; 2) при оптимизации процесса наработки вирусного сырья; 3) при оптимизации режима инактивации и концентрирования вирусного антигена. Метод применяли для количественного контроля вирусного антигена при изготовлении вакцины.

В качестве дополнительного метода оценки антигенности "маркированных" вакцин, мы разработали метод, основанный на определении уровня антител к gB ВБА в сыворотках крови иммунизированных морских свшюк с помощью блокирующего прямого яВ-ИФА на основе мкАТ 26/33. Было установлено, что при иммунизации морских свинок инактивированными "маркированными" вакцинами, титры gB-специфических антител, выявляемые в ИФА, хорошо коррелировали с титрами вирус-нейтрализующих антител, а также с защитным эффектом вакцин (Табл. 11). Учитывая это, разработанный метод использовали в качестве одного из методов оценки антигенности "маркированной" вакцины при оптимизации технологии ее изготовления (при выборе производственного "маркированного" штамма ВБА, клеточной системы и условий культивирования вируса, оптимизации условий инактивации и концентрирования инактивированного вируса и т.д.).

Разработанные методы контроля изготовления "маркированных" вакцин были использованы при разработке технологии изготовления дЕ-негативных инактивированных "маркированных" вакцин против БА.

Методы 2-центрового "сендвич" {*Е-ИФА и 2-ценгрового "сендвич" ЯВ-ИФА на основе gE- и gB-cпeцифичecкиx мкАТ (см. выше) были адаптированы для количественной оценки содержания §Е и яВ-антигенов

в препаратах ВСЖ, приготовленных на основе |»Е-положительных штаммов ВБА, а также в очищенных препаратах gE и gB. Разработанные методы использовали для количественного контроля содержания гликопро-теинов {>Е и §В при разработке дискриминирующей ¿Е-тест-системы и скрининговой §В-тест-системы (выбор производственного положительного штамма и системы культивирования, оптимизация условий наработки антигена, оптимизация всех стадий очистки антигена и др.) и контроля их изготовления.

Таблица 11. Оценка иммуногенности экспериментальных образцов концентрированной и неконцентрированной ш [активированной " gE-негативиой вакцины на морских свинках.

Доза вак- Результаты конт-

Тип "маркированной" цины Титры антител рольного заражения

вакцины (мл) <Iog2) (погибло/выжило)

a-gü ВН

0,9 8,7±1,7 5,2±0,9 0/5

Концентрированная 0,3 7,9±2,1 3,4+0,4 2/3

0,1 5,210,6 2,0±0,3 3/2

0,9 6,7±0,7 2,8±0,2 1/4

Некоицентрированная 0,3 4,7±0,5 2,8+0,1 3/2

0,1 3,4+0,2 1,3±0,2 4/1

КОНТРОЛЬ - - - 5/0

* Животных иммунизировали однократно, внутримышечно, разными дозами вакцин. Контрольное заражение животных проводили через 21 день после вакцинации путем внутримышечного введения 20 ЛДюо вирулентного штамма К ВБА. Кровь морских свинок для определения титра антител брали перед контрольным заражением.

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основой для проведения исследований, а также для разработки диагностических тест-систем и методов контроля изготовления тест-систем и "маркированных" вакцин, явилось получение репрезентативных панелей мкАТ против гликопротеинов gE и gB ВБА, которые по спектру специ-фичностей максимально приближены к поликлональной сыворотке. В пользу репрезентативности полученных нами панелей gE- и gB-спсцифических мкАТ свидетельствует то, что подавляющее большинство мкАТ реагировало с конформационными эпитопами гликопротеинов. Это полностью отражает ситуацию, присущую поликлональным сывороткам, в которых, как мы показали, антитела к конформационным эпигопам составляют значительную часть от всех gE- и gB-специфических антител. Полученные нами панели gE- и gB-специфических мкАТ выгодно отличаются от описанных другими авторами панелей мкАТ против gE и gB ВБА (Hampl et al., 1984; Lukacs et al., 1985; Jacobs et al, 1990; Fuchs et al., 1990; Nakamura et al., 1990). В этих панелях подавляющее большинство мкАТ реагируют с линейными эпитопами гликопротеинов, что не отражает реального распределения спектра специфичностей в поликлональ-

ных сыворотках. Такие панели мкАТ имеют ограниченную ценность для изучения антигенной структуры gE и gB ВБА.

В N-концевом сегменте gE мы идентифицировали высоко-антигенную область, включающую в себя кластер линейных эпитопоп. Это подтверждает данные других авторов, которые также локализовали в N-концевой области gE ряд линейных эпитопов (Jacobs et al, 1990; Fuchs et al., 1990; Ro et al., 1995). Кроме этого, мы установили, что эта область gE принимает также участие в формировании информационного эпиотпа мкАТ 1/14, и, возможно, в формировании еще ряда конформационных эпитопов gE. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности N-концевого фрагмента gE обнаружил в нем участки последовательности, обладающие высокой подвижностью, гидрофильностью и доступностью, что характерно для антигенных детерминант.

Антигенная структура gB ВБА представляется двумя структурно различными антигенными регионами, которые локализуются в разных субъединицах gB-комплекса (Рис. 10). В N-терминальной области gBb субъединицы (аминокислотные остатки 59-126) локализуются линейные эпито гш. В эктодоменной области gBc локализуется мощный кластер конформационных эпитопов, с которыми реагируют 22 мкАТ. В формировании эпнггопов этого антигенного региона gBc участвуют последовательности достаточно протяженного сегмента gB (аминокислотные остатки 540734).

Сравнительный анализ антигенных структур gB-гомологов герпесви-русов показывает, что такая структурная и топографическая "полярность" характерна для gB-гомологов других герпесвирусов, что, вероятно, является следствием сходства их структурной организации (Рис. 16). gB-гомологам других герпесвирусов (ВПГ-1, ЦМВЧ, ГВБ-1 и др.) присуща кластеризация линейных эпитопов вблизи N-конца (Fitzpatrick et al., 1990; Muggeridge et al., 1990; Kniess et al., 1991; Pereira, 1993). N-концевые линейные эпитопы располагаются в участке с наиболее низкой гомологией аминокислотной последовательности. Данным областям gB гомологов характерна высокая вероятность экспозиции на поверхности белка, гидрофильность и подвижность, свидетельствуя о высокой вероятности наличия эпитопов в данной области gB-гомологов. Концентрирование конформационных эпитопов в эктодоменной области С-терминального сегмента, объединяет антигенную структуру гликопротеи-на gB ВБА с антигенными структурами gB-гомологов ЦМВЧ и ВПГ-1 (Fitzpatrick et al., 1990; Muggeridge et al., 1990; Wagner et al., 1992; Pereira, 1993). По всей видимости, идентифицированная нами антигенная область в эктодомене gBc субъединицы, является аналогом антигенных доменов gB ЦМВЧ и ВПГ-1, картированных в топографически гомологичных регионах С-терминального сегмента gB. Эта антигенная область gB-гомологов локализована в участке с высоким уровнем гомологии (по аминокислотной последовательности гомология этого участка gB ВБА и аналогичного сегмента gB ВПГ-1 составляет около 60%). Для этой антигенной области ВБА, ЦМВЧ и ВПГ-1 характерна кластеризация конфор-

мационных эпитопов и достаточно высокая устойчивость к обработке до-децил-сульфатом натрия и некоторыми протеазами (трипсин и протсаза V8 St. aureus).

NH2|Cf1C^ |Оп-1-Í^Z^^SZS?»^-г СООН ВБА

1 100 200 300 400 500 600 700 800 900

гп ■ ТМ

NH2| "-1-1 C^J On-1-[-От--г-СООН ГВБ-1

1 100 200 300 400 500 600 700 800 900

СП __ __ТМ

-1-1<=——-г СООН ВПГ-1

1 100 200 300 400 500 600 700 800 900

NHjpfe,-,-,--СООН ЦМВЧ

1 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Рис. 16. Антигенные структуры gB-гомологов отдельных герпесвирусов. Антигенная структура gB ВБА составлена на основашш собственных дашшх. Антигенные структуры gB герпесвируса быка 1 типа (ГВБ-1), вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) и цитомегалоиируса человека (ЦМВЧ) составлены на основе данных литературы (Highlander et al., 1989; Fitzpatrick et al., 1990; Muggeridge et al., 1990; Kniess et al., 1991; Wagner et al., 1992; Pereira, 1993). Использованные обозначения указаны на рис. 5.

Обе выявленные нами антигенные области gB ВБА способны индуцировать защитный противовирусный иммунитет. Антитела против обоих антигенных регионов gB защищают мышей от инфицирования вирусом, нейтрализуют вирус in vitro, замедляют его проникновение в клетки, задерживают распространение вируса от клетки к клетке; все эти механизмы могут быть задействованы в обеспечении формирования защитного противовирусного иммунитета. Роль N-концевой области gB ВБА в индукции защитного иммунитета была подтверждена в экспериментах по активной иммунизации. Очевидно, что данная область gB ВБА является перспективным кандидатом на включение в субъединичные или ДНК-вакцины против БА. Фрагменты gB, соответствующие антигенной области на gBc субъединице, не проявили защитного эффекта при активной иммунизации мышей. По-видимому, это связано с тем, что экспрессиро-ванные в E.coli белки, использованные в экспериментах, не являются адекватными иммуногенами для исследования этой области gB, так как не обладают нативной конформацией и не содержат большинства иммунологически важных конформационных антигенных детерминант. Для исследования роли этой области в экспериментах по активной иммунизации необходимы другие подходы, например использование рекомби-нантных фрагментов, экспрессированных в эукариотической системе.

Важным с точки зрения разработки диагностических тестов было установление факта, что конформационные эпигопы gE и gB ВБА играют центральную роль в индукции гуморального иммунного ответа при инфицировании животных ВБА и выявление иммунодоминангных областей и эпигопов гликопротеинов, индуцирующих синтез антител в наиболее высоких титрах. Это позволило сделать вывод, что диагностические тесты, выявляющие в сыворотках свиней антитела против консервативных кон-формационных иммунодоминангных эпигопов gE и gB, являются наиболее перспективными для серологической диагностики БА. Этот вывод и определил стратегию разработки gE- и gB-специфических ИФА.

В работе была проведена разработка пяти дискриминирующих gE-ИФА и четырех скрининговых gB-ИФА, их оптимизация и сравнительная оценка. Было установлено, что прямые блокирущие gE- и gB-ИФА на основе gE- и gB-специфических мкАТ являются наиболее подходящими для практики тестами. Оптимизирована технология изготовления компонентов тестов, оптимизирована комплектация тестов и процедура постановки анализов. В результате, были разработаны чувствительные, специфичные, воспроизводимые и простые в постановке тест-системы для выявления инфицированных животных среди невакцинированного поголовья (gB-тест-система) и среди поголовья, вакцинированного gE-негативной "маркированной" вакциной (gE-тест-система). Разработанные диагностические gE- и gB-тсст-скстсмы по чувствительности, специфичности и воспроизводимости не уступали, а в ряде случаев превосходили аналогичные тесты ведущих зарубежных фирм (ГОЕХХ, Svanova Biotech, Bommeli и Rhone Merieux). На оба теста разработана НД на изготовление, контроль и применение.

Интересно, что конъюгаты мкАТ 101/9 и 26/33, которые использованы в разработанных нами gE- и gB-тест-системах, конкурировали с gE- и gB-специфическими конъюгатами из аналогичных тестов Svanova Biotech, IDEXX и Rhone Merieux. Очевидно, что в наших тест-системах и в аналогичных тестах этих фирм используются мкАТ, направленные против эпи-топов одного топологического антигенного домена. Эти результаты свидетельствуют, что эпитопы-мишени, используемые в наших gE- и gB-тест-сисгемах, действительно являются важнейшими иммунодоминант-ными эпитопами, индуцирующими мощный гуморальный иммунитет.

На основе полученных нами gE- и gB-специфических мкАТ был также разработан комплекс методов контроля и стандартизации изготовления диагностических gE- и gB-тест-систем и инактивированных gE-негативных "маркированных" вакцин против БА. Эти методы использовались при разработке технологии изготовления тест-систем и "маркированных" вакцин против БА, а также для контроля и стандартизации их изготовления.

4. ВЫВОДЫ

1. Получены представительные панели моноклональных антител к гликопротсинам gE и ВБА, а также набор рекомбинантных фрагментов, соответствующих различным участкам аминокислотной последовательности гликопротеинов, которые использовались в качестве инструментов изучения антигенных структур гликопротеинов.

2. В гликопротеине {»Е ВБА выявлено 11 топологически различных эпитопов и антигенных доменов, из которых 8 представлены конформа-ционными эпитопами и 3 линейными эпитопами. Ы-концевая область гликопротеина включает в себя кластер линейных эпитопов и участвует в формировании конформационных эпитопов.

3. В структуре гликопротеина §В ВБА выявлено 15 топологически различных эпитопов и антигенных доменов. Антигенная структура §В ВБА представлена двумя топологически и структурно различными антигенными областями. Одна область расположена в пределах 66 Ы-концевых аминокислотных остатков gBb субъединицы и содержит неперекрывающиеся линейные эпитопы. Вторая антигенная область локализована в эктодоменс §Вс субъединицы в границах аминокислотной последовательности 540-733 и представлена кластером двадцати двух вза-имноперекрывающихся конформационных эпитопов.

4. Антигенная структура гликопротеинов и §В ВБА консервативна.

5. Основная роль в индукции гуморального иммунного ответа против гликопротеинов gE и £В ВБА при иммунизации и инфицировании животных принадлежит конформационным эпитопам. Среди линейных эпитопов, эпитопам Л-концевых областей гликопротеинов принадлежит наиболее значительная роль в индукции гуморального иммунного ответа.

6. К-концевая область gBb субъединицы гликопротеина и антигенная область эктодоменного участка gBc субъединицы принимают участие в формировании защитного иммунитета.

7. Для выявления инфицированных свиней среди поголовья, вакцинированного gE-нeгaтивнoй "маркированной" вакциной разработана дискриминирующая диагностическая иммуноферментная gE-тест-система. Для выявления инфицированных свиней среди невакцинированного поголовья разработана скрининговая диагностическая иммуноферментная §В-тест-система. Разработанные тест-системы обладают высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью и по своим характеристикам не уступают зарубежным аналогам.

8. Разработана технология изготовления и методы контроля диагностических gE- и gB-тecт-cиcтeм.

9. На основе gE- и gB-cпeцифичecкиx моноклональных антител разработан комплекс методов технологического контроля изготовления инак-тивированных "маркированных" вакцин против БА.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны и предложены для практического использования:

1. Дискриминирующая диагностическая иммуноферментная тест-система для выявления в сыворотке крови свиней антител к гликопротеину gE ВБА, позволяющая дифференцировать инфицированных и вакцинированных gE-негативной "маркированной" вакциной животных.

2. Скрининговая диагностическая иммуноферментная тест-система для выявления антител к гликопротеину gB ВБА, позволяющая выявлять инфицированных свиней среди невакцинированного поголовья.

3. Методы контроля содержания gE- и gB-антигенов при изготовлении диагностических иммуноферментных gE- и gB-тест-систем.

4. Методы контроля антигенной активности и "маркированности" производственного вакцинного gE-негативного штамма ВБА, вирусного сырья и изготовленной "маркированной" вакцины.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Моренков О.С. Разработка иммуноферментных методов выявления антител к гликопротеину gB вируса болезни Ауески в сыворотке св5шей.// Вопросы вирусологии. 2000. N 3. С. 45'—48.

2. Morenkov O.S., Zaripov М.М., Fodor N., Braun A., Schmatchenko V.V, Smimov S.V., Fodor I. Antigenic regions of glycoprotein gB of Aujeszky's disease virus and their role in inducing protective immunity.// Proc. 2-nd World Congress on Vaccines and Immunization (Workshop: Advances in vaccines for farm animals and poultry). Liedge. 2000.

3. Зарипов M. M., Моренков О. С., Шматченко В. В., Смирнов С. В., Фунтиков В. А., Фодор И. Иммунологическая и функциональная характеристика эпито-пов и областей гликопротеина gB вируса болезни Ауески.// (Принята к печати в журнал Вопросы вирусологии).

4. Morenkov O.S., Sobko Yu.A., Panchenko O.A., Smimov S.V., Vrublevskaya V.V., Sergeev V.A. Development and comparison of ELISA tests for the detection of swine infected with Aujeszky's disease virus among non-vaccinated animals.// Proc. 16th Congress of the International Pig Veterinary Society. Melbourne. Australia. 2000. P. 616.

5. Моренков O.C., Собко Ю.А., Собко И.А., Панченко О.А., Сергеев В.А. Иммуноферментные тесты для серологической диагностики болезни Ауески.// (Принята к публикации в журнал Ветеринария)

6. Zaripov М.М., Morenkov O.S., Fodor N., Brown A., Schmatchenko V.V., Fodor, I. Distribution of B-cell epitopes on the pseudorabies virus glycoprotein B.// J. Gen. Virol. 1999. V. 80. P. 637-541.

7. Morenkov O.S., Fodor N., Fodor I. Indirect ELISAs based on recombinant and affinity-purified glycoprotein E of Aujeszky's disease virus to differentiate between vaccinated and infected animals.//Acta Veterinaria Hungarica. 1999. V. 47. N1. P. 137-151.

8. Гусева M.H., Михайлшшш В.В., Моренков О.С., Майков Н.С. Иммуноген-ные свойства концентрат-вакцин против болезни Ауески, делеционного по гли-

копротеину gE.// Произ. и кетггр. мед., вет. препар., опыт примен. и реализ. их в странах СНГ: Тез.докл.конф. Владимирская обл., и.Вольгинский: ФГУП ПЗБ. 1999. С.56.

9. Morenkov O.S., Smimov S.V., Vrublevskaya V.V.. Isolation of mutants of Aujeszky's disease virus with antigenically altered glycoprotein E by affinity chromatography using monoclonal antibodies. // J. Virol. Meth. 1998. V. 67. P. 108— 121.

10. Zaripov M.M., Morenkov O.S., Siklodi В., Barna-Vctro I., Gyipigynsi-Horvath A., Fodor I. Glycoprotein В of Aujeszky's disease virus: topographical epitope mapping and epitope-specific antibody response".// Res. Virol. 1998. V. 149. P. 29—41.

11. Гусева M.H., Михаилшшпг B.B., Моренков О.С. Иммунобиологические свойства инахтивировашюй вакцины против болезш! Ауески из штамма, делециошюго по гликопртеину gE.// Совр. асп. вет. патол. ж-ных: Матер.конф., посвящ.40-летию ВНИИЗЖ. Владимир. 1998. С. 245-249.

12. Morenkov O.S., Sobko Yu.A., Panchenko O.A. Glycoprotein gE blocking ELISAs to differentiate between Aujeszky's disease-vaccinated and infected animals.//J. Virol.Meth. 1997. V. 65. P. 83-94.

13. Morenkov O.S., Fodor N., Sobko Yu.A, Fodor I. Immunological characterisation of glycoprotein E of Aujeszky's disease virus.// Virus Research. 1997. V. 51. P. 65-79.

14. Моренков O.C., Смирнов C.B. Новый способ получения антигенных вариантов вирусов.// Тезисы докладов международной конференции "Проблемы инфекционной патологии ссльскохозяйствашых животных". Владимир. 1997 . С.124-125.

15. Моренков О.С., Фодор П., Собко Ю.А., Манцыгин Ю.А., Фодор И. Гли-копротеин gE вируса болезга! Ауески: эпитопная структура и эпитоп-специфический гуморальный иммунный ответ.//Тезисы докладов международной конференции "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных". Владимир. 1997 . С.130-131.

16. Моренков О.С. Сравнительная оценка различных иммуноферментных методов для выявлсш1я антител к гликопротсину gE вируса болезни Ауески в сыворотке свиней.//Тезисы докладов международной конференции "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных". Владимир. 1997. С.129.

17. Гусева М.Н., Михайлишин В.В., Моренков О.С., Лебедева Н.Н. Концентрирование вируса болезни Ауески с делецией по гликопротеину gl.//Тезисы докладов международной конференции "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных". Владимир. 1997. С. 97.

18. Гусева М.Н., Михайлишин В.В., Моренков О.С., Каракурчи Н.Я. Инактивация вируса болезни Ауески с делецией по гликопротеину gl.// Тезисы докладов международной конференции "Проблемы инфекционной патологии ссльскохозяйствашых животных". Владимир. 1997. С.98.

19. Зарипов М.М., Моренков О.С., Сиклоди Б., Фодор Н., Браун А., Барна-Ветро И., Геигеси-Хорва А., Фодор И. Эпитопная структура гликонротеина gB вируса болезни Ауески.// Тезисы докладов международной конференции "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйствешгых животных". Владимир. 1997. С.131.

20. Зарипов М.М., Моренков О.С., Манцыгин Ю.А. Эпитопное картирование гликопротеина gB Suid herpes virus.// Тезисы докладов. Городская научная конференция молодых ученых. Пущино. 1996 . С. 35.

21. Моренков О.С., Собко Ю.А., Панчегасо O.A., Ларионов E.JI., Сергеев В.А. Разработка gl-дискришпшрующей тест-системы для выявления инфицированных вирусом болезни Ауески животных в вакцинированном маркированной вакциной стаде.//Материалы международной научной конференции "Общая эпизоотология: иммунологические и методологические проблемы". Харьков. 1995 . С. 413— 415.

22. Собко Ю.А., Моренков О.С., Панченко O.A., Сергеев В.А., Белоконь В.И., Решотько Л.М. Определите иммуногенной активности маркированной вакцины против болезни Ауески.//Материалы международной научной конференции "Общая эпизоотология: иммунологические и методологические проблемы". Харьков. 1995 . С. 409-412.

23. Собко Ю.А., Моренков О.С., Панченко O.A., Сергеев В.А. Искоренение болезни Ауески.//Материалы международной научной конференции "Общая эпизоотология: иммунологические и методологические проблемы". Харьков. 1995 . С. 354-355.

24. Моренков О.С., Ю.А. Манцыгин, В.А. Сергеев, Ю.А. Собко , O.A. Панченко, М. А. Морегпсова, И.А. Катаева. Эгштопное картирование гликопротеина gl вируса болезни Ауескн.//Тезисы докладов всероссийской научно-практической конференции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных". Владимир. 1995. С.117.

25. Собко Ю.А., В.А. Сергеев, О.С. Моренков, О.А.Панченко. Иммуноген-ность инактивированной вакцины против болзни Ауески, приготовленной на основе различных штаммов вируса.// Тезисы докладов всероссийской научно-практической конференции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных". Владимир. 1995. С.174.

26. Моренков О.С., Собко Ю.А., Сергеев В.А., Манцыгин Ю.А., Панченко O.A., Катаева И.А., Моренкова М.А. Болезнь Ауески: дифференциация инфицированных и вакцинированных животных методом блокирующего ИФА на основе мАТ. Тезисы докладов всероссийской научно-практической конференции "Вирусные болезни сельскохозяйствашых животных". Владимир. 1995. С.235.

27. Моренков О.С., Манцыгин Ю.А., Сергеев В.А., Собко Ю.А., Моренкова М.А., Панченко O.A. Получаше и характеристика моноклональных антител к гликопротеину gB вируса болезни Ауески и их использование для опитопного картирования gB.// Вопросы вирусологии. 1994. N. 4. С.174-177.

28. Моренков О.С., Манцыгин Ю.А., Сергеев В.А., Собко Ю.А., Панченко O.A., Забелло Н.Е., Моренкова М.А. Использование моноклональных антител для определения иммуноферментным методом вируса болезни Ауески в культу-ралыюй среде.// Вопросы вирусологии. 1994. N 5. С.212-215.

29. Моренков О.С., Манцыгин Ю.А., Моренкова М.А., Собко Ю.А., Сергеев В.А., Панченко O.A., Забелло Н.Е. Выявление клеток, инфицированных вирусом болезни Ауески, с помощью моноклональных антител к вирус-специфическим белкам.// Тезисы докладов IV Совещания "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. 1994. Цитология. 1994. т. 36. N 6. С. 574.

30. Моренков О.С., Манцыгин Ю.А., Собко Ю.А., Сергеев В.А., Моренкова М.А, Панченко O.A., Забелло Н Е. Иммуноцитологический метод выявления антител к вирусу болезни Ауески в сыворотке животных.// Тезисы докладов IV Совещания "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. 1994. Цитология. 1994. т. 36. N6. С.575.

31. Моренков О.С., Манцыгин Ю.А. Выявление пролиферирующих клеток с помощью моноклональных антител к 5-бром-2'-дезоксиуридину методом перок-сидаза-антиперокеидаза.// Цитология. 1990. т. 32, С. 1225-1228.

Информация о работе

Моренков, Олег Сергеевич
доктора биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.06

Автореферат

Болезнь Ауески: иммунологическая характеристика гликопротеинов gE и gB вируса и разработка методов серологической диагностики болезни и контроля "маркированных" вакцин - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы