Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОХРАНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ЖИВОТНЫХ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОХРАНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ЖИВОТНЫХ"

3^9/3

На правах рукописи

БАГИРОВ Вугар Алинияз оглы

БИОТЕХНО ЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОХРАНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ЖИВОТНЫХ

03.00.23 - Биотехнология 03.00.13 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Дубровицы- 2004

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства.

Научные консультанты; академик РАСХН

Эрнст Лев Константинович;

доктор биологических наук, профессор Зиновьева Наталия Анатольевна.

Офи цнал ьн ые о пло и ей ты;

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук, профессор Клннский Юрий Дмитриевич;

доктор биологических наук, профессор Рябых Владимир Павлович; доктор биологических наук, профессор Ерохин Анатолий Сергеевич.

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Защита диссертации состоится О) февраля 2005 года, в 10 часов, на заседании диссертационного совета Д.006.013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровины, ВИЖ. Факс 8 (0967) 65-II-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖа.

Автореферат разослан 28 декабря 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологически

В.П, Губанова

1. Общая характеристика работы Актуплыюсть темы. Сохранение генетических ресурсов и рациональное использования животных является неотъемлемой частью биотехнологической и сельскохозяйственной науки. Из 6200 пород животных, относящихся к 40. вилам, внесенных в банк данных ФАО/ЕАЖ, более 30% мировых генетических ресурсов домашних животных находятся на грани вымирания (Shend, 1997; Sherf, 2000).

Впервые проблему сохранения генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных поднял A.C. Серебровский (1928) и ввел термин «генофонд». Автор подчеркивал, что «в лице генофонда мы имеем такое же национальное богатство, как в виде нефти, золота, угля, сокрытых в наших недрах». Рассматривая эту проблему, Ю.П. Алтухов с соавторами (1996) ввели термин «природоохранная генетика», который употребим и для популяций сельскохозяйственных животных, поскольку породы — это не что иное, как неотъемлемая часть животного мира.

Одним из выдающихся достижений отечественной науки XX столетия явилась разработка биотехнологического метода искусственного осеменения, позволяющего тиражировать ценные генотипы в сотни и даже тысячи раз, увеличивая их распространение в популяциях и вытесняя при этом малоценные генотипы.

Открытие Миловановым В.К., Соколовской И,И,, Смирновым И.В. (1947) возможности длительного сохранения семени животных в глубокоохлажденном состоянии явилось основой для создания криобанка генетических ресурсов высокопродуктивных, редких, уникальных и исчезающих видов животных.

Криобанк семени перед традиционными методами сохранения видов имеет такие преимущества, как возможность транспортировки на большие расстояния; легкость обмена генетического материала между популяциями; высокая степень надежности; сведение до минимума эффекта генетического дрейфа и инбридинга; обеспечение сохранения видов в случае эпидемий, экологических и социальных катастроф; использование отдаленной гибридизации с целью совершенствования животноводства: создание коллекции биологических материалов для различных исследований.

Генетический материал, сохраняемый в крнобанке, может быть использован не только для восстановления исчезающих видов, но и для обмена генетическим материалом между популяциями, разводимыми в неволе; для обогащения резерва наследственной изменчивости свободноживущих популяций, находящихся под угрозой исчезновения ввиду их малой численности; при разведении животных-носителей уникальных генов, полученных в процессе трансгенеза (Эрнст Л.К. и др., 1994; Эрнст Л.К., 2004),

Существование вида, его способность выжить в данной среде зависит от сохранности генома, которой вносит . сперматозоид в ооцнт при оплодотворении. Совокупность механизмов обеспечивающих защиту генома в половых клетках самцов, подвергающихся сложным трансформациям в ходе сперматогенеза, является одним из условий, обеспечивающие существование вида. I - ЦмЬ "СХА

Цель и задачи исследован и».

Целью диссертационной работы являлась разработка и усовершенствование технологий и методик сохранения и рационального использования генетических ресурсов разных видов, животных с использован нем бнотехпологическнх методов.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

• Усовершенствовать технологию криоконсервации семени кроликов.

• Разработать технологию криоконсервации эп ид иди мольного семени животных.

• Создать банк семени редких, исчезающих и уникальных видов животных.

• Изучить морфологические и гистологические особенности гонад и выполнить сравнительный анализ видовых характеристик сперматозоидов различных видов животных.

• Разработать методологию рационального использования генетических ресурсов.

» Изучить возможность получения трансгенных свиней после многолетнего хранения семени.

• Изучить возможность использования сперматозоидов в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК в ооциты кролика.

• Усовершенствовать методику кар и о ги п про ва н и я с использованием прикладных компьютерных программ и провести цитогенетический анализ •животных разных видов.

Научили тжизнп. В ходе выполнения диссертационной работы была усовершенствована технология криоконсервации семени кроликов, позволяющая улучшить биологическую сохранность сперматозоидов, получить более высокую оплодотворяющую способность сперматозоидов и повысить м! («го плод не в сравнении с прототипом.

Впервые была разработана технология криоконсервации эннд пли мал иного семени овцебыка, сайгака, яка как метод сохранения редких и исчезающих видов животных. Предложен метод внутритрубного осеменения для размножения трансгенных свиней при наличии ограниченных количеств глу бок оза морожен но го семени. Изучены видовые особенности сперматозоидов яков, сайгаков, овцебыков, кроликов, баранов, хряков и быков. Доказано, что в процессе криоконсервации семени, сперматозоиды способны связываться с чужеродной ДНК и переносить ее в ооциты при оплодотворении. Изучено влияние чужеродной ДНК на уровень хромосомной изменчивости у трансг енных свиней и кроликов.

Практическая шачнмость. Предложена усовершенствованная технология криоконсервации семени кроликов, на основе которой создан банк семени трансгенных кроликов. Разработана технология криоконсервации эп и дид н м ал ь н о го семени разных видов животных, с использованием которой создан банк семени редких, уникальных и исчезающих видов животных (овцебыков, сайгаков, яков). Создан банк семени трансгенных хряков 6-ти

поколений (Рг, р3> Р4, Р^ Р7). Доказано, что глубоко-замороженное семя трансгенных хряков, хранящееся в жидком азоте более 10 лет, может быть использовано для получения потомства и возобновления трансгенной линии. Разработана методика кариотнпирования на основе прикладных компьютерных программ, позволяющая повысить эффективность цитогенетического анализа животных.

Положения, выносимые на защиту.

• Усовершенствованная технология кр иокон серваш I и семени кроликов, позволяющая повысить сохранность, оплодотворяющую способность сперматозоидов и многоплодие.

• Технология крио консервации эпидидимального семени как метод сохранения и рационального использования генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных.

• Б иол отческая полноценность семени трансгенных хряков, хранившегося более 10 лет в криобанке.

• Метод внутритрубного осеменения как способ тиражирования уникальных генотипов при ограниченном запасе семени.

• Морфологические и гистологические особенности семенников яков, сайгаков, овцебыков.

• Морфологические и гистохимические особенности сперматозоидов яков, сайгаков, овцебыков, кроликов, баранов, хряков и быков.

• Новая методика кариотнпирования на основе использования прикладных программ как способ характеристики генетических ресурсов животных.

• Влияние чужеродной ДНК на уровень хромосомных нарушений и физиологические показатели у животных.

ДпрпДаним работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 12 научных кош|>еренциях (Москва, Дубровнцы, Боровск, Санкт-Петербург, Гаага, Рим), на заседаниях ученого совета ВИЖа. По материалам диссертации опубликовано 33 научные работы, в том числе в центральных журналах - 8, книг - б, методических рекомендаций - 3, в зарубежных изданиях — 2.

Обьем работы. Диссертация изложена на 245 страницах машинописного текста, включает 33 таблицы, 79 рисунков, 1 график, 3 схемы. Библиографический список содержит 425 источников, в том числе 257 на иностранных языках,

2, Материал и методы исследовании.

Работа выполнена в 1993-2004 гг. во Всероссийском г осу дарственном научно-исследовательском институте животноводства, в экспериментальных хозяйствах ВИЖа «Кленово-Чегодаево», «Дубровнцы», в экспериментальном хозяйстве ВИЭВ «Лисий остров» Тверской области, охранной зоне "Бикада" полуостров Таймыр, с. Бизинги Черекского района Кабардино-Балкарской

Cecity блики, в вольере организации «Охрана дикой природы» Калмыцкой Республики.

Опыты проводили на следующих видах животных: 1) кролики (Oryctolagus cuniculus) пород шиншилла, шампань, калифорнийская, русская горностаевая — всего SO самцов, 250 самок и 4 ваззктомированных самца в возрасте от 6 месяцев до 4 легг; 2) свиньи (Sus scrofä) породы крупная белая, ландрас и их помеси, люрок - всего 30 самцов и 80 самок в возрасте до 5 лет; 3) овцы (Ovis ans) пород романовская, кавказская, куйбышевская, ромни-марш, текенль, финский ландрас, линкольн и их помеси — всего 20 самцов в возрасте от 1 до 4 лет; 4) быки (Bos laurus) 20 пород — всего 50 голов в возрасте от 1 до 10 лет; 5) овцебыки (Ovibos moschatus) - 2 самца в возрасте больше 3 и 5 лет; 6) яки (Bos mulus) - 4 самца и 3 самки в возрасте от 1,5 до 7 лет; 7) сайгаки (Salga mtarica) -7 самцов в возрасте от 1,5 до 3,5 лет.

Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке I.

Семя брали при помощи искусственной вагины ог самцов кроликов, содержащихся в индивидуальных клетках. За основу взяты инструменты, приспособления и методика взятия семени, описанные Соколовской И.И. и Кононовым В.П, (1971), модифицированные нами. В свежевзятых эякулятах изучали качественные и количественные характеристики. Концентрацию сперматозоидов определяли при помощи камеры Горяева при увеличении 400s. Разработку среды для крн окон сер вашж семени кроликов проводили с использованием метода треугольных графиков по В.К. Мнлованову (1962) для нахождения оптимального соотношения испытуемых компонентов. 01гтнмальный режим замораживания определяли путем изменения объема гранул семени, замораживаемых на фторопластовой пластине. В качестве прототипа использовали среду, предложенную H.A. Комбаровой (1993).

Разбавленное семя охлаждали в течение 4-х часов в бытовом холодильнике до -+4 предварительно поместив пробирки с семенем в поролоновый теплоизолирующий штатив. Затем семя охлаждали до 0 °С, погружая пробирки в смесь воды со льдом. Замораживание семени проводили на охлажденной в жидком азоге фторопластовой пластине (Ющенко Н.П., 1968), Оттаивание семени осуществляли сухим методом с помощью оггаивателя (Кононов В.II., Нарижный А,Г., 1986).

Время выживания сперматозоидов оценивали по полу пери оду подвижности (Милонаноп В.К. и др. 1981) н морфологической сохранности акросоч акроскопнчсскнм методом (Соколоиская И.П., 1980).

Спаривание самки с напктомированным самцом проводили за 5 часов до осеменения. Для индукции овуляции самкам непосредственно перед осеменением »полили внутривенно хорионичсский юнадотропин (Ovogest 1500, Intcrvet, Германия) щ расчета 30 ME на I кг живой массы. Семя вводили в период о\о1ы однократно в дозе 0,25 мл, содержащей около 20 млн, подвижных сперматозоидов. На 12-13 день крольчих пальпировали для предварительной диагностики сукрольности. Результативность осеменения оценивал» по данным окрола, определяя процент окролнвшихся маток и размер гнезда.

['rte. 1 .Схема исследовании

Технология замораживания эпидидимального семени включала несколько этапов: получение содержимого эпндидимиса, извлечение из него сперматозоидов и их кр и о консервация.

Выделение ДНК из ткани (вышины ушной раковины) проводили перхлоратным методом по усовершенствованной методике (Зиновьева H.A. и др., 2001). Для доказательства трансгенностн использовали метод ПЦР-анализа (Soiki et al., 1985, 1988). Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в агарозном геле и визуализировали в УФ свете с помощью цифровой камеры и компьютерной программы Biotest.

Образцы тканей для гистологических исследований фиксировали в 10% растворе формалина и в фиксаторе Карнуа. Гистопрепараты готовили на парафиновом и замораживающем микротоме по методике Ромейс (1953). Анализ препаратов осуществляли с использованием камеры и компьютерной программы Image Scope (г, Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»). Для этого проводили видеозахват 50 случайных полей зрения на 3-х препаратах, окрашенных по Фельгену, определяли длину, ширину, среднюю яркость и площадь 50 ядер сперматозоидов. Условную плотность находили по формуле а=(255-Ь), где а - плотность; b - яркость. Перемножая условную плотность на илошадь ядра (axS), определяли условное количество ДНК. Препараты сперматозоидов для морфометрического анализа окрашивали гематоксилином-эозином. Измеряли длину, ширину, площадь, округлость [оловки сперматозоидов,

Криоконсервацию семени хряков проводили по методике ВИЖ с применением диализной криопрогектнвной обработки.

Хирургические операции по внутритрубному осеменению свиноматок проводили под общим наркозом. Свиноматок фиксировали на операционном столе, производили разрез брюшной стенки по белой линии живота между предпоследней и последней парой молочных желез. Выводили на поверхность брюшной стенки сначала один рог матки в месте его соединения с яйцеводом, затем второй.

Для переноса чужеродной ДНК (чДНК) сперматозоидами в ооциты генную конструкцию pCMVIacZ добавляли к охлажденному до 0°С семени из расчета 1 мкг ДНК на ) млн. сперматозоидов в виле 0,01% раствора в Трис-ЭДТА буфере, В контрольные образцы добавляли соответствующее количество трис-ЭДТА буфера. Семя инкубировали при 0сС в течение 10-15 минут, замораживали и сохраняли в жидком азоте до осеменения. Через 44-46 часов после осеменения проводили вымывание эмбрионов 0,9% раствором NaCl. Определяли количество оплодотворенных яйцеклеток, сопоставляя его с числом овуляций на яичниках. После морфологического тестирования эмбрионов их подвергали гистохимической реакции с субстратом X-gal с целью выявления активности ß-галактозпдазы (Гоголевский П.А., 1991; Кузнецов A.B., 1993).

Для получения препаратов хромосом использовались лимфоциты периферической крови. Для этого, в зависимости от вида животных, брали кровь в количестве 2-5 мл из ушной или яремной вены в стерильный

одноразовый шприц с гепарином. Препараты готовили по методике (Кленовицкий и др. 2003).

Анализ препаратов хромосом проводился с использованием стандартных программ обработки видеоизображений (Image Scope 1 (ООО «Системы для микроскопии и анализа», г. Москва), Photoshop),

3. Результаты исследований.

3.1. Усовершенствование технологии криоконсервации семени кролика.

Разработку технологии криоконсервации кроличьего семени проводили в несколько этапов:

1) совершенствование крнопротективной среды;

2) оптимизация режима замораживания семени;

3) выбор способа замораживания семени;

4) усовершенствование инструментария для искусственного осеменения крольчих.

3.1.1. Совершенствование криопротективной среды.

Оптимальное соотношение основных компонентов криопротекторной среды было найдено с использованием методов геометрических и арифметических рядов.

В качестве базовых были взяты компоненты, хорошо зарекомендовавшие себя как защитные факторы в работе с семенем других видов животных. В качестве неэлектролита была использована лактоза как дисахарид, обладающий высокими антиоксидантнымн свойствами и способный особо прочно связывать свободную воду. Электролитной частью среды являлся трис-цитратный буфер, зарекомендовавший себя как способный устойчиво удерживать концентрацию водородных ионов при охлаждении семени за счет сопряженного подавления констант диссоциации трис-катиона и основных анионов.

Таблица I

Состав среды для криоконсервации семени кроликов

Название Химическая формула М ол екул я р и ы н вес Кол-во вещества

Лактоза Ci;H«On*HiO 36032 2,17 г

Лимонная кислота он,о7 192,1 1,52 г

Трис C4H„NO, 121,1 2,74 г

Желток куриного яйца 15,0 мл

Глицерин С,НА 92,09 2,0 мл

ДМСО (CthbSO 78.11 2,5 мл

Вола бидистиллированная н?о IX 100 мл

pH среды 7,05

В связи с особым значением специфических криопротекггоров для защиты семени при замораживании методом треугольных графиков в среду в оптимальных концентрациях были введены наиболее широко используемые глицерин и ДМСО. Результаты исследования по нахождению оптимальных

концентраций этих крнолротекторов в связи с характеристиками биологической полноценности оттаянного семени показали, что оптимальные концентрации глицерина 2% и ДМ СО 2,5%.

Состав разработанной среды приведен в таблице 1.

3.1.2. Оптимизация режима замораживания семени.

Следующим этапом исследований явилось нахождение оптимального режима глубокого охлаждения семени при замораживании его гранулами разного обьема. Установлено, что объем замораживаемых гранул имеет решающее значение для выживаемости сперматозоидов. Чем больше объем гранулы в пределах до 0,3 мл, тем лучше сохраняется биологическая полноценность сперматозоидов.

Изменение характеристик семени на разных этапах криоконсервирования с использованием разрабатываемой нами технологии по сравнению с методикой-прототипом приведены в таблице 2,

Таблица 2

Изменение характеристик семени кроликов на разных

этапах криоконсервации__

Этапы крмо* консервации Подвижность, % Сперматозоидов с литактпыми акросомами, % Подвижных сперматозоидов с ннтактнымн акросомами, %

Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль

Свежевзятое семя 82±1,8 74+1,3 85+2,1 82+2,8 100 100

После разбавления 78+1,4 74+1,3 83+2,9 78+4,0 98±0,6 95±1,0**

После эквилибрации 73 ±0,9 73±0,8 82+3,0 73+3,2** 9б±0,9 89±1,4***

После оттаивания 25+2,3 15+1,1 73±2,2 55+3,0*** 86+1,6 67+2,1***

Примечание: опыт - замораживание семени по разработанной нами методике;

контроль - ¡аморвмеивание семени по методикой-прототипом.

Из данных таблицы 2 видно, что замораживание семени по разработанной нами методике значительно лучше защищает сперматозоиды по сравнению с м ето д и коЙ-прототи пом.

Результативность осеменений крольчих при использовании естественной случки, искусственного осеменения криоконсервированным семенем по нашей технологии и методике-прототипу приведена в таблице 3,

Как видно из таблицы 3, криоконсервация семени с использованием разработанной технологии позволяет сохранить более высокую оплодотворяющую способность сперматозоидов (+18%) и повысить многоплодие на 0,9 крольчонка, чем при использовании технологии-прототипа (разница статистически достоверна).

Таблица 3

Результативность осеменения крольчих семенем, замороженным

разными методами, в сравнен пи с естественным спариванием

Показатели Осеменено крольчих Из них окрол н л ось, голов Родилось крольчат, голов

п % л | % п %

Естественная случка 104 100 94 I 90,4+2,9 686 7,3+0.52***

Новая технология 110 100 86 78,2±3,9 498 5.8±0,70

Прототип 111 100 67 | 60.4+4,6** 329 4.9+2,0

3.1 Л. Выбор способа зам о ражи ванн я семенн.

Предложена и апробирована методика кр и око н сер ваци и семени кроликов в соломинках объемом 0,25 мл. Подвижность замороженно-оттаянных сперматозоидов в гранулах составила 25%, в то время как в соломинках - 20%. Сохранность акросом при этом была 73% и 62%, соответственно.

Хотя кри окон сер вацпя семенн кроликов в гранулах дает лучшие результаты по сравнению с соломинками, замораживание в соломинках имеет ряд преимуществ, таких как обеспечение лучшей стерильности, легкость и удобство оттаивания и маркировки,

3.1.4. Усовершенствование инструментарии длп искусственного осеменення крольчих.

Исходя из физиологических особенностей кроликов, при искусственном осеменении самок возникают проблемы, связанные с трудностями взятия семени и введения шприц-катетера. В этой связи были усовершенствованы вагина для взятия семени кроликов и шприц-катетер для искусственного осеменения крольчих.

Разработанная нами технология уже успешно используется для криоконсервацни семени кроликов в рамках создания банка семени трансгенных животных (раздел 3.3.1).

3.2. Усо верш енствова ш ie технологии криоконсервацни

in мд иди малыш го семени как метода сохранен« и н рационального использования генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных.

Возможность использования эпидидималького семени разных видов животных с целью получения потомства была доказана еше Ивановым И.И. (1910). Эрнст JI.K. с соавторами (1986), Шайдуллин H.H. (1994), Абилов Л.И. с соавторами (1994) подтвердили перспективность использования этого метода. Криоконсервация эпидидимального семени на сегодня осуществлена у снежного барана (Шайдуллин И.Н., 1988) и зубра (Абилов А.И, и др., 1994),

Задачей наших исследований явилось усовершенствование технологии получения и криоконсервацни эпидидимального семени животных и его более

рациональное использование. Предложенное нами фракционное выделение спермы - это новый подход в получении эпидиди мал ьного семени.

Суп, предложенной технологии заключается в следующем: хвост придатка отделяют ог семенника и осторожно освобождают от оболочек и кровеносных сосудов, оставляя чистый клубок ) овитого канала эпидидимиса, заполненного сперматозоидами. Через надрезы канальцев эпидидимиса получают первую фракцию.

После выделения первой фракции чистого семени извитой канал измельчают ножницами, получившуюся массу смешивают со средой и фильтруют через стеклянный фильтр.

Технология получения и криоконсервации эпндидим ал ьного семени животных включает в себя несколько этапов:

1) отбор семенников;

2) препарирование эпидидимиса;

3) получение содержимого эпидидимиса;

4) выделение сперматозоидов по фракциям;

5) разбавление сперматозоидов средой;

6) эквилнбрзция семени;

7) криоконсервация эпидиди мал ьного ссмени.

Первоначально технология была отработана на кроликах. Выделенные из хвоста эпидидимиса по вышеописанной методике сперматозоиды подвергались глубокой заморозке. Сравнительный анализ выживания сперматозоидов в эякулированном и эпидиднмальном семени приведен в таблице 4.

Таблица 4

Результаты замораживании эпндиднмальных сперматозоидов кролика

Этапы Подшгжносгь Сохранность акросом,

крайком серпа шш сперматозоиде», % сперматозоидов, %

Эякули- Эпидиди- Эякули- Эшшнди-

рованное мильное рованное малысое

Свсжевзятое ссмя 82+1.8 50+2,4 85+2,1 87+1,5

После разбавления 78±1.4 90+2,1 83+2.9 78+3,1

После эквилибрации 73+0,9 75+1,5 82+3,0 75±2.б

После замораживания-оттаивания 25±2,3 30+1,9 73+2,2 68+3,2

Как показано в таблице 4, подвижность сперматозоидов эпидиди мал ьного семени после замораживания-оттаивания составляла 30%, что было на 5% выше по сравнению с подвижностью сперматозоидов в эякулированном ссменн. Сохранность акросом сперматозоидов в эпидиди мольном ссмени лишь незначительно уступала этому показателю в эякулированном ссменн. Биологическая полноценность кр и окон сервирован но го эпидиди мал ьного ссмени кролика была доказана успешным получением потомства.

Разработанная методология сохранения генетических ресурсов редких, уникальных и исчезающих видов животных предусматривает провеление односторонней кастрации самцов, что не приводит к потере их воспроизводительной функции. Данная методология была апробирована на кроликах, баранах, сайгаках и яках.

Была изучена возможность криоконсервации эшшидимальных сперматозоидов из головки и тела эпидидимиса, а также тссгакулярных сперматозоидов. Проведенные эксперименты показали, что после замораживания и оттаивания сперматозоиды сохраняют свою биологическую полноценность и пригодны для интрацитоплазматической инъекции (Юв!) ооцитов.

Предложенный подход открывает новые возможности в сохранении генетических ресурсов с использованием эпидидимальных сперматозоидов не только из хвоста эпидндимиса, а также из головки и тела эпидидимиса, и тестикулярных сперматозоидов.

ЗЛ. Создание банка семени редких, исчезающих и уникальных видов животных.

Усовершенствованные в ходе выполнения диссертационной работы технологии криоконсервации семени (разделы З.1., 3.2.) были использованы для создания банка семени редких, исчезающих и уникальных видов животных.

3.3.1. Банк семени трансгенных кроликов.

Получение трансгенного животного является сложным и трудоемким процессом, поэтому ставится задача максимального тиражирования его в потомстве. Эту проблему помогает решать разработанная технология криоконсервации семени кроликов, дающая возможность круглогодично накапливать семя уникальных самцов и в последующем использовать его для осеменения самок. Характеристика созданного в холе выполнения диссертации банка семени трансгенных кроликов дана в таблице 5.

Таблица 5

Характеристика банка семени трансгенных кроликов

Показатели Трансгенные по генам

MCP BLV

Заморожено доз 1150 780

Подвижность свежевзятого семени, % 75+2,24 80+2,69

Подвижность после замораживания-оттаивания семени, % 30+1,29 25±2,89

Сохранность акросом % 65±f,49 60+1,97

Из таблицы 5 видно, что подвижность сперматозоидов кроликов, трансгенных по генам MCP и BLV, после замораживания и оттаивания составила 25-30%, при этом сохранность акросом была на уровне 60-65%. Всего заморожено 1930 доз семени трансгенных кроликов.

Биологическая полноценность семени была доказана успешным получением транс генного потомства. В ходе выполнения работы было исследовано пять поколений трансгенных животных. Для уменьшения эффекта инбридинга в размножении использовались интактные кролики,

С целью получения гомозиготного трансгенного потомства проводили спаривание по типу трансген х транс ген. Гомози готность самцов по интегрированному гену была доказана последующими анализирующими спариваниями с контрольными самками. Получено 2 гомозиготных трансгенных самца, семя от которых в количестве 200 доз содержится в криобанке.

3.3.2, Банк семени трансгенных баранов.

С молоком трансгенных животных уже получены целый ряд ценных веществ в том числе, биологически активные вещества технологического назначения, включая химозин (Эрнст и др., 1995).

Для сохранения генофонда трансгенных баранов по химозину с целью детального изучения этих животных и их дальнейшего использования создан банк семени. Всего заморожено 580 доз.

Характеристика семени трансгенных баранов приведена в таблице 6.

Таблица 6

Характеристика семени трансгенных баранов

Показатели Трансген н ый по химозину

Всего заморожено доз 580

Подвижность свежевзятого семени, % 90± 1.8

Подвижность после замораживания-оттаивания семени, % 45+1,5

Сохранность акросом % 68+2,3

Анализ таблицы 6 показал, что сперматозоиды баранов после криоконсервации сохраняли свою биологическую полноценность. Подвижность сперматозоидов трансгенных баранов после замораживания и оттаивания составила 45%, при этом сохранность акросом была на уровне 68%.

3.3.3. Банк семени трансгенных хряков.

Для сохранения генофонда свиней, трансгенных по генной конструкции релизинг-фактора гормона роста, нами был создан банк семени трансгенных хряков поколений Р^, Р^ Р4. Р^ Р*. Всего было заморожено 2530 доз семени. Характеристика отобранного и криоконсервированного семени хряков приведена в таблице 7.

Как показано в таблице 7, подвижность свежевзятого семени трансгенных хряков составляет 75-9094; при оценке спермы после процесса замораживания-оттаивания активность сперматозоидов в трансгенном семени составляла 35-

45%, сохранность акросом составила 52-65%. Полученные данные свидетельствует о биологической полноценности сперматозоидов трансгенных хряков.

Таблица 7

Характеристика банка семени трансгенных хряков

Показатели трансгеиные хр фактору го яки, по релизннг рмона роста

Рг F, е* Р« FT

Заморожено доз 570 210 430 720 460 350

Подвижность свежевзятого семени, % 90±1,7 80+1,5 75+3,4 85+1,5 85±2,2 90±1,9

Подвижность после замораживания-оттаивания семени,0/« 45±2,7 35+2,2 35±2,3 35+2,0 40+1,2 35+2,5

Сохранность акросом % 65±1,5 55+1,3 52+2,4 58+2,6 60+2,0 60+2,1

3.3.4. Банк семени овцебыков.

Создание криобанка семени овцебыков является одним из актуальных вопросов в сохранении генетических ресурсов и в дальнейшем использовании в селекционно-племенной работе с овцебыками.

Впервые нам удалось получить и заморозить эпидидимальные сперматозоиды овцебыка и создать криобанк семени овцебыков, характеристика которого приведена в таблице 8.

Таблица 8

Криоконсервация энндидимальиого семени овцебыков

Показатели Бык №1 (3-года) Бык №2 (5-лет)

Объем чистого эпидцдимального семени из одного придатка, мл 4 5

Общее количество сперматозоидов, млрд. 34.1 53,5

Общий объем, мл 15,5 19.8

Концентрация сперматозоидов после разбавления,млрд 2,2 2.7

Подвижность свежеразбавленного семени 80+1,1 90+ U

Объем одной дозы, мл 0,25 0,25

Общее количество доз 55 73

Подвижность семени после замораживание-оттаивания | 35+1,7 45 ±0,9

Как показано в таблице К, объем эпидиднмального семени и концентрация сперматозоидов у 5-летного овцебыка были несколько больше по сравнению с 3-летним быком. Подвижность сперматозоидов 3-летного овцебыка после оттаивания составила 35%, а 5-летного - 45%.

Последние годы в целях восстановления исторического ареала овцебыков на севере России ведется огромная работа но расселению и одомашниванию овцебыка. На Восточном Таймыре отловлено 175 овцебыков, 148 из них выпушены в четырех запланированных районах, а 24 теленка отправлены на фермы, создаваемые в Оленекском, Сунтарском, Мирнинском и Горном районах Якутии (Царев, 2002).

Перспективы дальнейшей реакклиматизации овцебыков велики. Для расселения овцебыков пригодны приморские тундры от Кольского до Чукотского полуострова, все крупные острова Северного Ледовитого океан и горные тундры в пределах ееверо-таежной зоны, то есть территории общей плошадыо около 3,5 млн. км2. Необходимым условием для решения згой задачи является создание банка семени, позволяющего сохранить и рационально использовать генофонд этого уникального вида животных, хорошо приспособленного к экстремальным условиям обитания.

3.3.5. Банк семени яков.

Получением эпидидимального семени у яков во ВНИИ животноводства Киргизии занимался В.В. Ельчанинов (1962), однако полученные им эпидидимальные сперматозоиды не подвергались криоконсервацни. Попытки по получению спермы от яков на искусственную вагину и ее криоконсервацни с целью использования для осеменения коров, сделанные Е. Загдсуреном (1980), не увенчались успехом.

Нам удалось получшъ снищи дим ал ьное семя Oft 4-х самцов и создать банк семени яков (таблица 9).

Таблица 9

Крноконсервация эпшшднмалыюго семени яков

Показатели Возраст животных, год

1.5 2JS 3,5 5,5

Объем чистого эпидидимального семени из одного придатка, мл 1,2 3,4 5 3,1

Обшее количество сперматозоидов, млрд. 12,8 37,7 53,4 32,4

Общий объем, мл 6,4 14,5 18,4 13,5

Концентрация сперматозоидов после разбавления, млрд. 2,0 2,6 2.9 2,4

Подвижность свежеразбавленного семени 70+2,4 80±2,7 90±2,4 75±2,2

Объем одной дозы, мл 0,25 0,25 0,25 0,25

Общее количество доз 25 58 75 50

Подвижность семени после заморажи ва и ие-оттаи ва н и я 25±2,9 30+1,5 35+1,3 25+2,1

Из таблицы 9 видно, что пик развития сперматогенеза наблюдался у животных в возрасте 2,5 и 3,5 года. Приведенные данные показывают, что

общее количество сперматозоидов, полученных после выделения их из эпидидимнеа составляло у быков в 1,5 года - 12,8 млрд; в 2,5 года - 37,7 млрд., в 3,5 года - 53,4 млрд. и в 5,5 лет - 12,7 млрд. Подвижность сперматозоидов после замораживания-оттаивания составила, соответственно, 25%, 30%, 35% и 25%.

Результаты проведенных экспериментов показывают возможность успешного замораживания эпидиди мольного семени яка, что дает возможность использовать его для сохранения генетических ресурсов и отдаленной гибридизации.

33.6. Банк семени сайгаков.

В литературе отсутствуют данные о получении, оценке и криоконсервацин спермы сайгака. В связи с этим, нами были выполнены работы по получению и сравнительной оценке электроэякулированного и эпидиди мал ьного семени сайгака (таблица 10),

Таблица 10

Кр но консервация эпиднднмального и электроэякулированного семени сайгаков

Показатели Метод получение семени

Эле ктроэя кул н-рованное семя п=5 Эшшидн м а л ь-н ое сем» п=1

Обьем чистого эпидидим ал ьного семени из одного придатка, мл - 1,2

Общее количество сперматозоидов, млрд. 13,6 (2,7)* 8,8

Общий объем, мл 8,0(1,6)* 4,2

Концентрация сперматозоидов после разбавления, млрд 1,7 2,1

Подвижность сперматозоидов в свежеразбавленном семени, % 80+2,5 70+1,6

Объем одной дозы, мл 0.20 0.20

Общее количество доз 40 20

Подвижность семени после замораживания-оттаивания, % 35£1,3 30£2,3

от одного животного

Как показано в таблице 10, подвижность сперматозоидов в свежем семени, полученном с использованием электроэякулятора, была выше, а концентрация ниже по сравнению с данными показателями в эпидидимальном семени. Из приведенных данных видно, что после замораживания и оттаивания сперматозоиды сайгаков сохранили свою биологическую полноценность.

В исследованиях по получению семени с помощью электроэякулятора наблюдали случаи загрязнения мочой, что является недостатком данного метода.

Когда-то многочисленный сайгак находится на грани вымирания. Со}данис банка ссмсни, позволяет сохранить и рационально использовать генофонд этого уникального вида животных, хороню приспособленного к условиям обитания в аридной зоне.

3.4. Изучение морфологических и гистологических особенностей гонад и видовых характеристик сперматозоидов различных вило» животных.

3.4.1. Биологические особенности гонад овцебыка.

В экспедиционных исследованиях на полуострове Таймыр проведена работа но изучению биологических особенностей овцебыков данной популяции. В первую очередь нас н ¡пересовала биология воспроизведения этих животных.

Анализ данных таблицы 11 показывает, что с возрастом всс и геометрические параметры семенников увеличиваются. Из таблицы видна асимметрия гонад у 3- и 5-лстного овцебыков.

Таблица 11

Физиологические параметры семенников овиеОыка

vYj it/it liolpacr, (лег) Вес семенника, 1 Дли на (гр) } семенника, (см) Обхват семенника, (см)

левый | правый) левый правый левый правый

1 3 72 I 78 | 7,7 8,0 11,3 11,6

2 5 91 | 94 j 10,1 10,3 12,9 14,2

Изучены особенности гистологического строения с смен никой овцебыка. Результаты показали, что у старшего быка внутреннее содержимое канальцев было более наполнено клеточными структурами спсрмагогенного ряда.

3.4.2. Биологические особенности гопал яка.

В результате экспедиции в Кабардино-Балкарию удалось провеет и научно-исследовательскую работу по тучен и ю биологических особенностей яков эюй популяции. Изучены воспроизводительные функции самцов яков

Оказхтось, что семенники у яка меньше, чем у крупного рогатого скота. Данные морфологической оценки семенников у яков разного возраста приведены к таблице 12.

Анализ таблицы 12 показывает, <по до достижения пол ной пазовой зрелости вес и геометрические параметры семенников увеличиваются. Кроме того, видна асимметрия гонад у разновозрастных яков.

При щучении гистологических препаратов семенников разновозрастных яков установлено, что семенники, как у других видов животных, покрыты фиброзной капсулой, состоящей из плотной соеди н н г ел ы I ой ткани, от них внутрь отходя г сосдиннтслмюткапные перегородки, разделяя их на отдельные дольки с канадцами.

Таблица 12

Физиологические параметры семенников яка

.V» пп Масть яков Возраст, 11 ка (лет) Вес сем (г енника, Р) Длина семенника, (см) Обхват семенника, (см)

левый правый левы К правый левый правый

1 Черно-пестрый 1,5 45 - 7,1 - 93 -

2 Светло-бурый 2,5 78 81 83 83 12,2 12,5

3 Черный комолый 3,5 103 97 10,4 10,1 14,8 143

4 Бурый 5.5 93 - 9,2 - 13,7 -

Самцы яка в возрасте 2,5 и 3,5 гола характеризуются достаточно развитыми структурам к канал ьцевой ткани, установлена полная картина сперматогенеза. Срез заполнен клеточными элементами сперматогеиного эпителия.

У более старших животных плотность канальиевой ткани уменьшается, структура их постепенно претерпевает обратное развитие, снижается активность сперматогенеза.

3.4.3. Биологические особенности гонад сайгака.

Эксперименты непосредственно проводились в вольере организации «Охрана дикой природы» Калмыцкой Республики.

Было изучена гистология семенника сайгака. На срезах выявлена довольно равномерная заполненность канальцев клетками спермагогенного ряда. Это говорит о нормальном функционировании органа.

3.4.4. Сравнительный анализ сперматозоидов различных видов животных.

Сравнение морфо метрических и физиологических параметров сперматозоидов у разных видов животных позволяет получить наиболее латное представление об их биологических особенностях (Милованов, 1962).

Применение новых методов исследований по изучению и автоматизации анализа морфометрических параметров сперматозоидов позволяет баз ее точно и достоверно определять нх показатели.

С использованием прикладных компьютерных программ были изучены основные морфометричсские параметры сперматозоидов разных видов животных (таблица 13), позволяющие охарактеризовать видовые особенности формы и строения их отдельных структур.

Впервые были изучены морфо метр и чес кие характеристики сперматозоидов овцебыка, сайгака и яка. Проведенный сравнительный анализ морфометрических показателей сперматозоидов у разных видов животных выявил видовые особенности. Обнаружены достоверные различия по общей длине, ширине, длине и плошали головки сперматозоидов.

Таил ш (а 13

Морфом ¡при ческа я характеристика сперматозоидов у разных видов жквошых

Инд животного Сайгак Парах Овцебык Бык Як Хряк | Кролик

Морфология сперматозоидов 1 / 1 \ ( V / 1

Длима сперматозоидов 54,6+0,34 59,7+0,12 64,5+0,44 71,210,22 72,910,24 57,310,19 56,910,23

Длина головки сперматозоидов 8,210,08 8,34+0,05 6,95+0,05 8,7510,06 8,7110,06 8,42+0,14 7,5110,05

Ширина головки сперматозоидов 4,54+0,06 4,5210,04 4,1110,04 4,84+0,05 4,6710,04 4,51+0,15 4,25+0,04

Площадь головки сперматозоидов 29,4+0,39 30,711,33 23,710,96 35,8+1,23 33,7Ц,68 31,6+1,17 28,710,83

Коэффициент округлости головки сперматозоидов 1,1910,014 1,1710,001 1,16+0,008 1,2610,001 1,2210,001 1,2910,001 1,1610,001

Параметры приведены в микронах

Одновременно была дана сравнительная характеристика ядер сперматозоидов этих видов животных. Результаты исследований приведены в таблице 14,

Таблица 14

Характеристика ндер сперматозоидов разных видов животных

Вид животных Плошадь Средняя яркость Средняя плотность Кол-во ДНК

Кролик 91,5 70,9 184,1 16,9

Баран 116,3 65,9 189,1 22,0

Хряк 101,2 72,8 182,2 18,4

Бык 108,9 60,9 194,1 21,1

Овцебык 76,2 63,5 191,5 14,6

Сайгак 109,2 73,6 181,4 19,8

Як 107,2 67,2 187,8 20,1

Как видно из таблицы 14 наиболее интенсивная окраска ядер сперматозоидов наблюдалась у быка, овцебыка и барана, а самые крупные ядра были у барана, сайгака и быка. Ядра сперматозоидов этих животных содержали наибольшее количество ДНК. При этом отмечено, что наибольшая конденсация хроматина у всех изученных видов наблюдается в участке, прилегающем к шейке сперматозоида ядра.

График 1

Зависимость между гаплоидным числом хромосом и количеством ДНК в сперматозоидах

Сравнительный анализ ядер сперматозоидов разных видов животных показал, что количество ДНК положительно коррелирует с числом хромосом (график I), Коэффициент корреляции между этими признаками равен 0,6.

3.5. Изучение возможности получения трансгенных сип иен после многолетнею хранения семени.

Тиражирование уникальных генотипов позволяет осуществлять искусственное осеменение. Однако в свиноводстве в связи с видовой особенностью воспроизводительной функции - потребность относительно большого объема семени для осеменения одной матки - эти, несомненно, прогрессивные методы не достаточно эффективны (Эрнст и др., 1994).

Проблему получения за короткий срок максимально большего числа потомков, в том числе от высокоценных и уникальных хряков, можно решить, применяя метод хирургического внутритрубного осеменения маток. При этом обеспечивается существенное, в сотни раз, сокращение потребности в семени в сравнении с обычным естественным или искусственным осеменением. Метод внутритрубного осеменения маток безальтернативен при незначительном запасе семени.

Данная технология была использована для получения трансгенного потомства с использованием семени, хранящегося более 10 лет в жидком азоте.

Сравнительная оценка за м орожен н о-оттая н но го семени трансгенных и интактных хряков но подвижности, сохранности акросом и выживаемости не выявила существенных различий этих показателей (таблица 15).

Таблица 15

Биологические свойства семени трансгеиных хряков после длительного хранения

Число Подвижность Сохранность

Группа животных животных, после акросом,

I) оттаивания,% %

Контрольная, интактная 8 38 ± 3,0 54,0 + 3

Трансгенные 1991 г. 9 38 ± 2,0 64,0 ± 5

Трансгенные 2002 г. 5 34 + 3,6 56,2 ±7

Как вскоре после замораживания, так и после 10-летнего хранения при температуре -^"С в жидком азоте, в оттаянной сперме имелось около 40% сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением и около 60% с морфологически нормальными акросомами. Следовательно, столь длительное хранение семени хряков в кр ио кон сервирован ном состоянии не повлияло заметно на его качественные показатели.

Основным показателем биологической полноценности как свежевзягой, так и криокон сервирован ной спермы является ее оплодотворяющая способность.

Спустя десятилетие после криоконссрвации семени возникла необходимость восстановления генотипов первого поколения трансгенных хрякон (таблица, 16).

Таблица 16

Результаты внутритрубного осеменения свинок спермой трансгенных хряков, хранившемся более 10 лет

Л хряка Число маток Опоросилось Родилось поросят

число % всего 113 Н11Х

хрячков емшок в т.ч. трансгенных

5963 2 1 ! 50±35 4 3 1 2

2975 9 3 33+16 10 6 4 3

6038 1 - - - - -

Итого 12 4 33+14 14 9 5 5

Из данных таблицы 16 видно, что, применяя метод внутритрубного осеменения свиноматок микролозами кр и »консервированного семени уникальных трансгенных хряков, хранившегося к течение 10 лет, нам удалось получить потомство. Из 12 осемененных свиноматок 4 опоросились, что составило 33%. При этом 35,7% потомков оказались носителями трансгена.

Таким образом, эти результаты указывают на возможность получения неограниченного числа потомков от производителя с использованием внутритрубного осеменения свиноматок и, наоборот, получения потомства от минимальных запасов семени, когда традиционные приемы оказываются безуспешными.

Для рационального использования генетических ресурсов уникальных свиней метод внутритрубного осеменения открывает перспективы в этом направлении.

Таким образом, создавая банк семени трансгснных животных, в частности хряков, можно сохранить наследственный материал в качестве резерва генетических ресурсов с определенными заданными генами.

3.6. Новые подходы в генетической трансформации животных.

3.6.1.Использование сперматозоидов в качестве вектора для переноса чДНК.

Многообещающим методом получения трансгенных животных на сегодняшний день является осеменение самок сперматозоидами, обработанными чДНК.

Результаты опытов, приведенные в таблице 17, показывают, что добавление чДНК к семени перед замораживанием при заблокированной охлаждением активности нуклеаз, существенно не повлияло на оплодотворяем ость. Это обстоятельство приводит к мысли, что чДНК, присутствующая в семени при замораживании, не связывается со сперматозоидами. Однако последующие опыты убедительно опровергли эту гипотезу.

Таблица 17

Влияние добавления чДНК к семени на оплодотворяемость

Показатели Осеменено маток Извлечено ооцнтови эмбрионов Оплодотворяемость, %

всего эмбрионов число ООН ИТ

Без инкубации с чДНК (контроль) 8 108 99 9 92±3

Инкубация с чДНК (опыт) 16 230 205 25 89±2

Добавление чДНК к замораживаемому семени выявило существенное влияние этого фактора на развитие эмбрионов (график 2).

График 2

Дегенерация эмбрионов, вызванная введением чДНК

%

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

Как видно ш графика 2, добавление чДНК к семени перед замораживанием к последующая инкубация при 0°С в течение 15-20 мин привели к появлению большого числа дегснерированных эмбрионов и высокой эмбриональной смертности. Поскольку такого явления не было в контрольной группе, эмбриональную смертность в данном случае однозначно можно объяснить действием экстр агенетнческой информации, заключенной в генной конструкции рСМУ1ас2.

При обработке сперматозоидов рекомбинантными ДНК в ряде случаев у доим плантационных эмбрионов кролика были выявлены характерные морфологические признаки алоптоза.

Причиной индукции апогстоэа в ранних эмбрионах может быть деградация как экзогенной, так и собственной ДНК в сперматозоидах. Данное

предположение основано на представлении о роли белка р53 в остановке и переключении клеточного цикла для репарации или дальнейшего развития клетки по пути апоптоза при появлении разрывов в хромосомной ДНК (Nelson, 1994).

Включение механизмов апоптоза у ранних эмбрионов в ответ на проникновение со сперматозоидом фрагментированной ДНК представляется вполне вероятным. Возможно, это является одним из способов защиты развивающегося организма от чужеродной генетической информации.

В экспериментах но переносу pCMVIacZ в ооциты кролика с помощью сперматозоидов выявлены задержки развития, дегенерация и гибель доим плантационных эмбрионов (график 3).

График 3

Влияние чДНК на развитие эмбрионов

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

число бластомеров

Стадия развития эмбрионов, вымытых через 44-46 ч после осеменения, должна соответствовать 8-16 бластомерам. Было отмечено, что в контрольной группе 86,9% эмбрионов находились на 16-клеточной стадии и 13,1% - на стадии 8 бластомеров. Это свидетельствует о нормальном развитии эмбрионов. В экспериментальной группе на стадии 16 бластомеров находилось только 50,7% эмбрионов, в то время как на стадии 8 бластомеров -24,9%, 4 бластомеров- 15,1%,и 1-2 бластомеров - 9,3% эмбрионов.

Как видно из представленных данных, инкубация с семенем генной конструкции перед замораживанием влияет на развитие полученных зародышей, что сопровождается явной задержкой развития эмбрионов экспериментальной группы (с рСМУ!ас2) в сравнении с контролем.

Прямыми тестами была выяснена возможность переноса сперматозоидами чужеродной генетической информации в ооциты с последующей ее экспрессией. Для этого в эмбрионах, полученных от

I

оплодотворения как нативными сперматозоидами, так и обработанными генной конструкцией рСМУ1ас2, была определена активность (3-галактозидазы -продукта экспрессии этого гена.

Таблица 18

Частота проявления экспрессии гена рСМУ1ас2 в эмбрионах

Показатели Всего исследовано эмбрионов Из них с положительной реакцией па га л а ктоз идазу

п % п %

Без инкубации с чДНК (контроль) 113 100 0 0

Инкубация с чДНК (опыт) 252 100 29 12+2"'

Данные таблицы 17 показывают, что 10-12% эмбрионов, полученных от семени, обработанного чДНК, имели положительную реакцию на 0-галаетозидазу.

Результаты проведенных экспериментов показали, что в процессе криоконсервацни семени генетическая конструкция рСМУ1ас2 была связана со сперматозоидами и перенесена в яйцеклетки в процессе оплодотворения с последующей экспрессией.

Количество эмбрионов с положительной реакцией на ^-галактоз ид аз у было значительно меньше, чем число дегенерированных эмбрионов. Этот факт позволяет предположить, что для гибели эмбриона в ряде случаев достаточно проникновения чДНК без наличия экспрессии.

Вместе с тем, некоторые эмбрионы, положительно прореагировавшие на присутствие продукта экспрессии, не были дегенерированы, нормально развивались, что указывает на возможность использования сперматозоидов, трансформированных в процессе замораживания, в качестве естественного вектора при получении трансгенных животных.

С другой стороны, возникает необходимость зашиты сперматозоидов от чужеродной генетической информации и, соответственно, снижения эмбриональных потерь. Современная технология искусственного осеменения не позволяет получать стерильное семя, а искусственная санация его не избавляет от чДНК. Кроме того, чужеродная генетическая информация заносится в семя при его технологической обработке,

3.6.2. Введение ретро вирус пых конструкций в семенники животных.

Последние годы наряду с введением чужеродных генов в эмбрионы и ооциты млекопитающих особый интерес представляет трансформация половых клеток самцов, т.к. сперматозоиды сами по себе являются природными векторами, доставляющими генетический материал в яйцеклетку.

Одним из эффективных методов переноса ДНК в сперматозоиды может служить использование ретровирусных векторов.

Ретровнрусныс конструкции были введены и семенники кроликов, хрякоп, баранов и быков (шбл низ 19).

Таблица 19

Результаты виеденнн рстронирусо» в семенннкн животных

Показатели Подвижность Подвижность 11ЦР-анализ

семени до семеин после па наличие

введение, % введение, % конструкции

Кролики 80 20 +

Хряки 80 30 -

Бараны 90 50 -Ь

Быки 90 20 +

В результате Г1ЦР - анализа было доказано наличие рстропнрусной генной конструкции к семени кроликов, бзраноп и быков. Возможно, что рстровнрус интегрировался в клепки - предшественники сперматозоидов, обуславливая тем самым длительное наличие ДНК генной конструкции в сперме.

Гистологические срезы семенников быка, после введение ретро в и рус нон конструкции

Окраска гематоксилин-эозин ом (ув. 10 х 40)

Рнсмюк 1

Л) нз шстосрем видно нормальное состоим и* структур семейных

канальиев. Сперма! огенм не нэpvшeн.

Б) На с рек видно начало разрушения парен шмы ссменннка

На рисунках 11 и Г видно ра1рушение слоев смерчанненныи тканей семенника я ре)улыа1е нньекини регровируснон конструкции.

Данные таблицы 19 показывают, что введение ретровируса отрицательно действует на подвижность сперматозоидов. В некоторых случаях в эякуляте сперматозоиды отсутствуют. Это, возможно, связано с тем, что при многократной инъекции нарушается гематотестикулярный барьер, что в конечном итоге приводит к нарушению сперматогенеза (рис. I)

З.б.З. Оптимизация технологии временного блокирования сперматогенеза у кроликов.

Трансплантация модифицированных первичных половых клеток в семенник стерильного самца является перспективным принципиально новым подходом в биотехнологии.

Стволовые клетки сперматогоиии инициируют и поддерживают сперматогенез в семенниках. Изучена возможность стерилизации самцов кроликов с целью дальнейшей трансплантации в их семенники модифицированных первичных патовых клеток.

Для стерилизации самцов использовали диметилфармамид + бусулфан (Д+Б), 40 мкг/мл. Анализ гистологических срезов семенников показал начало процесса блокирования сперматогенеза через неделю после введения Д+Б. В эякуляте присутствовали мертвые сперматозоиды. Отмечена деструкция осадка эякулята.

Через три недели на гистосрезах обнаружено отсутствие сперматозоидов и сперматнц и отмечался эффект разрушающего действия введенного фактора. В эякуляте сперматозоиды отсутствуют. Также наблюдалась деструкция осадка эякулята.

Спустя 7 недель структуры канальцев восстанавливалась. Юные формы сперм ато ген но го эпителия выглядели вполне нормально, хотя отмечалось отсутствие сперматозоидов и спермагид. В эякуляте сперматозоиды отсутствовали. Отмечена деструкция осадка эякулята.

С 14-й недели начинался процесс восстановления сперматогенеза, но появление сперматозоидов в эякуляте наблюдалось только на 15-м месяце после обработки. В дальнейшем идет полное восстановление воспроизводительной функции и отмечается появление сперматозоидов в эякуляте.

3.7. Цитогенетические исследования как метод характеристики генетических ресурсов.

3.7.1. Усовершенствование методики кари оптирования различных видов животных с использованием прикладных компьютерных программ.

Цитоге нети чески е исследования играют большую роль в решении ряда теоретических и прикладных вопросов. В том числе комплекс мероприятий, связанных с сохранением генетических ресурсов, включает в себя цитогснетическую аттестацию самцов, используемых для криобанка семени.

Однако применение цитогенетики в практике животноводства в России еще не вышло за рамки лабораторий научных и учебных центров. Основная причина этого — низкая технологичность используемых в нашей стране методов изучения хромосом. Кроме того, отсутствует программное обеспечение для анализа кэрнотнпов сельскохозяйственных животных.

Анализ препаратов хромосом является наиболее трудоемким процессом. В связи с этим был разрабоган ряд подходов, позволяющих упростить классический процесс кариотипированця. За основу были взяты система Image Scope 1 и Adobe Photoshop. Принципиальная схема кариоти пировэ н и я показана на рисунке 2.

м

Рис. 2 Схема карн оптировании с применением пакетов прикладных программ Image Scope I н Photoshop

Система Image Scope 1 обеспечивает получение, передачу изображения на компьютер с последующей его записью и обработкой (подсчет и измерение хромосом).

Однако Image Scope I не позволяет напрямую проводить кариоти пирование. Эта проблема решается с помощью Photoshop. Кариотипирование ведется в двухоконном режиме («Окна - Без перекрытия»), В одном из окон открыт исходный файл, во втором - рабочий, в котором создается кариотип.

При массовом исследовании подсчет хромосом проводится визуально. Используя Image Scope 1, подсчет можно проводить на дисплее или в автоматическом режиме. Процесс кариотип и рования, в случае необходимости, корректируется по морфометрическим показателям через рабочий файл и Image Scope 1.

3.7.2. Изучение и сравнительный анализ кариотипов яка, крупного рогатого скота, овцебыка it овец.

Изучены хромосомные наборы яка, крупного рогатого скота, овцебыка и овец. Проведенные исследования четырех видов полорогих показали наличие существенных хромосомных различий.

Кариотип яка (Bos mutus) по числу и морфологии хромосом идентичен кариотипу крупного рогатого скота. Содержит 29 пар акроцентрических аутосом, образующих по своей величине плавно убывающий ряд, крупную субметацентрнческую Х-хромосому и Y-хромосому - мелкая хромосома субметацентрической формы, диплоидное число равно 60 (рис. 3).

1 (10 (liUfl fift «Й £

и 7 fid но м 06 Oft 12

ЛЙ 13 Art (1(1 flfl 00 ft ft IS

Дй 19 00 /If: no Tift & Л 24 _

Oft 25 ft ii <i л Aft а л 29 г. XV

Рис. 3. Кариотип яка. Бык из кабардинской популяции. Окраска по Романовскому-Гимза. Предобработка 5-бром-дезоксиуридином и бромистым эгид и ем.

Кариотип крупного рогатого скота содержит 29 пар акроцентрических аутосом. Полагают, что он наиболее близок к пред ко вой форме. Мужская и женская половые хромосомы метацентрические {рис, 4).

АЛ . • м и и Л Л -I и ги\ Ъй »

у 1;и А ¡\ Ь ¡г ай. и и

11

ЛЙ А1' ай" N 11 и А Л и

и II

г Л 19 Л 'Л »11 Йгй 'ЙП Ли >4

Л г. Л Л V . м и Ч V

а 19

Рис. 4. Кариотип крупного рогатого скота. Бык. Предобработка 5-бром-дезоксиуридином н бромистым этидием. Окраска по Романовскому-Гимза.

Овцебык (Оу1Ьоз шозсЬаШя) является единственным представителем трибы Ov¡bov¡ni. По хромосомному набору он существенно отличается от этих видов. Диплоидное число хромосом у овцебыка равно 48. Из них 6 нар аутосом м етацентрич ее кие, а 17 - акроцентрики. Акроцентрики по величине образуют плавно убывающий ряд. Женская половая хромосома субтело центрическая, У-хромосома— метацентрик(рис. 5),

ЙКШ м

п« 6 4

Ш ЯЙ 1Ш Об ■1

оп 12 ЛП ап ап Лг* 16

ЛЛ 17 по. Од лт> пл 2д

ал 22 АЛ и й?

Рис. 5. Кариотип самца овцебыка из таймырской популяции. Предобработка 5-бром-дезоксиурндином и бромистым этидием. Окраска по Ром ановском у- Ги мза.

Кариотип овцы содержит 27 пар хромосом. 3 пары аутосом метацентрические, 23 лары акроцентрпки. У-хромосома - метацентрик, X-хромосома - крупный акроцентрик. По характеру дифференциальной изчерченности кариотип овцы сходен с хромосомным набором крупного рогатого скота. Это связано с тем, что кариотипы полорогих произошли от общей предковой формы (рис. б).

II ну

ОП ЯП

оп и а

ч

ле па пг й*

па ПО м

13

оо Г;п до 1Я

л л л л л о 23 ГГ

л ** 2Л • ' ( " XV

Л л

24

Рис. 6. Кариотип домашней овцы. Самец. Предобработка 5-бром-дезоксиуридииом и бромистым этиднем. Окраска по Романовскому-Гимза.

Анализ дифференциальной структуры хромосом овцы свидетельствует, что хромосома 1-й пары у О. апеэ Ь. соответствует 1 и 3; 2 - 2 и 8; 3 - 5 и И парам хромосом В. (аигш Ь. и С. Ыгсиз Ь. (Яковлев А.Ф., 1989).

Как отмечает Л.С. Билтуева (1995), овцебык имеет типичный для козьих рнсунок 9-й, 14-й и X - хромосом. На основании анализа дифференциальной окраски хромосом полагают, что формирование метацентриков у овцебыка произошло в результате центрических слияний базовых хромосом, соответствующих 1 и 18; 2 и 22; 5 и 27; 11 и 23; 25 и 29; 24 и 28 хромосомам крупного рогатого скота.

Считают, что эволюция кариотипов в семействе полорогих шла путем центрических слияний. Проведенные нами сравнение генных карт этих видов по 484 общим генам выявило 54 группы сцеплсния, что соответствует 26 перестройкам. Разумеется, требуется дальнейшее уточнение этого вопроса. Однако ясно, что кариологические различия между В. гаитиэ Ь. и О. алеэ Ь. не могут быть сведены лишь к наличию трех робертсоновских транслокацнй.

Очевидно, это справедливо и для других видов, входящих в семейство полорогих. Из-за отсутствия генных карт у яка и овцебыка сравнительный анализ их хромосомных наборов проведен только по морфологии и числу хромосом.

3.73. Анализ хромосомных аберрации у трансгенных животных.

На современном этапе развитии биотехнология, позволяющая целенаправленно нарабатывать ДНК как носителя генетической информации, открывает новые перспективы в животноводстве.

В последние годы в нашей стране проводятся работы по получению трансгенных животных с целью направленного изменения их продуктивных качеств и создания животных-продуцентов биологически активных веществ. Известно, что микроинъекиии чужеродной ДНК обуславливают дестабилизацию генома потомства (в ряде случаев трансгенез сопровождается хромосомными перестройками). Это свидетельствует о необходимости изучения цитогенетичсскнх нарушений у трансгенных животных,

3.7.3.1. Изучение влияния •(ДНК на стабильность кари о гни а трансгенныхкролнков.

Хромосомный набор у всех 55 опытных животных соответствовал видовой норме и содержал 44 хромосомы. Однако у значительной части из них был обнаружен повышенный уровень клеток с хромосомными аберрациями (рис. 7).

Рис. 7. Аберрации хромосом у кроликов, трансгснных по МСР а — хроматидные разрывы; б — изохроматидний разрыв; в — дииентрик.

Хромосомные аномалии у этих животных представлены, главным образом, хрочатидными и изохрочатидными пробелами и разрывами. Доля дн-центриков составила около 3% от числа аберраций. Около 3744 пораженных клеток несли множественные аберрашш, у 2 7,59 & были выявлены изохромитидные аберрации, Примерно 11% клеток одновременно содержали и множественные перестройки и изохрочатидные аберрации.

Отмечена определенная закономерность в распределении аберраций по хромосомам набора. В 45,3% случаев были поражены хромосомы 1 пары. Аномалии затрагивали как короткое, так и длинное плечо. Точки разрывов

а

располагались преимущественно в зонах, соответствующих светлым бендам, выявляемым при инкубации с 5 бром 2 дезокнуридином (5'BrdU) и бромистым этидием, в прителомерных и прицентромерных районах обоих плеч 1-й хромосомы. Это показывает наличие связи хромосомной нестабильности с особенностями нуклеотидного состава определенных участков ДНК,

3.7.3.2. Изучение влияния чДНК на стабильность карнотипа трансгенных свиней.

Исследовали свиней второго поколения, трансгенных по гену соматолиберина, полученных методом внутритрубного осеменения глубокозамороженным семенем, хранившимся 10 лет. Проведено двукратное взятие материала от 6 хрячков Fj и 5 контрольных аналогов. Анализ показал наличие нестабильности хромосомного набора у трансгенных животных (рис. 8,9).

{<1\\ти

1 * > •

)f и

* в б

tt Г- • s к»*

I f W р (1

If H ел Л* шш l *

и u "

Рис, 3, Структурные хромосомные нарушения у трансгенного хряка .450438.

Ml; 'diS5«О

I 1 » s

55 Sï 8

Ъ*Ь Ш га хл

» и

88АН(04nn>J в.

I» К W

Рис, 9, Структурные количественные нарушения хромосом у трансгенного хряка.

На рисунки 8 показан кариотип трансгенного хряка с множественными хромосомными аберрациями: а - ли центрическая хромосома, возникшая при слиянии хромосом 2-й и 9-й пар; б - ацентрический фрагмент; в -изохроматидный разрыв в длинном плече хромосомы 7; г - аберрантная хромосома неясной природы.

На рисунке 9 приведен кариотип трансгенного хряка с моносомией по хромосоме 2-й нары — а и дополнительная хромосома неясной природы. — б.

При первом взятии доля клеток с аберрациями в среднем составила более 40%. Спустя три месяца частота аберрантных клеток уменьшилась, но оставалась выше, чем в контроле: 14,5 и 7,5%, соответственно. Известно, что для молодняка характерен более высокий уровень хромосомной изменчивости. У сибсов доля аберрантных клеток на момент второго взятия была близка к уровню этого показателя в контроле, хотя на начало исследования она почти в 3 раза превосходила контрольный уровень. Аналогично изменялось и число аберраций на клеггку.

Результаты этих исследований свидетельствуют о дестабилизирующем действии экзогенов на ДНК хозяина. Таким образом, необходимым условием сохранения и рационального использования трансгенных животных является оценка полноценности генома, в том числе на хромосомном уровне.

выводы

]. Усовершенствованная технология криоконсервации семени кроликов позволяет повысить сохранность, оплодотворяющую способность сперматозоидов и многоплодие. Разработана крнопротектнвная среда следующего состава: лактоза-2,17 г, лимонная кислота-!,52 г, Трис-2,74 г, глнцерин-2,0 мл, ДМСО-2,5 мл, желток куриного яйца-15 мл, вола биднстиллированная-100 мл,

2. Создан банк семени гомозиготных и гемизиготных трансгенных кроликов по МСР и В1ЛЛ Дана оценка кри окон сервированного семени после оттаивания: подвижность сперматозоидов составляла 25-30%, при этом сохранность акросом была 60*65%. Получено жизнеспособное потомство от замороженного семени трансгенных кроликов из кр лобан ка.

3. Установлено, что сперматозоиды трансгенных хряков, хранившиеся 10 лег в жидком азоте, не потеряли своей биологической полноценности и сохранили оплодотворяющую способность- Из 12 внутритрубно осемененных свиноматок опоросилось 4, что составило 33%. При этом наследование трансгена было 35,1%.

4. Создан банк семени трансгенных баранов. Изучена биологическая полноценность сперматозоидов. Установлено, что после криоконсервации и оттаивания активность сперматозоидов у трансгенных баранов составляла 45%, а сохранность акросом — 68%.

5. Создан банк семени трансгенных хряков б поколений (Рз.Рз, F4.Ps, Ре.Р?)-Дана оценка биологической полноценности их сперматозоидов. После процесса замораживания-оттаивания активность составляла 35-45%, сохранность акросом была 52-65%.

6. Односторонняя кастрация самцов не приводит к снижению репродуктивной функции и может быть использована в качестве приема рационального использования и сохранения генетических ресурсов.

7. На основе разработанной технологии получения и криоконсервации эпидидимадьного семени с целью сохранения и рационального использования генетических ресурсов создан банк семени редких, уникальных и исчезающих видов животных.

8. Подвижность замороженно-оттаяиных эпидиднмал ьных сперматозоидов кролика составляла 30%, при этом сохранность акросом была 68%. Получено потомство от заморожен но-оттаян ной эпидидимальной семени кроликов.

9. Проведен сравнительный анализ морфо метрических показателей сперматозоидов разных видов животных. Обнаружены достоверные различия по обшей длине, ширине, длине и площади головки сперматозоидов. Впервые дана характеристика видовых особенности сперматозоидов сайгака, овцебыка и яка.

10. В результате изучения кариотипов и цитохимического анализа выявлены видовые особенности, а также установлена положительная связь между числом хромосом и содержанием ДНК в сперматозоидах у разных видов животных.

11. При криоконсервацни семени кроликов добавленная чДНК способна связываться со сперматозоидами и проникать в ооциты при оплодотворении с последующей ее экспрессией.

12. Связанная со сперматозоидами чДНК не влияет отрицательно на их оплодотворяющую способность. Перенесенная со сперматозоидами в ооциты чДНК задерживает развитие зародышей, вызывает дефрагментацию эмбрионов и раннюю эмбриональную смертность.

13. В результате ПЦР-анализа установлено наличие ретровирусной генной конструкции в семени кроликов, баранов и быков. Введение ретровирусной конструкции отрицательно действует на подвижность сперматозоидов, которая снижается до 20% при исходной подвижности 80-90%.

14. Анализ гистологических срезов семенников кроликов показал, что процесс блокирования сперматогенеза начался через неделю после введения димстнлфармамид+бусулфана. С 14 недели начинается процесс восстановления сперматогенеза. Появление сперматозоидов в эякуляте наблюдается на 15 месяце после обработки.

15. Разработанный метод использования прикладных компьютерных программ позволяет в значительной мере повысить эффективность нитогенети чес кого анализа.

16. Установлено, что интеграция чужеродных генов у кролика и свиньи сопровождается значительным повышением уровня хромосомных нарушений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. С целью повышения эффективности н расширения возможностей селекционно-племенной работы в кролиководстве предлагается технология криоконсервации семени кроликов, позволяющая получать высокую результативность осеменения.

2. Для сохранения и рационального использования свиней с уникальными генотипами предлагается метод внутритрубного осеменения свиноматок.

3. Рекомендуется технология получения и криоконсервации эпидидимального семени животных в целях сохранения генетических ресурсов редких, уникальных и исчезающих видов животных.

4. В целях сохранения и рационального использования редких, уникальных и исчезающих видов животных рекомендуется использовать метод односторонней кастрации животных.

Сиисок опубликованных работ ид теме диссертации.

]. Багнров В.А. Новый метод криоконсервации семени кроликов // Зоотехния. 1996. №6. С. 28-29.

2. Кононов В.П., Багнров В.Л. О некоторых причинах эмбриональной смертности у животных // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук 1996. ЛгЙ. С.37-38.

3. Эрнст Л.К., Кононов В.П., Багнров В.А., Зыкунов Н.П., Некрзсов A.A., Шатайло В.Н., Чабан ИМ. Трансгенных поросята от спермы, хранившейся в течении десяти лет // Свиноводство. 2002, № 3. С.23-24.

4. Кленовицкий U.M., Багнров В.А., Иолчиев Б.С. Доцев A.B. Вопросы прикладной цитогенетики сельскохозяйственных животных // Достижения науки итехники АПК. 2003. № 10. С.17-19,

5. Багнров U.A. Технология криоконсервации семени кролика 11 Достижения науки и техники АПК. 2004. № 9. С.35-37.

6. Кленовицкий П.М., Багнров П.А. Сохранение биоразнообразия и характеристика сиермиев разных видов животных // Аграрная наука. 2004. .VolO. С.26-28.

7. Кленовицкий П.М., Марзанов Н.С., Багнров В.Л,, Марзанов ГО.С., Абдул Ахад Бисвас А.К.М. Сравнение генных карт и анализ дивергенции кариотипов некоторых полорогих // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2004. №3. С.72-75.

8. Багнров В.А., Эрнст J1.К., Кленовицкий П.М., Зиновьева H.A. Сохранение генетических ресурсов редких, исчезающих и уникальных видов животных // Цитология 2004. Том. 46. Йв9. С.767-768.

9. Кленовицкий П.М., Багнров В.А., Марзанов Н.С., Зиновьева H.A. Генные карты сельскохозяйственных животных. Дубровицы. 2003. 91с.

Ю.Клсновицкий П.M Пики шов A.A., Иолчиев B.C., Багнров U.A., Марзанов Н.С. Введение в прикладную цитогенетику одомашненных животных. Дубровицы. 2003. 56с.

M .Кленовицкий П.M Абдул Ахад Бисвас А.К.М., Марзанов Ю.С., Марзанов Н.С., Багнров В.А. Сравнительный анализ генных порядков домашней овцы (Ovis aries L.) и крупного рогатого скота (Bos taurus L.). Дубровицы. 2003, 48с.

12.Кленовицкий П.М., Багнров В.А,, Марзанов U.C., Насибов М.Г. Генетика и биотехнология в селекции жнвогных. Москва. 2004. 238с.

13.Кленовицкий Г1.М, Никишов A.A., Иолчиев B.C., Багнров В.А. Хромосомы одомашненных животных и родственных им видов, Дубропици, 2002. 44с.

14.Кленовицкий U.M., Багнров В.А., НтГюло Ж.В., Допев A.B., Иолчиев B.C. Использование прикладных и pot ра мм обработки изображений, совместимых с Windows, в тштотенетнчсскнх исследованиях. Дуброшты.. 2002. 20с,

15.3ыкунон H.H., Багнров U.A., Кононов В.П., Некрасов A.A., Голыше» H.A. Вашкеев Е.Д., Шатайло В.Н., Чабан U.M., Клейко Н.Г., Эрнст JI.K. Метод внутритрубного осеменения свиней. Методические рекомендации. Выково-2003, 24с.

16.Багаров В.Л., Кленовицкнй П.М., Эрнст JT.K. Мутационные изменения у трансгенных свиней. Материалы международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных». Дубровицы. 2003. С.80-83.

17.B¡svas Д.A.A.K.M., Klenovitsky P.M., Bagirov V.A, Marzanov N.S. Syntenic maps construction of domestic sheep (Ovis arics L.). Материалы международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных». Дубровицы. 2003. С.153-155.

18.Баг»фов В. А., Зыку нов Н.П., Кононов В.П., Эрнст JI.K. Метод внутритрубного осеменения свиноматок. Материалы международной научно-практической конференции «Роль и значение искусственного осеменения с.х. животных XX и XXI веков». Дубровицы. 2004. С. 149-152.

19.Bagirov V.A, Exogenous DNA as the reason of embryonic mortality at animals. Материалы международной научно-практической конференции «Роль и значение искусственного осеменения сельскохозяйственных животных XX и XXI веков». Дубровицы. 2004. С.217-222.

20. Баги ров В. А., Эрнст JI.K,, Грезина Н.М., Кленовицкнй П.М., Зиновьева H.A. Сохранение генетических ресурсов разных видов животных и изучение особенностей ядер их сперматозоидов. Материалы международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», Дубровицы. 2004. С.129-134.

21.Багирон В.А. Криоконсервапия семени кролика. Школа- практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных». Дубровицы. 2002. С.7-12.

22.Кленовицкнй П.М., Баги ров В.А., Доцев A.B. Получение хромосомных препаратов и кари оптирование кроликов. Школа- практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных». Ду бровицы. 2002. С.62-66.

23.Bagirov V.A., Kononov V.P.. The possibility of exogenous DNA penetration into spermatozoa at semen cryopreservation. Book of Abstracts of die 51ft Annual Meeting of the EAAP. The Hagua. Netherland. 2000. P. 19.

24.ИОЛЧИСВ B.C., Кленовицкнй П.М., Баги ров В.Л., Гришин В.Н. Компьютерная обработка изображений в ш но генетике животных. Материалы международной научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства». Быково. 2002. Вып.8. С.228-229.

25.Багнров В.А. Возможность проникновения экстрагенсти ческой информации в сперматозоиды при криоконссрвации семени. 11-международная конференция «Актуальные проблемы биологии в животноводстве». Боровск 1995. С. 169-170.

26.Багнров В.Л., Кононов В.П. Сперматозоиды как векторы для переноса чужеродного генетического материала. Современные проблемы воспроизводства стада сельскохозяйственных животных и задачи кадрового обеспечения. Быково. 1996. С.21-22.

27,Багиров В.А. Индукция суперовуляции у крольчих. Научно-практическая конференция «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково. 1997, С.111-113.

28,Багнров В.А., Новые приемы получения трансгенных животных. Научно-практическая конференция «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». Быково. 1998. Часть I. С,95-97.

29,Багнров В, А., Кононов В.П. О возможности проникновения экстрагенетической информации в сперматозоиды при криоконсервации семени. Международная научно-практическая конференция. «Актуальные проблемы биологии в животноводстве». Боровск. 1997. С.272-278.

ЗО.Эрнст Л,К., Зыкунов Н.П., Баш ров В.А., Некрасов A.A., Шатанло В.Н., Чабан И.М. Трансгенные поросята от семени, сохраненного в течение десяти лет. VIII-Международная научно-практическая конференция «Перспективы развития свиноводства в XXI веке», Быково, 2001. С.151-153,

31 .Кононов В.II., Зыкунов Н.П., Багнроп В.А,, Ондзр A.A. Экстрагенетическая информация, как возможная причина эмбриональной смертности у свиней. VIll-Между народная научно-практическая конференция «Перспективы развития свиноводства в XXI веке». Быково. 2001, C.147-I50.

32.Зыкунов Н.П., Некрасов A.A., Багнроп В.А. Внутритрубное осеменение свиноматок микролозам и семени хряка. Материалы юбилейной международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию РАМЖ по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». Быково. 2004, 0,186-190,

33,Bagir«v V.A., Klenovitsky P.M., Zinoveva N.A, Analysis of chromosome aberrations in transgenic pigs and rabbits. Book of Abstracts of the 54lh Annual Meeting of the EAAP. Rome, Italy. 2003. P. 14,

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н, г. Дубровмцы тел, 8(27)65-14-24, 8(27)65-14-07

Слано в набор 22.12.2004 Заказ N° 37. Печ. л,2,1 Тираж 150 экз.