Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Переработка генетически модифицированного картофеля на биопродукты

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Переработка генетически модифицированного картофеля на биопродукты"

На правах рукописи

005"

Ягофаров Дамир Шамилевич

ПЕРЕРАБОТКА ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО КАРТОФЕЛЯ НА БИОПРОДУКТЫ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

гвм\?ш

Воронеж - 2012

005012821

Работа выполнена в Казанском национальном исследовательском технологическом университете

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Канарский Альберт Владимирович

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Болотов Владимир Михайлович зав.кафедрой ( ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»)

доктор технических наук Гуславский Александр Игнатьевич ведущий научный сотрудник (ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности»)

Ведущая организация : ФГАОУ ВПО «Казанский

(Приволжский) федеральный университет»

Защита диссертации состоится «04» апреля 2012 года в Ю00 ч на заседании диссертационного совета Д 212.035.06 при ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по адресу: 394036, г.Воронеж, пр-т Революции, д. 19

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»

Автореферат разослан «2» марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Г.П.ІІІуваева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Экономическая эффективность биотехнологического производства прежде всего определяется доступностью и стоимостью сырья. В современном производстве биопродуктов микробиологического синтеза в качестве сырья используют преимущественно зерновые культуры. Следует отметить, что зерновые культуры как источник крахмала и белка крайне необходимы для получения пищевых и кормовых продуктов, поэтому применение зерновых культур в биотехнологическом производстве приводит к дефициту этого сырья на мировом рынке и, соответственно, повышению его стоимости, что в конечном итоге сказывается на стоимости продуктов питания.

Более дешевым сырьем для производства биопродуктов является неоправданно забытый картофель, содержащий в своем составе преимущественно крахмал. Однако, вовлечение картофеля как сырья в биотехнологическое производство требует поддержания его устойчивого урожая.

Россия является одной из главных картофелеводческих стран мира. Однако, наблюдаются огромные потери урожая картофеля, особенно в южных регионах. Это происходит из-за поражения картофеля колорадским жуком, и в ряде областей страны нашествие этого вредителя сравнимо со стихийным бедствием. Наиболее перспективным сегодня представляется решение этой проблемы биологическими методами защиты картофеля и прежде всего методом генной инженерии, направленным на получение ГМ картофеля.

Несмотря на перспективу воспроизводства ГМ картофеля, этого нового и перспективного технического сырья, научного обоснования его эффективного применения и, прежде всего, крахмала, выделенного из ГМ картофеля, в биотехнологической промышленности отсутствует. Учитывая положительные экономические аспекты воспроизводства ГМ картофеля, проведение научных исследований по определению пригодности ГМ картофеля в биотехнологическом производстве является актуальным и своевременным.

Цель и задачи исследования. Научное обоснование комплексной переработки ГМ картофеля на биопродукты.

Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:

оценка технологических свойств ГМ картофеля для биотехнологической переработки;

- изучение физико-химических свойств крахмала ГМ картофеля, определяющих его пригодность для получения биопродуктов;

- определение возможности получения биопродукгов ферментативным гидролизом крахмала ГМ картофеля;

разработка технологии получения биопродуктов микробиологической конверсией вторичных ресурсов переработки ГМ картофеля;

- получение амилозы из крахмала ГМ картофеля.

Научная новизна. Впервые показана возможность применения ГМ картофеля сортов Луговской плюс и Невский плюс для переработки на биопродукты. Установлено, что морфологические и реологические свойства крахмала ГМ картофеля соответствуют эффективному его применению в биотехнологии.

Установлено, что эффективность ферментативного гидролиза крахмала ГМ картофеля до глюкозы превышает эффективность ферментативного гидролиза крахмала контрольного картофеля. Показана возможность культивирования мицелиального гриба р. Тгк1юс1ггта скрегеИит 302 на питательной среде, полученной из мезги и сока, которые образуются при переработке ГМ картофеля. Установлены высокие адсорбционные свойства клеточной стенки мицелиального гриба р. Тпскоёегта аярегеИит 302 по отношению к Т-2 микотоксину. Показано, что амилоза эффективно выделяется из крахмала ГМ картофеля методом электродиализа.

Практическая значимость. Показана целесообразность использования генетически модифицированного картофеля в биотехнологии. Установлено, что крахмал ГМ картофеля по физико-химическим свойствам пригоден для переработки в биопродукты.

Выход глюкозы из крахмала ГМ картофеля до 5 % выше выхода глюкозы из крахмала контрольного картофеля. Показана возможность снижения теплоэнергетических затрат в биотехнологическом производстве на подготовку субстратов из крахмала ГМ картофеля по сравнению с крахмалом из контрольного картофеля.

Установлена целесообразность биотехнологической конверсии вторичных ресурсов переработки ГМ картофеля мицелиальным грибом р. Тпскойегта азрггеНит 302 с последующим получением из этого гриба адсорбента микотоксинов и белкового кормового продукта. Разработан технологический регламент на опытное производство адсорбента микотоксинов из мицелиального гриба р. ТпсНойегта шреге11ит 302. Проведена опытная выработка адсорбента микотоксинов и его испытание на лабораторных животных.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на X и XI международных конференциях молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 20092010), XVII международной конференции по крахмалу, Москва-Краков (Москва), научной сессии (Казань, 2011).

Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту:

- установленные технологические свойства ГМ картофеля и физико-химические свойства крахмала ГМ картофеля, определяющие их пригодность для получения биопродуктов;

- результаты исследования ферментативного гидролиза крахмала ГМ картофеля;

- результаты исследования по выделению амилозы из ГМ картофеля методом элекгродиализа;

- результаты исследования микробиологической конверсии вторичных ресурсов переработки ГМ картофеля;

- разработанная технология адсорбента микотоксинов и кормового белка из биомассы гриба р. ТпсЬойегта азрегеИит 302.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и библиографического списка, содержащего 156 источников. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста и включает в себя 21 таблиц, 23 рисунка и 5 приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснованы актуальность и определены основные направления исследования.

Глава 1. Обзор литературы. Проведен обзор и анализ публикаций, касающихся характеристики крахмалосодержащего сырья, используемого в биотехнологической промышленности. Отмечено, что применение картофеля и крахмала, выделенного из него, более целесообразны при производстве биопродуктов по сравнению с применением в качестве сырья зерновых культур. Рассмотрены особенности технологии получения биопродуктов из крахмалосодержащего сырья и крахмала, а также особенности технологии биопродуктов из вторичных ресурсов переработки картофеля.

Глава 2. Материалы и методы исследований. В качестве объектов исследования использовался генетически модифицированный картофель сортов Луговской плюс и Невский плюс, прошедшие государственную регистрацию, внесенные в государственный реестр и разрешенные для изготовления на территории РФ, ввоза на территорию РФ и оборота [Свидетельство Роспотребнадзора № 77.99.26.11.У.6088.7.06 от 7 июля 2007

г.] и исходные сорта Луговской и Невский в качестве контрольных образцов. Сорта Луговской плюс и Невский плюс зарегистрированы в государственном реестре охраняемых селекционных достижений и отличаются от любого другого общеизвестного сорта, соответствуют требованиям однородности и стабильности [патент на селекционное достижение № 4983 от 02.12.2009. Картофель Луговской плюс; патент на селекционное достижение № 4981 от 02.12.2009. Картофель Невский плюс]. Образцы картофеля представлены Центром «Биоинженерия» РАН группой трансформации растений, г. Москва.

Технологические свойства картофеля, получение крахмала, определение состава крахмала, картофельной мезги, сока и биопродуктов проводили стандартными методами.

Морфологические свойства крахмала определялись методами оптического рассеяния света на приборе Coulter LS 130 (Beckman Coulter, High Wycombe, U.K.) и оптической микроскопии на приборе Olympus ВХ-50 (Olympus, Japan). Вязкость крахмала определяли на вискозиметре Bohlin Visco 88 (Bohlin Reologi UK Ltd.). Студнеобразующую способность крахмала определяли по методике Richard F. Tester и William R. Morrison на спектрофотометре DU-70 (Beckman Coulter, USA). Энтальпия желатинизации и ретроградации определялись на дифференциальном сканирующем калориметре SEIKO DSC 6200 (Seiko Instruments Inc.,Shizuoka, Japan).

Ферментативный гидролиз крахмала проводили ферментными препаратами я-амшгаза SPEZYME FRED-L, пуллуланаза OPTIMAX L-1000 и глюкоамшша DISTILLASE L400+ компании Genencor International, USA.

Крахмал на амилозу и амилопектин разделяли методом электродиализа на экспериментальной установке, созданной при участии автора.

При биотехнологической переработке мезги и сока ГМ картофеля использовался штамм мицелиального гриба р. Trichoderma asperellum 302. Оптимизацию компонентного состава питательной среды для культивирования гриба проводили традиционными микробиологическими методами, основанными на законах, описывающих протекание фундаментальных процессов микробиосинтеза - накопление биомассы и изменение содержания компонентов - углеводов в питательной среды в периодической культуре.

Для получения посевного материала (инокулята) культуру гриба выращивали на сусло - агаре при 28 °С в течение 7 суток и далее при комнатной температуре в течение 5 суток. Засев колб проводили 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой.

Культивирование гриба проводили в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 500 мл, содержащих 100 мл жидкой среды, составленной из картофельной мезги и сока. Состав варьировали по

содержанию углеводов с добавлением солей калия и фосфора; рН 5.0. Колбы инкубировали на качалке при 28 °С и 200 об/мин до 120 ч.

Гидролиз белков биомассы грпба осуществляли препаратом Protex 6L во встряхивателе с режимом термостатирования 60 °С в течение 12 часов при рН 8.5. Гидролизованные белки и клеточная стенка разделялись центрифугированием. Клеточная стенка дополнительно промывалась водой. Затем клеточную стенку высушивали конвективно при температуре 105 °С до влажности не более 10 %. В клеточной стенке определяли белок по Барнштейну согласно стандартной методике и D - глюкозамин колориметрическим методом Эльсона - Моргана.

Адсорбционные свойства клеточной стенки определяли по отношению к Т-2 микотоксину используя стандартный образец раствора Т-2 микотоксина в бензоле. Массовая концентрация Т-2 микотоксина 100 мкг/см3.

Адсорбцию Т-2 микотоксина проводили при концентрации его в растворе 50 мкг, соотношении токсин : адсорбент 1:1000, при рН среды 7.0 и 2.0, при температуре 37-39 °С, затем раствор центрифугировали, из фугата микотоксин переэкстрагировали в хлороформ трижды по 20 мл, хлороформенные экстракты объединяли и упаривали досуха на ротационном испарителе. Количественное определение остаточных количеств Т-2 микотоксина в сухом остатке проводили методом тонкослойной хроматографии с биоавтографическим завершением с использованием культуры Candidapseudotropicaîis штамм 44 ПК.

Эксперименты in vivo по определению эффективности адсорбента при острой интоксикации Т-2 микотоксином проводили на хсрысах. Крысам натощак внутрижелудочно с помощью зонда вводили болюсы, содержащие Т-2 микотоксин в дозе 3.2 мг/кг массы тела - первой группе и болюсы, содержащие микотоксин в той же дозе и дополнительно исследуемый адсорбент в соотношении токсин : адсорбент 1:1000 - второй группе крыс. За животными вели наблюдение в течение 72 часов.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по программе Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 3. Технологические свойства генетически модифицированного картофеля. Установлено, что генетически модифицированный картофель имеет сопоставимое с контрольным картофелем содержание крахмала и свободных Сахаров, что, в конечном итоге, определяет близкую по значению общую крахмалистость обоих сортов картофеля (таблица Î).

Выделение крахмала го ГМ картофеля не вызвало каких-либо затруднений. Выход крахмала для ГМ картофеля составлял 9.8 %, для контрольного картофеля - 9.9 %. Белизна крахмала ГМ картофеля, которая указывает на чистоту крахмала, составила 82 % и соответствовала белизне крахмала контрольного картофеля. Характеристики крахмала ГМ и контрольного картофеля соответствовали ГОСТ 7699-78.

Полученные результаты указывают на пригодность ГМ картофеля как для непосредственной переработки в биопродукты, так и для предварительного выделения крахмала с последующей его переработкой на биопродукты.

Таблица 1 - Свойства ГМ н контрольного картофеля урожая 2009 года

--^Сорт картофеля Показатели^—^^ Луговской контроль ГМ Луговской плюс Невский контроль ГМ Невский плюс

Массовая доля влаги в картофеле, % 73.00 74.00 76.00 78.00

Массовая доля крахмала, % 16.20 16.70 16.87 16.95

Массовая доля свободных Сахаров, % 0.30 0.30 0.44 0.57

Общая крахмалистость, % 16.50 17.00 17.31 17.52

Массовая доля протеина в крахмале, % 0.06 0.07 0.07 0.07

Крахмал в процессах биотехнологической переработки подвергается гидротепловой обработке, что обуславливает доступность ферментов к биополимерам крахмала амилозе и амилопектину и их ферментативный гидролиз. Эффективность гидротепловой обработки взаимосвязана с морфологическими, реологическими и термодинамическими свойствами крахмала. В этой связи для определения пригодности крахмала ГМ картофеля в биотехнологии необходимо изучение его физико-химических свойств.

Исследование морфологических свойств крахмала. При изучении морфологических свойств крахмала методом оптического рассеяния света критерием для оценки взяты среднеарифметический размер гранул крахмала, (таблица 2).

Значение среднеарифметического размера гранул крахмала, определенного методом оптической микроскопии, в 1.5 раза превышает

значение среднеарифметического размера гранул крахмала, определенного методом оптического рассеяния света. Это объясняется тем, что теория оптического рассеяния света рассчитана на измерение размеров частиц шарообразной формы, а реальные формы гранул крахмала имеют форму эллипсоидов, что влияет на форму индикатрисы рассеяния света и приводит к занижению результата - среднеарифметического размера гранул крахмала.

Таблица 2 - Среднеарифметический размер гран] |М1 крахмала

Крахмал картофеля сорта Среднеарифметический размер гранул крахмала, мкм (метод оптического рассеяния света) Среднеарифметический размер гранул крахмала, мкм (метод оптической микроскопии)

Луговской контроль* 39.09 98.56

ГМ линия 1 Луговской плюс* 37.04 87.44

ГМ линия 2 Луговской плюс* 41.32 95.42

Луговской контроль** 44.11 95.40

ГМ Луговской плюс** 35.51 95.00

Невский контроль** 40.17 92.72

ГМ Невский плюс** 35.17 88.47

сорта картофеля урожая: *-2008 года, **- 2009 года

Необходимо отметить, что значение среднеарифметического размера гранул крахмала ГМ картофеля меньше по сравнению с среднеарифметическими значениями размера гранул крахмала контрольного картофеля. Исследования показали, что гранулы крахмала ГМ картофеля по размерам более высокодисперсные и однородные по сравнению с гранулами крахмала контрольного картофеля.

Определение реологических свойств крахмала. Параметры реологических характеристик крахмального клейстера определялись при концентрации сухих веществ 1.0 %, 1.5 % и 2.0 %, при температурах 90 °С, 65 °С и 20 °С. В таблице 3 представлены параметры реологических характеристик крахмального клейстера при концентрации 2.0 %, температуре 65 °С и скорости вращения шпинделя вискозиметра в форме цилиндра, погруженного в крахмальный клейстер, 1000 об/мин. Согласно представленным данным, значение показателя вязкости крахмального клейстера ГМ картофеля превышает величину показателя вязкости крахмального клейстера контрольного картофеля.

Таблица 3 - Реологические характеристики крахмального клейстера при концентрации 2.0 % и скорости вращения шпинделя 1000 об/мин, температуре 65 °С_____

Крахмал картофеля сорта Динамическая вязкость - щ Пас Сдвиговая скорость - Касательное напряжение -т, Па

Луговской контроль* 0.028 1182 32.45

ГМ линия 1 Луговской плюс* 0.032 1182 38.35

ГМ линия 2 Луговской плюс* 0.029 1183 33.80

Луговской контроль** 0.030 1183 36.45

ГМ Луговской плюс** 0.067 1176 78.20

Невский контроль** 0.036 1181 42.70

ГМ Невский плюс** 0.064 1177 75.60

сорта картофеля урожая: *-2008 года, **- 2009 года

Динамическая вязкость непосредственно определяется такими параметрами как сдвиговая скорость, касательное напряжение. Сдвиговая скорость, характеризующая деформацию крахмального клейстера, для обоих вариантов крахмала различается незначительно. Значение касательного напряжения, которое характеризует жесткость крахмального клейстера, у крахмального клейстера ГМ картофеля превышает значение касательного напряжения крахмального клейстера контрольного картофеля. Это свидетельствует о большем количестве межмолекулярных связей в крахмале ГМ картофеля. Таким образом, крахмальный клейстер ГМ картофеля оказывается более жестким по сравнению с крахмальным клейстером контрольного картофеля.

Студнеобразующая способность крахмала. Студнеобразующая способность крахмала оценивалась фактором набухания. Из представленных результатов (таблица 4) видно, что для крахмала ГМ картофеля значения показателя фактора набухания выше по сравнению с контрольным вариантом.

Из представленных в таблице 3 реологических характеристик крахмального клейстера, можно сделать вывод о том, что значения показателей вязкости и жесткости крахмального клейстера, полученного из ГМ картофеля, превышают значения этих показателей крахмального клейстера, полученного из крахмала контрольного картофеля. Между значением вязкости и фактором набухания крахмала наблюдается прямопропорциональная зависимость.

Также наблюдается взаимосвязь между морфологическими и реологическими свойствами крахмала ГМ и контрольного картофеля.

Показатели вязкости и фактора набухания крахмала увеличиваются с уменьшением размера гранул крахмала.

Таблица 4 - Фактор набухания крахмала

Крахмал картофеля сорта Фактор набухания

50 °С 60 С 65 °С 70 °С 80 °С

Луговской контроль* 0.50 1.30 13.10 20.70 28.00

ГМ линия 1 Луговской плюс* 0.20 2.40 14.90 26.70 35.00

ГМ линия 2 Луговской плюс* 0.30 1.30 12.10 19.90 26.50

Луговской контроль** 0.10 9.70 20.90 28.70 37.90

ГМ Луговской плюс** 0.43 7.10 23.80 35.30 40.60

Невский контроль** 0.20 5.80 19.80 31.70 37.00

ГМ Невский плюс** 0.12 2.05 24.40 38.80 41.70

сорта картофеля урожая: *-2008 года, **- 2009 года

На основе полученных результатов исследования реологических свойств крахмала ГМ картофеля можно сделать вывод о том, что в биотехнологическом производстве продолжительность гидротепловой обработки крахмала ГМ картофеля может быть сокращена по сравнению с использованием крахмала контрольного картофеля.

Термодинамические характеристики крахмала Методом дифференциальной сканирующей калориметрии определены температуры начала кристаллизации крахмала, начальная и конечная температуры плавления кристаллической ламели крахмала, энтальпия желатинизации и ретроградации. В таблице 5 представлены значения энтальпии желатинизации и ретроградации крахмала.

Значения энтальпии желатинизации крахмала ГМ картофеля обоих годов урожая превышают значения энтальпии крахмала контрольного картофеля, что можно объяснить повышенным содержанием амилозы в крахмале ГМ картофеля. Определение содержания амилозы в крахмале показало, что содержание амилозы в крахмале ГМ картофеля - 22.5 %, контрольного картофеля - 21 %. Кроме того значенияпоказателя энтальпия связано с усовершенствованием кристаллита двойной спирали и/или увеличением длины двойной спирали амилопектина, а также с увеличением количества их упорядоченных структур. В кристаллической ламели крахмала ГМ картофеля улучшается ориентация аморфных областей, образуется более

совершенный кристалл, что сопровождается ростом энтальпии плавления кристаллической ламели.

Таблица 5- Значения энтальпии желатинизации и ретроградации крахмала_________

Крахмал картофеля сорта Энтальпия желатинизации, мДж/мг Энтальпия ретроградации, мДж/мг

Луговской контроль* 30 1.2

ГМ линия 1 Луговской плюс* 33 9

ГМ линия 2 Луговской плюс* 34 11

Луговской контроль** 19 7

ГМ Луговской плюс** 23 7

Невский контроль** 17 8

ГМ Невский плюс** 28 8

картофель урожая: *-2008 года, **- 2009 года

Энтальпия плавления кристаллической ламели крахмала ГМ картофеля сортов Луговской плюс и Невский плюс урожая 2009 года при ретроградации незначительно превышает энтальпию плавления кристаллической ламели крахмала контрольного картофеля. Это связано с ретро градацией амилозы в начальный период процесса ретроградации крахмала, так как содержание амилозы в крахмале ГМ картофеля на 1.5 % превышает содержание амилозы в крахмале контрольного картофеля а поэтому ретроградация амилопектина запаздывает и кристаллическая ламель крахмала не успевает полностью усовершенствоваться. Энтальпия плавления кристаллической ламели крахмала ГМ картофеля сорта Луговской плюс урожая 2008 при ретроградации ниже по сравнению с энтальпией плавления кристаллической ламели крахмала контрольного картофеля. Этот эффект «запаздывания» больше проявляется на этом крахмале.

Ферментативный гидролиз крахмала генетически модифицированного картофеля. Крахмал ГМ и контрольного картофеля подвергался трехступенчатой ферментативной обработке амаполитическими ферментами. Разжижение крахмала проводили ферментным препаратом а-амилаза. Далее проводили обработку крахмальной суспензии ферментным препаратом пуллуланаза. После двухступенчатой обработки выход глюкозы в крахмальных субстратах достигал 4-5 %. Затем субстрат обрабатывался ферментным препаратом глюкоамилаза.

В таблице 6 представлены значения выхода глюкозы в зависимости от продолжительности обработки крахмала ферментным препаратом

глюкоамилаза. В начальный период до 5 часов ферментативный гидролиз протекает наиболее интенсивно. По истечению 5 часов ферментативный гидролиз снижает свою интенсивность и выход глюкозы увеличивается незначительно. По истечении 11 часов роста выхода глюкозы практически не происходит.

Таблица 6- Выход глюкозы в зависимости от продолжительности обработки крахмала ферментным препаратом глюкоамилаза

Крахмал картофеля сорта

Выход глюкозы, %

Продолжительность, час

0.5

1.5

2.5

5.0

11

16

Луговской контроль*

58.80

61.40

67.07

74.05

77.90

ГМ линия 1 Луговской плюс*

67.07

69.80

75.05

76.40

79.40

ГМ линия 2 Луговской плюс*

67.07

75.04

81.03

82.07

83.60

Луговской контроль*

47.77

60.50

69.75

70.80

71.47

77.90

79.40

83.60

71.47

ГМ Луговской плюс"

50.05

66.47

71.40

72.47

74.00

Невский контроль"

44.11

58.68

61.75

80.97

83.00

ГМ Невский плюс*

44.09

58.71

61.80

81.35

84.95

74.00

83.00

84.95

картофель урожая: *-2008 года, **-2009 года

Результаты проведенных экспериментов показали, что эффективность ферментативного гидролиза крахмала ГМ картофеля до глюкозы выше эффективности ферментативного гидролиза крахмала контрольного картофеля. Как показано выше в крахмале ГМ картофеля содержится больше амилозы, чем в крахмале контрольного картофеля. В результате растворения амилозы амилопектин крахмала ГМ картофеля становиться более доступным для воздействия ферментами по сравнению с амилопектином крахмала контрольного картофеля. Это позволяет сделать вывод о целесообразности использования крахмала ГМ картофеля в биотехнологической промышленности при получении из него биопродуктов.

Получение амилозы из крахмала генетически модифицированного картофеля методом электродиализа. На основе результатов экспериментов установлено, что наибольшей эффективности разделения крахмала можно достичь с концентрацией сухих веществ крахмального клейстера 1 %, с использованием фторопластовой мембраны типа МФФК-4Г с размерами пор 0.6 мкм и при температуре в электролитической ячейке от 70 до 80 °С.

Как видно из представленных в таблице 7 результатов, выход амилозы из крахмала ГМ картофеля выше по сравнению с контрольным вариантом картофеля. Наибольший выход амилозы наблюдается из крахмала ГМ картофеля сорта Невский плюс, что говорит о перспективности его применения для получения рафинированных биополимеров - амилозы и амилопектина.

Таблица 7- Выход амилозы из крахмала

Крахмал картофеля сорта Выход амилозы, %

Луговской контроль* 52.4

ГМ линия 1 Луговской плюс* 53.3

ГМ линия 2 Луговской плюс* 57.8

Луговской контроль** 61.9

ГМ Луговской плюс** 66.7

Невский контроль** 54.8

ГМ Невский плюс** 71.1

картофель урожая: *-2008 года, **- 2009 года

Микробиологическая конверсия вторичных ресурсов переработки ГМ картофеля. Исследование картофельной мезги и сока, образующиеся при выделении крахмала из ГМ картофеля, показало, что в их составе присутствуют углеводы, в частности, крахмал и клетчатка, протеин и минеральные вещества. Ниже представлена характеристика картофельной мезги и картофельного сока ГМ картофеля сорта Луговской плюс урожая 2009 года.

Характеристика картофельной мезги (%, СВ): массовая доля углеводов- 65; массовая доля протеина- 17; массовая доля минеральных веществ- 13; массовая доля клетчатки- 13; крахмалистость- 7.55; содержание свободных Сахаров- 0.55; содержание крахмала- 7; массовая доля влаги- 12; рН мезги - 4.0-4.5.

Характеристика картофельного сока: массовая доля сухих веществ 5 %; массовая доля протеина 30 мг/кг; массовая доля азота 4 мг/кг; массовая доля калия 5 мг/кг; массовая доля магния 300 мг/кг; массовая доля фосфора 500 мг/кг; рН картофельного сока- 4.5-5.0.

Основным критерием микробиологической конверсии картофельной мезги и сока является их максимальная утилизация с получением экономически эффективных биопродуктов. В составе мезги присутствует клетчатка, поэтому для микробиологической конверсии картофельной мезги и сока целесообразно использовать мицелиальные грибы, продуценты комплекса ферментов гидролизующих клетчатку и крахмал. Кроме того,

14

клеточные стенки мицелиальных грибов являются источником хитин-глюкана, который обладает адсорбционными свойствами по отношению к микотоксинам. Это создает предпосылку для последующей комплексной переработки биомассы мицелиальных грибов на адсорбент и кормовой белок.

В исследованиях использовался непатогенный гриб р. Тпскойегта азреггПит 302 продуцирующий комплекс ферментов гидролизующих клетчатку и крахмал. Культивирование гриба на питательной среде, приготовленной на основе картофельной мезги и сока, показало целесообразность использования их в составе питательной среды в соотношении 1:1 с массовой долей СВ 3.5 % : из них 65 % углеводов, 17 % протеина, 13 % минеральных веществ. Для обогащения калием и фосфором в питательную среду вводили однозамещенный фосфат калия в количестве 0.1 % от общей массы СВ питательной среды. Для обогащения азотом вводили сульфат аммония в количестве 0.3 % ог общей массы СВ питательной среды.

Установлено, что оптимальная продолжительность культивирования гриба р. ТпсНос/егта ахрегеИит 302 при температуре 28 °С составляет 4 суток. В этих условиях гриб продуцирует ферменты гидролазы, под действием которых увеличивается содержание простых Сахаров. Затем содержание простых Сахаров снижается и к концу ферментации гриб ассимилирует до 95 % углеводов, присутствующих в питательной среде. Выход биомассы гриба составляет 55 %. Концентрация биомассы гриба в культуральной жидкости достигала до 20 г/л.

Адсорбционные свойства клеточной стенки гриба р. Тпскойегта трегеНит 302. В исследованиях использовался ферментативный метод разделения клеточной стенки гриба и белка, содержание которого в биомассе гриба составляло 25 %. Биомасса гриба р. Тг1сИос?егта азрегеИит 302 отделялась от культуральной жидкости и обрабатывалась ферментом РЯОТЕХ 6Ь для гидролиза белков. Затем гидролизованные белки' и клеточная стенка мицелиального гриба разделялись центрифугированием. Данная обработка позволяла придать высокое адсорбционное свойство клеточных стенок по отношению к Т-2 микотоксину.

Анализ представленных в таблице 8 результатов позволяет сделать вывод о том, что адсорбция Т-2 микотоксина клеточными стенками мицелиального гриба р. Тпскойегта а$реге\1ит 302 находится во взаимосвязи с содержанием в них белка и О-глюкозамином. В общем случае снижение содержания белка и увеличение содержания О-глюкозамина в клеточной стенке гриба приводит к увеличению эффективности адсорбции Т-2 микотоксина. Высокая эффективность адсорбции Т-2 микотоксина клеточной стенки гриба можно объяснить присутствием в ней хитин-глюканового комплекса.

Таблица 8 - Адсорбционные свойства клеточных стенок гриба р. Тгіскойегта аьуегеїіит 302. ____

Содержание белка Содержание ДТА* Адсорбция Т-2 мико-токсина, % Десорбция Т-2 мико-токсина,% Истинная адсорбция, %

рН 7 рН2 рН 8 рН2

16.80 19.50 52.00 61.36 5.93 55.43

5.18 26.10 70.72 76.96 10.05 66.91

8.22 27.30 76.96 76.96 4.14 72.82

10.33 20.80 70.72 70.72 10.94 59.78

* ДТА - Б-глнжозамин

Технология адсорбента мнкотоксинов и белковой кормовой добавки. Проведенные выше исследования взяты за основу при разработке технологии адсорбента микотоксинов и белковой кормовой добавки из биомассы гриба р. ТгісИосіегта сярегеНит 302, культивируемой на питательной среде, полученной из картофельной мезги и сока, образующиеся при выделении крахмала из ГМ картофеля.

Технологическая схема получения адсорбента микотоксинов включает (рис.1): подготовку питательной среды; получение посевного материала; культивирование биомассы гриба; выделение и промывка биомассы гриба; выделение клеточной стенки из биомассы гриба; промывка клеточной стенки гриба; сушка клеточной стенки гриба; измельчение и упаковка агломератов клеточных стенок; сбор белковых экстрактов, промывных вод клеточной стенки гриба, содержащих белки, концентрирование и сушка с получением белковой кормовой добавки; промывные воды биомассы гриба отправляются на биологическую очистку.

Таблица 9- Характеристика адсорбента микотоксинов

Наименование показателя Норма

Массовая доля сырого протеина, %, не более 10.0

Массовая доля белка по Барнштейну, %, не более 8.5

Насыпная масса, г/см3, не менее 0.7

Массовая доля влаги, %, не более 10.0

Адсорбция Т-2 микотоксина, %, не менее 72.0

Выбранные параметры процесса и оборудование для его проведения позволяют изготовить адсорбент микотоксинов из клеточной стенки гриба р. Тгісіюсіегта азрегеїїгт 302 с выходом адсорбента 60-65 % от сухой

биомассы гриба. Характеристика полученного адсорбента микотоксинов представлена в таблице 9.

Каргофельшя мезга нож мшро - ¡і макроэлементы

Рис.1 - Технологическая схема получения адсорбента микотоксинов и кормового белка

Другим преимуществом разработанной технологии является получение белковой кормовой добавки из экстракта. Массовая доля сырого протеина в белковой кормовой добавке не более 55 %, массовая доля белка

по Барнштейну не менее 50 %. Выход белковой кормовой добавки от биомассы гриба р. ТпсЬойегта аэрегеИит 302 составил 20-25 %.

ВЫВОДЫ

1. Установлена возможность применения ГМ картофеля сортов Луговской плюс и Невский плюс в биотехнологических производствах. Крахмалистость и содержание крахмала в ГМ картофеле сортов Луговской плюс и Невский плюс соответствуют нормам стандарта для переработки картофеля биотехнологическими методами. Показано, что крахмал ГМ картофеля соответствуют стандарту на крахмал картофельный и по физико-химическим свойствам пригоден для переработки в биопродукты.

2. Установлены различия между морфологическими и реологическими свойствами крахмала ГМ и контрольного картофеля. Крахмал ГМ картофеля имеет более высокую дисперсность гранул, вязкость и фактор набухания по сравнению с крахмалом контрольного картофеля. Это обуславливает снижение теплоэнергетических затрат в биотехнологическом производстве на подготовку субстратов из крахмала ГМ картофеля по сравнению с крахмалом из контрольного картофеля.

3. Показано, что эффективность ферментативного гидролиза крахмала ГМ картофеля до глюкозы выше эффективности ферментативного гидролиза крахмала контрольного картофеля. Выход глюкозы из крахмала ГМ картофеля до 5 % выше выхода глюкозы из крахмала контрольного картофеля.

4.Установлено, что амилоза эффективней выделяется из крахмала ГМ картофеля методом электродиализа по сравнению с крахмалом контрольного картофеля. Выделенная амилоза по чистоте пригодна для получения биопленок.

5. Показана целесообразность биотехнологической конверсии вторичных ресурсов переработки ГМ картофеля мицелиальным грибом р. Тпскос1егта азрегеНит 302 с последующим получением из этого гриба адсорбента микотоксинов и белкового кормового продукта.

6. Разработан технологический регламент на опытное производство адсорбента микотоксинов из мицелиального гриба р. Тг1сИос1егта азрегеПит 302. Проведена опытная выработка адсорбента микотоксинов и его испытание на лабораторных животных.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Закирова, А.Ш. Сравнительная оценка эффективности разделения картофельного крахмала на амилозу и амилопекган химическими методами /

А.Ш. Закирова, Д.Ш. Ягофаров, A.B. Канарский, Ю.Д.Сидоров // Вестник КГТУ № 9. - Казань, 2010. - 0,06 п.л. (лично автором -0,015 пл.).

2. Ягофаров, Д.Ш. Применение метода электродиализа для разделения амилозы и амилопектина картофельного крахмала / Д.Ш. Ягофаров, А.Ш. Закирова, A.B. Канарский, Ю.Д. Сидоров // Вестник КГТУ №11.- Казань, 2010.

- 0,06 пл. (л1Яно автором - 0,015 пл.).

3. Ягофаров, Д.Ш. Исследование морфологических свойств картофельного крахмала / Д.Ш. Ягофаров, A.B. Канарский, Ю.Д.Сидоров // Вестник КГТУ №4. - Казань, 2011. - 0,5 пл. (лично автором - 0,17 пл.).

4. Ягофаров, Д.Ш. Энзиморезистентность крахмала генетически модифицированного картофеля / Д.Ш. Ягофаров, А.Ш. Закирова, A.B. Канарский, Ю.Д.Сидоров // Вестник КГТУ №8. - Казань, 2011.-0,31 пл. (лично автором - 0,08 пл.).

5. Закирова, А.Ш. Применение фотоколориметрического метода для количественного определения амилозы в крахмале / А.Ш. Закирова, Д.Ш. Ягофаров, A.B. Канарский, Ю.Д.Сидороз // Вестник КГТУ № 10. - Казань, 2011. -.0,25 пл. (лично автором -0,62 пл.)

6. Канарский, A.B. Изучение структурных и реологических характеристик крахмала, выделенного из генно-модифицированного картофеля / A.B. Канарский, З.А. Канарская, Д.Ш. Ягофаров, JI.A. Вассерман, В.Г. Васильев КГ. Скрябин, А.М. Камионская // Биотехнология № 3. - 2011. - 0,43 пл. (лично автором - 0,62 пл.).

Статьи и материалы конференций

1. Ягофаров, Д.Ш. Применение электродиализа для получения амилозы и амилопектина из картофельного крахмала /Д.Ш. Ягофаров, A.B. Канарский, Ю.Д.Сидоров // X международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Сборник тезисов и докладов). -Казань, 2009 - 0,06 пл. (лично автором - 0,02 пл.).

2. Канарский, A.B. Физико-химические свойства крахмала биотехнологического картофеля в поколениях /A.B. Канарский, А.М. Камионская, JI.A. Вассерман, З.А. Канарская, Д.Ш. Ягофаров // Материалы XVI1 международной конференции по крахмалу Москва-Краков, М., Россия. 16-18 нюня 2009 - 0,06 пл. (лично автором - 0,012 пл.).

3. Ягофаров, Д.Ш. Исследование возможности разделения картофельного крахмала на амилозу и амилопектин /Д.Ш. Ягофаров, М.С. Понамарева, JI.X. Шайморданова // Научная сессия (Аннотации сообщений).

- Казань, 2009. - 0,06 пл.(лично автором - 0,02 пл.).

4. Сафин, Р.Х. Разработка технологии фракционирования методом электродиализа /Р.Х. Сафин, Д.Ш. Ягофаров, A.B. Канарский, Ю.Д.Сидоров // XI международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и

г

биотехнологии» (Сборник тезисов и докладов). - Казань, 2010. - 0,06 пл. (лично автором - 0,015 п.л.).

5. Ивлева, А.Р. Исследование реологических свойств крахмальных растворов / А.Р. Ивлева, М.С. Пономарева, Д.Ш. Ягофаров // Научная сессия (Аннотации сообщений). - Казань, 2009. - 0,06 п.л. (лично автором - 0,02 пл.).

6. Ягофаров, Д.Ш. Исследование морфологических свойств крахмала выделенного из генетически модифицированного картофеля /Д.Ш. Ягофаров, A.B. Канарский, Ю.Д. Сидоров, М.А. Поливанов // Научная сессия (Аннотации сообщений). - Казань, 2011. - 0,06 п.л. (лично автором - 0,015 пл.).

Благодарность

Выражаю искреннюю благодарность и признательность заместителю директора по научной работе ЦБ РАН, к.б.н., в.н.с. A.M. Камионской за предоставленный ГМ картофель и, соответственно, возможность проводить исследования на этом новом и перспективном техническом сырье.

Подписано в печать 30.02.2012. Формат 60 х 84 1/16 Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ39

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» (ФГБОУ ВПО «ВГУИТ») Отдел полиграфии ФГБОУ ВПО «ВГУИТ») Адрес академии и отдела полиграфии: 394036, Воронеж, пр. Революции, 19

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Ягофаров, Дамир Шамилевич, Воронеж

61 12-5/2952

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический

университет»

Ягофаров Дамир Шамилевич

ПЕРЕРАБОТКА ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО КАРТОФЕЛЯ НА БИОПРОДУКТЫ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор Канарский Альберт Владимирович

Воронеж-2012

СОДЕРЖАНИЕ

Условные обозначения........................................................................................5

Введение................................................................................................................^

1. Обзор литературы.............................................................................................^

1.1 Характеристика крахмалосодержащего сырья, используемого в биотехнологической промышленности..............................................................Ю

1.2 Физико-химические свойства крахмала.......................................................18

1.2.1 Набухаемость, клейстеризация, желатинизация и ретроградация

18

крахмала...............................................................................................................

1.2.2 Структура и кристалличность картофельного крахмала..........................23

1.2.3 Физико-химические свойства амилозы и амилопектина..........................25

1.3 Биопродукты из крахмалосодержащего сырья.............................................29

1.3.1 Получение амилозы и амилопектина.........................................................29

1.3.2 Получение глюкозы....................................................................................32

1.3.3 Получение биопродуктов из картофельной мезги и сока.........................35

1.4 Цель и задачи исследования..........................................................................39

41

2. Материалы и методы исследовании...............................................................^

2.1 Характеристика используемых материалов.................................................41

2.1.1 Определение технологических свойств картофеля...................................41

2.2 Получение крахмала......................................................................................41

2.3 Определение свойств крахмала ....................................................................41

2.3.1 Определение содержания протеина в крахмале........................................41

2.3.2 Определение белизны и зольности крахмала............................................42

2.3.3 Определение морфологических свойств крахмала...................................42

2.3.3.1 Определение морфологических свойств крахмала методом оптического

42

рассеяния света....................................................................................................^

2.3.3.2 Определение морфологических свойств крахмала методом оптической

43

микроскопии........................................................................................................^

2.3.4 Определение реологических свойств крахмала........................................

2.3.4.1 Определение вязкости крахмала.............................................................

2.3.4.2 Определение студнеобразующей способности крахмала......................45

2.3.5 Определение термодинамических характеристик крахмала....................46

2.3.6 Методика ферментативного гидролиза крахмала.....................................48

2 3 7 Методика разделения крахмала на амилозу и амилопектин методом

......................50

электродиализа ......................................................................

2.3.8 Метод определения амилозы......................................................................

2 3 9 Методики определения содержания клетчатки, белков, крахмала, золы в

..............52

картофельной мезге и соке.........................................................

2 3 10 Методика культивирования мицелиального гриба р.Trichoderma

.........................52

asperullum 302 ....................................................................

2 3 11 Метод получения клеточной стенки гриба p..Trichoderma

........................53

asperullum 302 ...................................................................

2.3.12 Определение содержания D-глюкозамина....................................53

2.3.13 Метод определения адсорбционных свойств клеточной стенки гриба

р Trichoderma asperellum 302 по отношению к Т-2 микотоксину................54

55

2.4 Обработка результатов эксперимента..........................................................

................56

3. Экспериментальная часть................................................................

3.1 Технологические свойства генетически модифицированного картофеля .56

3.2 Свойства крахмала генетически модифицированного картофеля..............58

3 2 1 Морфологические свойства крахмала генетически модифицированного

......................58

картофеля ..........................................................................

3 2 11 Изучение морфологических свойств крахмала методом оптического

...............58

рассеяния света.........................................................................

3 2 12 Изучение морфологических свойств крахмала методом оптической

.................69

микроскопии..........................................................................

3 2 2 Реологические свойства крахмала генетически модифицированного

..................74

картофеля...........................................................................

3 2 2 1 Вязкость крахмала генетически модифицированного картофеля.........74

3.2.2.2 Студнеобразная способность крахмала генетически

модифицированного картофеля................................................................

характеристики крахмала генетически 3.2.3 Термодинамические характерного у ^

модифицированного картофеля...................................................................

з.з Получение биопродукгов из крахмала и вторичных ресурсов переработки

генетически модифицированного картофеля.....................................................

3.3.1 Получение глюкозы ферментативным гидролизом крахмала генетически

............84

модифицированного картофеля................................................................

3.3.2 Получение амилозы н амилопектина из крахмала генетически

модифицированного картофеля.....................................................................

3.3.3 Получение адсорбента микотоксинов и белковой кормовой добавки ....95

................100

ВЫВОДЫ.....................................................................................

Список литературы..........................................................................

Приложения .........................................................................

Приложение 1.............................................................................

...............137

Приложение 2.........................................................

Приложение 3........................................................................

Приложение 4.............................................................................

............153

Приложение 5..........................................................

Условные обозначения

ГМ - генетически модифицированный СВ - сухое вещество

Tg - glass transition temperature (температура стеклования) Т - melting temperature (температура плавления)

ДСК (DSC) - дифференциальный сканирующий калориметр (differential scanning calorimeter)

ECL - exterior chain length (длина внешней части цепи) ICL - interior chain length (длина внутренней части цепи) Mw - molecular weight (молекулярная масса) DP - degree of polymerization (степень полимеризации) RB - radius of gyration (радиус вращения)

о

ГЭ - глюкозный эквивалент

LS - light scattering (рассеяние света)

РШ8 - polarization intensity differential scattermg (дифференциальная

интенсивность рассеивания поляризованного света)

SF - swelling factor (фактор набухания)

W - weight of starch (масса крахмала)

As - absorbance of starch (оптическая плотность крахмала)

AR- absorbance of reference (оптическая плотность контрольного образца)

АН - transition enthalpy (переходная энтальпия)

Т0 - onset temperature (начальная температура кристаллизации)

Т - conclusion temperature (конечная температура)

Тр - peak temperature (максимальная температура, или температура начала плавления кристаллической ламели)

МФФК-4Г - микрофильтрационная фторопластовая композиционная

гидрофильная мембрана

Low - низкий (значения прибором не улавливаются)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Экономическая эффективность

биотехнологического производства прежде всего определяется доступностью и стоимостью сырья. В современном производстве биопродуктов микробиологического синтеза в качестве сырья используют преимущественно зерновые культуры. Следует отметить, что зерновые культуры как источник крахмала и белка крайне необходимы дая получения пищевых и кормовых продуктов, поэтому применение зерновых культур в биотехнологическом производстве приводит к дефициту этого сырья на мировом рынке и, соответственно, повышению его стоимости, что в конечном итоге сказывается

на стоимости продуктов питания.

Более дешевым сырьем для производства биопродуктов является

неоправданно забытый картофель, содержащий в своем составе

преимущественно крахмал. Однако, вовлечение картофеля как сырья в

биотехнологическое производство требует подаержания его устойчивого

урожая.

Россия является одной из главных картофелеводческих стран мира. Однако, наблюдаются огромные потери урожая картофеля, особенно в южных регионах. Это происходит из-за поражения картофеля колорадским жуком, и в ряде областей страны нашествие этого вредителя сравнимо со стихийным бедствием. При существующем уровне развития картофелеводства в РФ потенциальные потери урожая оцениваются экспертами РАСХН в 4.1 млн. тонн картофеля на сумму 19.4 млрд. руб. Поскольку более 95 % картофеля сосредоточено в частном секторе, где при отсутствии обработок гибнет от 40 до 80 % потенциального урожая, некоторые эксперты оценивают реальные ежегодные потери картофеля от колорадского жука в 60 - 75 млрд. рублей. Наиболее перспективным сегодня представляется решение этой проблемы биологическими методами защиты картофеля и прежде всего методом генной

инженерии, направленным на получение ГМ картофеля.

Необходимо отметить, что расширение объемов воспроизводства

генетически модифицированных сельскохозяйственных растений, которые имеют более высокую урожайность, требуют меньший расход воды на их воспроизводство. Сельское хозяйство вообще и, в частности, пашня являются одним из главных источников парниковых газов, попадающих в атмосферу. За последние 10 лет выброс парниковых газов в атмосферу за счет выращивания генетически модифицированного сельскохозяйственного сырья снизился на 14.8 млрд.кг, а это равноценно тому, что с дорог мира исчезли 6.6 млн. автомобилей. За счет уменьшения глубины обработки почвы при выращивании генетически модифицированных растений снизилось потребление топлива, сохранился биоценоз почв и гумус. Использование биотехнологических сельскохозяйственных культур приносит производителям и, соответственно, их странам ощутимую экономическую выгоду.

Несмотря на перспективу воспроизводства ГМ картофеля, этого нового и перспективного технического сырья, научного обоснования его эффективного применения и, прежде всего, крахмала, выделенного из ГМ картофеля, в биотехнологической промышленности отсутствует. Учитывая положительные экономические и экологические аспекты воспроизводства ГМ картофеля, проведение научных исследований по определению пригодности ГМ картофеля в биотехнологическом производстве является актуальным и своевременным.

Цель в задачи исследования. Научное обоснование комплексной переработки ГМ картофеля на биопродукты.

Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:

- оценка технологических свойств ГМ картофеля для биотехнологической переработки;

- изучение физико-химических свойств крахмала ГМ картофеля, определяющих его пригодность для получения биопродуктов;

- определение возможности получения биопродуктов ферментативным гидролизом крахмала ГМ картофеля;

- определение возможности получения биопродуктов микробиологической конверсией вторичных ресурсов переработки ГМ картофеля;

- изучение возможности получения амилозы из крахмала ГМ картофеля.

Научная новизна. Впервые показана возможность применения ГМ картофеля сортов Луговской плюс и Невский плюс для переработки на биопродукты. Установлено, что морфологические и реологические свойства крахмала ГМ картофеля соответствуют эффективному его применению в биотехнологии.

Установлено, что эффективность ферментативного гидролиза крахмала ГМ картофеля до глюкозы превышает эффективность ферментативного гидролиза крахмала контрольного картофеля. Показана возможность культивирования мицелиального гриба р. ТпМегта аэрегеИит 302 на питательной среде, полученной из мезги и сока, которые образуется при переработке ГМ картофеля. Установлены высокие адсорбционные свойства клеточной стенки мицелиального гриба р. Тпскойегта юрегеПит 302 по отношению к Т-2 микотоксину. Показано, что амилоза эффективно выделяется из крахмала ГМ картофеля методом электродиализа.

Практическая значимость. Показана целесообразность использования генетически модифицированного картофеля в биотехнологии. Установлено, что крахмал ГМ картофеля по физико-химическим свойствам пригоден для

переработки в биопродукты.

Выход глюкозы из крахмала ГМ картофеля до 5 % выше выхода глюкозы из крахмала контрольного картофеля. Показана возможность снижения теплоэнергетических затрат в биотехнологическом производстве на подготовку субстратов из крахмала ГМ картофеля по сравнению с крахмалом из

контрольного картофеля.

Установлена целесообразность биотехнологической конверсии вторичных ресурсов переработки ГМ картофеля мицелиальным грибом р. ТпсШегта азрегеПит 302 с последующим получением из этого гриба адсорбента микотоксинов и белкового кормового продукта. Разработан технологический регламент на опытное производство адсорбента микотоксинов из мицелиального гриба р. ТПМегта азрегеПит 302. Проведена опытная

выработка адсорбента микотоксннов и его испытание на лабораторных животных.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на X и XI международных конференциях молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2009-2010), XVII международной конференции по крахмалу, Москва-Краков (Москва),

научной сессии (Казань, 2011).

Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту:

- установленные технологические свойства ГМ картофеля и физико-химические свойства крахмала ГМ картофеля, определяющие их пригодность

для получения биопродуктов;

- результаты исследования ферментативного гидролиза крахмала ГМ

картофеля;

- результаты исследования по выделению амилозы из ГМ картофеля

методом электродиализа;

- результаты исследования микробиологической конверсии вторичных

ресурсов переработки ГМ картофеля;

- разработанная технология адсорбента микотоксинов и кормового белка

из биомассы гриба р. Тпскойегта аярегеПит 302.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных

работ, в том числе 6 статей в журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и библиографического списка, содержащего 156 источников. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста и включает в себя 21 таблиц, 23 рисунка и 5 приложении.

Обзор литературы 1.1 Характеристика крахмалосодержащего сырья, используемого в биотехнологической промышленности

В настоящее время для России увеличение производства биопродуктов является важным элементом восстановления и подъема экономики. Развитие этой отрасли должно базироваться на использовании прогрессивных технологий воспроизводства и переработки крахмалосодержащего сырья [1,2,3,4].

Все виды крахмалосодержащего сырья, пригодного для биотехнологической промышленности по массовой доле сухих веществ (СВ) можно подразделить на две основные группы [1,5,6,7,8]:

-корнеклубнеплоды и стебельные растения - 20-30 % СВ: картофель,

батат, маниок, саговая пальма и др. [7,9,10].

-зерновые и зернобобовые - 85-90 % СВ: наиболее богатые крахмалом

кукуруза, сорго, пшеница, ячмень, рожь, рис, горох и др.[7,11,12].

Технологические свойства крахмалоносов в значительной мере определяются их структурой, химическим составом и анатомическим строением. Особенности строения плодов и семян крахмалоносов оказывают решающее влияние на организацию и ведение технологических процессов и

биопроизводства и извлечения крахмала.

Наиболее характерный представитель клубнеплодов - картофель (Solarium tuberosum). Химический состав клубня картофеля зависит от сорта, условий выращивания: почвы, внесения удобрений и климата; условий созревания, сбора и хранения урожая и от факторов связанных с его анализом [13]. Картофель содержит крахмала от 13 до 37 % сухого вещества; общее содержание углеводов от 13 до 30 %; содержание крахмала от 8.5 до 29 %; содержание Сахаров до 4 %, в том числе глюкозы от 0.10 до 0.50 %, фруктозы от 0.06 до 0.70 %, сахарозы от 0.14 до 0.50 %; содержание клетчатки от 0.7 до 3.5 %; содержание пектиновых веществ от 0.7 до 1.5 %; содержание сырого протеина от 0.5 до 4.5 %; общее содержание азота от 0.15 до 0.75 %;

содержание золы от 0.45 до 1.90 % и жиров от 0.02 до 0.20 % [14,15].

Наружный слой картофеля - перидерма (называемый также кожицей или пробкой) состоит из клетчатки, под которой находится тонкий пробковый слой клеток, наполненных высохшей плазмой, затем слой тонкостенных клеток с протоплазмой и за ними - клетки, наполненные протоплазмой и плавающими в ней гранулами крахмала. Тканевый слой между перидермой и сосудистым кольцом называется кортексом. Слой кортекс содержит наибольшее количество крахмала и протеинов [16]. Сосудистое кольцо служит транспортирующим механизмом и состоит из ксилемы и флоэмы. Ксилема транспортирует воду и растворенные нутриенты, в то время как флоэма ответственна за транспортировку о�