Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез диацетила в культурах молочнокислых бактерий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез диацетила в культурах молочнокислых бактерий"

российская академия наук

институт биохимии им. а.н.баха

На правах рукописи

' Р Г Б Ой

КИСРИЕВА Юлия Сергеевна 9 о г ^

■ СО 1!.ЛГ

удк 663.18

Г[ 1

БИОСИНТЕЗ ДИАЦЕТИЛА В КУЛЬТУРАХ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2000

Работа выполнена в лаборатории ферментов микроорганизмов Института биохимии им. А. Н. Баха Российской академии наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов Российской академии наук.

Защита диссертации состоится.^..... апреля 2000 г в.... \ часов

на заседании диссертационного совета (К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук & Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН ( 117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корл.1 ).

Автореферат разослан....................................................2000 г.

профессор А. М. Безбородое.

профессор Е.П. Феофилова; доктор биологических наук, профессор 3. Г. Евстигнеева.

Ученый секретарь диссертационного совета-кандидат биологических наук

А 80-3890 №9,0

Ет.Щ о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Диацетил (Дц) используется в пищевой промышленности для приготовления ароматизаторов, придающих продуктам разнообразные оттенки сливочно-молочного аромата. Это вещество образуется в процессе жизнедеятельности молочнокислых бактерий (МКБ). Собственного производства Дц в СНГ нет. Потребность промышленности в Дц на сегодняшний день по оценке Масложирпрома составляет не менее Зт/год. НПО "Ярсинтез" разработан химический способ получения Дц из Ci-фракции переработки нефти. Альтернативой химическому синтезу может быть микробный синтез Дц. Для создания технологии получения Дц, не содержащего остатки полупродуктов органического синтеза и ценящегося Fia мировом рынке значительно выше, необходим штамм-сверхпродуцент.

Среди исследователей нет единого мнения относительно биохимического механизма образования Дц. В литературе описаны два возможных пути образования диацетила. Согласно одному Дц образуется при конденсации гидроксиэтилтиаминпирофосфата и ацетил-КоА под действием фермента Дц-синтазы [Speckman, Collins, 1968; Kaneko et.al.1990]. Образование Дц по этому пути признается рядом ученых, однако Дц-синтаза не была выделена из клеток МКБ [Jonsson, Pettersson, 1977; Kempler, McKay, 1981]. Согласно второму пути диацетил образуется МКБ при неферментативном окислительном декарбоксилировании а-ацетолактата (АцЛ) [Veringa et.al.1984; Driedonks et.al.I990; Verhue, Tjan, 1991; Hugenholtz, Starrenburg, 1992], синтезирующегося при конденсации гидроксиэтил-ТРР с пируватом (ПВ) под действием фермента ацетолактатсинтазы (AuJIS) [КФ 4.1.3.18]. АцЛ декарбоксилируется до ацетоина (Ац) при участии фермента ацетолактагдекарбоксилазы (АцЛДС) [КФ 4.1,1.5]. Актуальной на сегодняшний день является разработка процессов, связанных с возможностью эффективного использования МКБ

для синтеза Дц, для этого необходимо знание метаболических путей и ферментов, лежащих в основе биосинтеза Дц МЮ>.

Цель и задачи исследования. Целью исследования было изучение ферментативных процессов лежащих в основе образования Дп МКБ. В задачи исследования входило. 1. Оценка Дц- и АцЛ-образуюшей способности штаммов ЬасвэсоссиБ 1ас(1К. Поиск штамма-продуцента Дц. 2. Изучение влияния условий культивирования на синтез Дц молочными лактококками. 3. Исследование в бесклеточных экстрактах МКБ активностей ключевых ферментов метаболизма цитрата. 4. Разработка схемы очистки и изучение свойств ферментов АцЛЯ и АцЛДС, участвующих » биосинтезе Дц.

Научная новизна работы. 1. Найден штамм (№ 4) способный образовывать значительные количества Дц и АцЛ в стационарных условиях, характерных для технологических процессов приготовления молочных продуктов. 2. Выделен штамм-сверхпродуцент Дц (№ 2103), являющийся природным мутантом, лишенным

ацетолактатдекарбоксилазы. 3. Модифицирован метод количественного определения АцЛ в среде для культивирования МКБ. 4. Впервые показано, что в статических условиях все штаммы образовывали АцЛ, что является доказательством образования Дц из АцЛ. 5. Установлено, что ацетолактатдекарбоксилазы штаммов ЬасЮсоссиз 1асЦк отличаются по кинетическим характеристикам. б. Показано, что особенности кинетических характеристик 2-х последовательно действующих ферментов - АцЛБ и АцЛДС обусловливают различия в уровне Дц у разных штаммов. 7. Разработаны схемы очистки и изучены свойства АцЛБ и АцЛДС .

Практическая ценность работы. Полученные результаты дополняют имеющиеся данные о ферментативных процессах, лежащих в основе образования Дц молочными лактококками и о влиянии различных факторов на образование Дц. Предложенная нами модификация метода

количественного определения АцЛ у Lactococcus lactis, выращенных на пептонно-дрожжевой среде, может быть применена для других молочнокислых бактерий, образующих Дц и АцЛ. Разработанный способ очистки AuJIS и АцЛДС может быть использован для дальнейшего изучения образования Дц в модельных экспериментах с чистыми ферментами. Обнаруженный уникальный штамм 2103, являющийся природным мутантом, лишенным АцЛДС, способен накапливать в среде очень высокие- концентрации Дц. На основе этой культуры возможна разработка технологии производства Дц для пищевой промышленности.

Апробация.

Материалы диссертации докладывались на Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 19-23 мая 1997), на конкурсе научных работ Института биохимии им. А. Н. Баха и на семинаре лаборатории ферментов микроорганизмов ИНБИ РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы и 1 сдана в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 27 рисунков и 19 таблиц. Список литературы включает 193 публикации.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследования являлись 15 штаммов L.lactis ssp.lactis biovar. diacetylactis (1-4, II, 12,) и L.lactis ssp. lactis (5-10, 13, 14, 15) из коллекции производственных МКБ Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности и штаммы L .lactis ssp. lactis из коллекции Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Для выращивания микроорганизмов использовали стерильное обезжиренное молоко и среду (ПДЭ) состава, г/л: глюкоза - 20; пептон -20; дрожжевой экстракт - 5; KÜ2PO., - 3,3; Na2HP04 - 2,3; CH,COONa *3H:0 - 2; цитрат Na • 2HzO -3; МцС12*Н20 - 0,2; MnS0^«5H20 - 0,05. Посевной материал выращивали в пробирках на стерильном обезжиренном молоке при температуре 30° С. В статических условиях выращивание проводили в пробирках и в конических колбах при 27-30° С. На качалке культуры выращивали в конических колбах при 27-30° Си 120 об/мин.

Для определения способности к потреблению цитрата культуры МКБ высевали на чашки Петри со средой Кемплера [Kempler, McKay, 1980], содержащей лимоннокислое железо и красную кровяную соль. Колонии МКБ, потребляющие цитрат, приобретали синюю окраску.

биомассу определяли по величине светорпсссивапия бактериальной суспензии при 540 им, откаллиброванной по сухой биомассе.[Cogaii, Walsh, Condon, 1989]

Ацетоин определяли по методике [Westerfeld, 1945], модифицированной нами. К 1мл анализируемой пробы с концентрацией Ац от 2 до 12 мкг/мл добавляли 0,6 мл 0,25%-ого раствора креатина (фирма "Merk", Германия) и 0,6 мл 3%-ого а-нафтола ("Реахим", Россия) в 2,5 М NaOH, выдерживали 12-15 мин на водяной бане при 37° С. Оптическую плотность измеряли на ФЭ1С при 540 нм в 0,5 см кювете.

ЛнЛ готовили непосредственно перед опытами гидролизом 10 мкл эфира а-метил-а-ацетоксиэтилацетоацетата двумя эквивалентами шелочи (1 мл 0,1 М NaOH) при комнатной температуре в течение 30 мин. Эфир был приготовлен по методике [Krampitz, 1948].

AiUI определяли по разнице концентраций Ац до и после обработки пробы серной кислотой [Umbarger, Brown, 1958, Bauerle et.al. 1964.]. Дц из анализируемой пробы (10 мл) полностью отгонялся с паром в 1-ю

фракцию дистиллята (5 мл), где его определяли по Верииге, Приллу и Хаммеру в модификации Уэлш и Когана [Veringa, cf.al.. 1984, Prill,, Hammer, 1938, Walsh, Cogan, 1974].

Для получения бес клеточных экстрактов клетки в конце экспоненциальной фазы роста (16-час) отделяли центрифугированием (6000 g, 15 мин, 4° С), пролшвали дважды 50 мМ фосфатным буфером (pH 6,5), затем суспендировали в том же буфере из расчета 3 мл на 1 г влажной биомассы. Полученную суспензию разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе (УЗД) ("MSE", Англия) при 0°С в течение 12 минут (но 1 минуте с 30-секундным интервалом). Разрушенные клетки отделяли центрифугированием при 25000 g и 4°С 20м и нут.

Концентрацию белка определяли по Брэдфорд с кумасси синим [Bradford, 1976] или, в ходе очистки ферментов, по оптической плотности при 280 нм на спектрофотометре "Shimadzu"( Япония)

Глюкозу определяли глкжозооксидазным методом. Цитрат определяли пиридиновым методом [Marier et.al. 1958].

Дц-редуктазную активность определяли по методу опубликованному Коганом [Cogan, 1981 J, NADH-оксидазную активность - no методу [Anders R.F., I logg, Jago, 1970], 1Д+)-лактатдегидрогеназную активность - по методу [Thomas, Turner, Crow, 1980.].

Активность АцЛДС определяли при 37°С в 1 мл реакционной смеси, содержащей 100 мМ ацетатный буфер (pH 5,7), 20 мМ АцЛ. Реакцию инициировали добавлением 05-0,2 мл бесклеточного экстракта. Для остановки реакции добавляли 1 мл 2,5 M NaOH. Концентрацию Ац анализировали по Вестерфелду [Westerfeld, 1945]. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкМ ацетоина за 1 минуту при заданных условиях.

(у

Активность AuJlS определяли при 37°С. К реакционной смеси, содержащей ШО мМ фосфатный буфер (рН 6,5), 0,17 мМ тиаминпирофосфат (ТРР) и 80 мМ пируват Na добавляли 0,05-0,2 мл бесклеточного экстракта. Останавливали реакцию 0,1 мл 50% НгБО^, пробы выдерживали в водяной бане при 37°С еще 25 минут для полного разрушения АцЛ до Аи. Затем отделяли выпавший белок центрифугированием при 12000 g 2 мин. и измеряли содержание Ац по Вестерфелду. За единицу активности Ац/IS принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ АцЛ в минуту.

Km для аллостерического фермента AuJIS определяли как концентрацию субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной. Для фермента, подчиняющегося кинетике Михаэлиса, К,„ находили по метолу двойных обратных величин Лайнуивера-Берка.

Электрофорез проводили по методу Лемли [Laemmli, 1970] в 10% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-Na). Белковые полосы окрашивали серебром по методу Нестеренко [Nesterenko, 1994.]. В качестве метчиков использовали: р-галактозидазу (116 кДа), фосфорилазу « (97,4 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), яичный альбумин (45 кДа), карбоангидразу (29 кДа) фирмы "Serva" (Германия).

Молекулярную массу нативного фермента AiJIS оценивали методом гель-хроматографии на колонке 93x0,8 см с Sephacryl S-200 (Pliannacia-LKB, Швеция), уравновешенной 20 мМ трис-буфером рН 7,2, содержащим 0,1 М NaCI и 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА). Использовали следующие белки-метчики: а- галактозидазу из Trichoderma reesei ( Mr 53,5 кДа) [Golubev, Neustroev, 1993], (3-ксилозидазу из Trichoderma reesei (Mr 100 кДа) [Herrmann et.al. 1997] и р-ксилозидазу из Aspergillus awamori (Mr 117 кДа) [Kurakake et.al. 1997].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Оценка способности штаммов Lactococcus iactis к образованию днацетила ияметоина.

На первом этапе исследования проводили поиск штаммов лактококков, активно продуцирующих Ди, и изучение влияния внешних факторов, включая состав питательной среды, на биосинтез Дц. В результате отбора обнаружен штамм 2103, образующий большие количества Дц. Оптимизирована среда для культивирования МКБ (ПДЭ-среда). Отобран штамм №4 из коллекции ВНИИ молочной промышленности, синтезирующий значительные количества Дц и Ац в стационарных условиях, характерных для технологических процессов приготовления молочнокислых продуктов. Установлено, что при выращивании на среде Кемплера все штаммы способны утилизировать цитрат и при пересевах на ПДЭ-среду не теряют цитратсбраживающей способности.

Установлена существенная роль аэрации и цитрата в образовании Дц и Аи культурами Lactococcus Iactis. Образование Дц было также значительно выше в присутствии цитрата. Добавление в среду цитрата и выращивание на качалке приводило к увеличению образования Дц в зависимости от штамма в 4-12 раз, а Ац- в 2-8 раз. Это подтверждает имеющиеся в литературе данные о том, что цитрат является источником излишка пирувага, который идет на синтез Ац и Дц [Cogan, 1987; Schmitt et.al. 1991; Tsau et.al. 1992; Snoep et.al.1992]. Микроорганизмы продуцируют Дц и Ац, чтобы устранить токсичные количества пирувата, не пошедшего на синтез клеточных материалов и не требующегося как акцептор водорода при образовании молочной кислоты.

Данных о том, насколько распространена у различных штаммов способность к биосинтезу Дц и Ац из глюкозы нет. Поэтому было проведено исследование штаммов на среде с глюкозой без цитрата. Все штаммы образовывали Дц из глюкозы, но в значительно меньших

количествах. Установлено, что при выращивании без нитрата в среде на качалке Дц может синтезироваться из глюкозы, как продукт ее гликолитического расщепления. Выращивание культур проводилось в течение 15 часов, к этому времени как мы установили потребление цитрата и глюкозы прекращалось. Однако при изучении динамики образования Дц и увеличении времени культивирования до 39 ч мы наблюдали возрастание содержания Дц и Ац в среде. Единственно возможной причиной увеличения образования Дц у этих культур являлось присутствие в среде АцЛ. который лекарбокеилирустся до Дц и Ац. Чтобы выяснить действительно ли АцЛ является предшественником Дц необходимо было определить способность МКБ выделять в среду АцЛ.

Образование а-ацетолактата в культурах МКБ.

Авторы [Speckman, Collins, 1968; Jonsson, Pettersson, 1977; Kaneko et.al. 1987; Jordan, Cogan, 1988) не обнаружили АцЛ в культуральной среде МКБ и это послужило одним из доказательств существования пути образования Дц через ферментативную конденсацию гидроксиэтил-тиаминпирофосфата и ацетил-КоА. Необходимо было выяснить вопрос о способности МКБ выделять в среду АцЛ. В литературе имеется крайне мало работ, в которых приводятся сведения о способности МКБ накапливать в среде АцЛ. Более того, эти сведения носят противоречивый характер. Известно, что Дц образуется из АцЛ только в релко встречающихся природных культурах - мутантах, лишенных ацетолактатдекарбоксилазы. Б других культурах, образующих Дц, вопрос о способности выделять в среду АцЛ остается открытым. Поэтому представлялось важным исследовать взаимосвязаны ли процессы синтеза Дц и АцЛ у L.Lactis.

Принимая по внимание, что одна из причин столь долгой дискуссии относительно механизмов образования Дц может быть связана с несовершенством методических подходов к анализу АцЛ, мы провели

предварительную работу по оценке используемых методов определения ЛцЛ.

При определении АцЛ за основу была принята методика, использованная при определении активности ацетолактатсинтазы [Bauerle, Freundlich, Stornier, 1964]. Выбор этой методики объясняется тем, что используя именно ее, Коллинз с сотр. показали неспособность МКБ выделять в среду АцЛ, тем самым подтверждая предложенный ими механизм ферментативного синтеза Дц из пирувата [Collins, Speckman, 19711. Мы установили, что применявшийся в этих работах Ац-мстод непригоден для измерения характерных для наших штаммов низких (до 0,6 мМ) концентраций АцЛ. Для анализа АцЛ нами был использован Дц-метод, который был разработан и применялся авторами [Veringa, Verbürg, Stadlioiiders, 1984], для определения АцЛ молоке. Насколько метод будет воспроизводиться в среде иного состава было неясно. Чтобы ответить на эти вопросы, была поставлена серия опытов и обнаружено влияние начальной концентрации АцЛ на степень окислительной деструкции и зависимость выхода Дц от pH пробы анализируемого образца и от уровня Дц в среде. Установлено, что формулой Веринга можно пользоваться в области низких (до 0,7мМ) концентраций АцЛ и в диапазоне концентраций Дц до 5мкт/мл. Этот метод лучше всего применять на начальных стадиях культивирования, когда АцЛ не успевает очень сильно разрушиться с образованием высокой концентрации Дц.

Одиннадцать штаммов были проверены на Дц- и АцЛ-образующую способность в динамике роста культур в статических и аэрируемых условиях с использованием ацетоинового (Ац-метод) и диацетилового методов (Дц-метод). В статических условиях АцЛ не был обнаружен Ац-мегодом. Результаты опытов подтвердили, что все без исключения штаммы выделяли АцЛ в культу рал ьную жидкость (табл.1). Штамм 2103 оказался сверхпродуцентом АцЛ.

Таблица I

Динамика образования АцЛ и Ди в культурах лактококков, выращенных в

статических условиях и на качалке.

№т ш тамма, где г - Статические Качалка

время условия

культивирования, час АцЛ.мМ Ди, АиЛ,мМ Ди,

мкг/мл мкг/мл

2? 0,17 - 0,16 -

2* 0,1 - 0,18 -

2.» 0,06 1,7 0,25 4,8

2"!9 0 2 0 5

45....... (1,1 0 0,03 0,6 1

4* 0,6 1,0 0,7 5,1

4'5 0,3 4,5 0,35 6,1

4" 0,03 2,4 0,1 1,2

4"' 0,02 2,0 0 0

6Ъ 0,06 1,3 0,25 4,8

б39 0 0 0,3 4,5

0,08 1,75 0,2 3,3

7" 0,09 1,8 0,28 5,3

..... 81* "Ч 0,05 1,4 0,1 Г 3,0

8" 0,08 1,75 0,17 5,1

10* 0,4 0,6 0,5 ч 1 4,5

10ь 0,04 - 1,8 8,5

ю25 0 0 2,1 12,9

1 о''1 0 0 1,1 9,7

11" 0,2 2,6 0,3 5,8

,,15 0,064-0,1 1,9 0,2 4,4+6,1

11* 0 0 - -

0 0 0,08 5,0

- - 0,060 1,5 0,35 7

15" 0,1 2,1 0,74 7,7

33," 0,05 0,7 0,6 1,7+4,5

33,'" - - 1,6 2,0

33 ч'5 0 0 0,13+0,3 1,5

33," О 0 0,09 0,7

2103" 0,4 7,7 1,4 2,7 ч 5

2103" 1,2 8,3 3,9 10+14

2103ь 3,9 9,0 7,4+8,3 72+93

2 ЮЗ2" 0,7 10,0 7,1+5,5 -

2 ЮЗ25 0,2 10,6 0,4 64

2103" 0,05 4,6 0 42

Так как в аэрируемых условиях все штаммы повышали оиосинтеч АцЛ и Дц, можно говорить о взаимосвязи АцЛ- и Дц-образования. Исключение составлял штамм 4. Это единственная культура, в которой аэрация не оказывала существенного влияния на синтез АцЛ и Дц (рис.1).

Штамм № 4

6 ■ с 5'

? 4 •

* 3. Ч 2 ; 1; о ч

время культивирования, час.

Рис. I. Влияние аэрации на образование диацетила 1 - на качалке, 2 - в статических условиях

Исследование образования АцЛ имеет принципиальное значение для решения вопроса о механизме образования Дц, поскольку в работах [Collins, Speckman, 1974; Jordan, Cogan, 1988] именно с помощью Ац-метода было показано отсутствие АцЛ в культуральной среде МКБ, что подтверждало образование Дц катализируемое Дц-синтазой. Несмотря на ряд условий, ограничивающих использование Дц-метода для измерения АцЛ в ПДЭ-среде, только с его помощью удалось показать, что в статических условиях все без исключения штаммы образовывали АцЛ, что доказывает образование Дц через окислительное декарбоксилирование АцЛ.

Исследование активностей ферментов метаболизма цитрата в бесклеточных экстрактах молочнокислых бактерий, выращенных на ПДЭ-среде с цитратом.

Чтобы иметь более полную картину ферментативных превращений, происходящих в клетке, ведущих к образованию АцЛ и Дц, была

исследована взаимосвязь между активностью ключевых ферментов метаболизма цитрата и образованием Дц у штаммов Шас^э Бзр. 1асКя и 1,. 1аст эзр. 1ас(15 Ыоуаг. с31асе1у!ас115, аккумулирующих АцЛ.

В бесклеточных экстрактах 15-ти часовых культур определяли активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (КФ 1.1.1.27), диацетипредуктазы (Дц-редуктазы) (КФ 1.1.1.5), КАЭН-оксидазы (КФ 1.11.1.1), АцЛ Б (КФ 4.1.3.18) и АцЛДС (КФ 4.1.1.5) (табл.2).

Таблица 2

Активность ключевых ферментов метаболизма цитрата в бесклеточных экстрактах МКБ _ ______________

Штамм ЛДГ ед/мг Дц- редуктаза, ед/мг НАДН-оксидаза ед/мг АцЛДС, ед/мг АцЛ Б, ед/мг

ЮмкМ 40 мкМ

2 10,4 0,035 0,008 0,007 0,061 0,46

3 8,5 0,047 0,007 0,006 0,052 0,69

4 3,7 0,01 0,17 0,02 0,04 0,26

6 6,5 0,066 0,011 0,006 0,093 0,55

7 7,5 0,033 0,005 0,03 0,15 0,52

8 5,9 0,033 0,004 0,004 0,05 0,44

10 7,1 0,079 0,005 0,003 0,07 0,48

11 6,4 0,033 0,038 0,006 0,072 0,36

13 11 0,058 0,008 0,004 0,023 0,44

14 10,8 0,088 0,021 0,006 0,038 0,36

15 8,4 0,057 0,005 0,003 0,033 0,46

335 6,8 0,04 0,03 0,011 - 0,58

. 2103 И 0,23 0,03 0 0 0,52

Исследование выявило высокий уровень АцЛ Я во всех штаммах кроме 4. Штаммы характеризовались низкой активностью АцЛДС. Отсутствие АцЛДС активности у штамма 2103 объясняет выделение

больших количеств АцЛ в среду, последующее декарбоксилирование которого ведет к образованию очень высоких концентраций Дц. Изучение особенностей кинетических параметров реакции декарбоксилирования АцЛ у различных штаммов позволило разделить исследованные штаммы на два типа - с гиперболической зависимостью активности декарбоксилазы от концентрации АцЛ ( 4 и 7 штаммы) и с сигмоидной (все остальные штаммы) (рис.2).

I ! « : о 1 =1

I !

л и

! О

! £ X

I б

I

I ч I >

; [АцЛ ],м М

Рис.2. Кинетика действия АцЛДС Для АцЛДС штамма 4 характерно очень низкое значение Ушах. Мы предположили, что различие в уровне Дц у разных штаммов объяснялось различием в механизме декарбоксилирования АцЛ. Известно, что аэрация подавляет активность ЛДГ и повышает активность АцЛБ и ЫАОН-оксидазы [Со^ап, 1995]. Образование больших количеств АиЛ 10-м штаммом в аэробных условиях объясняется активизацией АцЛБ и подавлением активности ЛДГ. Активность АцЛДС у 10 штамма имела сигмоидную зависимость от концентрации субстрата. Аэрация, по-видимому, увеличивает окислительно-восстановительный потенциал среды, что ведет к спонтанному окислительному декарбоксилированию. АцЛ до Дц. Таким образом, основная часть АиЛ, образованного 10-м штаммом, разрушалась до Дц, а не до Ац. На образование Дц влияли также

активность Дц-редуктазы и NADH-оксидазы. NADH-оксидаза предоставляет клетке альтернативный механизм регенерации NAD и создаются условия, при которых ПВК не расходуется на синтез молочной кислоты. Дц-рсдуктаза восстанавливает необратимо Дц в Ац, не обладающий ароматом. В задачу селекционеров входит подбор таких культур, которые обладали бы низкой Дц-редуктазной активностью и т.о. обеспечивали максимальное ароматобразование в молочных продуктах. Для 4 щтамма характерны очень низкая активность Дц-редуктазы и ЛДГ и высокая активность ЫА1)П-оксидазы, что является fviaiоприятпым для накопления Дц этим штаммом. Активность AuJIS 1-го штамма не увеличивалась в условиях аэрации, в отличие от остальных штаммов, поэтому этот штамм синтезировал много АоЛ и Дц в статических условиях выращивания.

Таким образом, полученные нами данные показали, что во всех штаммах, кроме 4, аэрация способствует образованию и накоплению Дц. активизируя АцЛБ и NADH-оксидазу и подавляя ЛДГ, оставляя 2 пути преобразования пирувата: в ацетил-КоА (ПДГ) и в АцЛ (АцЛБ).

Мы предположили, что механизм образования Дц связан с действием ферментов - АцЛ S и АцЛДС, отвечающих ¡а синтез и последующее разрушении АцЛ.

AiJJS АцЛДС ПВК -► АцЛ--*Ац

Высокая активность AiUIS и низкая АцЛДС ведет к накоплению АцЛ в среде с дальнейшим самопроизвольным декарбоксилированием до Дц. Поскольку механизм выброса АцЛ в культуральную среду может быть связан с особенностями кинетики действия 2-х последовательно действующих ферментов АпЛ8 и АцЛДС, мы очистили и изучили свойства этих ферментов, выделенных из культуры Uactis subsp.lactis biovar. diacetylaciis штамм № 4.

и

Выделение, очистка н свойства ацетолакчатсинтазы.

Свойства АцЛБ первоначально изучались в бесклеточном экстракте. Исследование активности АцЛВ в реакционных смесях с разными буферами позволило определить рН-оптимум фермента (рис.3). Оптимальное значение рН 5,8 в ацетатном и 6,5-7,0 в фосфатном буфере. Оптимум температуры для АцЛБ 38-40°С (рис.4). АцЛ5 в бесклеточном ■экстракте оказалась чрезвычайно нестабильной. Экстракт при комнатной температуре терял через 24 часа 50% активности. Было проведено исследование влияния стабилизирующих добавок и температуры на активность фермента. Фермент стабилизировался н присутствии пиру вата и 'ПФ (рис.5).

Изучение влияния ионов показало, что для проявления

каталитической активности АцЛБ не требуется что согласуется с

данными других авторов [Cogan, 1984].

Рис.3. Определение рН-оптимума АмПЭ.

ю" 8

■ I а

I

4 6

рН

- ацетатный буфер - ж - фос фатный бу фер ■

Рис4. Влияние температуры на активность АцГВ.

20 40 03

темтература, С

В результате проведенных экспериментов разработана схема очистки АцЛБ 1...1ас(15 эврЛа^!» Ь1 о\'аг/Л¡ассIу 1 ас11 б штамма 4 (табл.3). Основными этапами очистки являлись гидрофобная хроматография на Бутил-тойперл 650 ультрафильтрация, хроматография РРЬС на Мопо-0. Все буферные растворы содержали пиру ват (ЮмМ) и ТРР (0,2 мМ) в 'качестве стабилизаторов.

Рис.Б Хранение бесклеточны х

экстрактов 4 штамма в присутствии стабилизирую щих

Таблица 3.

Очистка ацетолактатсинтазы из ЬЛзсОб БиЬзрЛас!^ Ыоуаг.сИасс1у1асЙ5 штамм 4.

§ 5 н 5 и о Объём,мл Активность, ед/мл Общая активность, ед а о § и из 5 Концентра! ция белка, 1 мг/мл Удельная активность, 1 ед/ мг белка ч о X Степень очистки 1

Исходный экстракт 10 4160 41600 65 6,5 640 100 I

Вутил-Тойперл 650 Б 9 2311 20800 1,5 0,17 13867 50 22

Ультрафил ьтрация 3 6638 19914 0,66 0,22 30173 1 47 47

Моно-О 2 1791 . 3583 0,01 0,005 358300 9 560

Первым шагом очистки была гидрофобная хроматография на Бутнл-тойперле 650 Б. На колонку уравновешенную рабочим буфером с сульфатом аммония ( 20% насыщение) наносили раствор белка с (МН^БО.) (20% насыщение). Элюцию вели снижающимся градиентом концентрации соли (ЫН.|Ь50.| (20% - 0) в составе рабочего 50 мМ фосфатного буфера.

Рис.6 Хроматография АцЛ Б на бутил-тойперле 650 в.

41 л

; —•*—Белок, мкг/мл ♦ - Активность АцЛБ. ед/мг~|

Выход фермента на этой стадии очистки составил 50%, а удельная активность возросла в 22 раза (рис.6).

N301. М 1.0 О » О 8 О 7 О.б 0.5 О.-4

О.З 0.2 О- 1

1 Ю 20 ЭО <40

номера фракций

Рис. 7 Профиль элюцин АцЛ8 с колонки Мопо-0 (РРЬС). Заштрихована область активности АцЛН».

Активные фракции обессоливали и концентрировали ультрафильтрацией (УФ). В ходе УФ происходила 2-х кратная очистка. 11осле УФ концентрат разводили в 2 раза 50 мМ рабочим буфером, центрифугировали при 15000 g 30 минут, а затем наносили на колонку Mono Q (тип HR 5/5), предварительно уравновешенную 50 мМ рабочим буфером. Элюцию проводили линейным градиентом концентрации NaCI от 0 до I М в составе рабочего буфера. Выход фермента на стадии FPLC составил 9%. Профиль элюции AhJIS с ионообменной колонки Mono Q предоавлен ни рис 7. Очищенный фермент имел ул. активность 358300 сд/'мг. Степень очистки равна 560. При электрофорезе AuTIS в ПААГ в присутствии ДДС-Na было получено 2 белковые полосы, соответствующие 55 и 65 кДа (рис.8).

к Da

205

11Л-97-

45-2'J-

Рис.8. Электрофорез АцЛБ в ПААГ с ДДС-Na ,

I - бслки-мстчики: 2 - исходны!! экстракт; ? - гидрофобная хрочатогра-фия на Butyl-Toyopoarl 650 S: 4 - FPLC на Mono-Q. '

icDa

97.

Й7-

45- '

fcSSStessss?-j. ■ - • -v.. Рис. 9. Электрофорез AuJlS в ПААГ с ДДС-Na

1. белки метчики

2. гомогенный препарат

Очистка была проведена еще по одной дополнительно разработанной нами схеме, в результате которой был получен гомогенный белок с молекулярной массой 55 кОа (рис 9). Эта схема включала ИОХ на ДОА')-

тойперле n 20 мМ трис-буфере pH 7,2 (ступенчатая элюция от 0 до 0,5 М NaCI); диализ против 10-кратного объема 20 мМ трис-буфера pll 7,2, содержащего стабилизирующие добавки пиру вага (1 ОмМ) и тиаминпирофосфата (0,2мМ); FPLC на колонке Mono Q в том же трис-буфере (ступенчатая олюпия от 0 до 0,5 М NaCI) и IIPLC на колонке с phenyl Superosa (Pharmacia-LKB, Швеция ) n трис-буфере, элгоцню проводили ступенчато от 1,7 М до 0 М (NH^SO.,. Выход на последней стадии очистки составил лишь 0,2 %. Эта схема позволила получить шекфофоретически гомогенный фермент, по сю количеспт оказалось недостаточным для полной характеристики фермента. Молекулярная масса нативной AoJlS, определенная на колонке с Sepbacryl S-200, уравновешенной 20мМ трис-буфером, содержащим 0,1 М NaCI, соответствовала 150 кДа (рис.10). По видимому фермент состоит из 3-х идентичных субъединиц молекулярной массой 55 кДа.

Рис.10 Определение молекулярной массы нативной ацетолактатсинтазы методом гельфильтрации на Sephacryl S-200

5,25 --.....-.......-..........-......................................................1 ;

■5,2 5,15 ! 5,1

4,95 4,9 4,85 1 4,8

14 15 мл 16 17 18 '

Кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата (пирувата) сигмоидная (рис.11). Кажущаяся К„, для пирувата 70 мМ. Низкое сродство к субстрату (К„,=70мМ) играет важную роль в регуляции Дц-продукции.

2500

Рис. II. Зависимость удельной активности ацетолактатсинтазы от концентрации пирувата.

У многих бактерий существует две АцЛБ - одна анаболическая, она включается в биосинтез валина и изолейцина и имеет оптимум рН 8.0, другая катаболическая, катализирующая образование ацетоина из пирувата и имеет оптимум рН около 6.0. У Lactococcus lactis найдена и катаболическая, и анаболическая АцЛБ [Godon et.al.1992]. Выделенная нами синтаза являлась катаболической, т.к. работала при рН 6.5 и не требовала кофакторов. AixilS из L.lactis ssp. lactis являлась аллостерическим ферментом с низким сродством к субстрату, что подтверждало отсутствие конкуренции за пируват между АцЛБ и такими ферментами как лактатдегидрогеназа и пируватдегидрогеназа. Образование Дц наблюдается только в условиях высоких внутриклеточных концентраций ПВК, которое происходит при сбраживании цитрата культурой при низких рН [Hugenholtz, 1993]. Эти данные свидетельствуют о том, что образование АцЛ и Дц необходимо клеткам для удаления токсичного избытка пирувата JSnoep et.al. 1992.; Collins 1972.; Tsau et.al. 1992]. Исследование свойств очищенной АцЛБ показало, что для проявления АцЛ-синтазной активности необходима высокая концентрация ПВК. Такие высокие концентрации не могут быть достигнуты в нормальных физиологических условиях. Действительная концентрация

пирувата в цитоплазме будет гораздо ниже, а в результате скорость синтеза АцЛ ниже, чем скорость его декарбоксилирования.

Выделение, очистка и свойства ацетолактатдекарбоксилазы.

Этапы очистки АцЛДС представлены в табл.4. Основными этапами очистки являлись обработка экстракта протаминсульфатом, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобная хроматография на Бутил-той перле 650 Б (рис.12), диализ и хроматография РРЬС на Мопо-С). Получили очищенный в 4828 раз фермент с 4,8% выходом и уд. активностью 140 ед/мг. Оптимальным значением рН является 5,5-6,0 в ацетатном и 6-6,2 в фосфатном буфере (рис.13). Оптимум температуры при рН 6,0 - 40°С. Фермент отличался нестабильностью. При концентрации белка 2 мкг/мл полная потеря активности происходила за 24 ч при 4°С. Добавление бычьего сывороточного альбумина (5мг/мл) позволяло сохранять активность в течение 2-х нед при 4°С. Профиль элюции АцЛДС с колонки Мопо 0 и после рехроматографии РРЬС представлен на рис.14 и 15 соответственно. Электрофорез в ПААГ в присутствии ДДС-№ активных фракций на каждой стадии очистки АцЛДС представлен на рис.16. Полученный нами препарат показал одну белковую полосу с молекулярной массой 35 кДа.

Кривая зависимости активности АцЛДС от концентрации субстрата (АцЛ) -гиперболическая (рис.17). Кажущаяся К,,, равна 20 мМ (рис.18). Фермент терял активность в растворе ЭДТА (0,5мМ) (при инкубировании в течение 15 мин при 37° С наблюдали 3-х кратное снижение активности). Добавление 2мМ М&*2 восстанавливало 80 % активности. АцЛДС для проявления активности нуждалась в присутствии ионов Мц+2.

Таблица 4.

Очистка аистолактатдекарбоксилазы из L lactis subsp. lactis biovar.

5 й « = Исходный экстракт Обработка протамин-сульфатом 5 Объём,мл р Активность У ед/мл i 1 Общая активность, i ! ед Li О 0J t— ua S " 733,6 " 1 Концентра-o-j ция белка, : мг/мл Удельная активность, 1 ед/мг | ч о X 2 CQ 6° | Степень очистки i

0,029 100

90 0,23 21 235,8 2,6 0.09 100 3,1

Высали ванне (NHjhSO., 140-70] 3.5 3,7 ■ 13 108,5 31 0,1 1 62 3,8

Кутил-Тсш-перл 650 S 20 0,63 12,6 х 28 1.4 •0,45 60 15,5

Диализ про-1ш> 25 мМ трнс-буфера рН 7,3 FPLC на Mono 0 Речрома-тшрафня на FI'LC 30 7,0 0,21 0,24 0,3 12,6 6Г32" 0,42 0,045 " 0,5 5 Л 30 8,1 17,2 182,8

4,0 0,26 ! 0,0072 0,0018 140 4,8 4828

Put.

900 800 - 700 600 £ 500 v- 400 f. 300

to 200 100 0

12 O'Miciiva АцЛДС it а Бугил-i «it it с p.ic 650 S.

1

0.9 0.8 0,7 J o.eg 0.5 J 0.4§ 0.3« 0.2 0.1

1 Ь м i, i м

Л Kt niliinc 11, A llJ! ДС . с .1 Ml

Рис.13 Определение рН-оптимума для АцДДС

2,5

5 ' V , н (J с , сл/мл 2 1,5

о < Ct С t 2 и ef 1

э < 1 2 < < 0,5

А

О 1

4 1«

6 7

- ацетатный буфер * фосфатный буфер

2.4

Рис. 14. Профиль элюиии АцЛДС с колонки Mono Q (FPLC): 1- поглощение при 280 нм 2 - активность АцЛДС, ед/мл

Номера фракций

Рис.15 Рехроматография АцЛДС на колонке Mono Q (FPLC):

1.- поглощение при 280 нм; 2 - активность АцЛДС, ед/мл

кОа 1 2 3 4 5 6 7

205 -

11697672914 -

Рис. 16. ДДС-№-электрофореграмма стадий очистки АцЛДС

1. стандартные белки-метчики

2. исходный экстракт

.1. обработка протаминсульфатом

4. осаждение сульфатом аммония

5. гидрофобная хроматография на Ва!у1-Тоуореаг1 650 Б

6. 1-я РРЬС

7. 2-я РРЬС

И.мМ

Рис. 17. Зависимость активности ацетолактатдекарбоксилазы от концентрации а-ацетолактата (8).

1/8, (мМ)

Рис. 18 Нахождение константы Михаэлиса по методу двойных обратных величин Лайнуивера-Берка.

0,09

_ 0,08

I

$ 0,07 8 0,06

1 0.05 < Л

£ 0,04 ¡0.03^ А ■

■ ♦

| 0,02 - ♦

" 0,01

л

1

л

д

л ■

, - 2

3

♦ ♦

10 20 30 40 Сэффекторал^М

Рис. 19. Влияние эффекторов лейцина (I), валила (2) и изолейцина (3) на активность ацетолакгатдскарбо кси л азы.

В присутствие 40мМ лейцина, валина и изолейцина происходит 4-х, 3-х и 2-х кратная активация АцЛДС (рис.19). Эти три аминокислоты являлись активаторами для АцЛДС культуры Шас^'в бэр. 1ас11б Ыоуэг. ¿¡асе1у1асЦ5. Исследование кинетических свойств очищенной нами АцЛДС 4-го штамма показало гиперболический характер зависимости активности фермента от концентрации АцЛ и высокое сродство к субстрату (К,„=20мМ) при низком Ушах (0,06 ед/мг).

о

Крайне низкое содержание и нестабильность АцЛДС в бесклеточном экстракте не позволило нам выделить его в достаточном количестве. Фалип с сотрудниками [Plialip et.al. 1994] клонировали ген, кодирующий образование АцЛДС у МКБ в E.coli, лишенную АцЛДС. Таким образом им удалось добиться сверхсинтеза АцЛДС, выделить и охарактеризовать этот фермент.

Таким образом нами выделены, очищены и охарактеризованы ферменты биосинтеза Дц. Определены условия, оптимальные для проведения дальнейших кинетических исследований. Дальнейшая очистка ферментов до гомогенного состояния позволит как получить молекулярно-массовые характеристики, так и применить полученные ферменты в исследованиях совместной кинетики действия системы АцЛБ/АцЛДС.

ВЫВОДЫ

1. Проведена оценка способности различных штаммов Laclococcus lactis к образованию Дц-, Ац- и АцЛ. Найден штамм (№ 4), образующий значительные количества Дц и АцЛ в стационарных условиях, характерных для технологических процессов приготовления молочнокислых продуктов. Штаммы №10, 13, 15 также представляют интерес для дальнейшего изучения, как способные на ПДЭ-среде синтезировать значительные количества Дц и Ац при выращивании в аэрируемых условиях.

2. Изучено влияние внешних факторов на синтез Дц молочными лактококками. Установлена существенная роль аэрации и цитрата на образование Дц и Ац культурами Lactococcus lactis. Показано, что при отсутствии цитрата в среде в аэробных

устовиях Дц может синтезироваться из глюкозы, как продукт ее гликолитического расщепления.

Исследована взаимосвязь бисинтеза Дц и АцЛ у ЬасЮсоссна 1асЦ'5. Проведена оценка существующих методов количественного определения АцЛ. Оптимизирован метод для определения АцЛ в ПДЭ-среде, с помощью которого нами впервые показано, что в статических условиях все исследованные штаммы образовывали АцЛ, что доказывало образование Дц через окислительное декарбоксилирование

В бесклеточных экстрактах МКБ иасЙБ вБр. ксО'э и Ь. 1ас1|5 ББр. !асНй biovar. с11асе1у1ас11э исследована активность ферментов метаболизма цитрата, от которых зависит уровень АцЛ в среде. Установлено, что АцЛДС штаммов Ь.1асПз различаются по кинетическим характеристикам. Выдвинута гипотеза о том, что механизм декарбоксилирования АцЛ обусловливает различия в уровне Дц у разных штаммов, механизм образования Дц связан с особенностями кинетики действия двух последовательно работающих ферментов - АцЛ 8 и АцЛДС, отвечающих за синтез и последующее разрушение АцЛ.

Разработана схема очистки АцЛБ и АцЛДС. Изучены свойства и кинетические характеристики ферментов. Найден штамм - сверхпродуцент Дц и АцЛ (№2103), являющийся природным мутантом, лишенным АцЛДС. На основе этой культуры возможна разработка технологии производства Дц для пищевой промышленности. - . ■ '

АцЛ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

ККисриеваЮ. С.,С еребренниковВ М„ 3 а г у с т и н а Н. А., Б е з б о р о д о в А. М , Л и в ш и ц В. А., С е м е н и х и и а В. Ф. Биосинтез а-ацетолактата диацетилобразующими культурами ЬасЮсоссия 1ас1|«. - Второй съезд Биохимического Общества РАН, Пущино, 19-23 мая 1997г., 4. П., с. 506.

2. Серебрении ков В. М., К и с р и е в а Ю. С., Загусти на Н. А., Г а в р и л о в а Л. Н., С е м е н и х и н а В. Ф. Образование диацетила и ацетоина производственными штаммами лактококков в различных условиях выращивания. - Прикладная биохимия и микробиология, 1998, т.34, № 3, с. 276280.

3.Серебренников В. М., К и с р и е в а Ю. С., 3 а г у с т и н а Н. А., СеменихинаВ. Ф., Безбородое А. М. О способности диацетнлобразующих молочнокислых бактерий из рода Ьа^ососсия 55р. Выделять в среду а-ацетомолочную кислоту. - Прикладная биохимия н микробиология, 1999, т.35, № 6, с. 685-694.

4 К и с р и е в а Ю. С..Серебренников В М., 3 а г у с т и н а Н. А., Безбородое А. М. Выделение и очистка ацетолактатсинтазы и ацетолактатдекарбоксилазы из культуры ЬасШсоссиэ 1ас11 а. - Прикладная биохимия и микробиология, 2000, т.36, № 2, с. 131-137.

Тираж 100

Заказ 125

Объем 1,69 п. л.

Типография ООО "Полиграфсервис", ул. Профсоюзная, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кисриева, Юлия Сергеевна

Введение.

Глава! Обзор литературы.

1.1. Механизм утилизации цитрата.

1.2. Влияние аэрации.

1.3. Механизм образования Дц.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Объекты исследований и получение биомассы.

2.2. Методы определения ацетоина, диацетила и а-ацетолактата

2.3. Получение бесклеточного экстракта.

2.4. Определение концентрации белка.

2.5. Определение концентрации глюкозы и цитрата в культуральной жидкости бактерии.

2.6. Определение активностей ферментов.

2.7. Определение молекулярной массы субъединиц и нативного фермента.

2.8. Очистка ацетолактатсинтазы.

2.9. Очистка ацетолактатдекарбоксилазы.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Оценка диацетил и ацетоин - образующей способности штаммов Ьаскюоссиз 1ас^з.

3.1.1. Исследование коллекции ВНИИ молочной промышленности и ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов

3.1.2. Оптимальные условия для проявления культурой диацетил-образующей способности.

3.1.3. Оценка способности штаммов образовывать диацетил и ацетоин.

3.1.4. Итоги высева на среду Кемплера 15— штаммов для определения цитратсбраживающей способности.

3.2. а-Ацетолактат в культуральной среде МКБ из рода 1ас*ососсиз 1асйэ.

3.2.1 .Определение пределов надежности ацетоинового метода определения АцЛ.

3.2.2. Изучение динамики разрушения АцЛ до Дц в зависимости от состава среды, рН, начальной концентрации АцЛ.

3.2.3. Оценка штаммов лактококков по способности синтезировать АцЛ в зависимости от времени культивирования и условий выращивания.

3.3. Исследование активностей ферментов метаболизма цитрата в бесклеточных экстрактах молочнокислых бактерий.

3.4. Выделение, очистка и свойства ферментов ацетолактатсинтазы и ацетолактатдекарбоксилазы.

3.4.1. Выделение, очистка и свойства ацетолактатсинтазы

3.4.2. Выделение, очистка и свойства ацетолактатдекарбоксилазы.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтез диацетила в культурах молочнокислых бактерий"

Актуальность темы

В пищевой промышленности в качестве основного исходного сырья для приготовления ароматизаторов, придающих продуктам разнообразные оттенки сливочно-молочного аромата, используется диацетил (Дц). Его в качестве продукта жизнедеятельности образуют молочнокислые бактерии (МКБ). Дц является ответственным за характерный аромат молочнокислых продуктов. Собственного производства Дц в СНГ нет. До 1991 года его закупали в Германии и Голландии. Потребность промышленности в Дц на сегодняшний день по оценке Масложирпрома составляет не менее Зт/год, в перспективе по мере увеличения производства маргарина, потребность может возрасти до 5-10 т. Существует разработанный НПО "Ярсинтез" химический способ получения Дц из Сд-фракции углеводородных газов переработки нефти. Альтернативой химическому синтезу может быть микробный синтез Дц. Для этого необходимо найти штамм-сверхпродуцент, на основе которого может быть разработана технология получения Дц природного происхождения, не содержащего остатки полупродуктов органического синтеза и ценящегося на мировом рынке значительно выше полученных методом органического синтеза. До сих пор нет общепринятого представления о биохимическом механизме образования Дц. Существует две гипотезы образования Дц. Согласно одной Дц образуется при конденсации гидроксиэтилтиаминпирофосфата (гидроксиэтил-ТРР) и ацетил-КоА под действием фермента Дц-синтазы [Speckman, Collins, 1968; Kaneko et.al.1990]. Этот путь находил широкое признание вплоть до 80-х годов [Jonsson, Pettersson, 1977; Kempler, McKay, 1981], хотя экспериментальных доказательств, подтверждающих существование Дц-синтазы не было. Дц-синтаза никем не была выделена из культуры МКБ. Согласно второй гипотезе диацетил образуется МКБ при неферментативном окислительном декарбоксилировании а-ацетолактата (АцЛ) [De Man, 1959; Seitz et.al.1963; Branen, Keenan, 1972; Stadhouders, 1974; Veringa et.al.1984; Driedonks et.al.1990; Verhue, Tjan, 1991; Hugenholtz, Starrenburg, 1992], синтезирующегося при конденсации гидроксиэтил-ТРР с пируватом (ПВ) под действием фермента ацетолактатсинтазы (АцЛБ) [КФ 4.1.3.18]. АцЛ декарбоксилируется до ацетоина (Ац) под действием фермента ацетолактатдекарбоксилаза (АцЛДС) [КФ 4.1.1.5]. Существует необходимость в понимании метаболических путей и ферментов, лежащих в основе биосинтеза Дц МКБ. Потребительский рынок требует все большие количества натуральных продуктов и пищевых добавок. Многие продуцируемые микроорганизмами соединения могут быть синтезированы химическим путем. Однако, большинство вкусовых и ароматических соединений представляют собой комплексные смеси, общий эффект которых трудно воспроизвести. Вдобавок сегодняшний покупатель предпочитает "натуральные" продукты. По этим причинам компании во всем мире интенсивно исследуют пути использования микроорганизмов для биосинтеза вкусовых и ароматических смесей.

Актуальной на сегодняшний день является разработка процессов, связанных с возможностью эффективного использования МКБ для синтеза Дц, для этого необходимо знание метаболических путей и ферментов, лежащих в основе биосинтеза Дц МКБ.

Цель и задачи исследования

Главной целью исследования было изучение ферментативных процессов лежащих в основе образования Дц МКБ. В задачу исследования входили следующие вопросы:

1. Оценка Дц- и АцЛ-образующей способности штаммов Lactococcus lactis. Поиск штамма-продуцента Дц.

2. Изучение влияния условий культивирования на синтез Дц молочными лактококками.

3. Исследование активностей ключевых ферментов метаболизма цитрата в бесклеточных экстрактах МКБ.

4. Разработка схемы очистки и изучение свойств ферментов АцЛБ и АцЛДС, участвующих в биосинтезе Дц.

Научная новизна работы

1. Найден штамм (№ 4) способный образовывать значительные количества Дц и АцЛ в стационарных условиях, характерных для технологических процессов приготовления молочных продуктов.

2. Обнаружен уникальный штамм-сверхпродуцент Дц ( № 2103 ), являющийся природным мутантом, лишенным ацетолактатдекарбоксилазы.

3. Модифицирован метод количественного определения АцЛ в среде для культивирования МКБ (ПДЭ-среде) в диапазоне до 0,7 мМ.

4. Впервые показано, что в статических условиях все штаммы образовывали АцЛ, что является серьезным доказательством образования Дц из АцЛ.

5. Установлено, что ферменты ацетолактатдекарбоксилазы штаммов Ьа^ососсиэ 1асйз различаются по кинетическим характеристикам. Выдвинута гипотеза о том, что различия в уровне Дц у различных штаммов истекают из различия в механизме декарбоксилирования АцЛ.

6. Установлено, что особенности кинетических характеристик 2-х последовательно действующих ферментов ацетолактатсинтазы и ацетолактатдекарбоксилазы обусловливают различия в уровне Дц у разных штаммов.

7. Разработана схема очистки ацетолактатсинтазы и ацетолактатдекарбоксилазы.

Практическая ценность работы

Полученные результаты дополняют имеющиеся данные о ферментативных процессах, лежащих в основе образования Дц молочными 7 лактококками и о влиянии на Дц-образование внешних факторов. Предложенная нами модификация метода количественного определения АцЛ в Ьа^ососсив 1ас1!э выращенных на ПДЭ-среде может быть применена на других молочнокислых бактериях, образующих Дц и АцЛ. Разработанный способ очистки АцЛБ и АцЛДС может быть использован для дальнейшего изучения образования Дц в модельных экспериментах с чистыми ферментами. Обнаруженный уникальный штамм 2103, являющийся природным мутантом, лишенным АцЛДС, способен накапливать в среде очень высокие концентрации Дц. На основе этой культуры возможна разработка технологии производства Дц для пищевой промышленности.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кисриева, Юлия Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Проведена оценка способности различных штаммов Ьа^ососсиБ 1асКз к образованию Дц, Ац и АцЛ. Найден штамм (№ 4), образующий значительные количества Дц и АцЛ в стационарных условиях, характерных для технологических процессов приготовления молочнокислых продуктов. Штаммы №10, 13, 15 также представляют интерес для дальнейшего изучения, как способные на ПДЭ-среде синтезировать значительные количества Дц и Ац при выращивании в аэрируемых условиях.

2. Изучено влияние внешних факторов на синтез Дц молочными лактококками. Установлена существенная роль аэрации и цитрата на образование Дц и Ац культурами Ьаскэсоссиэ 1асйБ. Установлено, что при отсутствии цитрата в среде в аэробных устовиях Дц может синтезироваться из глюкозы, как продукт ее гликолитического расщепления.

3. Исследована взаимосвязь бисинтеза Дц и АцЛ у Ьа^ососсиэ 1асйз. Проведена оценка существующих методов количественного определения АцЛ и оптимизирован Дц-метод для определения АцЛ в ПДЭ-среде, с помощью которого нами впервые показано, что в статических условиях все исследованные штаммы образовывали АцЛ, что доказывает образование Дц через окислительное декарбоксилирование АцЛ.

4. В бесклеточных экстрактах МКБ иасйБ эвр. 1асйз и 1. 1асйз эвр. 1асйБ Ыоуаг. с11асе1у1ас11з, аккумулирующих АцЛ, исследована активность ферментов метаболизма цитрата, от которых зависит уровень АцЛ в среде. Установлено, что ферменты АцЛДС штаммов 1.1асйз различаются по кинетическим характеристикам. Выдвинута гипотеза о том, что механизм декарбоксилирования АцЛ обусловливает различие в уровне Дц у разных штаммов и механизм образования Дц связан с особенностями кинетики действия двух последовательно

91 работающих ферментов - АцЛЭ и АцЛДС, отвечающих за синтез и последующее разрушение АцЛ.

5. Разработаны схемы очистки АцЛБ и АцЛДС. Изучены свойства и кинетические характеристики ферментов.

6. Найден штамм - сверхпродуцент Дц и АцЛ (№2103), являющийся природным мутантом, лишенным АцЛДС. На основе этой культуры возможна разработка технологии производства Дц для пищевой промышленности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кисриева, Юлия Сергеевна, Москва

1. Банникова Л.А., Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Микробиологические основы молочного производства. Справочник.-М.: Агропромиздат.1987.

2. Богданов В.М., Пастер В.Я. Применение ароматообразующих микробов при выработке масла.//Мол. промышл.-1936.-Т.4,№14.

3. Богданов В.М. Пути усиления аромата масла.// Мол.-масл.пром.-1937.

4. Гибшман М.Р. Влияние химических веществ на образование летучих кислот, ацетоина и диацетила при молочнокислом брожении.// Микробиология.-1939,-Т.8, №3.-С.432.

5. Гриневич А. Г. Эффективность биологического действия некоторых физических и химических факторов на молочнокислые бактерии./дис. .д-ра биологических наук. Новосибирск., 1968.

6. Гриневич А.Г. Молочнокислые бактерии. Селекция промышленных штаммов,-Мн.: Высш.школа. 1981.

7. Калинина H.A., Ганина В.И., Суходелец В.В. Плазмидный состав и контроль ароматобразования у производственных штаммов лактококков. // Биотехнология.-1994.-№8.-С.7-10.

8. Квасников Е. И., Нестеренко О. А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. -М.: Наука, 1975.

9. Красникова Л.В. Метаболизм молочнокислых бактерий.-М.: Наука., 1980.

10. Лабораторные методы исследования в клинике и медицине.-М.: Медицина.,1987.-С.232.

11. Мазюкевич В.А. Изучение ароматических веществ, образующихся при молочнокислом брожении./ Диссертация'.-1937.

12. Максимова А.К. Интенсификация процесса ароматобразования в закваске для масла./ Автореф.канд.дисс., 1964, МГУ.

13. Новикова Г.А., Петрова Э.А., Ушакова В.И., Феофилова Е.П. Образование диацетила и ацетоина молочнокислыми стрептококками. / Труды института микробиологии АН СССР.-1959.-№6, С.87.

14. Пименова М.Н. Некоторые замечания к систематике молочнокислых стрептококков.// Микробиология.-1958.-Т.27, №2.-0.177-181.

15. Родопуло А.К., Кавадзе А.В., Писарницкий А.Ф. Биосинтез и метаболизм ацетоина и диацетила. // Прикладная биохимия и микробиология.-1976.-Т.12, вып.З.-С.309-316.

16. Тер-Казарьян С.Ш., Диланян З.Х., Сагоян А.С. Биосинтез диацетила молочнокислыми бактериями.// Прикладная биохимия и микробиология.-1972,-Т.8, №6.-0.896-900.

17. Шапошников В.Н. Техническая микробиология. М.: Советская наука., 1947, С.119.

18. Abbe K.,Takahashi S.,YamadaT. Involvement of oxygen-sensitive pyruvate formate-lyase in mixed-acid fermentation by Streptococcus mutants under strictly anaerobic conditions.// J.Bacterid.-1982.-Vol. 152.N 1 .-P. 175-182.

19. Anders R.F., Hogg D.M., Jago G.R. Formation of hydrogen peroxide by Group N Streptococci and its effect on their growth and metabolism. //Appl. Microbiol.-1970,-Vol.19.-P.602-612.

20. Andersen V.B. Formation of diacetyl and acetoin by certain starter organisms.// Milchwiss.-1959.-Vol.14.-P.429.

21. Basso A.L., Ricca E., Caruso C., Ferrara L., De Felice M. Acetohydroxy acid synthase and threonin deaminase activities and the biosynthesis of isoleucine-leucine-valine in Streptococcus bovis.// Res.Microbiol.-1993.-Vol.144.-P.539-545.

22. Bills D.D.,Day E.A. Dehydrogenase activity of lactic streptococci.// J.Dairy Sci.-1966.-Vol.49.N 5.-P.1473-1477.

23. Bradford M.M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding//Anal.Biochem.-1976.-Vol.72.N 2.-P.248-254.

24. Branen A.L., Keenan T.W. Diacetyl and acetoin production by Lactobacillus casei.//Appl.Microbiol.-1971.-Vol.22.N 3.-P.517-521.

25. Branen A.L., Keenan T.W. Effect of citrate on the composition and metabolism of Lactobacillus casei//Appl.Microbiol.-1971.-Vol.21N 5.-P.993-1001.

26. Branen A.L.,Keenan T.W. Biosynthesis of -acetolactate and its conversion to diacetyl and acetoin in cell-free extracts of Lactobacillus casei// Can. J.Microbiol.-1972.-Vol.8.-P.480-485.

27. Broom M.C.Thomas M.P.,Hiller A.J.,Jago G.R.// Pyruvate dehydrogenase activity in group N streptococci.//Aust.J.Biol.Sci.-1980.-Vol.33.N 1.-P.15-25.

28. Chistensen M.D.,Albury M.N.,Pederson C.S. Variation in the acetic acid-lactic acid ratio among the lactic acid bacteria.//Appl.Microbiol.-1958,-Vol.6.N 2.-P.316-318.

29. Chuang L.F.,Collins E.B. Biosynthesis of diacetil in bacteria and yeast.// J.Bacterid.-1968.-Vol.95.N 9.-P.2083-2089.

30. Chuang L.F.Collins E.B. Inhibition of diacetyl synthesis by valine and the roles of -ketoisovaleric acid in the synthesis of diacetyl by Saccharomyces cerevisiae// J.General Microbiol.-1972,-Vol.72.N 1.-P.201-210.

31. Cogan T.M. Citrate utilization in milk by Leuconostoc cremoris and Streptococcus diacetylactis// J.Dairy Res.-1975.-Vol.42.N 1 .-P.139-146.

32. Cogan T.M. Constitutive nature of the enzymes of citrate metabolism in Streptococcus lactis subsp.diacetylactis//J.Dairy Res.-1981 .-Vol.48.N 2.-P.489-493.

33. Cogan T.M.,CTDown M.,Mellerick D. Effect of pH and sugar on acetoin production from citrate by Leuconostoc lactis//Appl.Environ.Microbiol.-1981.-Vol.41.N 1.-P.1-5.

34. Cogan T.M. Acetoin production and citrate metabolism in Streptococcus lactis subsp. diacetylactis.// Ir.J.Food Sci.Technol.-1982.-Vol.6.N 1.-P.69-78.

35. Cogan.T.M. Acetolactate synthase of Leuconostoc cremoris and its regulation of acetoin production//J.Dairy Res.-1984.-Vol.51.N 2.-P.597-604.

36. Cogan T.M. Co-metabolism of citrate and glucose by Leuconostoc spp.: effect on growth,substrates and products// J.Appl.Bact.-1987.-Vol.63.-P.551-558.

37. Cogan T.M.,Walsh D.Condon S. Impact of aeration on the metabolic end-products formed from glucose and galactose by Streptococcus lactis// J.Appl.Bacteriol.-1989.-Vol.66.N 1 .-P.77-84.

38. Cogan T.M.Jordan K.N. Metabolism of Leuconostoc bacteria// J.Dairy Sci.-1993.-VOI.77.N 9.-P.2704-2717.

39. Cogan T.M. Flavour production by dairy starter cultures// J.Appl.Bact.Symposium supplement.-1995.-Vol.79.N 1.-P.49-64.

40. Collins E.B.,Bruhn J.C. Roles of acetate and pyruvate in the metabolism of Streptococcus diacetylactis// J.Bacteriol.-1970.-Vol.103.N 3.-P.541-546.

41. Collins E.B. Biosynthesis of flavour compounds by microorganisms// J.Dairy Sci.-1972.-Vol.55.N 7.-P.1022-1028.

42. Collins E.B.,Speckman R.A. Evidence for cellular control in the synthesis of acetoin or -ketoisovaleric acid by microorganisms.//Can.J.Microbiol.-1974.-Vol.20.-P.805811.

43. Collins E.B.,Speckman R.A. Influence of acetaldehyde on growth and acetoin prodaction by Leuconostoc citrovorum.// J.Dairy Sci.-1974.-Vol.57.N 4.-P.1428-1433. .

44. Condon S. Responses of lactic acid bacteria to oxygen.// FEMS Microbiol.Reviews.-1987.-Vol.46.

45. Cox G.A. The effect of acidity on the production of diacetyl by betacocci in milk.// J.Dairy Res.-1945,-Vol. 14.-P.28-35.

46. CrowV.L. Properties of 2,3-butanediol dehydrogenases from Lactococcus lactis subsp.lactis in relation to citrate-fermentation.// Appl.Environ.Microbiol.-1990,-Vol.56.N 6.-P. 1656-1665.

47. David S.,Van der Rest M.E.,Driessen A. J.M.,Simons G.,De Vos W.M. Nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of the Lactococcus lactis citrate permease gene.// J.Bacteriol.-1990.-Vol. 172.-P.5789-5794.

48. David S. Genetics of mesophilic citrate fermenting lactic acid bacteria. PhD Thesis. Agricultural University of Wageningen, Wageningen, 1992.

49. De Cardenas I.L.B.,Oliver G. Effect of pyruvate on the growth and the production of diacetyl and acetoin by Lactobacilli.// Microbiologie-Aliments-Nutrition.-1990.-Vol.8.-P.295-309.

50. De Cardenas I.L.B.,De Portillo M.C.P.,De Rivadeneira M.C.A.,Oliver G. Effect of temperature on diacetyl and acetoin production by Lactobacillus plantarum.// Microbiologie-Aliments-Nutrition.-1991 .-Vol.9. N 1 .-P. 185-191.

51. De Ley J. On the formation of acetoin by acetobacter.// J.Gen.Microbiol.-1965,-Vol.21.-P.352-365.

52. Dirar H.Collins E.B. End-products,fermentation balances and molar growth yields of homofermentative lactobacilli.// J.Gen.Microbiol.-1972.-Vol.73.-P.233-238.

53. Dolin M.L.,Gunsalus I.C. Pyruvic acid metabolism.//J.Bacteriol.-1951 .-Vol.62.N 1,-P.199-214.

54. Driedonks R.A.,Fellinger A.J.,Verbakel J.M.A.,Verhue W.M.,Verrips C.T. Food biotechnology: from basic to applied microbiology// J.Structural Biol.-1990,-Vol.104.N 1 -P.128-133.

55. Drinan D.F.,Tobin S.,Cogan T.M. Citric acid metabolism in hetero- and homofermentative lactic acid bacteria.// Appl.Environ.Microbiol.-1976.-Vol.31 .N4.-P.481-486.

56. El-Gendy S.M., Abdel-Galil H., Shahin Y., Hegazi F.Z. Acetoin and diacetyl production be homo- and hetero-fermentative lactic acid bacteria.// J.Jood Prot.-1983.-Vol.46.-P.420-425.

57. Friedmann T.E., Haugen G.E./ Pyruvic acid : determination of keto acid in blood and urine.// J.Biol.Chem.-1943.-Vol. 147.-P.415-442.

58. Galesloot T.E.,Hassing F.,Stadhouders J. Agar medium for the isolation and enumeration of aromabacteria in starters.// Netherlands Milk Dairy J.-1961 .-Vol.15,-P.127.

59. Gibson Y., Abd-el-Malek Y. The formation of CO by lactic acid bacteria and Bacillus licheniformis and a cultural method of detecting the process.//J.Dairy Res.-1945.-Vol.14.N 1.-P.35-44.

60. Gleen W.E., Prouty C.C. Bacteriological studies of cultured buttermilk. // Appl. Microbiol.-1955.-Vol.3.-P.317.

61. Godtfredsen S.E., Ottesen M. Maturation of beer with a-acetolactate decarboxylase.// Carlsberg.Res.Commun.-1982.-Vol.47.-P.93-103.

62. Godon J.-J.,Chopin M.-E.,Ehrlich S.E. Branched-chain amino acid biosynthesis genes in Lactococcus lactis subsp.lactis.// J.Bacteriol.-1992.-Vol. 174.-P.6580-6589.

63. Golubev A.M., Neustroev K.N. //J.Mol. Biol.- 1993.-Vol. 58,- P. 550-561.

64. Gornall A.G., Barswill C.J., Davis M.M. Determination of serum protein by means of the biuret reaction.//J.Biol.Chem.-1949.-Vol.177.-P.751-766.

65. Growell E.A., Guymon J.F. Influence of aeration and suspended material on higher alcohols, acetoin and diacetyl during fermentation. //Amer. J.Enol.Viticult.-1963,-Vol.14.-P. 214.

66. Halpern Y.S.,Umbarger H.E. Evidence for two distinct enzyme systems forming acetolactate in Aerobacter aerogenes. // J.Biol.Chem.-1959.-Vol.234.-P.3067-3071.

67. Harvey R.J.,Collins E.B. Role of citritase in acetoin formation by Streptococcus diacetylactis and Leuconostoc citrovorum.// J.Bacteriol.-1961.-Vol.82.N 6.-P.954-959.

68. Harvey R.J.Collins E.B. Citrate transport system of Streptococcus diacetilactis.// J.Bacteriol.-1962.-Vol.83.N 7.-P.1005-1011.

69. Harvey R.J.,Collins E.B. Roles of citrate and acetoin in the metabolism of Streptococcus diacetylactis.// J.Bacteriol.-1963.-Vol.83.N 9.-P. 1301-1307.

70. Harvey R.J., Collins E.B. The citritase of Streptococcus diacetylactis. Substrate, products and equilibrium. // J.Biol.Chem.-1963.-Vol.238.-P.2648.

71. Henderson C.E.,Perham R.N. Purification of the pyruvate dehydrogenase multienzyme complex of Bacillus stearothermophilus and resolution of its four component polypeptides.// Biochem.J.-1980.-Vol.189.-P.161-172.

72. Herrmann M.C. // Biochem. J.-1997,- Vol.321 ,-P 375-381.

73. Hiller A.J.,Jago G.R. L-lactate dehydrogenase,FDP-activated,from Streptococcus cremoris.// Methods Enzymol.-1982.-Vol.89.-P.362-367.

74. Hoecker W.H., Hammer B.W. Important factors in flavor development in butter cultures. // Iowa State College J.Sci.-1944.-Vol.18.-P.267.

75. Holtzclaw W.D.,Chapman L.F. Identification of a pH 6,5 acetohydroxyacid synthetase in Bacillus subtilis.//Arch.Microbiol.-1974,-Vol.96.-P.267-270.

76. Holtzclaw W.D.,Chapman L.F. Degradative acetolactate synthase of Bacillus subtilis: purification and properties.// J.Bacteriol.-1975.-Vol. 121 .N 3.-P.917-922.

77. Holzer H., Kohlhaw G. Enzymatic formation of a-acetolactate from a-hydroxyethyl-2-thiamine pyrophosphate and pyruvate. // Biochem.et Biophys. Res. Communs.-1961.-Vol.5.-P.452.

78. Hugenholtz J.,Starrenburg M.J.C. Diacetil production by different strains of Lactococcus lactis subsp.lactis var.diacetylactis and Leuconostoc spp.// Appl.Microbiol.and Biotechnol.-1992.-Vol.38.N 1.-P.17-22.

79. Hugenholtz J.Citrate metabolism in lactic acid bacteria.// FEMS Microbiology Reviews.-1993.-Vol. 12.-P. 165-178.

80. Hugenholtz J.,Starrenburg M.J.C.,Weerkamp A.H. Diacetyl production by Lactococcus lactis : Optimisation and metabolic engineering.// Progress in Biotechnology.-1994.-Vol.9.-P.225-228.

81. Inove T., Masuyama K. Yamamoto Y., Okada K., Kuroiwa Y. Mechanism of diacetil formation in beer.//J.Ferment.Technol.-1968.-Vol.46.-P.342-344.

82. Jonsson B.H.,Pettersson H.E. Studies on the citric acid fermentation in lactic starter cultures with special interest in -acetolactic acid.// Milchwissenschaft.-1977.-Vol.32.N 10.-P.587-594.

83. Jordan K.N.,Cogan T.M. Production of acetolactate by Streptococcus diacetylactis and Leuconostoc spp.// J.Dairy Res.-1988.-Vol.55.-P.227-232.

84. Jordan K.N.,Cogan T.M. Growth and metabolite production by mixed-strain starter cultures.// Irish J.of Agricultural and Food Research.-1995,-Vol.34.N 1.-P.39-47.

85. Juni E. a-Acetolactic acid an intermediate in acetylmethylcarbinol formation. // Federat. Proc.-1950.-Vol.9.-P.396.

86. Juni E. Mechanisms of formation of acetoin by bacteria.// J.Biol.Chem.-1952.-Vol.195.-P.715-726.

87. Kandler 0. Carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria.// J.Microbiol.-1983,-Vol.49.N 3.-P.209-224.

88. Kaneko T.,Suzuki H.,Takahashi T. Diacetyl formation and degradation by Streptococcus lactis subsp.diacetylactis 3022.// Agric.Biol.Chem.-1986. Vol.50. N 10. P.2639-2641.

89. Kaneko T.,Suzuki H.,Takahashi T. The effect of metal ions on diacetyl production by Streptococcus lactis subsp.diacetylactis 3022.// Agric.Biol.Chem.-1987.-Vol.51 N 9,-P.2315-2320.

90. Kaneko T.,Watanabe Y.,Suzuki H. Enhancement of diacetyl production by a diacetyl-resistant mutant of citrate-positive Lactococcus lactis ssp.lactis 3022 and by aerobic conditions of growth.//J.Dairy Sci.-1990.-Vol.73.N 2.-P.291-298.

91. Kaneko T.,Takahashi M.,Suzuki H. Acetoin fermentation by citrate-positive Lactococcus lactis subsp.lactis 3022 grown aerobically in the presence of hemin or Cu.//Appl.Environ.Microbiol.-1990.-Vol.56.N 9.-P.2644-2649.

92. Keen A.R.,Walker N.J. Diacetyl,acetoin and 2,3-butylene glycol,2-butanone and 2-butanol concentrations in ripening Cheddar cheese.// J.Dairy Res.-1974.-Vol.41-P.65-71.

93. Keenan T.W.,Lindsay R.C.,Morgan M.E.,Day E.A. Acetaldehyde production by single-strain lactic streptococci.// J.Dairi Sci.-1966.-Vol.49.-P.10-14.

94. Keenan T.W. Production of acetic acid and other volatile compounds by Leuconostoc citrovorum and Leuconostoc dextranicum.// Appl.Microbiol.-1968.-Vol.16.-P.1881-1885.

95. Keenan T.W.,Lindsay R.C. Diacetyl production and utilization by Lactobacillus species.// J.Dairy Sci.-1968.-Vol.51 .N 2.-P. 188-191.

96. Kempler G.M.,McKay L.L. Genetic evidence for plasmid-linked lactose metabolism in Streptococcus lactis ssp.diacetylactis.//Appl.Environ.Microbiol.-1979.-Vol.37 -P.1041-1047.

97. Kempler G.M.,McKay L.L. Improved medium for detection of citrate-fermenting Streptococcus lactis ssp.diacetylactis.//Appl.Environ.Microbiol.-1980.-Vol.39,-P.926-929.

98. Kempler G.M.,McKay L.L. Biochemistry and genetics of citrate utilization in Streptococcus lactis spp.diacetylactis.// J.Dairy ScL-1981 .-Vol.64.N 7.-P. 1527-1539.

99. Klaver F.A.M., Kingma F., Olieman C. Estimation of a-acetolactic acid in cultured dairy products by HPLC. In Posters and brief communications of XXIII International Dairy Congress, Montreal -1990.-P.229.

100. Kneteman A. Enrichment and isolation of Streptococcus citrophilus van Beynum et Pette Antonie van Leenwenhoek.// J.Microbiol.Serol.-1952.-Vol.18.-P.275.

101. Kobayashi Y.,Kalnitsky G.The bacterial synthesis of -acetolactate.// J.Biol.Chem.-1954.-Vol.211 .-P.473-482.

102. Kosikowski F. Cheese and fermented milk foods.Edwards Bros.,Ann Arbor,Mich.,1966.

103. Krampitz L.O. Synthesis of a -acetolactic acid.// Archives of Biochemistry.-1948,-Vol.17.-P.81-85.

104. Kuiper J.,Verhue W.M.M.,Klapwijk P.M. Aroma composition,the use thereof and the process for the preparation thereof. EP 0247646, Unilever BV,Rotterdam, 1988.

105. Kurakake M. // Biosci. Biotech. Biochem.- 1997.-Vol.61 .-P.2010-2014.

106. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T-4.ll Nature (London).-1970-Vol.227-P.680-685.

107. Lee S.M., Drucker D.B. Analysis of acetoin and diacetyl in bacterial culture supernatants by gas-liquid chromatography.// J. Clin. Microbiol.-1975-Vol.2-P. 162164.

108. Lindmark D.G., Paoblea P., Wood H.G. The pyruvate-formate lyase system of Streptococcus faecalis.// J.Biol.Chem.-1969.-Vol.244.-P.3605-3612.

109. Lindsay R.C., Day E.A. Rapid quantitative method for determination of acetaldehyde in lactic starter cultures.//!Dairy Sci.-1965.-Vol.48.N 4.-P.665-669.

110. Lin J.,Schmitt P.,Divies C. Characterization of a citrate negative mutant of Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides:metabolic and plasmidic properties.// Appl.Microbiol. Biotechnol.-1991.-Vol.34.-P.628-631.

111. Loken P.J.,Stormer F.C. Acetolactate decarboxylase from Aerobacter aerogenes// Eur.J.Biochem.-1970,-Vol. 14.-P. 133-137.

112. London J. The ecology and taxonomic status of the lactobacilli.// Ann. Rev.Microbiol.-1976.-Vol.30.-P.279-301.

113. Magee P.T.,De Robichon-Szulmajster H. The regulation of isoleucine-valine biosynthesis in S.cerevisiae.3. Properties and regulation of the activity of acetohydroxy acid synthetase.// Eur.J.Biochem.-1968.-Vol.3.-P.507-511.

114. Malthe-Sorensen D.,Stormer F.C. The pH 6 acetolactate-forming enzyme from Serratia marcescens.Purifications and properties.// Eur.J.Biochem.-1970.-Vol.14.-P. 127-132.

115. Man de J.C. The formation of diacetyl and acetoin from a-acetolactic acid.// Rec.trav.chim.Pays-Bas.-1959.-Vol. 78.-P.480-486.

116. Man de J.C.,Rogosa M.,Sharpe M.E. A medium for the cultivation of Lactobacilli.// J.Appl.Bacteriol.-l 960.-Vol.23.N 1 .-P. 130-137.

117. Man de J.C.,Galesloot T.E. The effect of the addition of manganese to milk upon the growth of starter bacteria.// Neth.Milk Dairy.-1962.-Vol.16.N 1.-P.1-23.

118. Marier J.R., Boulet M. Direct determination of citric acid in milk with an improved pyridine-acetic anhydride method.// J.Dairy Sci.-1958/-Vol.21 .-P. 1683-1692.

119. Marshall V.M. Fermented milks and their future trends//J.Dairy Research.-1987.-Vol.54.N 4.-P.559-574.

120. Marshall V.M. Lactic acid bacteria:starters for flavours.// FEMS Microbiol.Rev.-1987.-Vol.47.-P.327-336.

121. Matuszewski T.E.,Pijenowski E.,Supinska J. Streptococcus diacetylactis n.sp.i.jeo zastusowanie przy wyrobie masta.// Pol.Roczniki Nauk Rolniczych-1936.-Vol.36.-P.1.

122. McFall S.M.,Montville T.J. pH-mediated regulation of pyruvate catabolism in Lactobacillus plantarum chemostat cultures.// J.Ind.Microbiol.-1989.-Vol.4.-P.335-340.

123. Mellerick D.,Cogan T.M. Induction of some enzymes of citrate metabolism in Leuconostoc lactis and other heterofermentative lactic acid bacteria.// J.Dairy Research.-1981.-Vol.48.N 3.-P.497-502.

124. Michaelian M.B.,Farmer R.S.,Hammer B.W. Relationship of acetylmethylcarbinol and diacetyl to butter cultures.// Iowa Agric.Exp.Stn.Res.Bull-1933.-N.155.-P.323-360.

125. Mizuno W.G.,Jezeski J.J. Studies on starter metabolism.IV.Effect of various substrates on the formation of acetoin by a mixed strain starter culture.// J.Dairy Sci.-1959.-Vol.42.N 2.-P.251-255.

126. Mizuno W.G.,Jezeski J.J. Starter metabolism.V.The mechanism of acetoin formation as determined with C14-labeled substrates.// J.Dairy Sci.-1961.-Vol.44,-P.579-588.

127. Monnet C.,Phalip V.,Schmitt P.,Divies C. Comparison of -acetolactate synthase and -acetolactate decarboxylase in Lactococcus spp. and Leuconostoc spp.//Biotechnol.Lett.-1994.-Vol.16.N 3.-P.257.

128. Monnet C.,Schmitt P.,Divies C. Diacetyl production in milk by an -acetolactic acid accumulating strain of Lactococcus lactis ssp.lactis biovar.diacetylactis.//

129. J.Dairy Sci.-1994.- Vol.7.-P.2916-2924.

130. Murphy M.G.,Condon S. Comparison of aerobic and anaerobic growth of Lactobacillus plantarum in a glucose medium.//Arch.Microbiol.-1984.-Vol.138.-P.4953.

131. Nesterenko M.V.// Biochem.Biophys.Methods.-1994-Vol.28-P.239-242.

132. Nickels C.,Leesment H. Method for the differentiation and qualitative determination of starter bacteria.// Milchwissenschaft.-1964.-Vol.19.N 6.-P.374-378.

133. Oberman H. A comporative study on acetoin formation by some lactic streptococci. // Intern.Dairy Cong.16th.-1962.-Reports B.-P.273.

134. Orla-Jensen S.,Orla-Jensen A.O.,Spur B. The butter aroma bacteria.// J.Bacteriol.-1926.-Vol.12.N 1 .-P.333-341.

135. Patel M.S.,Roche T.E. Molecular biologi and biochemistry of pyruvate dehydrogenase complex.// FASEB J.-1990.-Vol.4.-P.3224-3233.

136. Perham R.N.Packman L.C.,Radford S.E. 2-Oxo acid dehydrogenase multienzyme complex : in the beginning and halfway there.// Biochem.Soc.Symp.-1987.-Vol.54.-P.67-81.

137. Pette J.W. Some aspects of the butter aroma problem. Proceedings of the 12th International Dairy Congress.-1949.-Vol.2.-P.572-579.

138. Phalip V.,Monnet C.,Schmitt P.Renault P.,Godon J.,Divies C. Purification and characterization of the catabolic -acetolactate synthase from Lactococcus lactis subsp.lactis NCDO 2118//FEBS Letters.-1994.-Vol.351 .-P.95-99.

139. Phalip V.,Schmitt P.,Divies C. Purification and characterization of the catabolic -acetolactate synthase from Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris// Current Microbiology.-1995.-Vol.31 .-P.316-321.

140. Pien V., Baisse J., Matrin R. Le dosage du diacetyl dans les beurres.//Lait.-1937.-Vol. 17.-P.673-698.

141. Prill E.A.,Hammer B.W. A colorimetric method for the micro-determination of diacetyl// Iowa State College Journal of Science.-1938.-Vol.12.-P.385-395.

142. Ramos A.,Jordan K.,Cogan T.,Santos H. Citrate and glucose co-metabolism by Lactococcus lactis subsp.lactis var.diacetylactis and Leuconostoc spp.//

143. Appl.Microbiol.Biotechnol.-1993.-Vol.38.-P. 17-22.

144. Rasmussen A.M.,Gibson R.M.,Godtfredsen S.E.,Ottesen M. Purification of a-acetolactate decarboxylase from Lactobacillus casei DSM 2547.// Carlsberg Res.Commun.-1985.-Vol.50.-P.73-82.

145. Reddy M.S.,Vedamuthu E.R.,Washam C.J.,Reinbold G.W. Agar medium for differential enumeration of lactic streptococci.//Appl.Microbiol.-1972.-Vol.24.-P.947-949.

146. Rossi J., Clementi F., Haznedari S. Diacetyl and acetoin production by immobilized Streptococcus diacetylactis.// Milchwissenschaft.-1984.-Vol.39.-P.336.

147. Russel J.B., Strobel H.J., Driessen A.J.M., Konings W.N. Sodium-dependent transport of neutral amino acids by whole cells and membrane vesicles of Streptococcus bovis, a ruminal bacterium.// J.Bacteriol.-1988.-Vol.170.-P.3531-3536.

148. Sandine W.E.,Seitz E.W.,Elliker P.R.,Day E.A. Studies on the mechanism of diacetyl synthesis by Streptococcus diacetilactis.// J.Dairy Sei.-1961 .-Vol.44.N 5,-P.1158-1162.

149. Schmitt P., Couvreur C., Cavin J.F., Prévost H., Divies Ch. Citrate utilization by free and immobilized Streptococcus lactis subsp.diacetylactis in continuous culture.//Appl.Microbiol.Biotechnol.-1988.-Vol.29.-P.430.

150. Schmitt P.,Divies C.,Merlot C. Utilization of citrate by Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris in continuous culture.// Biotechnol.Lett.-1990,-Vol.12.-P.127-130.

151. Schmitt P., Divies C. Effect of varying citrate levels on C4 compound formation and on enzyme levels in Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris grown in continuous culture.//Appl.Microbiol.Biothechnol.-1992.-Vol.37.-P.426.

152. Schreiber G., Kohlhaw G., Goedde H.W. Die biosynthese von acetoin in schweineherzmuskel.// Biochem.-1963.-Z.339.-P.83-93.

153. Sebek O.K.,Randies C.I. The oxidation of the stereoisomeric 2,3-butanediols by Pseudomonas.//Arch.Biochem.Biophys.-1952.-Vol.40.-P.373-379.

154. Seitz E.W. Studies on diacetyl production by Streptococcus diacetylactis matuszewski et.al. // Diss. Abstr.-1962.-Vol.23.-P.1877.

155. Seitz E.W.,Sandine W.E.,Elliker P.R.,Day E.A. Studies on diacetyl biosynthesis by Streptococcus diacetilactis.// Canadian J.Microbiol.-1963,-Vol.9.N 4.-P.431-440.

156. Seitz E.W., Höchster R.M. Active transport of L-valine by Streptococcus diacetilactis.//J.Dairy Sci.-1965.-Vol.48.N 6.-P. 1282-1286.

157. Sharpell F.H. Microbial flavors and fragrance // Comprehensive Biotecnology.-1985.-Vol.3.-P.965-981.

158. Silverman M., Werkman C.H. The formation of acetylmethylcarbinol from pyruvic acid by a bacterial enzyme preparation.//J.Biol.Chem.-1941 .-Vol. 138.N 1.-P.35-48.

159. Singer T.P., Pensky J.A. Mechanism of acetoin synthesis by a-carboxylase. // Biochem.Biophys.Acta.-1952.-Vol.9.-P.316.

160. Smart J.B.Thomas T. D. Effect of oxygen on lactose metabolism in lactic acid streptococci.//Appl.Environ.Microbiol.-1988.-Vol,53.-P.533-541.

161. Speckman R.A.,Collins E.B. Diacetyl biosynthesis in Streptococcus diacetilactis and Leuconostok citrovorum.//J.Bacteriol.-1968.-Vol.95.N 1 .-P. 174-180.

162. Speckman R.A.,Collins E.B. Separation of diacetyl,acetoin and 2,3-butylene glycol by salting-out chromatography.// Anal.Biochem.-1968.-Vol.9.-P. 154-160.

163. Speckman R.A.,Collins E.B. Incorporation of radioactive acetate into diacetyl by Streptococcus diacetilactis.//Appl.Microbiol.-1973.-Vol.26.N 5.-P.744-746.

164. Stadhouders J. Dairy starter cultures.// Milchwissenschaft.-1974.-Vol.29.N 6 -P.329-337.

165. Starrenburg M.J.C.,Hugenholtz J. Citrate fermentation by Lactococcus and Leuconostoc spp.//Appl.Environ.Microbiol.-1991.-Vol.57.N 12.-P.3535-3540.

166. Storch W. Untersuchungen über Butterfehler und saverung des Rahms.// Milch-Zeit.-1890.-Vol.90.-P.304.

167. Stormer F.C. Isolation of crystalline pH 6 acetolactate-forming enzyme from Aerobacter aerogenes.// J.Biologic.Chem.-1967.-Vol.242.N 8.-P.1756-1759.

168. Stormer F.C. The pH 6 acetolactate-forming enzyme from Aerobacter aerogenes.// J.Biological Chemistry.-1968.-Vol.243.N 13.-P.3735-3739.

169. Stormer F.C., Solberg Y., Hovig T. The pH 6,0 acetolactate-forming enzyme from Aerobacter aerogenes. Molecular properties.// European J.Biochem.-1969.-Vol.10.-P.251.

170. Stormer F.C. Evidence for regulation of Aerobacter aerogenes pH 6 acetolactate-forming enzyme by acetate ion// Biochemical and biophysical research communications.-1977.-Vol.74.N 3.-P.898-902.

171. Strecker H.J.,Harary I. Bacterial butylene glycol dehydrogenase and diacetyl reductase.//J.Biol.Chem -1954.-Vol.211 .-P.263-270.

172. Suomalainen H., Linnahalme T. Metabolites of a-ketomonocarboxylic acids formed by dried bakers and brewers yeast.//Arch.Biochem.Biopgys.-1966.-Vol.114,-P.512-513.

173. Suomalainen H., Ronkainen P.Mechanism of diacetyl formation in yeast fermentation.// Nature (Lond.)-1968.-Vol.220.-P.792-793.

174. Swartling P.F. Biochemical and serological properties of some citric acidfermenting streptococci from milk and dairy products.// J.Dairy Res -1951 .-Vol. 18,-P.256-267.

175. Thomas T.D.,Ellwood D.C.,Longyear M.V. Change from homo- and heterolactic fermentation by Streptococcus lactis resulting from glucose limitation by anaerobic chemostat cultures.// J.Bacteriol.-1979,-Vol. 138.-P. 109-117.

176. Thomas T.D., Turner K.W., Crow V.L. Galactose fermentation by Streptococcus lactis and Streptococcus cremoris : Pathways, products and regylation. //

177. J.Bacteriol.-1980,-Vol.144.- P.672-682.

178. Thornhill P.J.,Cogan T.M. Use of gas-liquid chromatography to determine the end products of growth of lactic acid bacteria// Appl.Environ.Microbiol.-1984,-Vol.47.N 6.-P.1250-1254.

179. Tsau J.L.,Guffanti A.N.,Montville T.J. Conversion of pyruvate to acetoin helps to maintain pH homeostasis in Lactobacillus plantarum.// AppI.Environment.Microbiol.-1992.-Vol.58.-P.891-894.

180. Umbarger H.E.,Brown B. Isoleucine and valine metabolism in Escherichia coli. VIII. Yhe formation of acetolactate.//J.Biol.Chem.-1958.-Vol.233.-P.1156-1160.

181. Van Beynum J.,Pette J.W. The decomposition of citric acid by Betacoccus cremoris.// J.Dairy Res.-1939.-Vol.10.-P.250.

182. Verhue W.M.,Tjan F.S.B. Study of the citrate metabolism of Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis by means of 13C nuclear magnetic resonance.// Appl.Environ.Microbiol.-1991.-Vol.57.-P.3371-3377.

183. Veringa H.A.,Verbürg F.H.,Stadhouders J. Determination of diacetyl in dairy products containing -acetolactic acid/// Neth.Milk Dairy J.-1984.-Vol.38.-P.251-263.

184. Veringa H.A.,Verburg F.H.,Stadhouders J. An alternative method for the production of cultured butter.//Milchwissenschaft.-1976.-Vol.31 .N 11.-P.658-662.

185. Walsh B.,Cogan T.M. Diacetyl,acetoin and acetaldehyde production by mixed-species lactic starter cultures.//Appl.Microbiol.-1973.-Vol.11 .-P.820-825.

186. Walsh B.,Cogan T.M. Separation and estimation of diacetyl and acetoin in milk// J.Dairy Res.-1974.-Vol.41 .N 1.-P.25-30.

187. Walsh B.,Cogan T.M. Further studies on the estimation of diacetyl by the methods of Prill and Hammer and Owades and Jakovac.// J.Dairy Res.-1974.-Vol.41.N 1.-P.31-35.

188. Watt D., Krampitz L.O. Alpha-acetolactic acid an intermediate in acetylmetylcarbinol formation. // Federat.Proc.-1947.-Vol.6.-P.301.

189. Westerfeld W.W. A colorimetric determination of blood acetoin.// J.Biol.Chem.-1945.-Vol.161 .N 3.-P.495-502.

190. White A.,Handler P.Smith E.L. In principles of biochemistry / 3rd ed.Mc Graw Hill,New York, 1964. P.515-526.

191. Wilkinson K.D.,Williams C.H.Jr. NADH inhibition and NAD activation of Escherichia coli lipoamide dehydrogenase catalyzing the NADH lipoamide reaction.//J.Biol.Chem.-1981.-Vol.256.-P.2307-2314.

192. Wissens A., Defloor K. Biosynthesis of acetoin by Streptococcus diacetylactis.// Chem.Abstr.-1965.-Vol.62.-P.4355.

193. Yang J.H., Kim S.S. Purification and characterization of the valine sensitive acetolactate synthase from Serratia marcescens ATCC 25419.// Biochim.Biophys.Acta.-1993,-Vol. 1157.-P. 178-184.

194. Yeoman S.J. The 2-oxo acid dehydrogenase complexes:recent advances.// Biochem. J.-1989.-Vol.257.-P.625-632.