Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтетическое получение аналогов бактериородопсина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтетическое получение аналогов бактериородопсина"

На правах рукописи

Миронова Екатерина Валентиновна

БИОСИНТЕТИЧЕСКОЕ ПОЛУЧЕНИЕ АНАЛОГОВ БАКТЕРИОРОДОПСИНА

03.00.23. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2002

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.

Ломоносова и в ФГУП «ГосНИИгенетика» Научные руководители:

доктор химических наук Ходонов Андрей Александрович доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Складнев Дмитрий Анатольевич Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

профессор Варфоломеев Сергей Дмитриевич

доктор химических наук,

профессор Звонкова Елена Николаевна

Ведущая организация:

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится « 28 » октября 2002 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова (119831, Москва, ул. М. Пироговская, д. 1).

Автореферат разослан «_»_2002 года

Ученый секретарь диссертационного совета, с.н.с., к.х.н.

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Использование биополимеров в качестве рабочей среды в сенсорных и вычислительных устройствах является одним из активно развивающихся направлений современной биоэлектроники. Хотя создание чисто "биологического" компьютера - дело далекого будущего, ряд гибридных технологий с объединением полупроводниковых и биологических элементов будет реализован уже в ближайшее время. Для этих целей значительный интерес представляют белки, функции которых связаны с преобразованием энергии света, поскольку устройства на их основе наиболее легко интегрируются в современные приборные схемы. Среди таких белков наиболее перспективен бактериородопсин (БР)1, обнаруженный в 1971 году Ое81егИеИ Б. и 81юескетш W. в галофильных бактериях ИаЫаМвпит заИпагыт, основной функцией которого является светозависимый транспорт протонов.

Хромофором бактериородопсина является протонированный альдимин ретиналя с в-аминогруппой остатка лизина-216. Поглощая квант света, бактериородопсин претерпевает цикл спектральных переходов, сопровождающихся изомеризацией белка, депротонированием и репротонированием альдиминной связи и переносом протона. Фотоцикл бактериородопсина можно описать следующей последовательностью интермедиатов:

1 Список используемых сокращений: БЛ и ЬЛ - темноадаптированная и светоадаптированная формы бактериородопсина, N38 - N бромсукцинимид, РСС - хлорохромат пиридиния, 8Б8 - додецилсульфат натрия, БО - бактериоопсин, АБР - аналоги бактериородопсина, БР -бактериородопсин, ДМФА - диметилформамид, ПМ - пурпурные мембраны. При обозначении мутантных белков использовали общепринятую систему: «исходный остаток аминокислоты - его положение в аминокислотной последовательности БР - аминокислотный остаток, на который проведена замена», аминокислотные остатки обозначены стандартными однобуквенными сокращениями.

BR568 ^ J625 ^ K590 ^ L550 ^ M412 ^ N560 ^ O640 ^ BR568.

Уникальность данного белка для нужд молекулярной биоэлектроники определяется его высокой стабильностью, быстротой фотоответа (время образования J625 составляет 0,5 пс), высоким квантовым выходом и доступностью в больших количествах.

Впервые пленки на основе бактериородопсина, названные "Биохром", были получены в 80-х годах в нашей стране в рамках проекта "Родопсин", и была продемонстрирована перспективность их применения в качестве фотохромных материалов и сред для голографической записи.

В последнее десятилетие усилиями ряда исследовательских коллективов достигнут определенный прорыв в использовании препаратов природного и модифицированного бактериородопсина для создания различных устройств на их основе (это фотохромные голографические среды и трехмерная оптоэлектронная память, пространственные модуляторы оптического сигнала, биочипы и биосенсоры). В 2001 году фирма Munich Innovative Biomaterials, GmbH (MIB) представила на рынок голографический интерферометр на основе пленки мутантного БР- D96N (http://www.mib-biotech.de).

В ходе проведенных исследований был предложен ряд подходов к изменению свойств бактериородопсина, таких как физико-химические воздействия, замена хромофора на синтетические аналоги и точечные замены аминокислот. Сочетание двух последних подходов позволяет варьировать в значительных пределах положение максимума поглощения и скорость фотоцикла аналогов бактериородопсина. В появившихся в последние годы пионерских работах по исследованию аналогов бактериородопсина с одновременной заменой хромофора и определенного остатка аминокислоты было показано, что для технологических целей такие препараты обладают лучшими характеристиками по сравнению с известными ранее вариантами.

Поскольку на функционирование бактериородопсина влияет модификация как белковой, так и хромофорной частей, возникает необходимость поиска новых сочетаний модификаций хромофор-белок, позволяющих получить перспективные для технологического использования препараты бактериородопсина. Настоящая работа, направленная на реализацию этой задачи, является частью плановых исследований по разработке новых материалов на основе аналогов бактериородопсина, проводимых на кафедре биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова совместно с НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Центром фотохимии РАН, Институтом биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, ОАО ЦНИТИ "Техномаш" и лабораторией генетики метилотрофных бактерий ФГУП «ГосНИИгенетика». Работа проводится в рамках выполнения грантов РФФИ 01-03-32078 и 02-03-06555 и гранта ИНТАС-01-0267.

Цель работы

Целью настоящей работы было комплексное исследование влияния одновременной модификации белковой и хромофорной частей на свойства бактериородопсина (максимумы поглощения, время регенерации апобелков с аналогами ретиналя, особенности кинетики М-интермедиата фотоцикла и стабильность препаратов).

Для реализации поставленной задачи было необходимо решить ряд промежуточных задач: 1) синтезировать набор аналогов ретиналя, 2) оптимизировать условия культивирования выбранных штаммов Н. заИпатиш для получения максимального выхода бактериородопсина, 3) наработать в необходимых количествах образцы бактериородопсина штаммов ЕТ1001, ^5 и Э96К, 4) получить препараты ряда аналогов бактериородопсина, 5) оценить стабильность и качество и исследовать свойства этих аналогов.

Научная новизна

Предложен метод окисления ретиналя, позволяющий за одну стадию синтезировать набор модифицированных по кольцу аналогов ретиналя.

Впервые получены и исследованы аналоги бактериородопсина D96N с 3,4-дидегидроретиналем и фенильным аналогом ретиналя, а так же исследованы кинетические особенности распада М-интермедиата их фотоциклов.

Сравнением особенностей кинетики релаксации М-интермеди-ата фотоцикла полученных аналогов бактериородопсина дикого и мутантного штаммов показано, что замена хромофора и точечная мутация D96N аминокислотной последовательности бактериородопсина оказывают аддитивное влияние на кинетику этого процесса.

Практическая ценность

Предложенный метод окисления ретиналя позволяет с высоким выходом получить 5,6-секо-5,6-диоксоретиналь, являющийся перспективным соединением для введения различного рода меток в молекулу ретиноидов.

Наработанные образцы аналогов бактериородопсина переданы в ОАО ЦНИТИ «Техномаш» для дальнейшего изучения возможности их применения в устройствах биомолекулярной электроники.

Препараты апомембран штамма ET1001 были использованы также для получения АБР, содержащих электронно-плотные метки и краун-эфирные фрагменты в хромофоре.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод окисления ретиналя с использованием хлорохромата пиридиния (РСС), дающий набор его аналогов: 5,6-диоксо-5,6-секо-, 5,6-дигидро-5,6-эпокси- и 4-оксоретинали.

2. Процедура культивирования Н. заИпагыт, позволяющая получить бактериородопсин с высоким выходом.

3. Результаты изучения взаимодействия ретиналя и его аналогов с бактериоопсином из штаммов Н. заИпатиш ЕТ1001, Э96К и JW5, а также исследования спектральных свойств и особенностей фотоцикла полученных пигментов.

Апробация работы Результаты работы были доложены на Международных конференциях «Биокатализ-98» (Пущино, Россия, 1998) и «Биокатализ-2002» (Москва, Россия, 2002), III Международном симпозиуме по органическому фотохромизму (Фукуока, Япония, 1999), XX Международной конференции по фотохимии (Москва, Россия, 2001).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на_страницах, содержит_схем,

_рисунков,_таблиц, список цитируемой литературы

включает_наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Синтез аналогов ретиналя Ранее в нашей лаборатории были изучены свойства набора АБР полученных из апомембран Н. заИпагиш штамма 353П (Мицнер Б.И., 1986; Ходонов А. А., 1996). На основе этих данных для настоящего исследования был выбран ряд АБР, обладающих характерными различиями в ^тах и кинетике фотоцикла, свойства которых (для БР штамма 353П) приведены в табл. 1.

Необходимые для получения АБР производные ретиналя (2, 4) были синтезированы по разработанным ранее методикам, а для получения 5,6-диоксо-5,6-секо- (5) и 4-оксоретиналя (3) предложен

удобный метод окисления триметилциклогексенового кольца ретиналя (1) (см. схему 1).

Таблица 1. Свойства АБР, полученных из апомембран штамма 353П.

N. Структура хромофора ^пах, нм ^шах, нм ^шах -М интерм едиата, нм Особенности кинетики распада М-подобного интермедиата фотоцикла

а11-Е- 132- ЬЛ ЭЛ

1 568 548 568 558 -410 -

2 ^^^^^ н о 603 - 603 593 -425 Сходна с природным БР.

3 о 527 504 506 - -410 Релаксация двухфазна, имеет сильно замедленную часть

4 512 504 508 - -395 Замедленная

5 о^ - - 450 450 - Фотоцикл отсутствует

Синтез фенильного аналога ретиналя (4) осуществили в несколько стадий. Его ключевой реакцией являлось олефинирование по Виттигу илида, генерированного из бензилтрифенилфосфоний бромида (7), С10-альдегидом (8). После снятия трифенилсилильной защиты и выделения 7£-изомера колоночной хроматографией выход фенильного аналога 11,12-дидегидроретинола (9) составил 34%. Окисление спирта (9) диоксидом марганца приводит к альдегиду (10) с выходом 82%. После восстановления тройной связи каталитическим гидрированием водородом и последующей термоизомеризации выход а11-Е-изомера фенильного аналога ретиналя (4) составил 73%.

3,4-Дидегидроретиналь (2) с выходом 50% получили аллильным бромированием ретиналя (1) с последующим дегидробромированием промежуточного 4-бромретиналя (11).

1)

© © ' (8) 0Б'РИэ

^У^РРИэВг К2С03, 18-краун-6

^ (7) --

РРИ,

2) Р

СТВГ (6)

он

(10) о

1) н2, Ра / СаС0э / РЬ(0Де)2

2) 12, Д, 80 °С

о

(4)

(1) МВБ

СН0 РСС / СН2С12

СНО

Вг

(11) КР /ДМФА

СНО

СНО

+

СНО

о

(3)

СНо

кХ (2)

Схема 1. Схема синтеза аналогов ретиналя.

Одной из задач исследования был поиск метода окисления, позволяющего синтезировать с достаточно высокими выходами набор производных ретиналя с модифицированным триметилциклогексеновым кольцом. Было предложено окислять ретиналь (1) хлорохроматом пиридиния (РСС/СН2С12), что позволило одновременно получить 5,6-диоксо-5,6-секоретиналь (5) с выходом 47%, 4-оксоретиналь (3) (7%) и 5,6-дигидро-5,6-эпоксиретиналь (12) (19%). Следует отметить, что 5,6-диоксо-5,6-секоретиналь (5)

является перспективным исходным соединением для введения в будущем различного рода меток в молекулы ретиноидов.

В литературе описано применение соединений хрома (VI) для окислительной модификации ретиноидов и каротиноидов. Так, ранее было исследовано окисление ретиноевой кислоты при помощи реактива Джонса и ретинилидендимедона бихроматом пиридиния и было показано, что в обоих случаях образуется смесь разнообразных продуктов с низким выходом.

В предложенном в настоящей работе варианте, при окислении ретиналя (1) в системе PCC / CH2Cl2, в основном, происходит избирательное расщепление С5-С6-двойной связи триметилциклогексенового кольца с образованием 5,6-диоксо-5,6-секоретиналя (5), а так же 4-оксо- (3) и 5,6-дигидро-5,6-эпокси-ретиналей (12). Следует отметить, что в данном случае процесс раскрытия триметилциклогексенового кольца идет в сравнительно мягких условиях через стадии образования промежуточных 5,6-эпоксида и гликоля, что подтверждается наличием в реакционной смеси некоторого количества 5,6-дигидро-5,6-эпоксиретиналя (12).

Строение 5,6-диоксо-5,6-секоретиналя (5) было доказано

13

спектральными методами: в спектре С-ЯМР присутствуют сигналы 20 атомов углерода, среди которых, наряду с сигналом альдегидной группы (190.6 м.д.), присутствуют два дополнительных сигнала карбонильных групп (203.6 и 208.2 м.д.), а в спектре 1Н-ЯМР отмечено наличие сигналов протонов всех фрагментов структуры 5,6-диоксо-5,6-секоретиналя (5). Дополнительным подтверждением уменьшения цепи сопряжения на одну кратную связь служит электронный спектр в метаноле: максимум поглощения (364 нм) имеет гипсохромный сдвиг на 16 нм относительно ретиналя (1).

Строение и чистота препаратов синтезированных аналогов ретиналя (2)-(5), (9), (10), (12) были подтверждены методами УФ- и 1Н-ЯМР спектроскопии и сравнением их физико-химических свойств

со свойствами образцов этих соединений с заведомой структурой, синтезированных в нашей лаборатории ранее.

Анализ данных по влиянию точечных мутаций аминокислотной последовательности на свойства бактериородопсина

Исследования БР с генетически модифицированной белковой частью начались с конца 80-х годов. За прошедшее время был накоплен большой массив информации о свойствах около 150 вариантов БР с единичными и множественными заменами аминокислот. Однако до сих пор эти данные не были систематизированы. По этой причине было необходимо провести сравнительный анализ опубликованных в литературе сведений по влиянию точечного мутагенеза на свойства БР, что позволило бы выделить области молекулы БР, замена аминокислотных остатков в которых вызывает значительные изменения таких его характеристик, как положение максимума поглощения, световую адаптацию, кинетику М-интермедиата фотоцикла и эффективность транспорта протона.

Некоторые результаты анализа представлены в таблице 2.

Следует отметить, что существуют области БР, замена аминокислот в которых вызывает незначительные изменения свойств белка. Характерно, что в основном они расположены по периферии молекулы БР.

В результате проведенного анализа можно выделить ряд аминокислотных остатков, замена которых вызывает резкое замедление фотоцикла, это Э85, Э96, М118, М145 и Э227. При этом описанные варианты мутаций по Э85 вызывают батохромный сдвиг ^макс на 30-50 нм, по М145 - гипсохромный сдвиг до 70 нм, а Э96, Э118 и Э227 практически не изменяют положения максимума поглощения БР. Из приведенного ряда производных БР для получения АБР в данной работе был выбран вариант Э96К, что позволяет получить пигмент с замедленным фотоциклом и неизменным положением максимума поглощения.

Таблица 2. Влияние точечных мутаций на свойства БР.

Замены аминокислотных остатков Примечание

Положение Хтах пигмента

гипсохром ный сдвиг W10C, Y79C, Y83F, W86F, T89V, Т90С, L93A, L93T, D115E, М118А, G122C, W137F, 8141А, М145А, W182F, Y185F, P186G, P186L, P186V, W189F, D212A. W86, Т90, D115, М118, М145, W182, Y185 расположены около полиеновой цепи ретиналя, Y83, W137, 8141, P186, W189 -около его кольца, а Т89, L93 и D212 - вблизи альдиминной связи.

батохром-ный сдвиг (-)А84, R82A, R82Q, D85C, D85A, D85E, D85H, D112E, D112N, 8141С, К216А, K216G. В основном расположены в районе альдиминной связи остатка ретиналя. 8141 -около его кольца, D112 не входит в центр связывания хромофора.

Нарушение световой адаптации и изомерного состава БР:

Нарушено соотношение изомеров в LA- БР V49A, A53G, Y57N, R82Q, D85E, D85N, Т89А, T89V, T89D, Р91А, L93A, L93T, М118А, М118Е, G122C, 8141С, М145А, W182F, Р186А, P186G, W189F, D212N, D212E, K216A. Локализованы около кольца и альдиминной связи остатка ретиналя. Р91 и Р186 не входят в центр связывания хромофора.

Кинетика об> разования и распада М-подобного интермедиата

Ускорение распада более чем в 10 раз: R82A, T205V, 8226А, Я227^ более чем в 5 раз: D115A, S141C.

Замедление распада более чем в 10 раз при заменах: D85A, D96A, D96E, D96N, М118А, М145А, D227G. более чем в 5 раз при заменах:T89D, М118Е, D212E.

Эффективность Н+-транспорта

полностью отсутствует (-)А84, D85A, D85C, D85N

снижен на порядок D96A, D96N, W137F, М145А, D212E

Аналоги бактериородопсина

Отбор штаммов Н. заИпагиш, использованных для получения АБР, осуществлен на основе ряда требований, связанных с технологической направленностью исследования, это: простота выделения препаратов БР не содержащих каротиноидов, уменьшение числа стадий процесса получения АБР или значительно замедленный

фотоцикл БР. В результате из набора доступных штаммов были выбраны три: ЕТ1001, JW5 и Б96К, краткая характеристика которых по сравнению с применяемым ранее штаммом 353П дана в табл. 3. Таблица 3. Характеристика штаммов Н. заИпатиш, используемых для

получения бактериородопсина.

Бактерио-опсин Ретиналь Кароти-ноиды Скорость распада М-интермедиата фотоцикла БР

353П ++ + ++ быстрая

ET1001 ++ + + - быстрая

JW5 + - - -

D96N ++ + + - медленная

«++» - повышенное содержание, «+» - стандартный уровень штаммов

дикого типа, «+ -» - пониженное содержание, «-» - не синтезируется

Процедура получения и исследования АБР, представлена на схеме 2. Она включает в себя следующие стадии: 1) культивирование галобактерий, 2) выделение ПМ (или «белых» мембран в случае штамма JW5), 3) обесцвечивание ПМ светозависимым гидроксиламинолизом, 4) синтез аналогов ретиналя, 5) взаимодействие аналогов ретиналя и апобелка, 5) изучение стабильности и контроль состава препаратов АБР.

Культивирование галобактерий H. salinarum

В этой части работы были подобраны оптимальные условия для наиболее эффективного производства препаратов ПМ, необходимых для дальнейших экспериментов. Хотя методы культивирования H. salinarum хорошо известны, было необходимо «адаптировать» их к имеющимся экспериментальным условиям.

Культивирование H. salinarum осуществлялось в прозрачной плоской кювете, рассчитанной на 4 л культуральной жидкости, с освещением 4-мя лампами дневного света ЛД-20, расположенной в термостатируемой комнате. Использована комплексная среда, содержащая в 1 л 250 г NaCl, 20 г MgSO47 Н2О, 3 г цитрата натрия, 2

г KCl, 2 г дрожжевого экстракта, 5 г пептона, 1 мл глицерина. Схема установки для культивирования галобактерий приведена на рис. 1.

Схема 2. Структура исследования.

Был проведен подбор условий (продолжительность, освещение и аэрация) с целью увеличения выхода ПМ с литра культуральной жидкости. Наряду с кривыми роста, были определены кривые накопления БР, поскольку известно, что у некоторых штаммов Н. БаИпатит на стационарной фазе роста происходит дополнительный

Рисунок 1. Установка для культивирования Н. БаИпатит. 1 -кювета, 2 - воздушный насос, 3 - фильтр, 4 - ротаметр, 5 - лампы дневного света.

биосинтез БР. Поскольку в бактериях штамма JW5 БР не образуется, а происходит накопление БО, для его спектрофотометрического определения было необходимо предварительно добавлять к исследуемой пробе а//-Е-ретиналь (1), что приводило к образованию БР.

Было показано, что у всех трех штаммов (ЕТ1001, JW5 и происходит дополнительный биосинтез БР (или БО) на стационарной фазе роста (см. рис. 2), причем в наиболее значительной степени - у штамма JW5, однако, при культивировании более 10 дней происходит снижение выхода БР.

Рисунок 2. Сравнение кривых роста Н. заИпатыш штаммов ЕТ1001 (37°С), JW5 (37°С), D96N (34°С). Обозначения:

♦ - оптическая плотность культуры при 650 нм, □ - накопление БР по оптической плотности супернатанта лизированных клеток при 570 нм. Проведенные эксперименты показали, что на уровень

накопления биомассы галобактерий влияет так же и объем инокулята.

В общем случае, он составлял 5% от объема засеваемой среды,

однако было обнаружено, что его увеличение до 10% вызывает

повышение выхода биомассы в 1,3 раза при соответствующем

повышении выхода БР. В результате были выбраны условия, которые

приведены в таблице 4.

2

для штамма JW5 определяли после инкубации с а//-Е-ретиналем (1).

Таблица 4. Условия культивирования Н. БаИпатиш.

Штамм ЕТ1001 JW5 Б96К

1, °С 37 37 34

Время, дн 8 10 10

Аэрация (л возд)/(л среды)/мин 0.45 0.45 0.45

Выход с 1 л биомасса, г 5 3,2 5,5

БР, мг 45 13 47

Для штамма JW5 отмечено, что добавление ретиналя или его аналога в процессе культивирования при освещении стимулирует биосинтез БО и повышает выход БР на 10%.

Получение аналогов бактериородопсина

Обесцвечивание пурпурных мембран осуществляли по стандартной методике: суспензию мембран в 1М растворе гидроксиламина, рН 7.0, при температуре 7-12°С освещали светом 2-х галогеновых ламп мощностью по 500 Вт, пропущенным через тепловой фильтр. Прохождение процесса контролировали по уменьшению оптической плотности при 563 нм.

Несмотря на то, что у БР-Б96К фотоцикл значительно замедлен, время его обесцвечивания почти не отличается от БР с природной аминокислотной последовательностью.

Концентрацию «активного» бактериоопсина в составе апомембран определяли взаимодействием с а//-Е-ретиналем (1) (см. рис. 3). Показано, что полученные в данных условиях препараты апомембран обладали достаточно воспроизводимыми свойствами. Так, степень встраивания ретиналя (1) была практически одинакова для апомембран в независимых экспериментах, однако сам процесс происходил медленнее, если увеличивалось время обесцвечивания ПМ (см. рис. 3). Так же было показано, что предложенная процедура обесцвечивания - регенерации слабо влияет на кинетику образования и распада М-интермедиата (для этих целей исследовали БР, регенерированный из БО и а//-Е-ретиналя (1)). Следовательно,

получаемые препараты апомембран пригодны для исследования кинетики М-интермедиата АБР.

А

A 0,8 ^ 0,70,60,50,40,30,20,1 -0,0

В

Апомембраны - Регенерированный БР ■ Исходный БР

300

400

500

600

700

10

20

30

Рисунок 3. Реконструкция БР, нормализовано по белковой полосе поглощения препаратов мембран до добавления ретиналя. А) Спектры препаратов, В) Кривые встраивания all-E-ретиналя (1) в апомембраны D96N, время обесцвечивания перед регенерацией составляет -♦- 17 ч, -■- 21 ч, -▲- 26 ч.

АБР получали добавлением к суспензии апомембран в стандартном буфере (100мМ NaCl, 5 мМ MES, рН 6.0) стехиометрических количеств all-E-ретиналя (1) и его аналогов. Для экспериментов использованы all-E-изомеры 3,4-дидегидро- (2), 4-оксо- (3), фенил- (4) и 5,6-диоксо-5,6-секоретиналя (5), спектральные свойства соответствующих препаратов АБР приведены в табл. 5.

Максимумы поглощения соответствующих пар АБР ET1001 и D96N оказались достаточно близкими (см. табл. 5).

Для получении АБР из штамма JW5 возможно два подхода: добавление ретиналя к растущей культуре клеток или к препарату «белых» мембран. Показано, что в первом случае (для ретиналя (1) или 3,4-дидегидроретиналя (2)) максимумы получаемых пигментов близки к максимумам соответствующих АБР из штаммов ET1001 и D96N, а во втором (аналоги ретиналя (3) и (5))- с некоторым сдвигом в сторону меньших длин волн (см. табл. 5). В общем, содержание «активного» белка в «белых» мембранах меньше, чем в апомембранах штаммов ET1001 и D96N, однако возможность

0

нм

получения АБР без использования гидроксиламинолиза является важным преимуществом для получения больших количеств АБР. Таблица 5. Спектральные свойства АБР.

Структура хромофора Штамм Дифференциальный ^шах, нм ^max, нм*

ЭЛ ЬЛ ЭЛ ЬЛ

Ж5 - - 558 565

1 Х^Л^Л^сно ЕТ1001 560 566 559 567

Э96К - - 560 569

ч/ 1 1 Ж5 - - 593 600

2 ЕТ1001 593 - 589 596

ч/Ч Э96К 589 597 580 592

Ж5 493 490 483

3 ЕТ1001 527 496 526 508

о Э96К 525 - 527 503

4 Э96К 497 497 508 508

Ж5 442 - 440 -

5 о^ Э96К 441 - 445 (пл) -

* для препарата АБР, переосажденного после регенерации 4 раза из воды.

Скорости встраивания аналогов ретиналя в бактериоопсин с природной последовательностью и мутантный Э96К очень близки. Встраивание всех исследованных аналогов ретиналя в БО происходит достаточно быстро, более 90% АБР регенерируется в течение часа.

Стабильность препаратов бактериородопсина при длительном

хранении

Для технологического применения АБР важно оценить их качество и стабильность при хранении в течение длительного времени. С этой целью образцы АБР были исследованы методом 8Э8-электрофореза в 15% полиакриламидном геле через различные промежутки времени после их получения (см. рис. 4). Препараты ПМ и АБР хранили при 4°С в виде суспензии в бидистилированной воде с концентрацией белка 5-10 мг/мл.

БР

Аналоги БР

ЕТ1001

096М

ЕТ1001

096М

/--\ Г--\ Л Ч /

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

66 кДа 45 кДа 36 кДа 29 кДа

24 кДа 20 кДа

Рисунок 4. Электрофорез препаратов БР. Исходные препараты БР: 1, 2, 3- выделены из штамма ЕТ1001, хранились 10 лет, 1 год и 1 мес. соответственно; 4, 5, 6 - из мутантного штамма D96N, хранились 1 год, 3 мес и 1 мес соответственно; 7- из штамма JW5 регенерированный ретиналем (1), хранился 1 мес. АБР: 8, 9 - из штамма ЕТ1001, регенерированные ретиналем (1) и 4-оксоретиналем (3); 10, 11, 12, 13 - из мутантного штамма D96N, регенерированные ретиналем (1), 4-оксо- (3), фенил- (4) и 3,4-дидегидроретиналем (2). 14 - стандарты молекулярных весов.

Было показано, что практически все препараты БР содержат единственный белок, причем при хранении в течение 12 месяцев его качество (за исключением БР из штамма JW5) практически не изменяется, частичный протеолиз и агрегация БР заметны лишь в препарате, полученном в нашей лаборатории ранее, и хранившемся при 4°С 10 лет. Небольшое увеличение электрофоретической подвижности при хранении более 1 мес. связано, как известно из литературных данных, с отщеплением не более 17 аминокислотных остатков с С-конца БР.

Можно констатировать, что АБР так же достаточно устойчивы к действию протеаз, хотя и обладают несколько меньшей

стабильностью, чем образцы БР, содержащего природный хромофор. Так, после хранения в течение 5 месяцев, отмечен незначительный протеолиз некоторых АБР (например, 4-оксо-БР-Б96К).

Кроме того, было установлено, что при хранении образцов БР в виде концентрированной водной суспензии в течение 1 года практически не изменяются и кинетические параметры его фотоцикла (исследовано на примере штамма ET1001).

Особенности фотоцикла аналогов бактериородопсина Кинетики фотоциклов препаратов БР и его аналогов были исследованы при 21 °C в суспензиях в буфере 100 мМ NaCl, 5 мМ MES, рН 6. Контрольные измерения исходных препаратов БР (до обесцвечивания) штаммов ET1001, JW5 и D96N выявили присущую им разницу кинетики фотоответов (см. рис. 5).

умну ----

глпсм I

Рисунок 5. Сравнение кинетики М-интермедиата БР штаммов ЕТ1001, JW5 и 96N.

1 -I

0.8 -

(D 0.6 -

I 1— 0.4 -

О

< 0.2 -

<1

0 -

750 цс —i—■ 50 мс -

10 c

Для БР штаммов ЕТ1001 и Б96К было показано, что в сравнении с исходными образцами ПМ скорости образования и релаксации М-интермедиатов в препаратах апомембран, регенерированных а//-Е-ретиналем (1), изменились очень мало. Отмечено, что по сравнению с исходными образцами белков они показали небольшое замедление скорости распада М- интермедиата для БО из штамма ЕТ1001 и, наоборот, некоторое его ускорение для БО, содержащего аминокислотную замену Б96К (рис. 6).

3

Данная часть работы проводилась под руководством с.н.с., к.б.н. Хитриной Л.В. на установке импульсной спектрофотометрии в лаборатории фотохимии биомембран Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

А)

1 -

ф 0.8 -

I

1- о 0.6 -

< 0.4 -

<1

0.2 -

В)

ф

х н

о <

750 цс -4— 50 мс —]

1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 -0

Рисунок 6. Кинетика М-интермедиата для АБР из апомембран А) штамма ЕТ1001, В) штамма Э96К. Изменение оптической плотности в максимуме поглощения М-интермедиата. 1 - исходные мембраны, 2

- регенерированные ретиналем (1), 3 - 3,4-дидегидроретиналем (2), 4

- 4-оксоретиналем (3), 5 - фенильным аналогом ретиналя (4).

Для всех АБР не наблюдалось существенного изменения эффективности фотоцикла при мутации в полипептидной цепи.

У 3,4-дидегидро-БР скорости образования и распада М (см. рис. 6) были весьма близки к исходной у контрольных препаратов соответствующего штамма. Показано наличие дополнительного замедления за счет модификации хромофора у фенил-БР и 4-оксо-БР в сильно замедленном цикле мутанта Э96К (рис. 6В). Кроме того, сохранялись и характерные различия в форме кривой фотоответа: кривые релаксации М-интермедиата у 4-оксо-БР ЕТ1001 и Э96К двухфазны, причем сильно замедленная часть составила ~ 10-15 % от амплитуды сигнала (см. рис. 6). Различие проявилось в наличии начального замедления распада М-интермедиата у фенил-БР и 4-оксо-БР-096К (для обоих мутантных аналогов 11/2 заметно увеличено), которое отсутствует у соответствующих АБР с природной последовательностью.

Было показано, что 5,6-диоксо-5,6-секоретиналь (5) образует пигменты с БО (были использованы штаммы Э96К и JW5), имеющие ^тах около 450 нм. Однако они не дают выраженного фотоответа на лазерную вспышку ни в области М-интермедиата, ни в максимуме

0

поглощения хромофора. Это не совпадает с литературными данными о том, что наличие триметилциклогексенового кольца не является необходимым для существования фотоцикла. Так, ациклический полиеналь, представляющий собой фрагмент ретиналя без кольца образует с БО пигмент с ^шах 466 нм, обладающий фотоциклом и протонным транспортом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые получен ряд АБР с модификацией как хромофора, так и аминокислотной последовательности и проведено комплексное изучение их свойств.

Полученные образцы АБР переданы в ЦНИТИ «Техномаш» для исследования возможности их применения в устройствах биомолекулярной электроники.

ВЫВОДЫ

1. Предложен удобный метод одновременного синтеза 5,6-диоксо-5,6-секоретиналя (5), 5,6-дигидро-5,6-эпоксиретиналя (12) и 4-оксоретиналя (3) окислением ретиналя (1).

2. Получен ряд аналогов бактериородопсина с модификацией как хромофора так и аминокислотной последовательности.

3. Осуществлено комплексное исследование аналогов бактериородопсина (определены спектральные свойства, устойчивость при длительном хранении, скорость регенерации и особенности фотоцикла).

4. Проведена оптимизация условий культивирования Н. заИпатиш штаммов ЕТ1001, JW5 и Э96К с целью увеличения выхода бактериородопсина.

5. Показана перспективность использования штамма JW5 для получения аналогов бактериородопсина в технологических целях.

6. Путем сравнения свойств аналогов бактериородопсина с природной аминокислотной последовательностью и с заменой аспарагиновой кислоты-96 на аспарагин установлено, что замена

хромофора и данная точечная мутация оказывают аддитивное влияние на кинетику фотоцикла бактериородопсина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Demina O.V., Shevyakov S.V., Lukin A.Yu., Mironova E.V., Shvets V.I., Khitrina L.V., Terpugov E.L., Degtyareva O.V., Khodonov A.A. Modified bacteriorhodopsins as a basis for new optical devices. // Abstracts of International conference "Biocatalysis-98: fundamentals & applications". - 1998. - Pushchino, Russia. - P. 30-31.

2. Khodonov A.A., Shevyakov S.V., Mironova E.V., Shvets V.I., Demina O.V., Khitrina L.V., Kaulen A.D. Bacteriorhodopsin analogs, bearing modified chromophore as a basis for the photochromic materials. // Abstracts of III International symposium on organic photochromism. -

1999. - Fukuoka, Japan. - P. 174.

3. Khodonov A.A., Shevyakov S.V., Mironova E.V., Shvets V.I., Alexeeva S.G., Demina O.V., Khitrina L.V., Kaulen A.D. Bacteriorhodopsin analogs, bearing modified chromophore as a basis for the photochromic materials. // Molecular Cryst. Liquid Cryst. -

2000. - V.345. - P. 317-322.

4. Khodonov A.A., Mironova E.V., Shevyakov S.V., Shvets V.I., Demina O.V., Khitrina L.V. Relationship between chromophore structure and photochemical properties in bacteriorhodopsin analogs series. // Abstracts of XX International conference on photochemistry. - 2001. -Moscow, Russia. - P. 299-300.

5. Е.В. Миронова, А.Ю. Лукин, С.В. Шевяков, С.Г. Алексеева, В.И. Швец, О.В. Демина, А.А. Ходонов, Л.В. Хитрина. Синтез и свойства аналогов бактериородопсина, содержащих электронно-плотные метки в хромофоре. // Биохимия. - 2001. - Т. 63, N 11. - С. 1638-1648.

6. Mironova E.V., Lukin A.Yu., Shevyakov S.V., Shvets V.I., Demina O.V., Skladnev D.A., Khitrina L.V., Grebennikov E.P., Adamov G.E., Khodonov A.A. Preparation of bacteriorhodopsin analogs with modified polypeptide and chromophoric parts. // Abstracts of International conference "Biocatalysis-2002: fundamentals & applications". - 2002. - Moscow, Russia - P. 115-116.

7. Е.В. Миронова, С.В. Леонтьева, С.В. Шевяков, С.Г. Алексеева,

В.И. Швец, О.В. Демина, И.С. Краснокутская, Е.И. Финкельштейн, А.А. Ходонов. Удобный способ получения производных ретиналя, модифицированных по триметилциклогексеновому кольцу. // Биоорг. Химия. - 2002. - Т. 28, N. 6. - С. 535-542.

Сдано в печать Формат 60x90/10 Тираж Заказ Отпечатано на ризографе.

119571, Москва, пр. Вернадского, 86 Издательско-полиграфический центр МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Миронова, Екатерина Валентиновна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Галофильные бактерии и бактериородопсин в современной биотехнологии.

1. Галобактерии.

1.1. Применение галофильных бактерий в биотехнологии.

1.2. На1оЪае1вгшт salinarum.

2. Пурпурные мембраны и родопсины галобактерий.

3. Бактериородопсин: структура и функции.

4. Основные способы изменения параметров фотоцикла бактериородопсина.

4.1. Физико-химические воздействия.

4.2. Замена хромофора.

4.3. Точечные замены аминокислот.

5. Техническое применение бактериородопсина.

5.1. Бактериородопсин как фотохромный молекулярный материал.

5.2. Создание голографических изображений на пленках, содержащих бактериородопсин.

5.3. Голографическая интерферометрия.

5.4. Обработка видеоизображений.

5.5. Молекулярная память на основе бактериородопсина.

5.6. Молекулярные фоторецепторы на основе бактериородопсина.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Выбор объектов исследования.

2. Окислительная модификация триметилциклогексенового кольца ретиноидов.

3. Синтез аналогов ретиналя.

4. Хромофорная полость бактериородопсина.

5. Анализ данных по влиянию точечных мутаций аминокислотной последовательности на свойства бактериородопсина.

6. Аналоги бактериородопсина.

6.1. Культивирование Н. 8а1тагиш.

6.2. Получение аналогов бактериородопсина.

6.3. Стабильность препаратов бактериородопсина при длительном хранении.

6.4. Особенности фотоцикла аналогов бактериородопсина.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Синтез аналогов ретиналя.

2. Получение препаратов пурпурных мембран.

3. Получение аналогов бактериородопсина.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосинтетическое получение аналогов бактериородопсина"

В природе обнаружено достаточно малое количество белков, функции которых связаны с преобразованием световой энергии, однако исключительно важная роль, которую они играют в процессах жизнедеятельности различных организмов, стала причиной повышенного интереса ученых к проблеме их строения и функционирования. По мере исследования свойств и механизма функционирования этих белков, был выявлен ряд особенностей, позволяющих использовать некоторые из них в технических целях, а так же разработан набор методов направленного изменения свойств белка в соответствии с технологическими требованиями.

Одним из наиболее простых и доступных преобразующих свет белков является обнаруженный в пурпурных мембранах (ПМ) галобактерий НЫоЪаМвгшш salinarum (ранее называемых Н. salinarium и Н. На1оЫиш) бактериородопсин (БР). Он был открыт Ое81егИек Б. и 81оескешш Ш. в 1971 году [1]. Экстремальные условия, в которых существует в природе данный вид бактерий (крайне высокая концентрация солей, повышенные температуры и интенсивное солнечное облучение), способствовали отбору белков, обладающих высокой устойчивостью к таким денатурирующим внешним воздействиям.

Хромофором БР является протонированный альдимин ретиналя с е-аминогруппой остатка Ьу8-216. Поглощая квант света, БР претерпевает цикл спектральных переходов (фотоцикл), сопровождающихся изомеризацией белка, депротонированием и репротонированием альдиминной связи и переносом протона.

Фотоцикл БР можно описать следующей последовательностью интермедиатов: В568 ^ ^25 ^ К590 ^ Ь55с ^ М412 ^ N560 ^ Об40 ^ В568.

Уникальная стабильность, в сочетании с наличием фотохромных свойств

БР, наряду с простотой его производства в больших количествах обеспечивают широкий диапазон технических приложений, в которых он может быть использован [2]. Однако на сегодняшний день осуществимы только оптические устройства на основе БР, поскольку их интеграция в современные приборные системы наиболее проста.

Оптические приложения основаны на применении пленок БР -полимерных матриц различного состава с включенными в них молекулами белка. Впервые в мире такие пленки, названные "Биохром", были получены и исследованы в России в рамках проекта "Родопсин" в 1980-х годах. Была продемонстрирована эффективность и перспективность их применения в качестве фотохромных материалов и сред для голографической записи [3].

В последнее десятилетие усилиями ряда исследовательских коллективов достигнут определенный прорыв в использовании препаратов природного и модифицированного БР для создания различных устройств на их основе. Были предложены прототипы трехмерной опто-электронной памяти, фотохромных голографических сред, пространственных модуляторов оптического сигнала и биосенсоров. Одним из практических результатов проводимых в этой области исследований стало то, что в 2001 году фирма Munich Innovative Biomaterials, GmbH (MIB) представила на рынок голографический интерферометр FringeMaker-plus® на основе пленки мутантного BPD96N.

Поскольку на функционирование БР влияет модификация как белковой, так и хромофорной частей, возникает необходимость поиска новых сочетаний модификаций хромофор-белок, позволяющих получить перспективные для технического использования препараты БР. Настоящая работа направлена на реализацию этой задачи, ее целью было комплексное исследование влияния одновременной модификации белковой и хромофорной частей на свойства БР (максимумы поглощения, время регенерации апобелков с аналогами ретиналя, особенности кинетики М-интермедиата фотоцикла и стабильность препаратов).

Диссертационная работа являлась частью плановых исследований по разработке новых оптических материалов на основе аналогов бактериородопсина, проводимых на кафедре биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова совместно с НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Центром фотохимии РАН, Институтом биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, OAO ЦНИТИ "Техномаш" и ФГУП «ГосНИИгенетика». Работа проводится в рамках выполнения грантов РФФИ 0103-32078 и 02-03-06555 и гранта ИНТАС-01-0267.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Галофильные бактерии и бактериородоисии в современной биотехнологии.

1. Галобактерии.

Галобактерии относят к архебактериям, которые представляют собой совершенно особую линию эволюции, отличающуюся как от прокариот, так и от эукариот. Эти бактерии распространены там, где есть подходящие условия для их роста: высокое содержание NaCl и других необходимых ионов, в соленых природных водоемах, бассейнах для выпаривания соли, белковых материалах (рыба, мясо), консервируемых с помощью соли [3].

В 1960-х годах начались первые эксперименты по культивированию и выделению галофильных бактерий [4-6]. Всего за прошедший период было выделено около 170 природных штаммов. В основном это были умеренно галофильные микроорганизмы, только несколько штаммов оказались экстремальными галофилами [7].

Бактерии, которым для роста необходимо присутствие NaCl, по степени галофильности делят на несколько типов. Наиболее широко используют классификацию по диапазону концентраций NaCl, в котором могут расти данные микроорганизмы, предложенную Kushner D.J. [8]: галотоллерантные (от 0 до 5% NaCl), экстремально галотоллерантные (0 до 15% NaCl), легкие галофилы (около 3% NaCl), умеренные галофилы (от 3 до 15% NaCl), пограничные экстремальные галофилы (>15% NaCl), экстремальные галофилы (около 25% NaCl).

В IX издании определителя бактерий Берджи [9] экстремально галофильные архебактерии объединены в порядок Halobacteriales, семейство Halobacteriaceae, которое включает 6 родов и более 20 видов, различающихся формой клеток, способностью к движению, отношением к кислотности среды, устойчивостью к NaCl и другими признаками.

Исследование биохимии галобактерий позволило предложить целый ряд вариантов применения этих микроорганизмов в биотехнологии.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Миронова, Екатерина Валентиновна

выводы.

1. Предложен удобный метод одновременного синтеза 5,6-диоксо-5,6-секоретиналя, 5,6-дигидро-5,6-эпоксиретиналя и 4-оксоретиналя окислением ретиналя.

2. Получен ряд АБР с модификацией как хромофора так и аминокислотной последовательности.

3. Осуществлено комплексное исследование АБР (определены спектральные свойства, устойчивость при длительном хранении, скорость регенерации и особенности фотоцикла).

4. Проведена оптимизация условий культивирования Н. salinarum штаммов ЕТ1001, 1Ш5 и Б96К с целью увеличения выхода БР.

5. Показана перспективность использования штамма 1Ш5 для получения АБР в технологических целях.

6. Путем сравнения свойств АБР с природной аминокислотной последовательностью и с заменой аспарагиновой кислоты-96 на аспарагин установлено, что замена хромофора и данная точечная мутация оказывают аддитивное влияние на кинетику фотоцикла БР.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю благодарность моим научным руководителям: профессору, д.х.н. Ходонову A.A. и старшему научному сотруднику д.б.н. Складневу Д.А. (ФГУП «ГосНИИгенетика») за постоянное внимание к работе в процессе ее выполнения и ценные советы при обсуждении результатов и написании диссертации.

Я искренне признательна старшему научному сотруднику, к.б.н. Хитриной Л.В. (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ) за практические рекомендации по получению бактериородопсина и его аналогов, помощь при исследовании кинетических особенностей фотоцикла АБР и ценные комментарии при обсуждении автореферата.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Миронова, Екатерина Валентиновна, Москва

1. Oesterhelt D., Stoeckenius W. Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium. // Nature (New Biol.) 1971. - V. 233, N. 39. - P. 149-152.

2. Hampp N. Bacteriorhodopsin as a photochromic retinal protein for optical memories. // Chem. Rev. 2000. - V. 100, N 5. - P. 1755-1776.

3. Светочувствительные биологические комплексы и оптическая регистрация информации. // Сборник научных трудов, Ред. Иваницкий Г.Р., Пущино 1985. -209 с.

4. Raymond J.C., Sistrom W.R. The isolation and preliminary characterization of a halophilic photosynthetic bacterium. // Arch. Mikrobiol. 1967. - V. 59, N. 1. - P. 255-268.

5. Gibbons N.E. Isolation, growth and requirements of halophilic bacteria. // Methods in Microbiology. B. 1969. - V. 3. - P. 169-183.

6. Kushner D.J. Mass culture of red halophilic bacteria. // Biotechnol. Bioengineering. -1966. V. 8, N. 2. - P. 237-245.

7. Kushner D.J. Halophilic bacteria. // Adv. Appl. Microbiol. 1968. - V. 10. - P.73-99.

8. Kushner D.J. Life in high salt and solute concentrations: halophilic bacteria. // In Microbial life in extreme environments. / Eds. Kushner D.J. London: Academic Press. 1978. - P. 317-368.

9. Определитель бактерий Берджи. // 9-ое издание, Т. 2. М: Мир. - 1997 - С. 754.

10. Margesin R., Schinner F. Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology. // Extremophiles. 2001. - V. 5, N. 2. - P. 73-83.

11. Oren A. Bioenergetic aspects of halophilism. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. -V. 63, N. 2. - P. 334-348.

12. Sauer T., Galinski E.A. Bacterial milking: a novel bioprocess for production of compatible solutes. // Biotechnol. Bioeng. 1998. - V. 57, N. 3. - P. 306-313.

13. Kulichevskaya I.S., Milekhina E.I., Borzenkov I.A., Zvyagintseva I.S., Belyaev S.S. Oxidation of petroleum hydrocarbons by extremely halophilic archaebacteria. // Microbiology 1992. - V. 60, N. 3. - P. 596-601.

14. Yakimov M.M., Timmis K.N., Wray V., Fredrickson H.L. Characterization of a new lipopeptide surfactant produced by thermotolerant and halotolerant subsurface Bacillus licheniformis BAS50. // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61, N. 5. - P. 17061713.

15. Banat I.M., Makkar R.S., Cameotra S.S. Potential commercial applications of microbial surfactants. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 53, N. 5. - P. 495508.

16. Choquet CG, Patel GB, Choquet CG, Ekiel I, Sprott GD Formation of stable liposomes from lipid extracts of archaeobacteria. // Патент США US5989587. -приоритет от 23.11.1999.

17. Steinbüchel A., Füchtenbusch B., Gorenflo V., Hein S., Jossek R., Langenbach S., Rehm B.H.A. Biosynthesis of polyesters in bacteria and recombinant organisms. // Polymer. Degrad. Stabil. 1997. - V. 59, N. 2. - P. 177-182.

18. Rodriguez-Valera F., Lillo J.G. Halobacteria as producers of polyhydroxyalkanoates. // FEMS Microbiol. Rev. 1992. - V. 103, N. 2. - P. 181-186.

19. Sudge S.S., Bastawde K.B., Gokhale D.B., Kalkote U.R., Ravindranathan T. Production of D-hydantoinase by halophilic Pseudomonas sp. NCIM 5109. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 49, N. . - P. 594-599.

20. Ryu K., Kim J., Dordick J.S. Catalytic properties and potential of an extracellular protease from an extreme halophile. // Enzyme Microb. Technol. 1994. - V. 16, N. 4. - P. 266-275.

21. Thongthai C., Suntinanalert P. Halophiles in Thai fish sauce (nam pla). // In: Rodriguez-Valera F (ed) General and applied aspects of halophilic microorganisms. Plenum Press, New York. 1991. - pp 381-388

22. Nichols D.S., Nichols P.D., McMeekin T.A. Polyunsatured fatty acids in antarctic bacteria. // Antarct. Sci. 1993. - V. 5, N. 1. - P. 149-160.

23. Nichols D.S., Russell N.J. Polyunsaturated fatty acids in marine bacteria—a dogma rewritten. // Microbiology (UK). 1999. - V. 145 (Pt. 4) - P. 767-779.

24. Азизова О. Галофильные бактерии новый источник биологически активных веществ. // www.cmjournal.com/ruspage404.htm

25. Stoeckenius W. Bacterial rhodopsins: evolution of a mechanistic model for the ion pumps. // Protein Sci. 1999. - V. 8, N. 2. - P. 447-459.

26. Ventosa A., Oren A. Halobacterium salinarum nom. corrig., a name to replace Halobacterium salinarium (Elazari-Volcani) and to include Halobacterium halobium and Halobacterium cutirubrum. // Int. J. Syst. Microbiol. 1996. - V. 46. - P. 347.

27. Lanyi J.K. Light energy conversion in Halobacterium halobium. // Microbiol. Rev. -1978. V. 42, N. 4. - P. 682-706.

28. Stoeckenius W., Lozier R.H., Bogomolni R.A. Bacteriorhodopsin and purple membrane of halobacteria. // Biochim. Biophys. Acta 1979. - V. 505, N. 3. - P. 215278.

29. Shahmohammadi H.R., Asgarani E., Terato H., Saito T., Ohyama Y., Gekko K., Yamamoto O., Ide H. Protective roles of bacterioruberin and intracellular KCl in the resistance of Halobacterium salinarium against DNA-damaging agents.

30. J. Radiat. Res. (Tokyo) 1998. - V. 39, N. 4. - P. 251-262.

31. Kelly M., Jensen S.L. Bacterial carotenoids. XXVI. C50-carotenoids. 2. Bacterioruberin. // Acta Chem. Scand. 1967 - V. 21, N. 9. - P. 2578-2580.

32. Kushwaha SC, Kramer JK, Kates M. Isolation and characterization of C50-carotenoid pigments and other polar isoprenoids from Halobacterium cutirubrum. // Biochim. Biophys. Acta 1975. - V. 398, N. 2. - P. 303-314.

33. Blawrock A.E., Stoeckenius W. Structure of purple membrane. // Nature (New Biol.) -1971. V. 233, N. 39. - P. 152-155.

34. Oesterhelt D., Stoeckenius W. Isolation of the cell membrane of Halobacterium halobium and its fractionation into red and purple membrane. // Methods Enzymol. -1974. V. 31 (Pt A) - P. 667-678.

35. Oesterhelt D., Brauchle C., Hampp N. Bacteriorhodopsin: a biological material for information processing. // Quart. Rev. Biophys. 1991. - V. 24, N 4. - P. 425-478.

36. Sumper M., Reitmeier H., Oesterhelt D. Biosynthesis of the purple membrane of halobacteria. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1976. - V.15, N. 5. - P. 187 - 194.

37. Lukashev E.P., Robertson B. Bacteriorhodopsin retains its light-induced proton pumping function after being heated to 140oC. // Bioelectrochem. Bioenerg. 1995. -V. 37, N. 2. - P. 157-160.

38. Govindjee R., Ohno K., Ebrey T.G. Effect of the removal of the COOH-terminal region of bacteriorhodopsin on its light-induced H+ changes. // Biophys. J. 1982. -V. 38, N. 1. - P. 85-87.

39. Liao M.J., Khorana H.G. Removal of the carboxyl-terminal peptide does not affect refolding or function of bacteriorhodopsin as a light-dependent proton pump. // J. Biol. Chem. 1984. - V. 259, N. 7. - P. 4194-4199.

40. Eisenbach M., Caplan S.R. Interaction of purple membrane with solvents. II. Mode of interaction. // Biochim. Biophys. Acta 1979. - V. 554, N. 2. - P. 281-292.

41. Hiraki K., Hamanaka T., Mitsui T., Kito Y. Structural studies of brown membrane by X-ray diffraction, circular dichroism and absorption spectra. // Photochem. Photobiol. 1981. - V. 33, N. 4. - P. 429-433.

42. Dencher N.A. The five retinal-protein pigments of halobacteria: bacteriorhodopsin, halorhodopsin, P 565, P 370, and slow-cycling rhodopsin. // Photochem. Photobiol. -1983. V. 38, N. 6. - P. 753-767.

43. Oren A. Bioenergetic aspects of halophilism. // Microbiol. Molecular Biol. Rev. -1999. V. 63, N. 2. - P. 334-348.

44. Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. // М.: Высшая школа. 1989. - С. 102-117.

45. Birge R.R. Nature of the primary photochemical events in rhodopsin and bacteriorhodopsin. // Biochim. Biophys. Acta 1990. - V. 1016, N. 3. - P. 293 - 327.

46. Hampp N., Popp A., Braeuchle C. Diffraction efficiency of bacteriorhodopsin films for holography containing bacteriorhodopsin wild type BRWT and its BRD85E and BRd96n. // J. Phys. Chem. 1992. - V. 96, N. 11. - P. 4679-4685.

47. Okada-Shudo Y., Yamaguchi I., Tomioka H., Sasabe H. Real-time image processing using polarization discrimination of bacteriorhodopsin. // Synthetic Metals. 1996. -V. 81,N. 2-3. - P. 147-149.

48. Logunov I., Schulten K. Quantum chemistry: molecular dynamics study of the dark-adaptation process in bacteriorhodopsin. // J. Am. Chem. Soc. 1996. - V. 118, N. 40.- P. 9727-9735

49. Scherrer P., Mathew M.K., Sperling W., Stoeckenius W. Retinal isomer ratio in dark-adapted purple membrane and bacteriorhodopsin monomers. // Biochemistry. 1989.- V. 28, N. 2. P. 829-835.

50. Hatcher M.E., Hu J.G., Belenky M., Verdegem P., Lugtenburg J., Griffin R.G., Herzfeld J. Control of the pump cycle in Bacteriorhodopsin: mechanisms elucidated by solid-state NMR of the D85N mutant. // Biophys. J. 2002. - V. 82, N. 2. - P. 1017-1029

51. Hage W., Kim M., Frei H., Mathies R.A. Protein dynamics in the bacteriorhodopsin photocycle: a nanosecond step-scan FTIR investigation of the KL to L transition. // J. Phys. Chem. 1996. - V. 100, N. 39. - P. 16026-16033.

52. Haupts U., Tittor J., Oesterhelt D. Closing on bacteriorhodopsin: progress in understanding the molecule. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct 1999. - V. 28. -P. 367-399.

53. Subramaniam S., Greenhalgh D.A., Khorana H.G. Aspartic acid 85 in bacteriorhodopsin functions both as proton acceptor and negative counterion to the Schiff base. // J. Biol. Chem. 1992. - V. 267, N. 36. - P. 25730-25733.

54. Brown L.S., Dioumaev A.K., Needleman R., Lanyi J.K. Local-access model for proton transfer in bacteriorhodopsin. // Biochemistry. 1998. - V. 37, N 7. - P. 39823993.

55. Luecke H., Richter H.T., Lanyi J.K. Proton transfer pathways in bacteriorhodopsin at 2.3 angstrom resolution. // Science. 1998. - V. 280, N. 5371. - P. 1934-1937.

56. Ovchinnikov Yu.A. Bioorganic chemistry of rhodopsins. // Pure Appl. Chem. 1986.- V. 58, N. 5. P. 725-736.

57. Овчинников Ю.А., Абдулаев Н.Г., Фейгина М.Ю., Киселев A.B., Лобанов H.A., Назимов И.В. Первичная структура бактериородопсина. // Биоорган. химия. -1978. Т. 4, N. 11. - С. 1573-1574.

58. Hacket N.R., Stern L.J., Chao B.H., Kronis K.A., Khorana H.G. Structure-function studies on bacteriorhodopsin. V. Effects of amino acid substitutions in the putative helix F. // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262, N. 19. - P. 9277-9284.

59. Jang D., El-Sayed M.A., Stern L.J., Mogi T., Khorana H.G. Effect of genetic modification of tyrosine-185 on the proton pump and the blue-to-purple transition in bacteriorhodopsin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990. - V. 87, N 11. - P. 41034107.

60. Krebs M.P., Mollaaghababa, Khorana H.G. Gene replacement in Halobacterium halobium and expression of bacteriorhodopsin mutants. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. - V. 90, N 5. - P. 1987-1991.

61. Feng Y., Menick D.R., Katz B.M., Beischel C.J., Hazard E.S., Misra S., Ebrey T.G., Crouch R.K. Probing of the retinal binding site of bacteriorhodopsin by affinity labeling. // Biochemistry. 1994. - V. 33, N. 38. - P. 11624 - 11630.

62. Flitsch S.L., Khorana H.G. Structural studies on transmembrane proteins. I. Model study using bacteriorhodopsin mutants containing single cysteine residues. // Biochemistry. 1989. - V. 28, N. 19. - P. 7800 - 7805.

63. Mogi T., Marti T., Khorana H.G. Structure-function studies on bacteriorhodopsin. IX. Substitutions of tryptophan residues affect protein-retinal interaction in bacteriorhodopsin. // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264, N. 24. - P. 14197-14201.

64. Brown L.S. Reconciling crystallography and mutagenesis: a synthetic approach to the creation of a comprehensive model for proton pumping by bacteriorhodopsin. // Biochim. Biophys. Acta 2000. - V. 1460, N. 1. - P. 49-59.

65. Tittor J., Soell C., Oesterhelt D., Butt H.J., Bamberg E. A defective proton pump, point-mutated bacteriorhodopsin Asp^96Asn is fully reactivated by azide. // EMBO J. 1989. - V. 8, N 11. - P. 3477-3482.

66. Мицнер Б.И., Ходонов A.A., Звонкова E.H., Евстигнеева Р.П. Аналоги ретиналя: синтез и взаимодействие с бактериородопсином. // Биоорган. химия. 1986. - Т. 12, N. 1. - С. 5-53.

67. The Retinoids. V. 1, 2. // Eds. Sporn M.B., Roberts A.B., Goodman D.S. Orlando: Acad. Press 1984. - 424 p., 446 p.

68. Chemistry and Biology of Synthetic Retinoids. // Eds. Dawson M.I., Okamura W.H. Boca Raton: CRC Press 1990. - 615 p.

69. Tokunaga F., Govinjee R., Ebrey T.G., Crouch R. Synthetic pigment analogues of the purple membrane protein. // Biophys. J. 1977. - V. 19, N. 2. - P. 191-198.

70. Crouch R.K., Scott R., Ghent S. Govindjee R., Chang Ch-H., Ebrey T. Properties of synthetic bacteriorhodopsin pigments. Further probes of the chromophore binding site. // Photochem. Photobiol. 1986. - V. 43, N. 3. - P. 297-303.

71. Oesterhelt D., Christoffel V. Reconstitution of a proton pump. // Biochem. Soc. Transact. 1976. - V. 4, N. 4. - P. 556-559.

72. Nakanishi K., Balogh-Nair V., Arnaboldi N., Tsujimoto K., Honig B. An external point-charge model for bacteriorhodopsin to account for its purple color // J. Am. Chem. Soc. 1980. - V. 102, N. 27. - P. 7945-7947.

73. Gartner W., Oesterhelt D., Seifer-Schiller E., Towner P., Hopf H., Bohm I. Acetylenic retinals form functional bacteriorhodopsins but not bovine rhodopsins. // J. Am. Chem. Soc. 1983. - V. 106, N. 19. - P. 5654-5659.

74. Даншина C.B., Драчев А.Л., Драчев Л.А., Каулен А.Д., Мицнер Б.И., Хитрина Л.В. Ходонов А.А. Цис- и транс-изомеры 11,12-дидегидробактериородопсина. // Биоорган. химия. 1989. - Т. 15, N. 3. - С. 307-312.

75. Хитрина Л.В., Еремин C.B., Ходонов А.А., Каулен А.Д. Хромофор-образующие изомеры 11,12-дидегидробактериородопсина. // Биол. мембраны. 1994. - Т. 11, N. 5. - С. 575-576.

76. Хитрина Л.В., Каулен А.Д., Еремин C.B., Ходонов А.А. Бактериородопсин. Белковые ограничения изомеризации хромофора. // Молек. биология. 1995. -Т. 29, N. 6. - С. 1398-1407.

77. Даншина C.B., Драчев А.Л., Драчев Л.А., Еремин C.B., Каулен А.Д., Мицнер Б.И., Хитрина Л.В., Чекулаева Л.Н. Фотоцикл и электрогенез 13-дезметилбактериородопсина. // Биофизика. 1989. - Т. 34, N. 4. - С. 623-626.

78. Серебряный B.A., Мицнер Б.И., Закис В.И., Цетлин В.И. Аналоги бактериородоисина на основе 4-замещенных ретиналей. // Биоорган. химия. -1981. Т. 7, N 11. - С. 1731-1733.

79. Shealy Y.F., Hosmer C.A., Riordan J.M. Modification of the intact retinoid structure in the cyclohexenyl region: alkylation of methyl 4-oxoretinoate. // Synthesis. 1993. -N. 11. - P. 1095-1098.

80. Rao V.J., Derguini F., Nakanishi K., Tagushi T., Hosoda A., Hanzava Y., Kobayashi Y., Pande S.M., Callender R.H. 5-(Trifluoromethyl)bacteriorhodopsin does not translocate protons. // J. Am. Chem. Soc. 1986. - V. 108, N 19. - P. 6077-6078.

81. Fang J.M., Carriker J.D., Balog-Nair V., Nakanishi K. Evidence for the necessity of double bond (13-ene)-isomerization in the proton pumping of bacteriorhodopsin. // J. Am. Chem. Soc. 1983. - V. 105, N. 15. - P. 5162-5164.

82. Кириллова Ю.Г., Еремин C.B., Хитрина Л.В., Мицнер Б.И. Циклопентеновые и циклогексеновые аналоги ретиналя по-разному взаимодействуют с бактериоопсином. // Биоорган. химия. 1993. - Т. 19, N. 8. - С. 825-835.

83. Кириллова Ю.Г., Хитрина Л.В., Ходонов А.А. Взаимодействие метилциклопентеновых аналогов 13-цис ретиналя с бактериоопсином. // Биол. мембраны. 1993. - Т. 10, N. 4. - С. 447-448.

84. Kirillova Yu.G., Eremin S.V., Khitrina L.V., Khodonov A.A. 13-C/s-retinal locked analogues interact with bacterioopsin in different manner. // Abstracts of Vlth International Conference on Retinal Proteins. Leiden, The Netherlands. 1994. - P. 120.

85. Groesbeek M., Kirillova Yu.G., Boeff R., Lugtenburg J. Synthesis of six novel retinals and their interaction with bacterioopsin. // Rec. Trav. Chim. Pays-Bas. 1994. - V. 113. - P. 45-52.

86. Khodonov A.A., Khitrina L.V. Synthesis of heavy atom labeled retinal and investigation of its interaction with bacterioopsin. // Abstracts of Vl-th International Conference on Retinal Proteins. Leiden, The Netherlands. 1994. - P. 118.

87. Danshina S.V., Drachev A.L., Drachev L.A., Eremin S.V., Kaulen A.D., Khitrina L.V., Mitsner B.I. C13-substituted bacteriorhodopsin analogs. // Archiv. Biochem. Biophys. 1990. - V.279, N2. - P. 225-231.

88. Ходонов A.A., Еремин С.В., Локшин Дж. Л., Швец В.И., Демина О.В., Хитрина Л.В., Каулен А.Д. Аналоги ретиналя и их роль в исследовании бактериородопсина. // Биоорган. химия. 1996. - Т. 22, N. 10-11. - P. 745-776.

89. Броун Л.С. Исследование механизмов переноса протонов в бактерпородопспне с помощью точечного мутагенеза и изменчивости первичной структуры белка. // Биохимия. 2001. - Т. 66, N. 11. - С. 1546-1554.

90. Soppa J., Oesterhelt D. Bacteriorhodopsin mutants of Halobacterium sp. GRB. // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264, N. 22. - P. 13043-13048.

91. Dunn R.J., Hacket N.R., McCoy J.M., Chao B.H., Kimura K., Khorana H.G. Structure-function studies on bacteriorhodopsin. I. Expression of the bacterio-opsin gene in Escherichia coli. // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262, N. 19. - P. 9246-9254.

92. Karnik S.S., Nassal M., Doi T., Jay E., Sgaramella V., Khorana H.G. Structure-function studies on bacteriorhodopsin. II. Improved expression of the bacterio-opsin gene in Escherichia coli. // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262, N. 19. - P. 9255-9263.

93. Nassal M., Mogi T., Karnik S.S., Khorana H.G. Structure-function studies on bacteriorhodopsin. III. Total synthesis of a gene for bacterio-opsin and its expression in Escherichia coli. // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262, N. 19. - P. 9264-9270.

94. Ni B., Chang M., Duschl A., Lani J., Needleman R. An efficient system for the synthesis of bacteriorhodopsin in Halobacterium halobium. // Gene. 1990. - V. 90, N. 1. - P. 169 - 172.

95. Braiman M.S., Stern L.J., Chao B.H., Khorana H.G. Structure-function studies on bacteriorhodopsin. IV. Purification and renaturation of bacterio-opsin polypeptide expressed in Escherichia coli. // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262, N. 19. - P. 92719276.

96. London E., Khorana H.G. Denaturation and renaturation of bacteriorhodopsin in detergents and lipid-detergent mixtures. // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257, N. 12. - P. 7003-7011.

97. Половникова О.Ю., Симонова Т.Н., Тараховский Ю.С., Никонова Т.Н., Суханов

98. Schweiger U., Tittor J., Oesterhelt D. Bacteriorhodopsin can function without a covalent linkage between retinal and protein. // Biochemistry. 1994 - V. 33, N. 2. -P. 535 - 541

99. Soppa J., Otomo J., Staub J., Tittor J., Meeben S., Oesterhelt D. Bacteriorhodopsin mutants of Halobacterium sp. GRB. II. Characterization of mutant. // J. Biol. Chem. -1989. V. 264, N. 22. - P. 13049-13056.

100. Imasheva E.S., Lu M., Balashov S.P., Ebrey T.G., Chen Y., Ablonczy Z., Menick

101. D.R., Crouch R.K. Exploring the function of Tyr83 in bacteriorhodopsin: features of the Y83F and Y83N mutants. // Biochemistry. 2001. - V. 40, N. 44. - P. 1332013330

102. Isenbarger T.A., Krebs M.P. Role of helix-helix interactions in assembly of bacteriorhodopsin lattice. // Biochemistry. 1999. - V. 38, N. 28. - P. 9023-9030.

103. Marti T., Otto H., Roesselet S.J., Heyn M.P., Khorana G.H. Consequences of amino acid insertions and/or deletions in transmembrane helix C of bacteriorhodopsin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. - V. 89, N. 4. - P. 1219-1223.

104. Greenhalgh D.A., Farrensl D.L., Subramaniamg S., Khorana H.G. Hydrophobic amino acids in the retinal-binding pocket of bacteriorhodopsin. // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268, N. 27. - P. 20305-20311.

105. Greenhalgh D.A., Altenbach C., Hubbel W.L., Khorana H.G. Locations of Arg-82, Asp-85, and Asp-96 in helix C of bacteriorhodopsin relative to the aqueous boundaries. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. - V. 88, N. 19. - P. 8626-8630.

106. Marti T., Rosselet S.J., Otto H., Hey M.P., Khoranal H.G. The retinylidene Schiff base counterion in bacteriorhodopsin. // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266, N. 28. - P. 1867418683.

107. Mogi T., Stern L.J., Marti T., Chao B.H., Khorana H.G. Aspartic acid substitutions affect proton translocation by bacteriorhodopsin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988.- V. 85, N. 12. P. 4148-4152.

108. Drachev L.A., Kaulen A.D., Khorana H.G., Mogi T., Postanogova N.V., Skulachev V.P., Stern L.J. The role of arginine 82 and 227 in the bacteriorhodopsin proton pump. // Photochem. Photobiol. 1992. - V. 55, N. 5. - P. 741-744.

109. Opportunities in biotechnology for future army applications. // National Academy Press, Washington, D.C. 2000. - 118 pp.

110. Bouas-Laurent H., Durr H. Organic photochromism (IUPAC technical report). // Pure Appl. Chem. 2001. - V. 73, N. 4. - P. 639-665.

111. Brauchle C., Hampp N., Oesterhelt D. Optical applications of bacteriorhodopsin and its mutated variants. // Adv. Mater. 1991. - V. 3, N 9. - P. 420-428.

112. Popp A., Wolperdinger M., Hampp N., Bruchle C., Oesterhelt D. Photochemical conversion of the O-intermediate to 9-cis-retinal- containing products in bacteriorhodopsin films // Biophys. J. 1993. - V. 65, N. 4. - P. 1449-1459.

113. Всеволодов H.H., Полторанский B.A. Голограммы на «Биохроме», биологическом фотохромном материале. // Сов. физ. тех. физ. 1985. - Т. 30. -С.1235.

114. Hampp N., Brauchle C., Oesterhelt D. Bacteriorhodopsin wild type and variant aspartate-96^asparagine as reversible holographic media. // Biophys. J. 1990. - V. 56, N. 6. - P. 83-93.

115. Zaitzev S.Y., Kozhevnikov N.M., Bapmenkov Y.O., Lipovskaya M.Y. Kinetics of dynamic hologram recording in polymer films with immobilized bacteriorhodopsin. // Photochem. Photobiol. 1992. - V. 55, N. 6. - P. 851-856.

116. Seitz A., Hampp N. Kinetic optimization of bacteriorhodopsin films for holographic interferometry. // J. Phys. Chem. B 2000. - V. 104, N. 30. - P. 7183-7192.

117. Birge R.R. Protein based computers. // Scientific American. 1995. - N 3. - P. 90-95.

118. Min J., Choi H.G., Oh B.-K., Lee W.H., Paek S.-H., Choi J.-W. Visual information processing using bacteriorhodopsin-based complex LB films. // Biosens. Bioelectron.- 2001. V. 16, N 9-12. - P. 917-923.

119. Min J., Choi J.-W., Lee W.H., Kim U.R. Photoreceptor consisting of spiropyran-bacteriorhodopsin films for photosignal enhancement. // Biosens. Bioelectron. 1998.- V. 13, N. 11. P. 1151-1155.

120. Choi H.-G., Min J., Choi J.-W. , Lee W. H. Molecular photoreceptor consisting of bacteriorhodopsin/flavin complex Langmuir-Blodgett films. // Biosens. Bioelectron. -1998. V. 13, N. 10. - P. 1069-1075.

121. Choi H.-G., Jung W.-C., Min J., Lee W.H., Choi J.-W. Color image detection by biomolecular photoreceptor using bacteriorhodopsin-based complex LB films. // Biosens. Bioelectron. 2001. - V. 16, N. 9-12. - P. 925-935.

122. Kolodner P., Lukashev E.P., Ching Y.-C., Druzhko A.B. Electric-field and photochemical effects in D85N mutant bacteriorhodopsin substituted with 4-keto-retinal. // Thin Solid Films. 1997. - V. 302, N. 2. - P. 231-234.

123. Druzhko A.B., Weetal H.H. Photoinduced transformation of wild-type and D96N-mutant 4-keto-bacteriorhodopsin gelatin films. // Thin Solid Films. 1997. - V. 293, N. 3. - P. 281-284.

124. Ходонов A.A., Мицнер Б.И., Звонкова E.H., Евстигнеева Р.П. Ароматические аналоги 13-цис и полностью-транс-ретиналей. // Биоорган. химия. 1987. - Т. 13, N. 2. - С. 238-251.

125. Khodonov A.A., Demina O.V., Khitrina L.V., Kaulen A.D., Silfsen P., Parkkinen S., Parkkinen J., Jaaskelainen T. Modified bacteriorhodopsins as a basis for new optical devices. // Sensors Actuators. B. 1997. - V. 38-39, N. 1-3. - 218-221.

126. Jaaskelainen T., Leppanen V.P., Parkkinen S., Parkkinen J.P.S., Khodonov A. The photochromic properties of 4-keto bacteriorhodopsin. // Optical Materials. 1996. -V. 6, N. 4. - P. 339-345

127. Драчев Л.А., Зорина В.В., Мицнер Б.И., Хитрина Л.В., Ходонов A.A., Чекулаева Л.Н. Фотоцикл и электрогенезис 13-цис и иолностью-транс ароматических аналогов бактериородопсина. // Биохимия. 1987. - Т. 52, N. 9. - С. 1559-1569.

128. Хитрина Л.В., Лазарева Ц.Р. Исследование 13-цис и иолностью-транс изомеров 4-кетобактериородопсина. // Биохимия. 1989. - Т. 54, N. 1. - С. 136-138.

129. Seiff F., Wallat I., Ermann P., Heyn M.P. A neutron diffraction study on the location of the polyene chain of retinal in bacteriorhodopsin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1985. V. 82, N. 10. P. 3227-3231.

130. Dawson M.I., Hobbs P.D. The synthetic chemistry of retinoids. // In The Retinoids: Biology, Chemistry, and Medicine. / Eds. Sporn M.B., Roberts A.B., Goodman D.S. New York: Raven Press. 1994. - V. 1. Chapter 2. - P. 5-178.

131. Dawson M.I., Hobbs P.D., Chan R.L.-S., Chao W.-R. Retinoic acid analogues with ring modification. Synthesis and pharmacological activity. // J. Med. Chem. 1981. -V. 24, N. 10 - P. 1214-1223

132. Rosenberger M. Retinoic acid metabolites. 1. Total synthesis of 4-hydroxy and 4-oxoretinoic acid. // J. Org. Chem. 1982. - V. 47. - P. 1698-1701.

133. Rosenberger M., Neucom C. Retinoic acid metabolites. 3. Total synthesis of (2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(6,6-dimethyl-2-(hydroxymethyl)-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenoic acid. // J. Org. Chem. 1982. - V. 47, N. 9. - P. 1782-1785.

134. Acton N., Brossi A. Oxidation products of retinylidene dimedone. // Helv. Chim. Acta 1980. - V. 63, F. 6, N. 145. - P. 1391-1395.

135. Singh A.K. Synthesis of oxygenated retinoids. // Synth. Commun. 1983. - V. 13, N. 11. - P. 919-925.

136. Barua A.B., Olson J.A. Synthesis of 4,4-difluoro analogs of retinol and retinoic acid. // J. Lipid Res. 1984. - V. 25, N. 3. - P. 304-309.

137. Henbest H.B., Jones E.R.H., Owen T.C. Oxidation of vitamin A1 and retinene1 by manganese dioxide. // J. Chem. Soc. 1957. - P. 4902-4912.

138. Соколова H.A., Мицнер Б.И., Закис В.И. Синтез 4-кето- и 4-гидроксипроизводных all-E- и У^-ретиналей и их взаимодействие с бактериоопсином. // Биоорган. химия. 1979. - Т. 5, N 7. - С. 1053-1058.

139. Beischel C.J., Mani V., Govindjee R., Ebrey T.G., Knapp D.R., Crouch R.K. Ring oxidized retinals form unusual bacteriorhodopsin analogue pigments. // Photochem. Photobiol. 1991. - V. 54, N.6. - P. 977-983.

140. Colmenares L.U., Liu R.S.H. An unexpected C-19 product from reaction of retinal with MnO2. Structure characterization and bacteriorhodopsin analogs. // Tetrahedron Lett. 1991. - V. 32, N. 17. - P. 1933-1936.

141. Williams T.C., Mani V. Design of a helix-bundle cross-link: NMR and UV-visible spectroscopic analysis and molecular modeling of ring-oxidized retinals. // Biochemistry. 1991. - V. 30, N. 11. - P. 2976-2988.

142. Schwieter U., Arnold W., Oberhaensli W.E., Rigassi N., Vetter W. 263. Synthesen in der Carotinoid-Reihe. Ein Beitrag zur Chromsaeure-Oxydation von Polyenen. // Helv. Chim. Acta 1971. - V. 54, F. 8, N. 262-263. - P. 2447-2459.

143. Oyler A R., Motto M.G., Naldi R.E., Facchine K.L., Hamburg P.F., Burinsky D.J., Dunphy R., Cotter M.L. Characterization of autoxidation products of retinoic acid. // Tetrahedron. 1989. - V. 45, N. 24. - P. 7679-7694.

144. Karras M., Snider B.B. Opsin shift in bovine rhodopsin and bacteriorhodopsin. Comparison of two external point-charge models. // J. Am. Chem. Soc. 1980. - V. 102, N 27. - P. 7947-7949.

145. Maryanoff B.E., Reitz A.B. The Wittig olefination reaction and modifications involving phosphoryl-stabilized carbanions. Stereochemistry, mechanism, and selected synthetic aspects. // Chem. Rev. 1989. - V. 89, N 4. - P. 863-927.

146. Bestmann H.J. Synthesis of polyenes via phosphonium ylides. // Pure Appl. Chem. -1979. V. 51, N 3. - P. 515-533.

147. Pommer H. Synthesen in der Vitamin A- Reihe. // Angew. Chem. 1960. - B. 72, N 22. - S. 811-819.

148. Buddrus J. Dehydrohalogenierung von Phosphoniumhalogeniden durch Epoxide. Teil 1: Bildung der Ilide und Umsetzung mit Carbonylverbindungen. // Chem. Ber. 1974.- B. 107, N 6. S. 2050-2061.

149. Buddrus J., Kimpenhaus W. Dehydrohalogenierung von Phosphoniumhalogeniden durch Epoxide. Teil 2: Kinetik und Mechanismus. // Chem. Ber. 1974. - B. 107, N 6.- S. 2062-2078.

150. Мицнер Б.И., Ходонов A.A., Звонкова E.H., Евстигнеева Р.П. Способ получения 6Z- и 6^-изомеров (2Е)-8-трифенилсилилокси-2,6-диметилокта-2,6-диен-4-ин-1-аля. // A.c. N 1027168 (СССР). Приоритет от 30.03.1982. - Бюлл. изобр. - 1983.- N 25.

151. Luecke H., Schobert B., Richter H.T., Cartailler J.P., Lanyi J.K. Structural changes in bacteriorhodopsin during ion transport at 2 angstrom resolution. // Science. 1999. -V. 286, N. 5438. - P. 255-260.

152. MacDonald R.E., Green R.V., Lanyi J.K. Light-activated amino acid transport systems in Ha/obacterium ha/obium envelope vesicles: role of chemical and electrical gradients. // Biochemistry. 1977. - V. 16, N. 14. - P. 3227-3235.

153. Brown H.J., Gibbons N.E. The effect of magnesium, potassium, and iron on the growth and morphology of red halophilic bacteria. // Can. J. Microbiol. 1955. - V. 1.- P. 486-494.

154. Oesterhelt D., Krippahl G. Phototrophic growth of halobacteria and its use for isolation of photosynthetically-deficient mutants. // Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur) -1983. V. 134 B, N 1. - P.137 - 150.

155. Katznelson H., Lochhead A.G. Growth factors requirement of halophilic bacteria. // Can. J. Research. 1952. - V. 64, N. 1. - P. 97-103.

156. Oesterhelt D. Reconstitution of the retinal proteins bacteriorhodopsin and halorhodopsin. // Meth. Enzymol. 1982. - V. 88, Pt. 2 - P. 10-17.