Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Культивирование дрожжей и галобактерий в условиях контролируемого окислительного стресса
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Культивирование дрожжей и галобактерий в условиях контролируемого окислительного стресса"
На правах рукописи
КАЛЕНОВ Сергей Владимирович
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ДРОЖЖЕЙ И ГАЛОБАКТЕРИЙ В УСЛОВИЯХ КОНТРОЛИРУЕМОГО ОКИСЛИТЕЛЬНОГО
СТРЕССА
Специальность 03 00 23 - Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук
00305939т
Москва 2007
003059397
Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им Д И Менделеева на кафедре биотехнологии
Научный руководитель Кандидат технических наук,
доцент А Е Кузнецов
Официальные оппоненты Доктор биологических наук, профессор
Галина Ивановна Эль-Регистан Доктор технических наук Виталий Викторович Лалов
Ведущая организация
ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г Москва
Защита состоится " 2007 г в^ часов на заседании диссер-
тационного совета ДМ 212 204 13 в Российском химико-технологическом университете им Д И Менделеева (125047, Москва, Миусская пл , 9) в ауд j/Xj^S
С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центре РХТУ им ДИ Менделеева
Автореферат разослан "JZ6" ¿-'C-íOfCé'* 2007 ;
Ученый секретарь диссертационного совета,
ДМ212 204 13 , ИВ Шакир
Г
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Совершенствование традиционных и разработка новых способов культивирования микроорганизмов является основой для получения продуктов их биосинтеза и использования специфических микробных процессов в отдельных областях биотехнологии Постоянное внимание уделяется поиску средств, позволяющих поддерживать необходимые ростовые и биосинтетические характеристики микробных продуцентов на протяжении определенной ферментационной стадии или всего жизненного цикла Широко применяются такие методы как иммобилизация клеток, управляемое культивирование с использованием современных оперативных средств и математических моделей, направленное вмешательство в метаболические процессы и др Отклонение сбалансированного процесса микробного синтеза от заданных оптимальных параметров ведет к ухудшению показателей биосинтеза, а нарушение этих параметров индуцирует развитие в клетках микроорганизмов состояния стресса Состояние стресса понимается как совокупность ответных реакции, направленных на преодоление неблагоприятных изменений окружения, вызванных стрессорным воздействием
Длительное время считали, что стресс неблагоприятно воздействует па микроорганизмы, что выражается в подавлении их физиологической активности, снижении эффективности биосинтеза Однако, в последние годы появилось много данных, свидетельствующих о том, что в определенных условиях воздействие оптимальных доз стрессорных факторов (стрессоров) приводит к улучшению ростовых характеристик микроорганизмов, стимуляции биосинтетических процессов, повышению скорости биотрансформации и разложения загрязнений |Т)аУ1е8 е! а1, 1995, Саф-ронов, 2002, Сорокодумов, 2005]
Таким образом, воздействие определенными дозами стрессора приводит к мобилизации физиологических и генетических резервов клетки [Нагще-Агготя, 2000] В этой связи целесообразно использовать понятие контролируемого стресса, при котором развивающаяся устойчивость к стрессорному воздействию проявляется как стимуляция метаболизма Контроль количества и качества стресс-фашоров, избирательное усиление или подавление действия их на клетки микроорганизмов может быть эффективным средством совершенствования процессов управляемого культивирования микроорганизмов в лабораторных и промышленных условиях
Цель и задачи исследований Целью настоящей работы было выяснить закономерности изменения биосинтетических и ростовых характеристик модельных микроорганизмов в условиях контролируемого окислительного стресса для совершенствования ферментационных процессов и разработки новых подходов управляемого культивирования промышленно важных микробных продуцентов
Для достижения цели были поставлены следующие задачи
1 - разработать стендовую установку и программное обеспечение для исследования процессов культивирования модельных микроорганизмов в условиях контролируемого окислительного стресса,
2 - исследовать изменения ростовых и биосинтетических характеристик модельных микроорганизмов при воздействии УФ облучением и пероксидом водорода, подобрать оптимальные дозы стрессоров,
3 - проанализировать действие факторов окружения, обладающих антистрессовым эффектом при окислительном стрессе,
4 - исследовать устойчивость к факторам окислительного стресса микроорганизмов различного физиологического состояния,
5 - исследовать совместное действие стрессорных и антистрессорных факторов в процессах культивирования модельных микроорганизмов,
6 ~ разработать методы, обеспечивающие поддержание состояния оптимального окислительного стресса для увеличения выхода целевого продукта,
7 - разработать автоматизированную систему культивирования и синтеза целевых продуктов в условиях контролируемого окислительного стресса
Научная новизна На примере дрожжей Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae и га-лобактерий Halobacterium salmarium показана перспективность использования контролируемого окислительного стресса для повышения эффективности ферментации
Обнаружено, что контролируемое совместное воздействие стрессоров (Н2О2, мягкий ультрафиолет) и антистрессорных факторов (видимый свет низкой интенсивности, антиокси-данты, удаление ингибиторов биосинтеза) улучшает ростовые и биосинтетические характеристики модельных микроорганизмов повышает выход биомассы, удельную скорость роста, бродильную активность и устойчивость к закистеншо у дрожжей, способствует поддержанию продуктивности биореактора с высокоплотностной культурой дрожжей, повышает уровень накоше-ния бактериородопсина при минимальном накоплешш каротиноидов у галобактерий Показано, что комбинированное действие ультрафиолета и видимого света или монохроматического излучения может выступать в качестве инструмента для управления ростом гетеротрофных микроорганизмов, не чувствительных в обычных условиях (без УФ облучения) к освещению
Для дрожжей Saccharomyces cerevisiae показана целесообразность использования посевного материала, предобработанного Н2О2 Подобраны условия выращивания засевной культуры в условиях окислительного стресса (внесение Н2О2 в предстационарной фазе роста разово в дозе 0,3-0,6 г/л при освещении суспензии фоновым дневным светом), обеспечивающие в основном процессе в аэробных или микроаэрофитьпых условиях увеличение удельной скорости роста на 15-25%, выхода биомассы на 15-25%, сокращение лаг-фазы более чем в 2 раза, в анаэробных условиях - увеличение удетьной скорости роста на 30-50% и сокращение времени сбраживания субстрата на 30%
Впервые установлено, что в процессе гтубинного культивирования галобактерий (ГБ) Н salinai шт рост культуры и синтез бактериородопсина (БР) в сильной степени зависят от наличия ингибиторов, предположительно продуктов химического и/или фотохимического окисления компонентов среды, образующихся при ее хранении или использовании С учетом этих факторов получен биосинтетически активный штамм галобактерий, подобраны оптимальные условия (среда, режим аэрации, подготовка посевного материала, освещение) и разработаны режимы культивирования (доливная культура, внесение ангиоксидантов, обработка адсорбентами), позволившие увеличить содержание бактериородопсина в клетках и его выход за цикл ферментации с 70-75 мг/л за 6-7 сут до 1700-1750 мг/л за 8 сут при одновременном повышении стабильности процесса и снижении содержания каротиноидов, что существенно упрощает процедуры выдечения бактериородопсина и его очистки
Практическая значимость На основе выявленных закономерностей разработаны новые методы культивирования микроорганизмов в условиях контротируемого окистительного стресса Предложены система и аппаратура культивирования, названная «солнечным» биореактором, в котором среда освещается одновременно светом видимого и мягкого ультрафиолетового УФА, УФБ диапазонов, что имитирует действие излучения солнца на поверхности земли, или подвергается воздействию подобранных малых доз пероксида водорода и видимого света
Вариант культивирования дрожжевой засевной культуры при одновременном воздействии пероксида водорода и видимого света предложен для улучшения показателей (жизнеспособности, бродильной активности дрожжей) при получении спирта из зерносырья Предложение вошло в план перспективных мероприятий Серебряно-Прудского биохимического завода (Московская обл )
Для управления процессами ферментации галобактерий разработаны программное обеспечение «BioDrome 1 0», автоматизированный комплекс и метод непрерывного контроля уровня накопления биомассы и бактериородопсина Возможности комплекса позволяют регистрировать и регулировать параметры ферментации, работать в режимах культивирования с обратной связью по показаниям датчиков, а также следить за процессом в режиме удаленного доступа Согласно предварительной технико-экономической оценке реализация предложенных решений на базе разработанного автоматизированного комплекса и методов культивирования галобактерий при промышленном получении бактериородопсина (в составе пурпурных мембран) позволит снизить его стоимость с 500-5000 руб за 1 мг (в зависимости от чистоты продукта) до 20-100 руб за 1 мг Отдельные элементы комплекса и разработанное иршраммное обеспечение используются в научных исследованиях на стендах ГУП НПО «Астрофизика», ВНИИ Молочной промышленности, а также в учебном процессе в РХТУ им ДИ Менделеева (каф биотехнологии, каф процессов и аппаратов)
Разработанные новые способы культивирования микроорганизмов защищены патентами РФ Апробация работы Материалы диссертационной работы доложены на российских и международных научно-технических конференциях и конгрессах Международная конференция «Успехи в химии и химической технологии» (Москва, 2002 г), конференция «Образовательные, научные и инженерные приложения в среде LabView и технологии National Instruments» (Москва, 2003 г), V и VI Международный Форум «Высокие технологии XXI века» (Москва, 2004 г, 2006 г), European Symposium on Environmental Biotechnology (ESEB 2004, Oostende, Belgium), Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2006 г), I, II, III IV Московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005, 2007 гг)
Публикации По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 7 статей, 8 тезисов сообщений, получен 1 патент РФ на изобретения и поданы 2 заявки на патентование
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав по результатам экспериментальной работы, выводов, списка использованной литературы, включающего?^^источников Работа изложена на-/ машинописного текста, иллюстрирована ¿V рисунками, таблицами В приложении представлены протоколы и акты внедрений
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектами исследований бьпи дрожжи Candida tropicahs шт СК-4 и Saccharomyces cercvisiae шт SL-100 и Меуеп расы Т 985 Дрожжи выращивали в колбах на стандартной минеральной среде с сахарозой, в стандартных условиях культивирования, в асептических условиях О накоплении биомассы судили по изменению оптической плотности на КФК-3 01 (?v=540 им, 1=3 мм) с последующим пересчетом на сухой вес
Содержание сахарозы определяли модифицированным методом Бертрана-Шарля Содержание НАД+ определяли спектрофотометрически по нарастанию поглощения при 340 им в присутствии этанола и алькогольдегидрогеназы Содержание этанола определяли методом ГЖХ Бродильную активность определяли методом вытеснения
Другим объектом исследовании были галобактерии Использовались штаммы Halobacte-rnim salmarium шт 353П, ST-033, а также спонтанные мутанты, полученные из шт ST-033 облучением ультрафиолетом Среда для выращивания галобактерий содержала, г/л NaCl - 250, MgS04x7II20 - 20, КС1 - 2, цитрат Na - 3, СаС12 - 0,2, триптон (пептон) - 5, дрожжевой экстракт - 2, глицерин - 4, вода - водопроводная Состав и содержание органических компонентов среды варьировали Культивирование в 100 мл колбах проводили в периодических условиях на качалке
G10 (New Brunswick,) при 150 об/мин. температуре 37-38 "С, объеме среды в колбах 25-75 мл. Уровень аэрации регулировали степенью заполнения колб. Объем посевного материала (клетки стационарной фаш роста) составлял 2-20% об. Время культивирования - 3-8 сут. н зависимости от целей эксперимента.
Опыты в лабораторном биореакторе с обечайкой из стекла, рабочим объемом 3 л («Фер-мус-3», НИИ «Биоавтоматика», г. Н. Новгород) проводили при 37-38 °С в режиме глубинного культивирования в стерильных условиях с автоматическим контролем pH, рОг, Eh с использо-в;шием разработанного программного обеспечения «BioDrome 1.0» на базе инструментария LabView 7.0 фирмы National Instruments (США). Величина pH (6,8-7.2) регулировалась подтит-ровкой NaOH, содержание кислорода поддерживалось и изменялось расходом подаваемого воздуха и/или интенсивностью перемешивания. В качестве источников мягкого УФА и УФБ-излучения использовали лампы PHILIPS TL 20W/05 и ДРШ-100 со светофильтрами ФС-6 и УФС-8 В качестве источников лазерного излучения использовали Не-Ne лазер и Аргон-ионный лазер. Интенсивность освещения определяли с помощью люксметра - УФ-радиометра ТКА-01/3 (г. Санкт-Петербург). Облучение УФ в биореакторе проводили через выносной контур с кварцевой кюветой. Колбы и биорсактор освещали лампами дневного света ши светодиодными
матрицами с интенсивностью 10-150 мВт/л (в пересчете на длину волны Х=555 нм).
При культивировании галобактерий использовали адсорбент (активированный уголь АГ-3) для удаления из среды ингибиторов роста Для повышения выхода биомассы ГБ и содержания БР в реактор вносили субстратную подпитку, представляющую концентрированный раствор, содержащий триптон, дрожжевой экстракт и глицерин. Содержание клеток определяли турбшшметрически (спектрофотометр SpecordM40. Х=660 нм. 1=10 мм).
Динамику накопления БР определяли по разработанному экспресс-методу, основанному на цветовом анализе суспензии без непосредственного выделения БР: клеточная суспензия, прокачиваемая через кювету (1=10 мм) сканируется с помощью CCD матрицы сканера Lpson Perfection 1270 Обработка производится в автоматическом режиме с применением разработанной системы «Bio Drome 10» и использованием калибровки эталонов БР. построенной согласно [Oesterhell and Stoeckenius, 1974]. Наличие БР и каротнноидов контролировали также по спектрам лизатов галобактерий (Specord М40, /,=400-620 нм).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ I, Культивирование дрожжей Candida tropicalis в условиях окислительного стресса.
Ранее было показано, что умеренные дозы оксиданта, такого как HiOi улучшают показатели ферментационных процессов при культивировании дрожжей С. tropicalis на сахарозе [Сафронов, 2004], дрожжей S. cerevisiae на сахарозе и зерновом сусле [Сорокодумов. 2005], а также повышают эффективность биодеструкции фенола микробоценозами с доминированием
Содержание БР, мг/г биомассы
Мах -----------—------— Min
41) 3ft 32 2S 24 2IP 16 12 ft 4 I)
Рис. 1 Карта цвета для определения содержания БР. Кривая - изменение цвета суспензии ио ходу культивирования.
дрожжей Однако не была выяснена возможность исполыования друшх агентов окислительного cipecca, например УФ-излучения, не изучены эффекты адаптации клеток к окислительному стрессу и продолжительность сохранения адаптивных свойств у дрожжевых популяций, a ¡ак-жс сочетание действия оксидантов с антнстрессорными факторами для усиления позитивных эффектов у стрссс-индуцированных культур Выяснение особенностей физиологических реакции у дрожжей в условиях окислитечыюго стресса для выбора рациональных режимов их куль-швирования составите первое направление работы
В качестве еще одною агента окислительного стресса, действие которою во мноюм анало-[ично действию Н2О2, использовали ультрафиолетовое и ¡лучение ближних УФА и УФЬ диапазонов спектра В клетках оба стрессора индуцируют одну и ту же систему ангиоксидантиого ответа на воздействие этих стресс-факторов
В лабораторных экспериментах при выращивании дрожжей С twpicalis в колбах при рассеянном освещении и предварительно обтученных УФ-излучением выявили стимулирующее действие мягкого ультрафиолета на скорость роста и выход дрожжей Эффект зависел от физио-ло!ического возраста облучаемой культуры (удельной скорости роста и плотности дрожжевой популяции) Заметное положительное действие УФ-излучсния проявлялось для активно растущих культур (фаза экспоненциально1 о роста) Оптимальный режим облучения при использовании УФ-лампы «Филипс» 1 мин для стоя суспензии толщиной 4 мм с 00^=0,7-1 при позе излу че-пия 1000 Дж/м^ (250 Дж/л) Режим был апробован при росте дрожжей в биорсакторе (источник УФ-изпучения - лампа ДРШ-100) в периодических условиях культивирования О воздействии УФ-излучения на микроор1 анизмы судили по показателям концентрации растворенною кислорода р02, pH, Fh, выводимых непосредственно на монитор компьютера, и при сравнении кривых роста биомассы 1ак как в ответе микроорганизмов на окислительный стресс, индуцируемый утьтрафиолетом, может участвовать система фоторепарации, эксперименты проводили в двух вариантах с освещением биореактора видимым светом и с затемнением
Окислительный стресс вызывали в культуре дрожжей с ОП 0,3-3,0 облучением ультрафиолетом интенсивности 0,5-2 Вт/л при скорости вращения мешалки 150-370 об/мин Освещение видимым светом интенсивностью 40 мВт/л производили через стеклянную обечайку биореакгора
В отмеченных условиях облучения дрожжи реагируют на действие УФ-излучения как при освещении биорсактора, так и в темноте при этом процесс роста становится чувствительным к действию видимого i веча Изменение условий освещения индуцирует у культуры переходное состояние, проявляющееся в преломлении кривой рОг в ускорении или замедлении падения pOi, колебаниях в показаниях рО? Такой переходный процесс длится 1-2,5 ч
При освещении биореактора видимым светом включение УФ-облучения втияэт положительно на дыхательную активность дрожжей а отключение УФ-облучения снижает дыхательную активность В темноном режиме УФ-обтучсние снижает дыхательную активность а его отключение либо не влияс1 на шмснение дыхания либо еще более замедляет падение р02 по мере роста дрожжей В системе, постоянно облучаемой ультрафиолетом, подача enera стимулирует дыхательную активность, в то время как отсутствие свега либо снижает, либо не влияет на нее При этом в отсутствие УФ-облучения дрожжи печувстиитсльны к воздействию видимо! о света
Отклик дрожжевой популяции на режимы УФ и светового облучения, определяемый по ишенсииям кривой роста, в целом, коррелировал с характером изменения величины рОг Полученные данчые позволяют заключи»., что совместное действие оптимальных доз УФ-излучения и ви тимото света стимулирует рост дрожжей С tropicalis Стимулирующим эффект был подтвержден в же периментах, когда дрожжи выращивали при постоянном действии ультрафиолета и света (на всем ншняжепш цикла развития) В утих условиях возрастала удельная мороегь роста а уровень накопления биомассы повышался на 15-20% по сравнению с тарпан-
том без облучения На величин} сгимучирующего эффекта влияли концентрации посевного материала и субсграта Разница по выходу биомассы между облучаемыми УФ на свету и в темноте вариантами была больше при концентрации инокулята менее 0,15 г/л (по асд) В темноте при возрастании внесенной концентрации засевных дрожжей выше 5-6 г/л исчезает отрицательное действие примененных доз УФ-облучения, в диапазоне концентрации дрожжей, чувствительном к воздействию ультрафиолета положительный эффект УФ-облучения сохраняется при повышении концентрации субсграта в среде, с увеличением интенсивности видимого cRcra положительный эффект существенно не меняется, более интенсивное воздействие УФ-излучеиия лампы ДРШ на суспензию дрожжей - порядка 5-10 Вт/л - вызывает репрессию роста дрожжей независимо от того, освещается ли содержимое биореактора видимым светом или нет, при этом репрессирующий эффект сохраняется даже при высоких стартовых концентрациях дрожжей
Из полученных данных следует важный вывод 1С1еро1рофные микроор! аннзмы, под-всршутые стрессовым воздействиям, приобретают чувствительность к видимому iBeiy низкой интенсивности При этом стрессовое состояние может быть вызвано различными ti рессорами ультрафиолетом, пероксидом водорода, механическим воздействием (замораживанием-оттаиванием) и другими
Чувствительность стрессированных клеток к видимому CBeiy может бить объяснена ин-дукциеи системы фоторепарации с фотолиазой в качестве ключевого фермента
Таким образом, обнаружен новый подход к улучшению показателей микробных фермсн-иций, включающий одновременное воздействие на выращиваемую культуру стрессорного фактора, например, оптимальных доз мягкого ультрафиолета или пероксида водорода, и ан rati рессового фактора - видимого света Такое сочетание стрессорного-антистрессового воздей-с1вня можно охарактеризовать как контролируемый окислительным стресс, и использовать для управляемою культивирования гетеротрофных микроорганизмов По-видимому, этот механизм имеет место в природе
Комбинированное воздействие видимого света и мягкого ультрафиолета в определенной степени имитирует природное солнечное излучение, имеющее не только видимую, но и УФА и УФЬ-сосгавляющую и воздействующее на микроорганизмы, обитающие на поверхности воды, почвы, растений
Исследование роста дрожжей С tropicalis при воздействии УФ-нзлучсния и лазерно! о излучения видимою диапазона спектра
Приведенные выше данные свидетельствуют, что в условиях окислительного стресса микроорганизмы приобретают чувствите щность к воздействиям, которые принято относить к низкоэнергегическим, в частости к видимому свету ни ¡кой ишснсивноыи (10 100 мВт/л) Первичным рецептором этого воздействия может быть фотолиаза, входящая в систему фоторепарации рцаглр/ющая ьа свет в диапазонах 370-390 им - для фотолиазы 1-го типа и 430-450 им -для фоточиазы 2-го типа [Eker et al 1994, Kim Sang-Tae et al, 1993]
Для подтверждения предположения о чувствительности стресс-индуциронанных дрожжей к низкоинтенсиному свету дрожжи облучали низкоинтенсивным светом лазеров (ПИЛИ) гелий-неонового (красный свет) и арюн-ионною (сине-зеленый lbci)
В контроле - без индукции стресса ультрафиолетом не было значимых различий между вариантами облучения лазерами в icmhotc или при видимом cbctí В опыте, - предварительно стресгированные ультрафиолетом дрожжи становились чувствительными к свегу лазера В вариашах обучения инокулята оптимальной дозой УФ последующее облучение He-Ne лазером с интенсивностью 3 мВт'л уьеличивало прирост биомассы на 10 -15%, при этом только при использовании в качестве инокулята клеток экспоненциальной фазы роста (но не стацио-
нарных) Аналогичные эффекты давало облучение сине-зеленым светом Ar-ионного лазера интенсивностью около 10 мВт/л
Для суспензии дрожжевых клеток в лаг-фазе ОП 0,5-1,0 оптимальная доза предоблучения ультрафиолетом составляла около 1000 Дж/л, а для суспензии с ОП 10-100 - около 10000 Дж/л
Для стимуляции роста дрожжей в ферментере можно рекомендовать режимы предоблу-чение ультрафиолетом с интенсивностью 10-100 мВт/л при последующем или одновременном немонохроматическом освещении видимым светом с интенсивностью 40 мВт/л, или 1-10 мВт/л - при освещении красным монохроматическим светом, или 5-50 мВт/л - сине-зеленым монохроматическим светом, при дозе засевного материала в периодической культуре 0,08-0,8 ед опт пл (0,06-0,6 г асд/л)
Позитивное воздействие окислительного стресса на рост дрожжей р Candida может отражать их приспособленность к экологическим условиям обитания на поверхности растений, в ситуациях избытка углеводного субстрата, кислорода и одновременно освещенности солнечным светом
2. Исследование процесса культивирования дрожжей-сахаромицетов в присутствии агентов окислительного стресса.
Природные условия обитания широко используемых в промышленности дрожжей-сахаромицетов и дрожжей р Candida схожи, однако в отличие от первых, представители р Candida, в частности С tropicalis не являются истинными бродилыциками Однако в наших экспериментах наблюдалось повышение их бродильной активности после воздействия оптимальных доз факторов окислительного стресса Поэтому было интересно исследовать воздействие окислитетьного стресса (пероксид водорода и мягкий ультрафиолет) на рост сахаромицетов
В задачи входито более детальное выяснение особенностей отклика дрожжей на окислительный стресс с учетом возможного вклада фотореактивации и скорости адаптации дрожжей к воздействию разных стрессоров в условиях контролируемого освещения культур, а также получение разных линии дрожжей при последовательных пассажах в асептических условиях Дрожжи выращивали при освещении и без освещения Варьировали аэробные, микроаэро-фильные, анаэробные условия роста при воздействии разных концентраций Н2О2 (дозы мягкого УФ), количество инокулята и субстрата (сахарозы) в ферментационной среде
В условиях освещения опыты выявили чувствительность сахаромицетов к сублегальным дозам агентов окислительного стресса, зависимость реакции клеток от фазы роста культуры и концентрации субстрата, адаптацию дрожжей к стрессу при последовательных пассажах в условиях воздействия сублетальных доз окислителей При культивировании с малой концентрацией субстрата - 5 г/л клетки менее устойчивы к воздействию Н2О2 и мягкого УФ, чем при его больших концентрациях - 30 г/л и 150 г/л, что проявляется в увеличении доли мертвых клеток По мере адаптации дрожжей к Н2О2 при последовательных пересевах доля мертвых клеток снижается Так, при выращивании штамма Meyen Т 985 при 30 г/л сахарозы и внесении Н2О2 в концентрациях 0,6 г/л и 0,3 г/л (культура конца экспоненциальной фазы, содержание биомассы 2,2-2,4 г/л) в первом случае доля мертвых клеток снижалась с 70% в первом пассаже до 25% в десятом, во втором - с 60% в первом пассаже до 35% в десятом, что говорит об адаптационных изменениях При содержании сахарозы 5 г/л количество мертвых клеток во всех пассажах остается практически неизменным
Адаптированные к Н2О2 линии дрожжей при последующем пересеве в свежую среду и культивировании без внесения псроксида имели более высокие показатели физиологической активности, что проявлялось в повышении уровня накоплении биомассы, скорости роста, устойчивости к низким pH Так, при концентрации субстрата 30 г/л, внесении
0,3 г/л Н2О2 и без подтитровки среды в первом пассаже к концу роста дрожжей рН достигал 2,35, в десятом - 2,12, при внесении 0,6 г/л Н2О2 в первом пассаже рН падал до 2,35, а в десятом - до 2,05 При этом уже в пятом пассаже во втором случае уровень биомассы составлял 2,7 г/л по сравнению с 2,2 г/л в первом пассаже Скорость роста к концу перепассирования увеличивалась на 15-20% Подобным же образом клетки дрожжей реагировали на облучение мягким УФ в пассажах
При адаптации к Н2О2 или к мягкому УФ решающее значение имел фактор освещения В условиях полной темноты клетки не адаптировались ни к мягкому УФ, ни к пероксиду и при пересевах погибали Однако достаточно было рассеянного дневного освещения (например, света с интенсивностью 40 мВт/л), чтобы кардинально изменилась выживаемость культуры Таким образом, свет в данпом случае выступает как антпстрессор, вероятно, через механизм фоторепарации [Jagger et al, 1970, Eker, 1986] Аналогичные вышеописанным эффекты адаптации к воздействию пероксида водорода наблюдали у штамма SL-100 при концентрации сахарозы 150 г/л при росте дрожжей в аэробных условиях и в микроаэрофильном режиме В анаэробных условиях дрожжевые клетки не адаптировались к внесению пероксида доля жизнеспособных клеток не возрастала
Таким образом, выявлена корреляция между возрастанием числа жизнеспособных клеток, уровнем накопления биомассы, удельной скоростью роста и устойчивостью к неоптимальным рН в пересевах линий дрожжей, выросших при оптимальных условиях внесения Н2О2 (или воздействия мягкого УФ) Адаптация выражалась также в повышении устойчивости клеток к внесению повышенных доз Н202 - 1,8-2,4 г/л, тогда как в контрольных вариантах клетки погибали при дозе 1,2 г/л пероксида Такая перекрестная адаптация дрожжей к Н2О2, УФ и рН подтверждает ранее полученные данные о позитивном эффекте предадаптации дрожжей к рН и пероксиду для повышения их устойчивости к УФ- или гамма облучению [Singh et al, 1999]
При пересевах дрожжей, адаптированных к Н2О2, на среду без пероксида водорода, устойчивость клеток к стрессорным воздействиям сохраняется лишь в первом пассаже При 2-ом пересеве положительные эффекты (устойчивость к внесению Н2О1) нивелируются и к 3-му - показатели роста и активности культуры возвращаются к уровню контроля, то есть наблюдается быстрая деадаптация дрожжей Возможно процессы адаптации обусловлены индукцией систем репарации, помогающих клеткам преодолевать неблагоприятные воздействия, при этом, скорее всего, не происходит отбора относительно устойчивых субклонов на генетическом уровне, что согласуется с литературными данными [Davies et al, 1995]
Следующий этап исследований включал культивирование дрожжей в лабораторном биореакторе с поддержанием рН (4-4,5), при достатке кислорода в среде, или в анаэробном режиме, при уровне освещенности не менее 40 мВт/л или в темноте, при использовании в качестве инокулята неадаптированных (рис 2А) или адаптированных к пероксиду (5-й и 10-й пассажи) дрожжей (рис 2В, 2С) Основная задача - выяснение влияния предадаптации инокулята к стрессу на показатели роста и брожения основной культуры В результате этой серии экспериментов выявлено следующее
1 ) На свету по сравнению с контролем (рис 2А) продолжительность лаг-фазы в культуре дрожжей с инокулятом 10-го пассажа (рис 2С) снижается более чем в 2 раза
2) При освещении в культуре с предадаптированным к Н2О2 инокулятом количество накопленной биомассы увеличивается по сравнению с контролем, а именно при использовании адаптированных дрожжей 5-го пассажа - на 11%, а 10-го пассажа - на 19%
3 ) Добавление пероксида в предстационарную фазу роста (на 17-22 ч культивирования) индуцировало автолиз клеток как в адаптированной затемненной (5 пассаж), так и неадаптированной культурах (рис 2А, 2В) Однако внесение Н202 при освещении не индуцировало гибель
Биомасса на свету (40 мВт/л) Биомасса после пероксида на свету (40 мВт/л)
12 14 16 18 20 22 24 25 28 Время, ч
Биомасса на свету (40 мВт/л) Биомасса после пероксида на свету (40 мВт/л) Биомасса после пероксида в темноте г зд
-•-Сахароза ,
клеток у адаптированной линии (рис 2В, 2С), то есть свет протестировал клетки при окислительном стрессе
При добавлении Н202 во всех вариантах опыта наблюдали резкое усиление дыхательной активности (рис 3), свидетельствующее о существенном изменении окислительно-восстановительного баланса клетки Это могло приводить к изменению соотношения НАД+/НАДН по мере адаптации к Н202 в дрожжевых клетках, что косвенно было выявлено по увеличению содержания в них НАД+ (рис 4)
Анализ количества ПАД+ в клетках адаптированных линий дрожжей (инокулят 5-го и 10-го пассажей) через 3 ч после внесения Н2О2 показал, что в адаптированных линиях его было существенно бопыие чем в клетках неадаптированной линии Активация НАДН-зависимых систем в адаптированных линиях после внесения Н2О2, может приводить к переводу большей части НАДН в окисленную форму, чему дополнительно способствует ингибирование при воздействии пероксида основных поставщиков НАДН ЦТК и гликолиза Соответственно, наблюдаемое усиление дыхательной активности повышает баланс НАД/НАДН [Оос1оп, 1998]
В анаэробной культуре (рис 5А), развивающейся в темноте, засеянной клетками адаптированной к Н2О2 линии дрожжей, выращенных в аэробных условиях (инокулят линии 5-го пассажа, рис 2В), клегки в лаг-фазе продолжали отмирать, лаг-фаза составляла 47 ч, удельная скорость роста в экспоненциальной фазе 0,044 ч~', конечный выход биомассы был низким (2,2 г/л), в середине экспоненциальной фазы доля мертвых клеток достигла 42%, а к концу культивирования 92% (рис 5А), при этом
-•-Биомасса на свету (40 мВт/л)
Биомасса после пероксида на свету (40 мВт/л)
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Время, ч
Рис 2 Накопление биомассы и потребление субстрата штаммом сахаромицетов Меуеп Т 985 при росте в аэробных условиях в биореакторе (сахароза 30 г/л)
А - неадаптированная к Н202 культура (контроль), В - адаптированная к Н2О2 линия 5-го пассажа, С -адаптированная к Н2О2 линия 10-го пассажа
Цифрами у стрелок указана доля мертвых клеток
62000 72000
32000 В2СС0 102000 Время, с
112003 122000
Рис. 3. Усиление потребления кислорода после внесения НтСь в культуру с адаптированным инокуля-том 10-го пассажа (см. рис. 2С).
1 - содержание кислорода, %; 2 ■ рН.
4 -3,5
3 -2.5 2 1,5 1
0,5 0
3 58
3.71
бродильная активность была невелика (рис. 6А), продолжительность брожения составила около 93 ч, а содержание этанола 4,)%.
В культурах, растущих при осветлении (рис. 5С, П), засеянных клетками линий, адаптированных к Н3О3. рост и брожение были существенно интенсивнее (рис. 5С, П; 6С, П) по сравнению как с предыдущим опытом, так и с контрольной культурой, засеянной клетками, не подвергавшимися воздействию пероксида водорода (рис. 58, 6В).
Наибольшую удельную скорость роста (0,067 ч } в экспоненциалы той фазе и бродильную активность имела культура с иноку-лятом 10-1 о предадаптир-ованногё пассажа, далее (по убыванию) — вариант 5-го предадаптированного пассажа (^=0,059 ч ') й контроль (цЧ),046 ч"1) Содержание спирта по окончании брожения во всех вариантах существенно не отличалось и составило 6,2-6,4% масс. Все выявленные закономерности наблюдались и для штамма 81*-100,
Таким образом, показана иоз-можность существенного улучшении показателей роста дрожжевых культур и процесса спиртового брожения при Сочетанием воздействии на дрожжи оптимальными дозами стрессорвых факторов (пероксида водорода или мягкого ультрафиолета) и антистресс-фактором, в частности, видимым светом, что позволяет предложить новый способ ведения процесса спиртового брожения. По предлагаемому способу для поддержания высокой физиологической активности дрожжей-сахаромицетов посевной материал получают при росте дрожжей в аэробных или микроаэро-фильных условиях и совместном воздействии видимого света и Н3О2 или мягкого ультрафиолета диапазона УФА,'УФК.
Линию стресс-индуцированных дрожжей поддерживают путем пересевов на среду с содержанием сбраживаемых углеводов 30 г/л и более, при периодическом внесении ТЬСь в дозах 0,3-0,6 г/я, содержании дрожжевых клеток не менее 1-2 г/я, при освещении культуры видимым спетом с интенсивностью около 40 мВт/л. Основной ферментационный процесс также необходимо веста в условиях освещения видимым светом той же интенсивности, но без внесения пероксида водорода.
Контроль
5-ый пассаж
10-ый пассаж
Рве. 4, Изменение содержания НАД+ в линиях дрожжей по мерс адаптации к пероксиду водорода, через 3 ч после внесения пероксида и культуру предстацнон арной фазы.
Предложенный способ позволяет поддерживать высокую физиологическую активность клеток дрожжей и способствует повышению производительности процесса - сокращению времени брожения на 30%
Биомасса на свету (40 мВт/л)4
20 40
Время, ч
Рис 5 Динамика накопления биомассы и потребления субстрата клетками штамма Меуеп Т 985 при анаэробном культивировании в биореакторе А - адаптированная культура (инокулят - линия 5-го пассажа), рост в темноте, В - неадаптированная культура (контроль), рост на свету, С - адаптированная культура (инокулят - линия 5-го пассажа), рост на свету, В - адаптированная культура (инокулят - линия 10-го пассажа), рост на свету
1000 -.
800
О
о ц
г
600
400
200 -
40 60 Время, ч
100
Рис 6 Бродильная активность при анаэробном культивировании штамма сахаромицетов Меуеп Т 985 в биореакторе А -адаптированная культура (инокулят - линия 5-го пассажа), рост в темноте, В - неадаптированная культура (контроль), рост на свету, С - адаптированная культура (инокулят - линия 5-го пассажа), рост на свету, О - адаптированная культура (инокулят - линия 10-го пассажа), рост на свету
3 Модификация культивирования галобактерий для получения бактериородопсина
Фототрофные галофилыше бактерии р Halobactermm являются практически важными продуцентами бактериородопсина (БР) [Oesterhelt, 1971], находящего в настоящее время все более широкое применение в биомолекулярных устройствах [Birge, 1990, Wu et al, 2002, Seitz et al, 2000] Среда обитания галобактерий - сильно минерализованные озера и лиманы, зачастую недостаток кислорода, интенсивное освещение, солнечная иррадиация способствовала выработке ими адаптивных механизмов экстремофилии Исследования галобактерий могут служить основой для разработки более совершенных по сравнешпо с существующими способов культивирования
Наблюдаемые при стандартном культивировании [Mukohata et al, 1982] неудовлетворительные воспроизводимость и нестабильность результатов, зачастую плохой рост галобактерий, вариа-билыюсть в морфологии и цвете коло1шй и клеток могут быть обусловлены как свойствами штаммов, так и большой зависимостью от состава органических компонентов питательных сред и наличия в них примесей В нашей работе с использованием процедуры облучения ультрафиолетом была получена серия мутантов, рост которых и способность к синтезу БР были исследованы на среде
с триптоном (Serva) - 5 г/л, дрожжевым экстрактом (Organotechnie) -2 г/л и глицерином - 4 мл/л (рост в колбах) Был отобран наиболее перспективный штамм UM-17, показавший наибольшую способность к синтезу БР при приемлемых ростовых характеристиках
Характеристики роста
штамма UM-17 и накопление им БР были проверены при использовании с триптоном, пептоном, дрожжевым экстрактом различных марок и варьировании их концентрации, а также варьировании количества посевного материала На рис 7 представлена динамика накопления биомассы и синтеза БР штаммом UM-17 на некоторых из сред Среды, содержащие 5 г/л триптона или пептона, 2 г/л дрожжевого экстракта и 4 мл/л глицерина, оказались наиболее предпочтительны Однако рост бактерий и синтез БР на них сильно зависели от марки используемых триптона или пептона Наилучшим оказался триптон фирмы Serva (рис 7, вариант С), на среде с которым конечный уровень биомассы составил 3 г/л, удельная скорость роста в экспоненциальной фазе - 0,054 ч-1, максимальное накопление БР - 75 мг/л На среде с триптоном Hispanlab выход биомассы был выше - 3,7 г/л, удельная скорость роста - 0,1 ч-1, но накопление БР меньше -43-44 mi/л Марка дрожжевого экстракта (Hispanlab, Organotechnie, Difco) на рост галобактерий существенно не влияла Рост штамма ST-033 на тех же питательных средах был аналогичен, однако накопление им бактериородопсина составило лишь 55-60% от уровня штамма UM-17
4 .....
36 - 0,07
32 ■ 0 06-е
28 - ------^ 1С о."
24 - 2В ■ 0 05 ш О)
2 - -Э * - -О - . __ ■ 0 04 |
1 6 ■ Г /я' -^ÍA г 0 03 а.
1 2 - J J • jfS ш ■ 0 02 о
08 - 2А О
04 J jr м у/ ■ ■ - * -0 01
0 -1---------1— - 0
0 40 80 120 160
Время, ч
Рис 7 Сравнительная характеристика роста биомассы и накопления БР штаммом UM-17 на средах с различным составом органических компонентов
А - 5,5 г/л дрожжевого экстракта (Organotechnie), 4 мл/л глицерина, В - 5 г/л триптона (Hisparúab), 2 г/л дрожжевого экстракта (Organotechnie), 4 мл/л глицерина, С - 5 г/л триптона (Serva), 2 г/л дрожжевого экстракта (Organotechnie), 4 мл/л глицерина 1 - накопление биомассы, 2 - накопление бактериородопсина
Как видно из динамики роста бактерий (рис 7), в фазе линейного роста, обусловленной в том числе дефицитом кислорода, синтез БР продолжается, но до определенного момента, после которого на некоторых средах происходит падение содержания БР
Качественные изменения в состоянии культуры хорошо прослеживаются по спектрам лиза-тов галобактерий, выращенных на средах с триптоном разных марок (рис 8) При использовании триптона Hispanlab ярко выраженные пики каротиноидов проявляются уже на 158 ч культивирования Содержание БР к этому времени составляет 44 мг/л, а на 210 ч падает до 38 мг/л При использовании среды с дрожжевым экстрактом, но без триптона или пептона, пики каротиноидов проявляются еще раньше Последующие опыты проводили со штаммом UM-17, растущим на среде,
обеспечившей максимальный синтез бактериородопсина (триптон Serva с дрожжевым экстрактом Ог-ganotechme и глицерином)
Выбор направления дальнейших исследований был основан на наблюдениях, предполагавших наличие эффекта старения среды при ее храпении Предположительно старение могло быть связано с образованием продуктов химического и/или фотохимического окисления органических компонентов, способных ингиби-ровать рост бактерий и биосинтез БР При культивировании на среде, хранящейся при комнатной температуре и дневном освещении в течение 2-х суток, наблюдались ухудшение роста галобактерий и накопления БР Аналогичные, но более интенсивные процессы старения среды могут протекать, очевидно, и в ходе культивирования галобактерий (5-7 суток роста при температуре 37-38 °С и аэрации) Известно, что такие соединения как липиды, которые могут входить в состав примесей используемых органических субстратов или экскретироваться, могут подвергаться перекисному окислению [Кудряшов, 2004] равно как и другие соединения Образовавшиеся продукты окисления могут оказывать токсическое действие на клетки, вызывать в них состояние окислительного стресса и индуцировать
400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 Длина волны,нм
Рис 8 Изменения в спектрах лизатов клеток культур штамма UM-17 разного возраста, выращенных на
1-4 - среде с триптоном Serva, 5 Hispanlab Время культивирования 162 ч,4-210 ч,5- 158 ч
- среде с триптоном 1 - 45 ч, 2 - 93 ч, 3 -
180
Рис 9 Влияние «возраста» питательной среды на накопление биомассы штаммом ЦМ-17, инокулят вносили в 1 - свежеприготовленную среду, 2-2 сут аэрации и освещения среды до засева, 3-4 сут аэрации и освещения среды до засева, 4-6 сут аэрации и освещения среды до засева
синтез веществ-антиоксидантов, участвующих в ответе бактерий на стресс-факторы В частности, у галобактерий такими антиоксидантами являются каротиноиды [Карнаухов, 1988, Síes et al, 1992, Krmsky, 1998]
С целью выяснения роли «старения» среды в опытах стерильную среду выдерясивали в колбах на качалке без засева 2, 4, 6 суток при аэрации и освещении, после чего вносили инокулят (рис 9)
Как видно из представленных данных, уровень накопления биомассы закономерно снижался по мере «старения» среды перед засевом К концу культивирования па среде 6 суточного возраста накопление биомассы составило лишь около 50% по сравнению с использованием свежеприготовленной среды Содержание БР после 160 ч культивирования галобактерий составило для свежеприготовленной среды - 72 мг/л, при использовании 2-суточной питательной среды - 37 мг/л, 4-суточной - 22 мг/л, 6-суточной - 14 мг/л
Таким образом, вероятно, в питательной среде протекают процессы химического или фотохимического окисления ее компонентов, приводящие к ингибированию роста галобактерий, синтеза ими БР и индукции синтеза каротиноидов, что определяется по более раннему проявлению пиков каротиноидов в спектрах лизатов Можно предположить, что продукты окисления участвуют в регуляции синтеза каротиноидов и БР на клеточном уровне
Накопление окисленных продуктов - ингибиторов роста и биосинтеза БР, при выращивании бактерий на свежеприготовленной питательной среде происходит по ходу культивирования в результате упомянутых процессов, а также окисления образующихся при росте галобактерий метаболитов Их совместное действие приводит к замедлению и торможению роста галобактерий и накопления ими бактериородопсина На рис 10-12 представлены результаты опытов с внесением отработанной культуральной жидкости (ОКЖ) в питательную среду Существенное замедление роста наблюдается, когда содержание ОКЖ в исходной питательной среде составляет около половины общего объема среды (рис 10)
Снижение в уровне накопления БР начинается уже при внесении ОКЖ в объеме 1/5 от общего объема питательной среды, а спектры лизатов клеток в этих вариантах демонстрируют, что с увеличением доли внесенной ОКЖ увеличивается содержание каротиноидов по отношению к содержанию БР (рис 11,12)
Основываясь на полученных данных были предложены приемы культивирования, нивелирующие отрицательные воздействия продуктов окисления Апробированы следующие подходы 1 - культивирование при дефиците кислорода (для уменьшения количества окисленных продуктов - ингибиторов), 2 - культивирование с доливом свежеприготовленной среды (за счет разбавления снижается содержание токсичных окисленных продуктов), 3 - внесение антиоксн-
Время, ч
Рис 10 Динамика накопления биомассы штамма иМ-17 при внесении отработанной культуральной жидкости в питательную среду 1 - контроль, без внесения ОКЖ, 2-е внесением 1/5 части ОКЖ от общего объема, 3 - 2/5 объема, 4 - 3/5 объема, 5 - 4/5 объема Во всех вариантах среды содержали одно и то же количество органического субстрата
480 600 520 540 Длина полны, нм
600 620
Рис. 11. Спектры лизатов биомассы штамма иМ-17 при культивировалии с внесением отработанной культуральиой жидкости в питательную среду: 1 -контроль, без внесения ОКЖ, 2-е внесением 1/5 части ОКЖ от общего объема, 3 - 2/5 объема, 4 - 3/5 объема, 5 4/5 объема. Во веек вариантах среды содержали одно и то же количество органического субстрата.
мнтов, 4 - подбор условий освещения (стимулирование синтеза БР при о г. > .ченьшении фотохимического воздействия на среду); 5 - селективное извлечен не « и: п > н
сорбентам в npOüí 61 tí культур ы.
Эксперименты nptnií> i.n ■ cj штаммом U М ■ 17 i' i- i
биореакторе
Опыты в колбас ока i;: ¡ ■.(■> первые четыре пвдид г;- :r,u лишь незначительно п вмент-ч н вень накопления био>;::;.чи н (зякт-.: риородопсина óeí . ■ v i уменьшения содержа и и: ¡:ilfi,' ' нощдов в клетках гало ив -quid а к. внесение аитиоксид; : . = - ■ ¡. - ■ . токоферола, сульф: . и)
увеличивает выход бг. lu'Ot. ; > : на 10-15%. Изменен i ■ ■ ■.. ■■ \ к.-щения (интенсивноеiu ,!.ihm;;) ■ l ны) повысили выход f¡ ly.accti иг более, чем на 10%, а. БГ t> .i.'
Самым деисти-,;!М;..1'| .<■.:■; вариант с удаление* mi i í ijb роста гадобакгернй co[i ■ шм» средслвенпо i) ходе фермента]
Применение сорбен но-..... tí
(рост в колбах) поим т i, ш •• ¡\ биомассы на 45-50% и :■ :;-
75% по сравнению) к г 'г i: . 'i:¡ рис. 13 приведены ргг -',r;m,i ч м IÓ из экспериментов при г i.r-.ки : нии штамма UM-1" и "i - t - i- 1 ■ прокачкой фертев1ир> i--so; i к. . i ■ ры чере) выиосиой кшплр . и егью. содержащей г:- г-'
извлечения ингибитор i i sa и долнвом CBC/Kíiif:i ■ ■■. t^ .i л i концентрированной i ir.nv п ■.>i Среды. Через 8 сут ну .¡ ¡iu-i|-, n;i ння талобактерий l . ■ ■ > ■ -¡ >16 удалюсь лостичь к':-! «m н
накопления биомассы 4: n хомувеществу) при cv ■ ipiü'r o~> держании бактериоз ■ 1 i 1750 мт/л.
Крайне важно, что в этом варианте культивирования в спеюре лизагга клето ■ in н практически полностью отсутствуют пики каротиноидов и проявляется только ip ■ п ¡
Рис. 12. Цвет суспензии и уровень накопления БР штаммом иМ-17 при культивировании с внесением отра ботанной культуральной жидкости в питательную среду: I -контроль, без внесения ОКЖ, 2— с внесением 1/5 час си ОКЖ от общего объема, 3 - 2/5 объема, 4-3/5 объема, 5 - 4/5 объема. Во всех вариантах среды содержали одно и то же количество органического субстрата
- Биомасса ГБ - БР
40 i 35 ¡ 30 -25 20 ' 15 J 10 5
I
■r^rl.
о ^
О 20 40 60 80 100 120 Время, ч
Рис 13 Накопление биомассы при выращивании нпамма иМ-17 в биорсакторе, пред)сматривающем извлечение ингибиторов биосинтеза сорбенюм (ЗА замена адсорбента) долив среды в бнореактор (Д) и внесение подпиток (ВГ1)
Пик БР
400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 Длина волны, нм
Рис 14 Спектр лизата биомассы штамма иМ-17 при культивировании с извлечением ингибиторов биосинтеза
пик БР (рис 14) Зго в дальнейшем позволяет существенно обтегчить выделение БР из биомассы очистку его ог каротиноидов и обеспечит получение относительно дешевых препаратов БР
Для реализации такого спо соба кулынвнровапия (с доливом среды и прокачкой через сорбент) в автомагическом режиме нами разработан метод экспресс анализа содержания БР позволяющий сравнивать пока ¡ai ели текущего процесса культивирования с эталонным вариантом и своевременно заменять отработанный адсорбент Метод основан на анализе цвета среды культивирования с клетками галобактерий с помощью CCD матрицы сканера Fpson Perfection 1270 и вкшочае) соо1ветсг-вующее разработанное программное обеспечение
Предварительная технико-экономическая оценка показала, что получение БР (в составе пурпурных мембран) по разработанной технологии позволит снизить стоимость его с 500-5000 руб за 1 mi (в зависимости от чистоты продукта) до 20-100 руб за 1 mi-
Выводы
1 Разработано аппаратурное оформление и программное обеспечение «BioDromc 1 0>> для управляемого культивиров-нтия микроор! аннзмов в биореакторах Система внедрена в РХГУ им ДИ Менделеева дм проведения научных исследований и учебною процесса, а также в Г УГ1 НПО «Астрофизика», В11ИИ Молочной промышленности (i Москва)
2 Разработана концепция ('солнечного биореактора«, в котором культивирование микро-орынизмов осущес!вляе1ся при одновременном освешенш. раоочей юны светом видимою и ультрафиолетового диапазона На примере культивирования дрожжей С tropicalis и S сеге-vtsiae показано, чго такой прием позволяет повысить выход биомассы с единицы губстрага на 10-20% без ухудшения производительной и биореактора
3 Предложено использование пероксида водорода или УФ-облучения для подготовки предадаптированного посевного материала S cerevisiae с целью улучшения физиологических характеристик культуры При выращивании посевного материала в аэробном или микроаэро-фильном режимах пероксид водорода в пассажах лучше всего вносить в предстационарной фазе роста в дозе 0,3-0,6 г/л при концентрации биомассы дрожжей 2,2-2,4 г/л в условиях освещения суспензии фоновым видимым светом
4 Показаны адаптационные изменения культуры S cerevisiae в пассажах при внесении пероксида водорода или воздействии УФ, которые нивелируются через определенное время после прекращения адаптационной обработки
5 Отработаны варианты анаэробной ферментации дрожжей S cerevisiae с использованием предадаптированного к пероксиду посевного материала, приводящие к интенсификации спиртового брожения и сокращению времени сбраживания субстрата на 30%
6 Подобрана питательная среда, режимы аэрации и освещения для культивирования га-лобактерий с целью получения бактериородопсина Показана необходимость учета фактора «старения» питательной среды для обеспечения стабильности роста галобактерий и синтеза бактериородопсина
7 Предложен режим культивирования галобактерий с доливом питательной среды и использованием инкапсулированного адсорбента для уменьшения концентрации накапливающихся в среде ингибиторов роста, в том числе, продуктов абиотического окисления Режим позволяет получать до 1700-1750 мг/л бактериородопсина за 8 сут культивирования при одновременном повышении стабильности процесса и минимизации содержания каротиноидов
8 Предложен метод оценки результативности культивирования галобактерий в отношении накопления бактериородопсина Метод основан на количественной оценке цветовой гаммы бактериальной суспензии с использованием фотосканера, включает обработку результатов и регулирование на их основе течения процесса, для чего создано программное обеспечение, интегрированное в общий пакет BioDrome 1 0
Основные результаты диссертации изложены в следующих работах-
1 Кузнецов А Е , Неручев Ф А , Карпов А В, Каленов С В , Сафронов В В , Серегин А М Исследование совмещенных гибридных процессов биодеструкции и биосинтеза на примере модельной системы роста дрожжей Candida tropicalis - В сб Биотехнология состояние и перспективы развития Материалы 1-го Международного конгресса (Москва, 14-18 октября 2002г) - М ЗАО "ПИК "Максима", РХТУ им Д И Менделеева, 2002, с 207,208
2 Каленов С В , Кузнецов А Е , Косивцов Ю Ю Лабораторный биореактор с системой удаленного доступа для сбора данных и контроля ферментационного процесса - В сб Биотехнология состояние и перспективы развития Материалы 1-го Международного конгресса (Москва, 14-18 октября 2002г) -М ЗАО "ПИК "Максима", РХТУ им ДИ Менделеева, 2002, с 208,209
3 Каленов С В , Серегин А М , Кузнецов А Е , Солдатов В И , Лалов В В , Складнев Д А , Страховская М Г Биотехнологический комплекс для исследования светочувствительных процессов культивирования - В сб Биотехнология состояние и перспективы развития Материалы 2-го Международного конгресса (Москва, 10-14 ноября 2003г ) - М ЗАО "ПИК "Максима", 2003, т 1, с 308-310
4 Каленов С В Кузнецов А Е Лабораторный биореактор с системой удаленного доступа для сбора данных и контроля ферментационных процессов на базе LabView фирмы "National Instruments" - В сб трудов конф Образовательные, научные и инженерные приложения в среде LabVIEW и технологии National Instruments (Москва, 14-15 ноября 2003 г) - М Изд-во РУДН, 2003, с 138-141
5 Серегин А М , Солдатов В И , Складнев Д А , Кузнецов А Е , Каленов С В Использование лазерного излучения при культивировании галобактерий - В сб Высокие технологии XXI века Материалы конференции V Международного Форума (Москва, 19-23 апреля 2004 г) — М Российский Фонд развития высоких технологий (РФРВТ), 2004, с 335-338
6 Kouznetsov A Y , Kalyonov S V , Soldatov V I, Seregin A M , Strakhovskaya M G , Sklad-nev D A Light as an ambient control factor in the systems of microbiological cultivation and biodestruction - European Symposium on Environmental Biotechnology (ESEB 2004), Oostende (Belgium), April 25-28, 2004,4pp
7 Kouznetsov A Ye , Ka'yonov S V Simultaneous hybrid processes as a way to improve char-actenstics of cultivation of micro-organisms and biodestruction of pollutants - European Symposium on Envnonmental Biotechnology (ESEB 2004), Oostende (Belgium), April 25-28, 2004, 4 pp
8 Каленов С В , Неручев Ф А , Карпов А В , Кузнецов А Е Проведение совмещенных ферментационных и фотохимических процессов в гибридном лабораторном биореакторе - В сб Успехи в химии и химической технологии Том XVI N5 /РХТУ им Д И Менделеева М , 2002, с 84-86
9 Патент РФ № 2268924 с приоритетом от 23 11 2004 Способ получешы биомассы дрожжей // Кузнецов А Е, Сорокодумов С Н, Винаров А Ю , Кухаренко А А, Каленов С В , Крылов И А
10 Кузнецов А Е , Сорокодумов С Н , Каленов С В , Винаров А Ю Использование перекиси водорода для совершенствования процессов культивирования микроорганизмов - В сб Биотехнология состояние и перспективы развития Материалы 3-го Международного конгресса (Москва, 14-18 марта 2005г) - М ЗАО "Экспо-биохим-технологии", 2005, т 1, с 335,336
11 Каленов С В , Кузнецов А Е , Складнев Д А , Синайский В В Оптимизация процесса культивирования галобактерий с целью получения бахтериородопсина - В сб Высокие технологии XXI века Материалы конференции VI Международного Форума (Москва, 24-28 апреля 2006 г) - М Российский Фонд развития высоких технологий (РФРВТ), 2006
12 Kouznetsov A Ye , Kalyonov S V Simultaneous hybrid processes as a way to improve characteristics of cultivation of micro-organisms and biodestruction of pollutants // In New Research on the Environment and Biotechnology, Nova Science Publishers Inc, New York, 2006, pp 99-104
13 SuyasovNA Karetkm В A , Kalyonov S V , Shakir IV and Panphilov VI Increasing efficiency of biodegradation of fat-containmg wastes of meat-processing industry // In Industrial Application of Biotechnology, Nova Science Publishers Inc, New York, 2006, pp 105-113
14 Каленов С В , Кузнецов А Е , Складнев Д А Аспекты культивирования галобактерии, связанные с увеличением выхода бактериородопсина - В сб трудов Международной школы-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология" посвященной 100-летию со дня рождения С И Алиханяна - Москва-Пущино, 2006, с 122-123
15 Заявка на патентование № 20006118728 от 30 05 2006 Способ получения биомассы галобактерий // Каленов С В , Кузнецов А Е
16 Заявка на патентование № 20006118729 от 30 05 2006 Способ получения бактериородопсина // Кузнецов А Е , Каленов С В
17 Каленов С В , Кузнецов А Е Ресурсосберегающая технология получения бактериородопсина на основе галобактерий / Химическая промышленность сегодня, 2007, №3, с 23-32
18 Лосева С А , Кузнецов А Е , Каленов С В Культивирование дрожжей Saccharomyces cerevmae в условиях окислительного стресса - В сб Биотехнология состояние и перспективы развития Материалы 4-го Международного конгресса (Москва, 12-16 марта 2007г) - М ЗАО "Экспо-биохим-технологии", 2007, т 2, с 76,77
Подписано в печать 16 04 07 Формат 60x90 1/16 Гарнитура Тайме Печать офсетная Бумага тип Уел печ л 1,5 Тираж 100 экз Заказ № 4137
Отпечатано в типографии ООО «Мультипринт» 121360г Москва, ул Верейская,д 29 Тел 978-85-03,518-76-24,
Содержание диссертации, кандидата технических наук, Калёнов, Сергей Владимирович
ВВЕДЕНИЕ
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1 Стресс у микроорганизмов и стресс-факторы
1.2. Окислительный стресс и АФК
1.3. Механизмы защиты микроорганизмов и их адаптация к действию стрессоров
1.4. Перекрестная адаптация к действию разных видов стрессового воздействия
1.5. Изменение характеристик процессов биосинтеза при действии стресс-факторов
1.6. Совместное действие стресс и антистресс-факторов. Использование света низкой интенсивности для стимулирования биологической активности
1.7. Галобактерии как перспективный объект исследований
1.7.1. Среда обитания, таксономическая и биохимическая характеристика галобактерий
1.7.2. Бактериородопсин и его функции
1.7.3. Особенности культивирования галобактерий и синтеза бактериородопсина
1.7.4. Практическая значимость галобактерий и бактериородопсина
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ
3.1. Культивирование дрожжей Candida tropicalis
3.1.1. Культивирование дрожжей С. tropicalis при одновременном воздействии света видимого и УФ диапазонов спектра
3.1.2. Исследование роста дрожжей С. tropicalis при воздействии УФ-излучения и лазерного излучения видимого диапазона спектра
3.2. Культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae
3.2.1. Исследование эффекта адаптации к пероксиду водорода и ультрафиолету
3.2.2. Динамика роста и потребления субстрата при внесении Н2О2 110 3.2.3. Разработка рекомендаций по использованию процесса культивирования с внесением пероксида водорода в промышленных условиях 125 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
ГАЛОБАКТЕРИЙ
4.1. Выбор исходных и получение мутантных штаммов
4.2. Выявление основных факторов, определяющих активность культуры галобактерий в отношении синтеза бактериородопсина
4.2.1. Подбор питательной среды
4.2.2. Рост и накопление БР в условиях культивирования с подпиткой
4.2.3. Влияние интенсивности аэрации и уровня освещения
4.2.4. Состояние и доза посевного материала
4.2.5. Культивирование с добавлением отработанной культуральной жидкости
4.2.6. Исследование эффекта старения среды
4.2.7. Влияние пероксида водорода и мягкого УФ-излучения
4.3. Разработка способов культивирования в условиях контролируемого окислительного стресса
4.3.1. Подготовка посевного материала
4.3.2. Культивирование при дефиците кислорода
4.3.3. Культивирование в доливном режиме
4.3.4. Культивирование с внесением антиоксидантов
4.3.5. Подбор условий освещения
4.3.6. Культивирование с селективным извлечением ингибиторов сорбентом в процессе роста
4.4. Совершенствование автоматизированного комплекса для культивирования галобактерий и получения бактериородопсина
4.5. Оценка технико-экономических показателей получения бактериородопсина по разработанному способу в сравнении с другими вариантами
ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Культивирование дрожжей и галобактерий в условиях контролируемого окислительного стресса"
Совершенствование традиционных и разработка новых способов культивирования микроорганизмов является основой для получения продуктов биосинтеза и использования специфических микробных процессов в отдельных областях биотехнологии. Постоянное внимание уделяется поиску средств, позволяющих поддерживать необходимые ростовые и биосинтетические характеристики микробных продуцентов на протяжении определенной ферментационной стадии или всего жизненного цикла. Широко применяются такие методы как иммобилизация клеток, управляемое культивирование с использованием современных оперативных средств и математических моделей, направленное вмешательство в метаболические процессы и др. Отклонение сбалансированного процесса микробного синтеза от заданных оптимальных параметров ведет к ухудшению показателей биосинтеза, а нарушение этих параметров индуцирует развитие в клетках микроорганизмов состояние стресса. Состояние стресса понимается как совокупность ответных реакций, направленных на преодоление неблагоприятных изменений окружения, вызванных стрессорным воздействием.
Длительное время считали, что стресс неблагоприятно воздействует на микроорганизмы, что выражается в подавлении их физиологической активности, снижении эффективности биосинтеза. Поэтому в многочисленных исследованиях в первую очередь обращается внимание на изучение различных изменений в живых клетках в стрессовых условиях и механизмов повышения устойчивости микроорганизмов к стрессовым воздействиям.
Однако в последнее время появляется все больше данных, указывающих на ограниченность мнения о сугубо отрицательном воздействии стресс-факторов (стрессоров) на микроорганизмы [1, 2]. В определенных условиях воздействие оптимальных доз стресс-факторов может привести к улучшению ростовых характеристик [3], других показателей биосинтеза [4, 5], повышению скорости биотрансформации и разложения загрязнений [1, 6-9] и может использоваться при получении некоторых продуктов биосинтеза, например, эрго-стерина из клеток дрожжей при обработке ультрафиолетом [10]. Показано, что микробные клетки и популяции, предадаптированные к воздействию стрессоров, зачастую обладают лучшими ростовыми характеристиками, эффективнее потребляют субстрат и образуют меньше побочных внеклеточных продуктов жизнедеятельности [2, 3, 11, 12].
Таким образом, учитывая все возрастающее число публикаций и фактов, свидетельствующих о положительном воздействии оптимальных доз стрессоров на различные процессы роста, биосинтеза и биотрансформации, целесообразнее использовать понятие оптимального или контролируемого стресса как одного из путей совершенствования процессов управляемого культивирования микроорганизмов.
Контроль стресса и стресс-факторов, избирательное усиление или подавление действия их на клетки микроорганизмов может послужить дополнительным средством для совершенствования процессов управляемого культивирования микроорганизмов в лабораторных и промышленных биореакторах.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было выяснить закономерности изменения биосинтетических и ростовых характеристик модельных микроорганизмов в условиях контролируемого окислительного стресса для совершенствования ферментационных процессов и разработки новых подходов управляемого культивирования промышленно важных микробных продуцентов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1 - разработать стендовую установку и программное обеспечение для исследования процессов культивирования модельных микроорганизмов в условиях контролируемого окислительного стресса;
2 - исследовать изменения ростовых и биосинтетических характеристик модельных микроорганизмов при воздействии УФ облучением и пероксидом водорода, подобрать оптимальные дозы стрессоров;
3 - проанализировать действие факторов окружения, обладающих антистрессовым эффектом при окислительном стрессе;
4 - исследовать устойчивость к факторам окислительного стресса микроорганизмов различного физиологического состояния;
5 - исследовать совместное действие стрессорных и антистрессорных факторов в процессах культивирования модельных микроорганизмов;
6 - разработать методы, обеспечивающие поддержание состояния оптимального окислительного стресса для увеличения выхода целевого продукта;
7 - разработать автоматизированную систему культивирования и синтеза целевых продуктов в условиях контролируемого окислительного стресса.
Научная новизна.
На примере дрожжей Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae и гало-бактерий Halobacterium salinarium показана перспективность использования контролируемого окислительного стресса для повышения эффективности ферментации.
Обнаружено, что контролируемое совместное воздействие стрессоров (Н202, мягкий ультрафиолет) и антистрессорных факторов (видимый свет низкой интенсивности, антиоксиданты, удаление ингибиторов биосинтеза) улучшает ростовые и биосинтетические характеристики модельных микроорганизмов: повышает выход биомассы, удельную скорость роста, бродильную активность и устойчивость к закислению у дрожжей, способствует поддержанию продуктивности биореактора с высокоплотностной культурой дрожжей, повышает уровень накопления бактериородопсина при минимальном накоплении каротиноидов у галобактерий. Показано, что комбинированное действие ультрафиолета и видимого света или монохроматического излучения может выступать в качестве инструмента для управления ростом гетеротрофных микроорганизмов, не чувствительных в обычных условиях (без УФ облучения) к освещению.
Для дрожжей Saccharomyces cerevisiae показана целесообразность использования посевного материала, предобработанного Н2О2. Подобраны условия выращивания засевной культуры в условиях окислительного стресса (внесение Н202 в предстационарной фазе роста разово в дозе 0,3-0,6 г/л при освещении суспензии фоновым дневным светом), обеспечивающие в основном процессе в аэробных или микроаэрофильных условиях увеличение удельной скорости роста на 15-25%, выхода биомассы на 15-25%, сокращение лаг-фазы более чем в 2 раза; в анаэробных условиях - увеличение удельной скорости роста на 30-50% и сокращение времени сбраживания субстрата на 30%.
Впервые установлено, что в процессе глубинного культивирования галобактерий (ГБ) Н. salinarium рост культуры и синтез бактериородопсина (БР) в сильной степени зависят от наличия ингибиторов, предположительно продуктов химического и/или фотохимического окисления компонентов среды, образующихся при ее хранении или использовании. С учетом этих факторов получен биосинтетически активный штамм галобактерий, подобраны оптимальные условия (среда, режим аэрации, подготовка посевного материала, освещение) и разработаны режимы культивирования (доливная культура, внесение антиокси-дантов, обработка адсорбентами), позволившие увеличить содержание бактериородопсина в клетках и его выход за цикл ферментации с 70-75 мг/л за 6-7 сут. до 1700-1750 мг/л за 8 сут. при одновременном повышении стабильности процесса и снижении содержания каротиноидов, что существенно упрощает процедуры выделения бактериородопсина и его очистки.
Практическая значимость.
На основе проведенных исследований, выявленных воздействий и закономерностей разработаны новые методы культивирования микроорганизмов с контролированием факторов окислительного стресса. Предложена система культивирования, названная «солнечным» биореактором, в которой среда освещается одновременно светом видимого и мягкого ультрафиолетового УФА, УФБ диапазонов (имитируется действие излучения солнца на поверхности земли) или подвергается воздействию относительно малых доз пероксида водорода и видимого света.
Для управления ферментационными процессами разработаны программное обеспечение «BioDrome 1.0», автоматизированный комплекс, и метод непрерывного контроля уровня накопления биомассы и бактериородопсина в клетках галобактерий (по цветовым оттенкам ферментационной среды). Возможности комплекса позволяют регистрировать и регулировать параметры ферментации, работать в различных режимах культивирования с обратной связью по показаниям датчиков, а также следить за процессом в режиме удаленного доступа. Отдельные элементы комплекса и разработанное программное обеспечение используются в учебном процессе в РХТУ им. Д.И. Менделеева (каф. биотехнологии, каф. процессов и аппаратов), а также в научных исследованиях на стендах ГУП НПО «Астрофизика», ВНИИ Молочной промышленности.
Вариант метода культивирования с использованием одновременного воздействия пероксида водорода и видимого света, предложен для улучшения показателей (жизнеспособности, бродильной активности) дрожжевой засевной культуры при получении спирта из зерносырья. Предложенное решение вошло в план перспективных мероприятий Серебряно-Прудского биохимического завода (Московская обл.).
Согласно предварительной технико-экономической оценке реализация предложенных решений на базе разработанного автоматизированного комплекса и предложенных методов культивирования галобактерий при промышленном получении бактериородопсина (в составе пурпурных мембран) позволит снизить стоимость его с 500-5000 руб. за 1 мг (в зависимости от чистоты продукта) до 20-100 руб. за 1 мг.
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Калёнов, Сергей Владимирович
выводы
1. Разработано аппаратурное оформление и программное обеспечение «BioDrome 1.0» для управляемого культивирования микроорганизмов в биореакторах. Система внедрена в РХТУ им. Д.И. Менделеева для проведения научных исследований и учебного процесса, а также в ГУП НПО «Астрофизика», ВНИИ Молочной промышленности (г. Москва).
2. Разработана концепция «солнечного биореактора», в котором культивирование микроорганизмов осуществляется при одновременном освещении рабочей зоны светом видимого и ультрафиолетового диапазона. На примере культивирования дрожжей С. tropicalis и S. cerevisiae показано, что такой прием позволяет повысить выход биомассы с единицы субстрата на 10-20% без ухудшения производительности биореактора.
3. Предложено использование пероксида водорода или УФ-облучения для подготовки предадаптированного посевного материала S. cerevisiae с целью улучшения физиологических характеристик культуры. При выращивании посевного материала в аэробном или микроаэрофильном режимах пероксид водорода в пассажах лучше всего вносить в предстационарной фазе роста в дозе 0,3-0,6 г/л при концентрации биомассы дрожжей 2,2-2,4 г/л в условиях освещения суспензии фоновым видимым светом.
4. Показаны адаптационные изменения культуры S. cerevisiae в пассажах при внесении пероксида водорода или воздействии УФ, которые нивелируются через определенное время после прекращения адаптационной обработки.
5. Отработаны варианты анаэробной ферментации дрожжей S. cerevisiae с использованием предадаптированного к пероксиду посевного материала, приводящие к интенсификации спиртового брожения и сокращению времени сбраживания субстрата на 30%.
6. Подобрана питательная среда, режимы аэрации и освещения для культивирования галобактерий с целью получения бактериородопсина. Показана необходимость учета фактора «старения» питательной среды для обеспечения стабильности роста галобактерий и синтеза бактериородопсина.
7. Предложен режим культивирования галобактерий с доливом питательной среды и использованием инкапсулированного адсорбента для уменьшения концентрации накапливающихся в среде ингибиторов роста, в том числе, продуктов абиотического окисления. Режим позволяет получать до 1700-1750 мг/л бактериородопсина за 8 сут. культивирования при одновременном повышении стабильности процесса и минимизации содержания каротиноидов.
8. Предложен метод оценки результативности культивирования галобактерий в отношении накопления бактериородопсина. Метод основан на количественной оценке цветовой гаммы бактериальной суспензии с использованием фотосканера, включает обработку результатов и регулирование на их основе течения процесса, для чего создано программное обеспечение, интегрированное в общий пакет BioDrome 1.0.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Калёнов, Сергей Владимирович, Москва
1. Сафронов В.В. Интенсивная малоотходная систем биодеструкции загрязнений высококонцентрированных стоков. / Диссертация на соискание степени кандидата технических наук. М: РХТУ им. Д.И.Менделеева, 2004 г.
2. Сорокодумов С.Н. Интенсификация процессов спиртообразования и утилизации отходов спиртового производства. / Диссертация на соискание степени кандидата технических наук. М: РХТУ им. Д.И.Менделеева, 2005 г.
3. Davies J. М. S., Lowry С. V. and Davies К. J. A. Transient adaptation to oxidative stress in yeast. Archives of biochemistry and biophysics, 1995, vol. 317, issue 1, p. 1-6.
4. Rosenfeld E., Beauvoit В., Blondin В., Salmon J.M. Oxygen consumption by anaerobic Saccharomyces cerevisiae under enological conditions: effect on fermentation kinetics. Applied and Environmental Microbiology, 2003, vol. 69, No. 1, p. 113-121.
5. Rau W. Photoregulation of carotenoid biosynthesis / Eds. J.W.Porter, S.L. Spurgeon. John Willey & Son, 1983, p. 123 157.
6. Uytingco M.S., Parida S., Wiencek J.M. Waste stream cleanup by enzymati-cally-catalyzed reaction in an organic solvent. Sci. Conf. Chem. Def. Res., Aberdeen, Md, 16-19 Nov., 1993: Abstr. Dig. / US Army Edgewood Res., Dev. and Eng. Cent., 1993, p. 61.
7. Biiyiiksonmez F., Hess T.F., Crawfold R.L., et al. Optimization of simultaneous chemical and biological mineralization of perchlorethylene. Appl. And Env. Microbiol., 1999, v. 65, No 6, p. 2784-2788.
8. Fiorenza S., Ward C.H. Microbial adaptation to hydrogen peroxide and bio-degradation of aromatic hydrocarbons. J. of Ind. Microbiol, and Biotechnol., 1997, vol. 18, No 2/3, p. 140-151.
9. Аркадьева 3.A., Безбородов A.M., Блохина И.Н. и др. Промышленная микробиология: Учеб. пособие для вузов. /Под ред. Н.С. Егорова. М.: Высш. шк., 1989.-688 с.
10. Jamieson D. J. Saccharomyces cerevisiae has distinct adaptive responses to both hydrogen peroxide and menadione. Journal of Bacteriology, 1992, vol. 174, issue 20, p. 6678-6681.
11. Lewis J.C., Learmonth R.P., Attfield P.V., Watson K. Stress co-tolerance and trehalose content in baking strains of Saccharomyce cerevisiae. J. of Ind. Microbiol. and Biotechnol., 1997, 18, No l,p.30-36.
12. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) / Под ред. В.К. Мазурика, М.Ф. Ломанова. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2004. - 488 с.
13. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий. М.: Медицина, 2003. - 136 с.
14. Ярмоненко С.П. Радиобиология человека и животных: Учеб. пособие. -М.: Высш. шк., 2004. 549 с.
15. Macario Е. С., Macario A. J. L. // Frontiers in Biosci, 2000, vol. 5, No 4, p. 780-786.
16. Brock Biology of Microorganisms /Ed. M. T. Madigan, J.M. Martinko, J. Parker. Illinois: Illinois University Inc, 2002, ch. 14, p. 569.
17. Островский Д.Н. Окислительный стресс у бактерий. 53-е Баховское чтение. М.:ИНБИ РАН, 1997. 24с.
18. Богдановский Г.А. Химическая экология. М.: Изд-во МГУ, 1994. -237с.
19. Скурлатов Ю.И., Дука Г.Г., Мизити А. Введение в экологическую химию М.: Высш. шк., 1994. - 400 с.
20. Кузнецов А.Е., Градова Н.Б. Научные основы экобиотехнологии. М.: Мир, 2006, 504 с.
21. Lee S.H., Carberry J.B. Biodegradation of PCP enchanced by chemical oxidation pretreatment. Water Environ. Res. 1992,64, p. 682-690.
22. Синельников B.E. Проблемы чистой воды. M.: Знание, 1978. - 64 с.
23. Синельников В.Е. Механизм самоочищения водоемов. М.: Стройиз-дат, 1980.- 112с.
24. Ruiz-Duenas F.J., Guillen F., Camarero S. et al. Regulation of Peroxidase Transcript Levels in Liquid Cultures of the Ligninolytic Fungus Pleurotus eryngii. -Applied and Environmental Microbiology, 1999, Vol. 65, No. 10, p. 4458-4463.
25. Wood J.M. Clorinated hydrocarbons: oxidation in the biosphere. Environ. Sci. Technol., 1982, vol. 16, No 5, p.291 A-297A.
26. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г., Богдановская Ж.Н. Микробный синтез на основе целлюлозы: Белок и другие ценные продукты. Минск: Наука и техника, 1988.-261 с.
27. Janshekar H., Fiechter A. On the bacterial degradation of lignin. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1982, v.14, p. 147-150.
28. Kirk K. Microbial degradation of lignin in soil. Arch. Microbiol., 1972.
29. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита. Соросовский образовательный журнал, 1999, №1, с.2-7.
30. Madeo F., Frohlich Е., Ligr М., Grey М., Sigrist S.J., Wolf D.H., Frohlich K.-U. Oxygen stress: A regulator of apoptosis in yeast. -Journal of Cell Biology, 1999, vol. 145, issue 4, p. 757-767.
31. Singh RK, Verma NC. Effect of environmental stress on radiation response of Saccharomyces cerevisiae. Indian J Biochem Biophys, 1999 Oct; 36(5): 296-8.
32. Tyagi R., Srinivas G., Vyas D. et al. Differential effect of ultraviolet-B radiation on certain metabolic processes in a chromatically adapting Nostoc. Photochemistry and Photobiology, 1992, vol. 55, No 3, p. 401-407.
33. Girotti A.W., Lin F.B., Geiger P.G. Oxidative damage to eucaryotic membranes and potential repair systems. Abstracts of the 21st annual meeting of the American Society for Photobiology. - Photochemistry and Photobiology, 1993, p. 47.
34. Hu M.-L., Tappel A.L. Potentiation of oxidative damage to proteins by ul-traviolet-A and protection by antioxidants. Photochemistry and Photobiology, 1992, vol. 56, No 3, p. 357-363.
35. Fraikin G. Different mechanisms of yeast cell photoinactivation for UV-A and visible radiation. Abstracts of the 20th annual meeting of the American Society for Photobiology. - Photochemistry and Photobiology, 1992, vol. 55, p. 49.
36. Хочачка А., Сомеро Д. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988,586 с.
37. Gressel I.B., Rau W. // Enciclopedia Plant Physiol., 1983, vol. 16, p. 604639.
38. Osherov N., May G. // FEMS Microboil. Lett, 2001. vol. 199, p. 153-160.
39. Pfyffer G.E./ Pfyffer B. U, Rast D. M.//Sydowia.l996. vol. 39, p. 160-201; Ballio A., Vit-torio V., Russel S. T. // Arch. Biochem. Biophys. 1964. vol. 107, p. 177-183; Hollsworth J., Magan N. // Microbiology, 1994, vol. 140, p. 2705-2713.
40. Gekko K., Kuwana Y., Sasaki Т., Makino S.// Agric. Biol. Chem. 1991, vol. 55, No 6, p. 1663-1664.
41. Феофилова Е.П. // Микробиология, 1992, т. 61, No 2, с. 387-391.
42. Neves M. J., Jorge J.A., Francois J. M., Terenzi H. // FEBS Lett, 1991, vol. 283, No 1, p. 19-22.
43. Pharr D. M., Stoop J. M. H., Williamson M. E., Stufler M. 0., Massei M. 0., Con-niking M. A. // Hort. Sci, 1995, vol. 30, No 6, p. 1182-1187.
44. Ellis S. W, Grindle M., Lewis D.H. // Mycol. Res, 1991, vol. 95, p. 457-464.
45. Dotsch G. A., Rast D. // Phytochemie, 1972, Bd. 11, S. 2677-2681.
46. Noventa-Jordai M. A., Lourdes M., Polireli Т., Bonini M., Jorge J., Ter-enzi H. // FEBS Lett, 1996, vol. 378, p. 32-36.
47. Рапопорт А. И., Пузыревская О. M., Саубенова М.Г. // Микробиология, 1998, т. 57, No 2. с. 329-331.
48. Yakovlev A.Ya., Borovskii G.V., Voivikov V.K., Grabetrych O.I., Podezi-nova T.P., Antipina A.I. // Abst. Int. Symp. Plant under environmental stress. Moscow. Russia, 2001, p. 317.
49. Кулаева O.H. // Энциклопедия «Современное естествознание» M.: магистр-пресс, 2000, т. 2, с. 271-279.
50. АЬее Т., Wouters J.А. // Int. J. Food Microbiol, 1999, vol. 50, No 1-2, p. 65-91.
51. Trent J.D. // Ferms Microboil. Rev, 1996, vol. 18, No 2-3, p. 249-258.
52. Sanders J.W., Venema G., Kok J. // FERM Rev, 1999, vol. 23, No 4, p. 483501.
53. Gottersman S.,Wickner S., Maurizi M.R. // Genes Dev, 1997, vol. 11, No 7, p. 815-823.
54. Graumann P., Marahiel M. // FEBS Lett, 1994, vol. 338, No 1, p. 157-160.
55. Goldstien J., Pollin N.S., Inouye M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, vol. 87, No 1, p. 283-287.
56. Mizushima Т., Kataoka K., Ogata Y., Inoue R., Sekimizu K. // Mol. Microboil, 1997, vol. 23, No 2, p. 283-287.
57. Csonka l.N. // Bacteriol. Rev, 1989, vol. 53, No 1, p. 121-147.
58. Litius G., Holmberg N., Bulow L. // Biotechnology, 1996, vol. 14, No 1, p. 177-180.
59. Blomberg A. // FEMS Lett, 2000, vol. 182, No 1, p. 121-147.
60. Krantz, M., Nordlander, В., Valadi, H., Johansson, M., Gustafsson, L., Hoh-mann, S. Anaerobicity prepares Saccharomyces cerevisiae cells for faster adaptation to osmotic shock. Eukaryotic Cell, 2004, vol. 3, issue 6, p. 1381-1390.
61. Holmes J.D., Smith P.R., Evans-Gowing R. et al. Bacterial photoprotection through extracellular cadmium sulfide crystallites. Photochemistry and Photobiology, 1995, vol. 62, No 6, p. 1022-1026.
62. Elkins G.J., Hassett D.J., Stewart P.S., Schweizer H.P., McDermott T.R. Protective role of catalase in Pseudomonas aeruginosa biofilm resistance to hydrogen peroxide. Appl. and Environ. Microbiol., 1999, vol. 65, No. 10, p. 4594-4600.
63. Izawa S., Inoue Y., Kimura A. Importance of catalase in the adaptive response to hydrogen peroxide: analysis of acatalasaemic Saccharamyces cerevisiae. -J. Biochem., 1996, vol. 320, p. 61-67.
64. Jamieson D.J., Rivers S.L., Stephen D.W.S. Analysis of Saccharamyces cerevisiae proteins induced by peroxide and superoxide stress. Microbiology, 1994, vol. 140, p. 3277-3283.
65. Hassan H.M., Fridovich I. Regulation of the synthesis of catalase and peroxidase in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1978, vol. 253, p. 6445-6450.
66. Winquist L., Rannug U., Rannug A., Ramel C. Protection from toxic and mutagenic effects of H202 by catalase induction in Salmonella typhimurium. Mu-tat.Res., 1984, vol. 141, p. 145-147.
67. Benaroudj, N., Lee, D.H., Goldberg, A.L. Trehalose Accumulation during Cellular Stress Protects Cells and Cellular Pro-teins from Damage by Oxygen Radicals. Journal of Biological Chemistry, 2001, vol. 276, issue 26, p. 24261-24267.
68. Herdeiro, R.S., Pereira, M.D., Panek, A.D., Eleutherio, E.C.A. Trehalose protects Saccharamyces cerevisiae from lipid peroxidation during oxidative stress. Bio-chimica et Biophysica Acta - General Subjects, 2006, vol. 1760, issue 3, p. 340-346.
69. Островский Д.Н. Окислительный стресс у бактерии.53-е Баховское чтение. М.: ИНБИ РАН, 1997. 24 с.
70. Щипанова И.Н., Харатьян Е.Ф., Сибельдина JI.A., Огрель О.Д., Островский Д.Н. // Биохимия, 1992 т. 57, No 6, с. 862-872.
71. Steels, E.L., Learmonth, R.P., Watson, К. Stress tolerance and membrane lipid unsaturation in Saccharomyces cerevisiae grown aerobically or anaerobically. -Microbiology, 1994, vol. 140, issue 3, p. 569-576.
72. Hengee-Aronis R. Survival of hunger and stress: the role of rpoS in Escherichia coli // Cell, 1993, vol. 72, p. 165-168.
73. Karyl I. Minard and Lee McAlister-Henn Antioxidant function of cytosolic sources of NADPH in yeast. Free Radical Biology and Medicine, 2001, vol. 31, issue 6, p. 832-843.
74. Storz G., Baird P.T., Toledano M.B. et. al. Regulation of hydrogen peroxide-inducible genes in bacteria. Abstracts of the 21st annual meeting of the American Society for Photobiology. - Photochemistry and Photobiology, 1993, p. 47.
75. Zheng M., Aslund F, Storz G. //Science, vol. 338, No 5357, p. 1718-1721.
76. Sousa-Lopes, A., Antunes, F., Cyrne, L., Marinho, H.S. Decreased cellular permeability to H202 protects Saccharomyces cerevisiae cells in stationary phase against oxidative stress. FEBS Letters, 2004, vol. 578, issue 1-2, p. 152-155.
77. Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J.-M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M.B., Labarre, J. The H202 stimulon in Saccharomyces cerevisiae. Journal of biological chemistry, 1998, vol. 273, issue 35, p. 22480-22489.
78. Uchida N., Mitani H., Shima A. Multiple effects of fluorescent light on repair of ultraviolet-induced DNA lesions in cultured goldfish cells. Photochemistry and Photobiology, 1995, vol. 61, No 1, p. 79-83.
79. Sancar A., Tang M.-S. Nucleotide excision repair. Photochemistry and Photobiology, 1993, vol. 57, No 5, p. 905-921.
80. Lu, F., Wang, Y., Bai, D., Du, L. Adaptive response of Saccharomyces cerevisiae to hyperosmotic and oxidative stress. Process biochemistry, 2005, vol. 40, issue 11, p. 3614-3618.
81. Hartke A., Boushe S., Laplace J-M., Benachour A., Boutibonnes PH., Auf-fray Ya // Arch. Microbiol, 1995, vol. 163, No 2, p. 329-336.
82. Воробьева Л.И., Чердынцева Т. А. Абилев С.К.// Микробиология, 1995, т. 4, No 1, с. 187-192.
83. Mitani Н., Shima A. Induction of cyclobutane pyrimidine dimer photolyase in cultured fish cells by fluorescent light and oxygen stress. Photochemistry and Photobiology, 1995, vol. 61, No 4, p. 373-377.
84. Fukui A., Laskowski W. Modifying factors of the cellular concentration of photolyase molecules in Saccharomyces cerevisiae cells I. Effects of temperature and light. - Photochemistry and Photobiology, 1984, vol. 39, No. 5, p. 613-617.
85. Fukui A., Laskowski W. Modifying factors of the cellular concentration of photolyase molecules in Saccharomyces cerevisiae cells II. Effects of preillumination with light flashes. - Photochemistry and Photobiology, 1984, vol. 40, No. 2, p. 227-230.
86. Квасников Е.И., Щелокова И.Ф. Дрожжи. Биология. Пути использования. Киев: Наук думка, 1991.-328 с.
87. Авакянц С.П., Шакарова Ф.И. Биохимические и микробиологические методы исследования дрожжей и вина. М.: Наука, 1971. - с. 35-39.
88. Schroeder W.A., Johnson Е.А. // J. Gen. Microbiol, 1993, vol. 139, p. 907909.
89. Schroeder W.A., Johnson E.A. Singlet oxygen and peroxyl radicals regulate carotenoid biosynthesis in Phaffia rhodozyma. Journal of Biological Chemistry, 1995. vol. 270, No. 31, p. 18374-18379.
90. Jae-Cheol Jeong, In-Young Lee, Seon-Won Kim & Young-Hoon Park Stimulation of P-carotene synthesis by hydrogen peroxide in Blakeslea trispora. -Biotechnology Letters, 1999 21: 683-686. Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands.
91. Scott J.P., Ollis D.F. Integration of chemical and biological oxidation processes for water treatment: review and recommendations. Environ. Prog. 1995,14, p. 88-103.
92. Nagamune Т., Kurata H., Hirata M. et al. Photosensitive phenomena of ni-trile hydratase of Rhodococcus sp. N-771. Photochemistry and Photobiology, 1990, vol. 51, No. l,p. 87-90.
93. Гурвич А.Г. Принципы аналитической биологии и теории клеточных полей, М., "Наука", 1990.
94. Рорр F.A. Koharent electromagnetische Felder in biologischen Systemen, "Laser + Electro-Optik", 1980, 12, No 3, s. 28 32.
95. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Сверхслабые излучения в межклеточных взаимодействиях Н." Наука", 1981. с. 144.
96. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Биоинформационная функция естественных электромагнитных полей, Н. " Наука ", 1985, с.182.
97. Лазеры в клинической медицине, под редакцией проф.Плетнева С.Д., М. "Медицина", 1981,с.399.
98. Webb S.J., Nutrition, Coherent Oscillations and Solitary Waves. The Control of in vivo Events in Time and Space and Relationship to Disease, " IRCS Med Sci" 1 1/1983,p. 483-488.
99. Голант М.Б., О проблеме резонансного действия когерентных электромагнитных излучений миллиметрового диапазона волн на живые организмы, "Биофизика", 1989, т. XXXIY, N 2, с. 339-348.
100. Голант М.Б.," Резонансное действие когерентных элект-ромагнитных излучений миллиметрового диапазона волн на живые организмы, " Биофизика " 1989, т XXXIY, вып. 6, с. 1004 1014.
101. Девятков Н.Д., Гельвич Э.А., Голант М.Б., Реброва Т.Б., Севастьянова Л.А., Радиофизические аспекты использования в медицине энергетических и информационных воздействий электромагнтиных колебаний, " Электроника СВЧ ", 1981, вып.9 (333), с. 43-50.
102. Attfield P.V. Stress tolerance: The key to effective strains of industrial baker's yeast. Nature Biotechnology, 1997, vol. 15, issue 13, p. 1351-1357.
103. Северина Л.О., Пименов H.B., Плакунов B.K.// Микробиология. 1985, 54, вып. 1, 5-10.
104. Гусев М.В., Гохлернер Г.Б.// Вестник МГУ, серия 16 "Биология". 1983, 11, No 1, с. 29-34.
105. Северина Л.О., Пименов Н.В., Плакунов В.К.// Микробиология. 1985, 54, вып. 2, 197-202.
106. Скулачев В.П.// Светочувствительные биологические комплексы и оптическая регистрация информации. Пущино, 1985, 7-14.
107. Абдулаев Н.Г., Киселев А.В., Овчинников Ю.А. и др.// Биологические мембраны. 1985,2, N 5,453-459.
108. Лобырева Л.Б., Фельдман Р.С., Плакунов В.К.// Микробиология. 1987, No 56, вып. 1, с. 16-20.
109. Лобырева Л.Б., Фельдман Р.С., Плакунов В.К.// Микробиология. 1987, No 56, вып. 2, с. 189-193.
110. Синещеков В.А., Литвин Ф.Ф. // Биофизика. 1987, XXXII, вып. 3, с. 540-553.
111. Тарасов A.J1., Звягинцева И.С. Лысенко A.M. // Микробиология. 1987, 56, вып. 6. с. 342-398.
112. Oesterhelt D., Krippahl G.// Febs letters. North-Holland Publishing Company Amsterdam. October 1973, vol. 36, No 1, p. 72-76.
113. Mukohata Y., Sugiyama Y. Isolation of the white membrane of crystalline bacterio-opsin from Halobacterium halobium RlmW lacking carotenoid. Methods in Enzymology, 1982, vol. 88, p. 407-411.
114. Bayley S.T., Morton R.A. // Strategies of microbial life in extreme environments, ed. M. Shilo. Berlin, 1979, p. 109-124.
115. Belozersky A.M., Spirin A.S. // The nucleic acids, ed. M. Chargraff, J.N. Davidson. 1960, vol 3, p. 147.
116. Boring J., Kushner D.J., Gibbons N.E. // Can. J. Microbiol., 1963, vol. 9, p. 143.
117. Baryshev V.A., Glagolev A.N., Skulachev V.P. // Nature, 1981, vol. 292, p. 338-340.
118. Brown K.J., Gibbons N.E. The effect of magnesium, potassium and iron on the growth and morphology of red halophilic bacteria. Canad.J.Microblol., 1955, vol. l,p. 486-494.
119. Hartmann R., Sickenger H.-D., Oesterhelt D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol.77, p. 3821-3825.
120. Stoeckenius W., Rowen R. //J. Cell. Biol., 1967, vol. 34, p. 365-392.
121. Карнаухов B.H. Биологические функции каротиноидов. M.: Наука, 1988.-241 с.
122. Sies Н., Stahl W. and Sundquist A.R. Antioxidant functions of vitamins. Vitamins E and C, beta-carotene, and other carotenoids. Annals of the New York Academy of Sciences, 1992, vol 669, Issue 1, p. 7-20.
123. Krinsky N. I. The Antioxidant and Biological Properties of the Carotenoids. Annals of the New York Academy of Sciences, 1998, vol. 854, p. 443-447.
124. Krinsky N.I. // Free radicals, oxidative stress, and antioxidants / Ed. T. Oz-ben. N. Y.: Plenum Press, 1998. p. 323-332.
125. Hurst J.S., Jin G.-F., Saini M., Awasthi Y.C., van Kuijk F.J. G. M. Toxicity of carotenoid oxidative breakdown products to cultured human retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2004, 45, p. 1297-B108.
126. Danon A., Stoeckenius W. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, vol. 71, p. 1234-1238.
127. Oesterhelt D. and Stoeckenius W. Nature New. Biol., 1971,223, p. 149-152.
128. Миронова E.B. Биосинтетическое получение аналогов бактериородопсина. / Диссертация на соискание степени кандидата химических наук. М: МГАТХТ им. М.В. Ломоносова, 2002 г.
129. Gibbons N.E. // Proc. 2nd Int. Sympos. Food. Microbiol. H.M. Stat. Office, London, 1958, 69.
130. Kushwaha S.C., Kates M. // Can. J. Biochem., 1976, vol. 54, p. 824-829.
131. Sumper M., Reitmeier W., Oesterhelt D. Biosynthesis of the Purple Membrane of Halobacteria. Angew. Chemie, Intern. Ed. Engl., 1976, vol. 15, p. 187-194.
132. Hartmann R., Oesterhelt D.// Eur. Biochem, 1977, vol 77, p. 325-335.
133. Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. М. 1989.
134. Harold F. M.// Bacterid. Rev. 1972, vol. 36, p. 172.
135. Onishi H., McCance M.E., Gibbons N.E. A synthetic medium for extremely halophilic bacteria. Canad. J. Microbiol., 1965, vol 11, p. 365-373.
136. Sumper M.// Method in enzimology. 1982, vol. 88, part 1, p. 391-395.
137. Kushwaha S.C., Kates M. // Can. J. Biochem. 1974, vol. 54, p. 824-839.
138. Larsen, H. Biochemical aspects of extreme halophilism," Advances in Microbial Physiology, vol. 1, p. 97-132.
139. Dundas I.D., Srinivasan V.R., Halvorsson, H.O. A chemically defined medium for Halobacterium Salinarium strain 1. Canadian Journal of Microbiology, 1963, 9, p. 619-625.
140. Rogers P.J., Morris C.A. Regulation of bacteriorhodopsin synthesis by growth rate in continuous culture of Halobacterium halobium. Arch. Microbiol., 1978, vol. 119, p. 323-325.
141. Gochnauer M.B., Kushner, D.J. Growth and nutrition of extremely halophilic bacteria. Canad. J. Microbiol., 1969, 15, p. 1157-1165.
142. Weber H.J., Sarma S., Leighton T. The Halobacterium group: Microbiological methods. Method in enzymol.; 1982, vol.88, p.369-373.
143. Grey V.L., Fitt P.S. An improved synthetic growth medium for Halobacterium cutirubrum. Can.J.Microbiol., 1976, vol. 22, No 3, p. 440-442.
144. Shehgal S.N., Gibbons N.E. Effect of some metal ions on the growth of Halobacterium cutirubrum. Can. J. Microbiol., 1960, vol. 6, p. 165-169.
145. Oesterhelt D., Meentam, Schuhman L. Reversible dissociation of the purple complex. Eur.J.Biochem., 1973,40, p.453-463.
146. Lanyi J.K. Biochimica et Biophysica Acta, 2000, 1460, p. 1-3.
147. Birge R.R. Photophysics and Molecular Electronic Applications of the Rhodopsins. Annual Review of Physical Chemistry, 1990, vol. 41, p. 683 -733.
148. Wu P., Kimball D.R. and B.R, Nakashima M., and DeCristofano B. Enhancement of photoinduced anisotropy and all-optical switching in Bacteriorhodopsin films. Appl. Phys. Lett., 2002, vol. 81, p. 3888-3890.
149. Seitz A. and Hampp N. Kinetic optimization of bacteriorhodopsin films for holographic interferometry. J. Phys. Chem, 2000, vol. 104, p. 7183-7192.
150. Skladnev D.A., Egorova T.A. Stable isotopes labeled bacteriorhodopsin for computers. Тезисы VII Международной конференции по ретинальсодержащим белкам. Зихрон Яков (Израиль), 1997, с. 207.
151. Oesterhelt D. and Stoeckenius W. Isolation of the cell membrane of Halo-bacterium halobium and its fraction into red and purple membrane. Methods Enzy-mology. 31, p. 667-678 (1974).
152. Gropp F., Betlach M. C. The bat gene of Halobacterium halobium encodes a trans-acting oxygen inducibility factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., June 1994, vol. 91, p. 5475-5479.
153. Sang Yup Lee, Ho Nam Chang, Young Soon Um, and Soon Ho Hong Bac-teriorhodopsin production by cell recycle culture of Halobacterium halobium. Biotechnology Letters, August 1998, vol. 20, No 8, p. 763-765.
154. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток: Пер. с англ. М.: Мир, 1978.
155. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. М.: Мир, 1987. - 567 с.
156. Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. М.: Мир, 1978,464 с.
157. Удаление токсичных продуктов из организма методом гемосорбции в клинике и эксперименте. Труды 2-го МОЛГМИ им. Н.И. Пирогова. М.: 1974, т. 31, вып. 1.
158. Швайкова М.Д Токсикологическая химия. М.: Медицина, 1975.
159. Артюшин Л.Ф. Основы воспроизведения цвета в фотографии, кино и полиграфии. М.: Искусство, 1970. - 548 с.
160. Фейнман Р., Лейтон Р., Сэндс М. Фейнмановские лекции по физике. Вып. 3: Излучение. Волны. Кванты: Пер. с англ. / Под ред. Смородинского Я.А. Изд. 4-е, испр. М.: Едиториал УРСС, 2004. - 240 с.
161. Симонович С.В., Евсеев Г.А., Мураховский В.И., Бобровский С.И. Информатика базовый курс. СПб.: Питер, 2001. - 640 с.
162. Петровский А.И. Photoshop 6. Трюки в дизайне изображений. СПб: Майор, 2001.- 176 с.
163. Schutten R.J., de Haan G., van Roermund A.H. M. Noise filtering for television receivers with reduced memory. Proc. of the Int. Workshop on HDTV and the Evolution of Television, Taipei, Taiwan, Nov. 1995, p. 6A15--6A22.
164. Рыбаков M. Фотошопинг. Как управиться с цветом. Upgrade Special. Цифровая фотография, февраль 2005, #14 (2), с. 56-65.
165. Stone М.С., Cowan W.B., and Beatty J.C., Color gamut mapping and the printing of digital color images. ACM TOG, Oct. 1988,3 (7), p. 249-292.
166. Tumblin J., Rushmeier H. Tone reproduction for realistic images, IEEE Computer Graphics & Applications, November 1993, 13 (6), p. 42-48.
167. Ракитин В.И., Первушин B.E. Практическое руководство по методам вычислений с приложением программ для персональных компьютеров: Учеб. пособие.-М. Высш. шк., 1998.-383 с.
168. Загидуллин Р.Ш. LabView в исследованиях и разработках. М.: Горячая линия-Телеком, 2005. - 352 с.
169. Круглински Д., Уингоу С., Шеферд Дж. Программирование на Microsoft Visual С++ для профессионалов. СПб.: Питер, 2001. - 864 с.
-
Калёнов, Сергей Владимирович
-
кандидата технических наук
-
Москва, 2007
-
ВАК 03.00.23
- Влияние стрессовых изменений осмолярности и рН среды на экстремально галофильные архебактерии
- Влияние биологически активной добавки "Баксин-КД" на резистентность, продуктивность бройлеров и репродуктивную способность кур
- Отходы производства концентрированных белковых продуктов из сои как сырьё для получения кормовых добавок
- Биосинтез лимонных кислот дрожжами Yarrowia lipolytica N1 из этанола в условиях непрерывного культивирования
- Динамика возрастной структуры и развитие популяции дрожжей в управляемых условиях культивирования
