Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние стрессовых изменений осмолярности и рН среды на экстремально галофильные архебактерии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние стрессовых изменений осмолярности и рН среды на экстремально галофильные архебактерии"

РГ6 од

^ 3 . ,

Российская Академия Наук Институт микробиологии

■Л

На правах рукописи

УДК 579.841.51.016.7 579.841.5.017

К0К0ЕВА ПАШ ВАХТАНГОВНА

в/иякг стрЕссозих 11з;,екеш ошолярвости и рн сресу ал зкстрошш) лрхеб/хтеш

Специальность 03.00.07. - илкройиология

ШОРИЕРАТ диссортгцяя на соискание ученой степени кандидата биологических наук

!&сква - 1994

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН

Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Плакунов В.К.

Офациальныэ оппоненты : академик РАН Кондратьева E.H.

доктор биологических наук Жйлина Т.Н.

Ведущая организация : кафедра биологии почв

факультет почвоведения МГУ, Москва.

Закдага состоится "/¿С" иМ?Ш. 1994 г. в ¿Г часов па заседании специализированного совета Д.002.64.01. в Института микробиологии РАН по адресу ! II78II, г.Москва, Проспект 60-летия Октября, д.7, корпус 2.

С диссертацией шено ознакоышюя в библиотека Института микробиологии РАН.

Автореферат разослан "¿L" . . 1994 г.

Ученый секретарь специали- ууУ Никитин Л.Е.

аированного совета, к.б.н.

Актуальность темы. Галобактерии относятся к весьма необычной группе микроорганизмов, называемых архебактериями (или археями), которые отличаются от других бактерий (эубактерий) по составу и структуре многих клеточных компонентов. Способность к росту при высоком содержании солея в среде обусловливает чрезвычайную устойчивость к солям их внеклеточных ферментов Св частности,протеинаэ), которые могут нормально функционировать, например, при концентрациях ИаСГ, близких к насыщающим. Галобактерии образуют необычные внеклеточные полисахариды, содержание сульфатные группы, что ранее считалось характерным только для высших Сэукариотических) организмов. Внутриклеточные ферменты галобактерий (в частности, связанные с синтезом биополимеров) также обнаруживают специфические особенности, которые могут найти прикладное использование. В мембранах галобактерий содержатся фосфолипиды, представляющие собой простые эфиры, очень устойчивые к гидролитическому воздействия, и,наконец, мембраны галобактерий содержат фоторецепторный белок, бактериоро-допсин, определяющий способность галобактерий к бесхлорофильному фотосинтезу и находящий практическое применение в фотосенсорных процессах Св частности, в бессеребряной фотографии).

Все это свидетельствует об особом эволюционном положении галобактерий и определяет их важную роль в т.н. "экстремобиоценозах", то есть в экотопах, где физико-химические условия среды резко отличаются от обычной физиологической нормы. Такие биоценозы, как правило, очень чувствительны к различным стрессовым Св том числе и к антропогенным) воздействиям, например, в случае галофильных систем - к снижению осмотического давления среды С в.результате выпадения осадков, разлива паводковых вод, и др.).

Предсказание поведения такой экосистемы и перспектив сохранения ее стабильности должно быть основано на' определении "нормы

реакции" ее обитателей и возможностей их "адаптации" к стрессовым воздействиям. Между тем, сведения о реакциях галофилов на гипоос-мотический стресс чрезвычайно скудны. Гораздо больше известно об "адаптации" микроорганизмов к гиперосмотическим условиям С обзоры Larsen et, al. ,1987; Csonca,Hanson, 1991; Booth, 1992 и др.). В случае гипоосмотических стрессов внимание исследователей привлекало в основном изучение нижней границы стабильности клеток и характер их повреждений в результате шока: потеря низкомолекулярных веществ и т.fl.CTschichhoiz,Truper,I990; Berrier et al.,1992 и др.).

В лаборатории регуляции микробного метаболизма Института микробиологии РАН было обнаружено явление,условно названное "гало-деадаптацией", состоящее в модификации метаболизма умеренных галофилов при снижении осмотического давления в среде. Показано, что удобным тестом на эти изменения служит активность транспортных систем аминокислот С Плакунов и др.,1991 ; 1992). Представленная диссертация является развитием иследований явления "галодеадаптации" в применении к экстремально галофилъныы архебактериям. Цель работы. Цель работы состояла в следующем: I) разработать удобные тесты для количественной характеристики осмочувствитель-ности галобактерий; 2) исследовать с их помощью возможность "галодеадаптации" галобактерий к гипоосмотическим стрессам, в частности их реакцию на предполагаемые сигналы "осмотической тревоги"; 3)изу чить пределы стабилизации клеток и способность к выживанию в гипо-осмотической среде.

Научная новизна. Впервые показана возможность модификации осмо-чувствительносгк галобактерий всех известных родов под влиянием продуктов их осиолизиса. Установлено, что модифицированные клетки растут с более высокой скоростью в разбавленных средах Сдо 5% NaCl), чем клетки контрольных культур, не подвергнутых действию

осмолизата. Предложен новый способ стабилизации клеток галобзоте-рий путем "кислотного шока" при рН 3,0-4,0, позволявший промывать их дистиллированной водой и определять сухус биомассу и удельное содержание белка. Доказана избирательность и обратимость воздействия "кислотного шока" на активность мембранных транспортных систем, что позволяет рассматривать замену катионов-стабилизаторов СЫа+ и на протоны как возможный механизм "экологической

адаптации" галобактерий к гипоосмотическим средам. Научйо-практическая значимость. Впервые разработан метод приготовления биомассы галобактерий, не содержащей солей, что может быть использовано для облегчения извлечения из:нее ценных продуктов. Изучены возможности защитных реакций галобактерий как обитателей галофильных "экстремобиоценозов", являвшихся.природными заповедниками уникального Генофонда и выполняющих 1 важные функции поддержания круговорота зеществ в природе в экстремальных условиях, что способствует более точным прогнозам сохранения их стабильности. Апробация работы. Часть материалов диссертации была представлена на конкурсе работ молодых ученых Института микробиологии РАН в 1993 г. и отмечена первой премией.

Публикации. По теме диссертации опубликовано две статьи, три статьи сданы в печать.

Эбъем и структура кксертации. Материалы диссертации изложены на Ус? машинописных страницах и вюгочарт разделы "Введение", "Обзор титературы", "Экспериментальная -часть", "Заключение", "Выводы" и 'Список литературы" С /¡¡^наименований). Диссерт ация содержит ф зисунков и /¿таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Микроорганизмы и условия культивирования.

В работе использовали культуры экстремально галофильных архе-бактерий Halobacterim salinarím B-I769, Н. sacckcrovorm B-I747, Háloferax medíterranet B-I748, Hf.volcanii B-I768, Haloarcula hispánica B-I755 и NatroTiobacterim pharaanis B-I749, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов при ИБФМ РАН.

Посевным материалом служила суспензия клеток, полученная смывом со скошенной твердой среды. Для выращивания Nb.phaxaonis использовали питательную среду № 3 следующего состава Св г/л дистиллированной воды): дрожжевой экстракт - 10,0, каэаминовые кислоты - 7,5, цитрат натрия ( трехзамещенный ) - 3,0, КС1 - 2,0, Na2C03. IOHgO - 20,0 С или Na2C03 безводный - 5 ), NaCl - 250, рН 9,5. Для культивирования остальных галобактерий использовали среду № I. Она включала (в г/л дистиллированной воды): дрожжевой экстракт - 5,0, гидролизат казеина - 5,0, глутамат натрия - 2,0, КС1 - 2,0, цитрат натрия (трехзамещенный) -3,0, MgS04-7H20 - 20,0, NaCl - 200,0, рН 7,0-7,2. Для приготовления твердых сред № I и № 3 к соответствующим жидким средам добавляли I.7/Í агара. Приведенные выше среды представляет собой модификацию сред, описанных Тин-даллом для выращивания бактерий семейства Halobacteriaceae (Tin-dal1,1992).

В некоторых экспериментах галобактерии культивировали на среде № 4, представляющей собой среду № I, разбавленную в 10 рас < • тельно содержания органических питательных веществ. Она i v v (в г/л дистиллированной воды): дрожжевой экстракт - 0,5, гидролизат казеина - 0,5, глутамат натрия - 0,2, КС1 - 2,0, цитрат натрия ( трехзамещенный ) - 0,3, MgS04.7Н20 - 20,0, NaCl - 200,0, рН 7,0-7.2.

Для культивирования Н. ваИпаг1т кроме сложных сред использовали также синтетическую среду следующего состава Св г/л дистиллированной воды): 1,-аланин - 0,43, Ь-аргинин - 0,40, Ь-цистеин-0,05, Ь-глутаминовая кислота - 1,30, глицин - 0,06, Ь-изолейцин - 0,44, Ь-лейцин - 0,85, Ь-метионин - 0,37, Ь-фенилаланин - 0,26, Ь-про-лин - 0,05, Ь-серин - 0,61, Ь-треонин - 0,50, Ь-тироэин - 0,20, Ь-валин - 1,0,КС1 -1,0, КН2Р04 - 0,15, К2НР04 - 0.15, Ш3 - 0,10, 0,10, МдБ04.7Н20 - 20,0, ИаС1 - 250, цитрат натрия Стрехзамещен-ный)-0,5,глицерин - 1,0; микроэлементы Св мг/л): СаС12-2Н20 - 0,7, СиБОд. 5Н20 - 0,05, ГеС12.4Н20 - 2,3, КпБ04. Н20 - 0,3, гпБОд. 7Н20 -0,44, рН 6,6 (0п1бЬ1 е1 а1.,1965). В некоторых случаях для выращивания И. га Ипаг1ип использовали указанную синтетическую среду без ароматических-аминокислот (среда № 2).

Культуры выращивали в колбах Эрленмейера на 250 мл с 50 мл среды на качалке при 180 об/мин при 37°С. Инкубацию проводили в течение 65 часов. Затем 2 мл полученного посевного материала переносили в 50 мл той же среды и инкубировали при аналогичных условиях в течение различных промежутков времени, в зависимости от поставленной задачи.

Скорость роста измеряли как по светорассеянию суспензии (X = 540 нм, 1=0,5 см), так и по содержанию белка. Оба показателя находятся в прямой корреляционной друг с другом. рН среды определяли на универсальном иономере ЭВ-74. Получение осмолиззта и способы его фракционирования.

Для изучения влияния компонентов осмолизата клеток галобгкте-рий на их чувствительность к осмотическому шоку культуры соответствующих галобактерий выращивали в течение 72 ч Сранняя стационарная фаза). Клетки этого возраста собирали из 150 мл среды центрифугированием при 5000 д при комнатной температуре в течение 10-15

мин и промывали солевым раствором, содержащим 200 г/л NaCl и 20 г/л MgSO^. 7^0 СрН 7,0). .Промытые .клетки подвергали осмолизису в 5 мл дистиллированной воды при тщательном перемешивании до образования слегка мутного раствора.Незначительный осадок отделяли центрифугированием при 5000 g и отбрасывали. Такой осмолизат хранили при температуре -12°С. Перед внесением в среду к осмолизату (с содержанием белка около 20 мг/мл) добавляли NaCl до концентрации 20У. во избежание изменения содержания этой соли в питательной среде. Полученный осмолизат стерилизовали автоклавированием при 0,5 ати и использовали либо непосредственно Спри необходимости его стерильно разбавляли солевым раствором и вносили в среду в количестве 10% по объему), либо подвергали дальнейшему фракционированию: а) методом гель-фильтрации для разделения на низко- и высокомолекулярную фракции; б) методом ионообменной хроматографии; в)путем экстракции липидов. Для выявления "быстрого" эффекта осмо-лизата соответствующую фракцию вносили в экспоненциально растущую культуру галобактерий и инкубировали определенное время С1-3 ч) при 37°С на качалке, после чего измеряли осмочувствительность. Для выявления "медленного" эффекта соответствующую фракцию вносили одновременно с посевным материалом. Чтобы максимально уменьшить возможный автолиз клеток галобактерий при засеве среды всегда использовали свежий посевной материал, причем засеваемую среду и добавляемую фракцию осмолизата заранее прогревали до температуры культивирования. Инкубацию проводили в течение 72 ч, измеряя осмо-осмочувствительность через каждые 24 ч. Определение осмочувствительности клеток галобактерий.

Измерение осмочувствительности осуществляли двумя методами: по изменению светорассеяния суспензии клеток при ее разбавлении дистиллированной водой и по выходу в среду веществ, поглощаювдх

УФ свет в области 260-280 нм. ( в основном это белки, нуклеиновые кислоты и нуклеотиды).

В первом методе определенный объем суспензии клеток вносили при перемешивании в такой объем дистиллированной воды, который обеспечивал необходимую степень снижения содержания NaCl Свплоть до I/O. Через 30-60 мин измеряли оптическую плотность при X. = 440 нм Сдля повышения чувствительности метода) и строили график зависимости оптической плотности от концентрации NaCl, по которому расчитывали следующие показатели: ИНдд - 50%-шй индекс, т.е. концентрация NaCl, при которой происходит снижена© светорассеяния суспензии в два раза: П.О. средний - показатель осмоустойчивости, рассчитанный по формуле: И^-ИН^УЮ^, где KH§q в ИН^ф- индекса для контрольной и опытной культур соответственно: И.О.при 5Я NaCl - показатель осмоустойчивости, расчитанный по формуле»

ОП440" OI541Q /ОП440' где ОП440 и 0П44О~ светоРассеяниэ контрольной и опытной культур при 5% НаС1 в процентах к светорассеянию при 5/i. Первые два показателя характеризуют усредненную чувствительность популяции, тогда как третий более корректно характеризует чувствительность гетерогенной популяции, так как учитывает в основном клетки, обладающие повышенной осмоустойчивостью и сохраняющиеся при "критической" концентрации С550 NaCl.

Во втором методе клетки собирали цефифугированием, промывали солевым раствором и помещали в раствор NaCl со сниженным его содержанием (I5/i). Через I ч клетки отделяли центрифугированием, снимали спектр супернатанта на спектрофотометре "Specord UV VIS" и характеризовали осмочувствительность по разности оптической плотности контрольной и опытной культур между 260 и 300 нм, рассчитывая относительное снижение оптической плотности по формуле : ^ = D260"D300/D260"D300' где пРиведены оптические плотности

опытной и контрольной культур при 260 и 300 нм. Определение транспортной активности.

Клетки микроорганизма ресуспендировали в 0,05 М растворе трис-НС1-буфера СрН 7,0), содержащего 200 г/л NaCl и 20 г/л MgS04.7H20 до оптической плотности 0,8 и добавляли к раствору L-Ut^Clтирозина СХемапол,Чехословакия,уд.активность 333 мКи/ммоль). Пробы фильтровали через стеклянные фильтры "V/hatman GF/F", затем дважды промывали 2 мл солевого раствора. Радиоактивность клеток измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Rackbeta 1219" CLSCB, Швеция) и вычитали величину неспецифического связывания метки фильтром. Кинетические параметры рассчитывали по методу Лайнуивера-Берка, контролируя расчеты методом нелинейной регрессии Ньютона СЭберт,Эдерер,1988) с помощью компьютерной программы, разработанной И.В.Глаголевым (личное сообщение).

Содержание белка определяли по методу Лоури в модификации Гартри (Hartree,I972).

*

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Модификация осмочувствительности клеток экстремально галофильных-архебактерий.

Специфической особенностью экстремально галофильных архебактерий Сгалобактерий) является зависимость от высокого уровня солей (главным образом NaCl) в среде. Снижение концентрации NaCl до 10 -15% вызывает у клеток осмотический шок,выражавшийся в их набухании и последующей дезинтеграции. Принято считать, что при концентрации NaCl ниже 5- 10V. жизнеспособные клетки галобактерий существовать, как правило, не могут за некоторыми исключениями, например, для представителей рода Halococcus СTindal1,1992).

Между тем, галобактерии изолированы не только из высокосоленых

водоемов и солеварен, где содержание солей достаточно постоянно, но и из таких экотопов как солончаки, аридные почвы (Звягинцева и др.,1987, 1992) Сгде возможны колебания солености в довольно широких пределах в результате паводков, выпадения осадков и т.д.) и даже из морской воды (Rodriguez-Valera et al., 1979). В этих случаях клетки галобактерий должны Подвергаться сильнейшим осмотическим стрессам, выходящим за пределы общепринятой "зоны жизнеспособности".

Логично предположить,что- у галобактерий могут существовать специальные зволюционно выработанные механизмы, позволяющие хотя бы части клеток популяции переживать подобные ситуации.

Такие механизмы могут быть основаны на формировании "переживающих форм" типа цист, обнаруженных в последнее время в популяциях некоторых галобактерий СКострикнна и др. ,1990). Другая возможность - участие специальных "авторегуляторных" факторов (Хохлов, 1988) в модификации осмотического статуса клеток в ответ на снижение концентрации солей в среде, что наблюдается, например» при изменении фазового состояния мембран ряда бактерий СЭль-Регистан и др.,1985). Еще проще предположить, что "сигналом" об изменении осмотических условий в среде могли бы являться не специальные факторы, а некоторые из обычных клеточных компонентов, освобождающихся в среду в процессе осмолизиса, но в норме в среде не присутствующие.

В серки экспериментов, посвященных изучению влияния•осмолиза-та H.salinarim на осмочувствительность клеток этой архебактерии, было выявлено небольшое, но вполне достоверное снижение осмочув-ствительности после культивирования в присутствии осмолизата. Типичные результаты представлены на рис.I и 2. Можно видеть, что культивирование в течение 48 ч на среде № I с' добавлением осмоли-

140 120 100 80 60 40 20

0П, %

20

15 «а.* 10

Рис.I.Определение осиочувствительности Н. salinaтiш методом разбавления суспензии клеток. ОП - светорассеяние суспензии в % к ОП при 20'/. ИаЙ1. I - культура выращена без осмолизата, 2 - культура выращена с осмолизатом.

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

о1—

240

250

260

270

280

290

300

Рис. 2. Определение осиочувствительности Н, гаИпагьт по выходу веществ, поглощавших УФ. и - оптическая плотность супернатанта. I -культура выращена без осмолизата,2-культура выращена с осмолизатом.

зата в количестве 0,5 мг белка/мл вызывает заметное снижение осмочувствительности клеток, измеряемой как по степени уменьшения светорассеяния суспензии, так и по выходу в среду продуктов лизиса.

Наряду с этим "медленным" эффектом осмолизата проверяли возможность "быстрого" воздействия осмолизата на экспоненциально растушую культуру за время инкубации 1-3 ч, однако ни в одном из вариантов опыта достоверного изменения осмочувствительности зарегистрировано не было. Первые признаки повышения осмоустойчивости появлялись не ранее, чем через 12 ч инкубации.

Эксперименты, проведенные по той же схеме с другими представителями экстремально галофильных архебактерий, показали, что метод, основанный на изменении светорассеяния суспензии, имеет узкую применимость, т.к. лишь в случав №. рЬигаотэ удалось зарегистрировать падение светорассеяния за ограниченный период инкубации после разбавления суспензии дистиллированной водой. В остальных случаях наблюдалось лишь возрастание светорассеяния за счет набухания клеток, а их лизис наступал только после продолжительной инкубации. Поэтому в табл.1 приведены лишь данные, полученные вторым методом, основанным на измерении оптической плотности "вытекающих" иэ клеток продуктов осмолиза. Можно видеть, что все изученные архебактерии реагируют на присутствие в питательной среде собственного осмолизата сходным образом, хотя выраженность этой реакции различна.

Для дальнейшего более детальното исследования . была выбрана культура Н.гаИпаггт, к которой в полной мере применим первый, более удобный для экспериментов метод и у которой в наибольшей степени выражена реакция на собственный осмолиэат.

В отличие от условий выращивания Н. БаИпаПш в чистой культуре в природных галофильных бактериальных ценозах сосуществуют

Таблица I. Влияние собственных осиолизатов на развитие осмоустой-чивости галобактерий через 48 ч культивирования.

Микроорганизм °260 " С300 ДО В %

контроль * осмолисат

На1оЬас1ег1ига заНпа^иш 0,38 0,28 74

¡ЫоЬаЛепит зассЬагоуогиш 0,25 0,20 80

Набегах тесИЦеггапе! 0,16 0,14 88

На1оГегах уо1сапи 0,21 0,17 81

На1оагси1а Ыэрагиса 0,22 0,17 77

Иа1гопоЬас1ег1иш рКагаоЩэ 0,34 0,26 76

Примечание: измерение проводили не через 24, а через 48 ч в связи с низкой скоростью роста некоторых культур. '

разные организмы, растущие при повышенных концентрациях N¿01,

Поэтому логично было предположить, что клетки Н.заИпагьш способны реагировать повышением осыоустойчивости не только на свой осмолизат.но и на присутствие осмолизата других галобактерий. Действительно, изучение влияния осмолизатов клеток И. засс/гагоиогая.и /УЬ.рЬагаогиг на осмочувствительность Н. ваИпагИяп, показало, что в их присутствии осыоустойчивость Н. БаИпаг^ит повышается примерно в той же степени, что и в присутствии собственного осмолизата. Подбор оптимальных условий для изучения влияния осмолизата клеток Н. 5аНпаг1ит на их осмочувствительность.

Влияние возраста лизируемых клеток. Сравнение эффективности осмолизатов, полученных из 24-.48- и 72-часовых культур К.заипщчгяп. и испытанных в количествах, уравненных по содержанию белка ( 0,5 мг/мл), показало, что наибольшая степень устойчивости к осмолизнсу наблюдается у клеток, выращенных в присутствии осмолизата 72-часовых культур.

Влияние возраста посевного материале и возраста культуры. Поскольку внесение посевного материала в свежую среду сопровождается большей или меньшей степенью его автолиза, существует опасность "автоиндукции" осморезистентности за счет продуктов автолиза, состав которых может перекрываться с составом продуктов осмолизиса. Поэтому было изучено влияние возраста посевного материала на осмочувстви-тельность клеток и эффект, оказываемый осмолизатом. Как и следовало ожидать, наибольшую осмочувствительность обнаруживали культуры в возрасте 24 ч, выращенные из 24-часового инокулята. В процессе роста культуры снижается как ее осмочувствительность, так и "отклик" на внесение осмолизата. Это достаточно убедительно свидетельствует о существовании явления "аутоиндукции".осморезистентности у плотных суспензионных культур И. salinarim. особенно при их выращивании на качалке (механическое встряхивание усиливает логические процессы).

В дальнейших исследованиях с целью уменьшения "аутоиндукции" осморезистентности, а также уменьшения лаг-фазы использовали свежий 24-часовой посевной материал, который вносили в подогретую среду.

Влияние количества вносимого осмолизата. При внесении в среду неразбавленного осмолизата (в количестве 10% по объему), а также осмолизата, разведенного в 10, 100.и 1000 раз его концентрация по белку достигала соответственно 2, 0,2, 0,02 и 0,002 мг/мл.Согласно представленным в табл,2 данным, наиболее выраженный (и примерно равный) эффект наблюдается при концентрации осмолизата 0,2 и 0,02 мг/мл. Неразбавленный осмолизат несколько стимулирует рост культуры; при остальных его концентрациях скорость роста не отличается от контрольной.

Эти данные позволяют сделать два предположения. Во-первых, в

Таблица 2. Влияние концентрации осмолизата на развитие осмбустой-чивости Н. Ба11паг1т через 24 ч культивированивания.

Вариант опыта г И%) . П.О. средний в У. П.О. при 5 У. ИаС1 в У.

Контрольная культура, выращенная без добавок 5,9 ± 0.2

Неразбавленный осмолизат ( 2мг/мл по белку) 5,'3 ± 0,2 •10 24

Разбавление I : 10 5,1 ± 0.3 14 31

Разбавление I г 100 5,0 ±0,4 15 32

Разбавление I : 1000 5,8 ± 0,4 0 0

осмолизате могут присутствовать вещества с противоположным действием, как повышающие, так и понижающие осмочувствительность С или меняющие характер своего действия в зависимости от концентрации). Во-вторых, для веществ, вызывающих осмозащитную реакцию может существовать "пороговая доза" (между 0,02 и 0,002 мг/мл по белку), и дальнейшее повышение концентрации не усиливает эффект. Такой характер активности свойственен "сигнальным" эффекторам триггерного действия, а не соединениям-"иодифякаторам", увеличение концентрации которых должно плавно усиливать эффект. №?учение эффекта фракций осмолизата.

Детализация механизма действия такой многокомпонентной системы, как осмолизат, представлялась иалоперспективной, что привело к необходимости хотя бы предварительного фракционирования "сырого" осмолизата.

С этой целью осуществили разделение осмолизата на высоко- и низкомолекулярную фракции методом гель-фильтрации, а затем фракционировали их методом ионообменной хроматографии. Кроме того, из

осмолизата экстрагировали липиды по стандартной методике смесью метанола и хлороформа.

Испытание эффекта этих фракций достаточно убедительно показало,

что осмозапщтное действие в основном связано с низкомолекулярной фракцией. Высокомолекулярная фракция в некоторых опытах вызывала даже повышение осмочувствительности клеток. Наиболее активной оказалась фракция, полученная после пропускания низкомолекулярной фракции через анионит, тогда как фракция, полученная элюированием с анионита, проявила явно выраженную обратную активность. После экстракции липидов активность осмолизата повышалась, тогда как сами липиды обнаружили лишь слабый защитный эффект.

Таким образом, в результате этих экспериментов удалось подтвердить наличие в осмолизате веществ с противоположной активностью, как повышающих, так и понижающих осмочувствительность, однако активность второго типа преобладает. Можно также утверждать, что второй тип активности многокомпонентен.

По-видимому,"сигнальная" роль компонентов осмолизата основана на кооперативном взаимодействии с множественными рецепторами клетки, что позволяет последней отличать сигналы "осмотической тревоги" от евтрофикации за счет "случайного" попадания в среду органических веществ.

Взаимосвязь осмочувствительности и выживаемости клеток.

Эволюционно закрепленный механизм управления осмочувствитель-ностью клеток галобактерий должен обеспечивать их выживание при осмотическом стрессе. Мы изучили, как влияет выращивание культуры Н.заИтш1ш в присутствии осмолизата на скорость ее роста после осмотического шока. В качестве инокулята использовали суспензии

оп

чаем

Рис.3 Влияние осмолизата на осмочувствительность■ культур Н.эаИпа-гiш, измеряемую по скорости роста после осмотического шока. I - культура, не подвергнутая осмотическому шоку, 2,3 - инкубация при 8% НаС1, 4,5 - инкубация при 6,6% НаС1, 6,7 - инкубация при 5% НаС1. 3,5,7 - культуры выращены без осмолизата, 2,4,6 - культуры выращены в присутствии осмолизата.

клеток, выращенных в отсутствие Сконтроль) и в присутствии Сопыт) осмолизата С0,2 иг/мл по исходному белку) после их выдергивания в разбавленной питательной среде С5-8 % N¿01) в течение I ч. Затем к каждому варианту добавляли МаС1 до 20% и использовали для засева свежей среды в количестве 10% (по объему). Полученные результаты представлены на рис.3." Наибольшие различия обнаружены после инкубации клеток при 6,6% ИаСЬ скорость роста опытной культуры в экспоненциальной фазе (р % 0,1 заметно превышает скорость

роста контрольной культуры См % 0,06 ч~Ь. Можно было полагать, что различия в скоростях роста контрольных и опытных культур обусловлены сохранением большего числа жизнеспособных клеток после шока в опытных вариантах, что и удалось подтвердить путем высева культур на плотные среды.

Осюстабилизация клеток Н. 5а11пагшш путем подкисления среды.

Хотя молекулярные механизмы процесса повышения осмоустойчи-вости галобактерий при инкубировании их в присутствии осмолизата остаются неизвестными, можно предположить, что это повышение осмо-устойчивости обусловлено стабилизацией наружного слоя клеток СБ-слоя), заменяющего у галобактерий истинную клеточную стенку. Поскольку он состоит из сильно кислых гликопротеинов, решающую роль в его стабилизации играет экранирование отрицательных зарядов с помощью одно- и двухвалентных катионов. Логично было бы предположить, что защитным действием могут обладать и ионы Н+, так как повышение их концентрации Сподкисление среды) приводит к подавлению диссоциации кислотных групп. В этом случае, по-видимому,должна отпасть необходимость в других катионах-стабилизаторах.

Действительно, подкисление среды до рН 6,0 снижало осмочувст-вительность клеток Н.5аПпаг1ига (ИН^) до 2,5% НаС1, а при рН 4,0 и ниже происходила настолько выраженная их стабилизация, что они выдерживали даже промывание дистиллированной водой.

Обнаруженный стабилизирующий эффект ионов Н+ позволил разработать метод получения биомассы галобактерий, свободной от солей. Получение сухой биомассы галобактерий. не содержащей солей.

Образцы клеточной суспензии, отобранные на разных стадиях роста культуры, подкисляли 2 М НС1 до рН 4.0 или 3,0. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 д в течение 15 мин и путем повторного центрифугирования трижды промывали дистиллированной водой, подкисленной до рН 4,0 и 3,0 соответственно (всего 1,5-кратным объемом по отношению к объему исходной суспензии). При необходимости полноту удаления солей контролировали по реакции на анионы СГ с АдНО^. После промывания клетки переносили в стеклянные бюкси и высушивали до постоянного веса при 105°.

Поскольку в контрольном варианте (при рН около 83 нельзя определить биомассу из-за высокого содержания солей, для дополнительной проверки возможности частичного лизиса клеток в процессе обра- • ботки их дистиллированной водой сравнивали содержание белка в клетках исходной культуры (однократно промытых солевым раствором), а также в контрольных клетках Стриады промытых солевым раствором) и в опытных клетках, отмытых дистиллированной водой перед высушиванием. Результаты представлены в табл.4. Между контрольными и опытными вариантами достоверные различия, как правило,отсутствуют, однако при рН 4,0 в некоторых случаях определяемые величины биомассы и белка ниже, чем при рН 3,0. Учитывая наблюдаемое иногда слипание клеток при этом рН, следует предпочесть проведение определений при рН 3,0. Высокое содержание белка в биомассе по сравнению с некоторыми другими бактериями, вероятно, обусловлено тем,что поверхностные слои клеток галобактерий состоят из белковых субъединиц, а не из пептидогликана или липополисахарида. Влияние "кислотного шока" на жизнеспособность клеток Н. заНпаПит.

Клетки М.5а11паг1Ш, инкубированные в воде при рН 3,0 и 4,0 и помещенные в свежую питательную среду, возобновляли размножение, хотя и после длительной лаг-фалы. Лаг-фаза в контрольной культуре также возрастала в 1,5-2 раза (по сравнению со стандартной процедурой посева), вероятно, вследствие механического повреждения клеток при многократном центрифугировании. Скорость роста культур в опытных вариантах ниже, чем в контрольном, однако к началу стационарной фазы они достигали примерно такой же плотности, как и контроль, а при повторном пересеве росли со скоростью, неотличимой от контроля. Микроскопический анализ и высев на плотную среду показали однородность культуры и отсутствие морфологически измененных вариантов. Таким образом, воздействие экстремальной (для данного

Таблица 3. Величина сухой биомассы и содержание белка в клетках галобактерий.

Культура и вариант опыта Биомасса Содержание белка

В г/л В г/л В % от сухой биомассы

На1оЬас1ег1шп sali.nari.um Исходный Контроль рН 4;о рН 3,0 1,32+0,32 1,23+0,38 1,17+0,16 1,13+0,26 1,03+0,27 1.03+0,06 78,0 83,7

На1оЬас1ег1иш зассЬаготсгит Исходный Контроль рН 4.0 рН 3.0 I,12±0,16 1,15+0,03 1,07+0,21 0.88+0,25 0,98+0.25 0,96+0,26 87,5 83,5

На1оагси1а 1изра!иса Исходный Контроль рН 4,0 рН 3,0 1,58+0,07 1,75+0,06 1,28+0,11 1,17+0,01 1,05+0,03 1,18+0.02 66,5 67.4 !

Набегах те<Л1еггапе1 Исходный Контроль рН 4,0 рН 3,0 1,31+0,08 1.19+0,03 0,95+0.04 0,86+0.02 0,88+0,01 ' 0,96+0,05 ! 67,2 ! •80,7 |

На1оГегах уо1сапИ Исходный Контроль рН 4;о рН 3,0 1,1110,07' 1.32+0,01 0,95+0,04 0,86+0,03 0,88+0,01 1,15+0,05 79,3 ' . «7.1 |

Примечание: указана величина .медианы и доверительного интервала для !Р = 95%; пропуск означает, что определение ¡невозможно.

организма) кислотности среды, повреждая клетки Н.за!лпогииа, не лишает их жизнеспособности, а значит,. может обеспечить их ' выживаемость при стрессовом снижении осмотического давления в среде.

Метод раздельного определения в клетках Н. заПпагИта активности

транспортных систем тирозина.

Для выявления хотя бы части механизмов, вызывающих повреждение

клеток под действием кислотного шока, мы использовали в качестве

тест-объекта системы мембранного транспорта, как весьма

чувствительные метаболические системы, одними из первых

реагирующие на изменение условий окружающей среды. Очень удобными

для этих целей представляются три транспортные системы тирозина:

две специфичных для этой аминокислоты, сильно отличающиеся по

сродству (система с высоким сродством ССВС-система) с ^ около -й

10 М и система с низким сродством ССНС-система) с Ку около

10 М) и одна общая с другими ароматическими •аминокислотам (Ку —К

около 10 ° 10. Для раздельного определения активности всех трех систем был разработан метод избирательного ингибирования транспорта Ь-тирозина его аналогом [.-фенилаланином, который практически полностью конкурентно ингибирует транспорт тирозина посредством общей системы при 5-10- кратном избытке, тогда как активность СВС-системы подавляется при более высоком уровне фенилаланина (по бесконкурентному типу), активность СНС-систеш практически нечувствительна к фенилаланину.

Логично было ожидать, что столь различные по параметрам и физиологическому значению системы обнаружат не одинаковую чувствительность к "кислотному шоку", что позволит разграничить специфические и неспецифические (денатурирующие) эффекты такой обработки.

Таблица 4. Зависимость активности транспортных систем тирозина у Н.5аИпаг1ьт от условий обработки клеток, выращенных на синтетической среде.

Условия обработки клеток

Активность транспортных систем тирозина Контроль, рН 7,0 Солевой раствор, рН зГ 0 Дистиллированная вода.рН 3,0

Суммарная активность: 1. пмоль/мг белка 2. Я от контроля 329,0 100 36,0 И 39,0 12

Общая система: 1. пмоль/мг белка, 2. % от суммарной активности, 3. % от контроля 25,0 8 100 18;0 50 72 21,0 54 84

СВС-система 1. пмоль/мг белка, 2. %•от суммарной активности, 3. % от контроля 109,0 33 100 8,0 22 7 0 0 0

СНС-система 1. пмоль/мг белка, 2. У. от суммарной активности, 3. У, от контроля 195.0 59 100 10,0 28 5 18,0 46 9

Примечание: возраст культуры 48 ч.

Влияние "кислотного шока" ца активность транспортных систем тирозина % Н.8а11паг1шв.

Данные, касающиеся удельной активности и относительного содержания трех указанных систем в контрольных и подвергнутых воздействию кислой среды клетеах И.еаИпагхш представлены в табл.4. Культуру в этом случае выращивали в течение 48 ч на синтетической среде, не содержащей ароматических аминокислот, на которой лучше всего выявляется активность специфичных транспортных систем. Клетки после воздействия кислой среды СрН 3,0) инкубировали в

свежей питательной среде в течение 21 ч для репарации транспортных систем, поскольку непосредственно после обработки и даже после 2-часовой репарации транспортная активность оказалась полностью подавленной. Аналогичные по характеру результаты получены и после выращивания культуры на сложной пептонной среде.

Представленные в табл.4 данные показывает, что воздействие кислой среды приводит к сильному, но обратимому повреждению систем транспорта тирозина. После' репарации активность общей система восстанавливается почти полностью Сдо 72-84% от контрольных клеток). Активность специфичных систем даже после 21-часовой репарации остается на очень низком уровне С0-9% от контроля), хотя к началу возобновления экспоненциального роста культуры их активность достигает уровня контроля Сданные не приведены). Таким образом,воздействие кислой среды вызывает инактивацию транспортных систем тирозина, однако, в связи с обратимостью и избирательностью этот эффект не может рассматриваться.как чисто денатурирующий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, нами впервые обнаружена возможность модификации осмочувствительности клеток галобактерий под воздействием продуктов их осмотического лизиса, а также под действием "кислотного шока",что потенциально может реализоваться ке только в искусственных, лабораторных условиях, но и в условиях существования природных популяций в рамках так называемой "экологической адаптации".

В этой случае последовательность событий можно представить следующим, образом. Под воздействием осмотического стресса С например вследствие разбавления природной среды осадками и др.) происходит осмолизис части природной популяции, в результате чего в среде по-

является специфический набор продуктов, ранее в ней отсутствующих. Эти продукты путем диффузии распространяют сигнал "осмотической тревоги",заставляющий популяцию включать механизмы осмозащиты.Наиболее вероятной реакцией галобактерий на такой сигнал является изменение конформации С"упрочнение") наружного слоя гликопротеинов СБ-слоя). "Упрочнение" Б-слоя само по себе может вызывать некоторое повышение осмоустойчивости клеток и, кроме того,облегчать формирование "локального" протонного градиента, существование которого продемонстрирована для грамотрицательных бактерий. Дальнейшая

• + р+

замена обычных катионов-стабилизаторов С На и Мд ) на протоны переводит клетки галобактерий в состояние "консервации", формально сходное с состоянием спор или цист.

"Консервированные" клетки галобактерий возобновляют активный рост лишь после длительной лаг-фазы. Причиной ее может быть сложность процесса восстановления нормальной структуры и функций клеточной мембраны, так как изменение конформации гликолипидов С под влиянием протонов ) да и самих мембранных белков не может не сказаться на их взаимодействии и функционировании.

Многокомпонентность сигнала "осмотической тревоги" имеет, по-видимому, важный физиологический смысл, так как позволяет клетке отличать появление в среде специфического набора продуктов осмоли-зиса от временного обогащения среды органическими веществами С на-например, в результате сезонной евтрофикации). Реакция на такой сигнал должна осуществляться по принципу кооперативного взаимодействия с множеством рецепторов.

Вполне закономерно, что возникает много новых вопросов,требующих ответа, например: реализуется ли данный механизм на уровне всей популяции (со сравнительно небольшим ответом всех или основной массы клеток) или реагирует только часть С5 - 10%) популяции,

но с гораздо более выраженным эффектом- (последний вариант нам представляется более целесообразным с точки зрения выживания попу-" ляции).

О

ВЫВОДЫ

1.Впервые обнаружен феномен повышения осмоустойчивости клеток галобактерий родов На1оЬас1егИт, НаI гспоЬас Iег Iшг, На1о/егах и Яа1оагси1а под влиянием продуктов их осмолизиса, которые можно рассматривать как сигналы "осмотической тревоги".

2. Культуры галобактерий. выращенные в присутствии осмолизата, характеризуются меньшей степенью дезинтеграции в гипоосмотических средах, более высокой скоростью роста и меньшим периодом реабилитации после гипоосмотического стресса по сравнению с контрольными культурами, не подвергнутыми действию осмолизата.

3. Разработан новый способ стабилизации клеток галобактерий путем "кислотного шока" при рН 3,0-4,0, позволяющий промывать их дистиллированной водой и определять сухую биомассу и удельное содержание белка.

4. Разработан метод раздельного определения в клетках На1оЬас1е-Г1Ш 5а(лпдг£ша активности трех транспортных систем тирозина: двух специфичных для этого субстрата и одной общей для всех ароматических аминокислот. Изучены механизмы регуляции их активности и физиологическая роль.

5. Доказана избирательность, и обратимость воздействия "кислотного шока" на активность этих транспортных систем,что позволяет рассматривать замену катионов-стабилизаторов СШ и Мд ) на протоны как возможный механизм "адаптации" галобактерий к гипоосмотическим средам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1.Кокоева М. В. .Лобырева Л. Б. .Плакунов В. К. Физиологическое значение транспортных систеи тирозина у Kalabac ter ium sait nan ид. Микробиология.1992.Т.61.Вып.6,С.945-949.

2.Кокоева М.В..Плакунов В.К. Возможность модификации осмочувстзи-тельности экстремально галофильных архебактерий. ¡Микробиология.

1993. Т. 62. Вып. 5. С. 825-834.

3.Плакунов В. К..Кокоева М.В. Оскостабилизация клеток галобактерий и получение их сухой биомассы, не содеркацей солей. Микробиология

1994. (принята к печати).

4.Кокоева М. В., Плакунов В.К. Влияние "кислотного шока" на жизнеспособность клеток и активность транспортных систем тирозина у

у Halobacteriua salinarium. Иикробиология.1994,Спринята к печати)..

5.Lobyreva L. В.,Kokoeva M. V. .PiakunoY V. К. Physiological role of tyrosine transport systems in Halobacterim salinarium. Archiv. Microbiol.1994 (accepted for press).