Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимическое изучение бактериродопсина с помощью моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Втюрина, Ирина Юрьевна

ВВЕДЕН!®

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антигенная структура белков и способы ее изучения

1.2. Моноклональные антитела как инструмент для изучения антигенной структуры белков

1.3. Бактериородопсин - уникальная модель для изучения антигенной структуры и топографии мембранных: белков

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение и характеристика моноклональных антител

3.2. Изучение антигенной структуры бактерио-родопсина с помощью моноклональных антител

3.3. Топография бактериородопсина в мембране, выявленная с помощью моноклональных антител

3.4. Заключительное обсуждение 88 ВЫВОДЫ 95 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунохимическое изучение бактериродопсина с помощью моноклональных антител"

Изучение антигенной структуры белков является одной из наиболее важных задач молекулярной иммунологии. Белки образуют основной класс антигенов, на которые отвечает иммунная система, поэтому знание структурной основы антигенности белков необходимо как для понимания защитных механизмов организма и способности различать свое-чузюе, так и для создания искусственных иммунорегуляторов, моделирующих антигенную структуру полимеров, например синтетических вакцин» В последние годы, благодаря появлению техники гибридом, открылись новые возможности для структурного изучения антигенов. Это связано с тем, что моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, связываются со специфическим участком на поверхности белка (антигенной детертнантой) и могут быть использованы в качестве селективных зондов на определенные структурные участки. Тем не менее, круг белков, для которых проведено детальной изучение антигенной структуры, в настоящее время невелик, К числу наименее изученных в иммунохимическом плане объектов относятся мембранные белки,

Бактериородопсин - мембранный белок бактерии н.ЬааоЫит - играет важную роль в энергетике этих организмов, являясь фотоиндуцируемым протонным насосом. Благодаря установлению полной аминокислотной последовательности и принципов пространственной организации полипептидной цепи он является удобным объектом для изучения антигенной структуры мембранных белков. Установление топографии бактериородопсина в мембране является необходимым этапом на пути к выяснению механизма функционирования этого белка. их антител. На рис. 4 представлен типичный профиль элвдии мо-ноклональных антител цри аффинной хроматографии на белок А-сефарозе. Белок выходил с колонки одним пиком, и его выход составлял 65-75 мкг на I мл культуральной жидкости.

Гомогенность выделенных моноклональных антител проверялась с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. На рис. 5 представлены электрофореграммы моноклональных антител И)^д-, Н^Е^, А-^н^, н^ и • Из рисунка видно, что антитела практически гомогенны и содержат лишь следовые количества примесных белков ( < 1%).

Для доказательства моноклональности антитела были подвергнуты анализу с помощью аналитического изо электрофокусирования (ИЭФ) в тонком слое полиакриламидного геля. Известно [27], что молекулы антител обладают микрогетерогенностью вследствие посттрансляционных модификаций полипептидной цепи, главным образом благодаря присоединению нескольких (2-5) углеводных цепей с различным содержанием остатков И-ацетилней-раминовой кислоты. В результате этого каждое антитело проявляется при ИЭФ в виде набора близко расположенных полос. В том случае, если препарат содержит несколько различных антител, на изоэлектрофореграмме будет присутствовать соответствующее количество наборов полос; поэтому о моноклональности антител можно судить по количеству наборов полос [7б].

На рис. 6 представлены результаты ИЭФ моноклональных антител. Каждое антитело имеет единственный набор полос, причем мажорные полосы в этих наборах уникальны для каждого антитела и равны 6,0; 5,8; 6,3; 4,85 и 5,3,для моноклональных антител л>2ах9 н5е5, а14н3, н5з?5 и б)соответственно. Таким обра

Целью настоящей работы явилось получение моноклональных антител к бактериородопсину и изучение с их помощью антигенной структуры и топографии бактериородопсина в мембране.

В ходе работы были достигнуты следующие результаты: I. Получен набор гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к различным участкам полипептидной цепи бактериородопсина. 2. Обнаружено пять новых антигенных детерминант бактериородопсина и проведена их локализация. 3. Исследовано влияние модификаций ряда аминокислотных остатков на антигенные свойства молекулы бактериородопсина. 4. Выявлены существенные аминокислотные остатки, входящие в состав ряда антигенных детерминант. 5. Обнаружено, что участки полипептидной цепи 33-56, 156-163, 194-209, расположенные в местах сочленения I и 2, 5 и б, 6 и 7 сб-спиральных сешентов, экспонированы на поверхности мембраны. Эти данные уточняют картину пространственного расположения бактериородопсина в мембране, что необходимо для понимания механизма его функционирования.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Втюрина, Ирина Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Получено пять гибридом, продуцирующих моноклональ-ные антитела к бактериородопсину; цроведена биохимическая и иммунохимическая характеристика этих антител.

2. С помощью моноклональных антител изучена антигенная структура бактериородопсина: установлена точная локализация антигенных детерминант, выявлены существенные аминокислотные ОСТаТКИ этих детерминант (А8р^б5Аар28;1Ъе^251Ье1^&1и1^).

3. йммунохимическими методами исследована топография бактериородопсина в мембране; показано, что N-концевая часть молекулы, а также участки полипептидной цепи 33-56, 156-163 и 194-209, расположенные в местах сочленения I и 2, 5 и 6, 6 и 7 -спиральных сешентов бактериородопсина, соответственно, экспонированы на поверхности мембраны.

Выражаю глубокую благодарность академику Ю.А.Овчинникову за научное руководство и постоянное внимание, оказанное при проведении данной работы; ст.н.с. Р.Г.Василову за ценные советы и помощь; ст.н.с. В.И.Цетлину и ст.н.с. А.В.Киселеву и м.н.с. А.Б.Курятову за предоставление препаратов бактерио-родопсина и участие в обсуждении полученных результатов, -а также членам группы белков иммунной системы за товарищеское участие и творческую атмосферу, способствующую успешному завершению работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Втюрина, Ирина Юрьевна, Москва

1. Köhler G., Milstein С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.- Nature, 1975, v.256, p.495-497.

2. Xelton D.E., Scharff M.D. Monoclonal antibodies: powerful new tool in biology and medicine.- Ann. Rev. Biochem., 1981, v.50, p.657-690.

3. Fazekas de S.G., Scheideggar D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics.- J.Immunol. Meth., 1980,v.35, p.1-21.

4. Davie J.M. Hybridomes: A revolution in Reagent Production.-Pharmacological Reviews, 1982, v.54, p.115-118.

5. Schroder J. Monoclonal antibodies: A new tool for research and immuno diagnostics.- Medical Biology, 1980, v.58,p.140-148.

6. Van Eldik L.J., Fok K.-F., Erickson B.W., Watterson D.M. Engineering of site-directed antisera against vertebrate calmodulin by using synthetic peptide immunogens containing an immuno-reactive site.- Proc. Nat. Acad. Sei.,1983, v.80, p.6775-6779.

7. Barkas Th., Juillerat M., Kistler J., Schwendimann B., Moody J. Antibodies to synthetic peptides as probes of acetylchlorine receptor structure.- Bur. J. Biochem., 1984, v.143, p.309-314.

8. Wilson J.A., Niman H.L., Houghten R.A., Cherenson A.R.,

9. Connolly M.L., Lerner H.A. The structure of an antigenic determinant in a protein.- Cell, 1984, v.37» pi767-778.

10. Atassi M.Z. Immunochemistry of proteins.- Plenum Press, N .-Y. and London, 1977, v. 2, p.594-601.

11. Arnold B., Burgert H.-G., Hamann U., Hammerling G.I., Kees U., Kvist S. Structure and immunological function of genetically engineered hybrid molecules of histocompatibility.- Cell, 1984, v. 38, p.79-87.

12. Benjamin C., Berzofsky A., East J. et al. The antigenic structure of proteins: a reappraisal.- Ann. Rev. Immunol, 1984, v.2, p.67-101.13* Sela M. Antigenicity: Some molecular aspects.- Science, 1969, v.166, p.1365-1374.

13. Cpumpton M.J. Protein antigens: the molecular bases of antigenicity and immunogenicityIn the Antigens II, M.Sela, ed. (New York: Academic Press), 1974, p.1-78.15« Jerne N.K. Immunological speculations.- Ann. Rev. Microbiol., 1960, v.14, p.341-346.

14. Sela M., Schechter B., Schechter I., Borek P. Antibodies to sequential and conformational determinants.- Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1967, v.32, p.537.- 99

15. Петров Р.В. Иммунология. М.: Медицина, 1983.

16. Goodman L.W. Antigenic determinants and. antibody combining sites.- Tfcie Antigens. V. 5.,Ei. by Sela M. , 1975,p.127-187.

17. Furie В., Schechter A.N., Sachs D.H. Anfinsen C.B. An immunological approach to the conformational equilibrium of staphylococal nuclease.- J. Molec. Biol., 1975» v.92»p. 497-506.

18. Lando G., Reichlin M. Antigenic structure of sperm whale myoglobin Characterization of antibodies preferentially reactive with peptides arising in response to immunization with the native protein.- J. Immunol., 1982, v.129 >p.21 2 217.

19. Atassi M.Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins.- Immunochemistry, 1975, v.12, p.425-458.

20. Atassi M.Z., Sakata S., Kazin A.L. Localization and verification by synthesis of five antigenic sites of bovine serum albumin.- Biochem. J., 1979, v.179, p.527-551.

21. Lerner R.I. Tapping the immunological repertoire to produce antibodies of predetermined specificity.- Nature, 1982, v.299, P.592-596.2?. Глинн Л., Стыоард M., Структура и функции антител. М.: Мир, 1983.

22. Davies D.R., Metzger Н. Structural basis of antibody function.- Ann. Rev. Immunol., 1985, v.1, p.87-117.

23. Amit A.C., Mariozza R.A.,.Phillips S.F.V., Poljak R.J. Three-dimensional structure of an antigen-antibody complexоat 6A resolution.- Nature, 1985 (in press).

24. Ibrahimi I.M., Prager E.M., White T.J., Wilson A.C. Amino acid sequence of California quail lysozyme. Effect of evolutionary substitutions on the antigenic structure of lysozyme.- Biochemistry, 1979, v.18, p.2736-2744.

25. Wiley D.C., Wilson J.A., Skehel J.J. Structural identifi~ cation of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation.-Nature, 1981, v.289, p.373-378.

26. Smith-Gill S.J., Wilson A.C., Potter M., Prager E.M., Peld-man R.J., Mainhart C.R. Mapping the antigenic epitope fora monoclonal antibody against lysozyme.- J. Immunol., 1982, v.128, p.314- 324.

27. Xobayashi T., Fujio H., Konso K., Dohi Y., Hirayama A., Ta-kajaki Y., Kosaki G.^ Amano T. A monoclonal antibody specific for a distinct region of hen egg-white lysozyme.- Mol. Immunol., 1982, v.19, p.619.

28. Berzofsky J.A., Hicks G., Pedorko J., Minna J. Properties of monoclonal antibodies specific for determinants of a protein antigen, myoglobin.- J.Biol. Chem., 1980, v.255, p. 11188-11191.

29. East I.J., Hurrel J.G.R., Todd P.E., Leach S.J. Antigenic specificity of monoclonal antibodies to human myoglobin.

30. J. Biol. Chem., 1982, v.257, p.3199-3206.

31. Lapresle C., Doyen N. Study of an antigenic site of human serum albumin with monoclonal antibodies.- Mol.Immunol.,1985, v.20, p.549-555.

32. Benjamin D.C., DeCourcy K., Riley R.L., Wilson L.D. Clonal analysis of the antigenic structure and genetic controlof immune responses to bovine serum albumin.- Fed. Proc., 1985, v.42, p.1237- 1243.

33. Westhof D., Altschuh D., Moras D., Bloomer H.C., Mondra- . gon A., Klug A., Van Regenmort&l M.H.V. Correlation between segmental mobility and the location of antigenic determinants in proteins.- Nature, 1984, v. 511, p.123-126.

34. Behring Institute MITTEIL UNGEN, Antibodies. Compliment Vaccins, 1984, N0.76, November.

35. Kabsch W., Sander W. How good are predictions of protein secondary structure?- FEBS Lett., 1983, v.155, p.179-182.

36. Sela M. From synthetic antigens to synthetic vaccines.-Biopolymers, 1985, v.22, p.415-424.

37. Tainer Y.A., Getzoff E.D., Alexander H., Houghten R.A., Olson A.J., Lerner R.A., Hendrickson W.A. The reactivity of anti-peptide antibodies is a function of the atomic mobility of sites in a protein.- Nature, 1984, v.512,p.127-155.

38. Edmudson A.B. Amino acid sequence of sperm-whale myoglobin.- Nature, 1965, v.205, p.885-894.o

39. Takano T. Structure of myoglobin refined at 2.0 A resolution. I. Crystallographic refinement of metmyoglobin from sperm whale.- J. Mol. Biol., 1977, v.110, p.537-562.

40. Crumpton M.J., Wilkinson J.M. The immunological activity of some of the chymotryptic peptides of sperm-whale myoglobin.- Biochem. J., 1965, v.94, p.545-561.

41. Hurrell J.G.R., Smith J.A., Leach S.J. The detection of five antigenically reactive regions in the soybean leghemo-globin a molecule.- Immunochemistry, 1978, v.15, p»297-509.

42. Smith J.A., Hurrell J.G.R., Leach S.J. A novel method/for delineating antigenic determinants: Peptide synthesis and radioimmunoassay using the same solid support.- Immunochemistry, 1977, v.14, p.565-678.

43. Berzofsky J.A., Buckenmeyer G.K., Hicks G., Gurd F.R.N., Feldiffan R.J., Minna J. Topographic antigenic determinantsrecognized, by monoclonal antibodies to sperm-whale myoglobin.- J. Biol. Chem., 1982, v.257, p.3189-3198.

44. Osserman E.F., Canfield R.E., Beychok S. eds. Lysozyme.-New York, 1974.

45. Thompson K., Harris M., Benjamini E., Mitchell G., Noble M. Cellular and humoral immunity: A distinction in antigenic recognition.- Nature New Biol., 1972, v.258, p.20-27.

46. Atassi M.Z., Lee C.-L. The precise and entire antigenic structure of native lysozyme.- Biochem. J., 1978» v.171» p.429-4 34.

47. Berthou G., Lifchitz A., Artumiuk P., Solles P. Internal mobility in lysozyme molecule: cox^relation with antigenic structure.- Proc. R. Soc., 1983, v.217, p.471-489.

48. Reichlin M. Amino acid substitution and the antigenecity of globular proteins.- Adv. Immunol., 1975» v.20, p.71-98.

49. Schwartz R.M., Dayhoff M.O. Cytochromes.- In: Atlas of Protein Sequence and Structure, 1978, v.5 (Suppl.3). Ed. by M.D.Dayhoff.

50. Margoliash E. The molecular variations of cytochrome cas a function of the evolution of species. Harvey Lect., 1972, v.66, p.177-194.

51. Dickerson R.E. C.ytochromec and the evolution of energymetabolism.- Sci.Amer., 1980, v.242(3), p.136-147.

52. Urbanski G.J., Margoliash B. Topographic determinants on cytochrome, P» I.The complete antigenic structures of rabbit, mouse, and guanaco cytochromes c in rabbits and mice.-J. Immunol., 1977, v.118, p.1170-1184.

53. Yemmerson R., Margoliash E. Topographic antigenic determinants on cytochrome c. Immunoadsorbent separation of the rabbit antibody populations directed against horse cytochrome.c.- J. Biol. Chem., 1979, v.254, p.12706-12716.

54. Brown J.R. Structural origins of mammalian albumin.- Fed. Proc., 1976, v.35, p.2141-2157.

55. Sakata S., Atassi M.Z. Immunochemistry of serum albumin. A time-dependent examination of the antibody response to bovine serum albumin by the activity of its third domain.-Mol. Immunol., 1976, v.16, p. 451-463.

56. Habeeb A.F.S.A., Atassi M.Z. A breyment comprising the last third of bovine serum albumin which accounts for almostall the antigenic reactivity of the native protein.- J.Biol. Chem., 1976, v.251,-p.4616-4621.

57. Doyen N., Pesce A.J., Lapresle C. Immunological cross-reactivity between cyanogen bromide fragments of human serum albumin.- J. Biol. Chem., 1982, v.257, p. 2770-2782.

58. Benjamin D.C., Diagle L.A., Riley R.L. The antigenic structure of bovine serujpi albumin: T-cell, B-cell and Ia-deter-minants.- Inî Protein Conformation as Immunological Signàl* Ed. by F.Celeda, V.Schumaker, E.E.Sercarz, p.261-274.

59. Hybridoma techniques, EMBO, SKMB Course, 1980, Basel, Cold Spring Harbor Laboratory.77* Hurrel Y.G.R. Monoclonal hybridoma antibodies techniquesand applications, CRC Press, Inc.Boca Raton, Florida, 1983«

60. Vienken J., Eimmermann U., Fouchard M., Zagury D. Electro-fusion of myeloma cells on the single cell level.- FE BS Lett., 1983, V.165, No.1, p.54-56.

61. Liesegang B., Radbruch A., Rajewsky K. Isolation of myeloma variants with predefined variant surface immunoglobulin by cell sorting.- Proc. Nat. Acad. Sci^ 1978, v.75, p.3901-3905.

62. Chang M., Steplewski Z., Korpowski H. Production of monoclonal antibodies in serum free medium.- J. Immun. Methods, 1980, v.39, p.369-375.

63. Milstein C., Guello A.C. Hybrid Hybridomas and the production of bi-specific monoclonal antibodies.- Immunology Today, 1984, v.5, No.10, p.299-304.

64. Blythman H.E., Casellas P., Gros 0., Gros P., Jemsen F.K., Paelucci F., Pau B., Vidal H. Immunotoxins: hybrid molecules of monoclonal antibodies and a toxin submit specificallykill tumor cells.- Nature, 1981, v.290, p.145-153.

65. Nathaniel A., Brown M.D. Prospects for human monoclonal antibodies: a critical perspective.- The Jale Journal of Biology and Medicine, 1982, v.55, p.297-303.

66. Cole S.P.C., Campling B.G., Atlaw T., Kozbor S.f Roder J.C. Human monoclonal antibodies Mol. and Cell Biochem., 1984, v.62, p.109-120.

67. Steinetz M., Klein E. Human monoclonal antibodies produced by immortalization with Epstein-Barr virus.- Immunol.Today, 1981, v.2, p.38-39.

68. Kozbor D., Roder J.C. Requirements for the establishmentof high-tltered human monoclonal antibodies against tetanus using the Epstein-Barr virus technique.- J. Immunol., 1981, v.127, p.1275-1280.

69. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием,иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами.- М.: Наука, 1983, с.269-297.

70. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A. The enzyme linked immunosorbent assay. London, 1979»

71. Wilson M., Nakane P.K. Immunofluorescence and related techniques. Ed. by Knapp W. et al. Elsevier, Holland, 1978.

72. Stendhal S., Soini E. New trends in non-isotopic immonoassays.-In: Progress in bioorganic chemistry and molecular biology. Ed. by Yu.A.Ovchinnikov, Elsevier, 1985, p.463-468.

73. Лефковитс И. Методы исследований в иммунологии.- М.: Мир, 1981.

74. Hudson L., Hay F.C. Practical immunology. Oxford, 1980.

75. Garvey J.C., Gremer N.E., Sussdorf D.H. Methods in immunology. Ed. by W.A. Benjamin, M.A.Reding, 1977.

76. Langone J.J. Use of labeled protein in a quantitative immunochemical analysis of antigens and antibodies.- J. Immun; Meth., 1982, v.51, p.3-22.

77. Bio-Rad Laboratory: chromatography, electrophoresis, immu-nochemistry and HPLC, 1984, p.43-45.

78. Klausner A. Monoclonal markers upping production, vying for new contracts.- Biotechnology, 1983» No.11, p.736-740.

79. Microcarrier cell culture: principles and methods.-Pharmacia, Sweden, 1981.

80. Sohansson ,A., Nielsen V. Biosilon: a new microcarriers.hVi

81. Y General meeting of Esact, Oxford, 1979. Develop. Biol. Standard, 46, p.125-129.

82. Morrison S.L., Johnson M., Herzberg L.A., Oi V.T. Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains.- Pros.Nat. Acad. Sci., 1984, v.81, p.6851-6855.

83. Shively J.Cloning and expression of functional antibody molecules in E-coli.- Gell, in press.

84. Sasson A. Biothechnologies: challenges and promises. UNESCO, 1984, p.97-109^- 109

85. Burerley P.C.L. Hybridomas, monoclonal cells and analysis of the immune system.-Brit. Med. Bui., 1934, v.40, p.213-217.

86. Brodsky P.M., Parham P. Evolution of HLA antigenic determinants: species cross-reactions of monoclonal antibodies.-Immunogenetics, 1982, v.15, p .151-166.

87. Parham P. Changes in conformation with loss of alloanti-genic determinants of a histocompatibility antigen (UCA-B7) induced by monoclonal antibodus.- J. Immun., 1984, v. 132, N0.6, p.2975-2983.

88. Diamond A.G., Butcher G.W., Howard J.C. Localized conformational changes in A class.I.major histocompatibility antigen by the binding of monoclonal antibodies.- J.Immun., 1984, v.132, n0.3» p.1169-1175.

89. Kohno Y., Berkower J., Minna J., Berzofsky J.A. Idiotypes of antimyoglobin antibodies: shared idiotypes among monoclonal antibodies to distinct determinants of sperm-whale myoglobin.- J. Immun., 1982, v.128, p.1742-1752.

90. Miller A., Cling L.-K., Benjamin C., Sercarz E., Brodeur P., Riblet R. Detailed analysis of the public idiotype of anti-hen egg-white lysozyme antibodies.- Ann. N.I. Acad. Sci., 1983, v.418, p.140-159.

91. Hammerling G.J., Rusch E., Tada N., Kimura S., Hammerligg U. Localization of allodeterminants on H-2Kb antigens with monoclonal antibodies and H-2 mutant mice.- Proc. Nat.

92. Acad. "Sci, 1982, v.79, p. 4757-4741.

93. Pillemer E., Weissman I.L. A monoclonal antibody that detects a Vic TEPC - 15 idiotypic determinant cross-reactive with, a Thy-1 determinant.- J.Exp.Med., 1981,v.153, p.1068-1072.

94. Lane D., Kaprowski H. Molecular recognition and the future of monoclonal antibodies.- Nature, 1982, v.296, v.296,p.200-203.

95. Dulbecco R. Cross-reactivity between Thy-I and a component of intermediate filaments demonstrated using a monoclonal antibody.- Nature, 1981, vol.292, p.772-778.

96. Berzofsky &.A., Schether .A.N., The concept of cross^reac-tivity and-specificity in immunology.- Mol. Immunol., 1981, vol.18, p.751-763.

97. Talmadge D. Immunological specificity.- Science, v.129» p.1643-1648.

98. Глинн JI., Стьюарт M. Структура и функции антител. М.: Мир, 1983, с.103-109.

99. Nelson D.R., Robinson N.C. Membrane proteins: a summary of known structure information.- Meth. Enzym., 1983, v.97, p.571-618.

100. Henderson R. The purple membrane from H.Halobium.- Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 1977, v.6, p. 87-100.

101. Ovchinnikov Yu.A. Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure function relationships.- FEBS Lett., 1982, v.148, p.179-191.

102. Dencher N.A. et al. The five retinal-protein pigments of halobacteriai bacteriorhodopsin, halorhodopsin, p565, p370 and slow-cycling rhodopsin.- Ehotochem. and Ehotobiol., 1983, v.38, p.753-767.

103. Henderson R., Unwin P.N.T. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy.- Nature, 1975» v.154, p.501-514.

104. Ovchinnikov Yu.A., Abdulaev N.G., Feigina M.Iu., Kiselev A.V., Lobanov N.A. The structural basis of the functioning of brs an overview.- FEBS Lett., 1979, v.100, p.219-224.

105. Khorana H.G., Gerber G.E., Herling W.C., Gray C.P., Anderegg R.I., Nihey K., Biemann K. Aminoacid sequence of "bacteriorhodopsin.- Proc. Nat. Acad. Sci., 1979»v.76, p.5046-5050.

106. Ovchinnikov Yu.A., Abdulaev N.G., Kiselev A.V. Bacteriorhodopsin topography in purple membrane.- Biological Membranes, 1984, v.5, p.197-220.

107. Киселев А.В. Изучение топографии бактериородопсина в пурпурной мембране. Автореферат дис. на соискание уч. ст. канд. хим.наук. М. :ИБХ им. М.М.Шемякина АН СССР, 1981.

108. Ovchinnikov lu.A., Abdulaev N.G., Feigina M.Yu., Kise-lev A.V., Lobanov N.A. Recent findings in the structure-functional characteristics of bacteriorhodopsin.- FEBS Lett., 1977, v.84, No.1, p.1-14.

109. Gerber G.E., Gray C.P., Wildenauer D., Khorana H.G. Orientation of BR in H.H. as studied by selective proteolysis.» Proc. Nat. Acad. Sci., 1977, v.74, p.5426-5450.

110. Katre N.V., Stoud R.M. A probable linking sequence between two transmembrane components of br.- FEBS Lett., 1981,v. 156, p.170-174.

111. Lemke H.-D., Bergmeyer J., Straub J., Oesterhelt D. Reversible inhibition of the proton pump bacteriorhodopsin by modification of tyrosine 64,- J.Biol.Chem., 1982, v.257, p.9584-9588.

112. Kimura T. , Mason L., Khorana H.G. Immunological probes for bacteriorhodopsin.- J. Biol.Chem., 1982, v.257,p.2859-2867.

113. Oesterhelp D., Stoeckenius W. Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium.-Nature (New Biol.), 1971, v.233, p.149-152.

114. Abdulaev N.G., Ovchinnikov Yu.A. Some approaches to determining the primary structure of membrane proteins.

115. Meth.Bnzymol•, 19S2, v.88, p.723-729.

116. Цетлин В.И., Закис В.И., Алдашев А.А., Курятов А.Б., Овечкина Г.В., Шныров В.Л. Топография витинил связывающего участка в восстановленных производных бактериородопсина.- Биоорган.химия, 1983, т.9, с.1589-160S.

117. Gerber G.E., Anderegg R.G., Herling W.C., Gray С.P.,

118. Khorana H.G. Partial primary structure of bacteriorhodo-psinî sequencing methods for membrane proteins.- Proc. Nat. Acad. Sci., 1979, v.76, p.227-231.

119. Carraway K.L., Koshland D.E. Garbodiimide modification of proteins.- Meth. Enzym., 1972, v.23, p.616-662.

120. WangT.T., Young N.M. Modification of aspargtic residues to induce trypsin cleavage.- Anal. Biochem., 1978, v.91, p. 696-699.

121. Pontana A. Modification of tryptophan with BNPS-Skatole (2-2Nitrophenylsulfenyl)-3 methyl-3-bromandolenine.

122. Meth. Enzymol., 1972, v.25, p.419-423.t

123. Курятов А.Б., Овечкина Г.В., Аленычева Т.Н., Минаева Л.П., Цетлин В.И. Биосинтетические и 14С-производные бактериородопсина.- Биоорган, химия, 1984, т.10, с.333-340.

124. Herbert W.J. Handbook of experimental immunology. Ed. by D.M.Weir. Oxford, London, Edinburgh, Melbourne, 1978. V.3. Appendices 3. Mineral-oil adjuvants and the immuni -zation of laboratory animals.

125. Kearney J.F., Radbruch A., Liesengang В., Rajewsky K,

126. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines.- J.Immunol., 1979» v.123, p.1548-1550.

127. Адаме P. Методы культуры клеток для биохимикатов. М.:1. Мир, 1983, с.74-87.

128. Littlefield J.W. Selection of hybrids from matings offibroblasts in vitro and their presumed recombinants.-Science, 1964, v.145, р.709-7Ю.

129. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983, с.240-252.

130. Mishel В.В., Shiigi S.M. Selected methods in cellular immunology.-W.H.Freeman & Co., San Francisco, 1979, Chap. 17, p.15-19.

131. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, Иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983, с.365-381.

132. Gregory N.Warr. Antibody as a tool. Ed. by J.Marchalonis and G.Warr. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore, 1982, p.48.

133. Tung A.S., Sato S., Nisonoff A. Production of large amounts of antibodies in individual mice.- J. Immun., 1976, v.116, p.676-681.

134. ЛефковитсИ., Пернис Б. Методы исследований в иммунологии.1. М.: Мир, 1981, с.66-74.

135. March. Е. A simplified method for cyanogen bromide activation of agarose for affinity chromatography.- Anal. Biochem., 1974, v.60, p.149-152.

136. Лефковитс И. Методы исследований в иммунологии. М.:1. Мир, 1981, с. ,95«П9.

137. Winter А., Ек К., Anderson U.V. LKB application . 1977, Note 250.

138. Ouchterlony Ô'. Progress in allergy. Ed. by Kallos P. Basel, 1958, v.5, p.1-78.

139. Steinetz M., Klein E. Human monoclonal antibodies produced by immortalization with Epstein-Barr virus.- Immunol. Today, 1981, v.2, No.2, p.215.

140. Van Weemwn B.K., Schuurs A.H.W.M. Immunoenzymatic techniques. INSERM Symposium 2. Ed. Feldman.- Publ. North Holland Publishing Co., Amsterdam, 1976.

141. Лефковитс И. Методы исследований в иммунологии. М.: Мир, 1981, с.12-57.

142. Blayrock А.Е., Scherphof G.L. Structure of cell envelope of H.halobium.- J. Cell Biology, 1976, v.71, p.1-22.

143. Steitz T.A., Goldman A., Engelman D.M. Quantitative application of the helical hairpin hypothesis to membrane proteins.- Biophys.J., 1982, v.37, p.124-125.

144. King G.I., Spoekenius W., Crespi J.L., Shoenbrorn B.P. The location of retinal in the purple membrane profileby neutron defraction. J.Mol.Biol., 1979, V.1J0, p.395-404.

145. Konyma T.K., Kinosita J.R., Ikigami A. Fluorescent energy transfer studies of transmembrane location of retinal in purple membrane. J.Mol.Biol., 198$, v.165, p.91-107.

146. Hung K.S., Radhakrishnan R., Bayley H., Khorana H.G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. J.Biol.Chem., 1982B, v.257, p.13616-1$623.

147. Beiseler B., Prinz H., Beyrenther K. Topological studies of Lactose Permease of Escherichia coli by protein sequence analysis. EMBO J. (in press).

148. Laver W.G., Air G.m., Webster R.G. Mechanism of antigenic drift in influenza virus. Amino acid sequence changes in an antigenically active region of Hong Kong (H3N2) influenza virus haemagglucinin. J.Mol.Biol., 1981, v.145,p.339-352.