Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства возбудителей парамиксовирусной инфекции птиц второго серотипа

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства возбудителей парамиксовирусной инфекции птиц второго серотипа"

ч-

#

^ МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

% И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

На правах рукописи

РУКАВИШНИКОВ Андрей Владимирович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ПАРАМИКСОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПТИЦ ВТОРОГО СЕРОТИПА

03.00.06— вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1994

Работа выполнена в лаборатории контроля н стандартизации препаратов, применяемых в птицеводстве Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации

доктор биологических наук В. А. Лукина (РНИиТИБП) кандидат ветеринарных наук 3. Я. Чистова (ВГНКИ)

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства (ВНИВИП).

Защита диссертации состоится « » "д<5/¿а-Ё^Я 1994 года в Щ часов на заседании диссертационного совета Д 120.85.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

Адрес: 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук В. И. Смоленский Официальные оппоненты:

Автореферат разослан

1994 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат ветеринарных наук

Ю. А. Козырев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблеем. Парамиксовирусы (ГШ) птиц - достаточно многочисленная, но сравнительно малоизученная группа вирусов. В настоящее время представители ее объединены в 9 серологических вариантов, которые являются возбудителями заболеваний домашних, синантропных и диких птиц. Наиболее часто в птицеводческих хозяйствах регистрируют энзоотии, вызываемые парачиксо-вирусами 1-3 серотипов. Однако наименее изученным среди этих вирусов оказался парамиксовирус второго серотила (ГШ-2)

(D.J.Alexander, 1506, 1987).

ПМВ-2 изолирован во многих странах мира, в том числе и в СНГ. Сведения, указывающие на широкое распространение парамик-совируса 2-го серотила, главным образом, основаны на данных зарубежных авторов (51. A. Lipkir.d et al, 1981, 1982; И. J. Alexander, 1980, 1982; II-XJalcobl, 1982; B.Andral et al, 1984; E.:rbuqua et

al, 1985; J.X.LeOros, ISS6; B.B.Gooman et al, less). Отечественные публикации о выделении ПШ-2 единичны и не отражают широты его распространения в птицехоэяйствах России и других госу -дарств содружества (В.А.Исаченко с соавт., 1975; Н.Г.Осидзе с соавт., 1990; М.А.Яхно с соавт., 1990; В.А.Тер-Погосян, 1992).

Имеющиеся данные иностранной литературы не дают полной информации о культурадьнкх, антигенных, патогенных, физико-химических свойствах вируса, а иногда содержат противоречивые сведения. Так, например, недостаточно освещена возможность культивирования ПМВ-2 в первичных культурах клеток эмбрионов птиц, .^¿алоизу-чена устойчивость этого вируса к действию разных температур. Неоднозначны сведения об антигенной изменчивости ПМЗ-2, хотя предполагается, что в современных условиях происходит антигенный дрейф HJf-гликопротеида, обусловливающий возникновение нобых

эпизоотических вариантов вируса ( и.А.ЫрЫпй еъ а1, 1986 ). Окончательно не решен вопрос о патогенности ПМВ-2 и не определена его роль в инфекционной патологии птиц. Публикации отечественных исследователей, посвященные решению этих проблем, практически отсутствуют. Лабораторная диагностика ПМВ-2 инфекции в нашей стране находится в стадии научных изысканий, а мероприятия по борьбе не разработаны.

В этой связи, представляет большой практический и научный интерес изучение биологических свойств ЛМ8-2, его роли в инфекционной патологии птиц, изыскание простых в исполнении методов диагностики и разработка мер борьбы с данной инфекцией. .

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлось определение широты распространения ПМВ-2 в птицехозяйствах России и других стран СНГ, изучение основных биологических свойств выделенных изолятов, изыскание оптимального метода диагностики ПМВ-2 инфекции и разработка мероприятий по борьбе с этим заболеванием.

Исходя из этого были поставлены следующие задачи:

- определить широту распространения ПМВ-2 путем серологического обследования поголовья птицехозяйств различных регионов СНГ;

- провести направленные вирусологические исследования пат-материала от больных и павших птиц из различных регионов СНГ для вццеления изолятов ГШВ-2;

- изучить основные биологические свойства выделенных изолятов ПМВ-2 в сравнении с эталонным штаммом;

- изучить роль ПМВ-2 в инфекционной патологии птиц; изыскать оптимальный метод детекции - идентификации

П'3-2, организовать производство диагностического набора для использования в ветеринарной практике;

- разработать проект "Временной инструкции о мероприятиях по борьбе с ПМВ-2 инфекцией птиц".

Научная новизна. Научная новизна работы заключается в следующем:

1. Впервые установлена циркуляция ПМЗ-2 в птицехозяйствах Ставропольского края, Липецкой, Псковской, Орловской, Рязанской, Пензенской областей России и Таджикистане.

2. Впервые на территории СНГ ввделен юкейпалодобный вирус от домашних уток.

3. Показано близкое антигенное родство итаммов ПШ-2, выделенных от кур, индеек и уток в различных регионах СНГ, по отношению к эталонному Цыпленок/Калифорния/Юкейпа/56 и отечественному Курица/СССР/1/86 штаммам.

4. Получены новые данные по ряду биологических свойств ПМЗ-2: спектру гемагглютинирующей активности, ингибиторочувствительности, устойчивости к действию некоторых физико-химических факторов и патогенности.

5. Впервые получены данные о неспецифической резистентности птиц при экспериментальном заражении ПШ-2 и установлена его роль в инфекционной патологии птиц.

6. Показала возможность использования фильтрационно-хрома-тографической технологии на отечественном оборудовании для концентрирования и очистки ПМВ-2.

Практическая значимость. На основании результатов вирусологических и серологических исследований, данных изучения антигенных свойств ПМВ-2 предложена модификация существующего "Набора для выявления и идентификации парамиксовирусов птиц в РТГА" и организовано его серийное производство. От ветеринарных специализированных лабораторий по болезням птиц, в которых применялся

модифицированный диагностикам, получены положительные отзывы об активности, специфичности и возможности использования его компонентов для идентификации вщслешшх изолятов и выявления антител к ЛМВ-2 в сыворотках крови.

В соответствии с предложенной модификацией внесены дополнения и изменения в технические условия и инструкцию по изготовлении и контролю "Набора для выявления и идентификации парамиксо-вирусов птиц в РГГА" и составлено новое наставление по применению данного диагностикума, утвержденное Департаментом ветеринарии 25.03.1994 г. № 19-4-06/166.

Разработан проект "Временной инструкции о мероприятиях по борьбе с ПШ-2 инфекцией птиц" и представлен на утверждение в Департамент ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на ХШ научной конференции молодых ученых Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (1992); на семинаре ветеринарных врачей в Республиканской научно-производственной ветеринарной лаборатории (1992); на заседаниях Ученого совета и проблемно-методических комиссий ВП1КИ . (1991-1994).

Публикации. Но теме диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Объем и структура диссертация. Диссертация изложена на {¿О страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы и практические предложения. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 15 рисунками. Список литературы содержит 156 источников, в том числе

' 108 иностранных. Приложение на З-Ь страницах:.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. Сбор материала для вирусологических и серологических исследований проводили в птицехозяйствах Московской, Тульской, Орловской, Псковской, Липецкой, Рязанской, Архангельской, Куйбышевской, Пензенской областей, Краснодарского и Ставропольского краев и Таджикистана.

Кроме того, в работе использовали: вирус ньюкаслской болезни из штамма "Ла-Сота", эталонный штамм ПШ-2/Цьпленок/Калифорния/ Юкейпа/56 (Юк/56), эпизоотический штамм ПШ-2/Курица/СССР/1/8б (Бр-86), а тагосе изоляты ПМВ-2, ввделекные ранее в Московской и Тульской областях - Курица/СССР/3/90 (Бр-90) и Цылленок/Ёфремово/ 4/90 (Ефрем/90), которые были получены из музея вирусов лаборатории контроля и стандартизации препаратов, применяемых в птицеводстве вгнки.

Выделение вирусов проводили на 9-10-дневньгх эмбрионах кур.

Гемагглютинирующую активность выделенных изолятов определяли в реакции гемагглютинации (РГА) микрометодом с 0,7 % взвесью эритроцитов петуха.

Идентификацию изолированных гемагглютинирующих агентов проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием набора сывороток для лабораторной диагностики гриппа птиц 1-13 серотипов Покровского завода биопрепаратов и референс-сыво-роток к штаммам ПМВ птиц 1-4 и 6-9 серотипов.

РТГА выполняли микрометодом с рабочей дозой антигена 8 агглютинирующих единиц и 0,7 % взвесью эритроцитов петуха. Для устранения неспецифических ингибиторов используемые сыворотки крови обрабатывали нейраминидазой нехолерных вибрионов Горьковс-

_ б -

кого НИИЭМ.

Электронно-микроскопическое исследование проводили методом негативного контрастирования с использованием микроскопа хе:-100 СХ11 при инструментальном увеличении х 40000-112000.

Электрофорез белков осуществляли по методу и.ЬаептП ¡1970) в 10 % полиакриламидном геле (ПАР) с использованием трисглици-новой системы.

Концентрирование вируса проводили методом ультрафильтрации. Полученный концентрат очищали хроматографией на химически модифицированных макропористых стеклах (ШС-ПВП-2000 В).

Содержание общего белка определяли спектрофотометрически.

Гипериммунные сыворотки к исследуемым штаммам получали путем двукратной иммунизации белых крыс и кроликов очищенным и концентрированным вирусным материалом.

Инфекционную активность штаммов ПМЗ-2 устанавливали путем титрования на 9-10-дневных эмбрионах кур. Инфекционный титр подсчитывали по методу Г.Кербера в модификации И.П.Ашмарина (1961) и выражали в ЭДДздд^д у^.

Способность к репродукции при различных условиях инкубации определяли путем инфицирования 9-10-дневных эмбрионов кур 10-кратными серийными разведениями вируса исследуемых штаммов с' последующим инкубированием при 28; 37 и 40 °С в течение 72 часов и при 37 °С в течение 48-120 часов.

При изучении культуральных свойств ПМЗ-2 были использованы монослойные первичные культуры клеток куриных, утиных и перепелиных фибробластов. Чувствительность той или иной культуры клеток -к вирусу определяли по уровню накопления в ней гемагглотини-нов и наличии цитопатического действия (ЦОД).

Спектр гемагглвтинирувдей активности изучали в РГА с I %-

ной взвесью эритроцитов петуха, голубя, утки, быка, лошади, кролика, барана, морской свинки, белой мыши, кошки, собаки.

Ингибиторочувствительность проверяли в РТГА с нормальными сыворотками лошади, быка, барана, кролика, белой крысы, морской свинки и кур.

Чувствительность к хлороформу изучали ПО методу а.МауеГ и K.Bogel (1961), к эфиру Hovozzo и С.Бигке (1973). Устойчивость к рН 3,0 и рН 10,0 в течение 4 часов при 4 ЭС определяли титрованием на 9-дневных эмбрионах кур.

Термостабильность штаммов ПМВ-2 устанавливали путем оценки термоустойчивости вирусных гемагглютининов и инфекционных свойств. Термоустойчивость вирусных гемагглютининов устанавливали по титру в РГА после прогревания при 56 °С через каждые 15 минут в .течение

2-х часов и при 37 °С в течение 331 дня. Терморезистентность инфекционных свойств определяли титрованием на куриных эмбрионах вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости (ВЭЮ исследуемых штаммов после предварительного прогревания при 56 °С в течение 30, 45, 60, 90, 105, 120 минут и при 37 °С в течение 1-7 суток

и 222 дней.

Гемолитическую активность определяли методом, описанным Е.А.Говорковой с соавт. (1989).

Ферментативную активность оценивали по показателям сорб-ционно-элшрущей и нейраминидазной активностей. Сорбцию проводили на формалинизированных эритроцитах петуха, приготовленных по методу Т.Баррет и С.Инглис (1988), при +4 °С в течение I; 2;

3-х часов. Элюцил в буферный физиологический раствор (рН 7.2 -7,4) осуществляли при 37 °С в течение 3 часов,

Нейраминидазную активность определяли по методу D.Aainoff (1961), используя в качестве субстрата фетуин.

Патогенность вируса для эмбрионов кур устанавливали путем заражения их в аллантоисную полость с последующим инкубированием до вывода цыплят; для 30-дневных цыплят - разными дозами и способами инфицирования. Интрацеребральный индекс патогенности (ЩИП) определяли по методу, описанному для ВНЕ (З.Дярски, 1980). Совместное течение ПМВ-1 и ПМВ-2 инфекций изучали путем заражения 30-дневных цыплят внутримышечно смесью соответствующих изолятов.

В качестве показателей естественной резистентности выбраны активность лизоцима - по В.Г.Дорофейчуку в модификации ВНИВИП (1980); бактерицидная активность - по О.В.Смирновой и Т.А.Кузьминой (1966) в модификации Н.Н.Максимюка (1993).

Технологическая схема и??отовления набора для диагностики ПМВ-2 инфекции включала ряд этапов:

- получение инактивированного антигена (получение ВЭ5К инфицированных эмбрионов кур 9-10-дневного возраста после 72-х часовой инкубации, инактивацию вируса димерэтиленимином, контроль полноты его инактивации, активности и стерильности антигена, лиофнлизацию проводили общепринятыми методами);

- получение специфической сыворотки к ПШ-2 от кроликов, иммунизированных очищенным и концентрированным вирусным материалом, контроль активности, специфичности, стерильности и лиофилизацию;

- комплектование набора. '

При анализе и обобщении результатов исследований использовали методы статистической обработки, общепринятые в биологии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение и идентификация изолятов ПШ-2. За период с 1991 по 1993 гг. было вццелено в различных регионах России и Таджикис-

тане 38 гемагглютинируюцих изолятов, из которых при идентификации 14 отнесены к ГШ-1, 17 - к ПМВ-2, I - ортомиксовирусам, а б - представляли собой рекомбинантные изоляты с антигенными детерминантами к ПМЗ-2 и вирусу ньюкаслской болезни.

Изоляты ПМВ-2 были Еыделены от кур, индеек и уток, а рекомбинантные, в основном, от кур. Вирус был изолирован от птиц старше 20-дневного возраста, преимущественно в осенне-зимний период.

В результате проведенных вирусологических исследований впервые установлена циркуляция ПШ-2 в Липецкой, Псковской, Орловской областях, Ставропольском крае, Таджикистане и подтверждена в Московской и Тульской областях.

Для дальнейших исследований нами было отобрано 9 изолятов из разных мест вццеления.

Широкое распространение ПМВ-2 инфекции на значительной территории СНГ показало исследование 2673 проб сывороток крови. Специфические антитела были обнаружены в 25,8-100,0 % проб сывороток крови птиц из Рязанской, Псковской, Московской, Пензенской, Тульской областей, Ставропольского края и Таджикистана со среднегеометрическим титром - 3,1-5,3 1ов*\ В сыворотке крови птиц из Крымской (Украина), Свердловской, Архангельской и Куйбышевской областей антител к ПШ-2 не выявлено.

При изучении частоты выявления специфических антител в полевых сыворотках к различным штаммам II;,13-2 установлено, что к отечественному штамму Бр-86 были обнаружены антитела в более высоких титрах и на II % больше, нежели к эталонному Юк/56.

Во всех 2673 пробах сывороток крови также определяли наличие антител к ПМВ птиц других серотипов. В результате были обнаружены только поствакцинальные антитела к вирусу ньюкаслской болезни. Антител к ПМЗ-З; 4; 6-9 не выявлено.

Изучение способности ПМВ-2 к репродукции в эмбрионах кур при различной температуре их инкубирования показало, что все исследованные штаммы активно размножались при температуре 37 °С в инфекционных титрах 6,5 - 8,25 ЮИД^/р j. При температуре 28 °С штаммы Ш<1В-2 практически не репродуцировались или имели очень низкую инфекционную активность - 1,0 - 4,0 1в ЭИДздд) j. При повышенной температуре (40 °С) размножение штаммов наблюдалось в титрах на 0,25 - 1,5 ig ЭВДзд выше, чем при температуре 37 °С.

Установлено, что наибольший выход вируса обеспечивали заражающие дозы Ю4»0 ЭЭДдц/од и I03»0 ЭЗД^/дд при 37 °С инкубирования инфицированных эмбрионов в течение 72 и 96 часов соответственно. При этом гемагглютинирующая активность штаммов достигала 7-9 log2, а инфекционная - не менее IО6,0-8,0 ЭИД^Д),!.

Все исследованные штаммы размножались в культуре куриных и перепелиных фибробластов. Максимальный выход вируса по данным РГА отмечался на 4-6 сутки культивирования. ГА-титр штаммов ПМВ-2 в культуральной жидкости был значительно ниже (2,2 -6,3 log2), чем в экстразмбриональной жидкости эмбрионов кур (6,98,5 1о£^). На размножение вируса также указывало цитопатическое действие, которое проявлялось через 48-96 часов после инфицирования указанных культур клеток. ЦОД характеризовалось наличием синцитиальных образований и цитоллазматичееких включений. При использовании культур фибробластов эмбрионов уток штаммы ПМВ-2 не размножались и цитопатаческий эффект отсутствовал.

При концентрировании 7 штаммов ПМВ-2 в Ю раз содержание гемагглютинина в вирусном концентрате по данным РГА не соответствовало кратности концентрирования, а содержание белка составило 12,8 - 29,8 % от исходного. В результате проведения хроматографии получены очищенные концентраты вирусных суспензий, освобож-

денные от балластных белков на 92,5+2,9 % с сохранением ГА-активности на 67,2+28,5 %.

Морфология и структура. Исследованные штаммы ПМВ-2 имели сходные морфологические признаки. Вирионы представляли собой полиморфные частицы, размер которых составлял 120-180 нм и более. У большинства штаммов выявлено наличие нитевидных форм длиной до 1000 нм.

Сравнительный анализ электрофоретической подвижности структурных полипептидов штаммов Юк/56, Бр-86 и Голиц/92 показал, что они имели сходные, но не идентичные профили. Основные отличия между штаммами обнаружены в белковых фракциях с молекулярными массами 40-41; 58-60 и 72-75 кДа, которые соответствовали гли-копротеиду НУ и белкам У и М. .

При изучении спектра гемагглютинирующей активности установлено, что различные штаммы ЛМВ-2 способны агглютинировать эритроциты нескольких видов животных и птиц. Наиболее высокие гемагглю-тинируодие титры получены с эритроцитами птиц (петуха, утки, голубя) , собаки и морской свинки. Несколько ниже эти показатели были с эритроцитами белой мыши и барана. С эритроцитами кролика вирус проявил низкую активность. Все штаммы проявляли сходную активность к каждому виду эритроцитов, за исключением эритроцитов барана и кролика (некоторые штаммы их не агглютинировали). Исследованные штаммы ПМВ-2 не взаимодействовали с эритроцитами лошади, быка и кошки.

Изучение антигенных взаимоотношений 13 штаммов ПМВ-2 в перекрестной РТГА показало, что штаммы, выделенные на территории СНГ, представляли собой довольно однородную группу вирусов. Однако в антигенной структуре гемагглютинина некоторых штаммов были выявлены различия (Р<С0,05).

Для более полной характеристики взаимоотношений между свежевьщеленными, ранее изолированными и эталонным штаммами бы- -ла рассчитана степень их антигенного родства по формуле «Г.Агс1ге(;и и Р.Ь.Ногз1а11 (1950). При этом все исследованные штаммы по отношению к эталонному Юк/56 и отечественному Бр-86 штаммам оказались близкородственными с антигенным родством 70,9 - 100,0 %. Аналогичное родство проявило большинство вццеленных нами штаммов между собой, однако некоторые из них (Ефрем/90, № 6, Голиц/92, Липецк/91 и Липецк/92) значительно отличались друг от друга. Так, например, антигенное родство штаммов Липецк/91 и Липецк/92, изолированных в Липецкой области от кур в 1991 и уток в 1992 годах, составило 70,9 %, а их однородность с другими штаммами - 50 -100 %. Оригинальными являются штаммы Голиц/92 и № 6, проявившие до 64,3 % различий между собой и со штаммами ПМВ-2, использованными при изучении антигенных свойств (табл. I).

Таблица I

Антигенное родство между штаммами ПМВ-2, изолированными на территории СНГ

Штаммы

! Степень } Iантигенного ! ! родстьа,г !

Антигенное родство (%)

1. Бр-90 и Ефрем/90

2. Бр-90 и № 6

3. Ефрем/90 и № б

4. Ефрем/90 и Голиц/92

5. № б и Липецк/91

6. 1? 6 и Голиц/92

7. Липецк/92 и Голиц/92

8. Липецк/92 и Липецк/91

9. Лкпецк/91 и.Голиц/92

1,00 1,41 2,00 1,41 2,00 2,80 2,00 1,41 1,00

100,0 70,9 50,0 70,9 50,0 35,7 50,0 70,9 100,0

Ингибитоэочурстеитёльность. Все исследованные штаммы ПМВ-2

были резистентны по отношению к ингибиторам нормальных сывороток кур, барана и быка. Чувствительность штаммов к термолабильным и термостабильным ингибиторам нормальных сывороток лошади, кролика, белой крысы и морской свинки проявилась в разнообразных вариациях, что указывает на штамловые различия.

Устойчивость к действию некоторых физико-химических факторов»

Все штаммы, использованные в опыте, были чувствительны к действию эфира, хлороформа, рН 10,0 и устойчивы к рН 3,0 (Р<0,05).

При изучении влияния температуры 37 °С на термостабильность ПМВ-2 установлено, что в течение I суток инфекционный титр снизился более чем на 1,0 ig ЗЦЦ^д у четырех из восьми исследованных штаммов (Бр-66, Псков, Липецк/91 и № 6). Через 7 суток было отмечено снижение инфекционной активности на 3,5 - 5,0 le ЭИД^д у всех штаммов. Через 222 дня низкую инфекционную активность, которая была обнаружена только в неразведенной ВЭЖ, сохранили 2 штамма (Ек/56 и Бр-86). Гемагглютинин тестированных штаммов ШВ-2 при тех яе условиях отличался большей стабильностью. Гемагглюти-нирующий титр большинства штаммов при 37 °С в течение 331 дня снизился незначительно, и лишь некоторые штаммы (Д П, Д И, Псков) за указанный срок полностью потеряли свою активность (рис.1).

На основании данных изучения термоустойчивости вирусных гемагглютининов при температуре 56 °С, исследованные штаммы ПМВ-2 разделены на термостабильные и термолабильные. Гемагглютинин термолабильных штаммов ведерживал прогревание до 60 минут, а термостабильных - до 105 минут (таблица 2). При этом инфекционная активность всех штаммов снижалась одновременно с гемагглю-тинирующей и, при полной потере последней, улавливалась только в неразведенной ВЭЖ.

Ч* 9,0

о •

* 6.0 £

■

й 6,0

5,0 .4,0

3,0

2,0;

1.0

ЩШ шш

I

0 209 331

РисЛ. Влияние температуры 37 °С на гемагглютинируюиую активность штаммов ПМВ-2

- Юк/56, Бр-8б, Бр-90, Ефрем/90, Д I, »6, Липецк/91, Липецк/92;

- Д П, Псков; - Д И.

прогревание (дней)

Таблица 2

Термоустойчивость вирусных гемагглютининов штаммов ПМВ-2 при температуре 56 °С (Т^-признак)

! Устойчивость гемагглютининов после Штаммы ' прогревания в течение (минут)

!~15 7 30 !~45 7 60~1~75 Т 90~1 ~105~1 _120"

Бр-90

Бр-86, Д I, Чех/92 Юк/56, Голиц/92 . Ефрем/90 Д П, Псков Липецк/91, Липецк/92 » 6

"+" - наличие гемагглютинации; - отсутствие гемагглютинации.

Все штаммы обладали гемолитической активностью по отношению к эритроцитам курицы и морской свинки в широком диапазоне рН и различались по интенсивности гемолиза. Эритроциты морской свинки были более чувствительны к лизису штаммами ЛМВ-2. С обоими видами эритроцитов было отмечено два рН-оптимума активности: в области кислых и нейтральных значений.

. Ферментативная активность. При изучении сорбционно-элюируя-щей активности установлено, что штаммы ПМВ-2 обладали высокой сорбционной способностью и полностью адсорбировались на формали-низировакных эритроцитах петуха в течение I часа. По скорости элю-ции штаммы были условно разделены на быстроэлюирующие (Юк/56, Бр-90, Д I, Ефрем/90, № 6, Липецк/92), характеризующиеся 100 % десорбцией в течение 3 часов и медленноэлюирующие (Бр-86, Д П,

Д Ш, Псков, Липецк/91, Чех/92, Голиц/92), чья элюирующая активность через 3 часа составила 6,25 - 50,0 %.

Опт!«!ум рН нейраминидазной активности исследованных штаммов был неодинаков и колебался в пределах 4,2 - 5,4. Диапазон инактивации 50 % ферментативной активности выделенных нами штаммов (Псков, Липецк/92, Голиц/92) был расширен по сравнению с этим же показателем для эталонного Юк/56 и отечественного Бр-86 штаммов за счет сдвига рН в кислую сторону.

Изучение патогенных свойств 13 штаммов ПМВ-2 для эмбрионов кур показало сходные результаты. Специфическая гибель зараженных эмбрионов в течение 72 часов после инфицирования наблюдалась редко и варьировала от 0 до 15,5 С увеличением срока инкубации возрастал процент гибели омбрионов. К моменту вывода цыплят (12-й 'день инкубации после заражения) живыми оставались 40 70 % эмбрионов, а выводимость составляла 10-30/6, тогда как в контроле выживало 90 % эмбрионов и выводимость составляла 80 %. При инфицировании эмбрионов ПМВ-2 в дозе 6,5 - 7,5хе ^50/0,1 все выведенные цыплята погибали в первые трое суток жизни, а при заражении в дозе 3,5 1в ЭЦЦздД) ^ - выживало 66,7 % цыплят. В контрольной группе гибели цыплят в течение 15 дней не наблюдали.

Для 6-ти штаммов бьши определены ИЦИП (Бр-86 - 0,66; Голиц/ 92 - 0,56; Бр-90 и Псков - 0,48; Юк/56 - 0,36; Липецк/92 - 0,00). На основании полученных данных исследованные штаммы были условно разделены на патогенные и апатогенные (ИЦИП - 0,00).

Инфицирование 30-дневных цыплят внутримышечно, внутривенно, интратрахеально и перорально различающимися по ИЦИП штаммами Липецк/92 (апатогенным) и Голиц/92 (наиболее патогенным среди ввде-денкьгх нами штаммов) не вызывало клинических проявлений заболевания в течение 14 дней, но индуцировало выработку гуморальных анти-

2 " ? тел в титрах 5,9+1,0 юе ~ 7,9+0,9103 . Антигемагглютинины

были также обнаружены в сыворотке крови незараженных цыплят, пол-

саженных к опытным группам, в титрах 4,3+0,4 В сыворотке

крови птиц контрольной группы антитела к ПМВ-2 отсутствовали.

Отсутствие клинических проявлений у цыплят 30-дневного возраста при экспериментальном инфицировании указывает на то, что случаи ьццеления ПМВ-2 во время энзоотий, вероятно, относятся к смешанным инфекциям, в условиях которых он может играть роль фактора, усугубляющего тяжесть других заболеваний. Это предположение было подтверждено на модели экспериментальной сочетанной инфекции с использованием патогенного изолята вируса ныокаслской болезш и штамма ПМВ-2, одновременно выделенных на одной птицефабрике. Явление синергизма между ПМЗ-1 и ПМЗ-2 проявлялось в сокращении времени гибели птиц при смешанной инфекции по сравнению с этим же показателем при моноинфекции ныокаслской болезни. Штамм ПМВ-2 самостоятельно гибели птиц не вызывал.

При изучении некоторых показателей неспецифической -резистентности птиц, у которых после экспериментального заражения штаммами Липецк/92 и Голиц/92 отсутствовали клинические признаки заболевания, было установлено следующее. Различающиеся по ¡ЩИП штаммы ПМВ-2 вызывали статистически достоверное снижение уровней бактерицидной активности и активности лизоцкма в сыворотке крови (Р40,05). Снижение естественной резистентности было отмечено не только при парентеральном заражении птиц, но и при контактном пути инфицирования (рисунок 2). Полученные данные подтверждены в производственных условиях при обследовании птиц во время энзоотии ПМВ-2 инфекции.

Серологическая диагностика ПМВ-2 инфекции.

С целью снижения стоимости и упрощения изготовления сулее?-

I

1У

группы

П

Ш

1У

группы

.Рис. 2

Бактерицидная активность (А) и активность лизоцима (Б) сыворотки крови цыплят, инфицированных ШВ-2: I - парентерально, штамм Голиц/92; П - парентерально, штамм Липецк/92; Ш - контактно; 1У - контрольная группа.

вующего "Набора для выявления и идентификации парамиксовирусов птиц в РТГА", содержащего антигены ПМВ 8-ми (1-4 и 6-9) сероти-пов, нами была предложена его модификация, которая заключалась в следующем:

- на основании полученных данных вирусологических и серологических исследований в состав набора был включен инактивирован-ный антиген только ПМВ-2 и специфическая сыворотка к нему;

- для приготовления антигена использовали штамм вируса с учетом близкого антигенного родства ко всем ПМВ-2, выделенным в различных регионах СНГ в течение 1986-1992 гг.;- специфическую к ПМВ-2 сыворотку получали на очищенный и

концентрированный по фильтрационно-хроматографической технологии вирус. Высокая специфичность и активность полученной сыворотки позволяли давать однозначный ответ при типировании изолятов ПА©.

Наш организовано серийное производство модифицированного набора по заявкам с птицехозяйетв и ветеринарных специализированных лабораторий по болезням птиц. Отзывы с мест применения данного набора свидетельствуют об активности, специфичности и возможности использования его компонентов для идентификации выделенных изолятов и выявления антител к ПМВ-2 в сыворотках крови.

ВЫВОДЫ

■ I. Установлена циркуляция ПМВ-2 в птицехозяйствах Ставропольского края, Московской, Тульской, Липецкой, Псковской, Орловской, Рязанской, Пензенской областей России и Таджикистана, что свидетельствует о его широком распространении среди домашних птиц на значительной территории СНГ.

2. В антигенном отношении штаммы 1ШЗ-2, выделенные от кур, индеек и уток из различных регионов СНГ, представляли собой одно-

родную группу вирусов, близкородственную эталонному Цыпленок/ Калифорния Д)кейпа/56 и отечественному Цурица/СССР/1/8б штаммам с антигенным родством 70,9 - 100 %.

3. Исследованные штаммы проявили сходство по морфологическим и культуральным свойствам; были чувствительны к эфиру, хлороформу, рН 10,0; устойчивы к рН 3,0; патогенны для эмбрионов кур и цыплят 30-дневного возраста при различных способах инфицирования.

4. Выявлены штаммовые различия ПМВ-2 по ряду биологических свойств: спектру гемагглютинирующей активности, ингибиторочувст-витальности,'термостабильности, показателям гемолитической, влю-ирутацей» нейраминидазной активностей и вирулентности для 1-дневных цыплят при интрацеребральном заражении.

5. Определена роль ХШВ-2 в инфекционной патологии птиц, которая заключается в снижении естественной резистентности (бактерицидной активности, активности лизоцима сыворотки крови), что приводит к повышенной восприимчивости к возбудителям других инфекций и сопровождается снижением продуктивности (привесов, яйценоскости) и сохранности молодняка при выращивании.

При экспериментальной смешанной инфекции показана способность вирусов этой группы усугублять течение ньюкаслской болезни.

6. Показана возможность использования фильтрационно-хрома-тографической технологии на отечественном оборудовании для концентрирования и очистки ПМВ-2. Получены очищенные концентраты вирусных суспензий, освобожденные от балластных белков на 92,5+2,9 % с сохранением ГА-активности на 67,2+28,5 %,

ПРАКТИЧЕСКИЕ ГВДЛОйЕШИ

1. Модифицирован и внедрен в ветеринарную практику "Набор для выявления и идентификации парамиксовирусов птиц в РГГА".

2. В соответствии с предложенной модификацией внесены дополнения и изменения в технические условия и инструкцию по изготовлению и контролю "Набора для выявления и идентификации парамиксовирусов птиц в РТГА", составлено новое наставление по применению данного диагностикума (утверждено Департаментом ветеринарии 25.03.1994 г. № 19-4-06/166).

3. На основании полученных данных изучения антигенных и биологических свойств ПМВ-2 разработан проект "Временной инструкции о мероприятиях по борьбе с ПМВ-2 инфекцией птиц" и представлен на утверждение в Департамент ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

•I. Родин Ю.В., Рукавишников A.B., Смоленский В.И., Горева И.П. Инфекционная болезнь птицы, вызываемая парамкксовирусом-2 (Юкайпе)//Сборник научных трудов ВГНКИ.-1991(1992).-Т.53.-С. 80-83.

2. Рукавишников'A.B., Смоленский В.И., Лалферова С.М. Концентрирование и очистка парамиксовируса птиц второго сероти-па//Сборник научных трудов ВПЖИ.- 1994.-Т.55.-С. 236-242.

3. Максимюк H.H.,•Телишевская Л.Я., Рукавишников A.B. Испытание препарата "Пептидамин" на цыплятах раннего возраста// Сборник научных трудов ВГНКИ.-1994.-Т.56.-С. 78-83.