Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства вируса парагриппа собак и разработка метода диагностики болезни

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства вируса парагриппа собак и разработка метода диагностики болезни"

РГБ ОД

7 5 ЛЕН ?т

На правах рукописи

Мухин Алексей Николаевич

Биологические свойства вируса парагриппа собак и разработка метода

диагностики болезни

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в лаборатории препаратов, применяемых в звероводстве. Всероссийского государственного научно-исследовательского институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препарато! (ВГНКИ).

Научный руководитель:

Доктор ветеринарных наук, профессор В.И. Уласов

Официальные оппоненты:

-доктор биологических наук, профессор В.В.Гуненков -доктор биологических наук О.А.Верховский Ведущая организация: МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, г. Москва.

Защита диссертации состоится « 2000г. в

на заседании Диссертационного совета Д 12085.01. при Всероссийско.\ государственном научно-исследовательском институте контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) пс адресу 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5, тел. 253-14-91.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ. Автореферат разослан /^¿г^Я^ 2000г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук Козырев

/7 М<-Щд

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы:

В инфекционной патологии собак значительное место занимают аболевания респираторного тракта. Существует достаточно много тиологических агентов, вызывающих у собак респираторные болезни со ходными симптомами. До последнего времени основной причиной таких аболеваний в нашей стране считали аденовирусы собак, вирус чумы шотоядных и возбудителей бактериальной природы (Bordetella ironchiseptica, стрептококки, микоплазмы и др.), однако вспышки шфекционного трахеобронхита у вакцинированных против чумы и деновироза собак и неэффективность лечения антибиотиками указывали на галичие иного этиологического агента, вызывающего данное заболевание. )тим агентом является вирус парагриппа собак. Несмотря на то, что впервые тарамиксовирус был выделен Binn L.N. и др. в 1967 году, в нашей стране щрус парагриппа был изолирован от собак Захаровой Е.Д. и др. лишь в 1995 •оду, и до настоящего времени не проводилось широких исследований этой шфекции.

Заболевание парагриппом характеризуется воспалительными юражениями респираторного тракта различной локализации и тяжести. Зольные собаки отстают в росте и развитии, быстро устают при физической нагрузке, ухудшается их экстерьер. Кроме того, парагрипп часто осложняется другой вирусной, бактериальной и микоплазменной инфекцией, что может тривести к гибели животных.

Опасность распространения парагриппа возрастает при разведении :обак в питомниках, организации выставок и соревнований.

Для профилактики распространения болезни и выбора тактики лечения необходима своевременная и точная постановка диагноза.

Цель работы:

Изучить некоторые биологические свойства штамма «Рикан» вирус; парагриппа собак. Разработать метод изготовления, контроля и применение «Набора для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакцш торможения гемагглютинации (РТГА)».

Задачи исследований:

- изучить гемагглютинирующие свойства штамма «Рикан» вирус; парагриппа собак;

- изучить культуральные свойства штамма «Рикан» вируса парагрипп: собак и определить оптимальные способы и сроки получения инактивации, стабилизации и хранения вирусного антигена;

- определить спектр патогенности и антигенную активность штамм; «Рикан» вируса парагриппа для собак и некоторых видо! лабораторных животных;

- разработать методы получения специфических сывороток дш диагностики парагриппа собак;

- разработать методику постановки РТГА для прижизненно! диагностики парагриппа собак и определения иммунного статус; животных.

Научная новизна:

- дана биологическая характеристика изолированному от соба! штамму «Рикан» вируса парагриппа. Получены данные о еп морфологии, полипептидном составе, гемагглютинирующих I культуральных свойствах;

- установлена способность штамма вызывать у экспериментальнс зараженных собак респираторное заболевание и стимулировать ] них выработку вируснейтрализуюших и антигемагглютинирующю антител. Показана устойчивость кроликов и морских свинок 1

вирусу парагриппа и. способность этих животных реагировать на введение вируса выработкой гуморальных антител;

- установлена возможность инактивации инфекционной активности парамиксовируса собак ультрафиолетовым излучением при сохранении гемагглютинирующих свойств;

- определены условия стабилизации и хранения гемагглютинирующего антигена;

- показана высокая специфичность и чувствительность реакции торможения гемагглютинации для выявления антител к вирусу парагриппа собак в сыворотке крови.

Практическая ценность:

На основании проведенных исследований разработаны «Временное наставление по применению...» и «Технические условия на набор для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)». Указанные документы рассмотрены на заседании Ветфармбиосовета 12 апреля 2000 года (протокол №2, №001046) и утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 23 мая 2000 года (№13-7-2/2042).

Федеральным институтом промышленной собственности 21.08.2000 г. принято решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2000104630/13 (004915) с приоритетом от 28.02.2000 г. на «Штамм Paramyxovirus canis, используемый для контроля антигенной активности вакцин и получения специфической сыворотки и антигена для диагностики парамиксовирусной инфекции собак».

Апробация:

Материалы диссертации доложены и получили положительную оценку:

на Международной конференции, посвященной 80-летию Московской Государственной Академии Ветеринарной Медицины и Биотехнологии им. К.И. Скрябина, Москва, 25-27.06. 1999г.;

на Восьмом Международном конгрессе по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных, Москва, 6-8.04.2000 г.;

на межлабораторном совещании сотрудников ВГНКИ (протокол №17 от 9.03.2000 г.).

Публикации по теме работы:

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы (всего 114 источников, в том числе 93 иностранных). Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 8 рисунками.

В проведении исследований оказывали помощь ветеринарные специалисты профильных подразделений ВГНКИ. Особо хотелось бы поблагодарить за практическую помощь Захарову Е.Д., Уласова В.И., Ольшанскую A.A., Гореву И.П., Чистову З.Я., Величко А. В., Опарина Ю.Г. Могильного Ю.И.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы Работа выполнена в период с 1997 по 2000 гг. в лаборатории препаратов, применяемых в звероводстве, ВГНКИ, а также в ветеринарных учреждениях г. Москвы.

В работе использовали штамм «Рикан» вируса парагриппа собак с инфекционной активностью 105'5-Юб'25ТЦД50/мл на уровне 6-9-го пассажа.

Штамм вируса культивировали в первично трипсинизированных и субкультурах клеток почки щенка собаки (ПЩ) и котенка (ПК), фибробластов эмбриона кур (ФЭК) и японского перепела (ФЭП), а также перевиваемых линиях культур клеток почки собаки (MDCK) и кошки ^CRFK). Культуры клеток выращивали в пробирках, матрасах и микропанелях.

Посадочная концентрация составляла 300 тыс. кл/мл для первично грипсинизированных и 100 тыс. кл/мл для перевиваемых культур клеток.

Для выращивания первично трипсинизированных и субкультур клеток ПЩ и ПК использовали ростовую питательную среду следующего состава: гидролизат лактоальбумина -50%, среда Игла MEM с глутамином - 20%, :реда 199 - 20%, сыворотку крупного рогатого скота - 10%, гентамицин - 10 «г/л.

Культуры клеток ФЭК и ФЭП культивировали на ГЛА с 10% :ыворотки крупного рогатого скота и гентамицином.

Для выращивания перевиваемых линий клеток использовалась питательная среда RPMI 1640 с добавлением 5 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота и гентамицина в концентрации 10 мкг\мл.

В качестве поддерживающих использовали бессывороточные среды того же состава.

Инфекционную активность вируса устанавливали методом титрования з культуре клеток MDCK на 96-луночных планшетах для культур клеток фирмы "Costar" по стандартной методике. Инфекционный титр рассчитывали 10 методу Рида и Менча.

Электронно-микроскопические исследования проводили совместно с зедущим научным сотрудником лаборатории инструментальных методов ^следования ВГНКИ Ю.И. Могильным, для исследований использовали сультуральную расплодку вируса парагриппа собак штамма «Рикан» с титром

6,25 ^ ТЦДл/мл. Просмотр препаратов осуществляли в электронном микроскопе .ШМ-100 СХ 11 (Япония) с ускоряющим напряжением 80 кВ.

Диск-электрофорез вирусных полипептидов в полиакриламидном геле ставили на аппарате «АВГЭ-2», при напряжении 110 В, силе тока 40 мА, в течение 2-х часов. В работе использовали вирус, концентрированный ультрацентрифугированием и очищенный в ступенчатом градиенте плотности сахарозы.

При лиофилизации вируса использовали среду ВГНКИ №3, сорбит-желатозу и среды, состоящие из сахарозы, мясопептонного бульона, поливинилпиралидона и сахарозы, мясопептонного бульона, азида натрия. Нативный вируссодержащий материал с титром 6,25 ^ ТЦД5о/мл соединяли с равным объемом каждой из сред. Лиофилизацию проводили в однокамерном аппарате системы СТ-2. Работа выполнялась совместно с ведущим научным сотрудником лаборатории инструментальных методов института Ю.Г.Опариным.

В лабораторных опытах использовали животных: беспородных щенков собак в возрасте 2-4 месяца, кроликов породы Шиншилла массой 2,5-3 кг, морских свинок массой 250-300 гр.

Гипериммунные сыворотки к вирусу парагриппа собак получали на кроликах. Гипериммунизацию проводили по трем схемам с использованием 3-х вариантов антигена. В качестве антигена использовали нативный вирус с титром в РГА 1:32, а так же вирус, концентрированный ультрацентрифугированием или обратным диализом с ПЭГ 6000.

По первой схеме антиген вводили трехкратно с трехнедельным интервалом: 1-е введение - внутривенно 1 мл, 2 и 3-е введения - внутрикожно 2 мл антигена с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1.

По второй и третьей схемам кроликов иммунизировали аналогично, только при первом введении антиген вводили в объеме 2 мл внутрибрюшинно или внутрикожно с адъювантом Фрейнда.

Реакцию нейтрализации проводили микрометодом в 96-луночных панелях для культур клеток фирмы "Costar" на перевиваемой линии клеток почки собаки MDCK с 100 ТЦЦ50 штамма "Рикан" вируса парагриппа собак.

Реакции гемагглютинации (РГА) и торможения гемагглютинации 'РТГА) проводили микрометодом по общепринятой методике. РГА ставили с эритроцитами 8 видов животных в фосфатном буферном растворе (ФБР) рН 5,2-7,4. В РТГА использовали 0,75 % суспензию эритроцитов морской :винки в ФБР рН 7,2 и 4 ГАЕ штамма "Рикан" вируса парагриппа собак.

2.2.Результаты собственных исследований

2.2.1.Изучен не морфологии вирионов штамма «Рикан» вируса парагриппа

собак

Электронно-микроскопические исследования вирионов штамма <Рикан» вируса парагриппа собак показали, что они обладают морфологией, сарактерной для семейства Paramycoviridae. На микрофотографиях наблюдали шеоморфные, чаще округлые, частицы диаметром 120-200 нм, состоящие из гуклеокапсида со спиральным типом симметрии и липопротеидной оболочки.

С помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле в составе ¡ирионов выявлено 5 полипептидов: HN (гемагглютинин и нейраминидаза), F фактор слияния клеток), М (матричный полипептид) и Р (неструктурный >елок) с молекулярными массами 67,60,56,40 и 32 кД соответственно.

2.2.2. Изучение гемагглютинирующих свойств вируса парагриппа собак

Гемагтлютинирующую активность вируса парагриппа собак »пределяли по отношению к эритроцитам 8-ми видов животных. Во всех 1пытах использовали по 4 серии нативной вирусной расплодки штамма с итром 5,25-6,25 lg ТЦД50/мл и хранившейся при температуре -20° С.

В таблице 1 приведены результаты титрования вируса при значениях рН 6,2-7,4 и температуре 4° С.

При сравнении эритроцитов различных видов животных наибольшие титры гемагглютининов отмечали с эритроцитами морской свинки - 5,25±0,6 log2. С эритроцитами белой крысы, человека и кошки титры гемагглютининов были ниже. Наименьшие титры гемагглютининов были получены с эритроцитами собаки. С суспензией эритроцитов петуха, свиньи и барана при всех значениях рН и температуры гемагглютинации не наблюдалось.

Таблица 1. РГА различных видов эритроцитов со штаммом «Рикан» вируса парагриппа собак при различных значениях рН среды

Вид эритроцитов Средний геометрический титр гемагглютининов (log2) при рН среды

6,2 6,4 6,6 6,8 7,2 7,4

Морской свинки 4,0+0,8 5,0+0,7 5,0±0,7 5,25±0,6 5,25+0,6 5,0±0,8

Белой крысы 2,75±0,8 4,0+0,8 4,0+0,8 4,25+0,8 4,25±0,8 3,75+0,8

Человека 2,75+0,5 3,75+0,6 3,75+0,6 4,25+0,6 4,25+0,6 3,75±0,6

Кошки 2,75+0,8 3,75+0,6 3,75+0,6 3,75+0,6 3,75±0,6 2,75±0,8

Собаки 1,0±0,4 1,75±0,5 1,75+0,5 1,75+0,5 1,75+0,5 1,0+0,4

Петуха - - - - - -

Барана - - - - - -

Свиньи - - - - - -

Примечание: «-« - агглютинация отсутствует

Изучение активности гемагглютининов вируса парагриппа собак с эритроцитами морских свинок, белых крыс, человека, кошек и собак при различных рН ФБР показало, что наивысшие титры гемагглютининов обнаруживаются при рН ФБР 6,8-7,2.

Однако наиболее четкие и стабильные результаты реакции были получены при использовании ФБР с рН 7,2. При этом значении рН среды проявлялась наибольшая активность гемагглютининов вируса парагриппа :обак с эритроцитами всех видов животных, которые были использованы в исследовании.

Агглютинация эритроцитов морской свинки при 20° С наблюдалась герез 1 час, а при 4° С - через 1,5-2 часа. При 37° С вирус парагриппа »ритроциты морской свинки не агглютинировал. Наиболее высокие титры -емагглютининов наблюдались при 4° С.

Таким образом, при проведении РГА с вирусом парагриппа собак, на гаш взгляд наиболее приемлемым является использование 0,75% суспензии »ритроцитов морской свинки в ФБР рН 7,2 при температуре 4° С.

2.2.3. Изучение культуральных свойств вируса парагриппа собак

Для культивирования СР1У нами были выбраны наиболее доступные и фостые в работе культуры клеток - ПЩ, МОСК, ПК, СИРК, ФЭК, ФЭП, ;оторые были получены из лаборатории питательных сред, культур клеток и •каней ВГНКИ.

Культуральные свойства вируса определяли по характеру и срокам юявления ЦПД, инфекционной и гемагглютинирующей активности юлученных вирусных расплодок, гемадсорбционной способности шфицированных клеток.

Результаты заражения клеточных культур вирусом парагриппа собак итамма «Рикан» представлены в таблице 2.

Наибольшей чувствительностью к вирусу парагриппа собак в наших шытах обладали культуры клеток собак.

На 4-5-е сутки после заражения в этих культурах наблюдали арактерные признаки цитопатического действия парамиксовирусов -бразование крупных, как бы рассыпанных по стеклу округлых клеток и

синцитиев. На 5-7-е сутки пораженные клетки отслаивались от стекла, в монослое образовывались «окна». В те же сроки в зараженных культурах клеток наблюдали явление гемадсорбции. Титры вируса составили 5,6-6 ^ ТЦД50/МЛ, а вирусных гемагглютининов 4-5 \ogi-

Было установлено, что к вирусу парагриппа собак чувствительны культуры клеток кошки ПК и СКБК, однако инфекционная и агглютинирующая активность полученного вируса невысока - 2-2,5 ТЦД50/мл и 1-2 1о§2. Культуры клеток ФЭК и ФЭП непригодны для культивирования штамма «Рикан» вируса парагриппа собак.

Таблица 2.Чувствителъность клеточных культур к вирусу парагриппа собак штамма «Рикан»

Наименование культур клеток Бремя появления ЦПД (су т) Накопление вируса

цщ 0е тцдфш) Гемадсорбция ГАт'мл) РГА М

Пассаж Пассаж Пассаж Пассаж

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

ПЩ 5 5 5 6 6 6 6,25 6,25 6,25 5 5 5

МИСК 5 5 5 5,6 5,6 5,6 5,75 5,75 5,75 4 4 4

ПК - б 6 0 2,25 1,75 2 2,75 1,75 1 2 1

СИРК - 6 6 0 2 1,5 1 2 I 1 2 1

ФЭК - - - 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ФЭП - - - 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Примечание: «-« -признаки. ЦПД отсутствуют

В результате проведенных исследований установлено, что оптимальной заражающей дозой вируса парагриппа собак для культуры клеток МОСК является 0,2 ТЦД5о/клетку. Показана прямая зависимость между заражающей

дозой и накоплением вируса в культуре клеток: при снижении заражающей дозы в 10 раз выход вируса снижался на 1 ^ ТЦД50/МЛ, накопление вирусных гемагглютининов уменьшалось на 1

Вирус впервые обнаруживался в зараженных культурах клеток на 3-й сутки культивирования, причем развитие ЦПД совпадало по времени с появлением вирусных гемагглютининов. Максимальное накопление инфекционной активности и вирусных гемагглютининов происходило на 7-е сутки после заражения. Увеличение сроков культивирования приводило к снижению активности полученной вирусной расплодки, в следствие термолабильности вируса и вирусных гемагглютининов (рис.1).

7

2

3

4

5

6

7

8

дни после заражения

—♦—титр вируса по ЦПД (1д ТЦД50\мл) —ш—титр вируса в РГАд (1д ГА50\мл) —А—титр вируса в РГА (1од2)

Рис.1. Динамика накопления вируса парагриппа собак в культуре клеток МБСК.

2.2.4. Изучение патогенности и антигенной активности вируса парагриппа для собак и лабораторных животных

С целью изучения патогенности и антигенной активности штамма

«Рикан» вируса парагриппа для собак проводили экспериментальное заражение беспородных щенков собаки.

У 10-ти из 12-ти щенков, зараженных интраназалыю и интратрахеально, через 2-4 дня развилось заболевание, сопровождающееся характерными для парагриппа собак клиническими признаками: серозным ринитом и конъюнктивитом, кашлем, гипертермией. Выздоровление заболевших щенков происходило на 7-10 день.

Наиболее тяжелые поражения были отмечены у щенков, которым вирус парагриппа вводили в легкое. На 7-й день после заражения 2 щенка были эутаназированы. При вскрытии трупов в носовых ходах и трахее наблюдали воспалительное поражение эпителия, их просвет был заполнен слизью. В легких наблюдали множественные точечные очаги воспаления. Из пораженной ткани легкого в культуре клеток ПЩ был выделен гемагглютинирующий агент, идентифицированный в РТГА со специфичной сывороткой, как вирус парагриппа собак.

Период выздоровления у щенков, зараженных в легкое, составил более 2-х недель.

Все щенки до заражения имели вируснейтрализующие и тормозящие гемагглютинацию антитела к вирусу парагриппа собак в титрах (средние геометрические) 3,2 и 5,3^2 соответственно. В период с 7-го по 28-й день после заражения наблюдалось постепенное увеличение уровня антигемагглютининов и вируснейтрализующих антител у инфицированных щенков, с максимумом на 28 день (7,7к^2 в РТГА и 5,0 в РН). В дальнейшем отмечено постепенное снижение уровня специфических антител к вирусу парагриппа собак у экспериментально зараженных щенков. Через 7 недель

уровень антигемагглютининов составил 6,7 log2, а вируснейтрализующих антител 4,3 log2.

Следующим этапом наших исследований было определение патогенности штамма «Рикан» вируса парагриппа собак для лабораторных животных и выбор модели, способной отвечать на воздействие вируса выработкой гуморальных антител.

Штамм «Рикан» вируса парагриппа собак, введенный в дозе 103'5 -2*105'5 ТЦЦ5о, не вызывал заболевания у кроликов и морских свинок.

Появление специфических антигемагглютининов и

вируснейтрализующих антител к вирусу парагриппа собак в сыворотках крови зараженных животных отмечали на 7-е сутки после заражения. Наивысшие титры антител были выявлены через 3-4 недели после введения вируса и составили в среднем по группам: у кроликов 5,0 log2 в РТГА и 3,2 log2 в РН, а у морских свинок -11,0 log? и 6,7 log2 соответственно.

2,2.5. Получение диагностических сывороток к вирусу парагриппа собак

В качестве продуцентов диагностических сывороток нами были выбраны кролики породы Шиншилла. Сыворотки с максимальной активностью были получены при использовании парамиксовирусного антигена, концентрированного ультрацентрифугированием, вводимого по :хеме: 1-е введение - внутривенно, далее - два внутрикожных ведения с 3-недельным интервалом с адъювантом Фрейнда.

Титры антител в полученных гипериммунных сыворотках составили 9,2± 0,8 log2 в РН и 11,2+0,8 log2 в РТГА.

Специфичность диагностических сывороток проверяли в РТГА, РНГА или РН с возбудителями инфекционных болезней плотоядных. Сыворотки были положительными к вирусу парагриппа собак и отрицательными по отношению к вирусу чумы плотоядных, коронавирусу и парвовирусу собак, аденовирусам собак 1-го и 2-го типов, вирусу болезни Ауески.

2.2.6. Изготовление сухого инактивированного паралшксовирусного

антигена

Гемагглютинирующий парамиксовирусный антиген, используемый в РТГА, должен обладать биологической безопасностью. Для инактивации инфекционной активности штамма «Рикан» вируса парагриппа собак использовали ультрафиолетовое излучение. Время экспозиции - 15-100 минут.

Результаты исследования устойчивости парамиксовируса собак к УФ-излучению представлены в таблице 3.

Гемагглютинирующая активность парамиксовируса оставалась неизменной после 60-ти минут УФ-облучения лампой ДБ-3, с плотностью лучистого потока 68,2 Вт/м2, и снижалась после 80-ти минут обработки, при этом вирус терял инфекционную активность после 15-минутного облучения.

Таблица 3. Устойчивость парамиксовируса собак к УФ-излучению

Время инактивации (мин) Титр вируса (ТЦДц/мл) Титр гемагглюти-нинов С'Оёз) Накопление гемагглютииинов в к. кл. ШСК

1-й пассаж 2-й пассаж 3-й пассаж

0 5,25 5 - - -

15 0 5 2 4 5

30 0 5 0 0 0

40 0 5 0 0 0

45 0 5 0 0 0

60 0 5 0 0 0

80 0 4 0 0 0

100 0 2 0 0 0

Возможность реверсии инактивированного вируса к вирулентному изучалась путем пассирования в культуре клеток МОСК.

На протяжении 3-х последовательных пассажей вирус, инактивированный ультрафиолетом в течение 30-ти и более минут, не размножался в культуре клеток.

Учитывая вышесказанное, в качестве гемагглютинирующего антигена для РГА и РТГА использовали культуральную расплодку штамма «Рикан» CPIV, полученную на культуре клеток ШЦ, инактивированную ультрафиолетовым излучением в течение 40 минут и лиофилизированную с защитной средой, содержащей сахарозу, МПБ и азид натрия. Гемагглютинирующая активность изготовленного таким образом парамиксовирусного антигена составила 4 log2 и сохранялась неизменной в течение не менее 12 месяцев при 2-4° С.

2.2.7. Изготовление «Набора для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)»

РТГА для выявления специфических антител к вирусу парагриппа

собак является быстрым и надежным методом лабораторной диагностики парагриппа собак. Учитывая результаты проведенных исследований, нами был разработан «Набор для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)».

Набор рассчитан на проведение исследования 10-ти проб сывороток

крови и включает следующие компоненты: сухой инактивированный

парамиксовирусный антиген, сухую контрольную положительную сыворотку,

сухую контрольную отрицательную сыворотку, формалинизированные

эритроциты морской свинки 0,75%-ной концентрации, фосфатный буферный

раствор (ФБР) рН 7,2.

2.2.8. Проверка специфичности «Набора для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации

(РТГА)»

При проверке специфичности «Набора для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)»

использовали гипериммунные сыворотки крови к возбудителям заболеваний собак.

РТГА с иммуноглобулином против парвовирусного энтерита и чумы плотоядных, поливалентной сывороткой против чумы, парвовирусных инфекций и вирусного гепатита плотоядных, гипериммунными сыворотками против коронавируса собак, аденовирусов собак 1-го и 2-го типов, вируса алеутской болезни норок и иммуноглобулином против вируса болезни Ауески была отрицательной. Данные препараты тормозили агглютинацию эритроцитов морской свинки в титрах не выше 4 При этом титр

антигемагглютининов в контрольной положительной сыворотке был 8 а контрольная отрицательная сыворотка не вызывала эффекта торможения гемагглютинации. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что разработанный нами набор специфичен.

2.2.9. Изучение чувствительности «Набора для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации

(РТГА)»

Чувствительность «Набора для обнаружения антител к вирус} парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)> проверяли с заведомо положительными сыворотками в отношении вирус! парагриппа собак, предварительно исследованными в РН.

Данные проведенных опытов представлены в таблице 4.

Все сыворотки, положительные в РН, оказались так ж положительными и в РТГА, что свидетельствует о высокой совпадаемост результатов РН и РТГА. Титры в РТГА на 2-3 выше аналогичных в Р1 что говорит о высокой чувствительности разработанного набора.

Эффективность использования «Набора для обнаружения антител вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА при серологической диагностике парагриппа собак подтверждена в хо; межлабораторных испытаний в ВГНКИ (протокол №127 от 17.11.99 г.).

Таблица 4. Сравнение результатов титрования сывороток, позитивных к вирусу парагриппа собак, в РН и РТГА

X« п\п Исследуемый материал Кол-во проб Средний геометрический титр антител (log:)

PH РТГА

1 Гипериммунная сыворотка кролика к СР1У 4 9,2+0,8 11,2+0,8

2 Нормальная сыворотка кролика 2 0 <4

3 Сыворотка крови щенка, экспериментально зараженного СР1У 4 5,0+0,4 7,7+0,3

4 Сыворотка крови щенка, иммунизированного вакциной «.\obivac опт» 4 6,0±0,4 8,0+0,3

5 Сыворотка крови 2-месячного невакцинированного щенка 4 2,0±0,3 5,25±0,2

6 Сыворотка крови собаки с признаками острого респираторного заболевания 2 4,5+0,4 б,5±0,5

Всего исследовано проб 20 20 20

Всего положительных проб 18 18 18

Всего отрицательных проб 2 2 2

2.2.10. Применение «Набора для обнаружения антител к вирусу гарагриппа собак в реакции торможения гемагглютипации (РТГА)» для исследования «полевых» сывороток собак При титровании с помощью «Набора для обнаружения антител к вирусу

арагрнппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)» 12-ти

ар сывороток крови, взятых с двухнедельным интервалом, от собак с

тоническими признаками острого респираторного заболевания, в 7-ми

тучаях было отмечено 4-8-кратное увеличение уровня специфических

пител в повторных пробах. Для животных с возросшими титрами такие

гзультаты служили лабораторным подтверждением диагноза.

В 5 случаях уровень специфических антител в повторных пробах не отличался от исходного, т.е. диагноз на парагрипп был отрицательным. У 2 собак из этой группы методом ИФЛ была установлена чума плотоядных, а у 2 выявлены в РДП антитела к аденовирусам.

Учитывая результаты, полученные при обследовании спонтанно заболевших и экспериментально зараженных собак, мы считаем, чте увеличение титров специфических антигемагглютининов в сыворотках крови взятых с интервалом 10-21 день, в 4 и более раз при наличии клинических признаков поражения респираторного тракта, свидетельствует об инфицировании животных вирусом парагриппа.

Серологические исследования, проведенные нами с помощью «Наборе для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)», показали наличие гуморальных антител к СР1У у 96% обследованных животных, что свидетельствует о широком распространении вируса парагриппа в популяциях собак Москвы и Московской области.

Практический интерес представляет также определение титров поствакцинальных антител при оценке антигенности вакцин против парагриппа собак. РТГА с разработанным набором была использована при контроле качества ассоциированных вакцин «1МоЫуас БНРРЬ) (Голландия) и «Уап§агс1-5» (США). Двум группам щенков вводили испытуемые препараты согласно наставлениям. Парные пробы сывороток крови, полученные до и после вакцинации, исследовали в РТГА. Через две недели после вакцинации наблюдали ярко выраженный иммунный ответ у всех привитых щенков. Прирост антител составил 4,2-4,5 \og2-

Результаты проведенных опытов показали высокую антигенную активность парагриппозных компонентов ассоциированных вакцин.

Выводы

1. Установлено, что парамиксовирус вызывает у собак спонтанно возникающее и воспроизводимое в лабораторных условиях заболевание респираторного тракта. До 96% собак, обследованных в городе Москве и Московской области, являются носителями антител к этому возбудителю.

2. Вирионы штамма «Рикан» имеют характерное для парамиксовирусов строение: представляют собой округлые частицы диаметром 120-200 нм и содержат в своем составе полипептиды с молекулярными массами 67, 60, 56, 40, и 32 кДа.

3. Штамм «Рикан» при экспериментальном заражении патогенен для собак, не вызывает заболевания у кроликов и морских свинок и индуцирует у них образование вируснейтрализующих и тормозящих гемагглютинацию антител.

4. Вирус парагриппа размножается в первично трипсинизированных и перевиваемых культурах клеток почки собаки и кошки. Максимальное накопление инфекционного вируса (до 6 ^ ТЦД50/МЛ) и вирусных гемагглготининов (до 5 в культуре клеток происходит на 6-7-е сутки после заражения.

5. Установлено, что парамиксовирус собак агглютинирует эритроциты морской свинки, белой крысы, человека, кошки и собаки. Наибольшая активность вируса проявляется с 0,75%-ной суспензией эритроцитов морской свинки в ФБР рН 6,8-7,2 при температуре 4°С.

6. Гипериммунизация кроликов, включающая одно внутривенное и два внутрикожных введения вируса, обеспечивает получение активной и специфичной сыворотки, содержащей антитела к вирусу парагриппа собак в титрах до 9 1о§2 в РН и 11 1о§2 в РТГ'А.

7. Вирус парагриппа собак, инактивированный ультрафиолетовым излучением и лиофилизированный с защитной средой, содержащей

сахарозу, МПБ и азид натрия, сохраняет гемагглютинирующую активность в течение 12-ти месяцев при температуре 2-4° С. 8. Выявление 4-кратного и более высокого прироста антигемагглютининов к парамиксовирусу в парных пробах сывороток крови собак свидетельствует о перенесенной ими парагриппозной инфекции.

Практические предложения

Результаты исследований, изложенных в диссертации, использованы при разработке «Технических условий...» и «Временного наставления по применению набора для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)».

Список работ опубликованных по теме диссертации

1.Захарова Е.Д., Уласов В.И., Ольшанская A.A., Мухин А.Н. Парамиксовирус - возбудитель респираторного заболевания у собак. Материалы научно-практической конференции «Зоогигиена, профилактика и терапия болезней сельскохозяйственных и мелких домашних животных», Новосибирск, 20.10.1998 г., стр. 13-14.

2. Захарова Е.Д., Мухин А.Н., Уласов В.И. Заболевание органов дыхания собак, вызванное парамиксовирусом. Материалы 2-й региональной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе», п. Персиановский, 27.05.1999 г., стр.5-16.

3. Мухин А.Н., Захарова Е.Д., Уласов В.И. Обнаружение антител к вирусу парагриппа собак в РТГА. Тезисы докладов Международной конференции, посвященной 80-летию МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, Москва, 1999 г., стр. 16-17.

4. Мухин А.Н., Захарова Е.Д., Уласов В.И. Ретроспективная диагностика парагриппа собак. Материалы 8-го Международного конгресса

по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных, Москва, 6-8.03.2000 г., стр. 294-295.

5. Захарова Е.Д., Мухин А.Н., Уласов В.И. Респираторные инфекции у собак. Материалы 8-го Международного конгресса по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных, Москва, 6-8.03.2000 г., стр. 300-301.

6. Мухин А.Н., Захарова Е.Д., Величко A.B., Уласов В.И. Культур альные свойства вируса парагриппа собак. Материалы Международной научной конференции «Незаразные болезни животных», Казань, 30-31.05.2000 г., стр. 196-197.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мухин, Алексей Николаевич

Список используемых сокращений.

Введение.

1 .Обзор литературы.

1.1. Распространение парагриппа собак.

1.2. Патогенез, клинические и патологоанатомические изменения при парагриппе собак.

1.3. Систематика и морфология вируса парагриппа собак.

1.4. Патогенность вируса для естественно-восприимчивых и лабораторных животных.

1.5. Культуральные свойства вируса парагриппа собак.

1.6. Диагностика парагриппа собак.

1.7.Серологические методы диагностики.

1.8. Специфическая профилактика парагриппа собак.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические свойства вируса парагриппа собак и разработка метода диагностики болезни"

Актуальность проблемы:

В инфекционной патологии собак значительное место занимают заболевания респираторного тракта. Существует достаточно много этиологических агентов, вызывающих у собак респираторные болезни со сходными симптомами. До последнего времени основной причиной таких заболеваний в нашей стране считали аденовирус собак 2-го типа, вирус чумы плотоядных и возбудителей бактериальной природы (Bordetella bronchiseptica, стрептококки, микоплазмы и др.). Однако вспышки инфекционного трахеобронхита у вакцинированных против чумы и аденовироза собак и неэффективность лечения антибиотиками указывали на наличие иного этиологического агента, вызывающего данное заболевание. Этим агентом является вирус парагриппа собак. Несмотря на то, что впервые CPIV был выделен Binn L.N. и др. в 1967 году, в нашей стране вирус парагриппа был изолирован от собак Захаровой Е.Д. и др. лишь в 1995 году и до настоящего времени не проводилось широких исследований этой инфекции.

Заболевание парагриппом характеризуется воспалительными поражениями респираторного тракта различной локализации и тяжести. Больные собаки отстают в росте и развитии, быстро устают при физической нагрузке, ухудшается их экстерьер. Кроме того, парагрипп часто осложняется другой вирусной, бактериальной и микоплазменной инфекцией, что может привести к гибели собак.

Опасность распространения парагриппа возрастает при разведении собак в питомниках, организации выставок и соревнований.

Для профилактики распространения болезни и выбора тактики лечения необходима своевременная и точная постановка диагноза.

При лабораторной диагностике парагриппа собак применяют выделение вируса в культуре клеток и его последующую идентификацию. Для выявления антител к вирусу в сыворотках крови больных собак используют РН, но эта реакция длительна, трудоемка и сложна по выполнению.

Способность вируса парагриппа собак вызывать агглютинацию эритроцитов позволяет использовать это свойство для совершенствования серологической диагностики при данном заболевании. Несмотря на простоту и доступность реакции гемагглютинации и реакции торможения гемагглютинации у нас в стране эти методы не используются, т.к. не разработаны способы получения стабильных препаратов для их осуществления и стандартные методики для проведения реакций.

Цель работы:

Изучить некоторые биологические свойства штамма «Рикан» вируса парагриппа собак. Разработать метод изготовления, контроля и применения «Набора для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)».

Задачи исследований:

- изучить гемагглютинирующие свойства штамма «Рикан» вируса парагриппа собак;

- изучить культуральные свойства штамма «Рикан» вируса парагриппа собак и определить оптимальные способы и сроки получения, инактивации, стабилизации и хранения вирусного антигена;

- определить спектр патогенности и антигенную активность штамма «Рикан» вируса парагриппа для собак и некоторых видов лабораторных животных;

- разработать методы получения специфических сывороток для диагностики парагриппа собак;

- разработать методику постановки РТГА для прижизненной диагностики парагриппа собак и определения иммунного статуса животных.

Научная новизна:

Дана биологическая характеристика изолированному от собак штамму «Рикан» вируса парагриппа. Получены данные о его морфологии, полипептидном составе, гемагглютинирующих и культуральных свойствах.

Установлена способность штамма вызывать у экспериментально зараженных собак респираторное заболевание и стимулировать у них выработку вируснейтрализующих и антигемагглютинирующих антител. Показана устойчивость кроликов и морских свинок к вирусу парагриппа, и способность этих животных реагировать на введение вируса выработкой гуморальных антител.

Установлена возможность инактивации инфекционной активности парамиксовируса собак ультрафиолетовым излучением при сохранении гемагглютинирующих свойств.

Определены условия стабилизации и хранения гемагглютинирующего антигена.

Показана высокая специфичность и чувствительность реакции торможения гемагглютинации для выявления антител к вирусу парагриппа собак в сыворотке крови.

Практическая ценность:

На основании проведенных исследований разработаны «Технические условия на набор для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)» и «Временное наставление по применению набора для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)». Указанные документы рассмотрены на заседании Ветфармбиосовета 12 апреля 2000 года (протокол

2, №001046) и утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 23 мая 2000 года (№13-7-2/2042). Федеральным институтом промышленной собственности 21.08.2000 г. принято решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2000104630/13(004915) с приоритетом от 28.02.2000 г. на «Штамм Paramyxovirus canis, используемый для контроля антигенной активности вакцин и получения специфической сыворотки и антигена для диагностики парамиксовирусной инфекции собак». На защиту выносятся следующие положения:

1. Результаты изучения биологических свойств штамма «Рикан» вируса парагриппа собак.

2. Разработка «Набора для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)»

3. Метод обнаружения специфических антител в РТГА с парамиксовирусом собак для диагностики, контроля вакцин и серологического мониторинга.

Апробация:

Материалы диссертации доложены и получили положительную оценку: на Международной конференции, посвященной 80-летию Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, Москва, 25-27.06. 1999г.; на восьмом Международном конгрессе по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных, Москва, 6-8.04.2000 г.; на научно-проблемной комиссии по контролю и стандартизации биопрепаратов применяемых при вирусных болезнях животных ВГНКИ (протокол №17 от 9.03.2000 г.).

Публикации по теме работы:

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы (всего 114 источников, в том числе 93 иностранных). Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 8 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Мухин, Алексей Николаевич

Выводы

1. Установлено, что парамиксовирус вызывает у собак спонтанно возникающее и воспроизводимое в лабораторных условиях заболевание респираторного тракта. До 96% собак, обследованных в городе Москве и Московской области, являются носителями антител к этому возбудителю.

2. Вирионы штамма «Рикан» имеют характерное для парамиксовирусов строение: представляют собой округлые частицы диаметром 120-200 нм и содержат в своем составе полипептиды с молекулярными массами 67, 60, 56, 40, и 32 кДа.

3. Штамм «Рикан» при экспериментальном заражении патогенен для собак, не вызывает заболевания у кроликов и морских свинок и индуцирует у них образование вируснейтрализующих и тормозящих гемагглютинацию антител.

4. Вирус парагриппа размножается в первично трипсинизированных и перевиваемых культурах клеток почки собаки и кошки. Максимальное накопление инфекционного вируса (до 6 ТЦД50/мл) и вирусных гемагглютининов (до 5 1о§2) в культуре клеток происходит на 6-7-е сутки после заражения.

5. Установлено, что парамиксовирус собак агглютинирует эритроциты морской свинки, белой крысы, человека, кошки и собаки. Наибольшая активность вируса проявляется с 0,75%-ной суспензией эритроцитов морской свинки в ФБР рН 6,8-7,2 при температуре 4°С.

6. Гипериммунизация кроликов, включающая одно внутривенное и два внутрикожных введения вируса, обеспечивает получение активной и специфичной сыворотки, содержащей антитела к вирусу парагриппа собак в титрах до 9 1о§2 в РН и 111о§2 в РТГА.

7. Вирус парагриппа собак, инактивированный ультрафиолетовым излучением и лиофилизированный с защитной средой, содержащей сахарозу, МПБ и азид натрия, сохраняет гемагглютинирующую активность в течение 12-ти месяцев при температуре 2-4° С.

8. Выявление 4-кратного и более высокого прироста антигемагглютининов к парамиксовирусу в парных пробах сывороток крови собак свидетельствует о перенесенной ими парагриппозной инфекции.

Практические предложения

Результаты исследований, изложенные в диссертации, использованы при разработке «Набора для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)». «Технические условия.» и «Временное наставление по применению набора для обнаружения антител к вирусу парагриппа собак в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)» утверждены Департаментом Ветеринарии Минсельхозпрода РФ 23 мая 2000 года (№13-7-2/2042). Федеральным институтом промышленной собственности 21.08.2000 г. принято решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2000104630/13(004915) с приоритетом от 28.02.200 г. на «Штамм Paramyxovirus canis, используемый для контроля антигенной активности вакцин и получения специфической сыворотки и антигена для диагностики парамиксовирусной инфекции собак».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мухин, Алексей Николаевич, Москва

1. Букринская А.Г., Зайдес В.М. Молекулярная биология парамиксовирусов.// Москва, Медицина (1978).

2. Вирусология методы. Под редакцией Мейхи Б.// Москва, Мир (1988).

3. Гринин A.C., Титов И.Н. Очистка, концентрация и фракционирование вирусов животных.// М. (1971).

4. Гуненков В.В. О лабораторной диагностике вирусных пневмо-энтеритов телят.//Ветеринария. 8: 90-93 (1978).

5. Душкин Д.В. Бордетеллеозная инфекция собак.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.в.н., Москва (1998).

6. Захарова Е.Д., Уласов В.И., Ольшанская A.A., Могильный Ю.И. Парагрипп собак. // Ветеринария. 9: 47 (1997).

7. Захарова Е.Д., Уласов В.И., Ольшанская A.A. Парамиксовирусная инфекция у собак.// Материалы 7-й международной конференции по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных., Москва 248-249(1998).

8. Жданова В.М., Гайдамович С.Я. Общая вирусология. // Москва, Медицина 2:186-220(1982).

9. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. Статистическая обработка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах. // Москва. 40-43 (1990).

10. Ю.Инфекционные болезни животных. Под редакцией Осидзе Д.Ф.// Москва, Агропромиздат (1987).

11. Коляков Я.Е. Ветеринарная иммунология.// Москва, Агропомиздат. (1986).

12. Ларски З.И. Диагностика вирусных болезней животных.// Москва, Колос (1980).

13. Матвеева К.И., М.И.Соколов. Руководство по микробиологической диагностики инфекционных болезней. // Москва, Медицина (1964).

14. Методы исследования в иммунологии. Под редакцией Лефковитса И., Перниса Б.// Москва, Мир 95-118 (1981).15.0рлянкин Б.Г. Классификация и номенклатура вирусов позвоночных. // Методичекое пособие. Россельхозакадемия, ВИЭВ 34-36 (1998).

15. Сергеев В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных. // Москва, "Колос" (1976).

16. Сюрин В.Н. Руководство по ветеринарной вирусологии. // Москва, "Колос" (1966).

17. Сюрин В.Н., Фомина Н.В. Частная ветеринарная вирусология. // Москва (1990).

18. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных болезней животных.// Справочник. Москва, В.О. Агропромиздат (1991).

19. Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Миме С., Сембрук Д., Уайт Д. Биология вирусов животных. // Москва (1977).

20. Фримель Г.М. Иммунологические методы.// Медецина. (1987).

21. Ajiki М., Takamura К., Hiramatsu К., Nakai М., Konishi S. Isolation and characterization of parainfluenza 5 virus from a dog. // Jpn. J. Vet. Sci. 44: 606618 (1982).

22. Appel M. and Percy. D.H. SV5-like parainfluenza vims in dogs. // J. Am. Vet. Mod. Assoc. 156:1778-1781 (1970).

23. Appel M., Bemis D.A. The canine contagious respiratory disease complex (kennel cough).// Cornell vet. 68-70 (1978).

24. Appel M., Carmichael Y.E. Systemic viral disease.// Canine Med. 4 Ed., 17 (1979).

25. Appel M.J. Canine infectious tracheobronchitis (kennel cough): a status report. // Compend. Cont. Educ. 3:70-79 (1981).

26. Appel M.J. The virus diseases of carnivores. 125-132 (1989)

27. Atoynatan T. and Hsiung G.D. Epidemiologic studies of latent virus infections in captive monkeys and baboons. II. Serologic evidence of myxovirus infections with special references to SV5. // Am. J. Epidemiol. 89: 472-479 (1969).

28. Azetaka M., Konishi S. Kennel cough complex: confirmation and analysis of the outbreak in Japan. // Jpn. J. Vet. Sei. 50 (4): 851-858 (1988).

29. Baumgartner W.K., Krakowka S., Koestner A. and Evermann, J. Acute encephalitis and hydrocephalus in dogs caused by canine parainfluenza virus. // Vet. Pathol., 19: 79-92 (1982).

30. Baumgartner W. K., Krakowka S., Koestner A., Evermann J. Ultrastructural evaluation of the acute encephalitis and hydrocephalus in dogs caused by canine parainfluenza virus. // Vet. Pat. 19 (3) : 305-314 (1982 May).

31. Baumgartner W.K., Krakowka S., Blakeslee J. Evolution of in vitro persistence of to strain of canine parainfluenza virus. // Arch. Virol. 93: 147-154 (1987).

32. Baumgartner W., Krakowka S.,Gorham J.R. Canine parainfluenza virus-induced encephalitis in ferrets. // J. Comp. Path. 100 : 67-72 (1989).

33. Baumgartner W., Krakowka S., Durchfeld B. In vitro cytopathogenicity and in vivo virulence of two strains of canine parainfluenza virus. // Vet. Pathol. 28(4):324-331 (1991).

34. Bemis D.A., Carmichael D.E., Appel M.J.G. Naturally occuring respiratory disease in a kennel caused by Bordeitella bronchiseptica.// Cornell Vet. 67:282293 (1977).

35. Bemis D.A., Grisen H.A., Appel M.J.G. Pathogenesis of canine bordeteliosis.// J. Infect Dis. 135:753-762(1977).

36. Bibrack B., Benary F. Seroepizootologische untersuchungen uber die bedeutung von parainfluenza-2-infektionen beim zwingerhusten in Deutschland. // Zbl. Vet. B. 22:610-614 (1975).

37. Binn L.N., Eddy G.A., Lazar E.G., Helms J. and Murnane T. Viruses recovered from laboratory dogs with respiratory disease. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 126: 140-146(1967).

38. Binn L.N., Lazar E.G., Rogul M., Shepler V.M., Swango L.J., Claypoole T., Hubbard D.W., Asbill S.G. and Alexander A.D. Upper respiratory disease in military dogs: bacterial, mycoplasmal, and viral studies. // Am. J. Vet. Rec. 29: 1809-1815 (1968).

39. Binn L.N. and Lazar E.C. Commentes on epizootiology of paraunfluenza SV5 in dog. // J. Am.Vet. Med. Aassoc. 156: 1774-1777 (1970).

40. Binn L.N., Lazar E.C., Helms J. and Cross R.E. Viral antibody patterns in laboratory dogs with respiratory disease. // Am. J. Vet. Res.31: 697-701 (1970).

41. Binn L.N., Alford J.P, Marchwicki R.H., Keefe T.J, Beattic R.J. and Wall H.G. Studies of respiratory disease in random-source laboratory dogs: viral infections in unconditioned dogs. // Lab. Aaim. Sci. 29: 48-52 (1979).

42. Bittle J.L. and Emery J.B. The epizootiology of canine parainfluenza. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 156:1771-1773 (1970).

43. Brown A.L, Bihr J.G, Vitamvas J.A. and Miera L. An alternative method for evaluating potency of modified live canine parainfluenza virus vaccine. // J. Biol. Stand. 6:271-281 (1978).

44. Chang P.W. and Hsuing G.D. Experimental infection of parainfluenza virus type 5 in mice, hamsters, and monkeys. // J. Immunol. 95: 591-601 (1965).

45. Chappuis G., Terre Y, PrecaustaP., Mougeoth H, Moreau V, Hellman C. La vaccinetion associe du chien: La vaccin pentavalent.// Rev. Med. Vet. 36: 877 (1973).

46. Choppin P.W. Multiplication of a mixovirus (SV-5) with minimal cytopathic effects and without interferens.// Virology 23:224-233 (1964).

47. Choppin P.W., Stoeckenius W. The morphology of SV-5 virus.// Virology 23:2141-2157(1968).

48. Choppin P.W., Compans R.W. Reproduction of paramyxoviruses.// Compr. Virol. 4: 95-178(1975).

49. Choppin P.W. Isolation of paramyxoviruses from patients with chronic neurologic diseases.// J. Inf. Dis. 143:501-503 (1981).

50. Chladek D.W., Williams J.M., Gerber D.L., Harris L.L. and Muidok F.M. A canine parainfluenza — Bordetella bronchiseptica vaccine: Part 1. Immunogenicity. // Am. J. Vet. Res. 12: 266-270 (1961).

51. Clapper W.E., Meade G.H. Normal flora of the nose, throat and lower intestine of dogs. // J. Bacterid. 85: 643-648 (1963).

52. Cornvel H.J.C., McCandlish I.A.P., Thompson H., Laird H.M., Wright N.G. Isolation of a parainfluenza 2 virus SV5 from dogs with respiratory disease. // Vet. Rec. 98:301-302(1976).

53. Crandell R.A., Brunlow W.B. and Davison V.E. Isolation of a parainfluenza vims from sentry dogs with upper respiratory disease. // Am. J. Vet. Res. 29: 2141-2147(1968).

54. Cuadrado R.R. An epidemiological study on parainfluenza. DA and mumps virus infection in domestic animals in New England. // Bull. O.M.S. 33:803-808 (1965).

55. Dambro N. N, Grad R., Witten M. L, Quan S. F., Sobonya R. E., Ray C.G., Devine L., Lemen R.J. Bronchoalveolar lavage fluid cytology reflects airway inflammation in beagle puppies with acute bronchiolitis. // Pediatr Pulmol. 12 (4): 213-220 (1992 Apr).

56. Davidson W.R., Appel M.J, Doster G.L., Baker O.E., Brown J.F. Diseases and parasites of red foxes, gray foxes, and coyotes from commercial sources selling to fox-chasing enclosures. // J. Wildl. Dis.28(4):581-589 (1992).

57. Dhein C.R., Gorham J.R. Canine respiratory infections. // Infectious diseases. 177-205 (1988).

58. Durchfeld B., Baumgartner W., Krakowka S. Intranasal infection of ferrets (Mustela putorius furo) with canine parainfluenza virus. // Zentralbl Veterinarmed. 38(7):505-512 (1990).

59. Emery J.B., House J.A., Bittle J.L. and Spotts A.M. A canine parainfluenza viral vaccine: immunogenicity and safety. // Am. J. Vet. Res. 37: 1323-1327 (1976).

60. Evermann J.P., Lincoln J.D. and McKiernan A.J. Isolation of a paramyxovirus from the cerebrospinal fluid of a dog withe posterior paresis. // J. Ani. Vet. Med. Assoc. 177: 1132-1134(1980).

61. Evermann J.P., Krakowka S., McKeiranan A.J., Baumgartner W.K. Properties of encephalitogenic canine parainfluenza'virus. // Arch. Virol. 68: 165-172 (1981).

62. Fontaine M., Ricq A., Brion A., Cyoret P. La rhino-amygdalite contagieuse du chien. // Bull. Acad. Vet. 30:479 (1976).

63. Fontaine M. Le infection respiratoire du chien par paramyxovirus. // Rec. Med. Vet. 158 (9-11) : 663-667 (1982).

64. Fulton R.V., Ott R.L., Duenwald J.C., Gorham J.R., Serum antibodes against canine respiratory viruses: prevalence amand dogs of eastern Washington.// Am. J. Vet. Res. 35:853-855 (1974).

65. Glazer K., Raghow R., Kinsbury D. W. Regulation of Sendai virus transcription: evidence for single promotor in vivo.// J. Virol. 21: 863—877 (1977).

66. Glickman L.T. and Appel MJ. Intranasal vaccine trail for canine infectious tracheobronchitis (kennel cough). //Lab. Anim. Sci. 31: 397-399 (1981).

67. Holzman S., Conroy M.J., Davidson W.R. Diseases, parasites and survival of coyotes in south-central Georgia. // J. Wildl. Dis. 28(4):572-580 (1992).

68. Hsuing G.D. Parainfluenza 5 virus infection in man and animals. // Progr. Med. Virol. 14: 241-274 (1972).

69. Hull R.N. The simian viruses. // In: S. Card, C. Hallauer and K.F. Meyer (Eds.), Virology Monographs 2. Springer-Verlag, Inc., New York, pp. 30-39 (1968).

70. Jakab G.S. Viral-bacterial interactions inpulmonary infection.// Adv. Vet. Sci. Comp. Med. 26:155 (1982).

71. Kalter S.S., Ratner J., Kalter G.V., Kodriguez A.R. and Kirn C.S. A survey of primate sera for antibodies to viruses of human and simian origin. // Am. J. Epidemiol. 86: 552-568 (1967).

72. Kawano M., Bando H., Ohgimoto S., Okamoto K., Kondo K., Tsurudome M., Nishio M., Ito Y. Complete nucleotide sequence of the matrix gene of human parainfluenza type 2 virus and expression of the M protein in bacteria. // Virology. 179(2):857-61 (1990).

73. Kinsbury D. W., Hsu C. H., Marti H. C. Intracellular metabolism of Sendai virus nucleocapsid. // Virology. 91: 86—94 (1978a).

74. Kinsbary D. W., Bratt M. A., Choppin P. W. et al. Paramyxoviridae. // Intervirology. 10: 137—152 (1978b).

75. Kondo K, Bando H., Kawano M., Tsurudome M., Komada H., Nishio M., Ito Y. Sequencing analyses and comparison of parainfluenza virus type 4A and 4B NP protein genes. // Virology. 174(1): 1-8 (1990).

76. Kontor E.J., Wegrzyn R.J. and Goodnow R.A. Canine infectious tracheobronchitis: effects of an intranasal live canine parainfluenza —

77. Bordetelia bronchiseptica vaccine on viral shedding and clinical tracheobronchitis (kennel cough). //Am. J. Vet. Res. 42: 1694-1698 (1981).

78. Klenk H. D., Nagai Y., Rott R. The structure and function of paramyxovirus glycoproteins. // Med. micr.164 : 35—47 (1977).

79. Lamb R. A., Choppin P. W. Determination by peptide mapping of the unique polypeptides in Sendai virions and infected cells. // Virology. 84: 469—478 (1978).

80. Lazar E.C., Swango L.J. and Binn L.N. Serologic and infectivity studiec of canine SV-5 virus. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 135: 173-176 (1970).

81. Leppert M., Kolakovsky D. 5'terminus of defective and nondefective Sendai virus genomes is pppAp. J. Virol. 25: N. 1. D. 427 (1978).

82. Love D.N. Revieu of canine viral disease.// Aust. Vet. J. 43:567-570 (1972).

83. Mathews R.E.F. Fourth report of the International committee on Taxonomy of Viruses: classification and nomenclature of viruses. // Intervirology. 7: 4-199 (1982).

84. McCandlish I.A.P., Thompson H., Cornvel H.J.C., Wright N.G. A study of dogs with kennel cough. // Vet. Res. 102 (14): 298- 301 (1978).

85. McGavin D.R., Mellows A.J., Choice L. Evidence for Australia-wide canine parainfluenza infection. // Austr. Vet. J. 66 (7) : 221 (1989).

86. McKiernan B.C., Smith A.R., Kissil M. Bacterial isolates from the cower trachea of clinically healthy dogs.// J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 20:139-142 (1984).

87. Moloney M.B., Pye D., Smith H.V., Scott P.C. Isolation of parainfluenza virus from dogs. // Austr. Vet. J. 62 (8) 285-286 (1985).

88. Moraillon R., Chappuis G. Le diagnostic différentiel des viroses respiratoires du chien. // Rec. Med. Vet. 158 (9-11): 681-686 (1982).

89. Packard M.E., Grafton-Packard B. The effect of canine parainflyenza vaccine on the spread of tracheobronhial coughs in a boarding kennel.// J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 15:241 (1979).

90. Portner A. Association of nucleocapsid polypeptides with defective RNA synthesis in a temperature-sensitive mutant of Sendai virus. // Virology. 77: 481—489 (1977).

91. Quan S.F., Lemen R.J., Witten M.L., Sherrill D.L., Grad R., Sobonya R.E., Ray C.G. Changes in lung mechanics and reactivity with age after viral bronchiolitis in beagle puppies. // J. Appl. Physiol.69(6):2034-42 (1990).

92. Quan S.F., Witten M.L., Grad R., Ray C.G., Lemen R.J. Changes in lung mechanics and histamine responsiveness after sequential canine adenovirus 2 and canine parainfluenza 2 virus infection in beagle puppies. // Pediatr Pulmonol. 10(4):236-43 (1991).

93. Raghow R., Kinsbary D. W. Structural polypeptides of Sendai virus: analysis by tryptic peptide virus mapping.— Intervirology. 8 : 122—128 (1977).

94. Rosenberg F.J., Lief F.S., Todd J.D. and Reif J.S. Studies of canine respiratory viruses. 1 .Experimental infection of dogs with an SV5-like canine parainfluenza agent. // Am. J. Epidemiol.94:147-165 (1971).

95. Saona-Black L. Infection of certain cell cultures and dogs and cats with a canine isolate of paramyxovirus. // MS Thesis, Coroell University (1969).

96. Saona-Black L. and Lee K.M. Infection of dogs and cats with a canine parainfluenza virus and the application of a conglutinating-complement-absorption test on cat serums. // Cornell Vet. 60:120-134 (1970).

97. Scheid A., Choppin P. W. Two disulfide— linked polypeptide chains constitute the active F-protein of paramyxoviruses. // Virology. 80: 54-66 (1977).

98. Sheshberadaran H., Lamb R.A. Sequence characterization of the membrane protein gene of paramyxovirus simian virus 5. // Virology. 176(l):234-43 (1990).

99. Shin S.R., Tsao K.S., Ning H.C., Lin T.Y. Diagnosis of respiratory tract viruses in 24h by immunofluorescent staining of shell vial cultures containing Madin-Darby Canine Kidney (MDSK) cells. J. Virol. Methods 81 (1-2): 77-81 (1999).

100. Tischler S. A., Hill Y.R. Kennel cough syndrome in a pet store.// J. Anim. Hosp. Assoc. 13:342(1977).

101. Thayer G.R. Canine infectious tracheobrochitis.// In Greene C.E. (ed): Clinical microbiology and infectious diseases of dog and cat. WB Saunders Co, Philadelphia. 430 (1984).

102. Thompson H., Wright N.G. and Comwell H.J.C. Contagious respiratory disease in dogs. // Vet. Bull. (London) 45:481-488 (1975).

103. Ueland K. Serological, bacteriological and clinical observations on an outbreak of canine infectious tracheobronchitis in Norway. // Vet. Ree. 126(19):481-3 (1990).

104. Wagener JS., Minnich L., Sobonya R., Taussg J.L.M., Ray C.O. and Fulginiti V. Parainfluenza type 2 infection in dogs. A model for viral lowerrespiratory tract infection in humans. // Am. Rev. Respir. Dis. 127: 771-776 (1983).

105. Wagener JS, Sobonya R, Minnich L, Taussg J.L.M. Role of canine parainfluenza virus and Bordetella bronchiseptica in kennel cough. // Am. J. Vet. Res. 45 (9) : 1862-1866 (1984).

106. Wrigt N.G, Thompson H, Cornvell H.S.C, Taylor D. Canine respiratory virus infection. // J. Small Anim. Pract. 15: 27-35 (1974).

107. Yonezawa Y. Genome analysis of virulent and attenuated strains of canine parainfluenza virus. // Brit. Vet. J. 141 (2) : 192-194 (1985 Mar-Apr).

108. Zakstelskaya L.Y, Zhdanov V.M, Yakhno M.A, Gushcnin B.V, Klimenko S.M, Demidova S.A, Konovalova N.G, Gushina E.A. Persistent SV-5 virus infection in continous cell cultures.// Acta. Virol. 20:506-511 (1976).

109. Zuffa T, Krobot P. Dokaz protilatok proti virusom infekcnej laringotrcheitidy a parainfluenzy 2 u psov v chovov na uzemi CSSR. // Vet. Med. 32(11): 689-694.