Биокаталитические свойства лакказ из различных источников

Горбачева, Марина Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биокаталитические свойства лакказ из различных источников
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биокаталитические свойства лакказ из различных источников"

и о

На правах рукописи

Горбачева Марина Анатольевна

Биокаталитические свойства лакказ из различных источников

Специальность 03.00.04 —биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2009 д д Ь

003469994

Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н.Баха РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

С.В. Шлеев

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

И.Н. Курочкин кандидат химических наук, Т.В. Тихонова

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт физиологически активных веществ РАН

Защита состоится 2» М <3 <Я 2009 г. в ^ часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп.1.

Автореферат разослан иг.

Ученый секретарь

диссертационного совета, К/М п

кандидат биологических наук А //I А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лакказа является одним из ключевых ферментов, входящих, наряду с лигнинпероксидазой и марганецпероксидазой, в лигнолитический комплекс древоразрушающих грибов. Этот фермент также входит в состав сока лакового дерева Rhus vernicifera. В последние годы лакказо-подобные медьсодержащие оксидазы были обнаружены и в бактериях. Все названные оксидазы из различных источников объединяет способность катализировать реакции окисления широкого круга органических и неорганических субстратов молекулярным кислородом с восстановлением последнего непосредственно до воды, минуя стадию образования пероксида водорода. Это обстоятельство, а так же разнообразие физиологических функций, выполняемых лакказами в различных организмах, делает их привлекательными объектами для фундаментальных и прикладных исследований.

Движущей силой реакций окисления, катализируемых лакказами, является разность редокс-потенциалов субстрата-донора и первичного акцептора электронов — Т1 центра лакказ. От разности этих потенциалов в отсутствии влияния стерического фактора зависит скорость реакции окисления субстратов. В связи с этим было интересно исследовать реакции переноса электронов с субстратов, имеющих одинаковое строение, но отличающиеся значениями редокс-потенциалов, на активный центр лакказ с различными значениями потенциалов Т1 центров, а так же влияние разнообразных факторов на возможность протекания реакций окисления соединений с различной структурой и редокс-потенциалами.

Лакказы способны катализировать реакции безмедиаторного восстановления молекулярного кислорода на электродах. Поскольку в настоящее время активно исследуется возможность создания биокатодов и биоанодов, в том числе и с использованием лакказ, изучение влияния редокс-потенциала иона меди Т1 лакказ, выделенных из различных источников, а так же pH и состава раствора на эффективность прямого биоэлектрокатализа является в настоящее время весьма актуальным.

Высоко редокс-потенциальные лакказы из базидиальных грибов Trameíes hirsuta и Cereña maxima, низко редокс-потенциальная растительная лакказа Rhus vernicifera, а так же рекомбинантный бактериальный фермент Bacillus halodurans, экспрессированный в Е. coli, являются хорошими объектами для этих исследований. Кроме того, исследование механизма функционирования указанных выше ферментов представляет несомненный интерес с точки зрения

возможности и/или ограниченности их использования в биотехнологических процессах.

Научная новизна работы. Сравнительное исследование катализа реакций окисления субстратов с различными окислительно-восстановительными потенциалами высоко и низко редокс-потенциальными лакказами позволило выдвинуть предположение о возможных причинах различий физиологической роли этих ферментов в реакциях образования и деструкции лигнина с участием природных редокс-медиаторов. Впервые показан эффект прямого биоэлектрокатализа с участием рекомбинантной лакказо-подобной медьсодержащей оксидазы В. Иа1ос1игап$. Установлено, что для функционирования этого фермента необходимо наличие в реакционной среде ионов двухвалентной меди. В отличие от грибных и древесной лакказ, оксидаза В. каЫигапБ способна катализировать реакции электровосстановления молекулярного кислорода при нейтральных значениях рН раствора в присутствии ионов хлора.

Показано, что низкопотенциальная растительная лакказа К. уегпЫ/ега может катализировать окисление органических субстратов - доноров атомов водорода при нейтральных и слабощелочных значениях рН раствора, в отличие от высокопотенциальных грибных лакказ. Этот растительный фермент проявляет электрокаталитическую активность в реакциях безмедиаторного электровосстановления молекулярного кислорода как при кислых, так и нейтральных значениях рН раствора и в присутствии анионов хлора.

Практическая значимость работы. Сравнение электрокаталитических свойств лакказ из различных источников в реакциях восстановления молекулярного кислорода вносит вклад в понимание механизма прямого безмедиаторного биоэлектрокатализа лакказами, что дает возможность проведения направленного мутагенеза лакказ для получения электрокатализаторов, отвечающих требованиям, предъявляемым к биокатализатору катода имплантированного биотопливного элемента. Результаты исследований эффективности катализа лакказами в зависимости от значения их редокс-потенциалов показали, что только высоко редокс-потенциальные ферменты могут быть использованы в свободно -радикальной реакции окислительной полимеризации анилина с целью получения электропроводящего полимера.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось: сравнение гомогенных каталитических и гетерогенных биоэлектрокаталитических характеристик высоко редокс-потенциальных грибных лакказ и низко редокс-

потенциальной растительной лакказы, а так же определение некоторых биохимических и электрокаталитических свойств бактериальной медьсодержащей лакказо-подобной оксидазы;

выяснение возможности использования этих ферментов в качестве биокатализатора реакции электровосстановления молекулярного кислорода на биокатоде топливного элемента и для проведения свободно-радикальной окислительной полимеризации анилина. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение эффективности биокаталитического окисления цианидных комплексов переходных металлов, имеющих различные значения стандартных редокс-потенциалов, грибной и древесной лакказами, а так же реакций электровосстановления молекулярного кислорода на электродах из углеродных материалов, модифицированных лакказами из различных источников, при различных значениях рН и составах рабочего раствора.

2. Сравнить эффективность реакций окисления ионов двухвалентного марганца, хелатированных анионами дикарбоновых кислот, в присутствии лакказ Т. hirsuta, С. maxima и R. vernicifera и выяснить возможность окисления нефенольных подструктур лигнина комплексами двух и трехвалентного марганца.

3. Выяснить возможность проведения биокаталитического синтеза водной дисперсии наночастиц электропроводящего полианилина и поли-(2-акриламидо-2-метил-1-пропансульфоновой) кислоты с участием высоко- и низкопотенциальных лакказ.

4. Определить некоторые биохимические характеристики лакказо-подобной оксидазы из В. halodurans и исследовать ее биоэлектрокаталитические свойства.

5. Выяснить возможность использования лакказ и лакказо-подобной оксидазы в качестве катализаторов реакции электровосстановления молекулярного кислорода на катоде биотопливного элемента, протекающей по прямому безмедиаторному механизму.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на научных конференциях: Международной конференции "Биокатализ-2007" 17-22 июня 2007, Москва-С. Петербург РФ и IV Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта 2007 г.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, в числе которых 2 статьи в зарубежном и 2 в отечественных

журналах, 2 тезисов докладов и 1 статья в сборнике МГУИЭ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков и ZJ таблиц. Список цитируемой литературы включает2.ÏÏ/ наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной pà6oTbi, изложена . актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава представляет собой обзор литературы, посвященный описанию основных физико-химических и биохимических свойств трех групп изучаемых в настоящее время лакказ: растительных, грибных и бактериальных. Рассматривается строение активных центров ферментов, механизм катализа, возможные пути использования лакказ для фундаментальных и прикладных исследований.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

Объектами исследования являлись лакказы из грибов Trametes hirsuta и Cereña maxima, фермент из сока лакового дерева Rhus vernicifera и медьсодержащий лакказо-подобный рекомбинантный фермент Bacílus halodurans.

Очистка ферментов. Частично очищенный ферментный препарат растительной лакказы R. vernicifera был любезно предоставлен профессором Б. Рэйнхаммером (Швеция). Ферменты из культуральной жидкости Т. hirsuta и С. maxima были очищены путем осаждения сульфатом аммония с последующей очисткой методом ионообменной хроматографии низкого давления. Лакказы Т. hirsuta, С. maxima и R. vernicifera были очищены до гомогенного по данным ДДС-электрофореза состояния на гельфильтрационной колонке BioSep-SEC-S 2000 Phenomenex (США) с использованием ВЭЖХ - системы «Стайер» («Аквилон», Россия). Бактериальный фермент В. halodurans был любезно предоставлен проф. , Дитмаром Халтрихом (Австрия) и использовался без дополнительной очистки. Коммерческий препарат лакказы Myceliophthora termophila фирмы «Novozymes» был очищен по описанной ранее методике для коммерческого препарата Dení-Lite.

Исследование рН-зависимости скорости реакций и кинетические измерения. Определение каталитических констант ферментативных реакций, катализируемых лакказами, проводили на кислородном электроде типа Кларка, используя анализатор BAS CV-50W («BAS», США).

Скорость ферментативной реакции рассчитывали по изменению тока при потенциале -600 мВ, используя анализатор BAS CV-50W («BAS», США). Отклик электрода пересчитывали на изменение концентрации кислорода в системе. Кинетические параметры ферментативных реакций вычисляли по уравнению Михаэлиса-Ментен, используя компьютерную программу Microcal Origin (версия 5.0). При расчете константы скорости (ккат) и эффективности катализа (£каЖм) учитывали стехиометрию реакции. Исходную концентрацию дикислорода в буферном растворе принимали равной 0.26 мМ. При определении каталитических констант ферментативных реакций в качестве субстратов - доноров электронов использовали K4Fe(CN)6> K„Mo(CN)8i K4W(CN)8, K40s(CN)6, АБТС, а в качестве субстратов - доноров атомов водорода - гидрохинон, гваякол, серингалдазин.

Исследование рН зависимости скорости реакций проводили как с использованием кислородного электрода, так и спектральным методом с использованием спектрофотометра «НкасЫ-557»(Япония) в диапазоне рН 3.0-9.0 в 0.04 M универсальном буфере.

Регистрация окисления Mr?*-комплексов дикарбоновых кислот, катализируемого лакказами. Реакцию окисления Мп2+, катализируемую лакказами, проводили в 0.1 M Na-тартратном и Na-оксалатном буферах рН 5.0 в присутствии 0.1 мМ MnS04. Продукт реакции - трехвалентный марганец образует низкостабильные комплексы с тартрат- и оксалат-анионами, имеющие максимум поглощения при 238 (£>38=6500 M"W) и 270 нм (Ç27o=5500 M'W), соответственно. Образование продуктов реакции — ионов трехвалентного марганца регистрировали спектрофотометрически.

Электрохимические исследования. Циклические вольтамперограммы записывали в интервале потенциалов 0 — 1200 мВ, используя анализатор BAS CV 50W(CI1IA), функционирующий в трехэлектродном режиме. В качестве рабочего электрода использовали графитовый и стеклоуглеродный электроды. Перед проведением экспериментов поверхность стеклоуглеродного электрода последовательно полировали суспензией AI2O3 и промывали бидистиллированной водой. Поверхность графитового электрода многократно полировали на влажной наждачной бумаге (Tufback Durite PI 200, США), затем промывали бидистиллированной водой и высушивали.

В третьй главе приводятся собственные результаты и их обсуждение.

Эффективность биокаталитического окисления цианидных комплексов переходных металлов с различными редокс-потенциалами с участием высокопотенциальной лакказы Т. hirsuta и низкопотенциальндго фермента

R. vernicifera.

Одной из важнейших движущих сил реакций окисления субстратов лакказ является разность редокс-потенциалов субстрата и Т1 центра фермента. Для выяснения зависимости эффективности катализа лакказами от разности окислительно-восстановительных потенциалов были выбраны комплексы переходных металлов сходного строения: K4Fe(CN)6, K4W(CN)8, K40s(CN)6, K4Mo(CN)8 с известными значениями стандартных окислительно-восстановительных потенциалов. Такой выбор был обусловлен тем, что реакции окисления этих субстратов не сопровождаются перестройкой их молекул в отличие от объектов органической природы. Кроме того, при использовании этих соединений не возникает проблем с растворимостью субстратов, поскольку цианидные комплексы хорошо растворимы в водных растворах, что позволяет исследовать параметры реакций в одинаковых условиях.

Кинетические параметры реакций, катализируемых лакказами Т. hirsuta (Е=780 мВ) и R. vernicifera (Е=420 мВ) по ряду гомологичных субстратов представлены в таблице 1. Из таблицы видно, что лакказа R. vernicifera не может катализировать окисление субстратов с потенциалом выше 640 мВ.

Табл. 1. Кинетические параметры реакций, катализируемых лакказами*

Субстрат E0', мВ (oth. НВЭ) Trametes hirsuta (780 мВ OTH. НВЭ) Rhus vernicifera (420 мВ отн. НВЭ)

k c"1 Км, мкМ ^кат^-М* мкМ''-c"1 ^кат> С Км, мкМ kvJKu, мкМ-'-с1

K4MO(CN)8 780 169 671 0.251 - - -

ÍMOS(CN)6 640 221 410 0.536 38 1390 0.027

K4W(CN)8 520 226 259 0.873 63 770 0.081

K4Fe(CN)6 435 230 178 1.292 64 462 0.138

Ошибка при расчетах составляла не более 10 %.

Для обеих лакказ показана линейная зависимость логарифма эффективности катализа (kKJKM) от разности редокс-потенциалов Т1 центров исследованных ферментов и цианидных комплексов переходных металлов (рис.1). Это свидетельствует о том, что скорость-лимитирующая стадия окисления этих соединений включает внешнесферный механизм переноса электронов, предложенный Маркусом. На основании полученных экспериментальных данных можно сделать вывод, что, в основном, соединения с редокс-потенциалами, превышающими значение редокс-потенциалов Т1 центра лакказ более чем на 220 мВ не являются «прямыми» субстратами этих ферментов.

Рис.1. Зависимость

Т. hirsuta

6.0

25.5 ^ 5.0-1

4.5-

"K4Fe(CN)6 "K,W(CN),

K4Os(CN)( 'K4Mo(CN)g R. vernicifera / K,Fe(CN)6

K4W(CN)g < К Os(CN)

-300 -200 -100 0 100 200 300 EE-ES, MB

400

^(кклЖм) ОТ разности редокс-потенциалов Т1 центра лакказ и редокс-потенциалов цианидных комплексов переходных металлов.

Условия: 0.04 М универсальный буфер рН 4.0,1=25°С

Так же были измерены константы Михаэлиса по кислороду для обеих лакказ. Нами было показано, что Км ферментов по кислороду для лакказы Т. hirsuta составляет 100 мкМ, а для лакказы R. vernicifera - 200 мкМ при использовании в качестве субстрата ферроцианида калия.

Окисление ионов Мп2+, хелатированных тартратными и оксалатными анионами, в присутствии грибных и древесной лакказ.

Марганец в микроколичествах присутствует в различных лигноцеллюлозных материалах. Среднее содержание марганца в растениях приблизительно равно 0.001 %. Марганец служит катализатором процессов дыхания растений, принимает участие в процессе фотосинтеза. В еловой древесине присутствует большая группа переходных металлов; в наибольшей концентрации марганец и железо содержатся в ксилеме. Так, содержание марганца достигает 3.9 мг на 100 грамм абсолютно сухой древесины. Ионы трехвалентного марганца являются сильными окислителями и способны непосредственно окислять нефенольные подструктуры лигнина, приводя к его деполимеризации. Дикарбоновые и а-оксикарбоновые кислоты являются

оптимальными природными комплексонами двух и трехвалентных ионов марганца. Как уже было отмечено ранее, редокс-потенциал Т1 центров грибных лакказ практически вдвое превышает редокс-потенциал древесной лакказы. В то же время редокс-потенциал пары Мп2+/Мп3+ составляет 1510 мВ (отн. НВЭ), что существенно превышает потенциал первичных акцепторов электронов изучаемых ферментов. Это делает процесс окисления ионов марганца термодинамически невозможным.

Прямым электрохимическим методом было показано, что образование комплекса марганца с хелатирующими агентами снижает редокс-потенциал пары Мп2+/Мп3+. Потенциал средней точки пары Мп2+/Мп3+ в тартратном буфере составляет +940 мВ (НВЭ), что можно принять за редокс-потенциал этой пары. Таким образом, полученное экспериментальным путем значение редокс-потенциала тартратных комплексов марганца указывает на принципиальную возможность их медленного окисления высокопотенциальными лакказами.

Для проверки этого предположения была изучена реакция ферментативного окисления хелатированных ионов двухвалентного марганца в присутствии лакказ Т. hirsuta и R. vernicifera. На рис. 2. показаны спектры образования оксалатного комплекса трехвалентного марганца в процессе ферментативной реакции, катализируемой лакказой Т. hirsuta. На вставке к рисунку приведена зависимость увеличения оптического поглощения продуктов реакции во времени. Скорость ферментативного окисления комплексов ионов двухвалентного марганца невелика и с увеличением времени наблюдается отклонение от линейной зависимости, что возможно связано с нестабильностью образующихся продуктов реакции. Обращает на себя внимание тот факт, что оптимум рН активности реакции окисления ионов двухвалентного марганца сдвинут в нейтральную область и находится в интервале рН 5.0-6.0, в то время как для цианидных комплексов переходных металлов рН-оптимум располагается в более кислой области.

В связи с тем, что два вышеупомянутых фермента — грибная и древесная лакказы в природе выполняют различные функции, а именно, высокопотенциальная грибная лакказа Т. hirsuta участвует в реакциях синтеза и деструкции лигнина, а фермент из сока лакового дерева R. vernicifera участвует в реакциях образования лигнина, было высказано предположение, а впоследствии и показано, что лакказа R. vernicifera из-за низкого значения редокс-потенциала Т1 центра не катализирует реакцию окисления хелатированных ионов двухвалентного марганца.

Рис. 2. Изменение во времени спектров поглощения Мп3+-оксалатного комплекса при катализе лакказой Т. hirsuta.

1 -10 мин; 2 -20 мин;

3-30 мин; 4 -40 мин;

5-60 мин; б - 80 мин.

X =270 нм. На вставке показана зависимость увеличения оптического поглощения продуктов реакции во времени.

Рис. 3. Профиль элюции с колонки «Luna С18» (обратнофазовая гидрофобная хроматография высокого давления) продуктов окисления вератрового спирта.

А - хроматограмма вератрового спирта (1), вератровой кислоты (2) и вератрового альдегида (3). Б - хроматограмма продуктов, образующихся в результате окисления вератрового спирта в системе, содержащей лакказу Т. hirsuta и хелатированные ионы марганца.

Условия: 0.1 М тартратный буфер рН 5.0, МО"6 М Т. hirsuta, 1 мМ MnSO-i, 0.5 мМ вератровый спирт. Время реакции 10 дней. Элюирование проводили линейным градиентом 5-95% ацетонитрила в 0.086% фосфорной кислоте со скоростью 1 мл/мин. в

течение 30 мин.

Косвенным свидетельством различий физиологических ролей является тот факт, что система, содержащая лакказу Т. hirsuta и хелатированные ионы трехвалентного марганца, способна катализировать окисление одного из многих нефенольных компонентов лигнина-вератрового спирта до вератровой кислоты, что было показано спектральным и хроматографическим методом (рис. 2, 3). Древесная

лакказа не катализирует реакцию окисления хелатированных ионов марганца и, соответственно, она не катализирует реакцию окисления вератрового спирта.

Сравнение рН-завиеимоети реакций окисления субстратов-доноров электронов и доноров атомов водорода высоко- и низкопотенциальными

лакказами.

Согласно существующим представлениям, все субстраты лакказ можно разделить на две группы: доноры электронов и доноры атомов водорода. Было показано, что грибные лакказы катализируют окисление обеих групп субстратов только при кислых значениях рН раствора (рис. 4.А). В то же время, лакказа Я. уегша/ега катализирует окисление субстратов - доноров атомов водорода, таких как гваякол, гидрохинон, которые являются структурными единицами лигнина, в нейтральных и слабощелочных растворах, а окисление субстратов - доноров

Рис. 4. Зависимость относительной активности реакций окисления субстратов-доноров от рН реакционной среды при катализе лакказами Т. hirsuta (А) и R, verniáfera (Б).

1(А) - АБТС; 2(а) - K4Fe(CN)6; 3(*)-гидрохинон;

4(4) - серингалдазин; 5(Ш1)- 3,4-диметоксифенол.

В настоящее время мы не можем однозначно объяснить этот эффект, однако на основании имеющихся литературных данных можно предположить, что различия в рН - зависимостях по субстратам - донорам электронов и донорам атомов водорода • для обеих лакказ связано с протеканием реакций окисления второй группы субстратов, катализируемой лакказой R. vernicifera, по другому механизму.

Возможность синтеза электропроводящего полианилина с участием высоко- и низкопотенциальных лакказ.

Одним из возможных направлений практического использования лакказ является органический синтез. Поэтому в качестве модели для исследования такой возможности нами была выбрана реакция получения электропроводящего полианилина. В настоящей работе было проведено сравнение результатов свободно-радикальной окислительной полимеризации анилина с участием лакказ из различных источников, имеющих различные редокс-потенциалы Т1 центров ферментов.

Полианилин (ПАНИ) относится к группе электропроводящих полимеров, которые интенсивно исследуются в последние годы, что связано с широкими возможностями их практического использования

Полианилин можно получать тремя способами: химическим (в подавляющем большинстве), электрохимическим и ферментативным с участием пероксидаз или лакказ. При ферментативном синтезе реакция образования ПА происходит в результате окисления мономера кислородом воздуха в присутствие лакказ по следующей схеме:

В качестве катализатора реакции полимеризации анилина использовали высоко редокс-потенциальную лакказу из базидиального гриба Т. hirsuta, низкопотенциальный фермент из сока лакового дерева R. vernicifera и для сравнения с ними коммерческий препарат рекомбинантного фермента Myceliophthora termophila фирмы «Novozymes».

с=о

[_н2с-сн-]п

Рис. 5. Структурная формула мономерного звена ПАМПС:

поли-(2-акриламвдо-2-метил-1-пропансульфоновая HN кислота)

\ ^СН3

Н2с^ \ I СНз S03H

Задачей, поставленной в этой части работы, являлось выяснение различий в эффективности катализа реакции полимеризации анилина этими ферментами. Для получения водной дисперсии электропроводящего полианилина использовали поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропансульфоновую) кислоту - ПАМПС, структурная формула которого приведена на рис. 5. При синтезе полианилина ПАМПС выполняет двойную функцию: является одновременно матрицей для полимеризации мономера и кислым допантом ПАНИ.

2.0т

300 400 500 600 700 Длина волны, нм

800 900

Рис. 6. УФ-видимые спектры водных дисперсий наночастиц ПАНИ/ПАМПС, синтезированых с использованием различных лакказ.

А - R. vernicifera; Б- М íhermophila; В- Т. hirsuta (разбавление водной дисперсии полимера в 10 раз) Условия: 50 мМ цитратно-фосфатный буфер рН 4.5, 3.65 мг/млR. vernicifera, 3.65 мг/мл МIhermophila, 0.008 мг/мл Т. hirsuta. Время синтеза 100 часов

УФ-видимые спектры водных дисперсий ПАНИ/ПАМПС, полученных с использованием ферментных препаратов из различных источников, представлены на рис. 6. Образование допированного электропроводящего полианилина проявляется на электронных спектрах тремя полосами поглощения (рис. 6, В). Первая полоса в области -330 нм соответствует я—я* переходу внутри бензоидных сегментов. Вторая (-420 нм) и третья (-750 нм) полосы соответствуют допированной электропроводящей форме полианилина и указывают на образование полярона.

Первой стадией окисления анилина является образование катион-радикала. Процесс окисления анилина на электроде при значениях рН, соответствующих условиям синтеза, начинается при потенциале -950 мВ (отн. НВЭ). Редокс потенциал Т1 центра высокопотенциальной грибной лакказы Т. hirsuta составляет 780 мВ (отн. НВЭ). Благодаря небольшой разнице редокс-потенциалов реакция окисления анилина с участием лакказы Т. hirsuta может протекать с достаточно большой скоростью (см. рис. 6, В). Лакказа R. vernicifera имеет редокс-потенциал первичного акцептора электронов - Т1 центра фермента -420 мВ отн. НВЭ. Разница в потенциалах начала окисления анилина и Т1 центра этого фермента составляет -530 мВ, что делает невозможным протекание реакции окислительной полимеризации анилина (рис. 6, А).

Потенциал Т1 центра лакказы М. thermophila фирмы «Novozymes» по литературным данным составляет -480-640 мВ (отн. НВЭ). Достаточно высокая разность потенциалов начала окисления анилина и Т1 центра рекомбинантного фермента приводит к низкой степени превращения мономеров, что видно на рис. 6, Б. При этом необходимо отметить, что представленный на рисунке спектр водной дисперсии интерполимерного комплекса полианилина, синтезированный с использованием высокопотенциальной лакказы Т. hirsuta (рис. 6, В), записан при 10-кратном разбавлении раствора, т.е. при использовании лакказы Т. hirsuta выход конечного продукта синтеза - полианилина во много раз выше, чем при синтезе с участием рекомбинантного фермента М. termophila. Помимо этого, концентрация белка в реакционной смеси при использовании лакказы Т. hirsuta составляла 8-10"3 мг/мл, в то время как концентрация рекомбинантного фермента при синтезе составляла 3.65 мг/мл. Электропроводимость образца полианилин/ПАМПС, синтезированного с использованием лакказы Т. hirsuta, измеренная стандартным двухточечным методом, составляла -10"2 См/см, что не уступает электропроводности полианилина, полученного традиционным химическим

методом с использованием персульфата аммония. Таким образом, эффективную полимеризацию анилина можно осуществить только с использованием высоко редокс-потенциальных лакказ.

Биоэлектрокаталитическое восстановление молекулярного кислорода на углеродных электродах с участием лакказ Т. hirsuta,С. maxima hR. vernicifera.

В 1978 году советскими учеными был открыт эффект «прямого безмедиаторного биоэлектрокатализа» реакций восстановления молекулярного кислорода на электродах с адсорбированной на них лакказой из гриба Trametes versicolor. Суть этого явления состоит в том, что электрод заменяет субстрат-донор электронов лакказы в каталитической реакции. С учетом появившихся в последнее время данных по структуре многих лакказ схематически этот процесс можно представить следующим образом (рис. 7.):

j.iVnp'ji; Молекула лакказы Рис. 7. Схема

электровосстановлен ия молекулярного НгО кислорода на электроде с °2 адсорбированной лакказой

Прямой Внутри ферм ентн ый

электронный электронный перенос п еренос = 8 А = 13 А

Из общих соображений, эффективность биоэлектрокатализа лакказой может зависеть от следующих факторов: каталитической активности фермента; редокс-потенциала Т1 центра; pi белковой глобулы; величины углеводной части и заряда поверхности электрода. Основные биохимические характеристики исследуемых в настоящей работе лакказ, за исключением бактериальной лакказо-подобной оксидазы В. halodurans, представлены в табл.2.

Однако, наибольший вклад в эффективность биоэлектрокаталитического восстановления молекулярного кислорода, по-видимому, вносит величина редокс-потенциала ионов меди Т1 центра лакказ, а так же рН и состав среды. Методом циклической вольтамперометрии было проведено сравнение электрохимических реакций восстановления молекулярного кислорода с участием лакказ Т. hirsuta, С. maxima и R. vernicifera, адсорбированных на электродах из спектрального графита. Влияние расстояния внутримолекулярного переноса во всех

исследованных лакказах не учитывалось и считалось, что оно мало влияет на общую эффективность биоэлектрокаталитического процесса. Табл. 2.

Некоторые биохимические характеристики грибных и растительной

лакказ.

Лакказа р1 М\у, кДа Содержание ионов меди Углеводная часть, % Редокс-потенциал Т1 центра, мВ

Т. ЫгзШа 4.0 70±2 4 12 780±10

С. тахта 3.5 57±5 4 13 750±10

Я. \ernicifera 8.2 120±10 4 40 420±20

Потенциал, мВ (отн. НВЭ) Потенциал, мВ (отн. НВЭ)

Рис. 8. Циклические вольтамперограммы реакций электровосстановления молекулярного кислорода, записанные на графитовых электродах, модифицированных различными лакказами.

1 -иммобилизованная лакказа; 2-фон в отсутствие фермента. Условия: 40 мМ универсальный буфер, скорость развертки потенциала электрода 10 мВ/сек., начальный потенциал электрода 1200 мВ.

На рис. 8. представлены циклические вольтамперограммы ^модифицированных и модифицированных лакказами электродов из спектрального графита.

Как видно из рисунков, редокс-потенциал начала реакции электровосстановления молекулярного кислорода на электродах с иммобилизованной лакказой зависит от значения редокс-потенциала Т1 центра ферментов. Для электрохимической реакции с участием высокопотенциальных грибных лакказ из Т. hirsuta (Е=780±10 мВ) и С. maxima (Е=750±10 мВ) при рН 4.0 начало реакции электровосстановления молекулярного кислорода различается незначительно, и коррелирует с небольшой разницей в значениях редокс-потенциалов их Т1 центров (рис. 8).

Для низкопотенциальной древесной лакказы при рН 4.0 потенциал начала электрохимического восстановления молекулярного кислорода смещен в область отрицательных значений приблизительно на 350 мВ по сравнению с грибными лакказами (рис. 8). Это согласуется с литературными данными по потенциометрическому титрованию Т1 центров лакказ.

Реакции электровосстановления молекулярного кислорода на электродах, модифицированных лакказами, ингибируются ионами хлора и фтора. При кислых значениях рН рабочего раствора (4.0) ингибирование электрокаталитических реакций ионами хлора составляет приблизительно 30% для лакказ Т. hirsuta и R. vernicifera при значении потенциала 0.2 В (отн. НВЭ) относительно исходной электрокаталитической активности (рис. 9).

Следует отметить, что при таком же рН рабочего раствора биоэлектрокаталитическая реакция восстановления молекулярного кислорода как для высоко-, так и для низкопотенциальных лакказ полностью ингибируется ионами фтора при концентрации последних свыше 1 мМ.

Данные, полученные при исследовании биоэлектрокаталитического процесса подтверяедаются результатами экспериментов по ингибированию этих лакказ хлорид- и фторид-ионами в гомогенных реакциях. Было показано, что в гомогенных реакциях ингибирование лакказы Т. hirsuta ионами хлора и фтора при рН 4.0 протекает по различным механизмам: конкурентному для хлорид-ионов и неконкурентному для ионов фтора. Константа ингибирования грибной лакказы Т. hirsuta ионами хлора составила 1.5 мМ, а фторид-ионами-0.04 мМ при использовании в качестве субстрата ферроцианида калия.

200 400 600 800 1000 1200 Потенциал, мВ (отн. НВЭ)

О 200 400 600 800 1000 Потенциал, мВ (отн. НВЭ)

R. vernicifera рН.7.6

200 400 600 т 1000 1200

Потенциал, мВ (отн. НВЭ)

О 200 400 600 800 1000 1200 Потенциал, мВ (отн. НВЭ)

Рис. 9. Ингибироваиие биоэлектрокаталитической реакции R. vernicifera и Т. hirsuta ионами хлора.

1-иммобилизованная лакказа; 2-иммобилизованная лакказа и 100 мМ NaCl; 3-фон в отсутствие фермента.

Условия: 40 мМ универсальный буфер, 100 мМ NaCl, скорость развертки потенциала электрода 10 мВ/сек., начальный потенциал электрода

1200 мВ.

Важным отличием реакций электрокатализа высоко- и низкопотенциальными лакказами является различие в электрокаталитической активности при разных значениях рН раствора, в котором протекает ферментативная реакция.

На рис. 10. приведена зависимость влияния рН среды на относительную эффективность реакции электрокаталитического восстановления молекулярного кислорода на графитовом электроде, модифицированном лакказами С. maxima и R. vernicifera, в интервале рН от 3.0 до 8.0 при потенциале электрода 400 мВ отн. НВЭ.

S? 6040-

lOO

20-

80-

С "------'-''era

3 4 5 6 7 8 pH универсального буфера

Рис. 10. Влияние рН среды на относительную эффективность реакции электрокаталитического восстановления молекулярного

кислорода на графитовых электродах, модифицированных лакказами С. maxima и R. vernicifera. Условия: 40 мМ универсальный буфер, потенциал 400 мВ, скорость развертки потенциала 10 мВ/сек.

Из рисунка видно, что pH-оптимум реакции электровосстановления молекулярного кислорода на электроде с высокопотенциальной грибной лакказой смещен в область кислых значений pH раствора по сравнению с электродом, модифицированным древесной лакказой. При pH 7.0 электрод, модифицированный грибной лакказой С. maxima практически электрохимически неактивен, в то время, как pH-оптимум электрокаталитической активности электрода с лакказой R. vernicifera находится в нейтральной области при pH 6.5-7.0. Найденный оптимум pH активности древесной лакказы в гетерогенной биоэлектрокаталитической системе подобен аналогичному pH-оптимуму этого фермента в гомогенных реакциях окисления субстратов-доноров атомов водорода.

Следует отметить, что биоэлектрокатализ с использованием низкопотенциальной лакказы при pH 7.6 так же ингибируется ионами хлора приблизительно на 30% по сравнению с ее первоначальной активностью, в то время как электрокаталитической активности грибных лакказ при этом значении pH раствора не наблюдалось вообще (рис. 9).

Электрокаталитические свойства бактериальной медьсодержащей лакказо-подобной оксидазы Bacillus halodurans.

В последнее десятилетие в литературе появились описания бактериальных лакказо-подобных медьсодержащих оксидаз, которые обладают лакказной активностью, но имеют существенные отличия в физиологических и биохимических свойствах по сравнению с грибными и растительными лакказами. Считается, что эти бактериальные ферменты способны катализировать реакции окисления различных субстратов при нейтральных значениях pH раствора и в присутствии значительных концентраций хлорид-ионов. Поэтому эти ферменты

являются интересными объектами для изучения с целью создания катода имплантируемого биотопливного элемента.

В качестве объекта настоящего исследования мы использовали рекомбинантный фермент В. НаЫигат, любезно предоставленный нам проф. Дитмаром Халтрихом (Австрия) в рамках выполнения совместных исследований. Препарат фермента имел невысокую удельную активность 0.025 и/мг, измеренную по окислению АБТС.

Перед изучением поведения лакказо-подобной оксидазы в биоэлектрокаталитических системах были определены ее некоторые биохимические характеристики, необходимые для подбора условий функционирования фермента на электроде. Бактериальная медьсодержащая оксидаза имела характерное для классических голубых лакказ поглощение в области ^.=610 нм. Молекулярная масса полученного фермента равнялась 56 кДа.

о4

100

о я со я

Ü а

о ё

6 7

pH буфера

Рис. 11. Зависимость относительной

активности реакции окисления серингалдазина,

катализируемой бактериальной оксидазой Bacillus halodurans, от pH

реакционной среды. Условия: 12.5 мМ трис-НС1 буфер, 1 мМ CuS04, 22 мкМ серингалдазина, 100 мМ NaCl, t=45° С

Кривая зависимости активности бактериального фермента от рН раствора при использовании в качестве субстрата серингалдазина, имела колоколообразный вид, характерный для грибных лакказ, но максимум активности был смещен в область нейтральных и слабощелочных значений рН раствора (рис. 11). Отличительной чертой исследуемого фермента являлась активация оксидазы ионами хлора, что хорошо видно на рис. 12.

При увеличении в растворе концентрации МаС1 вплоть до 100 мМ наблюдалось двухкратное увеличение активности бактериального фермента. Дальнейшее повышение концентрации ионов хлора в растворе не давало положительного эффекта.

Хочется отметить, что бактериальная оксидаза проявляла каталитическую активность лишь в присутствии ионов двухвалентной меди в концентрации 1 мМ, что возможно связано со слабым взаимодействием ионов меди активного центра с апоферментом и их возможной потерей белковой глобулой фермента в растворе.

Была показана возможность быстрого и обратимого восстановления и окисления фермента на золотом электроде путем прямого электронного транспорта между золотым электродом и исследуемой бактериальной оксидазой В. Иа1ос1игап$ в отсутствие редокс медиатора. Редокс-потенциал иона меди Т1 центра фермента, определенный методом потенциометрического редокс-титрования равнялся 325±10 мВ (отн. НВЭ). Таким образом, фермент В. ксйоёигат относится к группе низко редокс-потенциальных лакказ.

240-,

100 200 300 400 Концентрация №С1, мМ

Рис. 12. Зависимость активности оксидазы

В. Нсйойигат от концентрации хлорид-ионов. Условия: 15 мМ К-фосфатный буфер рН 7.0,1 мМ Си304, 22 мкМ серингалдазин, 1=45° С

500

Была исследована возможность прямого электронного переноса между оксидазой из В. Иа1ос/игапя и графитовым электродом в аэробных условиях. При насыщении раствора молекулярным кислородом на модифицированном оксидазой электроде наблюдалась биокаталитическая реакция электровосстановления молекулярного кислорода (рис. 13).

Следует отметить, что потенциал начала электровосстановления молекулярного кислорода находится примерно на 120 мВ положительнее редокс-потенциала Т1 центра фермента, рассчитанного по данным редокс титрования. Биоэлектрокаталитическая активность фермента В. ¡ийойигапь была незначительной при отсутствии в рабочем растворе ионов двухвалентной меди. Эти результаты хорошо согласуются с данными по измерению каталитической активности исследуемого фермента в гомогенной системе.

Константа Михаэлиса по кислороду, рассчитанная для лакказо-подобной медьсодержащей оксидазы В. ИаШигапБ в гомогенной системе с использованием в качестве донора электронов ферроцианида калия, составила ~50 мкМ и была близка по значению к константе по кислороду для этого же фермента, полученной для гетерогенной биоэлектрохимической системы при потенциале 300 мВ (отн. НВЭ). Эти константы бактериальной оксидазы в несколько раз ниже по сравнению с аналогичными Км по кислороду, полученными для грибных и древесной лакказ.

Рис. 13. Циклическая вольтамперограмма реакции

электровосстановления молекулярного кислорода на

графитовом электроде с иммобилизованной оксидазой В. 1ш1о(1игат. Условия: 50 мМ трис-НС1 буфер, насыщенный кислородом, 1 мМ Си804,-200 мМ №С1, 1=45° С. Начальный потенциал 600 мВ. скорость сканирования

2 мВ/сек. (А)-фон в отсутствие фермента; (Б)-с адсорбированной оксидазой В. ЬаШигат.

Таким образом, было показано, что бактериальная медьсодержащая лакказо-подобная оксидаза из В. ИаШигат, адсорбированная на электроде, катализирует реакцию электровосстановления молекулярного кислорода по механизму прямого электронного переноса в нейтральных растворах, содержащих ИаС1 и ионы двухвалентной меди. Однако, этот фермент относится к низко редокс-потенциальным оксидазам и, поскольку, начало реакции электровосстановления молекулярного кислорода коррелирует с редокс-потенциалом активного центра, стационарный потенциал такого катода существенно ниже равновесного

кислородного потенциала, что и является существенным недостатком для

использования этого бактериального фермента в качестве катализатора на катоде биотопливного элемента.

£ "8" Н

-12-

200 300 400 500 600

ГЪгенщда, мВ(<лн. НЮ)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследования возможности использования лакказ для создания катода биотопливного элемента.

Одной из целей настоящей работы являлось выяснение возможности использования лакказ и лакказо-подобной оксидазы в качестве катализаторов реакции электровосстановления молекулярного кислорода на катоде биотопливного элемента по прямому безмедиаторному механизму.

Необходимым условием функционирования имплантированного биотопливного элемента является физиологическое значение рН раствора 7.0-7.2, присутствие ионов хлора в концентрации около 100 мМ и перенапряжение менее 0.65 В.

В настоящей работе было показано, что лакказа R. vernicifera отвечает некоторым требованиям для создания вышеуказанных источников тока, а именно, она может функционировать при нейтральных значениях рН и в присутствии анионов хлора. Бактериальная медьсодержащая лакказо-подобная оксидаза из В. halodurans так же способна функционировать в нейтральных растворах и не ингибируется, а даже активируется ионами хлора. Однако, этот фермент относится к группе низко редокс-потенциальных оксидаз, что является главным препятствием при создании биокатода с их использованием. Кроме того, бактериальная оксидаза для проявления каталитической активности требует присутствия в реакционной среде дополнительно внесенных ионов меди.

Грибная лакказа Т. hirsuta относится к группе высокопотенциальных ферментов, по этой причине, а так же из-за своей высокой стабильности и каталитической активности она является перспективным объектом исследований с целью создания биосенсоров, датчиков и катода биотопливного элемента. Иммобилизованная на электроде лакказа Т. hirsuta способна осуществлять реакции прямого электронного переноса, что было показано нами ранее.

Однако, исследования по ингибированию этого фермента в гетерогенных реакциях показали, фермент ингибируется на 30% хлорид-анионами при рН 4.0, а в нейтральных растворах он каталитически неактивен.

Таким образом, можно сделать вывод, что в настоящее время не найдены хорошие биокатализаторы реакции электровосстановления молекулярного кислорода в физиологических условиях, удовлетворяющие всем требованиям, предъявляемым к биокатализатору топливного элемента, а именно: функционирование в нейтральных и слабощелочных растворах, при концентрации

хлорид ионов 0.1 M.B связи с этим, для создания катода биотопливного элемента необходимо продолжить поиск новых ферментов, отвечающих всем функциональным требованиям, целенаправленно модифицировать уже изученные, например, генно-инженерными или химическими методами, либо подбирать условия иммобилизации и иной модификации поверхностей и самих ферментов с целью повышения стабильности разрабатываемых электродов.

Выводы.

1. Показано, что грибная и древесная лакказы катализируют реакцию электровосстановления молекулярного кислорода на электродах из углеродных материалов по механизму прямого переноса электрона. Древесная лакказа способна катализировать эту реакцию при нейтральных значениях pH раствора со слабой степенью ингибирования ионами хлора. Грибная лакказа, напротив, обладает высокой биоэлектрокаталитической активностью только в кислой среде, при этом ферментативная активность значительно ингибируется ионами хлора.

2. Установлено, что бактериальная лакказо-подобная медьсодержащая оксидаза Bacillus halodurans является низко редокс-потенциальным ферментом, проявляющим электрокаталитическую активность по механизму прямого электронного переноса при нейтральных и слабощелочных значениях pH раствора в присутствии ионов хлора и двухвалентной меди.

3. Показано, что эффективность катализа (^кат^м) высоко- и низкопотенциальных лакказ по отношению к субстратам-доноров электронов близкого строения линейно зависит от «движущей силы реакции», т.е. от разности редокс-потенциалов Т1 центра фермента и субстрата.

4. Экспериментально доказано, что хелатированные ионы двухвалентного марганца являются природными субстратами высоко редокс-потенциальных грибных лакказ и, образующиеся в результате ферментативной реакции хелатированные ионы трехвалентного марганца способны к неферментативному окислению модельного соединения лигнина - вератрового спирта, до вератровой кислоты. Низко редокс-потенциальная древесная лакказа не катализирует эту реакцию.

5. Показана способность высоко редокс-потенциальных грибных лакказ катализировать свободно-радикальную реакцию полимеризации анилина, а также отсутствие такой возможности при использовании низко редокс-потенциальных ферментов.

Список публикаций

1. М.А.Горбачева. Г.П.Шумакович, О.В.Морозова, А.В.Стрельцов, Е.А.Зайцева, С.В.Шлеев, А.И.Ярополов. «Сравнительное изучение биокаталитических реакций с участием высоко- и низкопотенциальных грибных и древесной лакказ в гомогенных и гетерогенных реакциях» Вестник МГУ, Сер. 2. Химия, 2008, 49, с. 117-122.

2. Sergey Shleev, Yan Wang, Marina Gorbacheva. Andreas Christenson, Dietmar Haltrich, Roland Ludwig, Tautgirdas Ruzgas, Lo Gorton «Direct heterogeneous electron transfer reactions of Bacillus halodurans bacterial blue multicopper oxidase». Electroanalysis, 2008, № 9, 963-969.

3. O.B Морозова, Г.П. Шумакович, M.A. Горбачева, C.B. Шлеев, А. И. Ярополов ««Голубые» лакказы» Биохимия, 2007, т. 70, № 5, с. 1396-1412.

4. M.A.Gorbacheva. O.V.Morozova, G.P.Shumakovich, A.V.Streltsov, S.V.Shleev, A.I.Yaropolov «Enzymatic oxidation of manganese ions catalysed by laccase », Bioorganic Chemistry, 2009, № 37,1-5.

Статья в сборнике МГУИЭ:

1. Е.С. Горшина, Т.В. Русинова, Н.С. Марьина, Н.А. Шкурина, В.В. Бирюков, И.Н. Щеблыкин, М.А.Горбачева. О.В. Морозова, С.В. Шлеев, А.И. Ярополов «Биосинтез грибной лакказы - фермента для экологически безопасных производств» Сборник трудов МГУИЭ, 2006, с. 116-123.

Тезисы докладов:

1. М.А.Горбачева. Н.С. Марьина, Т.В. Русинова, Е.С. Горшина, С.В, Шлеев «Сравнение каталитических свойств грибной лакказы Trametes hirsuta и растительной лакказы Rhus vernicifera» Материалы IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта 2007 г., ч. 2, с. 278

2. M.A.Gorbacheva. O.V.Morozova, G.P.Shumakovich, A.I.Yaropolov, S.V.Shleev "Comparative studies of high and low redox potential laccase in homogeneous and heterogeneous biocatalytic reactions" Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2007" June, 17-22,2007, Moscow-St.Peterburg, Russian Federations, P. 96.

Заказ № 147/04/09 Подписано в печать 24.04.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

.^ЧЧ. 000 "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 mvw.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Горбачева, Марина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. РАСПРОСТРАНЕНИЕ ЛАККАЗ И ИХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ.

1.1.2. Растительные лакказы.

1.1.3. Грибные лакказы.

1.1.4. Бактериальные оксидазы с лакказной активностью.

1.2. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА КАТАЛИТИЧЕСКОГО ЦЕНТРА.

1.3. МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА.

1.4. ИНГИБИРОВАНИЕ ЛАККАЗНОЙ АКТИВНОСТИ.

1.5. БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛАККАЗ.

1.6. БИОЭЛЕКТРОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛАККАЗ.

1.7. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАККАЗ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. ИЗУЧАЕМЫЕ ФЕРМЕНТЫ.

2.2. СТАДИИ ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ.

2.3. РЕАКТИВЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ.

2.4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

2.4.1. Определение концентрации белка.

2.4.2. Контроль каталитической активности.

2.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ.

2.6. КИНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ.

2.6.1. Исследование рН-зависимости реакций и кинетические исследования.

2.6.2. Регистрация окисления хелатированных ионов Мп до Мп , катализируемого лакказами.

2.6.3. Определение констант ингибирования активности лакказы Т. hirsuta.

2.7. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ.

2.7.1. Подготовка и модификация графитовых электродов.

2.7.2. Подготовка и модификация стеклоуглеродного электрода.

2.7.3. Вольтамперометрические исследования.

2.8. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ОКИСЛЕНИЯ ВЕРАТРОВОГО СПИРТА ИНТЕРМЕДИАТАМИ, ОБРАЗУЮЩИМИСЯ ПРИ ФЕРМЕНТАТИВНОМ ОКИСЛЕНИИ ХЕЛАТИРОВАННЫХ ИОНОВ ДВУХВАЛЕНТНОГО МАРГАНЦА

2.9. ПОЛУЧЕНИЕ ЭЛЕКТРОПРОВОДНОГО КОМПЛЕКСА ПАНИ/ПАМПС.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. ПОЛУЧЕНИЕ ГОМОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ЛАККАЗ.

3.2.ЭФФЕКТИВНОСТЬ БИОКАТАЛИТИЧЕСКОГО ОКИСЛЕНИЯ ЦИАНИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ ПЕРЕХОДНЫХ МЕТАЛЛОВ ЛАККАЗАМИ

Т. hirsuta и R. vernicifera.

3.3. ОКИСЛЕНИЕ ИОНОВ Мп2+, ХЕЛАТИРОВАННЫХ ТАРТРАТНЫМИ И

ОКСАЛАТНЫМИ АНИОНАМИ, В ПРИСУТСТВИИ ГРИБНЫХ И ДРЕВЕСНОЙ ЛАККАЗ.

3.4. СРАВНЕНИЕ рН-ЗАВИСИМОСТИ РЕАКЦИЙ ОКИСЛЕНИЯ СУБСТРАТОВ-ДОНОРОВ ЭЛЕКТРОНОВ И ДОНОРОВ АТОМОВ ВОДОРОДА ВЫСОКО И НИЗКО РЕДОКС-ПОТЕНЦИАЛЬНЫМИ ЛАККАЗАМИ.

3.5. ВОЗМОЖНОСТЬ СИНТЕЗА ЭЛЕКТРОПРОВОДЯЩЕГО ПОЛИАНИЛИНА С УЧАСТИЕМ ВЫСОКО И НИЗКО РЕДОКС-ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ

ЛАККАЗ.

3.6. БИОЭЛЕКТРОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО КИСЛОРОДА НА УГЛЕРОДНЫХ ЭЛЕКТРОДАХ С УЧАСТИЕМ ЛАККАЗ

Т. hirsuta, С. maxima И R. vernicifera.

3.7. ЭЛЕКТРОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ГОЛУБОЙ МЕДЬСОДЕРЖАЩЕЙ ОКСИДАЗЫ Bacillus halodurans.

3.8. БЕЗМЕДИАТОРНОЕ ЭЛЕКТРОВОССТАНОВЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО КИСЛОРОДА НА ЭЛЕКТРОДАХ С ИММОБИЛИЗОВАННОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛАККАЗО-ПОДОБНОЙ ОКСИДАЗОЙ.

3.9. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЛАККАЗ ДЛЯ СОЗДАНИЯ КАТОДА БИОТОПЛИВНОГО ЭЛЕМЕНТА.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биокаталитические свойства лакказ из различных источников"

Уникальные каталитические свойства ферментов обеспечили им применение в самых разных областях биотехнологии: от научных исследований до промышленных процессов. К настоящему времени охарактеризовано большое число ферментов, для многих из которых получены трехмерные структуры с высоким разрешением, достаточно подробно описаны их биохимические и каталитические свойства и предложен вероятный механизм проявления биологической активности. Кроме того, на основе полученных данных, используя метод направленного мутагенеза, создаются ферменты с повышенной стабильностью и каталитической эффективностью. Все вышеперечисленное расширяет сферу практического использования ферментативного катализа.

Семейство лакказ, первый представитель которых впервые был обнаружен более столетия назад в соке японского лакового дерева Rhus vernicifera, попрежнему остается предметом интенсивных фундаментальных исследований.

Ферменты этого семейства найдены не только в растениях, но также в грибах, бактериях и насекомых. Лакказа [КФ 1.10.3.2] обладает способностью непосредственно катализировать окисление различных соединений молекулярным кислородом, включая о- и w-дифенолы, аминофенолы, полифенолы, полиамины, арилдиамины, фенольные подструктуры лигнина, а также некоторые неорганические ионы. Кроме того, фермент способен осуществлять прямой биоэлектрокатализ реакции восстановления молекулярного кислорода по механизму прямого безмедиаторного переноса электрона с электрода на активный центр лакказы с последующим восстановлением кислорода до воды.

Физиологические функции лакказ разнообразны: участие в процессах формирования пигментов и образования плодовых тел грибов, биодеградация лигнина и детоксификация фенолов. В связи с вышеперечисленными особенностями данного семейства ферментов они интенсивно используются в различных отраслях биотехнологии.

Большое число работ посвящено поиску и изучению новых штаммов базидиальных грибов - продуцентов лигнинолитических ферментов, и нахождению ферментов с новыми физико-химическими свойствами, что связано с возможными широкими прикладными аспектами их использования. Примерами применения лакказ являются получение биосвязующих для экологических древесно-стружечных плит [Болобова с соавт., 2002], создание биотопливных элементов [Heller et al., 2003; Heller, 2006; Coman et al., 2008], биодеградация ксенобиотиков [Johannes et al., 1996; Shintaro et al., 2001], производство антимикробных [Johansen et al., 2003], синтетических моющих [Boutique et al., 2004; Gardner et al., 2006] и косметических средств [Onuki et al., 2000; Aaslyng et al., 2002; Lang & Cotteret, 2006], использование ферментов в органическом синтезе [Echido et al., 2001; Karamyshev et al., 2003], аналитических системах [Kruus, 2000; Duran et al., 2002; Ярополов с соавт., 2005; Shleev et al., 2006; ], а также текстильной [Barfoed et al., 2004; Damkhus et al., 2002], пищевой [Huang et al., 2001; Si, 2001] и целлюлозно-бумажной промышленностях [Cheng et al., 2003; Pedersen et al., 2001; Lund & Felby, 2003; Jetten et al., 2004].

Интерес к изучению этих ферментов обусловлен, прежде всего, их каталитическими характеристиками и субстратной специфичностью. В последнее время все большие масштабы приобретает использование биокаталитических технологий в промышленности, что, возможно, связано с экологической безопасностью производства на их основе [Call and Мьске, 1997; Kruus, 2000;

Mayer and Staples, 2002; Couto and Herrera, 2006]. Промышленное получение биокатализаторов с использованием технических ферментных препаратов является экономически выгодным. Об этом свидетельствует возрастающий объем продаж технических препаратов ферментов на мировом рынке, который в 2007 году составил около 2.3 миллиарда долларов.

Помимо использования лакказ в качестве биокатализаторов различных биотехнологических процессов, они представляют большой интерес с точки зрения фундаментальных исследований их структуры и механизма катализа. Интерес связан с особенностями строения активного центра лакказ, в который входят четыре иона меди трех различных типов, координированное взаимодействие которых позволяет осуществлять восстановление молекулярного кислорода непосредственно до воды, минуя стадию образования пероксида водорода. Реакции окисления органических соединений с участием лакказ протекают по свободно-радикальному механизму, который в настоящее время изучен слабо. Кроме того, лакказа является одним из важнейших компонентов лигнолитического комплекса дереворазрушающих грибов белой гнили, осуществляющих разложение (а в некоторых случаях и синтез) одного из наиболее распространенных природных полимеров - лигнина, и роль лакказы в этих процессах до конца неизвестна.

В связи с вышесказанным, актуальным является проведение сравнительного исследования лакказ из различных источников с целью выяснения сходства и различий в механизмах их действия, что, в свою очередь, является основой для их дальнейшего практического использования в таких областях, как ферментативный синтез, биоэлектрокатализ и биодеградация ксенобиотиков. В зависимости от конкретного случая практического использования, к ферментам предъявляются весьма различные требования. Поэтому в настоящей работе было проведено сравнение физико-химических свойств лакказ из различных источников с целью определения и прогнозирования возможности их использования в тех или иных областях.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Горбачева, Марина Анатольевна

выводы

1. Грибная и древесная лакказы катализируют реакцию электровосстановления молекулярного кислорода на элеюродах из углеродных материалов по механизму прямого переноса электрона. Древесная лакказа способна катализировать эту реакцию при нейтральных значениях рН раствора со слабой степенью ингибирования ионами хлора. Грибная лакказа, напротив, обладает высокой биоэлектрокаталитической активностью только в кислой среде, при этом ферментативная активность значительно ингибируется ионами хлора.

2. Установлено, что бактериальная лакказо-подобная медьсодержащая оксидаза Bacillus halodurans является низко редокс-потенциальным ферментом, проявляющим электрокаталитическую активность по механизму прямого электронного переноса при нейтральных и слабощелочных значениях рН раствора в присутствии ионов хлора и двухвалентной меди.

3. Показано, что эффективность катализа (^ка-У-^м) высоко- и низкопотенциальных лакказ по отношению к субстратам-доноров электронов близкого строения линейно зависит от «движущей силы реакции», т.е. от разности редокс-потенциалов Т1 центра фермента и субстрата.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Горбачева, Марина Анатольевна, Москва

1. Aaslyng D., Tsuchiya R., Gaffar A., Smith S.F. «Tooth bleaching» US Patent № 6,379,653, April 30, 2002

2. Abadulla E., Tzanov Т., Costa S., Robra K.H., Cavaco-Paulo A., Gbbitz G. «Decolorization and detoxification of textile dyes with a laccase from Trametes hirsuta» Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66: 3357-3362.

3. Adams, Т.Н., Wieser, J.K. and Yu, J.-H. Asexual sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998.V. 62:35-54.

4. Agostinelli E.A., Cervoni L., Morpurgo L. Stability of japanese-lacquer- tree (Rhus vernicifera) laccase to thermal and chemical denaturation: comparison with ascorbat oxidase.// Biochem. J., 1995. V. 306, Pt. 3, 697-702.

5. Alcalde M., Bulter Т., Arnold F.H. «Colorimetric assays for biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by fungal laccases» J. Biomol. Screen. 2002. V. 7, 6:547-53

6. Alexandre, G., and Zhulin I.B. «Laccases are widespread in bacteria» Trends Biotechnol. 2000. V. 18:41-42.

7. Aramayo R. and Timberlake W.E. «The Aspergillus nidulans yA gene is regulated by abaAv> EMBO J. 1993. V. 12:2039-2048.

8. Arias, M.E., Arenas, M., Rodmguez, J., Soliveri, J., Ball, A.S. and Hern6ndez, M. «Kraft pulp biobleaching and mediated oxidation of a nonphenolic substrate by laccase from Streptomyces cyaneus CECT 3335» Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69:1953-1958.

9. Baldrian P. «Fungal laccases occurrence and properties» FEMS Microbiol. Rev. 2006. V. 30, №2: 215-242

10. Banerjee U.C., and Vohra R.M. «Production of laccase by Curvularia sp.» Folia Microbiol. 1991. V. 36:343-346.

11. Bao W, O'Malley DM, Whetten R, Sederoff RR «А laccase associated with lignification in loblolly pine xylem» Science 1993. V. 260:672-674.

12. Barfoed M., Kirk O., Salmon S. «Enzymatic method for textile dyeing» US Patent № 6,805,718,2004. October 19,

13. Barriere F., KavanaghP., Leech D. «А laccase-glucose oxidase biofuel cell prototype operating in a physiological buffer» Bioelectrochemistry 2005. V. 51(24): 5187-5192.

14. Barton S.C., Gallaway J., Atanassov P. «Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices» Chem. Rev. 2004. V. 104, 10: 4867-4886

15. Bar-Nun, N., Tal-Lev, A., Harel, E. and Mayer, A.M. «Repression of laccase formation in Botrytis cinerea and its possible relation to phytopathogenicity» Phytochemistry 1988. V. 27: 2505-2509.

16. Battistuzzi G, Bellei M, Leonardi A, Pierattelli R, De Candia A, Vila AJ, Sola M. «Reduction thermodynamics of the T1 Cu site in plant and fungal laccases» J. Biol. Inorg. Chem. 2005. V. 10(8):867-873.

17. Battistuzzi G., Di Rocco G., Leonardi A. and Sola M. «1Н NMR of native and azide-inhibited laccase from Rhus vernicifera» J. Inorg. Biochem. 2003. V. 96: 503-506.

18. Bento I., Martins Ligia O., Lopes G.G., Carrondo M.A., Lindley P.F. «Dioxygen reduction by multicopper oxidases; a structural perspective» The Royal Soc. Chem. 2005. 3507-3513.

19. Blaich R. and Esser K. «Function of enzymes in wood destroying fungi II. Multiple forms of laccase in white rot fungi» Arch. Microbiol. 1975. V. 103, № 1: 271 -Til.

20. Bligny R, Douce R Excretion of laccase by sycamore (Acer pseudoplatanus) cells. Purification and properties of the enzyme. Biochem J 1983. V. 237: 489—496.

21. Bogdanovskaya V.A., Tarasevich M.R., Hintsche R., Scheller F. «Electrochemical transformations of proteins adsorbed at carbon electrodes» Bioelectrochem. Bioenerget. 1988. V. 19: 581-584.

22. Bohmer, S., K. Messner, and E. Srebotnik. Oxidation of phenanthrene by a fungal laccase in the presence of 1-hydroxybenzotriazole and unsaturated lipids. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 244: 233-238.

23. Bollag, J.-M. and Leonowicz, A. Comparative studies of extracellular fungal laccases. Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 48: 849-854.

24. Bond A.M. «Chemical and electrochemical approaches to the investigation of redox reactions of simple electron transfer metalloproteins» Inorg. Chim. Acta 1994. V. 226, № 1-2: 293-340.

25. Bourbonnais R, Leech D, Paice MG. Electrochemical analysis of the interactions of laccase mediators with lignin model compounds. Biochim Biophys Acta 1998; V. 1379: 381-90.

26. Bourbonnais R, Paice MG, Freiermuth B, Bodie E, Borneman S. Reactivities of various mediators and laccases with kraft pulp and lignin model compounds. Appl Environ Microbiol 1997; V. 63: 4627^632.

27. Bourbonnais R, Paice MG. Oxidation of non-phenolic substrates: an expanded role of laccase in lignin biodegradation. FEBS Lett 1990; V. 267: 99-102.

28. Boutique J.-P., Burckett-Saint-Laurent J.C.T.R., Coosemans S.J.L., Goovaerts L., Gualco L.M.P., Johnston J.P. «Pouched cleaning compositions» US Patent № 6,815,410, November 9, 2004

29. Burrows A.L., Hill H.A., Leese T.A., Mcintire W.S., Nakayama H., Sanghera G.S «Direct electrochemistry of the enzyme, methylamine dehydrogenase, from bacterium W3A1» Eur. J. Biochem. 1991. V. 199, № 1: 73-78.

30. Burton, S. G. Oxidizing enzymes as biocatalysts. Trends Biotechnol. 2003. V. 21: 543549.

31. Cai, W., R. Martin, B. Lemaure, D. Courtois, and V. Pe'tiard. Polyphenol oxidases produced by in vitro cultures of rosemary. Plant Physiol. Biochem. 1993. V. 31:233-240.

32. Call H.P., Мьске I. «History, overview and applications of mediated lignolytic systems, especially laccase-mediator-systems (Lignozym®-process)» J. Biotechnol., 1997. V. 53, № 2: 163-202.

33. Chabanet A, Goldberg R, Catesson AM, Quinet-Szely M, Delaunay AM, Faye L. Characterization and Localization of a Phenoloxidase in Mung Bean Hypocotyl Cell Walls. Plant Physiol. 1994. V. 106(3): 1095-1102.

34. Chefetz, В., Chen, Y. and Hadar, Y. Purification and characterization of laccase from Chaetomium thermophilium and its role in humification. Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64:3175-3179.

35. Chen, S., Ge, W. and Buswell, J.A. Biochemical and molecular characterization of a laccase from the edible straw mushroom, Volvariella volvacea. Eur. J. Biochem. 2004. V. 271 :318-328.

36. Cheng H.N., Delagrave S., Gu Q.-M., Murphy D. «Bio-bleaching of pulp using laccase, mediator, and chain transfer agent» WO 2003023133, March 20, 2003

37. Choi, G.H., Larson, T.G. and Nuss, D.L. Molecular analysis of the laccase gene from the chestnut blight fungus and selective suppression of its expression in an isogenic hypovirulent strain. Mol. Plant Microbe Interact. 1992. V. 5: 119-128.

38. Claus, H., Laccases and their occurrence in prokaryotes. Arch. Microbiol. 2003. V. 179: 145-150.

39. Clutterbuck, A.J. Absence of laccase from yellow-spored mutants of Aspergillus nidulans. J. Gen. Microbiol. 1972. V. 70: 423-435.

40. Cole, J.L., Tan, G.O., Yang, E.K., Hodgson, K.O. and Solomon, E.I. Reactivity of the laccase trinuclear copper active site with dioxygen: an x-ray absorption edge study. J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112: 2243-2249.

41. Coll, P.M., C. Tabernero, R. Santamaria, and P. Perez. "Characterization and structural analysis of the laccase I gene from the newly isolated ligninolytic basidiomycete PM1 (CECT 2971)." Appl. Environ. Microbiol. 1993.V. 59: 4129-4135.

42. Collins PJ, Kotterman MJJ, Field JA, Dobson ADW. Oxidation of anthracene and benzoa.pyrene by laccases from Trametes versicolor. Appl Environ Microbiol 1996; V. 62: 4563-4567.

43. Coman V., Vaz-Dominguez C., Ludwig R., Harreither W., Haltrich D., De Lacey A., Ruzgas Т., Gorton L. and Shleev S. A membrane-, mediator-, cofactor-less glucose/oxygen biofuel cell. Physical Chemistry Chemical Physics, 2008, V. 10(40): 6093-6096.

44. Couto S.R. and Herrera J.L.T. «Industrial and biotechnological applications of laccases» Biotechnol. Adv. 2006. V. 24, № 5: 500-513

45. Crestini C, Argyropoulos DS. The early oxidative biodegradation steps of residual kraft lignin models with laccase. Bioorg Med Chem 1998. V. 6: 2161-2169.

46. Dalfard А. В., Khajeh K., Soudi M. R., Naderi-Manesh H., Ranjbar В., Sajedi R. H., Isolation and biochemical characterization of laccase and tyrosinase activities in a novel melanogenic soil bacterium. Enzyme Microb. Technol. 2006. V. 39: 1409-1416.

47. Damkhus Т., Fogt U. «Method of removing excess dye from print or colored textiles or yarn» US Patent № 6,409,771 June 25, 2002

48. Davin LB, Bedgar DL, Katayama T, Lewis NG On the stereoselective synthesis of (л)-pinoresinol in Forsythia suspense from its achiral precursor, coniferyl alcohol. Phytochemistry. 1992. V. 31: 3869-3874.

49. De Marco, A. and Roubelakis-Angelakis, K.A. Laccase activity could contribute to cell-wall reconstitution in regenerating protoplasts. Phytochemistry 1997 46:421-425.

50. De Pinto, M.C., and A.R. Bacelo. "Inhibition of both peroxidase and laccase by desferal (desferoxamine mesylate)." Phytochem. 1996. V. 42: 283-286.

51. Dean JFD, Eriksson K-EL Laccase and the deposition of lignin in vascular plants. Holzforschung. 1994. V. 48: 21-33.

52. Diamantidis G., Effosseb A., Potierb P., Ballyb R. «Purification and characterization of the first bacterial laccase in the rhizospheric bacterium Azospirillum lipoferum» Soil Biol. Biochem. 2000. V. 32, № 7: 919-927.

53. Dong J.L. and Zhang Y.Z «Purification and Characterization of Two Laccase Isoenzymes from a Ligninolytic Fungus Trametes gallica» Prep. Biochem. Biotech. 2004. V. 34, № 2: 179-194.

54. Duran N., Rosa M.A., D'Annibale A., Gianfreda L. «Applications of laccases and tyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different supports: a review» Enzyme Microb Technol. 2002. V. 31, № 7: 907-931.

55. Echigo Т., Ohno R. «Process for producing high-molecular-weight phenolic compounds with myrothecium» US Patent № 6,190,891 February 20, 2001

56. Edens W.A., Goins T.Q., Dooley D., Hensonl J.M. «Purification and characterization of a secreted laccase of Gaeumannomyces graminis var. Tritici» Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65, №7: 3071-3074.

57. Eggert С., LaFayette P.R., Temp U., Eriksson K.-E.L., Dean J.F.D. «Molecular Analysis of a Laccase Gene from the White Rot Fungus Pycnoporus cinnabarinus» Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64, № 5: 1766-1772.

58. Eggert, C. Temp U., Dean J.F.D., Eriksson K.-E.L. A fungal metabolite mediates degradation of non-phenolic lignin structures and synthetic lignin by laccase. FEBS Lett. 1996a. V. 391: 144-148.

59. Eggert, C., Temp, U. and Eriksson, K.-E.L. The ligninolytic system of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus: purification and characterization of the laccase. Appl. Environ. Microbiol. 1996b. V. 62: 1151-1158.

60. Ehresmann В., Imbault P., Well J.H. «Spectrophotometric determination of protein concentration in the cell extracts containing tRNA's» Anal. Biochem. 1973. V. 54, № 2: 454-463.

61. Eisenman HC, Mues M, Weber SE, Frases S, Chaskes S, Gerfen G, Casadevall A. Cryptococcus neoformans laccase catalyses melanin synthesis from both D- and L-DOPA. Microbiology. 2007. V. 153: 3954-3962.

62. Enguita F.J., Martins L.O., Henriques A.O., Carrondo M.A. «Crystal structure of a bacterial endospore Coat component: A laccase with enhanced thermostability properties» J. Biol Chem., 2003. V. 278, № 21: 19416 19425.

63. Faure D., Bouillant M.-L., Bally R., Comparative study of substrates and inhibitors of Azospirillum lipoferum and Pyricularia oryzae laccases. Applied and Environmental Microbiology. 1995. V. 61: 1144-1146.

64. Faure, D., Bouillant, M.L. and Bally, R. Isolation of Azospirillum lipoferum 4T Tn5 mutants affected in melanization and laccase activity. Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60: 3413-3415.

65. Frases S, Salazar A, Dadachova E, Casadevall A. Cryptococcus neoformans can utilize the bacterial melanin precursor homogentisic acid for fungal melanogenesis. Appl Environ Microbiol. 2007. V. 73(2): 615-21.

66. Freudenberg K, Harkin JM, Rechert M, Fukuzumi T Die an der Verholzung beteiligten Enzyme. Die Dehydrierung des Subaoinalkohols. Chem Ber. 1958. V. 91: 581-590.

67. Freudenberg K. Biosynthesis and constitution of lignin. Nature. 1959.V. 183: 1152-1155.

68. Froehner, S.C. and Eriksson, K.-E. Purification and properties of Neurospora crassa laccase. J. Bacteriol. 1974. V. 120: 458-465.

69. Fukushima, Y., and Т.К. Kirk. "Laccase component of the Ceriporiopsis subvermispora lignin-degrading system." Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61: 872-876.

70. Galhaup, C., Goller, S., Peterbauer, C.K., Strauss, J. and Haltrich, D. Characterization of the major laccase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ions. Microbiology. 2002. V. 148: 2159-2169.

71. Gardner R.R., Glogowski M.W., Haught J.C., Baeck A.C., Convents A.C., Smets J., Van Steenwinckel P.C.A., Gray P.G., Cruickshank G.D., Costello A., Duncan M. «Compositions for cleaning with softened water» W02006044952, April 27, 2006

72. Garzillo, A.M.V., Colao, M.C., Caruso, C., Caporale, C., Celletti, D. and Buonocore, V. Laccase from the white-rot fungus Trametes trogii. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 49: 545-551.

73. Gavnholt, B. and Larsen, K. Molecular biology of plant laccases in relation to lignin formation. Physiol. Plant. 2002. V. 116: 273-280.

74. Gelo-Pujic M, Kim HH, Butlin NG, Palmore GT. Electrochemical studies of a truncated laccase produced in Pichia pastoris. Appl Environ Microbiol. 1999. V. 65(12): 5515-5521.

75. Ghindilis A. «Direct electron transfer catalysed by enzymes: application for biosensor development» Biochem. Soc. Tran. 2000. V. 28, part 2: 84-89.

76. Gladys Alexandre, Renen Bally. Emergence of a laccase-positive variant of Azospirillum lipoferum occurs via a two-step phenotypic switching process. FEMS Microbiology Letters 1999. V. 174:371-378.

77. Gorton L., Lindgren A., Larsson Т., Munteanu F.D., Ruzgas Т., Gazaryan I. Direct electron transfer between heme-containing enzymes and electrodes as basis for third generation biosensors. Anal. Chim. Acta, 1999. V. 400: 91-108.

78. Grass G., Rensing C. «CueO is a multi-copper oxidase that confers copper tolerance in Escherichia coli».Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 286: 902-908.

79. Gregory, R.P., Bendall, D.S., The purification and some properties of the polyphenol oxidase from tea (Camella sinesis L.). Biochem. J. 1966. V. 101: 569-581

80. Guo L.H., Hill H.A.O. «Direct electrochemistry of proteins and enzymes» Adv. Inorg. Chem. 1991. V. 36:341-375.

81. Hagen W.R. «Direct electron transfer of redox proteins at the bare glassy carbon electrode» Eur. J. Biochem. 1989. V. 182, № 3: 523-530.

82. Hakulinen. N. Kiiskinen. L. L., Kruus, K., Saloheimo, M., Paananen. A., Koivula, A. Rouvinen. J. Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site. Nat. Struct. Biol. 2002. V. 9: 601 -605.

83. Hammcl K.E. Fungal degradation of lignin. In: Plant litter quality and decomposition., eds. G. Cadisch and K.E. Giller, CAB INTERNATIONAL, 1997. 33-45.

84. Harkin JM, Obst JR Lignification in trees: indication of exclusive peroxidase participation. Science. 1973. V. 180: 296-298.

85. Hatakka, A. Biodegradation of lignin. In: Biopolymers. Lignin, humic substances and coal. Wiley- VCH, Weinheim, Germany. 2001. V. 1: 129-180.

86. Heinzkill, M., Bech, L., Halkier, Т., Schneider, P. and Anke, T. Characterization of laccases from wood-rotting fungi (family Coprinaceae). Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64: 1601-1606.

87. Heller A. «Biological fuel cell and methods» US Patent 7,018,735, March 28, 2006

88. Heller A., Mano N., Kim H.-H., Zhang Y., Mao F., Chen Т., Barton S.C. «Miniature biological fuel cell that is operational under physiological conditions, and associated devices and methods» W003106966, December 20, 2003

89. Hirst J., Sucheta A., Ackrell B.A.C., Armstrong F. A. «Electrocatalytic voltammetry of succinate dehydrogenase: direct quantification of the catalytic properties of a complex electron-transport enzyme» J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118, № 21: 5031-5038.

90. Hoffmann, P. and Esser, K. The phenol oxidases of the Ascomycete Podospora anserina. Arch. Microbiol. 1977. V. 112: 111-114.

91. Huang R., Christenson P., Labuda I.M. «Process for the preparation of nootkatone by laccase catalysis» US Patent № 6,200,786, March 13, 2001

92. Hullo M.-F., Moszer I., Danchin A., and Martin-Verstraete, I. CotA of Bacillus subtilis Is a Copper-Dependent Laccase. J. Bacteriol. 2001. V. 183: 5426-5430.

93. Hyung K.H., Jun K.Y., Hong H.-G., Kim H.S., Shin W. «Immobilization of laccase onto the gold electrode using ^-mercaptopropionate» Bull. Korean Chem. Soc. 1997. V. 18: 564-566.

94. Ikeda O. and Sakurai T. «Electron transfer reaction of stellacyanin at a bare glassy carbon electrode» Eur. J.Biochem. 1994. V. 219, № 3: 813-819.

95. Ishigami, Т., Y. Hirose, and Y. Yamada. "Characterization of polyphenol oxidase from Chaetomium thermophile, a thermophilic fungus." J. Gen. Appl. Microbiol. 1988. V. 34: 401-407.

96. Ivnitski Dmitri, Branch Brittany, Atanassov Plamen and Apblett Christopher. Glucose oxidase anode for biofuel cell based on direct electron transfer. Electrochemistry Communications, 2006, V. 8, № 8: 1204-1210.

97. Jaeger K-E: Protein technologies and commercial enzymes: White is the hype-biocatalysts on the move. Curr Opin Biotechnol 2004, V. 15: 269-271.

98. Jetten J.M., Van Den Dool R., Van Hartingsveldt W., Besemer A.C. «Process for selective oxidation of cellulose» US Patent № 6,716,976, April 6, 2004

99. Johannes C., Majcherczyk A., Hbttermann A. «Degradation of anthracene by laccase of Trametes versicolor in the presence of different mediator compounds» Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. V. 46, № 3: 313-317.

100. Johannes, C. and Majcherczyk, A. Laccase activity tests and laccase inhibitors. J. Biotechnol. 2000. V. 78:193-199.

101. Johansen С., Deussen H.-J. «Antimicrobial composition containing an oxidoreductase and an enhancer of the N-hydroxyanilide-type» US Patent № 6,592,867, 2003., July 15

102. Jones D. T. GenTHREADER: an efficient and reliable protein fold recognition method for genomic sequences. J. Mol. Biol. .1999. V. 287: 797-815.

103. Jung, H., Xu, F. and Li, K. Purification and characterization of laccase from wood-degrading fungus Trichophyton rubrum LKY-7. Enz. Microb. Technol. 2002. V. 30: 161168.

104. Karamyshev A.V., Shleev S.V., Koroleva O.V., Yaropolov A.I., Sakharov I.Yu. «Laccase-catalyzed synthesis of conducting polyaniline» Enzyme Microb. Technol. 2003. V. 33, №5: 556-564.

105. Karhunen E., Niku-Paavola M.-L., Viikari L., Haltia Т., van der Meer R.A., Duine J.A. «А novel combination of prosthetic groups in a fungal laccase; PQQ and two copper atoms» FEBS Lett. 1990. V. 267, № 1, P. 6-8

106. Kawai, S., T. Umezawa, and T. Higuchi. Oxidation of methoxylated benzyl alcohols by laccase of Coriolus versicolor in the presence of syringaldehyde. Wood Res. 1989. V. 76: 10-16.

107. Keilin D, Mann T. Laccase, a blue copper-protein oxidase from the latex of Rhuss suceedanea//Nature. 1939. V. 143: 23-24.

108. Kersten, P.J., Kalyanaraman, В., Hammel, K.E., Reinhammar, B. and Kirk, Т.К. Comparison of lignin peroxidase, horseradish peroxidase and laccase in the oxidation of methoxybenzenes. Biochem. J. 1990. V. 268: 475-480.

109. Kiiskinen Laura-Leena. Characterization and heterologous production of a novel laccase from Melanocarpus albomyces. Dissertation for the degree of Doctor of Science in

110. Technology to be presented with due permission of the Department of Chemical Technology for public examination and debate in Auditorium KE2 (Komppa Auditorium) at Helsinki University of Technology (Espoo, Finland) on the 28th of January, 2005.

111. Kirk TK, Fenn P Formation and action of the lignolytic system basidiomycetes. In: Frankland JC, Hedger JC, Swift MJ (eds) Decomposer Basidiomycetes, Br Mycol Soc Symp 4. Cambridge University Press, Cambridge, 1982. 67-90

112. Kirk O, Borchert TV, and Fuglsang CC. Industrial enzyme applications. Curr Opin Biotechnol. 2002. V. 13: 345-351.

113. Kirk Т.К., Harkin J.M., Cowling E.B. Degradation of the lignin model compound syringyl-glycol-P-guaiacyl ether by Polyporus versicolor and Stereum frastulatum. // Biochem. Biophys. Acta, 1968, V. 165, N 1: 145-153.

114. Ко E.-M., Leem Y.-E., Choi H.T. «Purification and characterization of laccase isozymes from the white-rot basidiomycete Ganoderma lucidum» Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 57, № 1: 98-102.

115. Kreuter, Т., A. Steudel, and H. Pickert. "On the inhibition of laccase by lower fatty acids." Acta Biotechnol. 1991. V. 11: 81-83.

116. Kruus K. «Laccase: a useful enzyme for industrial applications». Kemia Kemi 2000. V. 27, №3: 184-186.

117. Kulys J, Drungiliene A, Wollenberger U, Krikstopaitis K, Scheller F. Electroanalytical determination of peroxidases and laccases on carbon paste electrodes. Electroanalysis 1997. V. 9:213-218.

118. Kumari H. L. and Sirsi M. «Purification and properties of laccase from Ganoderma lucidum» Arch. Microbiol. 1972. V. 84, № 4: 350-357.

119. Kuznetsov A.M., Bogdanovskaya Y.A., Tarasevich M.R., Gavrilova E.F. «The mechanism of cathode reduction of oxygen in a carbon carrier-laccase system» FEBS Lett. 1987. V. 215:219-222.

120. Kwon, S.-I., Anderson, A.J., Laccase isozymes: production by an opportunistic pathogen, a Fusarium proliferatum isolate from wheat. Physiol. Mol. Plant Pathol. 2001. V. 59: 235242.

121. LaFayette P.R., Eriksson K.-E.L., Dean J.F.D. Nucleotide sequence of a cDNA clone encoding an acidic laccase from sycamore maple (Acer pseudoplatanus).// Plant Physiol., 1995. V. 107, N2: 667-668.

122. Lang G., Cotteret J. «Dyeing composition containing a laccase and method for dyeing keratinous fibres» US Patent Application № 20060021155, February 2, 2006

123. Leatham, G.F. and Stahmann, M.A. Studies on the laccase of Lentinus edodes: specificity, localization and association with the development of fruiting bodies. J. Gen. Microbiol. 1981. V. 125:147-157.

124. Lee C.-W., Gray H.B., Anson F.C. «Catalysis of the reduction of dioxygen at graphite electrodes coated with fungal laccase А» J. Electroanal. Chem. 1984. V. 172, № 12: 289-300.

125. Lehman, E., Harel, E. and Mayer, A.M. Copper content and other characteristics of purified peach laccase. Phytochemistry 1974. V. 13: 1713-1717.

126. Li K, Xu F, Eriksson K-E. Comparison of fungal laccases and redox mediators in oxidation of a nonphenolic lignin model compound. Appl Environ Microbiol 1999. V. 65: 26542660.

127. Li X., Wei Z., Zhang M., Peng X., Yu G., Teng M., Gong W., Crystal structures of E. coli laccase CueO at different copper concentrations.Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 354: 21-26.

128. Lindgren A., Gorton L., Ruzgas Т., Baminger U., Haltrich D., Schblein M. «Direct electron transfer of cellobiose dehydrogenase from various biological origins at gold and graphite electrodes J. Electroanal. Chem. 2001. V. 496, № 1-2: 76-81.

129. Liu L, Dean JFD, Friedman WE, Eriksson KEL. A laccase-like phenoloxidase is correlated with lignin biosynthesis in Zinnia elegans stem tissues. The Plant Journal 1994. V. 6: 213224.

130. Lund M., Felby C. «Process for treating pulp with laccase and a mediator to increase paper wet strength» US Patent № 6,610,172, August 26, 2003

131. Malmstrom, B.G., Reinhammar, B. and Vanngard, T. The state of copper in stellacyanin and laccase from the lacquer tree Rhus vernicifera. Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 205: 48-57.

132. Marbach, I., Harel, E. and Mayer, A.M. Molecular properties of extracellular Botrytis cinerea laccase. Phytochemistry. 1984. V. 23: 2713-2717.

133. Mayer, A.M. and Staples, R.C. Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry. 2002. V. 60: 551-565.

134. McGuirl, M.A. and Dooley, D. M. Cooper-containing oxidases. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. V. 3: 138-144.

135. McMillin R., Eggleston M.K. Bioinorganic chemistry of laccase// Multi copper oxidases, 1998. 129-166.

136. Messerschmidt A., Huber R. The blue oxidases: ascorbat oxidase, laccase and ceruloplasmin. Modelling and structural relationship.// Eur. J. Biochem., 1990, V.187, N 2: 341-352.

137. Messerschmidt, A. Copper metalloenzymes. In: Comprehensive biological catalysis. (Sinnet, M., Ed.). Academic Press Limited, London. 1997. V. 3: 401-426.

138. Min K.-L.; Kim Y.-H.; Kim Y.W.; Jung H.S.; Hah Y.C. «Characterization of a novel laccase produced by the wood-rotting fungus Phellinus ribis» Arch. Biochem. Biophys. 2001. Y. 392, № 2: 279-286.

139. Molitoris H.P., Esser K. «Die phenoloxydasen des ascomyceten Podospora anserina. V. Eigenschaften der laccase I nach weiterer reinigung» Arch. Microbiol. 1970. V. 72, № 3: 267-296.

140. Murao, S., Y. Hinode, E. Matsumura, A. Numata, K. Kawai, H. Ohishi, H. Jin, H. Oyama, and T. Shin. "A novel laccase inhibitor, N-hydroxyglycine, produced by Penicillium citrinum YH-31." Biosci. Biotech. Biochem. 1992. V. 56: 987-988.

141. Nakamura T. «Purification and physico-chemical properties of laccase» Biochim. Biophys. Acta 1958. V. 30, № 1: 44-52.

142. Nakamura W Studies on the biosynthesis of lignin. Disproof against the catalytic activity of laccase in the oxidation of coniferyl alcohol. J Biochem.1967. V. 62: 54-61.

143. Ng T.B., Wang H.X. «А homodimeric laccase with unique characteristics from the yellow mushroom Cantharellus cibarius» Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 313, № 1: 37-41.

144. Niku-Paavola ML, Karhunen E, Salola P, Raunio V Ligninolytic enzymes of the white-rot fungus Phlebia radiata. Biochem J 1988. V. 254: 877-884.

145. Nishizawa, Y., Nakabayashi, K., and Shinagawa, E. Purification and characterization of laccase from white rot fungus Trametes sanguinea M85-2. J. Ferment. Bioeng. 1995. V. 80: 91-93.

146. Northcote DH Control of cell wall biogenesis: an overview. In: Lewis NG, Paice MG (eds) Plant Cell Wall Polymers, Amer. Chem. Soc. Symposium Series 1989. V. 399: 1-15.

147. Rodriguez E., Nuero O., Guillen F., Martinez A.T., Martinez M.J.: Degradation of phenolic and non-phenolic aromatic pollutants by four Pleurotus species: the role of laccase and versatile peroxidase. Soil Biol.Biochem. 2004. V. 36: 909-916.

148. O'Malley, D.M., Whetten, R., Bao, W., Chen, C.-L. and Sederoff, R.R. The role of laccase in lignification. Plant J. 1993. V. 4: 751-757.

149. Okusa K, Miyakoshi T, Chen C-L Comparative studies on dehydrogenative polymerization of coniferyl alcohol by laccases and peroxidases.Holzforschung. 1996. V. 50: 11-16.

150. OMURA Т. Studies on laccases of lacquer trees. I. Comparison of laccases obtained from Rhus vernicifera and Rhus succedanea. J Biochem. 1961. V. 50: 264-272.

151. Onuki Т., Noguchi M., Mitamura J. «Hairdye composition comprising indoline and/or an indoline compound and laccase» WO 00078274, December 28, 2000

152. Osina M. A., Bogdanovskaya V. A. and Tarasevich M. R. Bioamperometric Assay of Phenol Derivatives Using a Laccase-Nafion Composite. Russian Journal of Electrochemistry. 2003. V. 39, № 4: 407-412.

153. Palmer A. E., Lee, S. K., Solomon E. I. «Decay of the peroxide intermediate in laccase: reductive cleavage of the 0-0 bond» J. Am. Chem. Soc. 2001, V. 123, № 27: 6591-6599.

154. Palmieri, G., Giardina, P., Marzullo, L., Desiderio, В., Nitti, G., Cannio, R. and Sannia, G. Stability and activity of a phenol oxidase from the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 39: 632-636.

155. Palmore GTR, Kim H-H. Electro-enzymatic reduction of dioxygen to water in the cathode compartment of a biofuel cell. J Electroanal Chem 1999. V. 565: 110-117.

156. Palonen, H., Saloheimo, M., Viikari, L. and Kruus, K. Purification, characterization and sequence analysis of a laccase from the ascomycete Mauginiella sp. Enz. Microb. Technol. 2003. V. 33: 854-862.

157. Pedersen L.S., Felby C., Munk N. «Process for increasing the charge on a lignocellulosic material» US Patent № 6,187,136, February 13, 2001

158. Pezet, R., Purification and characterization of a 32-kDa laccaselike stilbene oxidase produced by Botrytis cenerea. Pers.: Fr. FEMS Microbiol. Lett. 1998. V. 167: 203-208.

159. Piontek K., Antorini M., Choinowski T. «Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.90-E resolution containing a full complement of coppers» J. Biol. Chem. 2002. V. 277, № 40: 37663-37669.

160. Raghukumar, C., Fungi from marine habitats: an application in bioremediation. Mycol. Res. 2000. V. 104: 1222-1226.

161. Reinhammar B. «Purification and properties of laccase and stellacyanin from Rhus vernicifera.» Biochim Biophys Acta. 1970. V. 205(1): 35-47.

162. Reinhammar B, Malkin R, Jensen P, Karlsson B, Andmasson LE, Aasa R, Vflnngerd T, Malmstrum BG. A new copper (II) electron paramagnetic resonance signal in two laccases and in cytochrome с oxidase. J Biol Chem. 1980. V. 255 (11): 5000-5003.

163. Reinhammar B.R., \^nngerd T.I. «The electron-accepting sites in Rhus vernicifera laccase as studied by anaerobic oxidation-reduction titrations» Eur. J. Biochem. 1971. V. 18, №4: 463-468.

164. Reinhammar B.R. «Oxidation-reduction potentials of the electron acceptors in laccases and stellacyanin» Biochim. Biophys. Acta 1972. V. 275, № 2: 245-259.

165. Reinhammar D., «Laccase» In: Copper Proteins and CopperEnzymes. 1984, V. 3: 1-35.

166. Richardson A.; McDougall G.J. A laccase-type polyphenol oxidase from lignifying xylem of tobacco Phytochemistry, 1997. V. 44, № 2: 229-235.

167. Rigling, D. and van Alfen, N.K. Regulation of laccase biosynthesis in the plant-pathogenic fungus Cryphonectria parasitica by double-stranded RNA. J. Bacteriol. 1991. V. 173: 8000-8003.

168. Riva S. «Laccases: blue enzymes for green chemistry» Trends Biotechnol. 2006. V. 24, №5:219-226.

169. Roberts S. A., Wildner G. F., Grass G., Weichsel A., Ambrus A., Rensing C., Montfort W. R., Labile A. Regulatory Copper Ion Lies Near the T1 Copper Site in the Multicopper Oxidase CueO. J. Biol. Chem. 2003. V. 278: 31958-31963.

170. Robinson SP, Loveys BR and Chacko EK. Polyphenol oxidase enzymes in the sap and skin of mango fruit. Australian Journal of Plant Physiology . 1993. V. 20(1): 99 107.

171. Sanchez-Amat A., Solano F. A Pluripotent Polyphenol Oxidase from the Melanogenic MaxineAlteromonas ^Shares Catalytic Capabilities of Tyrosinases and Laccases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 240: 787-792.

172. Sannia, G., Giardina, P., Luna, M., Rossi, M. and Buonocore, V. Laccase from Pleurotus ostreatus. Biotechnol. Lett. 1986/V. 8: 797-800.

173. Santucci R., Ferri Т., Morpurgo L., Savini I., Avigliano L. Unmediated heterogenious electron transport reaction of ascorbate oxidase and laccase at a gold electrode. Biochem. J., 1998. V. 332:611-615.

174. Sariaslani, F. S., J. M. Beale, Jr., and P. Rosazza. Oxidation of rotenone by Polyporus anceps laccase. J. Nat. Prod. 1984. V. 47: 692-697.

175. Sato, Y., Wuli, В., Sederoff, R., Whetten, R., Molecular cloning and expression of eight cDNAs in loblolly pine (Pinus taeda). J. Plant Res. 2001. V. 114: 147-155.

176. Schlosser D. and Hufer C. «Laccase-catalyzed oxidation of Mn2+ in the presence of natural Mn3+ chelators as a novel source of extracellular H2O2 production and its impact on manganese peroxidase» Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68, № 7: 3514-3521.

177. Schmid A., Dordick J. S., Hauer В., Kiener A., Wubbolts M. G. and Witholt B. Industrial biocatalysis today and tomorrow. Nature, 2001. V. 409 (6817): 258-268.

178. Schneider, P., Caspersen, M.B., Mondorf, K., Halkier, Т., Skov, L.K., Ostergaard, P.R., Brown, K.M., Brown, S.H. and Xu, F. Characterization of a Coprinus cinereus laccase. Enz. Microb. Technol. 1999. V. 25: 502-508.

179. Sethuraman, A., Akin, D.E. and Eriksson, K.-E. Production of ligninolytic enzymes and synthetic lignin mineralization by the bird's nest fungus Cyathus stercoreus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 52: 689-697.

180. Shiba T.;Xiao L.; Miyakoshi T.;Chen C.-L. Oxidation of isoeugenol and coniferyl alcohol catalyzed by laccases isolated from Rhus vernicifera Stokes and Pycnoporus coccineus. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2000. V. 10, № 6: 605-615.

181. Shintaro F., Masahiro G., Hiroyuki W. «Biodegradation of dioxin using laccase» JP2001037465, February 13, 2001

182. Shleev S., Christenson A., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A., Gorton L., Ruzgas T. «Electrochemical redox transformations of Tl and T2 copper sites in native Trametes hirsuta laccase at gold electrode» Biochem. J. 2005a. V. 385, № 3: 745-754.

183. Shleev S., Jarosz-Wilkolazka A., Khalunina A., Morozova O., Yaropolov A., Ruzgas Т., Gorton L. «Direct electron transfer reactions of laccases from different origins on carbon electrodes» Bioelectrochemistry 2005b. V. 67, № 1: 115-124.

184. Shleev S., Persson P., Shumakovich G., Mazhugo Y., Yaropolov A., Ruzgas Т., Gorton L. «Laccase based biosensors for monitoring lignin» Enzyme Microb. Technol. 2006a. V. 39, № 4: 835-840.

185. Shleev S., Reimann C.T., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A.I., Gorton L., T.Ruzgas «Autoreduction and aggregation of fungal laccase in solution phase: Possible correlation with a resting form of laccase» Biochimie 2006b. V. 88, № 9: 1275-1285.

186. Shleev S., Tkac J., Christenson A., Ruzgas Т., Yaropolov A.I., Whittaker J.W., Gorton L. «Direct electron transfer between copper-containing proteins and electrodes» Biosens. Bioelectron. 2005c. V. 20, № 12: 2517-2554.

187. Shleev S., Wettein J. Magnusson K.-E., Ruzgas T. «Electrochemical characterization and application of azurin-modified gold electrodes for detection of superoxide» Biosens. Bioelectron. 2006c. V. 22: 213-219.

188. Shleev S., Pita M., Yaropolov A.I., Ruzgas Т., Gorton L. «Direct heterogeneous electron transfer reactions of Trametes hirsuta laccase at bare and thiol-modified gold electrodes» Electroanalysis 2006d. V. 18(19-20): 1901-1908

189. Si J.Q. «Use of laccase in baking» US Patent № 6,296,883, October 2, 2001

190. Solano F., Garcia E., Perez De Egea, E. and Sanchez-Amat A. «Isolation and characterization of strain MMB-1 (CECT 4803), a novel melanogenic marine bacterium» Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63: 3499-3506.

191. Solomon E.I., Sundaram U.M., Machonkin Т.Е. «Multicopper oxidases and oxygenases» Chem. Rev. 1996. V. 96, N 7: 2563-2605.

192. Souza de C.G.M., Peralta R.M. «Purification and characterization of the main laccase produced by the white-rot fungus Pleurotus pulmonarius on wheat bran solid state medium» J. Basic Microbiol. 2003. V. 43, № 4: 278-286.

193. Spira-Solomon D.J., Allendorf M.D., Solomon E. I. «Low-temperature magnetic circular dichroism studies of native laccase: confirmation of a trinuclear copper active site» J. Am. Chem. Soc. 1986. V. 108, № 17: 5318-5328.

194. Sterjiades R., Dean J.F.D., Eriksson K.-E.L. «Laccase from sycamore maple (Acer pseudoplatanus) polymerizes monolignols» Plant Physiol. 1992. V. 99: 1162—1168.

195. Sterjiades R., Dean J.F.D., Gamble G., Himmelsbach D.S. «Extracellular laccases and peroxidases from sycamore maple (Acer pseudoplatanus) cell-suspension cultures. Reactions with monolignols and lignin model compounds» Planta 1993. V. 190: 75-87.

196. Sugumaran M., Giglio L., Kundzicz H., Saul S. and Semensi V. «Studies on the enzymes involved in puparial cuticle sclerotization in Drosophila melanogastery> Arch. Insect Biochem. Physiol. 1992. V. 19: 271-283.

197. Suzuki Т., Endo K., Ito M., Tsujibo H., Miyamoto K. and Inamori Y. «А thermostable laccase from Streptomyces lavendulae REN-7: purification, characterization, nucleotide sequence, and expression» Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. V. 67: 2167-2175.

198. Tarasevich M R, Bogdanovskaya V. A. «The surface-modified carbon materials for electrocatalysis» Russ. Chem. Rev. 1987. V. 56 (7): 653-669.

199. Tezuka К., Hayashi M., Ishikara H., Onozaki К., Nishimura M., Takahashi N. «Occurrence of heterogeneity on N-linked oligosaccharides attached to sycamore (Acer pseudoplatanus L.) laccase of excretion» Biochem. Mol. Biol. Int. 1993. V. 29: 395—402.

200. Thakker G.D., Evans C. S. and Rao K.K. «Purification and characterization of laccase from Monocillium indicum Saxena» Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. V. 37, № 3: 321-323.

201. Thuesen M.H., Farver O., Reinhammar В., Ulstrup J. «Cyclic voltammetry and electrocatalysis of the blue copper oxidase Polyporus versicolor laccase» Acta Chem. Scand. 1998. V. 52: 555-562.

202. Thurston CF The structure and function of fungal laccases. Microbiol 1994. V. 140: 19— 26.

203. Tien M., Kirk T. Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium. In: Methods Enzymol., (Wood, W.A., Kellogg, S.T., ed.), Academic Press, N.Y., 1988. V. 161: 238249.

204. Trudeau F,Daigle F, LeechD. Reagentlessmediated laccase electrode for the detection of enzyme modulators. Anal Chem 1997. V. 69: 882-6.

205. Van Beilen, J. В.; Li, Z. Enzyme technology: an overview. Curr. Opin. Biotechnol. 2002. V. 13:338-344.

206. Wang T.-Z.;Li W.-P.;Wan H.-W.;Zhou P.-J.;Qu S.-S. Assay for Laccase activity by microcalorimetry: Laccase was extracted from China lacquer of Rhus vernicifera. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2000. V. 45, № 1: 57-63

207. Vasil'eva I.S., Morozova O.V., Shumakovich G.P., Shleev S.V., Sakharov I.Yu., Yaropolov A.I. Laccase-catalyzed synthesis of optically active polyaniline. Synthetic Metals, 2007. V. 157:684-689.

208. Williamson, P.R. Biochemical and molecular characterization of the diphenol oxidase of Cryptococcus neoformans: identification as a laccase. J. Bacteriol. 1994. 176:656-664.

209. Vincent K.A., Parkin A., Armstrong F.A. «Investigating and exploiting the electrocatalytic poperties of hydrogenases» Chem. Rev. 2007. V. 107: 4366-4413.

210. Viterbo, A., Staples, R.C., Yagen, В., Mayer, A.M., Selective mode of action of cucurbitacin in the inhibition of laccase formation in Botrytis cinerea. Phytochemistry. 1994. V. 35: 1137-1142.

211. Wood, D.A. Production, purification and properties of extracellular laccase of Agaricus bisporus. J. Gen. Microbiol. 1980. V. 117: 327-338.

212. Woolery, G.L., Powers, L., Peisach, J. and Spiro, T.G. X-ray absorption study of Rhus laccase: evidence for a copper-copper interaction, which disappears on type 2 copper removal. Biochemistry. 1984. V. 23: 3428-3434.

213. Worral, J J., Chet, I. and Hbttermann, A. Association of rhizomorph formation with laccase activity mArmillaria spp. J. Gen. Microbiol. 1986. V. 132: 2527-2533.

214. Xie, X.; Wang, Z.; Wu, D.; Qu, S.; Wang, C. Microcalorimetric Studies of Rhus vernicifera Laccase Catalytic Oxidation Reactions. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2002. V. 70, №3: 889-896.

215. Xu F. «Application of oxidoreductases: recent progress» Industrial Biotechnol. 2005. V. 1, № 1: 38-50.

216. Xu F. «Oxidation of phenols, anilines, and benzenethiols by fungal laccases: correlation between activity and redox potentials as well as halide inhibition» Biochemistry 1996a. V. 35, №23: 7608-7614.

217. Xu F., Berka R. M. , Wahleithner J. A. , Nelson B.A. , Shuster J.R. , Brown S.H., Palmer A.E., Solomon E.I. «Site-directed mutations in fungal laccase: effect on redox potential, activity and pH profile» Biochemical J. 1998. V. 334, № 1: 63-70.

218. Xu F., Palmer A.E, Yaver D.S., Berka R.M., Gambetta G.A., Brown S.H., Solomon E.I. «Targeted mutations in a Trametes villosa laccase. Axial perturbations of the T1 copper» J. Biol. Chem. 1999. V. 274, № 18: 12372-12375.

219. Xu, F. "Catalysis of novel enzymatic iodide oxidation by fungal laccase." Appl. Biochem. Biotechnol. 1996b. V. 59: 221-230.

220. Xu, F. "Effects of redox potential and hydroxide inhibition on the pH activity profile of fungal laccases." J. Biol. Chem. 1997. V. 272: 924-928.

221. Xu, F. Applications of oxidoreductases: recent progress. Industrial Biotechnol. 2005. V. 1: 38-50.

222. Xu, F., Berka, R.M., Wahleithner, J.A., Nelson, B.A., Shuster, J.R., Brown, S.H., Palmer, A.E. and Solomon, E.I. Site-directed mutations in fungal laccase: effect on redox potential, activity and pH profile. Biochem. J. 1998. V. 334: 63-70.

223. Xu, F., Deussen, H.J., Lopez, В., Lam, L. and Li, K. Enzymatic and electrochemical oxidation of N-hydroxy compounds. Redox potential, electrontransfer kinetics, and radical stability. Eur. J. Biochem. 2001. V. 268: 4169-4176.

224. Xu, F., Kulys, J.J., Duke, K., Li, K., Krikstopaitis, K., Deussen, H.J., Abbate, E., Galinyte, V. and Schneider, P. Redox chemistry in laccase-catalyzed oxidation of N-hydroxy compounds. Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66: 2052-2056.

225. Yan Y, Su L, Mao L. Multi-walled carbon nanotube-based glucose/02 biofuel cell with glucose oxidase and laccase as biocatalysts. J Nanosci Nanotechnol. 2007 V. 7(4-5): 16251630.

226. Yang J. and Hu N. «Direct electron transfer for hemoglobin in biomembrane-like dimyristoyl phosphatidylcholine films on pyrolytic graphite electrodes» Bioelectrochem. Bioenerg. 1999. V. 48, № 1: 117-127.

227. Yaropolov A.I., Kharybin A.N., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton L. «Electrochemical properties of some copper-containing oxidases» Bioelectrochem. Bioenerg. 1996. V. 40, № 1:49-57.

228. Yaropolov A.I., Skorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeev S.D. «Laccase: properties, catalytic mechanism, and applicability» Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 49: 257-280.

229. Yoon C.-J. and Kim H.-H. «Electrochemical studies of immobilized laccases on the modified-gold electrodes»./ Korean Electrochem. Soc. 2004. V. 7: 26-31.

230. Yoshida H. Chemistry of lacquer (Urushi). J. Chem. Soc. Trans. 1883. V. 43,: 472-486.

231. Yoshitake A., Katayama Y., Nakamura M., Iimura Y., Kawai S., Morohoshi N. «N-Linked carbohydrate chains protect laccase-III from proteolysis in Coriolus versicolor» J. Gen. Microbiol. 1993. V. 139: 179-185.

232. Zhao, J., Kwan, H.S., Characterisation, molecular cloning and differential expression analysis of laccase genes from the edible mushroom Lentinula edodes. Appl. Environ. Microbiol. 1999.V. 65: 4908-4913.

233. Базилсвский M.B., Фаустов В.И. Современные теории химических реакций в конденсированной фазе. Успехи химии. 1992, т.61, №. 7, с. 1185-1223.

234. Березин И.В., Богдановская В.А., Варфоломеев С.Д., Тарасевич М.Р., Ярополов А.И., «Биоэлектрокатализ. Равновесный кислородный потенциал в присутствии лакказы» Доклады АН СССР 1978. Т. 240, № 3, С. 615-617.

235. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. Москва, Изд-во МГУ, 1976, с. 166-186.

236. Богдановская В.А., Бурштейн Р.Х., Тарасевич М.Р. «Влияние состояния поверхности платинового электрода на скорость электровосстановления кислорода» Электрохимия 1972. Т. 8, № 8, с. 1206-1209.

237. Болобова А.В., Аскадский А.А., Кондращенко В.И., Рабинович M.JI. «Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Кн. II: Ферменты, модели, процессы» М.: Наука, 2002, с. 343

238. Горшина Е.С., Русинова Т.В., Бирюков В.В., Морозова О.В., Шлеев С.В., Ярополов А.И. «Динамика оксидазной активности в процессе культивирования базидиальных грибов рода Trametes Fr.» Прикладная биохимия и микробиология 2006, Т. 42, № 6, с. 638-644.

239. Дейнеко И.П., Зиен Jle Куанг. Влияние соединений металлов переменной валентности на делигнификацию древесины в щелочной среде. ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2006. №2. с. 5-10.

240. Карякин А.А., Ярополов А.И., Зорин И.А., Гоготов И.Н., Варфоломеев С.Д. «Кинетика и механизм окисления водорода гидрогеназой Thiocapsa roseosersicina» Биохимия 1984. Т. 49, № 4, с. 611-621

241. Наки Али, Варфоломеев С.Д. Механизм ингибирования активности лакказы из polyporus versicolor ионами галогенов. Биохимия., 1981, Т.46, вып. 9. с. 1694-1701

242. Никитин В.М. Теоретические основы делигнификации. М., 1981. с. 29

243. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Ярополов А.И. «Роль ионов двухвалентного марганца в функционировании лигнолитических ферментов базидиального гриба Trametes pubescens». Вестник МГУ, Сер. 2. Химия 2005b. Т. 46, № 4, с. 267-273.

244. Остерман Л.А. «Методы исследования белков и нуклеиновых кислот» 2002, М.: "МЦНМО" с. 248.

245. Позднякова Н.Н., Никитина В.Е., Турковская О.В. Биоремедиация нефтезагрязненной почвы комплексом гриба Pleurotus ostreatus — почвенная микрофлора. Прикладная биохимия и микробиология 2008, Т. 48, № 1, с. 69-75.

246. Тарасевич М.Р. «Электрохимия углеродных потенциалов» М: Наука, 1984, с 254.

247. Ярополов А.И. «Каталитические закономерности действия биокатализаторов в электрохимических системах» Дисс.докт. хим. наук. М.: Химический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, 1986, с 357.

248. Ярополов А.И., Гиндилис A.JI. «Прямой перенос электрона в электроферментативных системах» Биофизика 1990. Т. 35, Вып. 4, с. 689-698.

249. Ярополов А.И., Гиндилис A.JI. «Связь между электрохимическими превращениями простетической группы и каталитической активностью лакказы» Электрохимия 1985. Т. 21, №7, с. 982-983.

250. Ярополов А.И., Карякин А.А., Гоготов И.Н., Зорин Н.А., Варфоломеев С.Д., Березин И.В. «Биоэлектрокатализ. Механизм окисления молекулярного водорода на электроде с иммобилизованной гидрогеназой» Доклады АН СССР 1984. Т. 274, № 6, с. 1434-1437.

251. Ярополов А.И., Сухомлин Т.К., Карякин А.А., Варфоломеев С.Д., Березин И.В. «О возможности туннельного переноса электрона при ферментативном катализе электродных процессов» Доклады АН СССР 1981. Т. 260, № 5, с. 1192-1195.

Информация о работе

Горбачева, Марина Анатольевна
кандидата химических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Биокаталитические свойства лакказ из различных источников - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы