Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическое обоснование использования личинок Tribolium confusum для биологической оценки качества зерновых белков

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Балаян, Валерий Михайлович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ЗЕРНОВЫХ БЕЛКОВ, МЕТОДЫ ЕЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

1.1. Факторы, определяющие биологическую ценность белков.

1.2. Химические методы оценки качества белков.

1.3 Методы биологической оценки качества белков. II

ГЛАВА 2. ПР0ТЕ0ЛИЗ БЕЛКОВ И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ

2.1. Некоторые особенности протеолиза белков.

2.2. Краткая характеристика пептидгидролаз желудочно-кишечного тракта животных.

2.3. Протеолитические ферменты насекомых.

ГЛАВА 3. ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ.

3.1. Общая характеристика ингибиторов протеиназ.

3.2. Физиологическая роль ингибиторов протеиназ в растении.

3.3. Роль ингибиторов протеиназ в питании.

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Биологические особенности тест-организма и его потребности в некоторых питательных веществах.

4.2. Методы биологической оценки.

4.3. Методы определения активности протеиназ.

4.4. Методы определения активности ингибиторов протеиназ.

4.5. Хроматографические методы и электрофорез.

ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ ПИТАНИЯ ТЕСТ-ОРГАНИЗМА НА ЗЕРНОВЫХ РАЦИОНАХ.

5.1. Влияние содержания белка в рационе на среднесуточные привесы тест-организма.

5.2. Влияние различного содержания ингибиторов на среднесуточные привесы тест-организма.

5.3. Влияние тепловой обработки зерновых рационов на среднесуточные привесы тест-организма.

5.4. Среднесуточные привесы тест-организма на зерновых рационах с различным содержанием лизина.

5.5. Среднесуточные привесы тест-организма на рационах из различных анатомических частей зерна.

ГЛАВА 6. НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА ПРОТЕИНАЗ ТЕСТ-ОРГАНИЗМА

6.1. Оптимум рН действия и субстратная специфичность протеиназ тест-организма.

6.г. Активность протеиназ тест-организма в различных отделах кишечника.

6.3. Влияние активаторов и ингибиторов на активность протеиназ тест-организма.

6.4. Возрастные изменения активности протеиназ тест-организма.

6.5. Влияние ингибиторов из семян злаков на активность протеиназ тест-организма в разном возрасте

6.6. Гельхроматография протеолитических ферментов тест-организма

ГЛАВА 7. ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ТЕСТ-ОРГАНИЗМА ИЗ СЕМЯН

ЗЕРНОВЫХ И ЗЕРНОБОБОВЫХ КУЛЬТУР.

7.1. Содержание ингибиторов протеиназ в семенах различных культур и методы их экстракции.

7.2. Влияние тепловой обработки на активность протеиназ тест-организма.«••

7.3. Изменения активности ингибиторов протеиназ при созревании и проращивании семян.

7.4. Разделение ингибиторов протеиназ из сои при помощи хроматографии на сефадексе а- 100,

ДЭАЭ - целлюлозе и гидроксилапатите.

ГЛАВА 8. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ

ЦЕННОСТИ ЗЕРНОВЫХ БЕЛКОВ.

8.2. Влияние различного соотношения белок/особь в . зерновом рационе на привесы тест-организма.

8.3. Определение оптимальной концентрации и соотношения белок/особь в рационе для проведения . биологической оценки.

8.4. Сравнительные исследования качества зерновых белков ячменя при помощи химических и биологических методов оценки.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимическое обоснование использования личинок Tribolium confusum для биологической оценки качества зерновых белков"

В Продовольственной программе СССР, принятой на Майском v (1982 г.) Пленуме ЦК КПСС, особо подчеркивается необходимость создания новых сортов и гибридов сельскохозяйственных культур с высоким качеством зерна* В настоящее время на долю растениеводства приходится около 80% общего производства белковых продуктов, однако растительные белки, в первую очередь злаков, значительно уступают по биологической ценности белкам животного происхождения.

В связи с этим одной из важнейших задач селекционной науки является поиск генотипов с улучшенным качеством белков, которое определяется сбалансированностью аминокислотного состава, переваримостью белка и усвояемостью отдельных его аминокислот* На пищевую ценность рациона могут оказывать существенное влияние неалиментарные вещества: ингибиторы ферментов, танины, фенолы, фитогемаглютенины, нитраты, алкалоиды и другие (42).

Для осуществления подобного рода программ необходимы такие экспресс - методы определения биологической ценности белков, которые позволяли бы оценивать и отбирать лучшие формы растений уже на ранних этапах селекционного процесса. Использование животных, в частности лабораторных крыс, для этих целей связано не только с трудоемкостью метода, но также с необходимостью располагать сравнительно ^большим количеством анализируемого материала ( I - 2 кг ). Что касается химических методов (определение аминокислотного состава, переваримости белков и др.), то они не в состоянии дать интегральную оценку качества зерновых белков.

Одними из перспективных тест - организмов для этой цели могут служить насекомые, которые эволюционно связаны с питанием зерном или продуктами его переработки, в частности, личинки малого мучного хрущака Tribolium confusum . Попытки использовать этот тест - организм для биологической оценки были предприняты уже в начале 60-х годов (92). Обнадеживающие результаты были получены в дальнейших исследованиях ряда авторов (152, 160, 184).

Однако, до сих пор практически не были изучены протеоли-тические ферменты пищеварительного тракта этого тест - орга-Ы низма. Не было известно^ в какой степени влияют на протеолиз белков присутствующие в семенах растений ингибиторы протеи-наз тест - организма и их свойства. Не делалось попыток исследовать физиологическую роль этих белков в растениях и локализацию их в анатомических частях зерновки. Практически не была изучена чувствительность тест - организма к качеству и количеству белка в рационе, а также влияние различного уровня ингибиторов протеиназ и термической обработки на его рост. Все это не позволяло определенно судить о возможности использования этого тест - организма для биологической оценки качества зерновых белков и той роли, которую могут играть ингибиторы протеиназ насекомых в растении.

Целью настоящих исследований являлось биохимическое обоснование использования личинок малого мучного хрущака iriboii-um confusum для биологической оценки качества зерновых белков.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

- личинки малого мучного хрущака являются чувствительным к качеству и количеству белка тест - организмом;

- гидролиз белков в пищеварительном тракте тест - организма осуществляется системой сериновых, тиоловых и карбоксильных протеиназ, которые локализованы в среднем отделе кишечника и по своим свойствам подобны ферментам млекопитающих;

- содержащиеся в зерне злаковых культур ингибиторы протеиназ тест - организма не оказывают существенного влияния на его i \ Hi' Хул'С^^- ^ i рост. Для инак'1ивации\'прот^иназ насекомых из сои необходимо проводить термическую обработку;

- ингибиторы протеиназ тест - организма могут выполнять как J защитную, так и ругуляторную функции в семенах растений;

- на основании проведенных исследований делается вывод о возможности использования личинок малого мучного хрущака в качестве тест - организма для биологической оценки качества зерновых белков.

Основные результаты диссертационной работы доложены на:

- 3 Украинском энтомологическом съезде (Ужгород, октябрь 1980 г.);

- Всесоюзном совещании "Важнейшие проблемы увеличения производства растительного белка и развитие научных исследований в этой области в свете решений ХХУ1 съезда КПСС" (Краснодар, декабрь 1981 г.);

- 4 Украинском биохимическом съезде (Днепропетровск, июнь 1982 г.);

- Заседании Координационного совета ВАСХНИЛ по качеству зерна (Одесса, март 1983 г.);

- Заседании Одесского отделения Всесоюзного биохимического общества (Одесса, апрель 1983 г.);

- Конференции отдела биохимии и физиологии питания Института питания АМН СССР (Москва, май 1984 г.).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Балаян, Валерий Михайлович

ВЫВОДЫ

На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы.

I. Установлена положительная корреляционная связь между среднесуточными привесами изучаемого тест-организма и содержанием лизина в рационах из ячменя и кукурузы: 0,85 и 0,75 соответственно (р = 0,01).

V 2. Ингибиторы протеиназ, присутствующие в семенах злаков, не оказывают отрицательного влияния на биологическую оценку при помощи данного тест-организма. С одной стороны это можно объяснить низким содержанием ингибиторов в злаках, а с другой стороны, по-видимому, определенную роль играют возрастные изменения чувствительности протеиназ личинок к действию этих белков и переваривание их в пищеварительном тракте.

3. В результате изучения субстратной специфичности, влияния на активность протеиназ ингибиторов и активаторов установлено, что в пищеварительном тракте тест-организма присутствуют сериновые, тиоловые и карбоксильные эндопептидазы, которые в основном локализованы в среднем отделе кишечника и осуществляют, по-видимому, как вне-, так и внутриклеточный протеолиз.

4. При изучении возрастных изменений активности протеиназ тест-организма и динамики среднесуточных привесов на зерновых рационах показано, что оптимальным для биологической оценки является возраст 8-20 дней. Причем, для проведения оценки достаточно скармливать рацион в течение 10 суток.

5. Показано, что соевые ингибиторы могут подавлять активность не только трипсина, химотрипсина и протеиназ личинок, но также эндогенных протеиназ самого зерна. Характерные изменения ингибиторной активности в процессе созревания и прорастания семян, возможно, связаны с регуляторной ролью этих белков. б. При сравнительной биологической оценке качества зерновых белков между среднесуточными привесами крыс, коэффициентом эффективности белка (КЭБ), химическим скором, индексом незаменимых аминокислот (ИНАК) и среднесуточными привесами тест-организма установлена положительная корреляционная связь 0,9; 0,92; 0,84 и 0,78 соответственно (р = 0,01).

121.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Первый этап исследований был связан с изучением особенностей питания тест-организма на зерновых рационах. Основное внимание было уделено изучению влияния различных концентраций белка, лизина и ингибиторов протеиназ на рост личинок, а также сравнительной оценке качества зерновых белков при помощи тест-организма и химических показателей (химический скор, индекс незаменимых аминокислот). Кроме того, изучали качество белков из различных анатомических частей зерна, влияние тепловой обработки на пищевую ценность зерна и динамику привесов личинок на различных рационах.

Результаты, полученные при скармливании личинкам зерновых рационов с различным уровнем белка показали, что скорость роста тест-организма зависит не только от концентрации белка, но также от его качества. Так, на рационах из кукурузы максимальные привесы наблюдались при 6%, тритикале - 6%, пшеницы - 10% и ячменя - 12%. Дальнейшее повышение уровня белка выше указанных значений уже не влияло на среднесуточные привесы тест-организма, а, следовательно, превышало физиологические потребности личинок в том или ином белке.

Исследования влияния различного содержания ингибиторов протеиназ в зерновых рационах из ячменя, пшеницы, тритикале и сои показали, что на рационах из семян злаков между содержанием ингибиторов и среднесуточными привесами тест-организма связи не наблюдалось. Полученные данные, по-видимому, можно объяснить низким уровнем ингибиторов в семенах злаковых культур, по-срав-нению с бобовыми, возрастными изменениями протеиназ, а также инактивацией ингибиторов в пищеварительном тракте тест-организма. В случае с соевым рационом, также как при кормлении животных (179), наблюдалось отрицательное влияние ингибиторов на привесы тест-организма.

Скармливание личинкам зерновых рационов после тепловой обработки при 120°С в течение 2 ч не отражалось на их росте в опытах с соей, тритикале и кукурузой. На рационах из ржи наблюдалось увеличение привесов, по-сравнению, с контролем, а на ячмене и пшенице, наоборот, торможение. Последние результаты, по-видимому, можно объяснить следствием разрушения лизина или снижением его доступности, что согласуется с данными, полученными при кормлении животных (61).

Автоклавирование при 132°С и р=0,2МПа в течение 10-15 мин и СВЧ-обработка в течение 6-9 мин позволила на фоне витаминных добавок повысить питательную ценность соевых белков. Аналогичные результаты были получены при скармливании рационов из сои крысам. Однако при использовании тепловой обработки необходимо учитывать влияние как минимум 3 факторов: содержание ингибиторов протеиназ, лизина и витаминов. Использование оптимальных режимов обработки с учетом изменений в содержании этих 3 компонентов пищи, позволит проводить биологическую оценку соевых белков при помощи тест-организма.

Особое значение для питания животных и насекомых имеет сба-балансированность зерновых белков по аминокислотному составу, в частности, уровень лимитирующей аминокислоты - лизина. При скармливании личинкам рационов из ячменя и кукурузы с различным содержанием лизина при одинаковой концентрации белка, было показано, что между содержанием лизина в обоих рационах и среднесуточными привесами тест-организма существует положительная корреляционная связь: 0,85 и 0,75 соответственно.

Общеизвестно, что у злаковых культур белки зародыша превос

110. ходят по своей питательной ценности белки эндосперма, приближаясь по этому показателю к белкам животного происхождения (21). В опытах на личинках было подтверждено высокое качество белков зародыша, по-сравнению, с эндоспермом. Следовательно, личинки являются чувствительным к качеству зерновых белков тест-организмом.

Важную роль в усвоении зерновых белков играет ферментная система пищеварительного тракта животных, в том числе и насекомых, осуществляющая гидролиз белков до пептидов и аминокислот. Исследования протеолитических ферментов личинок малого мучного хрущака показали, что протеолиз белков в пищеварительном тракте этого тест-организма осуществляется системой трипси-но- и химотрипсино-, пепсино- или катепсиноподобных протеиназ. Изучение активности этих ферментов по гидролизу различных белковых субстратов и определение оптимумов рН их действия позволяет, по-видимому, говорить о кислотно-щелочном типе пищеварения у данного тест-организма. Что касается участия различных отделов пищеварительного тракта личинок в протеолизе белков, то полученные результаты свидетельствуют об активном переваривании белков протеиназами среднего кишечника как в кислой, так и в нейтральной области значений рН. Это согласуется с данными, полученными целым рядом исследователей на других видах насекомых (2, 72, 197).

Использование специфических ингибиторов и активаторов ферментов показало, что протеиназы личинок представлены сериновы-ми, цистеиновыми и карбоксильными эндопептидазами. Наиболее высокой способностью активировать тиоловые протеиназы обладал дитиотреитол, который уже в концентрации 10""бм вызывал повышение казеинолитической активности ферментов на 86%. Необходимо также отметить, что в процессе хранения (2 сут при 4°С) ферментный препарат в значительной степени терял свою активность и использование тиоловых активаторов уже не позволяло восстановить ее.

Исследования возрастных изменений активности протеолити-ческих ферментов тест-организма показали, что максимальной способностью гидролизовать различные субстраты обладали экстракты из 14 - 19 дневных личинок и с возрастом ферментативная активность падала до минимальных значений в фазе куколки. В связи с полученными результатами наиболее интенсивное усвоение белков в пищеварительном тракте тест-организма можно ожидать в возрасте от 8 до 20 суток. Причем необходимо отметить, что глиадин пшеницы по переваримости протеиназами личинок уступает белкам животного происхождения: казеину, гемоглобину и протамину. Аналогичная картина наблюдается при гидролизе этих белков протеолитическими ферментами животных (59).

Исследования ряда авторов (7, 114) показали, что ферментная система насекомых может адаптироваться к качеству пищевых белков. В связи с отрицательным воздействием ингибиторов на протеолиз белков, изучали возрастные изменения чувствительности протеолитических ферментов тест-организма к их действию. Было показано, что с возрастом степень ингибирования активности протеиназ экстрактами из семян ячменя, пшеницы и кукурузы уменьшается, что, по-видимому, связано с определенными изменениями ферментной системы тест-организма.

Хроматографическое разделение протеолитических ферментов тест-организма при помощи гельфильтрации на сефадексе G - 100 показало, что ферменты, расщепляющие казеин и гемоглобин, занимают промежуточное положение между высоко- и низкомолекуляр

112. ными белковыми фракциями. Использование гельхроматографии позволило повысить активность ферментного препарата по гидролизу казеина в б ,1 раз, а гемоглобина - в 14,1 раз.

Таким образом, исследованные свойства протеиназ личинок малого мучного хрущака, а также результаты, полученные другими авторами при изучении ферментов личинок кожееда (72), большого мучного хрущака (148), вредной черепашки (8) и других видов насокомых (114) свидетельствует о наличии у этих организмов механизмов протеолиза, включающих начальный этап переваривания белков в просвете кишечника под действием пеп-сино-, трипсино- и химотрипсиноподобных протеиназ, затем гидролиз олигопептидов под действием экзопептидаз, а также внутриклеточного протеолиза под действием аминопептидаз и карбок-. сипептидаз.

Значительная часть исследований была посвящена ингибиторам протеиназ тест-организма из семян зерновых и зернобобовых культур, которые, оказывая влияние на протеолиз, могут выполнять регуляторную, защитную и антипитательную функции. Эти белки,наряду с ингибиторами протеолитических ферментов животных, микроорганизмов, были обнаружены в семенах зерновых и зернобобовых культур (83). Было проведено изучение некоторых свойств ингибиторов, изменения их активности при созревании и проращивании семян растений, а также влияние на питание тест-организма. В большинстве случаев тестирование ингибиторной активности проводили по трипсиноподобной протеиназе личинок, расщепляющей казеин при рН 7,0.

Как показали исследования, ингибиторы протеиназ тест-организма присутствуют в семенах всех изучаемых культур: ячменя и пшеницы, кукурузы и тритикале, ржи и сои. Они, как правило, из. представлены водо- и солерастворимыми фракциями белков, йак-синальной ингибиторной активностью обладали экстракты из сои, что соответствует данным по соевым ингибиторам трипсина (30). Ингибиторы обнаружены в различных анатомических частях зерновки, причем в зародышах их уровень значительно выше, чем в эндосперме. Изучение их чувствительности к температурному воздействию показало, что для большинства исследованных ингибиторов, за исключением сои и ячменя, тепловая обработка при 120°с в течение 2 ч приводит практически к полной инактивации белков. Что касается соевых ингибиторов протеиназ тест-организма, то лишь автоклавирование при 132°С и р = 0,2Ш1а в течение 10-15 мин или СВЧ-обработка в течение 9 мин позволяли практически полностью инактивировать их. Аналогичные результаты были получены при использовании таких же режимов теплового воздействия на ингибиторы трипсина.

Необходимо отметить, что при тепловой обработке ржаной и пшеничной муки при 70°С в течение I ч в водных экстрактах наблюдалось некоторое повышение ингибиторной активности, связанное, по-видимому, с разрушением белковых комплексов типа "протеиназа-ингибиторп и высвобождением из них ингибиторов.

Исследования содержания ингибиторов протеиназ тест-организма, трипсина и химотрипсина в различных формах тритикале показали, что в высокобелковых формах уровень ингибитора трипсина в 2,6, а ингибитора химотрипсина в 1,8 раза выше, чем у низкобелковых. Причем при разнице в содержании белка всего на 2%, ингибиторная активность отличалась в несколько раз. Аналогичные результаты были получены на высокобелковых и низкобелковых формах пшеницы (I). Полученные данные с одной стороны можно объяснить повышением уровня ингибиторов за счет увеличения содержания белка в семенах, а с другой стороны участием ингибиторов протеиназ в белковом обмене и накоплении запасных белков. В отношении ингибиторов протеиназ тест-организма такой взаимосвязи с содержанием белка в изучаемых образцах не обнаружено, однако их уровень в различных формах значительно отличается. Это, по-видимому, можно объяснить несколько различными функциями ингибиторов протеиназ тест-организма, трипсина и химотрипсина в семенах тритикале.

С целью разделения ингибиторов протеиназ из сои использовали различные хроматографические методы. Гельфильтрация на сефадексе G- 100 не позволила разделить перечисленные ингибиторы протеиназ и степень очистки белковых препаратов была незначительна. В дальнейшем использовали ионнообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, которая позволила в значительной степени повысить удельную активность и очистить ингибитор протеиназ личинок, что было показано с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле. Однако получить гомогенный ингибитор протеиназ не удалось. Аналогичная картина наблюдалась при использовании хроматографии на гидроксилапатите. Несмотря на различные принципы разделения, использованные в перечисленных хроматографических методах, близкие физико-химические свойства изучаемых белков не позволили их разделить. Полученные данные, по-видимому, можно объяснить действием поливалентного соевого ингибитора Кунитца, который может одновременно подавлять активность большого числа протеиназ млекопитающих, а также насекомых и бактерий (171). Еще одной причиной, затрудняющей разделение, может служить способность соевых ингибиторов образовывать диссоциирующие белковые комплексы, которые в процессе хроматографического разделения диссоциируют с

115. высвобождением ингибиторов протеиназ.

В пользу этого говорят полученные нами данные по влиянию разведений исходного раствора соевых ингибиторов на их активность. В частности, было показано, что ступенчатое разведение препарата не сопровождается пропорциональным снижением ингибиторной активности по протеиназам личинок и трипсину и даже х при уменьшении концентрации в 1Сг раз, активность ингибиторов остается на довольно высоком уровне. Для сравнения разведение ингибитора из семян пшеницы всего в 10 раз приводит к полной потере ингибиторной активности по протеиназам тест-организма.

С целью изучения физиологической роли ингибиторов протеиназ тест-организма в семенах сои и пшеницы было проведено изучение изменения ингибиторной активности при созревании зерна пшеницы и прорастании соевых бобов. Была предложена гипотеза, согласно которой белки, подавляющие активность протеиназ насекомых являются белками, выполняющими с одной стороны регу-ляторную функцию в протеолизе зерновых белков, а с другой стороны защитную, благодаря схожести активных центров эндо- и эк-зопротеиназ. В пользу этого свидетельствуют данные о способности ингибиторов из семян гречихи, латука, ячменя, ржи, вигны и фасоли наряду с экзопротеиназами подавлять активность собственных протеиназ (4, 75, 174), а также способность к образованию комплексов между ингибиторами и внутриклеточными проте-иназами при разрушении клеточных структур (99, 138). О том, что это может быть связано с прорастанием или созреванием семян говорят исследования по локализации протеиназ и их ингибиторов в различных органелах клетки (147, 155), а также результаты изучения изменения активности протеиназ и ингибиторов трипсина в созревающих семенах (10, II).

116.

Проведенные исследования в онтогенезе семян пшеницы и сои могут, по-видимому служить еще одним доказательством регуля-торной функции ингибиторов. Использование такого подхода с одной стороны позволяет учитывать активацию существующих, а с другой стороны биосинтез новых ферментных систем. Этот процесс носит последовательный характер и включает различные ферменты (28): I - ферменты, активные в сухих семенах и не меняющие свою активность; 2 - ферменты, менее активные в сухих'семенах, но увеличивающие свою активность по мере набухания; 3 - ферменты, активность которых в сухих семенах отсутствует; 4 -ферменты, активируемые после набухания; 5 - ферменты, синтезируемые с участием преформированной иРНК; 6 - ферменты, образующиеся только после синтеза иРНК. Таким образом, ингибиторы протеиназ могут участвовать в регуляции активности любой из перечисленных выше ферментных систем, как в период прорастания, так и в период созревания семян.

В результате проведенных исследований было показано, что при созревании пшеницы, начиная с 14 суток повышение активности ингибиторов протеиназ личинок протекает параллельно с увеличением активности ингибиторов трипсина и снижением активности протеиназ самой зерновки. Обратная картина наблюдалась при проращивании сои. Уже при замачивании соевых бобов наблюдалась диффузия ингибиторов протеиназ личинок и трипсина в окружающий раствор, а в дальнейшем при проращивании в течение 20 суток ингибиторная активность в семенах сои падала на фоне увеличения активности кислой и нейтральной протеиназ семян.

Еще одним доказательством участия ингибиторов в регуляции протеолиза могут служить результаты, полученные при изучении влияния частично очищенного соевого ингибитора и одной из бел

117. ковых фракций после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе на активность эндогенных протеиназ. Ингибирование их активности позволяет говорить о возможном участии ингибиторов в регуляции активности собственных протеиназ зерна, С одной стороны г можно предположить, что это связано с поливалентностью ингибитора Кунитца и схожестью активных центров эндо- и экзопро-теиназ, а с другой стороны участием ингибиторов в регуляции активности различных ферментных систем, функционирующих как при прорастании, так и при созревании семян.

Отдельная глава исследований посвящена разработке метода биологической оценки качества зерновых белков. Так было показано, что для проведения анализа достаточно скармливать зерновые рационы в течение 10-12 суток, так как за этот период вес личинок увеличивается в зависимости от качества белка более, чем в 30 раз. Были подобраны оптимальные концентрации белка и соотношение белок/особь в рационах для проведения биологической оценки при помощи изучаемого тест-организма. Так на рационе из ячменя лучшие результаты достигнуты при концентрации белка - 2 - 6% и 0,05 - 0,15 мг белка на одну особь в сутки. При проведении сравнительной оценки качества зерновых белков ячменя в опытах на крысах, при помощи тест-организма и химическими методами было показано, что между среднесуточными привесами тест-организма и привесами крыс, коэффициентом эффективности белка, химическим скором, индексом незаменимых аминокислот существует положительная корреляционная связь: 0,9; 0,92; 0,84 и 0,78 соответственно (р = 0,01)

Таким образом личинки малого мучного хрущака могут служить хорошим тест-организмом для биологической оценки качества зерновых белков в селекционно-генетических программах, направленных на создание сортов и гибридов злаковых культур с лучшими кормовыми достоинствами (рис. 13).

Рис. 13. Использование биохимических методов в селекции на качество зерновых белков злаковых культур /учитывая рекомендации (176)/.

119.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Балаян, Валерий Михайлович, Одесса

1. Адамовская В.Г., Левицкий А.П., Вовчук С.В. Взаимосвязь между уровнем протеиназ, их ингибиторами и хозяйственно полезными признаками зерна пшеницы. - Научно-технический бюллетень ВСГИ, 1980, №3, с.32-37.

2. Андриевский A.M., Катаненко С.В., Тоцкий В.Н. Онтогенетические особенности пептидгидролазной активности экстрактов тканей DrosopMia melanogaster. Украинский биохимический журнал, 1982, т.54, №5, с.519-524.

3. Антонов В.К. Химия протеолиэа. М.: Наука, 1983.-367с.

4. Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., Воскобойникова Й.Е. Наличие в семенах гречихи ингибитора собственного протеолити-ческого фермента. Доклады АН СССР, 1982, т.264, №4, с.991-993.

5. Бенкен И.И., Мосолов В.В., Федуркина Н.В. Влияние ингибитора протеиназ из фасоли на фитопатогенные грибы. Микология и фитопатология, 1976, т.10, №3, с.198-201.

6. Вилкова Н.А., Колесниченко Л.И. Особенности питания и пищеварения гороховой зерновки на горохе разных по устойчивости сортов. Труды ВИЗР, 1973, вып.37, с.164-171.

7. Вилкова Н.А., Шапиро И.Д. Пищевая ценность сортов и ее значение в устойчивости растений к вредителям. Труды ВИЗР, 1973, вып.37, с.30-40.

8. Вилкова Н.А. Физиологические основы теории устойчивости растений к насекомым. Автореф. Дисс. докт. биол. наук.- Ленинград, 1980. 49с.

9. Вовчук С.В., Левицкий А.П., Адамовская В.Г. Активность протеолитических ферментов и содержание ингибитора трипсина в зерне пшеницы при созревании. Научно-технический бюллетень ВСГИ, 1982, И, с.39-43.

10. Вовчук С.В., Левицкий А.П., Чарский В.В., Сиволап Ю.М. Обнаружение протеолитических ферментов и их ингибиторов в ядрах, выделенных из проростков ячменя. Научно-технический бюллетень ВСГИ, 1981, №1, с.42-49.

11. Вовчук С.В., Левицкий А.П., Адамовская В.Г. Система протеолиза и динамика накопления белков в зерне пшеницы при созревании. Научно-технический бюллетень ВСГИ, 1982, №4,с.48-52.

12. Высоцкий В.Г., Шатерников В.А. Адекватность для человека определений биологической ценности белков химическими и биологическими методами. Вопросы питания, 1980, №5, с.62-67.

13. Гилмур Д. Метаболизм насекомых. М.: Мир, 1968.-229с.

14. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982,тЛ.-392с.

15. Дин Р. Процессы распада белков в клетках. М.: Мир, I98I.-c.I20.

16. Жоли М. Физическая химия денатурации белков. М.: Мир,1978. 363с.

17. Евтихина З.Ф., Орехович В.Н., Шпикитер В.О. Очистка и некоторые свойства высокоактивного катепсина из селезенки.- Вопросы медицинской химии, 1963, №9, с.626-630.

18. Закладной Г.А., Ратанова В.Ф. Вредители хлебных запасов и меры борьбы с ними. М.: Колос, 1973. - 280с.

19. Зелинский В.Г., Вовчук С.В., Малиновский В.А. Выделение и изучение свойств ингибиторов трипсина из зерна ячменя.- Научно-технический бюллетень ВСГИ, 1981, №2, с.48-55.

20. Кауль А.К. Богатые белком семена зерновых культур.- В сб. Источники пищевого белка. М.: Колос, 1979, с.17-28.

21. Левицкий А.П. Пищеварительные ферменты слюнных желез.- Дисс. докт. биол. наук. Одесса, 1973. - 450с.

22. Левицкий А.П. Методы определения ингибиторов трипсина.- В сб. Биохимические методы исследования селекционного материала. Одесса, ВСГИ, 1979, с.68-72.

23. Левицкий А.П., Вовчук С.В. Биохимический метод определения переваримости растительных белков. В сб. Биохимические методы исследования селекционного материала. - Одесса, ВСГИ,1979, с.54-58.

24. Левицкий А.П. Химические и биологические методы определения пищевой (кормовой) ценности зерна. В сб. Биохимические методы исследования селекционного материала. - Одесса, ВСГИ, 1979, с.5-13.

25. Левицкий А.П., Вовчук С.В., Адамовская В.Г. Протеолитические ферменты и ингибиторы трипсина в эндосперме и зародыше зерна пшеницы. Физиология и биохимия культурных растений, 1982, т.14, №6, с.424-428.

26. Мазин А.Л., Сулимова Г.Е. Хроматография нуклеиновых кислот, белков и некоторых фагов на гранулированном гидроксил-алатите. Биохимия, 1975, т.40, №1, с.115-122.

27. Майер A.M. Метаболическая регуляция прорастания. В сб. Физиология и биохимия покоя и прорастания семян. - М.: Колос, 1982, с.397-424.

28. Мечников И.И. Учение о фагоцитах и его экспериментальные основы. В сб. Вопросы иммунитета. - М.: АН СССР, 1951, с.520-531.

29. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука, 197I, - 414с.

30. Мосолов В.В. Природные ингибиторы протеаз. Труды

31. Всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов. Вильнюс, 1973, с.21-24.

32. Мосолов В.В. Растительные белки ингибиторы ферментов. - В сб. Растительные белки и их биосинтез. - М.: Наука, 1975, с.172-184.

33. Мосолов В.В., Малова Е.Л., Валуева Т.А., Шульмина А.И. Свойства ингибитора сериновых протеиназ из картофеля. Биоорганическая химия, 1975, №1, с.1449-1457.

34. Мосолов В.В., Федуркина Н.В., Валуева Т.А. Выделение и свойства изоингибиторов трипсина из фасоли. Биохимия, 1977, т.42, F7, C.I20I-I2II.

35. Мосолов В.В., Федуркина Н.В. Стехиометрия взаимодействия белка-ингибитора протеаз из фасоли с трипсином и химо-трипсином. Доклады АН СССР, 1978, т.241, №3, с.1214-1216.

36. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы протеолитических ферментов. Автореф. Дисс. докт. биол. наук. - Москва, 1979, - 47с.

37. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеолиза. Баховские чтения, ХХХУТ. - М.: Наука, 1983. - 40с.

38. Номенклатура ферментов. Рекомендации Международного биохимического союза по номенклатуре и классификации ферментов, а также по единицам ферментов и символам кинетики ферментативных реакций. - М.: ВИНИТИ, 1979. - 319с.

39. Плотникова А.В. Биологическая ценность кукурузы с разным содержанием белка и лизина. Автореф. Дисс. канд. сель-хоз. наук. - Краснодар, 1981. - 24с.

40. Покровский А.А., Ертанов И.Д. Атакуемость белков пищевых продуктов протеолитическими ферментами in vitro. Вопросы питания, 1965, т.24, №3, с.38-44.

41. Покровский А.А. Роль биохимии в развитии науки о питании. М.: Наука, 1974. - 127с.

42. Покровский А.А. Метаболические аспекты фармакологии : и токсикологии пищи. М.: Медицина, 1979. - 184с.

43. Покровский С.Н. Выделение и изучение свойств белков-ингибиторов трипсина и химотрипсина из семян гречихи. Автореф. Дисс. канд. биол. наук. - Москва, 1981. - 21с.

44. Проссер Л. Сравнительная физиология животных. М.: Мир, 1977, т.1. - 608с.

45. Пыльнева П.Н. Определение общего азота в растительном материале с использованием приборов Сереньева. В сб. Биохимические методы исследования селекционного материала. - Одесса, ВСГИ, 1979, с.14-19.

46. Пыльнева П.Н., Шеремет A.M. Активность ингибитора трипсина у обычных и высокобелковых форм ячменя. В сб. Про-теолитические ферменты и их ингибиторы в семенах зерновых и зернобобовых культур. - Одесса, ВСГИ, 1982, с.51-54.

47. Рональд Л. Мадл., Хо К. Цен. Ингибиторы трипсина и химотрипсина тритикале. В сб. Тритикале - первая зерновая культура, созданная человеком. - М.: Колос, 1978. - 285с.

48. Румянцев П.Д. Биология вредителей хлебных запасов. -- М.: Хлебоиздат, 1959. 295с.

49. Рядчиков В.Г., Добровольская С.В. Методы биологической оценки зерна при селекции на качество. Краснодар, НИИСХ, 1976, - 28с.

50. Рядчиков В.Г. Улучшение зерновых белков и их оценка.- М.: Колос, 1978. 368с.

51. Собецкий Л.Н., Верещагина А.Б. Протеолитическая активность в кишечнике тлей. Труды Всесоюзного энтомологического общества, 1981, т.63, с.189-191.

52. Федуркина Н.В. Белки-ингибиторы сериновых протеиназ из фасоли. Автореф. Дисс. канд. биол. наук. - Москва, 1979.- •- 22с.

53. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов.- М.: Мир, 1980. 432с.

54. Филиппович Ю.В., Минина Н.И. Ферменты насекомых. Итоги науки и техники, серия "Биологическая химия", т.9. - М.: ВИНИТИ, 1976. - 218с.

55. Фурсов О.В. Протеазы и система "протеаза-ингибитор" родительских линий и гибридов кукурузы. Физиология и биохимия культурных растений, 1975, т.7, №4, с.424-428.

56. Черников М.П. 0 механизме действия протеиназ. В сб. Актуальные вопросы современной биохимии, т.1. - М.: Наука, 1959, с.170-177.

57. Черников М.П., Абрамова Е.П., Ляйман М.Э., Черникова Л, Шуляк А.П., Чеботарев А.К. Ингибиторы протеиназ семян некоторых растений, их свойства и влияние на усвоение белка.- Вестник АМН СССР, 1966, №10, с.57-64.

58. Черников М.П., Усачева Н.Т., Ляйман М.Э. О связи темпа переваривания белков со скоростью всасывания аминокислот.- Вопросы питания, 1973, т.32, №4, с.11-15.

59. Черников М.П. Протеолиз и биологическая ценность белков. М.: Медицина, 1975. - 231с.

60. Шатерников В.А., Высоцкий В.Г., Яцышина Т.А., Батурин А.К., Сафронова A.M. Пути повышения биологической ценно- . сти растительных белков. Вопросы питания, 1982, №6, с.20-28.

61. Эггум Б. Методы оценки использования белка животными.- М.: Колос, 1977. 189с.

62. Abe Makato, Arai Soiehi, Kato Hiromichi, Fujimaki Ma-aao. Thiol-protease inhibitors occurring in endosperm of corn.- Agr. and Biol. Chem., 1980, v.44, n.3, p.685-686.

63. Abita J.P., Lazdunski M. On the structural and functional role of carboxylates in chymotrypsinogen A. A comporison with chymotripsin, trypsinogen and trypsin. Biochem. Biophys. Res. Communs, 1969, v.35, p.707-712.

64. Agruwal O.P., Bahadur J. A comporison between the so-livary gland and gut protease activity with reference to pH optimum in Periplaneta americana. Hat. Acad. Sci. Lett., 1981, v.4, n.5, p.215-217.

65. Ahmad Zafeer, Salumuddin M., Siddi Majid. Purification and charactirization of three alkq^ine proteases from the gut ^ of the larva of army warm Spodoptera litura. Insect Biochem., 1980, v.10, n.6, p.667-673.

66. Applebaum S.W., Birk Y., Harpar I., Bondi A. Comparative studies on proteolytic enzymes of Tenebrio molitor. Сотр. Biochem. Physiol., 1964, v.11, p.85-103.

67. Applebaum S.W., Konijn A.M. The presence of a Triboli-um-protease inhibitor in wheat. J. Insect Physiol., 1966,v.12, n.6, p.665-669.

68. Asu H.W., Vavak D.L., Satterlee L.D., Miller G.A. A multienzyme technique for estimating protein digestibility. - Vfy- J. Pood Science, 1977, v.42, n.5, p.1269-1273.

69. Baines N.J., Baird J.В., Elmore D.T. The kinetics of hydrolysis of derivatives of arginine, homoarginine and ornithine by trypsin. J. Biochem., 1964, v.90, p.470-476.

70. Baker J.E. Properties of midgut proteases in larvae of Attagenus megatoma. Insect Biochem., 1976, v.6, n.2,p.143-148.

71. Baker J.E. Isolation and properties of digestive car-boxypeptidases from midguts of larvae of the black carpet beetle Attagenus megatoma. Insect Biochem., 1981, v.11, n.5j p.583-591.

72. Baker J.E. Localization of proteolytic enzymes in the midguts of larvae of the black carpet beetle. J. Ga Entomol., Soc., 1981, v.16, n.4, p.495-500.

73. Baker Ь.Е. Hew synthetic substrates for pepsin. J. Biol. Chem., 1951, v.193, p.809-813.

74. Barrett A.J. Introduction: the classification of proteinases. In book: Protein degradation in health and disease. Ciba Foundation symposium 75, 1980.

75. Baumgarther В., Chrispeels M.J. Partial characterisation of a protease inhibitor which inhibits the major endopep-tidase present in the cotyledons of mung beans, Plant Physiol., 1976, v.58, n.1, p.1-6.

76. Belew M., Porath J., Sundberg L. The trypsin and chy-motrypsin inhibitors in chick peas. Purification and properties of the inhibitors. Eur. J. Biochem., 1975, v.60, p.247-258.

77. Belitz H.D., Kaiser K.P., Santarius K. Trypsin and chy-motrypsin inhibitors from potatoes: isolation and some properties. Biochem. Biophys. Res. Communs, 1971, v.42, p.420-427.

78. Bergmann M. A classification of proteolytic enzymes.- Advances in Enzymol., 1942, v.2, p.49-54.

79. Bergmann M., Fruton J.S., Pollok H. The specificity of trypsin 1. J. Biol. Chem., 1939, v.127, 643-648.

80. Berridge N.J. Pure crystalline rennin. Hature, 1943, v.151, p.473-476.

81. Bhatty R.S. Trypsin inhibitor of Faba beans. 1. Preliminary studes. Can. J. Botany, 1975, v.53, p.3075-3077.

82. Birk Y., Applebaum S.W. Effect of soybean trypsin inhibitors on the development and midgut proteolytic activityof Tribolium castaneum larvae. Enzymologia, 1960, v.12, n.11, p.318-326.

83. Birk Y., Gertler A., Khalee S. Separation of a Tribo-lium-protease inhibitor from soybeans on a calcium phosphate.- Biochem. Biophys. Acta, v.67, p.326-328.

84. Birk Y. Chemistry and nutrition significance of proteinase inhibitors from plant sources. Ann. U.Y. Acad Sci., 1968, v.146, p.388-398.

85. Blou D.M., Wright C.S., Kukla D., Ruhlmann A., Steige-mann W., Huber R. A model for the association of bovine pancreatic trypsin inhibitor with chymotrypsin and trypsin. J.

86. Molec. Biol., 1972, v.69, p.137-144.

87. Bouman D.E. Fractions derived from soybeans and navy beans which retard tryptic degestion of casein. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1944, v.57, p.139-140.

88. Briegel Hans, Lea Arden 0. Relationship between protein and proteolytic activity in the midgut of mosquitoes. J. Insect Physiol., 1975, v.21, n.9, p.1597-1604.

89. Bresler S.E., Krutyakov V.M., Vlasov G.P. Catalytic activity of trypsin with an acylated "Active" serine. - Europ. J. Biochem., 1971, v.18, p.131-135.

90. Camus M.C., Laporte J.C. Edute de la teneur et de la repartation des inhibiteurs trypsiques dedikers bles durs (P. durum) et les tendres (F.vulgare) par une methode sur filinde gilatine. Ann. Techn. Agr., 1974, v.23, No.4, p.421-431.

91. Chaudhary K.D., Lemonde A. Phosphorus in the nutrition of Tribolium confusum. Canad. J. Zool., 1962, v.40, p.375-379.

92. Chen P.S. Advances in insect physiology, v.3. London-N.Y. Acad. Press., 1966, p.53.

93. Chirigos M.A., Meiss A.IT., Pisano J.J., Taylor M.W. Growth response of the confused flour beetle Tribolium confusum to six selected protein sources. J. Nutrition, 1960, v.72, p.121-130.

94. Chu H.M., Chi C.W. The isolation and crystallization of two trypsin-inhibitors of low molecular weight from mung bean. Sci. sinica, 1965, v.14, p.1441-1453.

95. Collins J.L., Sanders G.G. Changes in trypsin inhibitory activity in some soybean varieties during maturaty and -j * germination. J. Pood Science, 1976, v.41, n.1, p.168-172.

96. Dahlmann В., Jany K.D., Pfleiderer G. The midgut en-dopeptidases of the honey bee (Apis mellifira): comporison of the enzymes in different ontogenetic stages. Insect Biochem., 1978, v.8, n.3, p.203-211.

97. Davis G.R.F. Evaluation of the nutritional value of proteins of rupe, turnip rape and yellow mealworm, Tenebrio molitor. Arch, int physiol. biochim., 1974, v.82, n.1,p.141-148.

98. Djurtoft R., Foltann В., Johanaen A. On the molecular weight of prorennin and rennin. Conrpt. rend. trav. Lab. Carlaberg, v.34, p.287-291.

99. Dryden M.J., Kendrick J.G., Satterlee L.D., Shroeder L., Block R.G. Predicting protein degeatibility and quality uaingan enzyme Tetrahymena pyriformis in bioaasay. J. Food Biochem, v•1, Na1, p.35-44.

100. Dubin A. A polyvalent proteinaae inhibitor from hor-aeblood-leucocyte cytoaol. Iaolation, purification and aome molecular parametrea. Eur. J. Biochem., 1977, v.73, No. 5, p.429-435.

101. Dunn M.S., Rockland L.B. Biological value of proteina determined with Tetrahymena geleiih. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1947, v.64, p.377-379.

102. Eguchi Muaaharu, Iwamoto Akiko, Yamauchi Keiji. Interrelation of proteaaea from the midgut lumen, epithelia and peritrophic membrane of the ailkworm, Bombyx mori L. Appl. Entomol. and Zool., 1982, v.17, No.2, p.179-187.

103. Erickaon J.P., Miller E.R., Elliott P.O., Ku P.K., Ullrey D.E. Nutritional evaluation of triticale in awine atarter and grower dieta. J. Animal Science, 1979, v.48, No.3, p.547-553.

104. Erlanger B.P., Kokowaky N., Cohen W. The preparation and propertiea of two new chromogenic aubatrates of trypain. Arch, biochem. andBiophya., 1961, v.95, No.2, p.271-278.

105. Eto Toahio. Inhibitory effect of aoybean inhibitor on proteinaae of the ailkworm Bombyx mori. Huxon cancuraky dzaccu L. Sercult. Sci. Dap., 1977, v.46, No.2, p.171-172.

106. Evancho J.M., Hurt H.D., Devlin P.A., Landera R.E., Aahton D.H. Compariaon of Tetrahymena pyriformia and rat bio-aaaaya for the determination of protein quality. J. Pood Science, 1977, v.42, No.2, p.444-448.

107. FAO/WHO. Energy and Protein requirementa. World Health Organization Techn. Report No.522, and РАО Meetinga Rep. No.52. Publiah by РАО and Y/HO. Geneva, 1973.

108. Peeney R.E., Meona J.E., Bigler I.C. Inhibitation ofhuman trypsin plasmin and trombin by naturally occurring inhibitors of proteolytic enzymes. J. Biol. Chem., 1968, v.23, No.5, p.608-705.

109. Fraenkel G., Blewett M. The vitamin B-complex requirements of several insects. J. Biochem., 1943, v.37, No.8, p.686-692.

110. Fraenkel G., Blewett M. The importance of folic acid and unidentified members of the vitamin B-complex in the nutrition of certain insects. J. Biochem., 1947, v.41, No.6, p.469-475.

111. Fraenkel G., Printy G.E. The amino acid requirements of the confused beetle Tribolium confusum. Biol. Bull., 1954, v.106, No.2, p.149-157.

112. Furusawa Y., Kurosawa Y., Chuman I. Purification and properties of trypsin inhibitor from hakuhenzu bean (Dolichos lablab). Agric. Biol. Chem., 1974, v.38, No.6, p.1157-1164.

113. Gan J.C., Jeffay H. Origins and metabolism of the intracellular amino acid pools in rat liver and muscle. Bio-chim. biophys. acta, 1967, v.148, N0.4, p.448-451.

114. Gooding R.H. Digestive proteinases from blood-sucking insect. In: 13 Int. Congr. Entomol. Abstrs. - Lenin- v s grad, Nauka, 1971, p.381-382.

115. Gratecos D., Rovery M. L'hydrolyse des liasons de la leucine par diverses chymotrypsines. Biochim. biophys. acta, 1967, v.140, p.410-415.

116. GreenT.R., Ryan C.A. Wound-induced proteinase inhibi- , tor in plant leaves. A possible defense mechanism against insect. Science, 1972, v.175, p.776-777.

117. Grogan D.E., Hunt J.H. Digestive proteases of two species of wasps of the genus Vespula. Insect Biochem., 1977, v.7, No.3, p.191-196.131.

118. Halim A.H., Mitchell H.Z., Wassom C.E., Edmunds L.K.

119. Puppreasion of fungal growth by isolated trypsin inhibitors of corn grain. J. Agr. and Pood Chem., 1973, v.21, Ho.6, p.1118-1119.

120. Ham W.E., Pandstedt R.M. A proteolytic inhibiting substance in the extract from unheated soy bean meal. J. Biol. Chem., 1944, v.154, p.505-509.

121. Hankinson C.L. The preparation of crystalline rennin.- J. Dairy Sci., 1943, v.26, p.53-57.

122. Haynes R., Peeney R.E. Transformation of active-site lysine in naturally occurring trypsin inhibitors. A basis for a general mechanism for inhibition of proteolytic enzymes.- Biochemistry, 1968, v. 7, p.2879-2885.

123. Heimburger N., Haupt H., Schwick H.G. Proteinase inhibitors of human plasms. In: Proceedings of the International Research Conference on Proteinase Inhibitors, p.1-21, 1971.

124. Herriott R.M. Pepsinogen and pepsin. J. Gen. Physiol., 1962, v.45, Suppl. 1, p.57-62.

125. Hochstrasser K., Werle E. Uber pflanzliche Protease-inhibitoren 3. Reindar-stellung der Trypsininhibitorenaus Keimen von Weizen- und Roggensamen, Lokalisierung der aktiven Zentren. Hoppe-Seyler's, Z. Physiol. Chem., 1969, v.350,p.249-254.

126. Hosbach H.A., Egg A.H., Kubli E, Einfluss des Tutter-rusammensetrung Verdaungsenrym Aktivit&ten bei Drosophila me-lanoguster-larven. Rev. suisse zool., 1972, v.79, No.3,p.1049-1060.

127. Houseman J. a thiol-activated degestive proteinase from adults of Rhodnius prolixus. Can. J. Zool., 1978, v.56, Ho.5, p.1140-1143.

128. Huot L., Bernard R., Lemonde A. Aspects quantitatifs des besoins en mineraux de Tribolium confusum Duval. 2. Pour-centage optimum des cations Mg, Ca, Ha et K. Can. J. Zool., 1958, v.36, p.7-13.

129. Hwang D.L., Vang W-K., Pourd D.E., Davis L.K. Rapidrelease of protease inhibitors from soybeans. Immunochemical quantitation and parallels with lectins. Plant Physiol, 1978, v.61, No. 1, p.30-34.

130. Inagami Т., Sturtevant J.M. Nonspecific catalyses by ✓ chymotrypsin and trypsin. J. Biol. Chem., 1960, v.235,p.1019-1025.

131. Inouje K., Pruton J.S. Studies on the specificity of pepsin. Biochemistry, 1967, v.6, p.1765-1770.

132. Jan-Wilson Anna L., Wilson Karl a. Nature of proteinase inhibitors released from soybeans during inhibition and germination. Phytоchemistry, 1982, v.21, No.7, p.1547-1551.

133. Jany K.D., Hang H., Ishay J. Trypsin-like endopepti-dases from the midguts of the larvae from the hornets of Ves-pa orientalis and Vespa crabro. Insect Biochem., 1978, v.8, No.4, p.221-230.

134. Kakade M.L. Biochemical basis for the differences in plant protein utilization. J. Pood Chem., 1974, v.22, P.550-555.

135. Kang S.H., Puchs M.S. The identification of two protease inhibitors in Drosophila melanogaster. Сотр. Biochem. and Physiol., 1973, v.46, No.2, p.367-374.

136. Kassell B. Naturally occurring inhibitors of proteolytic enzymes. Methods Enzymol., 1970, v.19, p.839-906.

137. Kastner H.W., Kaul A.K., Niemann E.G. Use of Tetra-hymena pyriformis to evaluate the relative nutritive value (RNV) of some crop cultivars and process cereals. Qual. Plant., 1976, v.25, No.3-4, p.361-373.

138. Katsoris P.P., Marmaras V.J., Christodoulou C. Peptidases and aminopeptidases in the fruit-fly ceratitis capi-tata tissue destribution substrate specificity and development. Сотр. Biochem. and Physiol., 1981, B69, No.1, p.55-59.

139. Katunuma N., Kominami E., Banno Y., Kito K., Aoki Y., Urota G. Concept on mechanism and regulation of intracellular enzyme degradation in mammalian tissues. Adv. Enzyme Regul., Л 1976, v.14, p.325-345.

140. Keil В., Dlouha V., Holeysovsky V., Sorm P. Hypothesis of threedimensional arrangement of polypeptide chain in trypsin., Collection Czechosl. Chem. Communs, 1968, v.33,p.2307-2311.

141. Kirsi M., Mikola J. Occurrence of proteolytic inhibitors in various tissues of barley. Planta, 1971, v.96, p.281-291.

142. Kitagawa K., Izumiya N. Action of trypsin and papain on derivatives of (f -amino-^ guanidinobutyric acid homo-arginine. - J. Biochem., 1959, v.46, p.1159-1165.

143. Koide T.,.Ikenaka T. Studies on soybean trypsin inhibitors. 3. Amino-acid sequece of the carboxyl-terminal region and the complete amino-acid sequence of soybean trypsin inhibitor (Kunitz). Eur. J. Biochem., 1973, v.32, p.417-431.

144. Krogdake A., Holm H. Inhibition of human and rat pancreatic proteinases by crude and purified soybean proteinase inhibitors. J. Nutrition, 1979, v.109, p.551-558.

145. Kunitz M. Crystalline soybean trypsin inhibitor, 2. General properties. J. Gen. Physiol., 1947, v.30, р.291-ЗЮ.

146. Kunz P.A. Resolution and properties of the proteinases in the larva of the mosquito, 'Aedes aegypti. Insect л Biochem., 1978, v.8, No.1, p.43-51.

147. Lee D., Ryle A.P. Pepsin D. Aminor component of commercial pepsin preparations. J. Biochem., 1967, v.104,p.742-746.

148. Lenney J.P. Three yeast proteins which inhibit three yeast proteases. Fed. Proc., 1973, v.32, p.659-663.

149. Levinsky H.J., Applebaum S.W. Isolation and characterization of a new trypsih-like enzyme from Tenebrio molitor larvae. Inter. J. Peptide and Protein Res., 1977, v.10, No.3, p.252-264.

150. Liener L.E. Protease inhibitors and other toxic factors in seeds. Plant Proteins, London, 1978, v.26, p.117-140.

151. Lipke H., Fraenkel G. Effect of Soybean Inhibitors on Growth of Tribolium confusum. J. Agr. and Pood Chem., 1954, v.2, N0.8, p.410-414.

152. Loachiavo S.R., Mc Ginnis A.I., Metcalfe D.R. Nutritive value of barley varieties assesed with the confused flour beetle. Nature, 1969, v.224, No.5216, p.288-289.

153. Loschiavo S.R. An Insect Bioassay to Evaluate Peed Barley of Different Lysine Content. J. Sci. Pood Agric., 1980, v.31, No.4, P.351-354.

154. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Parr A.L., Randall R.J. Protein measurement with.Folin reagent. J. Biol. Chem., 1951, v.193, No.1, p.265-275.

155. Madar Z., Gertler A., Birk Y. The fate of the Bowman-Birk trypsin inhibitor from soybeans in the digestive tractof chicks. Сотр. Biochem. Physiol., 1979, 62A, p.1057-1062.

156. Matern Н», Betz H., Holzer H. Compartmentation of inhibitors of proteinases A and В and carboxypeptidase Y in yeast. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1974, v.60, p.1051-1057.

157. Mauron J. The analysis of food proteins, amino acid composition and nutritive value.-In: Proteins in human nutrition. Academic Press, New York and London, 1973, p. 139-151.

158. Mc Naughton G.L. Color trypsin inhibitor and urease activity as it effects growth of broilers. Zootech. int., 1982, v.8, p.40-42.

159. Metcalfe D.R., Loschiavo S.R., Mc Ginnis A.G. Evaluation of cereal cultivars for feeding value with the confused flour beetle, Tribolium confusum. Can. Entomol., 1972, v.104, No.9, p.1427-1431.

160. Mikola J., Suolinna E-M. Purification and properties of an inhibitor of microbiol alkaline proteinases from barley. Arch. Biochem. Biophys., 1971, v.144, No.2, p.566-575.

161. Mikola J., Kirsi M. Differences between endospermal and embryonal trypsin inhibitors in barley, wheat and rye.- Acta chem. Scand., 1972, v.26, p.787-795.

162. Mitchell H.H. A method of determination of the biological value of protein. J. Biol. Chem., 1924, v.58,p.873-879.

163. Mitchell H.H., Block R.J. Some relationships beet-ween the amino acid contents of proteins and their nutritive values for the rat. J. Biol. Chem., 1946, v.163, p.599-606.

164. Mohyuddin M., Kaul A.K., Sharma T.R., Niemann E.G. Use of two fungal strains as test organisms for the evaluation of relative value in cereals and legumes. Qual. Plant, 1976, v.25, No.3-4, p.317-329.

165. Neil G.L., Niemann C., Hein G.E. Structural specifi- v city dL- chymotrypsin: polypeptide-subsctrates. Nature,1966, v.210, p.903-908.

166. Newman C.W., Eslick R.F., Rasmuson R.C. Effect of barley variety on protein quality and nutritional value for rats. J. Anim. Sci., 1974, v.38, No.1, p.71-75.

167. Niemann E.G., Christoffers D., Georgi В., Kaestner H., Mohyuddin M., Sharma T.R. Screening methods for protein, amino acids and nutritive value in crops and processed food.- In: Seed Protein Improv. Nucl. Techn., Vienna, 1978, p.331-345.

168. NRC. Nutrient Requirements of Laboratory Animals. 2-nd revised edition. National Requirements Academy of Sciences National Research Council, Washington, D.C., 1972.

169. Ofelt C.W., Swith A.K., Mills J.M. Proteases of the soybean. Cereal. Chem., 1955, v.32, p.53-63.

170. Oser B.L. Method for integrateins essential amino136.acid content in the nutritional evaluation of proteins. J. Amer. Diet. Assoc., 1951, v.27, p.396-402.

171. Plapp B.V., Raftery M.A., Cole R.D. The trypsic digestion of S-aminoethylated ribonuclease. J. Biol. Chem., 1967, v.242, p.265-270.

172. Polanowski A. Trypsin inhibitor from rye seeds. -- Acta biochim. polon., 1967, v.14, p.389-395.

173. Postel W., Gorg A., Westermeier R. Isoelectrishe Fo-kussurung von samenproteinen-enzymen and- inhibitoren aus verchiedenem Sojasorten. Lebensmitt wiss. Technol., 1978, v.11, Ho.4, p.202-205.

174. Protein Methods for Cereal Breeders as Related to Human Nutritional Requirements. PAG Bulletin, 1975, v.2, p.22-48.

175. Rackis J.J. Significance of soya trypsin inhibitors in nutrition. J. Amer. Oil. Chem. Soc., 1981, v.58, No.3, p.495-501.

176. Rice R.H., Etzler M.E. Chemical modification and hybridisation of wheat germ agglutinins. Biochemistry, 1975, v.14, No.18, p.4093-4100.

177. Richardson M. Protein inhibitors of enzymes. Food chemistry, 1981, v.6, No.3, p.235-253.

178. Richmond V., Tong J., Wolf S., Trucco R.E., Caputto R. Chromatographic isolation of gastricsin, the proteolytic en- о zyme from gastric juice with pH optimum 3,2. Biochim. Bio-phys. acta, 1958, v.29, p.453-458.

179. Rjadchikov V.G. Protein quality and nutritional value of high-lysine maize. In: High-Quality Protein Maize.-Dowden, Hutchinson and Ross. Inc., 1975, p.475-482.

180. Ryan C.A. Wound-induced accumulation of proteinase inhibitor 1.in tomato leaves. Bayer 5. Proteinase Inhibit., 1974, p.667-673.

181. Ryle A.P., Hamilton M.P. Pepsinogen С and pepsin C. Further purification and amino acid composition. J. Biochem, 1966, v.101, p.176-180.

182. Sharma T.R., Kaul А.К», Niemann E.G. Evaluation of nutritional quality in plant cultivars using confused flour beetle, Tribolium confusum. Qual. Plant., 1977, v.27, Ho.3-4, p.303-321.

183. Shariff G., Vohra P., Qualset C.O. Further studies on the nutritional evaluation of wheat,triticale and rice grains using the red flour beetle. Cereal Chem., 1981, v.58, Ho.2, p.86-89.

184. Shields G.S., Hill R.L., Smith E.b. Preparation and properties of guanidinated mercuripapain. J. Biol. Chem., 1959, v.234, p.1747-1753.

185. Sinha M. Trypsin activity in the midgut of Sareopha-ga ruficornis and Musca domestica. Experientia, 1976, v.32, No.10, p.1289-1290.

186. Somadder K., Shrivastawa M. Digestive enzymes in the gut and salivary gland of the larvae of Chilo auricilius.- Experientia, 1980, v.36, No.2, p.218-223.

187. Splitter J.L.J., Shipe W.F. Enzymatic hydrolysis and vole bioassay for estimation of the nutritive quality of maize. J. Pood Sci., 1976, v.41, No.6, p.1387-1391.

188. Steffens R., Kassell B. Effect of trypsin inhibitors on growth and metamorphosis of corn borer larvae Ostrinia nu-bilalis. J. Agr. and Pood Chem., 1978, v.26, No.1, p.170-174.

189. Su Helen C.P., Speirs R.D., Mahany P.G. Trypsin inhibitors: effects on the rice weevil the laboratory. J. Ga Entomol. Soc., 1974, v.9, No.2, p.86-87.

190. Tang J., Mills J., Chiang L., Chiang L. de. Comparative studies on the structure and specificity of human gast-ricsin, pepsin and zymogen. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1967,v.140, p.68-71.

191. Taylor M.W., Medici I.L. Amino Acid Requirements of Grain Beetles. J. Nutrition, 1966, v.88, p.176-180.

192. Thomas K. Uber die biologische Wertigkeit der Stick-stoffsubstanzen in verschiedenen Nahrungsmitteln. Arch. Anat. Physiol. Abt., 1909, p.219-225.

193. Tikoos S.J.P., Abral Y.P., Sachor R.C. Studies on polyphenol oxidase in wheat grains. Cereal Chem., 1973, v.50, Ho.4, p.520-523.

194. Vohra P., Shariff G., Robinson D.W., Qualset C.O., Gall G.A. Nutritional evaluation of triticale, wheat and rye grain using red flour beetle Tribolium castaneum larvae and chickens. Nutr. Repts. Inter., 1978, v.18, No.3, p.289-300.

195. Ward Colin W. Aminopeptidases in webbing clothes moth larvae properties and specificities of the enzymes of intermediate electrophoretic mobility. Biochim. et biophys. acta, 1975, v.410, No.2, p.361-369.

196. Ward Colin W. Properties of the major carboxypepti-dase in the larvae of the webbing clothes moth Tineola bis-selliella. Biochim. et biophys. acta, 1976, v.429, No.2, p.564-572.

197. Weiel J., Hapner K.D. Barley proteinase inhibitors: a possible role in grosshopper control. Chytoehemistry, 1976, v.15, No.12, p.1885-1887.

198. Westhuiren M.C., Hewitt P.H., Toit P.J. Aminopepti-dase from the harvester termite Trinervitermes trinervoides: distribution, purification, physical and chemical properties. Insect Biochem., 1981, v.11, No.3, p.311-321.