Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АВТОТРОФИИ ПРИ ХЕМОСИНТЕЗЕ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АВТОТРОФИИ ПРИ ХЕМОСИНТЕЗЕ"



АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ЧШСТИТП МКРОБКСЯОПМ

—т

н*прлмх ру«""1»0"

РОМАНОВА Алла Карловна

биохимически*; кшниэш АВГОТРОМИ

при хемосинтезе .

( МмкроОиомгия - 03.00.07 )

(Диссертация написана на русском явика)

Авторвфврв» днвсвртвцш на соискание ученой степей« 1 доктора биологических наук

Москва, 1975 с*

АКАДЕМИЯ НА/К СССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

РОМАНОВА Алла Карловна

БИОШИЧИЖИК МЕХАНИЗМЫ АВТОЛ3 ОШ ПРИ ХЕМОСИНТЕЗЕ ( Микробиология - 03.00.07)

(Диссертация написана аа русском яэике)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА,1975 г.

> 4.1-И ■ '•*

1 <>(.,1, ¡к;;1" ' '

Экспериментальная работа выполнена в лабораториях фотобиохииии (завлабораторией - член-корр. АН СССР, профессор Д.Д.Красновский) и автотрофной ассимиляции углекислоты (завлабораторией канд.хин.наук Н.Г.До-ман) ItHCTUiyia бмохицш и i.. А.Ii.Faxe АН СССР и в от- ■ деле физиологии хемосинтезирующих микроорганизмов Института микробиологии Ali СССР (зав. отделом - до кг. биол,наук Г,А.Заварзин),

Научный консультант -

доктор биологических наук Г.А.Эаварзан

Официальные оппоненты: член-корр. АН СССР,профессор А.А.Ничипорович доктор биологических наук«профессор E.H.Кондратьева доктор биологических наук Т.Й.Каравайко

Диссертация направлена на отзыв в Институт: фотосинтеза АН СССР.

Автореферат разослан" fftTrli 1975г. Защита состоится в /^ч. ^¿У «ив. Г975г.

на заседании Ученого Совета Института микрошологйи АН СССР по адресу: П?312.Иосква,В-312, Профсоюзная ул., д.7, корп.2.

С диссертацией iiosho ознакомиться в библиотеке Института микробиологии All СССР

Ученый секретарь ИНИЯ АН СССР л л ,.

- Л, (ОС/кU

кандидат биологических наук w

(Л.К.Осницкая)

ВВЕДЕНИЕ

Физиологическое понятие об автотрофии как способности оргаинэыоз развиваться с использованием углекислоты в качестве единственного источника углерода возникло в промок веке.Биохимическое содержание этого термина било раскрыто лишь в середине нынешнего столетия благодаря примененив методов радиоактивных индикаторовхроматограф финна бумаге и успехам энзанологни.Результатом интенсивных исследований.проводившихся больший коллективом авторе в, явилось создание фундаментальной концепции начальных, стадии анаболизма фототрофных эвкариот,подучившей название восстановительного пентозофосфатного цикла ассимиляции углерода (ВЛФЦ) ,илн цикла Кальвина-,Б эс се ма { Са1у1п» ВаваЬат,19бг). П

Химизм и в особенности энэнмология биологической ассимиляции углекислоты в настоящее время продолжают привлекать пристальное внимание исследователей всего мира. Это вызвано не только теоретическим.но и практический ' значением проблемы,тесно связанной с разрешением таких насущных вопросов как пути повышения урожайности сельскохозяйственных культур«получение пищевого и кормового балка из дешевых и достушшх*>ародуктов и очистка атмосферы от загрязнения углекислый газом«

Дальнейшие исследования фотосинтеза эвкариот (зеленых водорослей и высших растений) позволили обнаружить ряд принципиально новых фактов»приведшие к описание фотосинтетического пути чотырехуглероднъос кислот«свойственного тропическим злакам,^линолатного пути углерода и сукну* лентиого типа фотосинтеза*? некоторых прокариотных фото-трофов обнаружены своеобразные черты пути ассимиляции углекислоты,получившего наименование восстановительного цикла карбоновых кислот Арнона{^<шэ^ ли, 1966).

Хемолитоавтотрофы представляет собой особую физиологическую группу микроорганизмов,способных к жиэнедеятель" восгкза счет энергии окисления неорганических субстратов с использованием С02 б качестве единственного источника углерода.Результаты исследования физиологии к биохимик хекоавтот^офов,имеющих давние традиции в напей стране* суммированы в ряде монографий (Вивоградский,1952; Лис« 1955;Ру0ан,19б1; Соколова.КараваЯно,1964;3аварэин,1972).

Представленная диссертация обобщает натериал,накопившийся в результате изучения автотрофим,включая результаты работ автора по биохимии хемоавтотрофни,в сравнительно-биохимическом аспекте.

основной задачей экспериментальной работы автора с сотрудниками являлось установление путей включения углерода углекислоты в продукты хемосинтеза на самых ран-вих его стадиях с цель» создания обобщенной концепции анаболизма при хемосинтезе в сравнении в фотисивтезом с одной стороны и метилотрофией с другой.

D работе приводятся результат более чем 15-талет-вкх детальных исследований физиологии и биохимии ассимиляции углекислоты у вновь выделенных и пало изученных представителей хемоавтотрофов.

При постановке экспериментов исходили из основных предпосылок,что поведение микроорганизмов в пробе отражает течение процессов в культуре,« что свойства ферментов in vitro в первом приближении близки к их свойствам в живой клетке.

В работе использованы следующие методические подходы:

I.Определение скорости ассимиляции углекислоты,меченной радиоуглеродом,целыми клетками хеиоавтотрофов и вы-

- А

явление факторов» влияхадх ва этот процесс.

П. Кинетическое исследование включения углерода С^О^ в продукты хемосинтеза о применение» метода радиохроиато-гра$ии на бумаге;

О, Определение активности и факторов регуляции действия важнейших ферментов, участвующих в ассимиляции С02 клетками хемоавтотрофов,с целью установления связи между физиологией ассимиляции и биохимией элементарных реакций начальных стадий анаболизма.

Честь I. АВТОТРОФИЯ КАК ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ПОНЯТИЕ И ЕЁ ШОШШЧЕСКАЯ СУЩНОСТЬ ПРИ ФОТОСИНТЕЗЕ.

В интересах единого понимания и ясности < терминологии основному содержанию раздела предпослана классификация типов питания живых существ (глава I), предложенная на <|ин-поаиуме в Колд Спринг Харборе в 1946 г. Современный термин "хемолитоавтотрофия", соответствует первоначальному смыслу понятия "хемосинтез", В представляемой работа используются более короткие термины "хвноевтотрофия" и аналогично "фото-автотрофня" во всех случаях, когда источником энергетических эквивалентов (восстановителя и АТФ) является факторы неорганической природы (минеральные субстраты окисления или свет)о

Содержание классических работ по расшифровке пути ассимиляции углерода СО^ при фотоавтотрофии, проведенных Кальвином, Венсоном и их сотрудниками на примере эвкариотных ор-ганиэмов-эеленых водорослей и высших растеннй-приводится во И главе диссертации вместе с изложением результатов дальнейшего изучения путей углерода при фотосинтезе« полученных в последующие годы. Рассмотрение литературных данных показывает, что усвоение СО^ при фототрофии эвкариот начинается с реакции присоединен!1 к высокоэргическому субстрату - ри-булоэо - 1,5 - дйфосфату (РуДФ) и, образования 2-кврбокси-

»

Э-кето-рибитол-1,5-дифосфзта, который, по крайней мере in Titro, разлагается на две молекулы ФГК. После восстановления ФПС до уровня углеводов происходит взаимопревращения фосфорилированных Сахаров, приводящие к регенерации РуДФ, завершающей последовательность реакций ВПФЦ.

Анализ литературных данных (глава П) показывает, что все фотоавтотрофные организм,как способные осуществлять фотолиз воды, так и неспособные, одноклеточные и многоклеточные, эвкариоты и прокариоты,ассимилируют углекислоту с участием ВПФЦ, назначение которого состоит не только в регенерации акцептора С02 (РуДО)> но и в биосинтезе большого числа метаболитов.

Путь четырехуглеродных кислот при фотосинтезе (Hatch, slack, 1966; Карпилов, 1972) представляет собой высокоепе-цяализированный механизм акцептирования С02 на трехуглерод-ном акцепторе и доставки его в виде стабильных соединений из вэрухвъ'-? тканей листа во внутренние, где происходит их декарбсксилировакие к фиксация С02 на РуДФ• Циклический механизм регенерации трехуглеродного акцептора самостоятельного значения не имеет, неразрывно связан с ВПФЦ и свойственен только многоклеточним фототрофэм.

Усиленное включение С02 в кислоты цикла Кребса в ночные часы у суккулентов также не представляет собой самостоятельного механизиа углеродного питания, являясь своего рода "метаболическим карданом" для запасания С02, фиксированного на трехуглеродном акцепторе ночью^у jgffi^ffiy ил яци и по основному механизму ВПФЦ днем. РаэделеШтеИфикбации С02 и метаболизации его с участием ВПФЦ имеет большой смысл у растений с малым отношением площади поверхности к массе листьев и затрудненной диффузией 002 ( ь;иьигп et al.,1968 ).

Гликолатный путь фотосинтеза представляет собой метаболическую ветвь фотосинтезе, имеющую исходным пунктом РуДФ и ведущую к биосинтезу двухуглеродных фрагментов. Процесс активируется при высоких концентрациях кислорода, низком

содержании С02 и яркой оовещенин.(то1Ъег1;,19в31Апйге»а ег а1., 1975).Большое значониэ с точки зрения выяснения закономерностей эволюции путей углерода имеют исследования фототро-фии бактерий, обнаружившие действие специфических ферментов карбоксилировашш, требующих ферредоксина. Однако, воз-мохность полного перехода на восстановительный цикл усвоения СО^ через карбоновые кислоты показана только у одного представителя зеленых фототрофных бактерий ( Еуагш ег а!.. 1966). У всех остальных исследованных фототрофных бактерий ВПФЦ является основным механизмом ассимиляции СО^.

Сведения о путях углерода при хеиоэвтотрофии в начале напей работы были фрагментарны, ограничены лишь отдельными представителями, а энзимологические исследования носили качественный характер. В последующих главах работы приводятся результаты экспериментальной работы автора с коллегами, имеющие целью восполнить этот пробел. '

Часть П. ФИЗИОЛОГИЯ И ЕИОХШИЯ АССИМИЛЯЦИИ С02 ЦЕЛЫМИ МЕТКАМИ ХЕМЭАВТОТРОФОВ

Отчетливая анаболическая направленность обмена соединений углерода у облигатных хекоавтотрофов и легкость перехода от автотрофии к гетеротрофии у факультативных хе~ моавтот^офов, наряду с отсутствием саащализацж* метаболизма связанной с многоклеточностью или с высокой дифференциацией клеток, имеющих место у эвкариот, делают хемоавтотрофцые микроорганизмы чрезвычайно удобными моделями для изучения анаболизма и путей его регуляции.

В работе использованы главным образом хемоавтотрофцые микроорганизмы из коллекции Института микробиология АН СССР (глава Ш). Основными объектами исследования являлась оСлигатный автотроф тионовая бактерия ТЫоЬаеШш 1Ь1оо*1йапе 59Н , выделенная Завэрэиным и Жилиной (1964) и факультативный автотроф водородная бактерия Нуйгодвшмю-

nee eutropha z-i, выделенная Савельевой и Хилиной (1968) Кроме этих двух микроорганизмов в целях оравнения Шли использованы и другие ктаммы водородных и тмоновых бактерий,, Нитрификатор Hitroeотопае europaea, мотнлотроф Kethjlo-einu^trichoeporium z-1442,фотоевтотрофные микроорганизмы и высвие рслепия.

Изложение экспериментальных данных об ассимиляции COg предпослана глава 17, имеющая справочный характер, в которой описаны основные физико-химические свойства углекислоты и показано, что процесс гидратации СО^ связан с глубокими изменениями связи между углеродом и кислородными атомами и происходит в небиологических условиях достаточно медленно.

Скорость ассимиляции 002 является критерием сравнения при оценке активности отдельных ферментов анаболизма, определяемой in v^tro и определении их физиологической роли. В первую очередь это относится к ферментам карбокси-лирования.

Задачей экспериментальной работы, результаты которой излагаются в У главе, являлось доказательство регулируемости процесса ассимиляции COg на уровне неповрежденной клетки. , •

Показано, что скорость включения С^ клетками T.thio-oxtdane 5Ш зависит от исходной концентрации бикарбоната, причем половина максимальной скорости достигается при его концентрации lull, что на порядок иихе значения аналогичного параметра, известного по литературным данным для H.«utropha z-i .Это говорит о различии свойств систем екцвлтирования углекислоты у этих двух микроорганизмов.

Скорость ассимиляции углекислоты хекоавтотрофкыми бактериями в стационарной культуре в сильной степени зависит от'физиологического состояния клеток. На примерах водородной бактерии Н. eutropha z-X и тионовой бактерии Т.

I1

I 2

3 к ?

.1«

I *

I

I

{О

20

Рис.1. Изменение важнейших показателей развития стационарных культур хемоавтотрофов.

А.-Н.ей1горЬа 2-1 Е.-Т. (Моох1<1апв 5Ш.

1 в

ЗДХоохЫапв 568 показано,что максимальная скорость усвоении С0г в расчете на «г белка биомассы в культуре наблюдается в период от конца экспоненциальной до середины пропорциональной фазы развития культур (рис.1).

Удельная скорость ассимиляции углекислоты в пробе, выделенной лэ культуры,как правило,близка к 0,1 мкмоль субстрата,ассимилированного за I мин в расчете на мг белка клеток. Однако,потенциальные возможности систем кар-боксилирования живых клеток хемоавтотрофов значительно выше.__При нарушении стационарности процесса ассимиляции

углекислоты помещением тиоио-вых бактерий в атмосферу с высоким (7-1Ссодержанием СО^ скорость фиксации радиоуглерода в кратковременных опытах может быть увеличена на порядок величины.

физиологическое своеобра" зие Т. ^ЫоозАйапа 59В .заключающееся в способности разви-1 ваться при значительной кислот ' ности С£еды, находит свое отражение в конструктивномобмене.

Максимальная скорость ас** симиляции углекислоты у этого микроорганизма наблюдается при рН 3,0 (рис.2). В этих условиях . бикарбонат практически отсутствует.и углекислота находится в виде негидратированной двуокиси углерода.

Рис.2. Зависимость ско-рН рости ассимиляции С1*1 углекис-

лоты от концентрации водородных ионов у т.Ш1оох1йапз 58П. 10

Л/\

Анализ концентрационных кривых зависимости скорости ассимиляции 00^ от рН среды показывает существование двух дискретных максимумов при рЫ 3,0 и при рН 6,0. Ва снижение общей скорости ассимиляции клетками т.гъюожЫапв 5В": (рис2) главным образок ответственна система, активная при повышенной концентрации водородных ионов. Это послужило основой для предположения, что в клетках т.гысюх1<1апв 5ав существует ферментативный механизм акотирования С02 и концентрирования его в клетках, действующий в специфических условиях повышенной кислотности. Можно было ожидать существования особого Фонда углекислоты в клетках, соответствующего продукту действия этого фермента, неустойчивого в стан* дартных условиях фиксации клеток и хроматографирования образующихся продуктов ассимиляции С^О^.

В качестве модельного организш для изучения механизма первичного акцептирования С02 был избран т.гМоох1б4ав 5Ш.

Первой стадией ассимиляции СО^ является перенос черва клеточную мембрану и образование внутриклеточного обменного фонда субстра^та карбоксилирования. Существование особого фонда углеродсодеряащего субстрата при хемоавто-трофин тлмоох1|1апв 5ев нами экспериментально доказано с применением метода кратковременного "глотка" С^О^ к последующего выдерживания микроорганизмов в обычной атмосфере. Разница между радиоактивность» опытных образцов и контрольных, зафиксированных сразу после введения С*^,отражает размеры обменного фонда лабильного продукта.

Наибольшая скорость включения лабильный про-

дукт у т.гм.оох1<1ап& 58н, наблюдаемая при рН 3,0 достигает 0,14 мкмоль в мин. на мг белка и сопоставима со средней величиной интенсивности ассимиляции С-^02 клетками ТЛМооэсЫапз 58В в стабильные продукты.

Рассмотрение литературных данных и результаты собственных экспериментов показывают, что ферментом, ответет-

|>

венным за первичное связывание СО2 клетками т.^юохЫапа 58й , является карбоангидраэа {карбонат-гидро~лиазз,1№ 4,2.1.1). Удельная активность фермента на всем протяжении развития культуры превышает наблюдаемую скорость ассимиляция углекислоты (СО^Хрис.В). Дэльнейиее доказательство участия карбознгидразы в ассимиляции 002 п пиь1аш?лаки18 фаи заключается 5 корреляции иигиСированйй?'фе|мевтатавн8-го гидрэтирования в экстрактах из клеток Т^Моох1<1апе 5ав (рис.4) с торможением ассимиляции 0С2 целыми клетками. На ассимиляцию с'** бикарбоната клетками т.4Моох1<1апв 5ВК сульфаниламид не действует, что говорит о различии клеточных механизмов усвоения углекислоты, находящейся в гидра-тированной и негидратированной форшх.

Таким образом, приспособление микроорганизма к разным условиям углеродного литания происходит уже на уровне переноса субстрата через мембрану клетки.

Совокупность фактических данных позволяет предполагать, что лабильные продукты хвмоавтотрофной ассимиляции С1*^ представлены в клетке главным образом свободный ионом бикарбоната, а также соединениями карбовсилирующих ферментов с С02 (НС03~) типа ферыен'йубстрат и в незначительной степени лабильными продуктами присоединения С02 типа овсалозцетата.

Цель дальнейших исследований заключалась в установлении универсальности механизма ВПФЦ среди представителей разных групп хемоавтотрофных бактерий. Для этого с применением С О2 (НС^Од-) было проведено обследование характера и кинетики появления меченых продуктов кратковременного хнмосивтеэв у представителей разных групп водородных бактерий, из которых наиболее подробно исследована н.е^го-рЬа а-1# тиояовой бактерии Т^МоохШапе 5Ш, нитрифи-Катора М.еигораеа.

Кинетическое доказательство действия ВПФЦ у т.1;111о- ■

0 3 к 6 & Ю Ш М 4$

часы

р^ис.д. Изменение активности карбоангидрааы (-1) в сравнении с интенсивностью ассимиляции углекислоты (2) при культивировании Т.гЫоохЫапв 58Н.

Рис.4. ИнгиСирование кэрбоангидразы сульфаниламидом в экстрактах из клеток т. тоо*1-

йапв 58В.

ох1йапа 5811 по луче но как методом кратковременного "глотке" с последующим выдерживанием бактерий на воздухе, так и методом непрерывного введения С^О^ в течение увеличивающихся промежутков времени. Для всех остальных микроорганизмов был использован только второй подход. Во всех случаях качественный состав ранних продуктов хемосинтеза соответствует ожидаемому при действии ВПФЦ: после самых коротких экспозиций в большая часть радиоактивности содержится в фосфорилированных соединениях ВПФЦ. Кинетика включения С^ говорит о первичности образования фосфорных эфиров по сравнению с прочими продуктами, в честности, аспартатом, глутвматом, сериноы (рис.5), кислотами цикла Кребса и др.

Рис.5; Изменение радиоактивности продуктов 8 сек.хемосинтеза Т.ъЫо-теййапа яда в присутствии Сч32 и последующего выдерживания кле-1 ток на обычном воздухе. рН 3,25; I г суммарная радиоактивность фосфорных зфиров и глицерино-' вой кислоты, 2 - радиоактивность аспартэта, , Э - радиоактивность глутамата.

Эти результаты согласуются с большим количеством литературных данных, накопившихся к настоящему времени.

Дальнейшей задачей являлось установить, как отракантон на начальных стадиях ънаболизиа физиологическое состояние микроорганизма и изменение факторов внешней среды.

и

Полученные результаты показывают» что при общей качественно« сходстве начальных путей ассимиляции С02 наблюдаются определенные количественные различия в составе продуктов не только у разных представителе-ГС хемоавтотрофов (табл.2 ИЗ)» но и у одного и того же организма под влиянием меняющихся внешиих условий.'

Различия в составе меченых продуктов у Т.гь1оох14впв 5ея и н.еи*торш> заключаются в способности

тионовой бактерии образовывать глицериновую кислоту путем дефосфорипированкя ФГК и накапливать аспарагияовую кислоту, тогда как в клетках водородной бактерии гяицерат в значительных количествах не накапливается, а из дккарбоно-вых аминокислот накапливается в большей степени глутамат.

Радиоактивные Продолжительность'экспозиции

Таблица 2

Радиоактивность продуктов хемосинтеза <3апа 58н, образующихся при оптимальном рН, как функция продолжительности экспозиции в присутствии С^С>2 (в % от общей радиоактивности .

растворимых веществ)

еоедин шшя

в сек, и включение С £>2

.5 15 80

Таблица 3

Радиоактивность продуктов хемосинтеза н.еШгорЬа 2-1 как функция продолжительности акспояицин г присутствии (ь % от общей радиоактивности растворимых веществ)

Радиоактивные Продолжительность экспозиции

соединения в сек, и включение С1ЧОг

5 15 30 60

Фосфорные эфири

Сахаров и ФПС 83,8 85,8 . 80,1 69,5

Серин 5,7 1,5 1.7 2.8

« -Алании следи следы 1.5 1.7

Аопарагииовая кислота 4,4 4,2 3,0 2,0

Глутаминовея кислота 0,0 0,0 1.0 8,6

Лимонная кислота следы следы 1.6 8,6

Фумаровая, яблочная и

янтарная кислоты 0,0 следы 0,3 1.0

Прочие соединения 6,1 8,5 10,8 10,6

Эти данные говорят о принципиальной общности пути фиксации радиоуглерода С02 у обоих видов бактерий, с одной стороны, и о действии разных механизмов регуляции отдельных реакций анаболизма с другой.

Сопоставление полученных нами результатов^ литератур^ ными данными позволило сделать вывод, что состав продуктов начальной стадии анаболизма при хемоавтотрофни отличается от состава продуктов у евкариотных фототрофов повыщен-ным относительным содержанием радиоуглерода в дикарбоновых аминокислотах и отсутствием сахарозы.

Количественное соотношение продуктов автотрофной ас-

1в

скмиляции у одного и того же организма подвержено изменениях под влиянием внешних и внутренних факторов.

Таблица 4.

Влияние рН среды на включение С^^в продукт 5 сек. хемосинтеза т. 1Ыоох1<1ап8 58Н.

от общей радиоактивности растворимых веществ)

Радиоактивные рН среда и распределение С14

соединения 2,2 3.1 з.э 5,3 6,2 6.7 ,

Фосфорные эфиры 39,5 67,2 53,8 59,4 35,2 12.5 •

Глицериновая кислота 27,5 И,Э 21,0 20,0 33,9 63,1 !

Серия 5,5 10,4 9,6 8,2 16,8 12,2 1

Аспарагиновая кислота 10,4 4,8 7,5 7,8 ?.0 И, 6

Неидевтифици-рованиые соединения . 17,1 6,а 8,1 4,6 7,1 0,6

Из данных табл.4 видно, что при крайних верхних и нижних значениях рН усиливается дефосфорилированив ФПС у тль1оох1й&па 5№. До мере уменьшения концентрации водородных ионов усиливается относительное значение процессов аминирования, что выражается в увеличении содержания радиоуглерода в аминокислотах.

Расчет абсолютного количества С^, включенного в отдельные продукты, показывает, что при неблагоприятных значениях рН снижается абсолютное содержание С*^ в метаболитах ВПфЦ, тогда как ъкорость реакций, представляющих собой

боковые ответвления от этого пути, иало зависит от кислот-вости среды вне клетки, чем и объясняется возрастание их относительного значения при крайних испытааных концентрациях ионов водорода.

Ход процессов метаболизма зависит также от физиологического состояния непроточной культуры: образование глицората из ФПС наблюдается го стадиях замедленного роста культуры......

Решающее значение, определяющее направление биосьлтеза, имеет состояние энергетических систем. В случаях нарушения стационарности энергоснабжения, приводящего к энергетическому голоданию, интенсивность ассимиляции снижается, я дуть переключается с ВПФЦ на /-карбоксилирова-иже, соответствующее "темновому" метаболизму фотоавтотро-фок.

Часть ИТ. ЭН81ШАГИЧБСКИБ МЕХАНИЗМЫ АССИМИЛЯЦИИ С02 ПРИ АВТОТРОФИЙ.

В работе представлено современное состояние знаний о ферментах, участвующих в цикле регенерации о -рибулозо-1,5-дифосфата (РуДФ). Привлечение обширных литературных данных позволило рассмотреть вопрос в сравнительно - биохимическом аспекте.

В немногочисленных энэимологических исследованиях, проводившихся до начала наших исследований, преобладал качественный подход, Требовались более надежные доказательства физиологической значимости важнейших ферментов ВЛФЦ.

Целью наших экспериментов являлось определение активности ключевых ферментов ВПФЦ и изучение условий,оптимальных для их действия in vitro, в сопоставлении с реаль-жой обстановкой в живой клетке (глава У1).

Три ферментативные реакции ВПФЦ, протекающие последовательно и катализируемые рибозофосфатизомеразой (D-ри-

|в

боао-5-фосфат-ке*од-изомераза, НФ 5.B.I.6), фосфорибуло-кииааой (АТФ: р -рибулозо-5-фосфат-1-фоофотрансф pass, НФ 2.7.1.19) и РуДФ - кврбонситзой {3-фоофо- D-глмцерат-кар-бокси-лиаза димериаующая, НФ A.Z.1.39) условно объединяются в одну группу, именуемую фазой карбоксилирования. Из них два фермента: фосфо рибудоки наза и РуДФ-карбоксилаза, являющиеся характеристическими для ВПФЦ,.. не встречаются в других метаболических последовательностях.

Удельная активность рибозофосф&тизомеразы, определявшаяся карбазоловым методой ( axelrod, Jang, 1954), в экстрактах из клеток T.thiooxld&ns 58Я в среднем была ра'в-на 830 мЕд на иг белка, а в экстратах из клеток T.tMooxi-dene 58R до 1500 мЕд на иг белка экстракта* ,

Об активности фосфорибулокиназы судили по скорое т^' накопления щелочегидролизуемого фосфоре РуДФ, в присутствии D -рибоэо-5-фосфата (Р5Ф), которой под действием эндогенной рибозофосфатизомеразы предварительно превращается в и -рибулозо-5-фосфят. Активность фермента в экстрактах из т.thlooxldsma 58R в разных опытах колебалась от 500 до 2000 мЕд'на иг белка экстракта, а в экстрактах из H.eutro-pba Z-S от 600 до 1000 мЕд. В отличие от типовых бактерий активность фосфорибулокиназы в экстрактах из водородных бактерий удалось определить только в анаэробных условиях. Это говорит о различии регулирующего действия кислорода на ферменты ВПФЦ у представителей разных групп хеыоавтотрофов.

На основании проведенных исследований разработан простой и экономичный слособ препаративного получения РуДФ из Р5Ф и АТФ с использованием неочищенного экстракта из клеток т.thlooxldana 58R в качестве ферментного препарата.

Исследование РуДФ-карбоксилазы в экстрактах из хемо-

ie

мтотрофних микроорганизмов было вами предпринято по ряд; причин. Необходимо было: I) получить энэимологиче-ское доказательство действия ВПФЦ, так как образование ФГК в целых клетках возможно шш путями; 2) показать, что потенциальные возможности фермента достаточны,чтобы обеспечите субстратом наблюда ему» скорость ассимиляции С02 целыми клетками микроорганизмов; 3) выяснить, каким образом согласуется низкое сродство РуДФ-карбоксилээы к бикарбонату с реальными концентрациями этого субстрата в условиях культивирования микроорганизмов.

Активность РуДФ-карбоксилазы обнаружена / нами в экстрактах из клеток всех исследованных хемоавтотрофов:

В.вп^горЬа г-^Н.рап^горЬа 2-Д1,Рвеи<1отопае ра11егоп11

т.*Ыоо*1|1ап0 58В и т.пеароИ^апив. На Примере водородной бактерии н.е^горьа 2-1 показано, что единственным меченым продуктом фиксации С1^ на РуДФ является ФГК,

Максимальная удельная активность РуДФ-карбоксилазы наблюдавшаяся в неочищенных экстрактах из н.еи^орЬа г-з достигает 140 мЕд на мг белка, однако более обычной у н.е^горьа г-1 и т.1Ыоо*1<1апв 5екявляется величина порядка 0,05 Бд на мг белка. Такая скорость нарбоксиляро-вания может обеспечить углеродом рост клеток только на стадиях замедленного роста и задержки роста. Таким образом РуДФ-карбоксилаза является ферментом, активность которого ограничивает скорость прохождения углерода через фазу карбоксилирования.

В связи с этим нами проведено детальное изучение действия разных факторов на активность РуДФ-карбоксилазы хемоавтотрофов.

Основным объектом исследования в этой части работы явилась водородная бактерия н.еи1горЬа е-1.

Установлено, что кинетика действия РуДФ-карбоксила ЗЫ В экстрактах ИЗ Н.еи1горЬа Ъ-1 И Ф^Н1оох1йапв 58И подчиняется закономерности реакции первого порядка. 20

с субстра-|| 1; П- 5-м*{.

Начальный ход кинетической кривой действия фермента на водородной.бактерия зависит от продолжительности предварительной инкубации о бикарбонатом (рис.6).При одновременном добавлвнмж обоих субстратов в ход» кривой хороао видев индукционный период,исчезающий доела предварительной инкубации о бикарбонатом перед добавлением второго субстрата (РуДФ).

имя пив & Рис.6. Влияние пред-

варительной инкубации экстракта иэ н.еиьеорь* а -I иа кинетику дай* ' отвия РуДФ-карбохсяла-аы. 1-однохремеянов до-, бавленка обоях тов к фермента; предиикубация фермента о бикарбонатом ; Ш-15", ¿0; 30-я 60-мив. преданкуба-цвя.

Нелинейность кинетики при одновременном добавлении обоих субстратов говорит о существовании процасса,предыест-вующого карбоксилировакию.Подобное явление отмечалось я для фермента эвкариот ( Роп, 1963)»причем предполагалось,что таким процессом является образование фермент-субстратного комплекса между РуДФ-карб оно и лаз ой и СО^* Однако вяачктео-но более вероятно .что при одновременном смапяваажя фермента с обоими субстратами скорость карбоксилироваоия РуДФ ограничена скоростью ре~кцня уравновешивания форм "углекислоты. Это заключение основано на следующих фактах. 1).Скорость неферментативного гмдратированяя СО^ в растворе достаточно мала,и продолжительность процесса (около

I мин) (paurholt ,1Э24) сопоставима о продолжительностью инкубации при определении активности РуДФ-карбоксилазы;

2) непосредственный субстратом при действии РуДФ-кар-биасидвзы эвкариот является растворенная двуокись углерода^ но иен бикарбоната.Это,поводимому,верно и для фермента прокариот-хемсазготрофов,однако прямые данные об этом атом в литературе отсутствуют.ниже приводятся соображения, подтверждение это предположение.

Uo налим данным,половина максимальной скорости карбоксидирования РуДф при действии фермента из H.eutropha Z~ 1 достигается при концентрации бикарбоната Ю м!1,что xopoiao совпадает с подавляющим большинством известных данных для эзкариотнше и пронариотных автотрофов.

С точки зрения физиологии водородных бактерия,культивируемых в присутствии 6 uli бикарбоната, эта величина выглядит слишком высокой и заставляет предполагать,что развитие культуры лимитировано бикарбонатом. Что же касается тионовоя оактерии T.trhiooxldaiis 58R ,то ее способность в росту при практическом отсутствия экзогенного бикарбоната я малоя растворимости двуокиси углерода кажется парадоксальной.

Исходя из предположения,что активной формой субстрата РуДФ-карбоксилазы является растворенная двуокись углерода, мы определили сродство фермента к этой форме субстрата.

Расчет показывает,что сродство РуДФ-карбоксилаэы к С02,растворенной в жидкой фазе,достаточно велико (Хц низка я равна 0,014 мМ).чтобы обеспечить нелимитяроэанный рост водородных бактерий при содержании двуокиси углерода 8 культурадьноЯ жидкости.достигающем 3,3 мЦ в условиях равновесия с атмосферой,содержащей IQE& СО^*

Представление о Си2 как активно» форме субстрата кар-боксидирования позволяет дать разумное объяснение способности хи оно воЯ бактерии т. ьЫоозМапв 5в В к росту при пониженных значениях рН г обычной атмосфере.Содержание Сиг в культуральной жидкости в этих условиях близко к значению Кц РуДФ-карбоксилазы для растворенной двуокиси углерода. Это означает,что рос« бактерий возможен,котя и лимитирован содержанием СО^* Показанное нами увеличение скорости роста и ассимиляции С ** при повышении концентрации углекислоты (СО^) подтверждает эти положение.Обнаруженная нами у тио-новой бактерии карбоангидраза создает в клетка обменный фонд бикарбоната и таким образом способствует повышенно 1 концентрации 00^ в цитоплазма.

Из изложенного видно,что вопрос о форме субстрата кар-боксилирования и сродстве к нему РуДФ-карбокснлазы не ограничен интересами ферментативной кинетики,ко имаех непосредственное физиологическое значение,являясь ло существу вопросом о требовании организма к субстрату литания.

Отчетл«вое представление об активной форме субстрата необходимо при анализе кривых насыщения РуДФ-карбоксилазы бикарбонатом, наблюдаемая в ряде случаев сигмоидность концентрационных кривых может быть результатом ограничения скорости ферментативной реакции предшествующей ей реакцией неферментативного дегидратирования бикарбоната при низких его концентрациях.Таким образом, доказательство алдостери-часких свойств РуДф-карбоксилазы кинетическими методами встречает особые трудности.Необходим тщательный подйор условий проведения реакции карбоксилирования РуДФ.

Безусловно необходима предварительная инкубация ферментного препарата с бикарбонатом,меченным для установления равновесия форм субстрата карбохаклировавия. ио

за

мере исчерпания запаса субстрата.образовавиегося за время предварительной инкубации,может возникнуть прямая зависимость от скорости неферментативного дегидратирования би-карооната.Уто осооенно вероятно при работе с объектами, не содержащими карбоангидразу ,или с высокоочиценным ферментом.

^ 7%ЩруДФ] (м)

>0 20 за кО 50 0уДР}(Н)

Рис.7. Зависимость активности РуДф-карбоксилазы н.еиЪгорЬа й-1 от. концентрации РуДФ. А - в линейных; Б - в двойных обратных координатах; В -в координатах Хмлла.Концентрация бикарооиата 50 м11.

Сродство РуДФ-нарбоксилаэы Н.«и*горЬа 3-1 ко второму субстрату - РуДФ - не отличается от величины этого параметра фермента из других автотрофов: константа Михэ-эяиса для РуДФ равна 0,12 мМ. (рис. 7).

Специфические ингибиторы действия РуДф-карбоксилаэы не известны., хотя активность фермента снижается под действием ряда факторов. Нами обнаружен новый факт ингибиро-вания РуДФ-карбоксилазы н.еи1горЬа ъ-х фторидом. Торможение на 50% достигается при концентрации фторида 7,0-9,5

Бикарбонат оказывает защитное действие при ингибировэ-нии РуДФ-карбоксилоэы фторидом.

РуДФ-карбоксилаза водородной бактерии г «и^орьа 2-1 неустойчива в очищенном и частично очищенном виде. В связи с этим было предпринято изучение факторов стабилизации активности фермента. Опыты с диализованныыи препаратами руДФ-карбоксилззы, проведенные нами, показывают абсолютную потребность фермента в ионах М Однако концентрации большие 10 ми, приводят к очевидному мигрированию действия фермента (рис. 8). В этом заключается одна из отличительных свойств ферменте водородных бактерий от РуДФ-карбоксилазы шпината, нечувствительной к высоким

концентрациям ионов ___о - "■■'

Рис.6. Влияние концентрации И£С1г на активность РуДФ-ка рбоксила зьг Н.еи1горЬа 2-1.

100

80

-з,о -г, о -/,# \

за

Активность, утраченная в результатеудаяеакя ионов цлишь частично восстанавливается'при повторной добавке 5" ыи; Kguig. Наиболее полное восстановление функции фермента происходит при одновременном присутствии 5 мЫ UgCl2. 10 uM глутатиона и 50 мМ бикарбоната. Эти факты свидетельствует о той, что при удалении иона происходят глубокие изменения конфоршцик РуДФ-карбоксилазы, которые не иогут быть сняты ' простым возвращением в систему.

Большое значение для сохранения активности РуДФ-карбоксилазы водородной бактерии u.eutropha ¡¿-i имеет концентрация белка, что обнаружено нами впервые. Разбавление фермента трис-HCI буфером или водой приводит к быстрой потере активности^что .также говорит о нарушении структурной организации.

Из данных рис. 9 видно, что ионы глутатион и

бикарбонат по отдельности проявляют разную способность к восстанови<жш функции разбавленных недиализованных (т.е. содержащих некоторое количество препаратов РуДФ-

карбоксилазы, частично утраченную в результате длительного хранения. Наилучшие результаты получены при одновременном присутствии бикарбоната и глутатиона. Добавка ионов

к недиализоваиным препаратам не имеет решающего значения^ Аналогичные систематические исследования в литературе отсутствуют, но имеются отдельные указания, подтверж дающие обнаруженные нами факты. Эффект присутствия глутатиона в свежеполученком экстракте не проявляется, его при сутствие необходимо при хранении фермента.

В диссертации пригодятся данные о влиянии некоторых восстановителей на активность РуДФ-карбоксилазы. Показана небольшая стимуляция действия РуДФ-карбоксилазы сульфидом тогда как 0,5 им - 200 мЦ тиосульфат, I ый - 20 мМ бисуль фит и 0,2 мЦ - 10 Ш сульфит натрия проявляют ингибирую-

зе ^

мин

рис. 9. Влияние Н глутатиона п бикарбоната на восстановление активности н.в^горЬа г-х в препарате, частично ииактквироваяноы в результате длительного хрв-1 нения, I - беэ добавок; 2 - првдинкубеция при.25°С с Мвс1г ; 3 - с глутвтионом; ц - о ¡¿еС1г и глутатяонои; 5 - с даНСОз ; 6 - с даНСОд и МгС12 ¡7-с «аНС08 и глутатионои; 8-0 %С12) глутатионои и наНСОд.

щве действие, различие действия восстановителей говорит о различии механизмов действия, определяемых молекулярными . строением испытанных анионов.

Естественный окислитель - кислород - в стандартных условийхопределения также снижает активность РуДф-карбокси-лазы, но не более, чем1 на 20?Е,

Таким образом, хотя для наиболее полного проявления активности РуДФ-карбоксилазы большое значение имеет восстановленное состояние сульфгидрильных групп, неорганические восстановители неэффективны.

Особое внимание было нами уделено изучению кажущегося парадоксальным ингибирующего действия АТФ на РуДФ-карбокои- ■ лазу. Сравнительное исследование показало, что АТФ ивгиби-

- > 37 '

Рис. 10. Зависимость ингнбирования РуДС"-карбоксилаэы от концентрации АТФ. А - хемоавтотрофные микроорганизмы; Б -.фотоавтотрофные организмы.' I-T.oeapolltanua 70Sj 2-H.pantotropha.Z~14i 3-Pa«udomonaa palleronti; 4-H.eu-tropha Z-1 * 5-T.thiooxldane 5§H| б-Rhodopgeudomonaа palustris j 7-OhJ.orella vulgariß^ 8-Flsun aatlvuo t 9-Fbase-olua vulgaris.

рует PyДФ-карб оке ила зу в экстрактах из 10-ти испытанных хемо- и фотоавтотрофных организмов (рис.10).

Торможение скорости реакции наполовину у исследован» ных нами обьекто? достигается при следующих концентрациях АТф (uti): У H.eutropHa а-1 - I,?4;H.peintotroptia г-14 - 0,91; Pejudouoaaa pallaronii — 0,46; Т.thloaxid&ae 58К - 0,91; T.aeapolltanus 703 - 0,63;Rhodopeeudomoaaa palustris - 1,75; Chlorella vulgaris - 0,68; гороха (Pi-виш eatlvu«)- 1,75, и лишь у фермента из листьев фасоли (FhÄoeolua vulgaris ) значительно вияе: 4,4 uil, а у сахарной свеклы (Beta vulgaris ) ингкбиров&ние РуДФ-карбок-силазы в присутствии АТФ практически отсутствует.Сколько-нибудь отчетливая корреляция характера энергетического об-

мена или клеточной организации организма и силой действия ' АТФ отсутствует. Физиологический смысл ингибирования РуДФ-карбоксилазы АТФ, продуктом энергетической фазы обмена мы усматриваем в предохранении фонда РуДФ от истощения в случае нарушения действия предыдущего фермента ЗПФЦ (фрсфори-булокинаэы) и накопления АТФ.

Реакцию карбоксилирования РуДФ в экстрактах из Н. «utropha z-i ингибирует также ее продукт, ФПС. Метаболиты цикла Кребса пируват и малат и аминокислоты а-аланин, аспартат и глухапат в концентрациях 2-12 мМ не действуют на активность РуДФ-карбоксилазы H.eutropba z-i и T.thio-oiidane 58R, тогда как цитрат ингибирует действие фермента о,боих микроорганизмов.

Для будущих исследований регуляции биосинтеза РуДФ-карбоксилазы и кинетических и физико-химических свойств фермента весьма существенно разработать быстрый и удобный ' метод его выделения. Мы сравним четыре способа очистки РуДФ-карбоксилазы:,Л I - фракционирование сульфатом аммония с последующим пропусканием через молекулярное сито св-фадекс Г-200; 2 - прямое ультра цен трифугировэ аие белков неочищенного экстракта при супервысокой скорости: 427000g : 8 - ультрацентрифугирование белков неочищенного экстракта в градиенте плотности сахарозы и 4 - ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы активной фракции, выпадающей в пределах 0,25 - 0,85 от полного насыщения сульфатом аимония.

По нашим данным,-наиболее удобными и перспективными с точки зрения количественного выделения РуДФ-карбоксилазы в неповрежденном состоянии являются методы, включающие центрифугирование в градиенте плотности сахарозы.

Удельная активность ферментного препарата полученного путем комбинации фракционного осаждения сульфатом аммония и центрифугирования в градиенте плотности сахаро-

аы (рис.И) равна 2,26 - 1,48 Ед на кг. При электрофорезе в полнакриламидном геле фермент дает одну полосу, медленно двигающуюся к аноду.

Рис.11. Распределение белка и активности РуДФ-карбо-ксилазы при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы франции белка Н. еиггорьа 2-1 , осаждаемого в пределах 0,25-0,85 от полного иаснщенкя сульфатом аммония.

Расчет, произведенный на основании данных,полученных нами при выделении РуДФ-карбохсилазы водородных бактерий показывает, что карбоксилирущий фермент составляет не менее 10^ от общего растворимого белка экстракта. Эта величина близка к имеющимся в литературе сведениям о содержании фермента в клетках пыкюери-тит гиЪгшп. В отличие от прокариотных организмов,содержание РуДФ-карбоксилазы в' листьях высших растений, выделяемой в виде так называемой 1°"фракции белка, по литературным данным, в несколько раз выше.

Целью наших дальнейших исследований было изучение реакции фиксации С бикарбоната в присутствии рибоэо-5-фосфата (Р5Ф) и АТФ, являющейся результатом последовательного действия всех трех ферментов фаэр карбоксилирования и общепринятым и легко доступным тестом на действие ВПФЦ.

РО

Эта работа была вызвана очевидным недостатком количественных данных, позволивших бы оценить скорость суммарной реакции в сопоставлении с активностями индивидуальных ферментов в ней участвующих, ев случае водородных бактерий - несоответствием отрицательного результата теста составу продуктов ассимиляции и результатам индивидуального определения активности трех ферментов.

Полученные результаты показывают (табл.5), что снижением исходной концентрации А1Ф у ряде исследованных объектов можно получить усиление фиксации С1^ бикарбоната в присутствии Р5Ф.

Таким образом, установлено, что обычно применяемая для демонстрации ключевых ферментов ВПФЦэнзимо^огическая проба фиксации НС1*03~ в присутствии Р5Ф и АТФ может рассматриваться лишь как качественная реакция. Получение количественного результата также возможно, но после тщательного подбора ксходзых концентраций субстратов.

Отличие водородных бактерий от других автотрофов заключается в том, что ни при одной цз испытанных концентраций АТФ не удалось получить фиксацию'С1'1 бикарбоната в присутствии Р5Ф, сравнимую с активностью руДФ-карбоксилв-эы (табл.5). Постановка опыта в атмосферё}аргона также успеха не имела.

Это говорит о существовании иного, неизвестного препятствия последовательному протекания реакций фазы кар-боксилирования в неочищенном экстракта из клеток водородных бактерий.

Нами выдвинуто предположение, что успех реакции фиксации в присутствии Р5Ф и АТФ зависит от про-

странственной организации ферментов фазы карбоксилирова-ния или по крайней мере, двух из них( фосфорибулокиназы и РуДФ-карбоксилазы>в виде комплекса.

Можно было предположить, что у водородных бактерий комплекс менее прочен, чем у тионозых, и результатом его

__ м

Таблща 5

Включение НС^^Од в экстрактах из клеток автотрофных организмов в присутствии Р5Ф и двух концентраций АТФ в сравнении с »ктивностыа РуДФ-карбоксилаэы

мЁд на мг белка

Р5Ф + АТФ 4,4 мЫ АТФ 0.22 Ш АТФ РуДФ

И.е^горЬа 2-Х 7.0 - 64,0

Н, «^горЬа 0 0 30,0

Н.ра^о1горЬа 2-14 0 0 32,5

Ровийотопаа р&ИвгопИ 0 . 0 16,0

А1са11нввва рагайохив

АТСС 17116 0 - 28*5

Т^ЫоожМапв 5Ш - 67,0

Т. ШоохМапв 5вй 1,42 4,95 50,1

I.пвар«111апив 70г 0 - 6,7

ВЬоАоравидопооая ра1ив1г!в О - 6,0

СЫогеИ« *и1г«г1в 0,46 Э,80 3,1

рхаит вамтпщ (листья) 5,5 40,6 68,4

в^а ти1еаг!е (листья) 76,5 - 97,5

РЬеево1ие \т1га5(аис1ья) 10,4 39,0 32,7 ,

разрушения является нарушение последовательности действия ферментов фазы карбоксищрования, выражающееся в отсутствии включения С1 бикарбоната в присутствии Р5Ф и АТФ,

Критерием прочности комплекса может являться поведение ферментов при их очистке, В качестве тест-объекта была избрана тионовая бактерия Т.гь1оох1аапв 5Ш.

На протяжении всей процедура выделения РуДФ-карбокси-

лаэы из T.thiooxiâacaSEfripenapax сохраняет способность н фиксации бикарбоната на Р5Ф и АТФ (табл.6).

Это говорит о существовании у т.thiooxldane 5вн достаточно прочной связи между ферментами фазы карбо! минирования.

Таблица 6.

Выход белка и активность ферментов фазы карбоксили-рования в ходе выделения РуДФ-карбоксилаэы из экстрактов ИЗ клеток t.thiooxldans 58Н

фракции

Выход белка мг

Удельная активность мЕд на мг белка

Общая активность Ед

I. Центрифугирование Надосадочная жидкость 17000 « 553,0 70 23 ' 38,7 12,7

Надосадочная жидкость 140000 g450,0 .130 60 53,5 27,0

П. Осаждение сульфатом аммония

Фракция 0-0,6 354,0 - - - -

фракция 0,3-0,4 224,0 320. 220 71,7 49,3

В. ДЭАЭ - целлюлоза 140,0 460 262 44,1 11,8

ХУ.ГидроксилапатиТ 10,3 2000 460 13,3 47,0

Надмолекулярная структура ферментов фазы карбоксили-рования, относящихся - числу растворимых, не исследована. На основании имеющихся в литературе весьма скудиых данных о молекулярной активности высокоочищенных, ферментов фазы

ts

карбоксияирования и их активности в неочищенных экстрактах нами рассчитано,что у прокариотных автотрофов на одну молекулу рибозоф->сфатизомеразы приходится 1*5 - 2,5 иоле-кули фосфорибулокиназы и 3 - 7 молекул РуДФ-карбоксилаэы.

Существование комплексов ферментов растворимой фазы клеток логически оправдано возможностью более эффективного использования продукта предшествующей реамии и большими возможностями регуляции действия ферментов.

следующая фаза И1ФЦ - фаза восстановления - включает , реакции,катализируемые фосфоглицераткиказой (ДТФ:фосфо-Х> глицерат-1- фосфогрансфере.за,:1Ф г.7.2.3) и глицеральде-гидфосфэ-догядрогв казан (Р-гдицеральдегид-3-фосфат:НАД(Ф)-окси^оредукта?а,нф I.2.1.12,и представляет собой пункт непосредственной субстратное связи энергетического обмена с конструктивней при авютрофии*

Наци показано,что двухферментная система.ответственная за восставочленив ФГК у водородной бактерии Н.еиЪгорЬв 1 -1,НАД-специфична.Это своИс-ви сближает ее с аналогичный системами из других автотрофкых бактерий,в ^тлмчие- от эвкариотных фототрофов.у которых глицеральдогидфосфптдегид-рогеназа специфична к паДф.

Ферментная система восстановления ФГК водородной бактерии требует двухвалентных ионоь м^1" или Мп^.но последние менее эффективны, Система активируется и присутствии стабилизаторов сулодгидрилышх групп белка.Специфика восстановительной Ф&э^ ШФЦ водородной бактерии заключается в слабом сродстве системы к АТФ по сравнению с соответствующими системами эвкариот. •

Показанное нами 1*нгмбирование фазы восстановления в присутствии А11Ф и АДф говорит о регулируемости процесса , величиной энергетического заряда.Метабелиты цикла.Кребса, о(- ала(1ан1аспартат,глутамат,фосфоеколиирувагСФШ) практик -чески не влияют на восстановление фосфоглицерата

экстрактами из H.eutropha z-l, тогда как 0,2 Mil РуДФ ингибйрует реакцию на 30^.

Продукты ВПФЦ у хемоавтотрофов являются исходный материалом для синтеза большого количества ингредиентов клетки. Однако для образования целого ряда важнейших метаболитов, в первую очередь дикарбоновых аминокислот и их производных, необходимо дополнительное включение СО^ для биосинтеза четырехуглеродной цепочки. 5 главе УП диссертации детально описаны важнейшие реакции карбоксилирова-ния грехуглеродных акцепторов, обнаруженные в автотрофных организмах.

Целью экспериментальной работы было обнаружение и определение активности и физиологического значения этих харбоксилаз.

Установлено, что в экстрактах из T.thlooxldane 58R, H.eutropha z-l u H.pantotropha 2 rll присутствует ФЕП-кар-Ооксилвэа (ортофосфвт: оксалоацетат-карбокси-лиазв нарбо-ксилирувщая Н.Ф.4.1 Д.31).

Фермент из т.thiooxidans 5SR наиболее активен при рН 6,1 и ингибируется в присутствии высоких (20 мМ) концентраций фосфата, мало чувствителен к добавке М Ы я восстановленного глутэтионэ. Максимальная величина удельной активности, наблюдавшаяся в наших опытах, 2,9м5д на мг белка.

Удельная активность ФЕП-карбоксилазы в неочищенных экстрактах из H.eutropha z-l в присутствии ионов М ё* еще ниже: 0,2 мЕд при рН 7,5. Фермент чувстви^элев к замораживанию. Фторид натрия (10 ыМ) не влияет на активность ФЕП-карбоксилазы H.eutropba Z-l( рис. 12).

На примере н.pantotropha г-И показано, что активность ФЕП-карбоксилазы в присутствии 2 м!К МлС1г на порядок величин выше, чем в присутствии MgCi2 той же кон-

за

центрации и достигает 10 мЕд на иг белка. Значение Кн для ИпС1г в присутствии избытка обоих субстратов равно 1x10"® К, что говорит о недостаточном содержании ионов II в среде выращивания водородных бактерий.

Кривая зависимости скорости реакции от концентрации СЕЛ имеет игмоидную форму. Сродство к ФЕП невелико: половина максимальной скорости достигается при концентрации ФЕП 2.65 «М.

2 нМ ацетил-КоА и аспартат ингкбируют, тогда как 0,36 мМ и I мМ АТФ и АДФ и б,? нМ фосфат не действуют на ФБП-карбоксилазу из автотрофно выращенных клеток Н.ралго-«горь& а-и. Однако адешшты и фосфат в тех же концентрациях ингибируют ФЕП-карбоксилазу из гетеротрофно выращенных клеток. Эти факты говорят о различии свойств ФЕП-карбоксилазы в зависимости от характера организма и выполняемой ферментом физиологической функции.

Низкая активность ФЕП-карбоксила зьг в экстрактах из всех исследованных нзми хеиоавтотрофов исключает возможность действия фермента в качестве первичного, акцептора

сог.

В экстрактах из Т.гыоозс1йапв 5Ш обнаружено усиление включения С14 бикарбоната на ФЕП в присутствии ИДФ, что говорит о действии другого фермента.карбоксилирования ФСП-карбоксикинэзы (ИТФ: оксэлоацета т-карбонси-лиаээ фосфора лиру ища я Н.Ф.4.1.1.32). Удельная активность 0,301,32 мЕд на иг белка, что сравнимо с активностью ФЕП-кар-боксилэзы в тех же экстрактах. Хотя действие ФЕП-карбокси-киназы в клетках хемоавтотрофов возможно, роль этого фермента в ассимиляции,очевидно,ничтожна. Основанием для такого вывода является известное из литературы слабое сродство фермента к бикарбонату (СО2) и высокое значение отношения АТФ:АДФ в условиях хеыолитотроФии.

В экстрактах из Ф.ЪЪ1оох1дапв 58Н,н.еиггорЬа 2-х и н.рао«о1гор11а Е-и радиоизотопным.методом нами обнаружен малик-энзим (Ь-малат; НАД (НАДФ)-оксядоредуктаза дека рбоксилирующая 1.1.1.38, 39, 40), активность которого,в направления карбоксишрования, одкзко, невелика (тебл,7).

Таблица 7.

Карбоксилирующая активность малик-энзима в экстрактах из тионовых и водородных бактерий

Объект исследования и Динуклео- Удельная актив-условия выращивания тид ность,

мЕд на мг белка

T.thlooxidana 5SR

0,70 0,50 вех

0,096 0,55

0,0«) 0,070

Способность к восстановительному карбонсилированию пирувата можно рассматривать как потенциальную возможность, имеющую ограниченное значение в условиях евтотюфии.

ФЕП в экстрактах из клеток H.eutropl» Z-I, выращенных автотрофно, образуется из ФГК с участием реакций. обращенного г ли к о ли за. aro показывают наши опыты "по инм~ . бированию фторидом включения С14 бикарбоната в присутствии Wk (рис. 12).

_____"ST

(автотрофные на тиосульфате) НАДО.Н

H.eutropha Z-i НАДФ.Н

(автотрофные, под

гремучей смесью) НАД.Н

H.pantotropha Z-II

НАДФ.Н

(автотрофные, под

гремучей смесью) НАД.Н

H.pantotropha Z-tl НАДФ.Н

(гетеротрофные, на

лактате) НАД.Н

аыфип

Рис.12* Кинетика включения С^ бикарбоната экстрактами из клеток B.eutrophft 2-1 в присутствии ' 5 мЦ ФЕЛ (I), (ФЕП + 10 мИ НаР (2), 10 UÜ ФГК (3) Ы ФГК + ИаР (4).

Начальный участок кинетической кривой I (рис.12)»изображающей включение С*'* бикарбоната в присутствии ФГК,говорит о существовании процесса»предшествующего карбонси-лмрованню и ограничивающего его скорость*Ивгибированне фторидом реакции в целом при отсутствии его действия на ФШ-карбоксилазу свидетельствует об участии вволазы (2-фосфо-D-глицерат-гидро-лнаэ а,Нф 4.2.I.I)*

Глутаминовая кислота,значительное накопление которой показано в опытах с неповрежденными клетками U.eutropha 2-1,образуется с участием реакций цикла КреСса.Это доказано опытами с применением специфического ингибитора цикла Кребса фторацетата.При введении в опытную среду 10 uli фторацетата наблюдается усиление радиоактивности цитрата при одновременном снижении включения С1** в глутамат(табл.8).

Включение С бикарбоната в промежуточные продукты цикла Кребса в клетках H.eutropha ъ-л невелико в условиях автотрофни.Наши результаты согласуются с дитератур-

38

Таблица 8.

Влияние 0,1 и фторзцетатэ натрия на распределение метки в продуктах I пин хемосинтеза н.в^горЬа г - I в присутствии 0*^02«

В % от общей ассимилированной радиоактивности

Инкубация с Фтор ацетатом В НИН Меченые продукты хемосинтеза Контроль 0 6 14 19 30

Фосфорные эфиры сахароз и органических кислот 63,30 73,10 69,50 68,80 72,40

Лимонная кислота 0,58 8,67 7,40 20,90 9,80

Глутаминован кислота 19,75 6,40 6,10 1,90 0,15

Аспарагиновая кислота 0,78 0,56 0,43 0,20 0,70

Серия 1,64 2,24 1.52 0,45 1,00

Фумаровая кислота Янтарная кислота Яблочная кислота 4,0 1,24 1,47 1,90 1.17

Лейцин 0,94 2,27 1,94 2,15 1,81

Моносахара 0,09 0,57 1,28 1,92 0,44

Прочие 6,66 4,95 10,36 11,88 13,53

ночи я^нннчч 1 ^рицд^яп^тдупт .п таи, ЧТО При автотрофяи—

реакции цикла Кребса имеют преимущественно биосинтетическое значение как путь синтеза аминокислот и других метаболитов.

Часть 17. ОСОБЫЕ СЛУЧАИ АВТОТРОФИИ И ГЕГЕРОТРОФИИ.

Рассмотрены пути ассимиляции одноуглеродных соединений более восстановленных,чем углекислота.

Окисление окиси углерода и усвоение образующейся при этом двуокиси углерода представляется как пример автотро-фии,отличающимся от других видов хе мо лит оаат от рофии лишь природой субстрата окисления,являющегося неорганическим соедннением,но одновременно и источником углерода.

Рост ?аеи<1оао{Ш8 оха1аЬ1сив и водородных бактерий за счет энергии окисления формната и ассимиляции освобождающейся углекислоты о участием ВПФЦ ( ЯеесЬ , 195В;Намсараев и др.»1971) охарактеризован как хемооргано-автотро^ия.

Две ^экологические группы бактерия,одна из которых использует в качестве источника анергии реакции окисления метана и метанола,а друга^окисляет метанол,но неспособна к окислению метана,отнесены к хемсорганогехеротрофам независимо от характера пути ассимиляции восстановленных одно-углеродных соединений.Биохимический механизм одного из-этих путей чрезвычайно близок к механизму ВПФЦ,но характеризуется отсутствием РуДФ-карбоксилаэы и фосфорибулокиназы Включение углерода происходит на уровне формальдегида с участием специфического фермента гексоэофоофатсинтетаэы* Другой путь ассимиляции одноуглеродных соединений (серино-вый) энэиматически характеризуете» высокой активностью се-рин-оксиие'ылтраысферазы (ь -серин;тетрагидрофолат-5,10- ' оксиметилтрансфераза.НФ 2.1.2.1) и в -глицерат:11АД-оксидо-редуктаэы (Н.Ф.1ЛЛ.г9).(ВШ>опв ей а! .,1971).

Включение углекислоты при мзтилотрофин происходит с учаотнем реакций карбоксилировашш трехуглеродных акцепторов, осиовнии из которых,по нашим данным,является ФВД-кар-бокеилаза.Удельная активность фермента из ЦаЫ1у1оз11шв ОДсЪогрох^иш а- 1442 невелика:0,4 мЕд на мг белка экстракта. Фермент требует присутствия ионов и активирует-

40

ся в присутствии ацетил-КоА., По степени ингибирования аде-вилатаии ФЫ1-карбоксилаза м, 1г1сЬоерог±ш« ъ -1442 занн-навт промежуточное положение между автотрофами и гетеро-трофами.

ВЫВОДЫ ИЗ ЭКСПЕРИКЕНТ АЛЬНОЙ ЧАСТИ

I. Ассимиляция С02 (НСО^) клетками хемодитоавтотрофов в физиологических условиях - процесс.регулируемый факторам* питательной среды,важнейшее значение из которых имеют энергетический субстрат м концентрация углекислоты. При росте в условиях пониженной концентрации СО-> роль акцептора выполняет карбоангидраза»результатом действия которой является образование в клетке фонда лабильно связанного углерода.

П./ всех исследованных хемодитоавтотрофов состав я кинетика ранних продуктов ассимиляции С1^ соответствует закономерности, присущей ВПФЦ.

И. В экстрактах из клеток хомолитоавтотрофов присутствуют ключевые ферменты ВПФЦ.Активность ферментов стадий карбок-силироваяия и восстановления ВПФЦ достаточна для обеспечения скорости ассимиляции СО^,наблюдаемой в изолированных из культуры пробах целых- клеток.Активность ферментов ВПФЦ зависят как от концентрации субстратов и кофакторов,так я от метаболитов,не принимающих непосредственного участия в катализируемой реакции. .

1У♦Карбокс илироваяив ФЫ1 представляет собой необходимый этал автотрофии как путь биосинтеза четырехуглеродного дикарбонового соединения,исходного пункта биосинтеза ряда аминокислот.Основной фермент карбоксилирования трехуглерод-ного акцептора при хвмолитоавютрофии - ФЕП-карбоксилаза -характеризуется своеобразием ответа на действие регулирующих факт оров.Регулят орные свойства ФШ-карбоксилазы определяются как спецификой изучаемого организма,так и метабола-

чайкой ролью,выполняемой ферментом в конкретных условиях г„ нитания организма. При автотрофии снижается чувствительн иэсть фермеита к регулирующему действию аденидатоз (по сравнению с гетеротрофной).

У.Результаты знзимологических исследований показывают,что скорость ассимиляции углекислоты клетками хемоли-тоаьтотроив зависит от »фиктивности действия ВПФЦ в целом,определяемой как результат действия активирующих и ингибирующих факторов. Установлено,что для поддержания скорости карбоксилироваиия РуДФ и ФШ на должном уровне необходимо: а) присутствие субстратов карбоксилироваиия в достаточной концентрации; б) достаточная скорость образования восстановителя (НАД.Н) и наличие восстановите?-льиой обстановки и клетке,обеспечивающей.сохранность сульфгидрильньис групп ферментов анаболизма; в) достаточная (но не ингибирующан РуДФ-карбоксилазу) концентрация ПФ и его отношение к содержанию других адекилатов в клетке ("эт-'иетичоский заряд" клетки); г) достаточная концентрации илшь двухвалентных металлов,главный образом, ¡|£г+,а ь нокитърых случаях 1йп2+;д) достаточная скорость мвтаоолн;шц|Ы субстратов и промежуточных продуктов,накопление которых а клетке приводит к ингибированию роак-чий 811фЦ; и частности «ингибиторами РуДФ-карбоксилазы у камоаатотрицав являются кислород,тиосульфат,сульфат,цктг» рат,л-кетоглутарат, а ингибиторами*фазы восстановления Ы1ФЦ являете» АйФ, АД-1> и РуДф ; в)сохранение структурной организации клетки не только на микроскопическом,но и на субиикроешьеском уровне.

ЗАШЧШЖ

Использование ч.омоавтотрофов ь качестве модельных оргакизмои при экспериментальном исследовании начальных стадий анаболизма позволяет постулир"вать общность принта

ципиальной схемы пути углерода углекислоты у прокариотных и эвкариотяых(фотолито-, хемолито- и хемооргано~)автотро-фов.Присутствие характерных ферментов ВПФЦ - РуДФ-карбок-еилазы и фосфорибулокииазы является показателем способности организма к автотрофии.

Прокаристная клетка хемоавтотрофа с точки зрения локализации основного механизма автотрофной ассимиляции углерода углекислоты с известной степенью приближенности может быть уподоблена хлоропласту эвкариотных фототро-фов (но не отождествлена с ним).

Период качественного изучения путей анаболизма у ав-тотрофов можно считать законченным. Задача зэк* чается в том,чтобы активно вмешиваться и регулировать процесс в целом организме.Неследование факторов регуляции действия индивидуальных ферментов поставляет необходимую для этого первичную информацию. Сопоставление условий действия ферментов in vitro с реальной обстановкой в клетке составляет предмет чрезвычайно интенсивно развивающейся в па-стоящее время отрасли энзимологии,которая может быть названа физиологической.

По теме диссертации опубликованы следующие работы: I.Романова А.К..Доман Н.Г.I960. Продукты фиксации меченой углекислоты водородными бактериями в процессе хемосинтеза. Микробиология.29.795. ¿.Романова А.К.1965. О путях углерода при хемосинтезе. Успехи Оиологич.химии,7,235. З.Романова А.Х.,Доман Н.Г.,Рубан JE.JI.I966. Изучение продуктов хемосинтеза Nitrosotnonae europatjC применением С1«. Тр.Иоск.об-ва испыт,природы57,

Романова А.К.,Доман Н.Г.,Рубан ЕЛЛ965-Продукты кратковременного хемосинтеза Nitrosomonas europaee Микробиология,.34,392.

. <з

5.Романова ¿.К.,Веденина И.Я.,Доман Н.ГЛ968. Карбоксиляро-вание рибулозодифосфата в бесклеточных препаратах водородных бактерий. Изв.АН СССР,3,363.

б.Заварзин Г.А,.Романова А.К., Жилина Т.НЛ968. Зависимость фиксации углекислоты тиоиовыыи бактериями от кислотности среды. Изв.АН СССР,Л,582.

7.Романова А.К.1968. Биологическое карбонснлнровацнв при фото- и хемосинтезе. Успехи биол.химии,265.

В.Романова А.К..Заварэин Г.А..Чокина Н.Г.1969. Влияние кислотности среды на продукты хемосинтеза тионовых бактерий. Изв.АН СССР,£,277.

Э.Романова А.К..Веденина И.Я. Кожевникова А.Н.1970.Исследо-вание продуктов кратковременного хемооинтеза и некоторых ферментов восстановительного пентоэо-фосфатного цикла в водородных бактериях ^Лгое«- -потопав еиг-(форЬа2-1 .Микробиология ,.22,55?.

Ю.Романова А.К.,Ножевникова А.Н..Веденина И.Я.,Домак Ы.Г.

1970.0 путях включения С** углекислоты в дикар-боновые аминокислоты при хемосинтезе Вуйгоевпо-попав еиЬгорЬа Ъ-Л .Цнкробиология.39.1001.

11.Романова А.К.,Веденина И.Я. Дорницкая В.М,,'Доман Н.Г. 1971. Получение очиценной рибулозодифосфаткар-болсилазы из водородных бактерий ну^гоееплшо-

пае еиЪгорЬа • V®*

12.Русикова Н.Г. ,3 авар зин ГЛТ^анжйеваН^У. .фельдштейн Н.М 1971. Закономерности развития тионовых бактерий ХЫоЪас 111иа 58Е и влияние некоторых факторов пи тательной среды на ассимиляции углерода. Микробиология ,40, 252.

13.Русинова Н.Г..Романова А.Н..ЛитовчеикоГ.Н..Доман Н.Г. 1971.Особенности фиксации углекислоты тионовыми бактериями тЫоЪасШи&.^эд .Микробиология,40, 765.

Н.Доиаа Н.Г..Романова А.К..Русинова Н.Г. .Литовчешсо Г.Н.

1971. Способ получения0 - рибулозо-1.5-дифос-

44 фата. Авторское свидетельство Иг 309610 с при-

оргтетом от 29 ноября 1969г.

14. Романова А.К.,Микельсаар ПЛ.,1972. Значение субстрата

и некоторых кофакторов для сохранения н восстановления активности рибулозодифосфаткербо-ксилазы водородных бактерий. Биохимия, 07, 1030.

15. Романова А.К.,Русинова Н.Г.,Корницкая В.М.Д972. Об

участии карбоакгидрвзы в ассимиляции углекислот» при хемосинтезе пЫоЪавШиа 5Ш. Докл. АН СССР, 203, 1209.

16. Романова А.К., 1973. Методы выделения ферментов фазы

карбоясидарования восстановительного пенто-зофосфатного цикла. В об."Методы выделение и исследования белков-компонентов фотосинтетического аппарата". Изд.АН СССР, Пущино-на-Оке, стр.ЗЭ.

17. Романова А.К., 197^ . Конструктивный обмен водородных

бактерий. "Микроб.прокодл? 1,3.

18. Романова А.К.,Русияо9а Н.Г.,Васильева Н.Я.,Корвицкая

В.М.,1973. Рибозофосфетизомераза,фосфорибуло-кинава и рхбулозодифосфаткарбоксилаза в экстрактах из клеток ТМоЪасШив <Ыоох1<Запв 58 и. Биохимия, §9,454.

19. Романове А.К.,Веденина И.Я., 1973. Ингибирование рибу-

лозодифосфвтнаротсилазы вденозинтрифосфатом у автотройных бактерий организмов. Докл.АН СССР, 2X1,241.

20. Нихельсаар П.Ч.«Романова А.Х.,Намсэрэев В,Б.,8аварзин

Г.А.,1974. Фиксация углекислоты на трехугле-родных акцепторах в экстрактах из Нуагоевпо-тоюав рапгоггорЬа £-11 и М«гЬу1ов1пив 1г1ЬЬо-врог1ия 2-1442, Микробиология, 42,957

21. Ротанова А.К.,Веденина И.Я.,1974, 0 фосфорибулокинаэе

и регуляции обменного фонда рибулозо-1,5-ди-фосфата у водородных бактерий.Микробиология, 43,369. ^

22.Ромавова А.К..Русияоьа Н. Г Л9 74. Фиксация углекислоты на трехуглеродных акцепторах у облигатного хемоавтотрофа ТЫоЬасШив гЫошсХаапе Микробиология,43,552..

23.Петрова Г.В.»Романова А.К.1974. Восстановление фосфогли*

цериновоа кислоты в экстрактах из водородной бактерии Нуйговепошопаа еиЬгорЬа *^-1.Цикро-бнологкя,43,771.

24.Романова А.К.»1975. Регуляция действия ферментов восстановительного пентоэофосфатного цикла. Успехи микробиологии27.

ГЪдк. • не». 7/1 У—78г. Формат 90*84 1/1вА..и Объем Зи.Д."' ^ЦИ ИИ-Тираж ЗГО ,.

Ф«бр11А КМ П Гли 10Г0 7ПрШ1*1Ц * МЧкОИТ*ЛМЫД р«бОТ

ЦСУ СССР