Новые нейтрофильные литотрофные железобактерии и их участие в окислении железа в водных экосистемах

Сорокина, Анна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые нейтрофильные литотрофные железобактерии и их участие в окислении железа в водных экосистемах
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новые нейтрофильные литотрофные железобактерии и их участие в окислении железа в водных экосистемах"

На правах рукописи

у*

005015772

Сорокина Анна Юрьевна

НОВЫЕ НЕИТРОФИЛЬНЫЕ ЛИТОТРОФНЫЕ ЖЕЛЕЗОБАКТЕРИИ И ИХ УЧАСТИЕ В ОКИСЛЕНИИ ЖЕЛЕЗА В ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2012

005015772

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Дубинина Галина Алексеевна

Официальные оппоненты: Грабович Маргарита Юрьевна

доктор биологических наук, доцент, Воронежский государственный университет, Биолого-почвенный факультет, кафедра биохимии и физиологии клетки, профессор

Пименов Николай Викторович

доктор биологических наук ИНМИ РАН, заместитель директора

Ведущая организация: Московский государственный университет

имени М.В. Ломоносова, Факультет Почвоведения

Защита состоится « 28 » мая 2012 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 002.224.01 при ИНМИ РАН по адресу: 117312, Москва, пр-т 60-летия Октября, д.7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН. Автореферат разослан « апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук CJl[ fjL^ Хижняк Т.В.

Актуальность проблемы. Способность к окислению восстановленных соединений железа присуща многим прокариотным организмам различных таксономических групп, обладающих разными типами обмена веществ. Представители железоокисляющих микроорганизмов встречаются в доменах Bacteria, Archaea и даже в домене Eucarya (Halberg & Johnson, 2001). Наиболее изучены представители литотрофных ацидофильных железобактерий, а также органогетеротрофные железобактерии, широко распространенные в пресных водоемах и осадках, обогащенных органическим веществом. С 90-х годов двадцатого столетия начались интенсивные исследования практически неизвестной группы нейтрофильных литотрофных железобактерий. Первым ее представителем была описанная еще в XIX веке Эренбергом Gallionella ferruginea (Ehrenberg, 1836). Согласно концепции С.Н. Виноградского, G. ferruginea является типичным аноргоксидантом, ассимилирующим углекислоту в процессе хемосинтеза (Виноградский, 1888, 1922). Однако, убедительные доказательства хемолитоавтотрофного метаболизма для G. ferruginea были получены лишь в 1991 году (Halbeck & Pedersen, 1991). Публикации о представителях другой новой группы - литотрофных анаэробных железобактерий, способных к окислению Fe(II) за счет использования нитратов в качестве акцептора электронов, появились только в конце 90-х годов.

Из-за трудностей выделения и культивирования группа нейтрофильных литотрофных анаэробных железобактерий слабо изучена в физиологическом и таксономическом плане. За последние 20 лет были описаны, но остаются до сих пор невалидированными три вида, относящиеся к классам Alpha- и Betaproteobacteria, и один вид описан в качестве единственного представителя нового класса Zetaproteobacteria. Ряд выделенных штаммов до сих пор не идентифицирован в таксономическом отношении. Немногочисленные экологические исследования указывают на участие литотрофных нейтрофильных железобактерий в образовании оксидов железа в специфических природных условиях, таких как глубоководные морские гидротермы (Горшков и др., 1992; Emerson & Moyer, 2002; Edwards et al., 2003), железистые осадки, образуемые на выходе глубинных подземных вод на дневную поверхность (Emerson & Moyer, 1997; Sobolev & Roden, 2004), ризосфера корней растений (Emerson et al., 1999). Исследование функциональной роли нейтрофильных железобактерий в природных экосистемах осложняется неустойчивостью соединений Fe(II) в водах со слабо кислыми, нейтральными и слабо щелочными значениями pH, при которых доминируют аэробные процессы химического окисления. Известно также, что химическое окисление Fe(II) слабо выражено при низком окислительно-восстановительном потенциале в

микроаэробных или анаэробных условиях среды - подобные условия характерны для ряда экосистем современных и древних водоемов.

В связи с вышесказанным, исследование процессов анаэробного окисления Fe(II) представляет большой теоретический интерес для выяснения генезиса и условий происхождения как современных, так и древних осадочных отложений докембрия (полосчатых руд = BIF) и рудных отложений более поздних геологических эпох. Следует указать также, что немаловажное практическое значение могут иметь биологические реакции анаэробного окисления Fe(II) в процессах коррозии металлических конструкций и оборудования систем водоснабжения, нефтедобычи и, вероятно, других крупномасштабных технологических процессов.

Одним из подходов к оценке роли биологических процессов в окислительных реакциях геохимического цикла железа может быть применение методов фракционирования стабильных изотопов 56/54Fe, которые дают ценную информацию для сравнительной характеристики бактериального и химического окисления Fe(II), а также позволяют судить о скорости и масштабах их геохимической активности. Имеющиеся сведения по фракционированию стабильных изотопов 56/54Fe немногочисленны из-за слабой изученности природы механизмов фракционирования железа вследствие высоких скоростей химических реакций окисления Fe(II) в условиях нейтральной кислотности сред в континентальных и океанических водоемах (Anbar, 2004). Большое значение имеет возможность использования стабильных изотопов железа в качестве маркеров для расшифровки и понимания происхождения осадочных руд Докембрия Земли и при изучении марсианских отложений железа (Beard et al., 1999; Anbar, 2004).

Настоящая работа направлена на исследование литотрофных микроорганизмов, участвующих в процессах анаэробного окисления Fe(II), и выяснение их функциональной роли в различных водных экосистемах.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы состояла в исследовании представителей нейтрофильных литотрофных железобактерий и выяснении их распространения и роли в окислении Fe(II) в минеральных железистых источниках различного генезиса.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

1. Исследование распространения, численности и доминирующих форм литотрофных железобактерий в источниках различного происхождения.

2. Исследование новых нейтрофильных литотрофных железобактерий, их метаболизма и таксономического положения.

3. Выяснение роли литотрофных железобактерий в процессах окисления железа

в природных условиях, а именно:

а. Определение вклада железобактерий в трансформацию состава стабильных изотопов железа в низкотемпературных минеральных источниках различного происхождения и в культурах железобактерий;

б. Сравнительная оценка скоростей биогенных и абиогенных процессов окисления железа в воде минеральных железистых источников с использованием методов фракционирования стабильных изотопов 56/54Fe.

Научная новизна работы. Выделено 6 штаммов нейтрофильных литотрофных факультативно анаэробных железобактерий, среди них 4 неизвестных ранее вида железобактерий, и два штамма, относящихся к ранее описанным видам, для которых способность к окислению Fe(II) нами показана впервые. Штамм Sp-1 описан в качестве единственного представителя нового рода Ferrovibrio denitrificans gen. nov., sp. nov. в пределах класса Alphaproteobacteria. Галотолерантный штамм Hfl, выделенный из солоноводного источника, описан в качестве нового вида Hoeflea siderophila sp. nov. рода Hoeflea в пределах класса Alphaproteobacteria. Результаты исследований расширяют представления об условиях распространения, видовом и физиологическом разнообразии нейтрофильных литотрофных железобактерий в железистых природных водах различного происхождения.

В работе был применен метод фракционирования стабильных изотопов железа с целью оценки скоростей и роли бактериальных процессов окисления Fe(II) по сравнению с абиогенным в воде железистых минеральных источников. Сопоставление величин скоростей окисления, эффекта фракционирования изотопов железа (обогащения оксидов железа легким изотопом) в источниках и бактериальных культурах по сравнению с химическими процессами свидетельствует о превалирующей роли биогенного фактора в окислительных реакциях геохимического цикла железа в исследованных водных экосистемах.

Практическая значимость. Работа расширяет фундаментальные представления об условиях местообитания и видовом разнообразии нейтрофильных литотрофных железобактерий и функциональной роли биологических окислительных реакций геохимического цикла железа в пресноводных и солоноводных экосистемах. Полученные результаты могут быть использованы в соответствующих разделах учебных программ по микробиологии и экологии.

Апробация работы. Результаты диссертации были изложены на международных и российских конференциях:

III и IV Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты микробиологии» (Москва, 2007, 2008).

12 Международном симпозиуме «Microbial Ecology», ISME, 2008 (Австралия,

2008).

7 Международном симпозиуме «Subsurface Microbiology», ISSM, 2008 (Япония,

2008).

Публикации. Материалы диссертации содержатся в 9 печатных работах: 5 экспериментальных статьях и 4 тезисах.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, заключения и выводов, изложенных на 131 страницах машинописного текста и содержит 13 таблиц, 21 рисунок и список литературы из 205 наименований, из них 44 отечественных и 161 иностранных работ.

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН под руководством д.б.н., проф. Дубининой Г.А. Молекулярно-биологическая часть работы проводилась в лаборатории всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (Пущино) под руководством к.б.н. Акимова В.Н. Измерение стабильных изотопов железа проводили в ИБВВ РАН (Борок) и в Геофизической обсерватории "Борок" -филиал ИФЗ РАН (Борок).

Автор выражает глубокую признательность д.б.н. Осипову Г.А., к.х.н. Гапеевой М.В., Долотову A.B., к.б.н. Кострикиной H.A., к.б.н. Черноусовой Е.Ю., K.6.H. Детковой Е.А., к.б.н. Лысенко A.M. за помощь на отдельных этапах работы. Автор выражает особую благодарность научному руководителю д.б.н., проф. Дубининой Г.А. и д.б.н. Сорокину Д.Ю. за полезные советы и поддержку на всех этапах работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили 8 слабоминерализованных и соленых железистых источников различного происхождения, расположенных в Республике Карелия, Новгородской области, Краснодарском и Ставропольском краях. В лабораторных экспериментах использовали 6 штаммов железобактерий, выделенных из проб различных железистых источников.

Моделирование процессов микробиологического и химического окисления FeflD в воде источников. Стеклянные флаконы объемом 0.5 л наполняли на изливе каждого источника водой доверху с помощью резинового шланга, пропуская через флаконы несколько объемов воды для предотвращения контакта с кислородом, и закрывали резиновыми пробками. В каждой серии экспериментов в качестве

ингибитора микробиологических процессов вносили свежепрокипяченый раствор NaCl в воду соответствующего источника в конечной концентрации 5 или 10% NaCl (Кузнецов и Дубинина, 1989). Для оценки влияния концентрации растворенного кислорода на скорость окисления и фракционирование стабильных изотопов железа в каждой серии опытов во флаконы вводили определенный объем стерильного воздуха по ранее разработанной схеме (Подкопаева и др., 2003). Соотношение жидкой и газовой фаз во флаконах составляло 1:1 на протяжении 45-90 суток. Периодически через 2-3 суток на газовом хроматографе анализировали содержание кислорода в газовой фазе флаконов, отбирая пробы микрошприцем. При снижении заданной концентрации кислорода в флаконе вводили необходимый объем воздуха для поддержания исходной концентрации 02. В анаэробные варианты вносили нитрат в конечной концентрации 7 мМ. В начале и в конце опытов в отобранных пробах, фиксированных ацетатным буфером, анализировали содержание растворенного Fe(II), а также использовали их для анализов изотопного состава остаточного Fe(II) в воде и новообразованных оксидах Fe(III). По ходу опыта с определенной периодичностью определяли убыль содержания растворенного Fe(II).

Выделение и культивирование микроорганизмов. Для выделения и учета железобактерий из слабоминерализованных источников использовали среду следующего состава (в г/л): (Nfi^SCU - 0.3; СаС12 ■ 6Н20 - 0.05; MgS04 • 7Н20 - 0.1; NaHC03 - 0.3; фосфатный буфер 10% (рН 7.0) - 0.1; Hepes буфер (рН 7.0) - 3.0; KNO3 - 0.3; CH3COONa - 0.15; витамины и микроэлементы (Pfennig & Lippert, 1966); дистиллированная вода - 1 л, рН среды - 6.8. Для получения твердых сред добавляли агар «Дифко» - 5.0 г/л.

Для выделения и учета железобактерий из солоноводного источника использовали среду следующего состава (г/л): NaCl - 20; NH4CI - 0.3; СаСЬ • 6 НгО - 0.3; MgCl2 • 7 Н20 - 3; NaHC03 - 0.5; фосфатный буфер 10% (рН 7.0) - 0.1; Hepes буфер (рН 7.2) - 3.0; KNO3 - 0.3; CH3COONa - 0.15; витамины и микроэлементы (Pfennig & Lippert, 1966); дистиллированная вода - 1 л, рН среды - 7.0. В твердые среды добавляли агар «Дифко» - 5.0 г/л. Перед посевом в каждую пробирку добавляли свежеприготовленную суспензию FeS (Kucera & Wolfe, 1957, в модификации Halbeck & Pedersen, 2005) (Halbeck et al, 2005) из расчета 0.2 мл на 10 мл среды.

Культивирование проводили в пробирках Хангейта, заполненных доверху свежепрокипяченой агаризованной или жидкой средой. Численность железобактерий определяли методом предельных десятикратных разведений по образованию колоний, накапливающих оксиды Fe(III).

Содержание Fe(II) определяли колориметрическим методом с а,а-дипиридилом на спектрофотометре КФК-3 («Фотометр», Россия) (Резников и др., 1970).

Белок клеточной биомассы определяли методом Лоури. Суспензию клеток, содержащую оксиды железа, предварительно обрабатывали 1% раствором щавелевой кислоты в течение 5 мин.

Изучение Фенотипических и хемотаксономическнх свойств чистых культур нейтрофильных литотрофных железобактерий проводили с помощью стандартных методов, используемых в микробиологической практике.

Молекулярно-биологические методы. Для экстракции ДНК из клеток железобактерий использовали модификацию метода (Ausubel et al., 1994) с дополнительными этапами быстро чередующихся циклов замораживания и оттаивания (Bej et al., 1991). Амплификацию гена 16S рРНК проводили на приборе GeneAmp PCR System 2700 («Applied Biosystems», США). Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL («Beckman Coulter», США) в соответствии с протоколом, предлагаемым фирмой. Для нахождения близкородственных организмов нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК сравнивали с последовательностями известных штаммов в базе NCBI. Последовательности выравнивали с соответствующими последовательностями ближайших видов с помощью программы CLUSTAL X (Thompson et al., 1997). Филогенетические деревья конструировали с помощью программы TREECON (Van de Peer & De Wächter, 1994).

Анализ изотопного состава 56/54Fe. Для анализа использовали воду, осадки источников и образовавшиеся в ходе модельных экспериментов или в бактериальных культурах оксиды железа, которые растворяли в смеси 2 мл Н3РО4 (95%) и 4 мл HNO3 (65%). Через 20 мин добавляли 4 мл бидистиллированной воды. Реакционную смесь нагревали в микроволновой печи SpeedWave MWS-3+. Изотопные соотношения определяли методом вилки = bracketing technique (Maréchal et al., 1999; Icopini et al., 2004). Измерение изотопных соотношений железа со средним стандартным отклонением 0.48% проводили на масс-спектрометре DRC-e ICP-MS («Perkin Elmer», США) при оптимальных условиях анализа соотношений стабильных изотопов 56/54Fe (Долотов и др., 2008) и рассчитывали, используя общепринятое математическое выражение:

5S6Fe = (([56Fc]/[54Fe])o6p / ([56Fe]/[54Fe])CT - 1) * 1000%», где ([56Fe]/[54Fe])o6P, и ([56Fe]/[54Fe])CT отношения 56Fe и 54Fe атомов железа в анализируемом образце и стандарте, соответственно. В качестве стандарта

использовали международный стандарт соотношений изотопов [56Fe]/[54Fe] для земной коры, равный 12.0119 («Perkin Eimen), США).

Все опыты проводили не менее трех раз, на рисунках и в таблицах приведены усредненные результаты представительных экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Распространение и численность железобактерий в железистых источниках различного генезиса

Краткая характеристика исследованных источников представлена в таблице 1.

Микроскопический анализ свежеосажденных железистых осадков на месте выходов источников и далее по ходу стока в желобах и взвешенных в болотной воде оксидов железа выявил, что они представлены в основном биологическими образованиями — ожелезненными структурами известных морфотипов железобактерий, а также палочковидными бактериями, покрытыми ожелезненными капсулами. Неожелезненные клетки практически отсутствовали или в препарате обнаруживались лишь единичные экземпляры. Аморфные оксиды железа, не ассоциированные с бактериальными клетками, составляли лишь незначительную часть анализируемых осадков. Сходная картина получена при микроскопическом анализе стекол обрастания и щелевых пелоскопов, экспонированных вертикально в осадки и водные слои источников, желобов и болот. Сравнительный микроскопический анализ выявил доминирующие морфотипы известных железобактерий (Gallionella, в качестве минорных компонентов - Toxothrix и Leptothrix) и различия в качественном и количественном составе сообществ железобактерий в свежеосажденных осадках различных источников (табл. 1).

Численность одноклеточных литотрофных железобактерий, способных к анаэробному росту, в воде на изливе всех исследуемых источников не превышала 10 кл/мл, а в верхнем слое рыхлого железистого осадка на выходе источника при контакте с водой составляла 105—107 кл/мл. Наименьшая численность, 105 кл/мл, обнаружена в мышьяковистых водах (концентрация As = 3 мг/л) Чвижепсинского источника и в источнике Долина Нарзанов. Необходимо отметить, что концентрация Ог в нижних слоях воды на границе с исследуемым осадком не превышала 0.1 мг/л. Таким образом, развитие железобактерий и окисление Fe(II) с их участием в воде источников происходило в строго микроаэробных условиях при концентрации Ог 0.05-0.1 мг/л. В источниках № 8 и № 1 при слабом дебете концентрация 02 в воде была выше, порядка 0.3-0.5 мг/л. Именно в этих условиях отмечено массовое

развитие микроаэробных железобактерий рода СаШопеПа, так же, как в прилегающих заболоченных участках, куда осуществляется сток железистых вод.

Таблица 1. Характеристика железистых источников, численность и доминирующие морфотипы железобактерий в свежеосажденных железистых осадках минеральных источников различного генезиса

Район исследований и генетическая связь месторождения мин. вод с коренными породами Источник Минерализация, г/л FeJ\ мг/л Температура, "С pH Доминирующие морфотипы железобактерий Численность одноклеточных железобактерий, кл/мл *

Новгородская область (Девон) №8 20 3 8°С 7.0 СаШопеПа, одноклеточные 107

Республика Карелия (Архей-прогерозой) № 1 0.3 16 9°С 6.4 СаШопеПа, одноклеточные, ЬерМЬга** 107

№3 0.56 63 5°С 6.3 Одноклеточные 106

№4 0.9 126 5.4°С 6.2 Одноклеточные ТохоЛгга** ю7

Краснодарский край (Палеоген) «Марка» 1.2 3 40°С 8.0 Одноклеточные ю7

№ 4ж 1.5 2 11°С 7.5 ю6

Краснодарский край (Юра) «Чвиже-псинский» Н.д. 3.5 10°С 6.3 ю5

Ставропольский край (-) «Долина Нарзанов» Н.д. 7 15°С 6.5 10!

Примечание: «Н.д.» - нет данных; «*» - определено методом посева на элективные питательные среды для анаэробных литотрофных железобактерий; «**» - минорный компонент сообщества железобактерий.

2. Новые нейтрофильные литотрофные железобактерии железистых источников различного генезиса

Из исследуемых источников выделено 6 штаммов литотрофных

железобактерий (рис. 1, табл. 2). Все штаммы, согласно результатам

филогенетического анализа, оказались представителями различных классов

Proteobacteria. Среди выделенных изолятов 4 штамма имели сходство

последовательностей гена 16S рРНК в пределах 89-98.5 %, отличаясь от ближайших

таксонов на видовом или родовом уровне (штаммы Sp-1, Obr-1, DNZ-1, Hfl). Два

штамма, Ас-1 и Мас-2, имели 99.8-99.9 % сходства с представителями известных

таксонов Acidovorax facilis и Cupriavidus metallidurans и отнесены к этим видам,

соответственно. В отличие от указанных видов новые штаммы обладали способностью к миксотрофному росту с использованием Fe(II) в качестве донора электронов. Два из выделенных штаммов, Sp-1 и Hfl, были охарактеризованы таксономически. Ниже приводится их характеристика.

Рис. 1. Морфология клеток железобактерий, выделенных из железистых минеральных источников различного генезиса а - штамм Hfl; б - Мас-2; в - Obr-4; г - Sp-1;

а-г - фазово-контрастный микроскоп, шкала 1 мкм.

Таблица 2. Филогенетическая характеристика литотрофных железобактерий, выделенных из железистых минеральных источников разного генезиса

Штамм Место отбора проб Морфология клеток Ближайшие культивируемые представители

Класс Семейство Род Вид сходство гена 16S pPHK, %

Sp-1 Термальный источник «Марка», Краснодарский край Тонкие вибрионы Alphaproteo-bacteria Entero-bacteriaceae Inquilinus /. limosus 89

Obr-4 Источник № 4ж, Краснодарский край Утолщенные палочки Gammaproteo bacteria Xantho-monadaceae Dokdonella D. koreensis 92

DNZ-1 Источник «Долина Нарзанов», Ставропольский край Короткие слабо изогнутые палочки Alphaproteo-bacteria Rhizo-biaceae Rhizobium R. daejeonense 98.2

Hfl Соленый источник № 8, Новгородская обл. Тонкие изогнутые палочки Alphaproteo-bacteria Phyllo-bacteriaceae Hoeflea H. phototrophica 98.5

Ac-1 Источник № 4ж, Краснодарский край Мелкие палочки Betaproteo-bacteria Comamo-nadaceae Acidovorax A. facilis 99.8

Mac-2. Источник «Чвижепсинский», Краснодарский край Короткие сильно изогнутые палочки Betaproteo-bacteria Burkholde-riaceae Cupriavidus C. metallidurans 99.9

шш P'l

ж шящ

2.1. Характеристика штамма Sp-1

Согласно результатам полифазного анализа, штамм Sp-1 (рис, 2) имеет ряд существенных отличий от представителей ближайших родов Sneathiella, Inquilinus, Oceanibaculum и Phaeospirillum в пределах класса Alphaproteobacteria. Наиболее важными являются способность к литотрофному росту за счет окисления Fe(II) в анаэробных или микроаэробных условиях, различия в составе жирных кислот и в содержании Г+Ц в ДНК. Штамм Sp-1 имеет различия в нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК 10.6-12% от ближайших известных представителей, что позволяет отнести его к новому роду, названному Ferrovibrio gen. nov. в пределах класса Alphaproteobacteria с видовым названием Ferrovibrio denitrificans gen. nov. sp. nov.

Рис. 2. Морфология клеток штамма 8р-1

а - фазово-контрастный микроскоп, препарат из среды без Ре(П); б — обильная инкрустация железом; в -тотальный препарат из среды без Ре(П); г — начальная стадия инкрустирования железом в экспоненциальной стадии роста, д -ультраструктура клетки из среды без Ре(П), б-д - электронный микроскоп; шкала 1 мкм.

Таксономическое описание Ferrovibrio gen. nov.

[ferro.vi.bri.o L. n.ferrum железо; N. L. mase. n. vibrio вибриоидные клетки; N. L. mase. n. Ferrovibrio железоокисляющий микроорганизм вибриоидной формы].

Клетки вибриоидной формы, подвижные за счет одного полярно расположенного жгутика. Размножение происходит путем бинарного деления. Клеточная стенка грамотрицательного типа. Использует в качестве источника углерода и энергии органические кислоты, спирты, аминокислоты, а также дрожжевой экстракт и пептон. В клетках обнаружена оксидазная активность и

низкая каталазная активность. Факультативный анаэроб, использующий окисленные соединения азота в качестве акцептора электронов при органотрофном и миксотрофном росте. Использует Fe(II) в качестве донора электронов. Отложение оксидов Fe(III) происходит на поверхности клеток. Полярные липиды мембран клеток: фосфатидилэтаноламин и два неидентифицируемых аминофосфолипида. Главный дыхательный липохинон - убихинон Qi0. Преобладающие жирные кислоты клеток: 18:1со7с, 19:0 сус, 16:0. Содержание Г+Ц в ДНК - 64.2 мол. %.

Типовой вид рода Ferrovibrio denitrificans sp. nov.

Таксономическое описание Ferrovibrio denitrificans sp. nov.

[de.ni.tri'fi.cans M. L. v. denitrifico денитрифицировать; M. L. part. adj. denitrificans денитрифицирующий].

Помимо характеристик, указанных при описании рода, новый вид имеет следующие свойства. Клетки представлены короткими тонкими вибрионами размером 0.3 х 0.8-1.3 мкм. Температурные пределы роста 5-45°С с оптимумом 35°С, диапазон pH 5.5-8, с оптимумом 6.2. Устойчив до 2.5 % к NaCl в среде. Штамм Sp-1 способен к органотрофному или миксотрофному росту с использованием Fe(II) в качестве донора электронов. Способен к аэробному органотрофному росту с использованием в качестве источника углерода и энергии ацетата, сукцината, цитрата, лактата, маната, фумарата, пропионата, пирувата, бутирата, пропанола, глицерина, дрожжевого экстракта, пептона. Слабый рост происходит за счет использования ряда аминокислот: аланина, гистидина, аспарагиновой и глутаминовой кислот. Не использует сахара, оксалат, формиат, бензоат, этанол, бутанол, пролин, лейцин, аспарагин, глутамин, фенилаланин, триптофан, гидролизат казеина. Источники азота — аммонийные соли, NO3 , N2O, мочевина, дрожжевой экстракт, пептон, не использует: NO2", гистидин, аспарагиновую кислоту, гидролизат казеина. Не способен к анаэробному росту с СЮ4", S°, S2O32", Fe(OH)3 в качестве акцепторов электронов. Н2 при росте на минеральной среде с нитратами не может служить в качестве донора электронов. Чувствителен к амикацину, линкомицину, неомицину, полимиксину, стрептомицину, рифампицину, налидиксовой кислоте. Устойчив к ампициллину, бацитрацину, ванкомицину, гентамицину, канамицину, микостатину, новобиоцину, пенициллину, тетрациклину. Содержание Г+Ц в ДНК - 64.2 мол. %.

Типовой штамм SplT депонирован в GenBank под номером GQ365620 и помещен в коллекции LMG 25817т и VKM В-2673т. Выделен из умеренно термального минерального железо-сульфидного источника «Марка» Псекупского месторождения минеральных вод (Северный Кавказ, Россия).

2.2. Характеристика штамма Hfl

Согласно результатам полифазного анализа второй исследуемый штамм, Hfl (рис. 3) является членом филогенетического кластера рода Hoeflea, но занимает обособленное положение в пределах этого рода.

Результаты исследования фенотипических, хемотаксономических свойств и филогенетического анализа штамма Hfl свидетельствуют о его видовой независимости от ближайших представителей и позволяют описать его в качестве нового вида рода Hoeflea в пределах семейства Phyllobacteriaceae порядка Rizobiales класса Alphaproteobacteria. Новый вид назван Hoeflea siderophila sp. nov.

Рис. 3. Морфология и ультраструктура клеток штамма Hfl

а — инкрустирование клеток железом; б - фазово-контрастный микроскоп,

препарат клеток, при росте в органогетеротрофных условиях из среды без Fe(II); в - клетки, контрастированные ФВК; г -ультраструктура клетки из среды без Fe(II); а, в, г — электронный микроскоп; шкала 1 мкм.

Таксономическое описание Hoeflea siderophila sp. nov.

[Si.de.ro'phi.la. L. n. sidero железо; N. L. masc. adj. philus любить; N. L. fem. adj. siderophila железолюбивая].

Тонкие слегка изогнутые палочки размером 0.4 х 0.9-2.2 мкм с одним полярно расположенным жгутиком. Размножение происходит бинарным делением, способен к образованию розеток. Клеточная стенка грамотрицательного типа. Факультативный анаэроб. Оптимальные значения и пределы роста: pH 7.5 (6.2-8.5), температура 30°С (9-38°С), соленость среды 1% NaCl (0.1-8.5%). Штамм Hfl способен к органотрофному или миксотрофному росту с использованием Fe(II) в качестве донора электронов за счет редукции ЫОз~ и N20, с образованием оксидов железа на поверхности клеток.

В клетках обнаружена оксидазная активность и низкая каталазная активность. При аэробном органотрофном росте штамм Hfl использует в качестве источника

углерода ацетат, сукцинат, цитрат, лактат, малат, фумарат, пропионат, пируват, бутират, пропанол, глицерин, широкий спектр Сахаров, таких как рибоза, ксилоза, арабиноза, глюкоза, фруктоза, L-сорбоза, галактоза, D-манноза, 2-дезоксиглюкоза, сахароза, D-лактоза, трегалоза, D-мальтоза, целлобиоза, мелибиоза, декстроза, мелицитоза, D-раффиноза, L-рамноза, а также Ь,СН3-глюкозид, D-глюкуроновая кислота, мезоинозит, М-эритрит, L-арабинит, D-глюкозамин, N-ацетилглюкозамин, декстрин, гликоген, дрожжевой экстракт, пептон. Слабый рост происходит в средах с некоторыми аминокислотами: фенилаланином, триптофаном, гистидином. Не использует оксалат, формиат, бензоат, этанол, бутанол, пролин, лейцин, аланин, аспарагин, глутамин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты, гидролизат казеина. Источники азота - аммонийные соли, N03~, N2O, мочевина, дрожжевой экстракт, пептон, не использует: NC^-, гистидин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты, гидролизат казеина. Не способен к анаэробному росту с С104~, S°, S2O32", Fe(OH)3 в качестве акцепторов электронов. При росте на минеральной среде Н2 не использует в качестве донора электронов. Преобладающие жирные кислоты клеток: 11-октадеценовая (18:1ш7с) 60.48%, гексадекановая (16:0) 14.65%, 11-метил-октадеценовая (11-Methyl 18:1со7с) 10.94%. Чувствителен к полимиксину, рифампицину и тетрациклину и устойчив к амикацину, бацитрацину, канамицину, микостатину и пенициллину. Содержание Г+Ц в ДНК - 57.5 мол. %.

Типовой штамм HflT депонирован в GenBank под номером EU670237 и помещен в коллекции DSM 21587т, VKM А7094т. Выделен из солоноводного железистого источника курорта Старая Русса (Новгородская область, Россия).

3. Анаэробный метаболизм новых литотрофных железобактерий

Физиолого-биохимические исследования окисления Fe(II) у новых представителей железобактерий были проведены при культивировании в анаэробных условиях, хотя оба вида обладали способностью использовать Ог в качестве акцептора электронов при окислении Fe(II) в микроаэробных условиях. Это было вызвано необходимостью избежать конкуренции с процессами быстрого химического окисления Fe(II) в опытах.

Биохимический анализ ферментов, участвующих в цепи последовательных реакций восстановления нитрата при окислении Fe(II), показал существенные различия в их активности. Так, активность нитратредуктазы у Н. siderophila составляла 30 нмоль в мин/мг белка, а нитритредуктазы была в 50 раз ниже и не превышала 0.6 нмоль в мин/мг белка. Сходная картина отмечена у F. denitrißcans:

при активности нитратредуктазы 46 нмоль в мин/мг белка, активность нитритредуктазы составляла 1.4 нмоль в мин/мг белка, т.е. в 30 раз ниже.

Наличие дисбаланса в активностях ферментов цепи реакций восстановления нитратов приводило к образованию в культурах Н. siderophila и F. denitrificans эквимолярных концентраций нитрита до 4.5 мМ, оказывающего, как известно, токсическое воздействие на бактериальные клетки (Benz et al., 1998). Однако, накопление N02~ выше 0.15 мМ в среде не происходило как следствие химического взаимодействия с Fe(II). При замене N03" на газообразную закись азота, N20 в качестве акцепторов электронов при окислении Fe(II), рост обоих видов железобактерий сопровождался накоплением N2 в газовой фазе, и ингибирования роста клеток не было отмечено на протяжении 17 суток эксперимента (рис. 4). Полученные результаты позволяют констатировать наличие и функционирование у исследуемых железобактерий «разорванной» цепи денитрификации:

N03" — N02~ — 1 — N20 — N2

Рис. 4. Соотношение убыли Ее(Н) и накопления биомассы клеток при анаэробном росте штамма Н. ь1йегорМ1а на среде с ацетатом 50 мг/л в атмосфере аргона.

а) с ЫОз" - в качестве акцептора электронов; б) с И20 — в качестве акцептора электронов.

При анаэробном органотрофном росте при увеличении концентрации ацетата в среде до 500 мг/л за короткий срок (7 суток) происходило накопление 6.4 мМ нитрита, что приводило к остановке бактериального роста. Не исключено, что низкой активностью нитритредуктазы объясняется восстановление нитратов только до нитритов у большой группы известных органогетеротрофных денитрифицирующих микроорганизмов.

Результаты рассмотренных выше опытов приведены для Н. siderophila. Для Р. denitriflcans получены сходные результаты, с незначительными количественными различиями.

Новый вид Н. .■¡МегоркИа способен к органогетеротрофному росту на ацетате в анаэробных условиях с газовой фазой аргон-Кт20 с максимальным потреблением ацетата 8.3 мг/мг белка (табл. 3). При добавлении в среду РсЭ04 клеточный урожай увеличивался на 25%, при этом потребление ацетата на синтез белка клеток в конструктивном метаболизме снижалось на 23%. При исключении ацетата из среды рост был незначительным, величина клеточного урожая не превышала 4 мг белка/л, но расход окисленного Ре(Н) возрастал в 2 раза, до 13 мг/мг белка по сравнению с миксотрофным ростом в присутствии ацетата.

Параллельно был отмечен слабый, но устойчивый рост, с образованием 2 мг белка/л в течение длительного времени на минеральной среде в анаэробных условиях в отсутствие восстановленного железа и ацетата. По-видимому, прирост белка происходил при органогетеротрофном росте за счет следовых количеств загрязняющих органических соединений, поступающих из газовой фазы, как это было показано для других микроорганизмов.

Поэтому в случае строгой лимитации конструктивного метаболизма клеток органическим веществом и увеличении количества окисленного Ре(Н) на единицу белка, вероятно, рост бактерий был обусловлен использованием загрязняющих органических веществ только в конструктивном метаболизме, а окисление Ре(П) — в энергетическом, т.е был строго литогетеротрофным.

Проведенный молекулярно-генетический анализ функциональных генов автотрофии клеток обоих видов свидетельствует об отсутствии генов ключевых ферментов цикла Кальвина (РУБИСКО) или восстановительного цикла трикарбоновых кислот (изоцитратлиазы), что подтверждает отсутствие способности к литоавтотрофному росту.

Таким образом, виды Н. $1<1егорЫ1а и Р. ¿еп'йпАсат при окислении железа способны к миксотрофному и литогетеротрофному росту, последний тип метаболизма следует рассматривать как один из вариантов миксотрофии.

Таблица 3. Соотношение убыли Ре(Н), потребления ацетата и прироста белка клеток Н. ¡1с1егор1и1а при различных условиях культивирования

Условия культивирования Содержание Реал, мг/л Содержание ацетата, мг/л Прирост белка клеток, мг/л Расход Ре, мг/мг белка Расход ацетата

Исх. 30 суток Исх. 30 суток мг/мг белка %

+ РеБОд + ацетат 70 25 50 0 7.5 6 6.7 100

- РеЭОд + ацетат - 50 0 6 - 8.3 123

+ РеБСЬ - ацетат 70 | 18 - 4 13 -

- РеБОд - ацетат - - 2 - -

Контроль (убитые клетки) 70 60 - 0 - -

4. Роль микроорганизмов в окислении Ее(Н) в природных водах минеральных железистых источников различного генезиса

4.1. Фракционирование стабильных изотопов железа в культурах железобактерий в микроаэробных и анаэробных условиях

С целью выяснения вклада бактериальных окислительных реакций в дифференциацию изотопного состава железа проанализирован изотопный состав оксидов железа, образуемых в чистых и накопительных культурах железобактерий, (табл. 4) при анаэробном нитратзависимом росте, заведомо исключающем активное протекание химических окислительных процессов.

Рост бактерий при окислении РеБ в жидкой среде с нитратами сопровождался образованием на дне флакона оксидов Ре(Ш) в виде рыхлого осадка. В чистых и накопительных культурах железобактерий отмечен существенный сдвиг в изотопном составе образованных оксидов железа в сторону обогащения легким изотопом, 54Ре в 2-8.8 раз по сравнению с исходным железом (табл. 4).

Таблица 4. Фракционирование стабильных изотопов железа в культурах литотрофных железобактерий в анаэробных условиях в средах с нитратом

Место выделения культур железобактерий Условия культивирования Исследуемый образец 6 56/54Fe, %*

Источник № 8 курорта Старая Русса, штамм Hfl Агаризо ванная среда + РеБ (анаэробные условия) Опыт (штамм Hfl) Охристые колонии -10 200

Контроль (без бактерий) Ре(П) в толще агаровой среды из осадка Ре8 -5 100

Источник № 4ж Псекупского месторождения мин. вод Агаризованная среда + РеЭ (микроаэробные условия) Опыт (накопительная культура железобактерий) Оксиды Ре(Ш) в колониях бактерий над слоем РеЭ -41 680

Оксиды Ре(Ш) из зон роста бактерий над слоем РеБ -53 880

Контроль (без бактерий) Ре(Н) в толще агаровой среды из осадка РеЭ -6 100

Жидкая среда + РеБ (анаэробные условия) Опыт (накопительная культура железобактерий) Бактериальный осадок оксидов Ре(Ш) со дна флакона -47 470

Контроль (без бактерий) РеБ из осадка на дне флакона -10 100

Примечание: Здесь и далее в таблицах «*» - соотношение значений опыт и контроль, в %; «Опыт» - суммарный эффект биологического и абиогенного окисления; «Контроль» - абиогенное окисление.

4.2. Изотопный состав железа в образцах воды источников, прилегающих болот и в железистых осадках

В таблице 5 представлены результаты определения состава стабильных изотопов 5б/54Ре в воде источников, стоков и прилегающих болот и в железистых осадках по ходу стока вод. Сопоставление величин изотопного состава растворенного Ре(Н) воды и образуемых охристых осадков Ре(Ш) свидетельствуют о преобладании в их составе легкого изотопа (54Ре). В наибольшей степени легким изотопом обогащены свежеосажденные оксиды железа на выходе источников и в верхних горизонтах охристых образований в болотах, а также самые поверхностные слои осадков, образуемые по ходу стока источников по желобам.

Таблица 5. Изменение соотношения стабильных изотопов железа природных образцов осадков Ре(Ш) в источниках и прилегающих болотах месторождения «Марциальные воды» и курорта Старая Русса

Место отбора проб Исследуемый образец 6 5"мРе, %*

Марциальные воды, Карелия Источник № 1 Источник Вода -14 100

Соскобы железистых осадков в трубе на выходе источника -25 180

Прилегающее болото Свежеосажденный рыхлый железистый осадок -42 300

Источник №2 Источник Вода -16 100

Свежеосажденный железистый осадок на изливе источника -27 170

Источник №3 Источник Вода -16 100

Железистый осадок на выходе источника -19 120

Прилегающее болото Свежеосажденный железистый осадок -36 225

Источник №4 Источник Вода -19 100

Свежеобразованный осадок на изливе источника -39 205

Старая Русса, Новгородская область Источник №8 Источник Вода -11 100

Свежеосажденная взвесь железистого осадка ^>3 390

4.3. Фракционирование стабильных изотопов Ре в модельных экспериментах

Результаты модельных экспериментов по влиянию кислородного режима водной среды и исходной концентрации Ре(Н) в минеральных источниках на скорость окислительных процессов и эффективность фракционирования стабильных изотопов железа представлены в таблице 6. При сопоставлении полученных результатов обнаруживается четкая зависимость дифференциации изотопного

состава в образуемых оксидах железа Ре(Ш) по сравнению с растворенным Ре(Н) исходной воды.

Максимальное обогащение образуемых оксидов железа легким изотопом 54Ре происходило при биологическом окислении железа в контролируемых микроаэробных условиях при минимальных концентрациях растворенного кислорода в опытах порядка 0.1-0.3 мг/л (в 1.9-4.7 раза), в меньшей степени - при слабом анаэробном окислении при внесении в образцы воды нитратов (в 1.6-2.9 раза).

Таблица 6. Зависимость скорости бактериального и химического окисления и величин фракционирования стабильных Изотов железа от кислородного режима и исходной концентрации Рс(П) в воде железистых источников месторождения «Марциальные воды» и курорта Старая Русса

Кислородный режим Вариант опытов Ее(1Г) в воде Ге(Ш) в осадках

Исходное содержание, мг/л Окислено Ре(П), % 8 56/54Ре, %о %*

Источник № 1

Микроаэробный Опыт 16 100 -75 470

Контроль 50 -16 100

Анаэробный** Опыт -22 160

Контроль -14 100

Источник № 3

Аэробный Опыт 63 90 -23 130

Контроль 73 -18 100

Анаэробный** Опыт 4 -47 290

Контроль 1.6 -16 100

Источник № 4

Аэробный Опыт 126 99 -18 140

Контроль 63 -13 100

Микроаэробный Опыт 99 -25 190

Контроль 34 -13 100

Источник № 8

Микроаэробный Опыт 11 100 -22 200

Контроль 36 -11 100

Примечание: «**» - при добавлении в воду ЫОз в конечной концентрации 7 мМ, см. методы.

В условиях свободного доступа воздуха (насыщение воды кислородом - 9.5 мг/л и температуре около 10-12°С) при высокой скорости окисления Ре(Н) отмечены минимальные величины фракционирования изотопов как при бактериальных, так и, особенно, при абиогенных процессах. Это может быть обусловлено тем, что в аэробных условиях при нейтральных значениях рН воды источников в опытных

флаконах с бактериальным материалом одновременно весьма активно протекали процессы химического окисления. При высокой скорости окислительных процессов в аэробных условиях эффективность дифференциации изотопного состава и относительное облегчение оксидов железа заметно снижалась во всех случаях, по сравнению с микроаэробными и анаэробными условиями, оставаясь, однако, в 1.3— 1.4 раза ниже в вариантах химического окисления по сравнению с бактериальным. Во всех опытных вариантах по сравнению с контрольными независимо от кислородного режима и исходной концентрации Ре(Н) в воде скорость бактериального окисления железа была в 1.2-2.9 раза выше.

В отличие от процессов аэробного окисления, при которых эффект обогащения легким изотопом конечных продуктов, оксидов Ре(Ш), отражает суммарный результат как биологических, так и химических реакций, при нитратзависимом анаэробном бактериальном окислении Ре(П) регистрируются величины изотопной дифференциации преимущественно в реакциях биогенного характера.

Исходная концентрация растворенного Ре(Н) в пределах 11-126 мг/л не оказывала заметного влияния на эффективность фракционирования стабильных изотопов как при бактериальном, так и при химическом окислении.

Обнаруженные на источниках «Марциапьных вод» закономерности дифференциации стабильных изотопов железа при биологических и абиогенных окислительных процессах практически не отличались от полученных при исследовании соленого источника № 8 Старой Руссы (табл. 6).

Учитывая более низкую скорость фракционирования изотопов железа в абиогенных реакциях по сравнению с бактериальными, следует подчеркнуть, что измеряемые величины изотопного состава образуемых оксидов железа в опытных вариантах модельных экспериментов ниже реальных в 1.2-1.8 раза и, в действительности, отражают лишь суммарный эффект фракционирования биологических и химических процессов.

Из приводимых результатов следует, что дифференциация изотопного состава 56/54Ре в исследованных водных экосистемах — воде железистых источников и прилегающих болотах, куда осуществлялся сток железистых вод подземных источников, определяется, по меньшей мере, двумя основными факторами: механизмом окислительных реакций (биологических или химических) и окислительной обстановкой внешней среды. Максимальный эффект фракционирования стабильных изотопов железа 56/54Ре и обогащения образуемых нерастворимых оксидов Ре(Ш) легким изотопом, 54Ре, проявляется в биологических реакциях, протекающих в микроаэробных условиях при содержании растворенного кислорода не выше первых долей мг/л (0.1-0.3 мг/л) или в анаэробных средах за

счет нитратного дыхания. Как показали наши исследования метаболизма чистых культур литотрофных железобактерий, подобные условия микроаэробного и анаэробного роста оптимальны для бактериального окисления Ре(П) нейтрофильными железобактериями. Последнее подтверждается и микроскопическими анализами состава осадков свежеобразованных оксидов Ре(Ш) на изливах источников и в болотах (где концентрация кислорода не превышала 0.10.3 мг/л). Они представлены исключительно ожелезненными одноклеточными бактериальными клетками в большинстве исследованных источников, редко стебельками СаШопеНа или тончайшими структурами ТохогИпх trichogenes, покрытыми аморфными отложениями оксидов железа. В природных средах подобные ожелезненные биогенные структуры с течением времени преобразуются в плотные отложения минералов гетита и гидрогетита (в меньшей степени), которые накапливаются в более глубоких слоях железистых отложений по ходу стока ручьев либо подвергаются в донных отложениях диагенетическим преобразованиям с участием бактериальных редукционных процессов (сульфат- и железоредукции) и сопровождаются образованием аморфных или кристаллических структур осадков РеБ, пирита, магнетита и др. Образование кристаллов магнетита и пирита обнаружено в градиентных условиях редокс-зоны образцов осадков болотца, прилегающего к источнику № 1, а также в анаэробных средах чистых культур нейтрофильных железобактерий, выделенных из минерального железистого источника Псекупского месторождения.

Приведенные результаты исследований свидетельствуют о ведущей роли биологических процессов по сравнению с абиогенными процессами в дифференциации изотопного состава отложений соединений железа и в скорости их образования в современных водных системах, обогащенных растворимым железом. Из вышеприведенных материалов о зависимости скорости окислительных процессов и трансформации изотопного состава железа от окислительного режима следует, что на границе редокс-зоны в микроаэробных условиях и нижележащих анаэробных горизонтах действие биогенного фактора, по сравнению с абиотическим, должно многократно усиливаться.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на интенсивно проводившиеся исследования литотрофных железоокисляющих микроорганизмов за последние два десятилетия, информация о видовом разнообразии, распространении и их функциональной роли в окислительных реакциях геохимического цикла железа остается ограниченной. К началу наших исследований были известны лишь аэробные литоавтотрофные

нейтрофильные железобактерии рода СаШопеНа и несколько неидентифицированных штаммов одноклеточных факультативно анаэробных литотрофных железобактерий.

Анализ разнообразия железобактерий и специфики состава литотрофных железобактерий в исследуемых экосистемах в воде и осадках железистых источников определяются условиями местообитания, прежде всего, кислородным режимом. Доминирующими железобактериями во всех источниках различного происхождения и химического состава вод были одноклеточные литотрофные железобактерии различных таксономических групп. Их численность в свежеосажденных осадках составляла 105-107 кл/мл. В отдельных экосистемах, при концентрации Ог не более 1 мг/л, отмечено массовое развитие в осадках микроаэрофильных автотрофных железобактерий рода СаШопеПа (болота, источники № 8 и № 1). Известные представители гетеротрофных железобактерий не были обнаружены в источниках ввиду чрезвычайно низкой продуктивности систем и низкой концентрации доступного органического вещества в глубинных водах на выходе на дневную поверхность.

При решении вопросов о роли биогенного фактора в процессах окисления Ре(Н) и в дифференциации изотопного состава в ходе образования оксидов Ре(Ш) в работе был использован комплексный подход. Он сочетал одновременное исследование качественного состава сообществ и численности микроорганизмов, участвующих в трансформации соединений железа, их активности в дифференциации изотопного состава окисляемого Ре(Н), а также специфики метаболизма доминирующих в сообществе представителей групп нейтрофильных литотрофных железобактерий. В значительной степени решению поставленных задач способствовало изучение процессов окисления железа в природных водоемах и влияния на них физико-химических факторов водной среды. Эти задачи выполнялись с использованием серии модельных экспериментов и применения ингибиторного анализа для дифференциации процессов биогенной и абиогенной природы.

В ходе исследований из различных минеральных источников методом предельных разведений исследуемых образцов на питательных средах были выделены 6 чистых культур, доминирующих в сообществах представителей литотрофных железобактерий. Большинство из них, на основании результатов филогенетического анализа представляли новые таксоны уровня рода (2 штамма) или вида (2 штамма). Способность к окислению Ре(Н) при миксотрофном росте обнаружена еще у четырех штаммов, в том числе у двух штаммов, принадлежащих к ранее описанным видам, для которых это свойство не было известно.

Приведенное детальное исследование двух штаммов с использованием фено-, генотипических и хемотаксономических свойств позволили описать новый род Ferrovibrio gen. nov. с новым видом Ferrovibrio denitrificans sp. nov. и новый вид Hoeflea siderophila sp. nov. в пределах класса Alphproteobacteria. Исследование метаболизма новых видов F. denitrificans и Н. siderophila показало, что они обладают широкими метаболическими возможностями и способны, помимо органотрофного, к миксотрофному росту в микроаэробных и анаэробных условиях, в последнем случае за счет восстановления окисленных соединений азота, NO3 или N20.

Результаты физиолого-биохимических исследований анаэробного метаболизма новых видов привели к заключению о функционировании в клетках «разорванной» цепи денитрификации, когда вследствие больших различий (в 30-50 раз) в активностях ферментов нитрат- и нитритредуктазы, протекает лишь первый этап восстановления N03~ до N02~ с последующим ингибированием клеточного роста образующимся нитритом. Однако, при замене ЫОз~ на N20 в качестве акцептора электронов, клетки обоих видов активно росли анаэробно органотрофно или литотрофно при окислении Fe(II), восстанавливая N20 до N2.

Анализы результатов модельных экспериментов по фракционированию изотопного состава 56/54Fe в исследованных водных экосистемах показали, что дифференциация и скорость окисления Fe(II) определяется, по меньшей мере, двумя основными факторами: механизмом окислительных реакций (биологических или химических) и окислительной обстановкой внешней среды. Во всех случаях в культурах железобактерий и в опытных вариантах модельных систем эффект обогащения легким изотопом 54Fe был в 1.3-8.8 раз выше (главным образом, в зависимости от кислородного режима) по сравнению с вариантом химического окисления. Максимальный эффект фракционирования стабильных изотопов железа в 4.7-8.8 раз выше отмечен в культурах железобактерий в отсутствие химического окисления Fe(II) в анаэробных условиях. Сопоставление величин фракционирования изотопов железа (обогащение осадков оксидов железа легким изотопом) в модельных экспериментах, в культурах железобактерий, в природных осадках исследованных источников, а также прилегающих болот, свидетельствуют о превалирующей роли биогенного фактора по сравнению с абиогенным в дифференциации изотопного состава отложений оксидов железа и в скорости процессов окислительной ветви геохимического цикла железа в современных водных системах, обогащенных растворенным железом.

выводы

1. Обнаружено, что нейтрофильные литотрофные железобактерии различных физиологических групп и морфотипов являются доминирующими компонентами в бактериальных сообществах 8 минеральных железистых источников различного происхождения и химического состава воды. Специфика качественного состава литотрофных железобактерий в биотопах определяется преимущественно кислородным режимом, в меньшей степени - концентрацией растворенного железа. Численность одноклеточных факультативно анаэробных литотрофных железобактерий во всех источниках составляла 1040' клеток в 1 мл взвеси оксидов железа. В прилегающих болотах и двух источниках, наряду с одноклеточными литотрофными железобактериями, отмечено массовое развитие микроаэрофильных автотрофных железобактерий рода Gallionella.

2. Согласно результатам филогенетического анализа, 6 выделенных штаммов факультативно анаэробных железобактерий принадлежат к классам Alpha-, Beta- и Gammaproteobacteria. Из них 2 штамма описаны таксономически в составе Alphaproteobacteria в качестве нового рода Ferrovibrio gen. nov. с типовым видом Ferrovibrio denitrificans sp. nov. и нового вида Hoeflea siderophila sp. nov. семейства Phyllobacteriaceae. Способность к миксотрофии при окислении Fe(II) обнаружена у двух штаммов неидентифицированных таксономически, имеющих 92 и 98.2% сходства нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК с ближайшими таксонами D. koreensis, R. daejeonense, а также у штаммов, отнесенных к двум известным видам, Acidovorax facilis и Cupriavidus metallidurans, для которых способность к литотрофии не была ранее показана.

3. Выяснено функционирование «разорванной цепи» денитрификации у новых видов при миксотрофном и органогетеротрофном росте как следствие дисбаланса ферментативной активности реакций процесса денитрификации, а именно - низкой активности нитритредуктазы (ниже в 30-50 раз) по сравнению с нитратредуктазой.

4. При литотрофном анаэробном и микроаэробном росте в культурах железобактерий происходит обогащение легким изотопом продуктов окисления железа - оксидов Fe(III) в 2-8.8 раз по сравнению с исходным растворенным в воде железом.

5. Скорость химического окисления растворенного железа и величины фракционирования стабильных изотопов 55/5<5Fe в воде источников определяется двумя основными факторами: механизмом окислительных реакций — биологических или химических, и кислородным режимом. Максимальный эффект фракционирования отмечен при окислении Fe(II) в микроаэробных и анаэробных условиях с участием микроорганизмов. Сопоставление величин скоростей окисления, эффекта фракционирования стабильных изотопов железа и обогащения осадков оксидов железа легким изотопом (54Fe) в модельных экспериментах и в бактериальных культурах свидетельствуют о превалирующей роли биогенного фактора в окислительных реакциях геохимического цикла железа в исследованных водных экосистемах.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Долотов А.В., Гапеева М.В., Дубинина Г.А., Сорокина А.Ю. О возможности использования квадрупольного масс-спектрометра ELAN DRC-e ICP-MS для определения изотопного состава железа в модельных экспериментах // Исследовано в России. 2008 / http://zhumal.ape.relarn.ru/articles/2008/095.pdf.

2. Дубинина Г.А., Сорокина А.Ю.. Долотов А.В., Гапеева М.В. Фракционирование стабильных изотопов железа в ходе бактериального окисления Fe2+ в низкотемпературных источниках различного генезиса // Исследовано в России. 2009 / http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2009/091 .pdf.

3. Сорокина А.Ю.. Черноусова Е.Ю., Дубинина Г.A. Hoeflea siderophila sp. nov., новая нейтрофильная железоокисляющая бактерия // Микробиология. 2012. Т. 81. Стр. 64-71.

4. Дубинина Г.А., Сорокина А.Ю.. Гапеева М.В., Долотов А.В. Сообщества нейтрофильных железоокисляющих микроорганизмов железистых источников различного генезиса и их участие в фракционировании стабильных изотопов железа // Микробиология. 2012. Т. 81. Стр. 96-104.

5. Sorokina A. Y.. Chernousova E.Y., Dzyuba M.V., Kuznetsov В. В., Dubinina G.A. Ferrovibrio denitrificans gen. nov., sp. nov., a novel neutrophilic lithotrophic facultative anaerobic Fe(II)-oxidizing bacteria // FEMS Letters. 2012. (в печати).

6. Сорокина А.Ю.. Черноусова Е.Ю., Дубинина Г.А. Новые литотрофные железобактерии. Тезисы III Молодежной школы-конференции с международным участием, Москва, Россия 2007. С. 83.

7. Sorokina A. Y.. Gavrish Е. Y., Dubinina G. A. Hoeflea siderophila sp. nov., a novel species of neutrophilic anaerobic Fe(II)-oxidizing bacteria. Abstracts of the 12' International Symposium on Microbial Ecology ISME 2008. Australia. P. 25.

8. Sorokina A.Y.. Dubinina G.A., Dolotov A.V., Gapeeva M.V. 56/54Fe isotope fractionation by neutrophilic lithotrophic Fe-oxidizing bacteria in iron-rich cold springs of various origin. Abstracts of the 7th International Symposium for Subsurface Microbiology ISSM 2008. Japan. P. 88.

9. Сорокина А.Ю.. Черноусова Е.Ю., Дубинина Г.А. Новые нейтрофильные железобактерии из подземных железистых источников различного происхождения. Тезисы IV Молодежной школы-конференции с международным участием, Москва, Россия 2008. С. 44.

Подписано в печать 24.04.2012 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1554. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,0. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. 774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сорокина, Анна Юрьевна, Москва

61 12-3/930

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук

На правах рукописи

Сорокина Анна Юрьевна

Новые нейтрофильные литотрофные железобактерии и их участие в окислении железа в водных экосистемах

Специальность 03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор Дубинина Г. А.

Москва-2012

Содержание

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Биоразнообразие микроорганизмов, участвующих в окислении соединений Ре(Н)..........................................................14

1.1. Таксономический состав и филогенетическое положение железоокисляющих прокариот.......................................................17

1.2. Физиологическое разнообразие и распространение железоокисляющих организмов......................................................21

1.2.1. Ацидофильные железоокисляющие прокариоты.......................21

1.2.2. Нейтрофильные железоокисляющие прокариоты.....................25

1.2.2.1. Аэробные железоокисляющие микроорганизмы.................28

1.2.2.2. Анаэробные железоокисляющие микроорганизмы..............33

1.2.2.3. Фотосинтезирующие железоокисляющие

микроорганизмы..................................................................36

1.3. Механизмы окисления Ре(П) у микроорганизмов.........................38

Глава 2. Роль микроорганизмов в окислительных реакциях геохимического цикла железа...........................................................49

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ......................................53

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты и методы исследований............................................56

3.1. Объекты исследований...........................................................56

3.2. Методы полевых исследований................................................56

3.2.1. Физико-химические методы..............................................56

3.2.2. Отбор проб........................... .........................................56

3.3. Моделирование процессов бактериального и химического окисления Ре(Н) в воде источников.................................................57

3.4. Методы лабораторных исследований........................................58

3.4.1. Состав питательных сред...................................................58

3.4.2. Методы исследования морфологии и ультраструктуры

клеток..................................................................................59

3.5. Исследование культурально-физиологических свойств бактерий.....59

3.5.1. Методы изучения ростовых параметров и метаболизма............59

3.5.2. Биохимические методы.......................................................60

3.5.3. Анализ состава жирных кислот клеток.................................61

3.5.4. Метод определения состава полярных липидов мембран

клеток..................................................................................61

3.5.5. Метод анализа мембранных липохинонов.............................61

3.6. Методы генетических исследований.........................................61

3.7. Анализ изотопного состава 56/54Ге............................................63

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Характеристика минеральных железистых источников различного происхождения.............................................................64

4.1. Низкотемпературные минеральные источники.............................65

4.2. Соленый источник................................................................66

4.3. Термальный источник............................................................66

4.4. Распространение и численность железобактерий в

железистых источниках различного генезиса....................................68

Глава 5. Выделение и характеристика новых нейтрофильных литотрофных железоокисляющих бактерий.........................................71

5.1. Новые литотрофные железобактерии из железистых

источников различного происхождения..........................................71

5.2. Характеристика штамма Эр-1 ...................................................76

5.3. Характеристика штамма Hfl ...................................................82

5.4. Анаэробный метаболизм F. denitrificans и Н. siderophila................89

Глава 6. Роль микроорганизмов в окислении Fe(II) в природных

водах минеральных железистых источников различного генезиса............98

6.1. Фракционирование стабильных изотопов 56/54Fe в культурах железобактерий в микроаэробных и анаэробных условиях..................98

6.2. Изотопный состав железа в образцах воды источников, прилегающих болот и в железистых осадках...................................100

6.3. Фракционирование стабильных изотопов 56/54Fe

в модельных экспериментах....................................................... 100

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................... 107

ВЫВОДЫ................................................................................. 110

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................112

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Способность к окислению восстановленных соединений железа присуща многим прокариотным организмам различных таксономических групп, обладающих разными типами обмена веществ. Представители железоокисляющих микроорганизмов встречаются в доменах Bacteria, Archaea и даже в домене Eucarya (Halberg & Johnson, 2001). Наиболее изучены представители литотрофных ацидофильных железобактерий и органогетеротрофных железобактерий, широко распространенных в пресных водоемах и осадках, обогащенных органическим веществом. С 90-х годов двадцатого столетия начались интенсивные исследования практически неизвестной группы нейтрофильных литотрофных железобактерий. Первым ее представителем была описанная Эренбергом Gallionella ferruginea (Ehrenberg, 1836), известная как хемолитоавтотрофный микроорганизм из классической работы С.Н. Виноградского (1888). Однако убедительные доказательства хемолитоавтотрофного метаболизма для G. ferruginea были получены лишь в 1991 году (Halbeck & Pedersen, 1991). Публикации о представителях другой новой группы литотрофных анаэробных железобактерий, способных к окислению Fe(II) за счет использования нитратов в качестве акцептора электронов, появились только в конце 90-х годов.

в специфических природных условиях, таких как глубоководные морские гидротермы (Горшков и др., 1992; Emerson & Moyer, 2002; Edwards et al, 2003), железистые осадки, образуемые на выходе глубинных подземных вод на дневную поверхность (Emerson & Moyer, 1997; Sobolev & Roden, 2004), ризосфера корней растений (Emerson et al, 1999). Исследование функциональной роли нейтрофильных железобактерий в природных экосистемах осложняется неустойчивостью соединений Fe(II) в диапазоне вод со слабокислыми, нейтральными и слабощелочными значениями pH, при которых с огромной скоростью протекают аэробные процессы химического окисления. Известно также, что химическое окисление Fe(II) слабо выражено при низком окислительно-восстановительном потенциале и микроаэробных или анаэробных условиях среды - подобные условия характерны для ряда водных экосистем современных и древних водоемов.

В связи с вышесказанным с точки зрения эволюции исследования процессов анаэробного окисления Fe(II) представляют большой теоретический интерес при выяснении генезиса и условий происхождения как современных, так и древних осадочных отложений докембрия (полосчатых руд = BIF) и рудных образований более поздних геологических эпох. Следует указать также, что немаловажное практическое значение могут иметь биологические реакции окисления Fe(II) в процессах коррозии металлических конструкций и оборудования систем водоснабжения, нефтедобычи и, вероятно, других крупномасштабных технологических процессов.

Одним из подходов к оценке роли биологических процессов в окислительных реакциях геохимического цикла железа может быть применение методов фракционирования стабильных изотопов 56/54Fe. Применение масс-спектрометрических методов анализа может дать ценную информацию для сравнительной оценки бактериального окисления Fe(II) в природных экосистемах по сравнению с химическими процессами, а также

позволяют судить о скорости и масштабах их геохимической активности.

Имеющиеся сведения по фракционированию стабильных изотопов 56/54Fe немногочисленны из-за слабой изученности природы механизмов фракционирования изотопного состава железа (Anbar, 2004), а также воздействия ряда физико-химических факторов (сорбционные процессы, влияние ионов некоторых тяжелых металлов, концентраций субстратов и др.) (Posth et al., 2011; Picardal, 2012) в определенных условиях при нейтральной кислотности сред в континентальных и океанических водоемах. Немаловажна возможность использования стабильных изотопов железа в качестве маркеров (biosignature) для расшифровки и понимания происхождения осадочных руд докембрия Земли и при изучении марсианских отложений железа (Beard et al., 1999; Anbar, 2004; Posth et al, 2011).

Представленная работа была направлена на исследование литотрофных микроорганизмов, участвующих в процессах анаэробного окисления Fe(II) и выяснение их функциональной роли в различных водных экосистемах.

Состояние вопроса. До конца 1980-х годов литотрофные

железоокисляющие бактерии были представлены лишь ацидофильными

микроорганизмами, растущими при pH среды менее 4.5, когда Fe(II)

устойчиво к химическому окислению кислородом воздуха. Начиная с конца

девяностых годов, появились публикации о представителях новой группы

нейтрофильных литотрофных железоокисляющих бактериях, способных к

окислению Fe(II) в анаэробных условиях за счет использования N03~ в

качестве акцептора электронов. На примере исследования ранее известной

железобактерии Gallionella ferruginea (Ehrenberg, 1836; Виноградский, 1952)

лишь спустя столетие после открытия С.Н. Виноградским хемосинтеза с

использованием радиоизотопного метода с 14СОг были получены

доказательства хемолитоавтотрофного роста в чистой культуре на

минеральной среде с Fe(II) в качестве источника энергии при росте в

микроаэробных условиях (Halbeck & Pedersen, 1991). В природных условиях

развитие литотрофных железобактерий, как правило, происходит на границе

редокс-зоны в таких водных экосистемах как глубоководные морские гидротермы (Горшков и др., 1992; Emerson & Moyer, 2002; Edwards et al, 2003), железистые осадки, образуемые на выходе глубинных подземных вод на дневную поверхность (Emerson & Moyer, 1997; Sobolev & Roden, 2004), ризосфера корней растений (Emerson et al, 1999).

Из-за трудностей выделения и культивирования группа нейтрофильных литотрофных железобактерий слабо изучена в физиологическом плане, а также в таксономическом отношении. За последние 20 лет были выделены и описаны, но остаются до сих пор невалидированными три вида, относящихся к классу Alpha- и Betaprotobacteria (Kumaraswamy et al., 2006; Weiss et al, 2007), и один вид описан в качестве единственного представителя нового класса Zetaproteobacteria (Emerson & Moyer, 2002). Ряд выделенных штаммов до сих пор не идентифицирован в таксономическом отношении (Emerson & Moyer, 1997, Benz et al, 1998, Sobolev & Roden, 2004, Weber et al, 2009, Edwards et al, 2003). Практически полностью отсутствуют сведения о биохимических ферментативных механизмах, связанных с окислением Fe(II) у микроаэробных и анаэробных железобактерий, а также о молекулярных механизмах автотрофии и путях генетической регуляции их метаболизма.

Помимо G. ferruginea, только для двух невалидированных анаэробных видов, Siderooxidans paludicola и Siderooxidans lithotrophicus (Halbeck & Pedersen, 1991, Weiss et al, 2007) и представителя гипертермофильных архей, Ferroglobus placidus (Hafenbradl, 1996), были предоставлены убедительные доказательства хемолитоавтотрофного роста, хотя молекулярно-генетическими исследованиями для упомянутых видов Siderooxidans это не было подтверждено (Picardal, 2012). Остальные известные штаммы факультативно-анаэробных железобактерий, способные окислять Fe(II) в микроаэробных или анаэробных условиях, обладают миксотрофным типом метаболизма.

Результаты экологических исследований указывают на участие

литотрофных нейтрофильных железобактерий в образовании оксидов железа

в специфических природных условиях, таких как глубоководные морские гидротермы, железистые осадки, образуемые на выходе глубинных подземных вод на дневную поверхность, ризосфера корней растений. Исследование функциональной роли железобактерий в природных экосистемах осложняется неустойчивостью соединений Ре(П) при нейтральной кислотности среды.

Исследования процессов анаэробного окисления Ре(И) представляют большой теоретический интерес с точки зрения эволюции при выяснении генезиса и условий происхождения как современных, так и древних осадочных отложений докембрия и рудных отложений более поздних геологических эпох Земли и Марса.

Одним из подходов к оценке роли биологических процессов в окислительных реакциях геохимического цикла железа может быть применение методов фракционирования стабильных изотопов 56/54Ре. Имеющиеся сведения по фракционированию стабильных изотопов 56/54Ре немногочисленны из-за слабой изученности природы механизмов изотопного фракционирования железа.

Цель и задачи работы. Цель данной работы состояла в исследовании представителей нейтрофильных литотрофных железобактерий и выяснении их распространения и роли в окислении Ре(П) в минеральных железистых источниках различного генезиса.

Конкретные задачи работы заключались в следующем:

3. Выяснение роли литотрофных железобактерий в процессах окисления железа в природных условиях, а именно:

Научная новизна работы. Выделено 6 штаммов нейтрофильных литотрофных факультативно анаэробных железобактерий, среди них 4 неизвестных ранее вида железобактерий, и два штамма, относящихся к ранее описанным видам, для которых способность к окислению Fe(II) нами показана впервые. Штамм Sp-1 описан в качестве единственного представителя нового рода Ferrovibrio denitrificans gen. nov., sp. nov. в пределах класса Alphaproteobacteria. Г алотолерантный штамм, Hfl, выделенный из солоноводного источника описан в качестве нового вида Hoeflea siderophila sp. nov. рода Hoeflea в пределах класса Alphaproteobacteria. Полученные данные расширяют представления об условиях распространения, видовом и физиологическом разнообразии нейтрофильных литотрофных железобактерий минеральных железистых источников различного происхождения.

Практическая значимость. Работа расширяет фундаментальные представления об условиях местообитаний, видовом разнообразии нейтрофильных литотрофных железобактерий и функциональной роли биологических окислительных реакций геохимического цикла железа в пресноводных и солоноводных экосистемах. Полученные результаты могут быть использованы в соответствующих разделах учебных программ по микробиологии и экологии.

Апробация работы. Результаты диссертации были доложены на III Молодежной школе-конференции с международным участием, Москва, 2007 г.; 12 Международном симпозиуме Microbial Ecology ISME 2008, Австралия, 2008 г.; 7 Международном симпозиуме Subsurface Microbiology ISSM 2008, Япония 2008 г.; IV Молодежной школе-конференции с международным участием, Москва, 2008 г.

Публикации. По материалам диссертации, включая тезисы, опубликовано 8 работ и 1 статья сдана в печать.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Заключение по литературному обзору, Экспериментальная часть, Результаты исследований и их обсуждение, Заключение, Выводы и Список литературы, который содержит 43 отечественных и 161 иностранных наименований работ. Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста и содержат 13 таблиц и 21 рисунок.

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов ИНМИ РАН (заведующий лабораторией - д.б.н., проф. Горленко В.М.). Молекулярно-биол�

Информация о работе

Сорокина, Анна Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Новые нейтрофильные литотрофные железобактерии и их участие в окислении железа в водных экосистемах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы