Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

НАЧАЛЬНЫЕ ПУТИ АССИМИЛЯЦИИ УГЛЕКИСЛОТЫ ХЕМОАВТОТРОФОМ [...]

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "НАЧАЛЬНЫЕ ПУТИ АССИМИЛЯЦИИ УГЛЕКИСЛОТЫ ХЕМОАВТОТРОФОМ [...]"

АКАДЕМИЯ НАУК ссс£ ..;.. ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ мм. А. Н. БАХА

На праве* ружопвсн

Л-

РУСИНОВА Нелли Георгиовна .. Г

НАЧАЛЬНЫЕ ПУТИ АССИМИЛЯЦИИ УГЛЕКИСЛОТЫ ХЕМОАВТОТРОФОМ 58К.

(Специальность 03,00.04- — биологическая химия)

А В Т О Р Е Ф Е Р* А Т

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1974

АЕАЛЭЮЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕШ ИНСТИТУТ ВКШМШ ш. А.Н.ЕШ

№ щжввт рукошся

РУСИНОВА Недяя Георгиевна НАЧШШЕ ПУТИ АССШШ1ЯШИ УГЛЕКИСЛОТЫ

шюмвшшш З^кюЬ-асМи^ {к1оюс1йап4 58Е

(Специальность 03.00.04 - Оиологжческая хвыня)

Автореферат диссертации аа соискание ученой степени кандидата биологически! наук

Москва - Х974

Работа выполнена в лаборатории автотрофной ассимиляции углерода Ордена Левина Института биохимии ш. А. Н. Баха

Научные руководители:

Кандидат химических наук В*Г.ЛОМАЯ Кандидат биологических наук А.К.РаЛАНОВА

Официальные оппонента: Доктор биологических наук Г.И.КАРАВАЙКО Кандидат биологических наук А.А.МУТУСКИН .

На официальный отзыв работа направлена на кафедру микробиологии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан " Ч " Ш&ЧЩ , 1374 г.

Защита диссертации состоится " " _ 1974 г.

на заседании Ученого Совета Ордена Ленина Института биохимии им. "Баха АН СССР (Москва, В-7Т, Ленинский проспект 33)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Ученый секретарь кандидат биологических наук

(Н.Н.ДОТЧКОВ)

ВВЕДЕНИЕ

Тионовые бактерии представляют исключительный интерес для изучения путей автотрофной ассимиляции углерода, Эти своеобразные, не имеющие светочувствительные пигментных систем микроорганизмы, осуществляют биосинтез органического вещества, используя в качестве единственного источника углерода углекислоту, а в качестве энергетического сустрата-минеральные соединения серы.

В настоящее время ясна лишь общая картина ассимиляции углекислоты тионовшш бактериями, которые усваивают ее, главным образом, через восстановительный пентозофосфатный цикл (цикл Кальвина). Перше данные о действии цикла Кальвина у тионовцх бактерий были получены в 1955 году (Sanißi. , vtshniac , 1955; 'ühudin^s.-u , 1955, 1956). Однако многие конкретные'механизмы автотрофной ассимиляции углерода этими микроорганизмами изучены далеко не достаточно.

Тионовая бактерия Shiob-uciiiuS ihloaxCdaruS обладающая способностью развиваться при значительной кислотности среды (от pH 5,0 до pH 2,0 и ниже), привлекла наше внимание презде всего с точки зрения необходимости выяснения особенностей первичного акцептирования углекислоты в условиях повышенной кислотности среды.

Основной задачей настоящего исследования являлось выяснение биохимического механизма автотрофной рссимнлядаи ут- ■ лерода у нового штамма тионовых бактерий а

triiüooetdcubi, 58В.

Для решения этой задачи была проведена следующая работа; I) изучена физиология ассимиляции углекислоты целой клеткой и разработаны условия выращивания биомассы jAhio -Q-x-idan-S . 53В в количествах, достаточных для экзимоло-гических исследований; 2) исследован процесс первичного акцептирования COg у J i-£iu>-coci,da.n-~i 58R; 3) кинетическим исследованием продуктов хемоавтотрофии и энзимологи-

цесюши методами доказано функционировали е восстановительного пентозофосфатяого цикла у i-hioúXLdünj 58R; 4) исследованы ферменты дополнительного карбоксилирования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использованный в настоящей работе штамм тионовюс бактерий Offii th.bú<yx¿dc<.ni 58R был выделен из термального источника (+54°С) острова Кунашир (Заварзпн, Еили-на, 1964).

Культуру Э- thoococidans 58Е выращивали на жидкой минеральной среде Эмото (Emolo , 1929) (pH среди 5,4) при непрерывном принудительном продувании воздухом (иногда с 1-Щй примеси COg).

О ходе развитая культуры судили по увеличению кислотности среды, определяя pH на потенциометре со стеклянным электродом, и по скорости потребления организмом тиосульфата, титруя культуральнуг среду раствором иода определенной концентрации в присутствии крахмала.

Количественное определение белка по методу Лоури (£о -"lO^^uj , 1951) производили после 30-минутного щелоч-

ного гидролиза клеток при 37°С.

Интенсивность ассгоотляции углекислоты целыми клетками исследовали при фиксациигаза С1402или НС^Од"из раствора МаНС03. В первом случае отбирали пробы по 50 -100 ил из продуваемой воздухом культуры; I-I5 мл культураль-ной жидкости быстро фильтровали через мембранный фильтр JE 4. Бактерии на фильтре с помощью специального держателя вносили на определенное время (3 сек - I мин) в квмеру, плавающую над ртутью (Домал, 1955) и содержащую 10% в воздухе.

Извлеченные из камеры фильтры быстро сбрасывали в стеклянный стаканчик с 20$ кипящим этанолом.

Зависимость интенсивности ассимиляции МаШ140з от •его концентрации проводили в сосудиках Варбурга при комнатной температуре (19°С),

\

Фонд углекислоты, лабильно связанной в клетках, определяли путем сравнения количества ассимилированной после 3-х секундной экспозиции в камере, содержащей меченную углекислоту (С1402)» с количеством радиоуглерода, включенного организмом, после дополнительного выдерживания таких клеток в атмосфере обычного воздуха. Фиксации опытного материала производили кипящим 20% этанолом. .

В каждом случае определенную часть спиртового экстракта наносили на латунные диски, добавляли соляную кислоту для полного удаления NaHC*40g и высушивали их. Радиоактивность определяли с помощью газопроточного гелиевого счетчика типа 2дг . _

Ранние продукты хемосинтеза У VhixoicuLan^ 58R изучали с помощью двумерной восходящей хроматографии на бумаге и последующей радиоавтографии спиртовых экстрактов S- ihiooxuians 58R после 3;15;30 и 60-секуняной экспозиции их в присутствии углекислота, содержащей С14. Положение радиоактивных стабильных продуктов определяли путем совмещения хроматограмм с рентгеновской пленкой или BJ-I). Радиоактивность продуктов просчитывали торцовым счетчиком с двух сторон хроматограммы.

Получение экстрактов из клеток 3'■ ihiOtrt-idanS 58?.. Осадок отмытых бактерий суспендировали в 10-кратном ■ по весу сирой биомассы объеме буферной смеси следующего состава; 0,01 ft а €¿2 ? 0.01 М глутатион; 0,1 М трис-RCi! . Разрушение клеток производили обработкой ультразвуком в маг-яитострияционном генераторе йирмы MSE (Англия) мощностью 500 вт при частоте 20 кц в течение 10 шн при 0°С. После разрушения суспензию центрифугировали на холоде ( + 4°С) при 17000 в течение 40 мин. Надосадочную жидкость, именуемую в дальнейшем изложении исходным экстрактом, использовали дал определения активности ферментов. Исходные экстракт хранила при 0°С не более I суток, или более длительно в замороженном ( - 10°С ) состоянии. Определение белка в исходных

экстрактах производили по методу Лоурп.

Лэнные по активности Ферментов представляли в единицах. фермента - количество фермента, которое катали* зарует превращение I ыкмоль субстрата за I мин при условиях опыта. £лн определения удельной активности часло единиц фермента относили к I иг белка.

Активность карбоксилирутеих ферлеатов определяли по включению меченого бикарбоната в кислотоустойчивий продукт реакции.

Активность карбоангидразы определяли индикаторным методом {FLouijhion, B-ooiJz t 1946) в модификации Виль-бур и Андерсон ("УМлЛип- , Яп&кггбоп- , 1948).

Активность ркбозофосфатизомеразы (.Лоое^гооС ,"7апд , 1954), фосфорибулокиназы (Huii^dv , 1962), фосфетазы фоофоглицершгоэой кислота (Heppei , 1955) определяли колориметрическим методом.

Отведение РтДФ - карбоксил азы от сопутствующее ферментов производили по схеме (Рс^еЛг&п , /<хпе , 1966), включающей фракционирование белков сернокислым аммонием, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ - деллшозе, адсорбционную хроматографию на гидрокеялапатите.

Зстектоофоретичес^ое разделение фракции после гидрокси-лапатита производили в полиакриламлднои мелкопоркстои геле (8%), приготовленном на 0,05 М трасНЙ! буфере с добавлением 0,01 мМ ЕЕГА, рН 7,5; продолжительность электрофореза 2 часа.

Сила тока на,кавдув труОку равна 0,5/пй . Внутренний диаметр трубок 4 мм, высота столбика мелкопористого геля 47 им, продолжительность электрофореза 2 часа. Температура во время разгонки +5°С.

Определение молекулярного веса очищенной РуДФ - карбо-гхяшазп 3 thti-coc.*-u&>irb 58R производила путем сравнения скорости прохождения в, электрическом поле белка Pyji5 - кар-ооксилазы зо скоростью прохозденик стандартных белков ап . Ма*и ,_ 1968).

Определение содержания.йосФора в опытных растворах производили по модифицированному методу Лоури, Лопес {Жсп&ъц,/¿>ры) 1946). ' '

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Физиологам ... РАЗВИТИЯ & ЩрОхМал*. 58й

Характерной особенностью^ 58й* как и ряда

других хемосянтеэируицих микроорганизмов, является медленный рост и низкая величина биомассы, накалливаодаяся в культуре к моменту ее иерегода в стационарную фазу.

Для биохимических исследований вакно знать, на какой стадии развития находится микроорганизм, так как активность фер — кентннх систем обусловлена физиологическим состояние» клетка.

рисД. Изменение важнейших показателей роста в процессе культивирования & tfotfxncidGra-s 58В. I- изменение pH (повышение pH относится к моментам подкормки тиосульфатом); 2 - потребление тло судьба та (имоль/л кулътуральной среди), 3- общая ассимиляция СО^(мкмолв/л кулътуральной среды). 4 - содержание белка («г/л кулътуральной среды).

На рис. I представлены кривые роста «Л игшоки- -сИсим 58В . Фаза задержки роста (лаг-фаза) в данном опыте продолжалась 20 часов. Кривые потребления тиосульфата, общей фи&саши углекислого газа & накоплет1я Зелка не шлеот четко выраженной экспоненциальной фазы и быстро переходят в линейную фазу. Кривая суммарно ассимилированного углекислого газа получена из данных до интенсивности ассимиляции углекислого газа клеткой радиометрическим методом. Эта кривая с некоторым отставанием повторяет кривую окисления тиосульфата. Концентрация ионов Н* в среде закономерно возрастает в процессе вырашшания культуры, за исключением моментов подкормки культуры тиосульфатом, когда значение рН возрастает в результате того, что добавляемый раствор тиосульфата имеет щелочную реакцию.

С целью уточнения (физиологических закономерностей развития культуры У Иг100Хсс1ап-5 ,58В проведено исследование зависимости скорости ассимиляции углерода микроорганизмом от важнейших факторов внешней среди: величины рН и концентрации углекислоты.

Как видно из данных рис. 2, скорость ассимиляции С*4СЦ клетками V- {■¡'ы.оо^ианаб 53В. , достигает максимальной величины при значительной кислотности среды в пределах рН 3,0-4,0.

Растворимость углекислоты в кислой среде очень мала. При концентрации углекислоты в воздухе, равной 0,03^, концентрация ее в растворе составляет 0,012 Ш при низких значениях рй. Ланные яаыих опытов говорят о том, что в этих условиях потребность бактерий в углекислоте значительно выше. Ассимиляция углекислоты (НС0д~ - из раствора МаШ03) клетками ОиосяиЛм-з, 58Й пропорциональна ее концентрации в пределах 0,023-0,113 »СЛ. При более высоких концентрациях углекислоты происходит насшение акцептирующих систем субстратом. Максимальная скорость ассимиляции углекислоты равна 0,067 мкмоль субстрата за I мин на мг белка. Концентрация углекислоты, при которой, достигается половина

I«.

г tj в

Q-i

f i I i

л 1 * 1 1 : 1 ¡' 1 ! ■. _l__ .

i 1 1 Í i i i

! !/ ; i i \ • r

Рис.2. Влияние кислотности среда на интенсивность фкксагога углекислоты JT ¿híctrU -dañó 5SB . при кратковременном хемосинтезе в атмосфере, содержащей С*40о . Зкспо-

¿ JA

зпшя в С Oj : 1-5; П-15; Ш-' -30 сек. По оси абсцисс отложены значения рН; по оси ординат - фиксация углекислоты (распады/мин), приведенная к количеству клеток, соответствующему 1,76 мг белка.

максимальной скорости асскшляцхи углекислота (кажущаяся ^-определенная asín; для цзлых клеток}, составляет I,Q¿\!, что свидетельствует о сравнительно высоком сродстве живой клетки к углекислоте,

Таким образом, данные наших опытов говорят о том, что при повышенной кислотности бактерии сталкиваются с дефицитом углекислоты в среде.

Повышение содержания COg в воздухе, продуваемом через культуральную среду, приводит к значительному увеличению урожая. Культуры, получившие дополнительную подкормку С02 до -10$, содержат в 2,8 раза больше белка (15 мг/л культуральной среды), чем культуры, продуваемые воздухом без дополнительной примеси СОп,

ПЕРВИЧНОЕ МШШРОВАНЙЕ И ШЩШТРИРОВШЕ -УГЛЕКИСЛОТЫ МЕТКАМИ Т ihioOo^doXlA 58R.

В ПРОЦЕССЕ ХЕМОСИНТЕЗА,

, I. Роль карбоангидразы (карбонзт-гидро-сгиаза. 4.2.I.I.)

Способность ¿Л ~LhiocrxidcuPi> 58R к ассями-

дядаи углекислого газа при повишенной кислотности когда содержание карбонатов и растворенного углекислого газа в среде ничтожно, наводит на мысль о существовании в клетках этого микроорганизма особш: систем акцептирования и концентрирования углекислого газа.

Трудно представить, что первичное связывание углекислоты в условиях повышенной кислотности, характерной для мест обитания thioooctdans 58R., осуществляется непосредственно РуЛЗ> - карбоксилаэой, оптимальный рН действия которой, по крайней мере in пН¿го - 7,5-8,0, а при рН ниже в,О этот фермент, полностью ивактивируется. {%0-ешЬ<лсН d id. t 1956).

№ предположили, что перши акцептором углекислоты является карбоангидраэа - фермент, катализирующий обратимую реакцию гидрвтирования углекислого газа и дегидратирования угольной кислоты

С0г + Б20 = Н2С03^= £Г* + НСО3"

Известно, что карбоангидраза растительного происхождения может действовать в широко» диапазоне рН от 1,04 до 11,9, хотя оптимальный рН действия наблюдается при рН 6,0-6,0 (SiUu /Wood , I9SI; flc-iU et at. , 1968).

наш были изучены некоторое свойства карбоангидразн. Активного карооангидразы в свежеполученном экстракте из клеток J• tbiOOXida-m 58В составляет 5,4 мкыоль С03 , гидратированиого за I мин количеством бесклеточного эк, стракта, содержащего I мг белка. Скорость реакции пропорциональна содержания белка в ферментной смеси (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость активности карбоангидразы от содержания белка в ферментной смеси.

Б процессе развития культуры J "1Нш(К&с1ап4 58Е. мы провели параллельное наблюдение за интенсивностью ассимиляции бикарбоната ( ^аНС^С^) и активностью карбоангидразы. На рис.4 изображены результаты, показывающие, что активность ассимиляции бикарбоната культурой У- МиоояиашЫ! ЕЗН и активность реакции гидратирования С02 в экстрактах из тех же клеток в расчете на I мг белка в мин одновременно снижаются в процессе развития культуры. Из данных рисунка видно, что величина активности карбоангидразы, дане при определении ее при 0°С, значительно выше скорости ассимиляции НС0д~ клетками при 28°С (температура развития культуры).

Действие сульфаниламида (ингибитор карбоангидразы) на карбоангидразу X Ы-иО-о^исиг^ 58Б. изучали после

10-минутной йрединкубациа фермента с ингибитором при 20°С и 10-минутного последующего доведения температуры до 0°С.

Сульфаниламид в концентрации от 0,2 Ш до 2 ь&1 тормозит

Рис. 4. Изменение активности карбо— ангвдразы (X) в исходню: экстрактах я скорости ассимиляции (2) клетками

58Й .

актианость фермента. Степень торможения прямо пропорциональна концентрации ингибитора, '''ормоскение скорости реакции на 50$ достигается при концентрации сульфаниламида 1,8 ЫМ.

С целью определения роли карбоангидразн в углеродном питании неповрежденных клеток С/ Ьки-схк^пЛ 5811

боли поставлены опыты по влиянию сульфаниламида на ассимиляцию углекислота в виде иона НС^Од" в жидкой фазе и в виде газа С1402.

Бактерии, свекеотобранше из растущей культуры, предварительно выдергивали 10 ш цри 20° в присутствии Я Ш сульфаниламида. В контрольном варианте вместо сульфаниламида добавляли равный объем воды. При одноминутном хемосинтезе ЛМо -ооиШсм 58В. в присутствии 5 Ш бикарбоната, меченного С1»4, сульфаниламид не влияет на ассимиляцию углекислоты, тогда как в присутствии С^Од , при концентрации его 7,5$ по

объему углекислоты в воздухе, торшзяшее действие ингибитора составляет 16,Таким образом, торможение ассимиляции углекислоты in тЯт£о проявляется в значительно меньшей степени, чем это наблюдается при действии его на карбоангвдразу в экстрактах из клеток J. thiocxCdati^ 53В. , что, возможно, можно объяснить затрудненной диффузией сульфаниламида вжише клетки. Действительно, при более длительном воздействии ингибитора на организм процент торможения ассимиляции С02 увеличивается до 19,5$ после 3 час я до 23,9% после 5 часов воздействия ингибитора.

Таким образом, активность карбоангпдразы значительно превышает самую высокую наблюдавшуюся активность ассимиляции углекислоты яивыми клетками J- t-hioooccuan-i 58К и

вполне достаточна для превращения растворенного молекулярного COg в ион бикарбоната и обеспечения субстратом последующих реакций карбоксилировапия.

При хемосинтезе Ihifrcxidasi-S 58В. в жидкой среде, содержащей в избытке ионы НС03~, карбоакгидраза, вероятно, не участвует в первичном акцептировании этого субстрата, о чем свидетельствует отсутствие тормозящего действия сульфаниламида.' Торможение сульфаниламидом хемосинтеза ¿TT thioimXdcbn-i 58R , находящегося в газообразной среде двуокиси углерода, при относительно кратковременном воздействии ингибитора на микроорганизм, можно объяснить ииги-бированием карбоангидраза и связать с необходимостью превращения газа С Og в ионы НС03".

2. Лабильное связывание углекислоты.

Существование первичного лабильного связывания углекислота, благодаря особенностям физиологии X Шию-х^сС&пя 58Н, можно продемонстрировать с помощью простого опыта (Ломай, Романова, 1965). Бели бактерии после короткой экспозиции в камере, содержащей С^Оо , вадержзгь затем в камере с обычным воздухом, не содержащем радиоактивный углекислый газ, и фиксировать дииящдм 2QJ6 этанолом, то общая ассимилированная

радиоактивность существенно выше, чем соответствующая величина для такого же количества бактерий, фиксированных сразу зе после короткой экспозиции в присутствии С й>. Результаты типичного опыта представлены в табл. X.

Таблица I

Изменение количества ассимилированного радиоуглерода после дополнительного выдергивания на воздухе 'Т. Иг1о-оос1аап^ 58Е , усвоивших меченую углекислоту в процессе хемосинтеза

рн Общая ассимилированная радиоактивность на аликвотную часть бактериальной суспензии, имц/мин

среди 5 сек в ггрисутсгвии 5 сек в присутствии С 0Р затем I мин на обычном воздухе

3,34 4043 19376

3,72 4100 25958

6,12 5869 16533

Значительная кислотность среда, достигающая 2,0-5,0 единиц рН, исключает при это.л возможность солевого связывания углекислоты. Можно сделать вывод о существовании нестойкой связи иного вида.' Включению С14 в стабильные продукты предшествует, вероятно, образование нестойко связанного с С соединения или соединений, разрушающихся при фиксации опытного материала кипящим этанолом.

Зслн клетки ¿Г 1Н<,о сосишп^ гвИ , получившие

^-секундный "глоток" (.Мокроносов, 1966) С1402 в камере с С^Оо, выдерживаются затеи в камере с обкчным воздухом в течение разных промежутков времени, то отмечается прямая пропорциональная зависимость нарастания метки в стабильных продуктах от временя выдерживания клеток в камере с обычным воздухом. Эти данные отражает скорость поступления метки в продукты хемосинтеза из обменного фонда нестойко связанного С1402 ' образующегося при "глотке" С*402. Обменный фонд ла-

бильно связанного радиоуглерода достаточно велик и-в разных опытах в 2-6 раз превышает количество стабильных меченных продуктов 3-секундноЙ экспозиции.

Изучение влияния значений рН среды на скорость поступления s обменный фонд нестабшсьно связанного С*4 показало, что наибольшей скорости этот процесс достигает при значениях рН 3,0-4,0, что совпадает с оптимальными значениями кислотности среда для развития микроорганизма.

Получена также ориентировочная количественная оценка емкости системы, лабильно связываниях С1402 . Накопление С^4 в стабильных продуктах после "глотка" С^02 достигает наибольшего значения после 1-2 дан выдерживания бактерий в камере с обычным воздухом (в отдельных опытах до 5-8 мин) и равно 1-7 нма:ь С02 на мг белка мгяфоорганизмов за 3 сек. Так как за время З-секущдаого "глотка" С^ О^ было усвоено . 1-7 нмоль С^402/мг белка, нетрудно рассчитать, что скорость поступления С^^Оо в фонд лабильно связанного С*4 за I мин равняется 0,02-0Д4 мкмоль С^О^/мг белка. Эта скорость совпадает по величине с обычно наблщаемой скоростью карбокси-лнрования Pyi№ в исходных экстрактах -¿Г ihioojUdLcifbi 58Е.

Полученные нами данные показывают, что клетки 7. ihlo -cxalci-n-i 5SR способны запасать углекислоту. Вероятно, благодаря действию карбоангидразы, внутри клетки поддерживается определенное равновесие различных форм углекислоты. Особенность У. ih<,ûooziûicin-i 53R по сравнению с другими объектами заключается в способности акцептировать СОо и запасать его при наибольшей кислотности среда, исключала ей химическое образование солей угольной кислоты. Запас лабильно связанной углекислоты в клетке (фонд С02) необходим для нормального функционирования различных ферментных систем ассимиляции углекислоты.

ВОССТАНОБИТШШЙ ПЕНТ030Ф0СФАТННЙ ЦИКЕ - ОСНОШОЙ _ ПУТЬ АССИМИЛЯЦИИ УГЛЕКИСЛОТЫ ПРИ ХЕМОСИНТЕЗЕ

¿Г. 1Нанхх.1х1агьз 58К

Для характристики дальнейшего рута углерода в клетке 3. 58Е мы I) изучили состав и динамику

продуктов, образующихся при ассимиляции углекислоты, и 2) определили активность основных ферментных систем углеродного обмена в экстрактах из клеток того же организма.

I. Кинетика включения С140<, в ранние продукты хемосинтеза.

После З-секундного хемосинтеза наибольшая часть С14 содержится в продуктах цикла Кальвина (табл.2), к которым.ш относили фосфорные э<|иры Сахаров, фосфоглицеркновую и глицериновую кислоты.

При вндеряивании .бактерий после 3-секувдноГо "глотка" С^^О,, в камере с обычным воздухом процент С*^ в продуктах дакла Кальвина постепенно снижается.

Процент содержания С4- в аспарагиновой кислоте при выдерживании на воздухе бактерий, предварительно получивших метку, увеличивается прв обоих значениях рн (рН 3,25 и 6,4).

Метка в глутаминовой кислоте появляется позднее: при рН 3,25 после I шл выдерживания на воздухе и к 5 мин достигает 10%, а при рН 6,4 после 2 мин выдерживания ва воздухе достигает лишь А% ст общей ассимилированной радиоактивности ( С14).

Содержание С*^ в кислотах цикла Кребса при обоих значениях рН невелико (единицы процентов). __

Среди самых ранних продуктов хемосинтеза

58Н встречается глицериновая кислота. По существующему представлению глицериновая кислота образуется из фосфогли-цериновой кислоты под действием фосфат азы.

По нашим данным при (табл.3) рН 4,0 в присутствии ис-' годного экстракта происходит отгаепление от фосфоглицериновой кислоты фосфора со скоростью 20 мЕп на I иг белка. При

Таблица 2

Радиоактивные продукты хемосинтеза иихУоо^Шлшл • 58Н , образушиеся после 3-секундного "глотка" С^402 и последующего выдерживания бактерий в обычной атмосфере, (В % от общей радиоактивности, обнаруженной на хроматограмме)

" "" 11 йродолкй^ёльность выдерживания ""

бактерий в камере с обычным воз-Раддоактивкые 3 сек духом (в сек) после 3-секундвоВ продукты экспозиции с ^^

рп сач02 " 15 30 60 120 300

Продукты цикла Кадь-вина 100,0 82,2. 82,1 79,1 74,8 56,5

Аспарагиновая кислота нет 10,7 11,2 II, Ь 12,4 23,8

Глутаминовая кислота нет нет нет 0,4 6,1 10,4

Серии нет следы 1,9 3,2 4,2

Фосфоенолшруват нет следы 2,9 2,8 нет нет

Лимонная кислота нет нет 1.0 нет нет нет

Яблочная кислота нет нет следы 2,6 0,6 нет

Янтарная кислота нет следы 1Д 1,3 0,9 1,3

Прочие нет нет нет нет нет 2,7

рН 6,4

Продукта цикла Кальвина 70,0 61,5 41; 2" 48,8 39,1 22,?

Аспарагиновая кислота 15,0 27,9 32,1 24,8 50,1 5Э,С

Глутаминовая каслота нет нет нет нет нет 3,9

Серии 15,0 Г0,2 9,1 10,8 3,9 13,5

Фосфоенолшгруват нет нет нет с; о Г), 1,5 0,2

Лимонная кислота нет нет 3,0 3,8 4,2 1,7

Фруктоза нет нет 2,3 нет 0,5 1,5

Прочие нет нет 4,3 6,6 0,7 нет

рН 9,0 отщепления фосфора не происходят. Следовательно, присутствие глицериновой кислоты на радиоавтографах монет быть объяснено действием кислой .фосфатазы фосфогдицериновой кислоты (фосфотидролаза моноэфнров ортофосфатаза, 3.1.3,2,), содержащейся в исходных экстрактах 3 i-hi&cxidcir/Vi 581.

Таблица 3

Скорость отщепления фосфора фосфоглицериновой кислота под действием фосфатазы в исходных экстрактах V. thLococidanJ, 58В..

рН реакционной смеси Удельная активность

мЕд /мг белка

9,0 0,0

4,0 20,0

Постепенное уменьшение относительной радиоактивности в продуктах цикла Кальвина отражает первичность их образования по сравнению с образованием аспарагиновой и глутшиновой кислот.

На основании изложенных данных можно сделать вывод о том, что доминирующее значение в первичном усвоении углекислот принадлежит циклу Кальвина.

2. Активность йешентов Фазы карбокститрования.

В настоящем разделе приводятся данные энзишлогичееких исследований о функционировании цикла Кальвина в клетках $. ihio-axidani - 58В. .

Из литературных данных известно { Quale d ai., 1954; bfe&biich' tei a£, , I £54), что экстракты из растений в присутствии рибозо-5-фосфага <Р5Ф) и ATS, фиксируя углекислоту, образуют фосфоглицериновую кислоту (ОГК).

Р5Ф ..■ ■.. . рибулозо-5-фосйат + АТФ ==

рибозофосфатизомераза^ j

^AvjHr—

РуДф —-<ЕГК

■—' РтгТТФ—рйпЛптглеттточя .

фосфорибулокинаяа ^РуЛФ-карбоксилаза

^/руда - рябулозо-1,5-дафосфат

^РуДФ - карбоксилаза — рибулозодифосфаткарбоксилаза (3-фосфо-1>-глнцерат-карбокси-лиаэа, димеризушая, 4.1.1.39).

Этот участок в цикле Кальвина называют фазой карбокси-лирования.

Включение С14 бикарбоната исходными экстрактами Нио -ОхкЖап-ь 58Л в.присутствии Р5Ф и АТФ в кислотоустойчивый продукт говортт о наличии у этой бактерии ферментов: ркбозофосфатизомеразы (рибозо-5-фосфат-кетолизомераза, 5.3.1.6), фосфэрибулокиназы (АТФ: рибулозо-5-фосфат-1-фосфо-трансфераза 2.7.1.19) и РуДФ - карбоксилазы.

Таблица 4

Активность ферментов фазы карбокстшровэния в исходных экстрактах ^ Ии-ссьсойст^ 58Й

Ферменты Активность

мЕд /мг белка

Фиксация НС^Од" в присутствии Р5Ф, АТФ и исходного экстракта

Рибозофосфатизомераза

Фосфоркбулокиназа

РуДФ - карбоксилаза

Сравнительное изучение активности трех важнейших ферментов цикла Кальвина показало, что активность рибозофосфати-•зомеразы и фосфорибулокиназн, определенная каждая в отдельности, на порядок величины выше активности РуДФ - карбоксила-зы, определенной в тех же препаратах-, тогда как суммарная активность всех грех ферментов, как правило, ниже или близка к активности РуДФ - карбоксилазы (табл. 4).

Следовательно, рибозофосфатизомераза, присутствующая в исходных экстрактах X Ш1ооэс1аап4 ГйЛ , способна

обеспечить субстратом следующую реакцию - фосфорилирование

39-120

460-1500 240- 380 80- 140

рибужозо-б-фосфата фосфорибуагакнназа также мажет обе-

спечить субстратом реакцию карбоксшгарования РуЛФ. Скорость сушарной реакции ограничивается в первую очередь активностью РуДФ - карбоксилазы.

3. Препаративное получение хмтиб-уяозо-Х.Б-дифосфата (МФ),

Достаточно высокая активность рибо зофосфатиэомеразы и фосфорибулокиназы в исходник экстрактах íkiocrridan-i 58R . позволила нам разработать способ получения РуДФ в препаратив-. них количествах сравнительно недорогим и ветруяоешош спосо-бои.- Активность исходного экстракта проверяли радиометрическим методом.

При составлении ферментной смеси для превращения рлбо-зо-5фосфата (Р5Ф) в руД£ за основу принят метод, предложенный для определения активности фосфорибулокиназы ( Hu^i'uhiz , Meth&ds in truy то tú ^ , T.'s, стр.258, 1962).

Ферментная смесь (конечный объем 60-80 мл) состоит из 200 мкмоль Р5Ф, 2100 мкмоль АТФ, 500 мкмоль шстеина солянокислого, 2000 мкмоль McC¿2 * 6Н20, 20-30 ыл исходного экстракта íf. ik¿OOXídan.¿ . 58В..

Бариевую соль Р5Ф (fieanal ) переводили в натриевуп, после полного растворения в 10 мл 0,1 н НС£ , эквивалентным количеством раствора Na^SO^. Все растворы нейтрализовали кристаллическим трисом.в Реакцию проводили в атмосфере аргона. За ходом реакции следили по понижению рй, постоянно подтитро-вывая ферментную сглесь 0,1 н раствором ЫаСН до рН 7,6-7,9. Реакцию прекращали добавлением 50$ раствора ТКУ (1/10 объема ТКУ - трихлоруксусная кислота - от объема реакционной смеси). В основу дальнейшей частичной очистки и выделения бариевой соли РуДФ положен метод Хорекер с сотр. (Ясгихкет et ol. , ШНШ Ln ЕггзутоЬ^у , 1957, 3, 193) с некоторы-

ми модификациям.

Супернатант, полученный в результате осакдения реакционной смеси"ТХУ и центрифугирования при 4000^ , в течение 10 мин тщательно перемешивали с активированным углем одной

из марок: КАД-И, ОУ-Б, АГ-5, ЕАУ. Уголь из этой смеси удаляли центрифугированием или вакуумным фильтрованием на воронке Битера. При такой обработке поглощение углем нуклеотидов практически полное, Ешюд РуДФ зависит от степени промывания угля водой (4-5-кратное).

г Супернатант и промывание вода кристаллическим МаНСОд доводила до рН 6,0, .затем добавляли раствор I н ацетата бария для перевода РуДФ в бариевую соль, который осаждали 30$ этанолом (конечная концентрация по объему).

Осажденный РуДФ - бариевая соль (после центрифугирования) доводили до постоянного веса над пятиокисью фосфора в вакуум-эксикаторе цра 0°0, определяли его активность (после перевода в натриевую соль), содержание фосфора в нем и использовали в работе.

Элементарный анализ одного из образцов РуДФ - бариевой соли показал соответствие формуле ^^дО^Р^Д^ * ^¡з0* Экспериментальные данные, % : С - 8,60; 8,69; II - 2,82; 3,09; Р - 8,8; 13,0; 7,72. Расчетные данные, % : С - 8,49; Н - 3,10; Р - 8,79. '

Радиохроматографический анализ РуДФ после исследования его на активность в реакции карбокышгрования радиометрическим методом в присутствии исходного экстракта хешавтотроф-ных водородных бактерий йюс/епотоасл 2-1 показал

наличие лишь одного продукта - фосфоглшернновой кислоты.

Частоту РуДФ определяли также по содеряанию фосфора. Фосфор, содержащийся в РуДФ, учитывали как цел очегидролазуе-шй. По разности между общим фосфором и суммой щелочегядро-лизуемого и минерального фосфора определяли содержание органических примесей в полученном препарате РуДФ (табл. 5).

Таблица 5 Анализ РуДФ по фосфору (в %)

Препарат Ще/ючегидролизуешй Минеральный Неизвестный ор-РуДФ фосфор (фосфор РуДФ) фосфор ганический фосфор

I П

43,5 78,4

18

О

38.5

21.6

4. Отделение тжбулозодифосфаткзрбоксилазы от сотпггству-

■ии Ферментов.

С целью изучения свойств РуДФ - карбоксилазы 'О Ькьо> -58В была произведена очистка этого фермента.

Из дакннх, представленных в табл. 6 видно, что активность РуДФ - карбоксилазы и включение НСИ03" в присутствии Р5Ф и АТ5 в исходной экстракте тионошх бактерий выражается сравнительно ниэкиш величинами: 70 я 23 мЕД /мг белка соответственно. Б результате центрифугировании при 140000 £ и осаздения белков сульфатом аммония удельная активность РуДФ--карбоксаказы и включения НС^Од- в присутствии Р5Ф и АТФ возрастает.

При ионообменной хроматографии максимальная активность РуДФ - карбоксилазы наблидается во фракциях Я? 14-18. Хотя максимум фйпссации ПС*40д~ в присутствии Р5Ф и АТФ несколько сдвинут по отношению к максимуму фиксации в присутствии Ру№, освободиться от примеси фосфорибулокшгазы не удается.

Б элюате с колонки, заполненной гидроксилапатитом, получено 5,3 мг белка, который щи электрофорезе в полиа1фйла-миднок геле имеет лишь одну полосу Срио.5), Молекулярный вес этого белка, белка РуДФ - карбоксилазы, равен 480000 и очень Слизок к молекулярному весу - карбоксилазы тионавой бактерии Я , который равен 436000 {МсСйч1и ,

СЯгаиРеЗ , 1373). Удельная активность РуДФ - карбоксилазы на последней стадии очистки составляет 2000 мЕд/мг белка. Таким образом, достигнута 30-кратная степень очистка РуДФ -карбоксилазы, однако полностью освободиться от примеси фос-форибулокиназы не удалось, что предполагает наличие трудно разделимого комплекса этих двух ферглентов ( Мое ВВюи аВ. , 1968). 0

КАРБОКСНМШ ТРЕБПЕРОДНЫХ АКЦЕПТОРОВ В ЭКСТРАКТАХ ИЗ КЛЕТОК Х.1ЬсХ>ОХа1аП-4 58й

Как било показано шше, среди ранних продуктов хемосинтеза 5Т ~Ск.1гО-ох1с1ап-5 58К. быстро появляется ас-

Таблица 6

Выход белка и активность ферментов на различных стадиях очистки РуДФ - карбоксилазн бес клеточного экстракта У ОгиЗОхСсктА 58Й.

Стадии Фракций Й1ХОД белка Удельная активность (мЕи/мг белка) Общая активность. (мВД 1

очистки мг % на на Р5Ф и АТФ на Руда на Р5Ф и АТФ

1 Центрифугирование Иадосадочтшя жидкость 17000 £ Надосадочная жидкость 140000^ 553,0 450,0 100 81,4 70 130 23 60 38700 58500 12700 27000

Осаждение " ■ < Н4>2 °4 Фракция 0,0-0,6 354,0 64,0 — — ^ _

Фракция 0,3-0,!: 224,0 40,5 320 220 71680 49280

Ш Хроматография ДЕ-22 целлюлоза 140,0 20,3 460 262 44097 11763

1У Хроматография Гидро кс ил ап атит 10,3 1,9 2000 460 13345 4703

у\

' В таблице указана максимальная активность ферментннх препаратов, полученных на разных стадиях очистки.

Рис. 5. Электрофорез ' РуД5 - карбоксилазн в полиакрилат.ташом геле. I - РуДО - карбоксилаза.

V*

ттарагановэя кислота, что указывает на возможность реакций карбоксшпгрования, приводящих к образованию щавелевоуксусной кислоты, лз которой путем амннировашя образуется аспараги-нозая кислота.

Кроме того высказывалось предположена (ёитк^ , -'ик-плтап. , К&Я) о возможном преобладающ: активности фермента фосфоенолпируваткарбоксилазы (4.1.1.31) (ортсфосфат: оке ало айе та т-карбокси-лна за фосфорллирушзя, 4.1.1.31) над активностью РуДО - карбокешшзы гтрп малых ковдектрацнях углекислоты, шеших место при высокой кислотности среды, ок-рухашей Ж {ргсоохШапл

В связи с этим была проверена активность ферментов, карбоксклирующих фосфоенолпкруват (ОМ) и шгруват (ПВК).

Из данных таблицы- 7 видно, что заметной активностью обладают <5531 - карбоксилаза (4.1.1.31), ФЕ1 - карбоксил23а .(4.1.1.32) (ГТ&: оке алоаце та т- карб окси-лназ а трансйосфор:;-лирушая, 4.1.1.32) и ыалак-энзии ( )- - мадат: НАДО - океи-редуктаза декарбоксклирушая, 1.1.1.40). Однако сугя.зрная активность этих ферментов составляет лишь около ¿3 от активности Руда - карбоксилазы. ФЕИ - карбоксилаза (4.1.1.38) (пиро-фосфат: оке ал о аде та т-карбокси-ллаз а, 4,1.1.38). действие

Таблица 7

Активность карбоксклаз акцепторов

в исходных экстрактах ХНЮсшйам 58Р>.

Фермент ре Активность, мЕц/мг белка

ош - карбоксалаза (4.1.1.31) 7,5 6,2 0,10 1,67

ФЕИ - карбоксилаза (4.1.1.32) 5,2 следы 1,32

ФЕИ - карооксилаза (4.1.1.38) р; ' » ц-г 6,2 нет нет

Малик-энзим 7,5 0,*?

ФЕП - к&рбоксилаэы (4.1.1.31), а также ФЕП - карооксилозы (4.1.1.32) направлено, главным образом, на образование щаве-левоуксусной кислоты, являющейся истотайком происхождения . аспарагиновой а Глутшинйёой ь&слот, й аьааго-нислот, из них образующихся. Действие маЛик-энйИна &&МючаеТ'ся в синтезе яблочной кислоты к, по-ввдшому, в дальнейшем образовании аминокислот через Фуиарат.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Па основании имеющихся литёратурных и полученных нам данных можно сделать вывод о том, что у У 1к1оох1сСсиь5 5ВЯ имеется ферментная система первичного акцептирования углекислоты, с участием которой в клетке образуется фовд углекислоты. Скорость акцептирований углекислоты атой системой примерно в 30-40 раз превышает скорость к&рбоксайирбвания РуДФ. По нашему предстайлеНиго система первй^нбго акцептирования углекислоты характеризуется: I) спой&бйбб¥ью действовать при значительной кислотности срёЯы (рН 3,06,4); 2) сравнительно высоким сродством к утяекйол&тб (кажущаяся Ку .для КС- раз-

на 1,0 iflUi 3) способностью активировать С02 и превращать ею в ион HCOß". Этим требованиям отвечает фермент карбоан-гидраза, обнаруженный кагщ в экстрактах клеток ^ thioc^ -clans 58R .

Дальнейшее превращение иона HCGg" в 00^ > являвшегося субстратом РуДФ - карбоксилазы происходит либо с участием другой карбоаыгидразы (возможно, изоэнзима), либо нефермен-тативно.

Восстановительный пектозофосфатный цикл остается основным биохимическим механизмом первичного усвоения углерода, поступавдего из фонда углекислота в стабильные цродукты хемосинтеза Jihloo-xidun-i 58Е. , о чем свидетельствуют кинетика состава ранних продуктов хемосинтеза и знэимологи-ческие данные. Наряду с продуктами восстановительного пенто-зофосфатного цикла очень рано образуются аспарапшовая и глу-ташиовая кислоты. В связи с этим бала исследована активность ферментов, катализирующих карею квитирование трехуглеродных акцепторов (ФЕИ и ПЕК).

Карбоксшшрования на трехуглеродных акцепторах при хемосинтезе ihiücoc^cia-nA 58R имеют вторичный характер. Активность феряентов: ФИГ - карбоксилазы (4,1,1.31), ФЗШ - карбоксилазы <4.1.1.32), малик-энзаыа, катализирущих это карбоксилироваше, составляет лишь 4% от карбоксшшрования, катализируемого РуДФ - карбоксилазой. Действие этих ферментов направлено на синтез ШУК и яблочной кислоты через ФЕП, в свою очередь образующуюся, из ФГК цякла Кальтна. 1ПУК и яблочная кислоты являются источником образования аспарагиновой и глутаминовой кислот, являшихся исходным продуктом для ряда важнейших биосинтезов.

В настоящей работе мы пытались проследить путь углерода с момента вхождения его в клетку, изучая при этом лишь основные свойства ферментов, катализирующих превращения углерода* Глубокое исследование особенностей важнейших ферментов ассимиляции углерода у thiOQOUdwM 58В. , в том числе а иарбоангидразы, значительно приблизило бы решение задач,

связанных с общей проблемой автотрофной ассимиляции углерода.

ВЫВОДЫ

I. Установлено,' что интенсивность ассшшишии углекислоты клетками: S- thioaxlUarui E8EL возрастает пропорционально концентрации бикарбоната до 0,113 Ш. Половина максимальной скорости ассимиляции бикарбоната целыми клетками, извлеченными из культуры, достигается при его концентрации I *4i. Максимальная Скорость ассимиляции бикарбоната составляет 0,067 мкмоль на мг белка за I мин*

__ 2. Выяснены оптимальные условия массового выращивания . У, thirGüxidan-i 58R . Установлено, что повышение

концентрации С02 в воздухе, продуваемом через культуру S'■ thicooci-dan-*. 58В , до IQJ приводит к увеличению вы-

хода биомассы в 2,8 раза (по содержанию белка).

3. Доказано образование фонда углеетгслоты в клетках

th^Q-ooc-läan-i 58В. , Установлено, что его образование

происходит с участием карбоангидразы, Изучены основные свойства карбоангидразы У. t-fiiaoocuaxr^s 58R . Определена активность карбоангидразы, которая составляет 3,4 кгаюль COg , гидратировышого за I мин на мг белка* Показано, что активность карбоангидразы в процессе роста Т. ibCo<ncicUtri^ 58R. коррелирует с активностью фиксации углекислоты целыми клетка-' ми. Показано также, что сульфаниламид в концентрации 1,8-2, СШ тормозит активность карбоангидразы в экстрактах из клеток

5F-. thieexi-dan* 58R на 502 и ассимиляцию це-

лыми клетками на 16,355 - 23,9%.

4. Ю&нетическима методами с применением C^^Og показано, что основная масса радиоуглерода при кратковременном хемосинтезе У- t-hie-cocicUtnA 58R включается через цикл Кальвина. Обнаружение глицериновой кислоты среди ранних продуктов хемосинтеза S- thiDGxUt&rt-i 58В мажет быть объяснено действием кислой фосфатазы ФГК, активность которой в исходных экстрактах составляет 20 мЕл/мг белка.

5. В экстрактах из клеток У- iniocoeiä-arU 58R. od-

ределеаа активность ферментов фазы карбоксилировашя цквла Кальвина. Активность РуШ - карбоксилазы составляет 39 -- 120 мЕд/иг белка; фосфорибулокиназы - 240-380 мЕц/мг белка; рибозофосфатязомерази - 460-1500 мЕд/мг белка.

6. На основе изучения активности ртбозофосфатизомеразы и фосфорибулокиназы, принимающих непосредственное участие в регенерации акцептора С02 в цикле Кальвина, предложен способ препаративного получения РуДФ из Р5Ф и А"ЕФ и разработана его технология.

7. В результате очистки руДФ - карбоксилазы получено около 1% белка, который при электрофорезе в падиакриламидном геле дает одну полосу. Молекулярный вес РуДФ - карбоксилазы составляет 480000. Величина удельной активности очищенной РуДФ - карбоксилазы равна 2,0 Е1д/мг белка.

8. Изучены основные свойства карбоксилаз трехуглеродшхх акцепторов. Активность ФЕИ - карбоксилазы (4.1.1.31) составляет 1,67 мЕя/мг белка, ФЕП - карбоксилазы (4.1.1.32) - -1,32 мЕд/мг белка, малик-энзима - 0,7 мЕй/кг белка. ФЕП - кар-боксилаза (4.1.1.38) в экстрактах клеток ^ Уис-ахлскт

не обнаружена.

9. Предложена схема пути ассимиляции углерода у V . О'зсСаап-Ь 58В, в процзссе хемосинтеза.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Романова А.К., Еилина Т.Н., Чекина Н.Г., Заварзин Г.А., 1966. Ассимиляция тионовыми бактериями. Тезисы докладов IX Международного конгресса по микробиологии. Москва ЕЭ/27, 175.

2. Романова А.К., Заварзин Т.А., Чекина Н.Г., 1969. Влияние кислотности среды на продукты хемосинтеза тионо-вых бактерий. Известил АН СССР, сер.биол., 3, 363.

3. Чекина Н.Г., Романова А.К., Санжиева Э.У., 1969. К вопросу о начальных этапах ассимиляции углекислоты

у тионовых бактерий. П Всесоюзный биохимический съезд, тезисы докладов. Секция 20. Ташкент, 26.

4. Русинова Н.Г., Романова А.К., Заварзин Г.А., Санаш-ева Э.У., Фельдитейн Н,М., 1971. Закономерности развития тионовых бактерий . SHlich'OJiUiu^b 58В, и влияние яекоторш; факторов питательной среда,на ассимиляцию углерода. Микробиология, 40, вып.З, 252.

5. Русинова Н.Г., Романова А.К., Литовченко Г.Н., Го-ман Н,Г., 1971, Особенности фиксации углекислоты тио-новымн бактериями 5ThLDbutil&u& 58Е . Микробиология, 40, вип.5, 765.

6. Лэман Н.Г., Романова А.К., Русинова Н.Г., Литовченко Г.Н., 197I. Способ получения 1>-рибулозо-1,5-дифос-фата. Авторское свидетельство на изобретение К 309610.

7. Романова А.К..Русинова Н.Г.,Корняцкая В.М.,1972. Об участии карбоангпдразы в ассго.кшщш углекислоты при Хемосинтезе 5%iob-c^t-lb.^ 56В . X оклады

АН СССР, 203, Д 5, 1209.

8. Романова А.К.,Русинова Н.Г. .Васильева Н.Я. .Корницкая В.М.,1973. Рибозофосфатлзомераэз,фосфорибулокиназа я рибулозодкфосфаткарбиксилаэа в экстрактах из клеток Shiob-œ^i-êu-i thiooxicl-û-nî 58 R. Ей охимия,38,JS 3,454.

9. Романова А.К., Русинова Н.Г.,1974. Фиксация углекислоты на трехуглеродных акцепторах у облигатного хемоав-тотрофа Jsfii&'t-aci-Îùii, thiO-oyUUaru, 58Ив печатя.

Результата исследований долоебны:

I. На IX Международном Конгрессе по микробиологии. Москва, 1966.

' 2. На П Всесоюзном биохимическом съезде. Ташкент, 1969.

3. На конференции молодых ученых Ордена Ленина Института биохимии им. А.Н.Баха, апрель 1370.

*|одп._и лея. 3/71-74 г. Зяк. 774. тир.200, Печатно-мноьит.пр-во ШС, К.-Басманная,6