Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические аспекты стабильности экспрессии гетерологичных генов в клетках Chlamydomonas reinhardtii

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические аспекты стабильности экспрессии гетерологичных генов в клетках Chlamydomonas reinhardtii"

рг Б ОД ? в НОЯ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ФОТОСИНТЕЗА

На правах рукописи УДК 582.264:577.21:579.25

БУТАНАЕВ АЛЕКСАНДР МИХАЙЛОВИЧ

БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СТАБИЛЬНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ СШАМУВОМОМБ ЕЕШНАНВТП

03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУВДНО - 1994

Работа выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН и Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Ладыгин Владимир Георгиевич Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Климов Вячеслав Васильевич кандидат биологических наук Зимин Андрей Антонович

Ведущее учреждение: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Защита диссертации состоится ло декабря 1994 г. в 9 час. СО мин. на заседании Специализированного Совета Д 200.29.01 при Институте почвоведения и фотосинтеза РАН по адресу: 142292, Московская область, г. Пущино.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института почвоведения и фотосинтеза РАН.

Автореферат разослан. . ноября 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

Актуальность проблемы. Одноклеточная эукариотическая зеле-ия водоросль СМатуйотопаэ гегпкапНИ является исключительно удобным модельным объектом в изучении ряда биологических процессов, таких, как структура и функция жгутиков, взаимодействие слеток во время спаривания, клеточный цикл и, прежде всего, фотосинтез.

Применение техники рекомбинантных ДНК в значительной мере шособствовало прогрессу в данной области исследований, в част-гости в изучении структуры и функции фотосистем I и II. Однако, ■фепятствием к дальнейшему развитию генетической инженерии ^Штуйошопаз является проблема нестабильной экспрессии гетеро-тогичных генов в клетках этого организма.

К настоящему моменту имеется ряд фактов, свидетельствующих 5 пользу возможности экспрессии чужеродных генов в хлоропласте этой водоросли, но экспрессия гетерологичных генов, интегрированных в геном ядра, все еще остается достаточно сложной принци-мальной проблемой, решение которой предстоит найти. Немногочис-тенные факты, касающиеся трансформации ядерного генома С. *етНагйЬН гетерологичными генами, весьма противоречивы и вряд ш дают возможность сделать обоснованный вывод о причине их не-¡табильной экспрессии.

Настоящая работа посвящена изучению стабильности экспрессии "етерологичных генов в клетках С. гетЫгМгг. *

Цель и задачи исследования. Целью работы было исследование фичин нестабильной экспрессии гетерологичных генов в клетках ЖЬатуйотопаэ гетПагйЫг. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1) создание эффективного метода трансформации Шатуйотопаз и надежной системы селекции трансформированных слонов, содержащих последовательность гетерологичного гена; !) получение трансформантов, содержащих последовательности гете-юлогичных генов; 3) изучение экспрессии гетерологичных генов в слетках водоросли.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан гетод трансформации С. гетПагйШ посредством электропорации. [ля трансформации водоросли сконструированы векторы, содержащие ! качестве гетерологичных селективных маркеров бактериальные ге-[ы, обусловливающие устойчивость к гигромицину (Прг) и канамици-[у (прг-П). Впервые показано, что для СШатуйотопаб система се-

лекции, включающая ген hpt, имеет значительные преимущества по сравнению с селекцией на устойчивость к канамицину. Результаты анализа гигромицин-устойчивых трансформантов позволили сделать вывод о том, что, несмотря на стабильность последовательности fipt в процессе митоза, устойчивость к гигромицину фенотнпически проявляется как крайне нестабильный признак. Далее, бь.ло обнаружено, что ДНК-повреждающие факторы способны увеличивать стабильность экспрессии гетерологичных генов в клетках Chlamydomonas, что подтвердилось в прямых экспериментах по определению активности неомицинфосфотрансферазы-П (продукт гетерологичного гена npt-II). Наконец, было выдвинуто предположение о том, что полученные результаты можно интерпретировать на основе известных фактов, касающихся убиквитин-зависимой системы протеолитической деградации белков. Результаты настоящей работы, несомненно, будут иметь значение в решении проблемы экспрессии гетерологичных генсв в клетках С. rsinharcLtii, что, в свою очередь, будет способствовать развитию как фундаментальных, так и прикладных исследований в данной области.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены й обсуждены на международной конференции "Soviet-Indian symposium on regulation of photosynthesis" (Pushchino, 1990) на семинарах отдела фотобиотехнологии ИПФС РАН и на заседаниях Ученого совета ИПФС РАН.

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 3 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 11 рисунков и 12 таблиц. Список цитируемой литературы включает 92 наименования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Трансформация С. reinhardtit

1. 1. Конструирование плазмид

Для изучения трансформации С. reinhardtii гетерологичными генами был сконструирован ряд вектороз интегративного типа. В

качестве доминантных селективных маркеров были выбраны бактериальные гены гигромицинфосфотрансферазы (hpt) Е. coli (Gritz а. Davies, 1983) и неомицинфосфотрансферазы (npt-II) из транспозона Tn5 (Beck et al., 1982).

Конструкцию трансформирующего вектора с доминантным селективным маркером устойчивости к гигромицину получали следующим образом. ДНК плазмиды pPCV 730, представляющей собой вектор для трансформации растений, обрабатывали BamHI, выделяли фрагмент 1,1 т. п. о. с кодирующей последовательностью гена hpt (Gritz а. Davies, 1983) и лигировали его с фрагментом HíndIII - Hpal 3,5 т.п.о. плазмиды pSV2 CAT (Gorman et al., 1983), содержащим промотор и сайт полиаденилирования ранних генов вируса SV40. Липкие концы предварительно заполняли в реакции с фрагментом Кленова. Далее трансформировали лигазной смесью штамм НВЮ1 Е. coli и отбирали бактериальные клоны с прямой ориентацией гена hpt. Полученный вектор, pCTV Hyg (Chlamydomonas transforming vector), использовали для трансформации С. reinhardtii (рис. 1).

Конструкцию трансформирующего вектора с доминантным селективным маркером устойчивости к канамицину получали следующим образом. Плазмиду pSV232A-L (De Wet et al., 1987) гидроли-зовали HtndIII и Smal. После этого выделяли фрагмент 6,6 т.п.н., содержащий промотор ранних генов и сайт полиаденилирования вируса SV40, и лигировали его с фрагментом Bglll-BawHI размером 1,0 т.п.н. плазмиды pMON 129 (Fraley et al., 1983), представляющим собой кодирующую часть гена npt-II (Beck et al., 1982). Липкие концы предварительно заполняли в реакции с фрагментом Кленова. Штамм НВ101 Е. coli трансформировали лигазной смесью и отбирали бактериальные клоны с прямой ориентацией гена npt-II. В результате была получена плазмида pCTV Neo, предназначенная для трансформации С. reinhardtii (рис. 1).

К рис. 1. Структура плазмид pCTV Hyg и pCTV Neo. Показана структура исходной плазмиды. pSV2 Cat, и производных от нее, pCTV Hyg и pCTV Neo, линеаризованных в сайте EcoRI. CAT - хло-рамфениколацетилтрансфераза, НРТ - гигромицинфосфотрансфераза, NPT-II - неомицинфосфотрансфераза, Amp" - устойчивость к ампициллину, Psv40 - промотор ранних генов вируса SV40, рА - сайт полиаденилирования вируса SV40, Е - Ecofíl, Ps - PstI, Pv -PvulI, H - HtndIII, Hp - Hpal, В - BamHI, Bg - Bglll. Sm - Smal.

CAT

I- R P8V40 pA E

Amp --

pSV2 CAT I __ _ , I

I I I п г

Р» Pv И Hp В Ps

pCTV Hyg

HPT

R Pav40 PA e

Amp _

Ps

Pv

II 1 1

Ps L- В Ps

H/B B/Hp

0.7

1.6 0.3 1.1 0.1 0.6 0.2

_I—I_U_LI

4.6 kb

T R Amp NPT-II P»v40 PA

pCTV Neo

1 Ps F Pv II Ps Pv 1 1 В Ps

H/Bg B/Sm

0.7 1.6 0.3 1.0 OA 0.6 0.2

_I_'I I ' I I I

6.2 kb

E

Рис. 1. Структура плазмид pCTV Hyg и pCTV Neo.

1. 2. Электропорация

Работа по изучению трансформации С. гегпЪаг&Ш гетероло-гичными генами была начата в 1989 г.. когда еще не были разработаны эффективные методы введения экзогенной ДНК в ядро этого организма. В качестве метода трансформации клеток водоросли был избран электрический пробой биомембраны (е1ес1;горога1;1оп).

В экспериментах по трансформации С. ге1пМгйШ использовали систему селекции, включающую ген НрЬ в составе плазмиды рСТУ Hyg и селективную среду с гигромицином в концентрации 10 мкг/мл, а также штамм суг-15 (мутант, дефектный по клеточной стенке). Для того, чтобы найти оптимальные условия трансформации, клеточную суспензию с»М5 подвергали действию электрического импульса разной длительности и амплитуды в различных их комбинациях.

Как можно судить по результатам этих экспериментов, наиболее эффективной была трансформация при длительности импульса 2 мс и напряженности электрического поля 1 кВ/см. В этом случае можно было получить около 103 колоний, устойчивых к гигромицину.

1. 4. Зависимость эффективности трансформации от фазы роста культуры

Была исследована также зависимость эффективности трансформации от фазы роста культуры. В этих экспериментах для трансформации отбирали клетки через определенные интервалы времени на стадии ранней логарифмической фазы роста, в середине ее, на стадии поздней логарифмической фазы роста и из стационарной фазы роста культуры.

Наибольший выход Нуя11-колоний был в том случае, если в эксперименте использовали культуру, находящуюся в середине логарифмической фазы роста (_106 клеток/мл). Эффективность трансформации резко падала при плотности культуры более 106 клеток/мл. и при плотности культуры 3 х 106 клеток/мл и более, получить трансформанты не удавалось.

1. 5. Молекулярно-генетический анализ трансформированных клонов

Избранная система селекции на устойчивость к гигромицину оказалась весьма удачной в том отношении, что она лишена недостатков, связанных с маркером устойчивости к канамицину, пр1-П. Это проявлялось в том, что:

a) клетки С. гетШгМИ сю-15 крайне чувствительны к концентрации гигромицина 10 мкг/мл и при посеве на чашку в мягком -агаре погибали через 4-5 дней;

b) спонтанные мутации устойчивости к гигромицину можно было не принимать во внимание, так как из 108 клеток, высеваемых на селективную среду в контрольном эксперименте, не появлялось ни одной Ну^-колонии.

Отдельные Ну^ - клоны поддерживали, постоянно пересевая, в течение восьми месяцев на неселективной среде без гигромицина. После 8 месяцев непрерывного роста на неселективной среде из Ну^-клонов была выделена суммарная ДНК, которую обрабатывали г^Н , разделяли в 0,8% агарозном геле, переносили на капроновый фильтр и гибридизовали с фрагментом ВатН! плазмиды рРСУ 730, содержащим кодирующую последовательность ft.pt.

Результаты гибридизации двух таких клонов представлены на рис. 2. РэП гидролизует рСТУ Hyg на три фрагмента (2,7, 1,0, и 0,9 т. п. о.), два из которых гомологичны зонду (2,7 и 1,0 т. п. о.)

2.7 - ' т

1.0

12 3 4

Рис. 2. Гибридизация суммарной ДНК Нуя11-клонов с ^-специфичным зондом. Суммарную ДНК из нетрансформированного исходного штамма сш-15, трансформированных клонов Н-1, Н-2 и ДНК плазмиды рСТУ Нуя гибридизовали с фрагментом ВатН! плазмиды рРСУ 730, содержащим кодирующую последовательность гена Пр!;. Количество нанесенной на гель ДНК СМатуйотопаз - 5 мкг, рСТУ Ну8 - 100 пкг. 1 - рСТУ нув; 2, 3 - Н-1, Н-2; 4 - суМ5.

(рис. 1). Как можно видеть из рис. 2, последовательность hpt присутствовала в геноме трансформантов и отсутствовала в геноме ¿сходного нетрансформированного штамма cw-15.

1. 6. Определение эффективности посева трансформантов на селективной среде

Несмотря на то. что ДНК pCTV Hyg, интегрированная в геном С. reinhardtii. наследовалась стабильно в течение, по крайней мере, восьми месяцев, устойчивость к гигромицину проявлялась как крайне нестабильный признак. Особенно явно это было видно из результатов экспериментов по определению "эффективности посева трансформантов на селективной среде, которые позволили сделать вывод о том, что лишь несколько процентов клеток в высеваемой популяции сохраняют устойчивость к Hyg.

Одинаковые результаты имели место как непосредственно после получения трансформантов, так и через 8 месяцев. Повторный эксперимент с HygR-клонами, изолированными в первоначальном эксперименте по определению эффективности посева, дал тот же результат. В контроле, где использовался исходный штамм cw-15, на среде с гигромицином клетки погибали.

Таким образом, исходя из результатов работы по трансформации Chlamydomonas с использованием в качестве селективного маркера гена hpt, можно заключить, что структурная нестабильность, т.е. нестабильность интегрированных последовательностей экзогенной ДНК, по-видимому не является причиной нестабильности трансформированных клонов. ~В противном случае, в результате сегрегации последовательность hpt утрачивалась бы, в результате чего, в конечном счете, все клетки HygR-трансформантов потеряли бы устойчивость к Hyg. В действительности, результаты гибридизации, а также результаты экспериментов по определению эффективности посева дают возможность полагать, что это не так.

Принимая во внимание известные факты, свидетельствующие в пользу стабильности гетерологичных последовательностей в ядре Chlamydomonas, возможности их транскрипции и активности чужеродного белка, а также результаты собственных исследований, можно было .полагать, что причину нестабильности следует искать на уровне стабильности продукта гетерологичного гена, т.е. протео-

литической устойчивости белка. Это предположение было принято в качестве рабочей гипотезы для дальнейших исследований.

2. Изучение стабильности экспрессии гетерологичных генов

2. 1. Эксперименты по мутагенезу С. reinhardtii

Прямым следствием рабочей гипотезы было предположение о возможности повышения стабильности чужеродных белков у Chlamydomonas, используя систему селекции на устойчивость к гиг-ромицину и методы мутагенеза.

В пользу данного предположения свидетельствуют также факты о генетической детерминации стабильности гетерологичных белков у ряда организмов, в частности у Е. colt (Goldberg a. St. John, 1976) и Saccharomyces cerevisiae (Suzuki a. Ichikawa, 1989). Если допустить, что подобные мутации возможны у С. reinhardtii, то их поиск можно было бы осуществить посредством отбора клонов с более высокой устойчивостью к гигромицину и (или) с более стабильным проявлением данного признака. Такой эксперимент было бы невозможно поставить, используя селективный маркер устойчивости к канамицину (npt-II), вследствие высокой частоты спонтанных мутаций к Km-устойчивости у Chlamydomonas.

В качестве мутагенных факторов были выбраны ультрафиолетовое излучение (UV), N-нитрозометилмочевина (NMU) и феназинмето-сульфат (PMS). Обработанные мутагенами клетки высевали в мягком агаре на селективную среду содержащую Hyg в концентрации 15 и 20 мкг/мл.

Несмотря на значительное время, потраченное на эти эксперименты, все попытки получить клоны с более высокой устойчивостью к гигромицину и (или) более высокой стабильностью проявления признака оказались безуспешными.

Тем не менее, в ходе экспериментов по мутагенезу было обнаружено, что мутагенные факторы способны радикальным образом увеличивать стабильность фенотипического проявления признака устойчивости к гигромицину у трансформированных клонов.

В связи с этим, можно было предположить, что такие мутагены, как UV-излучение, NMU и PMS, возможно, способны тем или иным образом влиять на экспрессию гетерологичных генов в клетках С. reinhardtii.

2. 2. Изучение влияния ДНК-повреждающих факторов на экспрессию гетерологичных генов hpt и npt-ll

Прежде всего, с целью более детального изучения влияния факторов, повреждающих ДНК, на устойчивость к гигромицину ■IygR-клонов, в последующих экспериментах исследовали зависимость lyg-устойчивости трансформантов от присутствия в среде PMS и NMU з различных концентрациях. Для этого, Hyg"-клоны выращивали на зреде, содержащей гигромицин в концентрации 10 мкг/мл и соответствующий мутаген в диапазоне концентраций 10 нМ - 1 мкМ. В сачестве контроля использовали исходный нетрансформированный зтамм cw-15 и штамм дикого типа с137.

Трансформанты были способны к росту на селективной среде ^олько в присутствии мутагена. В контрольном варианте cw-15 и ¡137 погибали как в отсутствие, так и в присутствие мутагена, [ругими словами, в диапазоне концентраций 10 нМ - 1 мкМ PMS и fMU способствовали стабильному проявлению признака устойчивости : гигромицину у всех изученных HygR-трансформантов (85 клонов).

Кроме доминантного селективного маркера hpt в дальнейших :сследованиях изучалась возможность использования в качестве та-:ого же маркера гена npt-II. Для этой цели была сконструирована лазмида pCTV Neo, содержащая ген npt-II под контролем промотора анних генов вируса SV40 (см. 1. 1.).

' В экспериментах по трансформации cw-15 плазмидной ДНК pCTV ео, использовали явление котрансформации (Kindle et al., 1989). летки cw-15 трансформировали в присутствии смеси ДНК pCTV Hyg и CTV Neo в концентрации 5 мкг/мл. Далее, на среде с Hyg в кон-ентрации 10 мкг/мл проводили селекцию Hyg"-колоний. Отдельные yg*-клоны размножали в отсутствие селекции и высевали на среду одержащую Km (50 мкг/мл) и PMS (10 нМ) для отбора Кшй-клонов. оля клонов, устойчивых к канамицину составляла 5-10%.

Для того, чтобы подтвердить присутствие экзогенной ДНК в еноме Km"-трансформантов, суммарную ДНК, выделенную из этих лонов, гибридизовали с ДНК плазмиды pCTV Meo. Результаты гибри-изации, представленные на рис. 3, позволили сделать вывод о ом, что экзогенная ДНК присутствовала в геноме трансформантов и гсутствовала в геноме исходного штамма cw-15. На рисунке два оагмента pCTV Neo, близкие по размеру, мигрируют вместе (2,1 и

2,0 т.п.н.).

Полученные KmR-клоны были использованы для изучения зависимости стабильного проявления признака устойчивости к Кш от присутствия в среде ДНК-повреждающих агентов, PMS и NMU. В этом эксперименте KmR-трансформанты высевали на среду, содержащую Кш в концентрации 50 мкг/мл и PMS или NMU в диапазоне концентраций 10 нМ - 1 мкМ. Результаты эксперимента позволили заключить, что стабильный рост KraR-трансформантов (75 клонов) на селективной среде имел место лишь в присутствии PMS или NMU.

Таким образом, в экспериментах по изучению зависимости стабильности проявления признака устойчивости к Hyg и Km у HygR- и KmR-трансформантов, соответственно, в присутствии таких мутагенов, как PMS и NMU, было показано, что эти соединения даже в незначительных концентрациях способны увеличивать стабильность фенотипического проявления признака, детерминируемого гетероло-гичным геном.

Подобные эксперименты проводились также с использованием ультрафиолетового излучения, но в этом случае результаты были менее четкие и поэтому не приводятся. По-видимому, это можно объяснить тем, что клетки облучались кратковременно, в то время, как действие PMS и NMU на клетку являлось постоянным.

12 3 4 5 Рис- 3. Гибридизация суммарной ДНК KmR-клонов с pCTV Ner\ Суммарную ДНК из нетрансформированного исходного штамма cw-15 и трансформированных клонов (К-1, К-3, К-4) гибридизовали с ДНК плазмиды pCTV Neo, гидролизо-"" ванной ВатHI. Количество нанесенной

^ на гель ДНК Chlamydomonas - 5 мкг,

2.2т PCTV Neo - 100 пкг. 1 - pCTV Neo;

2,1J~ - ~ " 2, 3, 4 - K-l, K-3, K-4; 5 - cw-15.

0.9 _

-IIIS последующих экспериментах, в которых ген npt-II использовался в качестве гена-репортера, изучалась активность неомицин-$осфотрансферазы в клетках KmR-трансформантов в зависимости от присутствия в среде PMS или NMU (рис. 4). Активность NPT-II оп-эеделяли в грубом экстракте из клеток водоросли по методу Стэбе-пя и др. (Staebell et al., 1990). Активность присутствовала в гом случае, если трансформированные клоны росли на среде, содержащей PMS или NMU в концентрации 10 нМ (верхний и средний ряд), i отсутствовала, если трансформанты выращивали без этих мутаге-юв (нижний ряд). Кроме того, в результате селекции на среде, содержащей Кш, имела место более высокая активность NPT-II [верхний ряд по соавнению со средним).

PMS NMU

-------- --------

I К-1 К-2 К-1 К-2 • • • • • '

т кш', pms\ nmu+

Кш*. PMS", NMU'

КРис/ 4. Анализ активности ЫРТ-П в клетках Кшк-трансформан-эв (количественный метод, 31аеЬе11 еЬ а1., 1990). Для анализа :пользовали экстракт из клеток двух Кшк-трансформантов (К-1, -2). Кш+, РМБ+ и НМи" - присутствие в среде канамицина. фена-«шетосульфата и нитрозометилмочевины, соответственно. Кш", ЛБ" и ими" - отсутствие в среде канамицина, феназинметосульфата нитрозометилмочевины. (К+) - положительный бактериальный конт-зль, (К-) - отрицательный бактериальный контроль.

• # •

* Ш

Количественный метод Стэбеля и др. (Staebell et al., 1990), хотя и является весьма чувствительным, к сожалению, имеет недостатки. Этот метод не позволяет разделить активность NPT-II и неспецифическую активность внутриклеточных фосфотрансфераз. В связи с этим, для определения активности NPT-II в клетках KraR-трансформантов использовался также более прямой метод Рейс-са и др. (Reiss et al, 1984), который позволяет отделить неспецифическую активность.

На рис. 5 показаны результаты определения активности NPT-II в зависимости от присутствия в среде PMS (10 нМ) с использованием электрофореза экстрактов из клеток водоросли в недена-турирующем полиакриламидаом геле (Relss et al, 1984). Активность NPT-II присутствовала в клетках Кшк-клонов, выращенных на среде, содержащей мутаген (дорожки 3 и 4) и отсутствовала, если мутагена не было (дорожки 1 и 2). Более высокая активность имела

Km" PMS" Km* PMS* Km" PMS+

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 5. Анализ активности NPT-II в клетках KmR-трансформантов (неденатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле Relss et al., 1984). Для анализа,использовали экстракт из клето двух KmR-трансформантов (К-1, К-2). 1, 3, 5 - К-1; 2, 4, 6 К-2; 7 - положительный контроль. Km - канамицин, PMS - феназин метосульфат, "+" - присутствует в среде, "-" - отсутствует среде.

есто в том случае, если клетки подвергались селективному давле-ию на среде, содержащей Km в концентрации 50 мкг/мл (дорожки 3, по сравнению с 5, 6). В качестве положительного контроля ис-ользовался экстракт из KmR-клеток Е. coli.

Таким образом, приведенные выше результаты свидетельствуют пользу того, что активность чужеродного белка (NPT-II) в клет-ах Chlamydomonas зависит от присутствия в среде таких ДНК-пов-еждающих агентов, как PMS и NMU. Необходимо также отметить, го селективное давление все-таки было необходимо для более ста-лльной экспрессии гетерологичного гена. По-видимому, часть чу-зродных последовательностей, интегрированных в геном ядра, все э подвергается или перестройкам, или делециям.

3. Сравнение частот использования кодонов ядерных генов С. reinhardtii и генов hpt и npt-II

Использование кодонов ядерных генов у С. reinhardtii, имеет знденцию к смещению в сторону определенных триплетов (biased Ddon usage) (Mayfield a. Kindle, 1990; Hall et al., 1993; De jstos et al., 1989), а именно: триплеты, у которых на третьем зсте стоит А, используются с крайне низкой частотой. Такое сме-зние, в принципе, может препятствовать экспрессии чужеродных шов в клетках Chlamydomonas, что обсуждалось ранее (Mayfield Kindle. 1990).

В настоящей работе сравнивали частоту использования кодонов гене hpt и npt-II. с результатами, представленными А. Франко L Franco) для ядерных генов в "Chlamydomonas Newsletter" lugust, 1993), которые, по-видимому, являются более репрезента-[вными. Так, например, кодоны, имеющие нулевую частоту исполь-)вания (Mayfield a. Kindle, 1990), судя по данным А. Франко, ¡и не менее, используются, хотя и редко. Результаты обработки (следовательности нуклеотидов hpt (Gritz a. Davies, 1983) и >t-II (Beck et al., 1982) с использованием компьютерной прог-1ммы "Microgenie" показали, что ряд кодонов с концевым А в гене it не используется: ТТЛ. СТА (Leu), ТСА (Ser). В то же время, iyrae такие кодоны используются с частотой, варьирующей от 0,03 i 0,32.

Сходные результаты получены и для гена npt-II: кодоны AGA и 'А имеют частоту использования, равную 0,00 в то время, как

частота использования других кодонов с концевым А варьирует от

0.05 до 0,56. Результаты, полученные для npt-II, подтверждают данные Холла и др. (Hall et al., 1993).

Суммируя, можно сказать, что смещение кодонов (codon blas), по-видимому, не является основным фактором, блокирующим экспрессию гетерологичного гена.

4. Интерпретация результатов

Принимая во внимание самые общие рассуждения, можно полагать, что причина нестабильного фенотипического проявления признака может находиться на любом из трех уровней: ДНК, РНК или белка. Т. е., причиной может быть либо нестабильность интегрированной последовательности чужеродного гена (структурная нестабильность), либо те или иные факторы, влияющие на транскрипцию и процессинг мРНК, • либо факторы, влияющие на синтез продукта гена и на его последующую стабильность. Необходимо также учитывать возможность того, что ядро и хлоропласт могут отличаться в отношении стабильности фенотипического проявления признака.

Говоря о причинах нестабильной экспрессии гетерологичных генов, интегрированных в геном ядра С. reinharätii. две из них, по-видимому, можно исключить. Это - структурная нестабильность и смещение использования кодонов, которое может влиять на эффективность трансляции. Во всяком случае, их влияние на стабильность вряд ли имеет принципиальное значение.

Выше было высказано предположение о том, что причина нестабильности фенотипического проявления признака гетерологичного гена может находиться на уровне стабильности его продукта (см.

1. 6.). Хотя это предположение не подтвердилось в экспериментах по мутагенезу, т.е. мутации, увеличивающие стабильность не были получены, результаты, касающиеся влияния мутагенов на стабильность экспрессии, косвенно подтверждают такую возможность.

Основной результат настоящей работы можно сформулировать следующим образом. С одной стороны, имеет место нестабильность фенотипического проявления признака гетерологичного гена, интегрированного в геном ядра, а с другой стороны, имеет место влияние ДНК-повреждающих факторов в сторону увеличения стабильности проявления этого признака. Каким образом можно интерпретировать эти результаты? Ниже обсуждается возможная связь нестабильности

энотипического проявления гетерологичного гена у сиьатуйотопаэ убиквитин-зависимой системой протеолитической деградации бел-эв.

Деградация внутриклеточных белков играет значительную роль изменении уровня содержания конкретного белка и в элиминации юмальных белков. Убиквитиновый путь, по-видимому, является ос-' эвной системой избирательной деградации белков в эукариотичес-эй клетке.

Убиквитинирование белков имеет место в самых разнообразных эоцессах, но в контексте настоящей работы прежде всего привлечет внимание участие компонентов убиквитиновой системы как в зотеолитической деградации белков, так и в репарации ДНК.

По этой причине, повреждение ДНК, вследствие воздействия на четку мутагенов, возможно, мобилизует систему на выполнение дикций репарации. Как следствие, ее протеолитическая активность зжет уменьшаться, что, в свою очередь, приводит к более высоко! уровню активности чужеродного белка.

Далее, поскольку многие гены, кодирующие компоненты убикви-шовой системы, жизненно важны для клетки, неудачу получения ггаций, увеличивающих стабильность экспрессии гетерологичного ;на, можно было бы объяснить их летальным эффектом.

Разумеется, все вышесказанное можно принять лишь в качестве 1бочей гипотезы для последующих исследований, в отношении кото-IX представляются разумными два подхода. Первое, поиск услов-)-летальных гв-мутантов, способных влиять на стабильность фено-шического проявления гетерологичного гена и, второе, поскольку шестно, что избирательное убиквитинирование белков может завись от и-концевой аминокислотной последовательности, экспери-!нты, направленные на получение слитых чужеродных белков, в ко-:рых Л-концевая область могла бы увеличить стабильность белка.

выводы

1. Разработана методика трансформации С. reinhardtii (штамм cw-15) посредством электропорации.

2. Для трансформации водоросли сконструированы векторы ин-тегративного типа, содержащие гетерологичные селективные маркеры hpt и npt-II под контролем промотора ранних генов вируса SV 40.

3. Впервые показано, что для Chlamydomonas система селекции на устойчивость к гигромицину имеет значительные преимущества по сравнению с селекцией на устойчивость к канамицину.

4. Несмотря на то. что экзогенная ДНК, интегрированная в геном водоросли, была митотически стабильна, устойчивость к гигромицину проявлялась как крайне нестабильный признак.

5. Обнаружено, что ДНК-повреждающие агенты, такие, как фе-назинметосульфат и нитрозометилмочевина, способны радикальным образом влиять на экспрессию гетерологичных генов (hpt и npt-II) в сторону увеличения ее стабильности.

6. Предполагается, что на стабильность экспрессии гетерологичных генов у С. reinhardtii может влиять убиквитин-зависимая система протеолитической деградации белков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. А. М. Butanaev, V. G. Ladygin. Transformation of Chlamydomonas reinhardtii by electroporatlon. // "Soviet-Indian symposium on regulation of photosynthesis". Pushchino. 1990.

P. 8-9.

2. A. M. Бутанаев. Эффективная трансформация одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii посредством электрического пробоя биомембраны (electroporatlon). // Биотехнология. 1994. №4. С. 5-7.

3. А. М. Бутанаев. Использование гена гигромицинфосфотранс-феразы в качестве доминантного селективного маркера для трансформации Chlamydomonas reinhardtii. // Молекулярная биология. 1994. Т. 28. №5. С. 1061-1068.

24.10.94 г. Зак.бЗСТ. Тир.100 экз. Уч.-изд.л. 1,0 Отлечатано на ротапринте в ОНИ' ПНЦ РАН