Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ХИЩНЫХ ГРИБОВ —ГИФОМИЦЕТОВ

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "БИОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ХИЩНЫХ ГРИБОВ —ГИФОМИЦЕТОВ"



МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ТЕПЛЯКОВА Тамара Владимировна

БИОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ХИЩНЫХ ГРИБОВ —ГИФОМИЦЕТОВ

03.00.16 — экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте молекулярной биологии научно произведет венного объединения «Вектор».

Научный консультант — Мацкевич Н. В., доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты Горленко М. В., доктор биологических наук, член-корр РАН, Шильникова В. К, доктор биологических наук, профессор; Бурова Л. Г., доктор биологических наук

Ведущая организация — Новосибирский аграрный университет, кафедра охраны природы ^ ^

Защита диссертации состоится « /

1992 г в часов на заседании специализированного сове-

та Д 120 35 08 по присуждению ученой степени доктора наук в Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева по адресу 127550, Москва И 5">0, ул Тимирязевская, 49, кори 17.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке академии п

Автореферат разослан Ж ¿1С.тЛс/д^? . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета —

канд Оиол наук, доцент

А. В. Чичев

• . ВВЕДЕНИЕ ■ 1

Актуальность проблемы. Увеличение масштабов сельскохозяйственного ' производства и повышение объема применения химических средств защиты растений приводят к распространению последних во внешней среда. Ежегодно число отравлений лвдей в мире от пестицидов достигает, по данным Всемирной организации здравоохранения, 500 тысяч (Чесноков, 1990). Если загрязнение природы начинает превосходить возможности ее очищения, человечество оказывается на грани "экологического кризиса" (Холл, 1972; Кошонзр, 1974; Дубинин, 1977). В связи о этим 'биологическим методам зашиты рао-тений придается особое значение в экологизации сельского хозяйства, проблемы которой обсуждались на Всесоюзной конференции "Экологические проблемы охраны живой природы", состоявшейся в Москве в 1990 году,

. ... В основе новой стратегии борьбы с вредителями, возбудителями болезней и оорняками лежит интеграция разных.методов, которая позволяет регулировать численность вредных объектов на хозяйственно неощутимом уровне {Роберте, 1901; Хейген, 1982; Бондаренко, 1988). В таких экосистемах, как теплицы, биологические методы зашиты'должны доминировать, поскольку, условия здесь благоприятны как для растений, так и вредителей и возбудителей заболеваний. Их быстрая адаптация к пестицидам приводит к повышению количества обработок,, увеличению норм расхода химических препаратов, создает опасность сохранения остатков ядов в продукции, ухудшает санитарно-гигиенические условия'труда работников, является причиной гибели полезных насекомых и загрязнения остатками пестицидов водных источников и грунтовых вод.

Особую опасность для растений огурца и томата представлю гздговые нематода, вызывавшие в результате паразитирования опухо-

ЦЕНТРАЛЬНАЯ

.НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА.;

йоск. сель- О хоз. академии

„2-ГАШШ'

ли на корнях и потерю продукции до 50$ и выше (Шиабова, 1977; Са-гитов, Перевертин, I9d7).

Среди природных регуляторов численности нематод определенное место занимают хищные грибы - гифомицеты, образующие на мицелии различные приспособления для улавливания нематод и составляющие оообую экологическую группу (Дурынина, Великанов, 1УБ4). Наиболее распространены и многочисленны в природе вицы с сетчатыми ловушками рода Arthrobotrys Corda emend Mecht. (iVexTHOBa, 1979), Многолетние попытки практического использования грибов-каматофагов не всегда давали положительные результаты, поскольку недостаточно были изучены закономерности их существования а распространения а почве, условия и механизмы проявления хищничества, характер взаимоотношений с другими организмами, ."«ало внимания уделялось иопро- • сам изменчивости, селекции, хранения штаммов хищных грибов - продуцентов биопрепарата. Все имеющиеся до сих пор споообы получения препаратов основаны на поверхностном выращивании и получении спо-рово-мицелиального комплекоа грибов на сыпучих и твердых субстратах, содержащих органические компоненты (Сопрунов, члгалин, 1963; Мехтиева, 1969; Косовец, 1972, Deachiena . 1939; Cayrol, iran-fcowBici , 1979; 1оацкевич и др., 1990). Однако регламентированное производство препарата в соответствии со стандартами, принятыми в микробиологической промышленности, до сих пор не было создано.

Цель и задачи исследований. Основная цель исследований -поиск штаммов хищных грибов-гифомицетов, перспективных для биологической защиты растений от галловых нематод, изучение их биоэкологических особенностей и разработка технологий получения и применения препаратов в условиях защищенною грунта.

Основные задачи:

- поиск перспективных штаммов хищных грибов и изучение их

биологических.особенностей при салротрофном и биотрофном питании

- изучение экологических особенностей хищных грибов и приспособленности их попултщй к обитанию в почве;

^ - выявление некоторых аспектов механизма хищничества грибов рода Агако-оЫ^гув; . ^ ,

; - - изучение явления микофшши применительно кхищщци грибеы-гифокшцетам;^ ; •' . ^

- разработка принципов и методов отбора, поддержания и оценки перспективных штаммов хищных грибов; V

- разработка биотехнологии препаратов на основе хищных гри-бов-гкфомицетов с экологических позиций; «

- испытание в защищенном грунте различных препаративных форм хищных грибов против галловых нематод..

' , Научная новизна. Впервые охарактеризованы биологические^ особенности и циклы развития ряда видов хищных грибов рода , Аг-ььго-Ъо^гуз. при салротрофном и биотрофном" питании, включая характеристику их мор£алого-нультуральных и яематофаговых свойств.

^Выявлены механизмы акта хищничества и процессов, обеспечива-' пщих фазу паразитизма: выработка и ваделениа привлекающих и парализующих,нематоду веществ; способ внедрения гриба в нематоду путем перемещения оболочки гриба к плазмалемме клеток нематоды через кутикулу. .'„л _ ...

•На основе данных рентгеновского микроанализа и электронно-микроскопических исследований высказано предположение о роли кальция в сократительных структурах, участвующих в выделении клейких веществ из ловушек и передвижении гриба через кутикулу нематоды. .

Впервые показано, что численность популяции хищных грибов,, помещенных в почву, стабилизируется за счет их способности не

только выживать, im и размножаться хламидоспорами. Обнаружена периодичность в формировании ловчих органов хищных грибов в природных делениях. Выявлены штаммовые рааличия по их отношению к фун-гнстазксу почвы.

Цод^чены ноше сведения о роли явления шкофилии в гшзьэде-ятельносп: хищных грибов л разработаны способы обнаружения z очистил штзммоз от грибов-мякоФилов при ах выделении из природных 1 слов я И и хранении в коллекщях.

ЕЦделен из природных уоговиЛ штамм I хищного гриба Arthro-totry 1 1 о г. у а lischt, (а.С. Y45i4j, I-JÜ), П^.квнны2 1МК>£ЕДЬН.М грибам рода Cep^loportur с jrdiv ! ойяддакийй, нарзду с иемато-'м^гевкми свойствами, способностью и]. \zr/№ipoLUTb фиСриполит^чнсше ItipUwiTH. Псолядовпнилмя л орфагоп'ч^ских wtoncvo-c^uxi и1 со- * *. кх оссбеннагтей этого штеьлаа устанскгено, что истаниш прелуцан-тш Лермонтов яшгяется не хкдаыЛ гр«:б, а гриб-микофил.

>соЕьрленствсваны методы сслекции и сохранение в 1*иллькцаях пирспоиглиих штаммов хищных грубев. лх L^xo-t.up члохг-

•iuc.<hü оссбоньости, которые vor; т слу^лть оон"аой дгь ссоы ол лия rr^Hfi.OTi отбора л поддержания стабилькс-агт! в»на молокенлд.'ачышх кзолгтев. Разработан экспресс-метод оценки ьсматофагсаоВ зЗДш^ти-i 1 ОСТИ ETEMMOB хищных грибов.

Разработаны способы получения форм биопрепарата на основе (.порОЕО-ыицелиальаого комплекса в условиях твердо-фазнок ферментации и на оонове мрцелия при глубинном культивировании. Изучены возрастные изменения мицелия по ряду показателей, включая жизнеспособность и неыатофагОЕЫй эффект. Впервые для контроля за развитием мицелия и оценки жидких питательных сред использован метод химического титрования.

практическая ценность работа. Почучен высокоэффективный

Штамм хищного .гриба а.оИвоарога ВШР-3062Д (а.с. 1688818, 1991), снижающий численность нематод в почве на 86,2$. По результатам тсизоюлагичесхих исследований Иркутского мединститута штагам ВКМр-3062Д не ойпадает патогенншш свойствами дая. тепдокровнкг животных и может быть использован в качестве продуцента биопрепарата., Разработаны метода поддержания этого штамма в процессе хранения и получения препарата.

Предложены методы контроля и очистка культур от мигофильннх грибов. I,

На основе штамма ВКМр-ЗОбЗД разработав регламент производства препарата (официальное название - "нематофагин-Ей"),предназначенного для биолабораторий. • ; •

• Получены исходные, данные для разработки опытно-промышленного регламента производства биопрепарата на основе мипелия глубинкой культуры. Положительные результаты испытаний партий шцелиальной ыасеы жшцкшс грибов, произведенных на Бердоком заводе биопрепаратов,, подтвердили перспективность, экономичность и экологическую целесообразность этого способа.

Разработаны.стратегии борьбы с галловыми нематодами овощных культур в защищенном грунте на основе использования разных препаративных форм хищных грибов,' которые обобщены в соответствующее методических рекомендациях. -

; Положения, выносимые на защиту:..

- целесообразность отбора в природных условиях эффективных штаммов хищных грибов среда наиболее широко распространенных видов и.изучения условий их жизнедеятельности не только в культуре, но и в почв*;

- наличие в щклах развития хищных грибов сапротрефной и , йютрофной 4аз развития, а такге жизненной формы существования

в природе в виде хламидоспор;

- роль в акте хищничества химических соединений, а также клеточных сократительных структур гриба, обеспечивающих выделение на поверхность ловчих приспособлений и мицелия токсических ве-цеотв и проникновение гифы через к}тикулу ьематода.;

- экологические связи хищных грибов с другими организмами почвы;

- доказательства явлений микофнлии в жизнедеятельности хищных грибов, а также возможности их контроля и очистки от грибов-ыикофилов;

- экологическое обоснование биотехнологачаских возможностей получения и применения хищных грибов в борьбе о галловыми нематодами в защищенном грунте.

Апробация работы. 1«1атериалы диссертационной работы были доложены на Всесоюзных конференциях по биологическим методам защиты растений (Новосибирск, 1962; Неринга, 1%3; Кишинев, 19В4; Шнек, 1964,1980; Рига, 1988; Велегож, 19о»,1990; Ьосква, 1991), советско-французском симпозиуме (Кишинев, 19о2), а также совещаниях для работников защиты растений различ"их краев и областей (Кемерово, Красноярск, Новосибирск). 3 19оа году материалы по практическому использованию хищных грибов бьли представлены на выставке ИНВЕКС-68 и "Советские изобретатели" (ЧССР, города: Брно, Прага, Кошица), а также на ЩЩ СССР в павильон« ".земледелие" и "Охрана природы".

Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы, в том числе 2 авторских свидетельства .1 монография. Экспериментальные данные, представленные в диссертации,получены лично соискателем и в'соавторстве о сотрудниками, работавшими под йго руководством, и в процессе творческих контактов.

' Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 317'стр. машинописного текста, иллюстрирована 57 рисунками 0-85 оригинальнши фотографиями, 30 таблицами и состоит из.введения , материалов и' методов,семи экспериментальных глав, заключений и'выводов.4 Список литературы включает 385 наименований, в тем числе 160'наименований иностранных авторов. В Приложении представлена научно-техническая документация'по регламенту получения.и применения нематофагина-ЕК; а также акты испытаний препарата. '

' « \ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ: v. .. .

/ " " Работа была начата в 1978 г. в Сибирском НИИ земледелия и '' химизации " сельского хозяйстваСО ВАСХНИЛ (г.Новосибирск), затем продолжалась во Всесоюзном НИИ биологических методов защиты растений (г.Кишшев, 1983-1986 гг.):и в настоящее время ведется во Всесоюзном НИИ молекулярной биологии НПО "Вектор" (г.Новосибирск) • Объекты исследований - виды и штаммы хищных. грибов-гифомице-тов,' выделенные в основном на территории Новосибирской области, а такав несколько штаммов из Молдовы и Казахстана,.относящиеся по классификации Н.А.Мехтиевой (IS79) к родам ^ Arthrobotrys Corda

emend Meoht., Dactylariopsia Maoht,, Golovinia lía oh t.

•.' *" Кроме того,, объектами исследований были штамм Arthrobotrya oligpspora XIX 4/27, селекции ВИГЙС:(Ыацкевич, Удадова, 1970), . штаммы Ш'.1^2461Д (а.с. 1264393;: IS83) и ВЮ№-3062Д (а.с.1688818, 1991) того же вида,*, а также штамм * I Aüonga (з.с.74593, 1980),

/" Хищные"грибы выделяли методом й.Ф.Сопрунова (1958): образда почвы раскладывали на . поверхности голодного агара в чашки Петра и добавляли лаЗораторнув. культуру нематоды мякробофага ■ Panagrel-lua rcdivivuo (l.) Guddey, культивируемую на толокне. При появ-лишш коиядиального спсроношения. яекато$аговые грибы, пересевали '

на питательную среду.

Хищные грибы культивировали на пептокно-кукурузноы агаре (Мадкевич к др., 1969), среда Чапека, картофально-глюкозном агара, нсчвеяном агаре {иаи&льченяая в ступке плодородная почва - ISO г, агар - 20 г, вода - до I л).

При глубинном культивировании /сподьзовали пивное сусло, разбавленное водой в 3 и 5 раз, среду Чапека (без агара), среду й 19, содержащую мелассу и кукурузный экстракт.

Циклы развития и жизненные форш хищных грибов изучали на питательных средах в поверхностной и глубинной культуре, в суспензии немагод, а также в природных условиях (почве).

Иематофаговый аффект определяя*! по показателям хищкостп (среднее число ловчих пристособлетй в саде зреншх «.пгросгспа пр.*. увеличении 9x10) и активности (галпчество уьерщвленных нематод, в гроцентах) по методаке Н.В.Мадкевич с соавторами (1969) г L.A.Ary-лина (1969). В качестве тест-объектор использовали культуру ¿.г— di^lvua, я также паразитические не^тоды ./aloiciogjne incttni-ti (Xofoid et rfhito) Chitvood, K.hapla Ohitwo^d.

Лля опенки нематофаговой эффектгхьост. лспсоьзовэли т-к №. ьами разработанную,новую методику, основанную па спосоокостд xel<-шх грибов образовывать аттрактивные ? токсл*ческие соединения.

Поддерживающий (стабилизирующий) отбор штаммов-продуцентов в лабораторной культуре проводили по общепринятой и модифицированной нами методаке клопового анализа, а также методом воспроизведения культур из фрагментов мицелья (Теплякова, IS77; Тешгяко-ва и др., ISS3).

Лдя изучения способов длительного сохранения культур хшцных грибов в коллекциях применяли лиофшызацию, хранение под гтнерал? ним маолсав я в стерильной почве (Беляьсва др., 19ъ6).

'Для изучения механизма хищничества использовали решает с бромной водой и водным раствором пермаязганата калия на двойные связи, а также гиотохшичесяую окраску Либермана-Бурхарда в модификации Шульца (Пиро, 1962).

- Содержание'в мицелии и ловчих щиспосойлениях кремния, сэры, фосфора, калия, кальция определяли о помощью скаяирухвдаро макроскопа ISN-35 ■ о.рентгеновским детектором (Тешшкова и др., 1ЭТ7; Кононова. Тепляиова,'I9Ô0; Тедляхова и др., ' IS85). При трансмиссионной, электронной микроскопии фиксацию-образцов проводили по методу Сабатини И др." ( Sabatini et al.,1963; Caulfield, 1957). Материал затевали в эпон-312 и смесь эпон-яраллит.Срезы получали на ультратомах LKB "Heichert ". Дополнительное контрастирование образцов, осуществляли по Рейнольдсу (Reynolds , 1963) и прооаат-ривали под электронными микроскопами УЭМ8-100-В (СССР) и 11-600-( Hitachi, Япония) • при ускоряющем напрязсгаш 75 кв.

• " Лдя сканирующей микроскопии образцы фиксировали 2 ч на холоде в 5^-ом растворе глутарового альдегида на ОД-моляр^оа какода-латном буфере (рН-7,3), затем обрабатывали спиртом, ацетоном и раствором амилацетата. После напыления золотом образцы просматривали в сканирующем микроскопе HH-2(Hitaohi , Япония). При подготовке образцов для*рентгеновского микроанализа, фзксацязо материала проводили жидют аэотсм по. разработанной нами мзгоддке.

Токсические свойства культуралкгоЗ жядаости грибоэ-нематофа-гов оценивали по методике Л.А.Курт' (IS73). В ряде других опц-тоз изучали, продукты метаболаava хищных грибов, диКуидирухацие кз культуры rpnda через полуке:!рснвдаемую. мембрану - цзллофгн. Действие ссдерядаого клеток кетелкя, хиишх грибов на нематод изучали после измельчения биомассы гриба с помощью стерильного песка. Зкстрахтн ¿гозогкчески акяшшх,веществ.палутаяп из мюдаяяя- ж

- тп -

культур ал ьной жидкости о помощью органических рас-творителей: хлороформа, хлориотого метилена, гексана.

Поведение хищных грибов в почве исследовали путем прямого микроскопирования, а также о помощью мембранных кемер (Муромцев и

» I

др., 1977). Взаимоотношения хищных грибов с почвенными антагонистами изучали методом О.Л.Рудакова (i9dl). Изучение срунгистати-ческого действия почвы на хищные грибы проводили по методике Дико (Dix , 19Ь7). Характер отношений хищшх грибов о микогельминтами определяли по методу Н.В.Ыацкевич и др. U9b2).

Наличие микофильных грибов в культурах хищных гифомицетов выявляли путем глазомерной ревизии колоний на наличие секторов или пятен мицелия, отличающихся от основной культуры, с последующим микроскопированием и выявлением микофнла внутри или на поверхности гиф хищного гриба.

При разработке регламента получения препарата на основе хищных грибов для биолабораторий испытывали разные способы получения маточных культур. Б качестве субстратов использовали зерно, подсолнечную лузгу, солому, торф. £ля подбора жидкой среды при глубинном культивировании проводили предварительное изучение влияния источников азота и углерода на продуктивное« хищных грибов по методике В.Н.Ыаксимова и др. (19Ь9, 19о0).

Возрастные изменения хищного гриоа ВКМ1-3062Д определяли путем прижизненной окраски мицелия глубинной культуры нейтральным красным (Беккер, 19ьЗ), Для вышеназванного штамма была также разработана оригинальная методика определения возрастной фазы на основе способности гриба образовывать ловушки в погруженной культуре.

При цитокариологических исследованиях грибы культивировали на предметных стеклах, фиксировали уксуснокислым алкогольм (1:3)

и окрашивали по методу РомановскогогГимза в нашей модификации (Мацкевич, Терлякова, 1974). / • . .' ' : - . ■ -

Вегетационные и производственные опыты по испытанию препаративных форд хищных грибов проводили в условиях завиденного грунта на растениях огурца и томата. .Оценку эффективности действия препаратов. осуществляли по; показателям интенсивности поражения растений ыелойдогннозом и распространенности заболевания (Методические указания по выявлению; учету, мерам борьбы о галловыми нема-то дамии оценке нематодоустойчивых сортов овощных культур в защищенном грунте, 1982), а также го урожаю овощей.\

' Количество личинок нематод в почвенный образцах определяли вороночным методом Бермана (Кирьянова и др. ,' 1969).

- • РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Биологические особенности хищных грибов-гифомицетов ■ при салротрофном и'биотрофном питании

, - Наибольшее количество выделенных.нами штаммов относится к -роду Arthrobotrye■ Corda emena Macht. (Теплякова, 1977). Хищные грибы этого рода характеризуются хорошим роотом на питательных средах, наличием крутых грушевидных» конических; яйцевидных, двужлеточных конидийсобранных в головки на простых или ветвящихся конидиеносцах, а также ловчих приспособлений в вида петель, колец и их сплетений;.-•'•• • - \■

• • Среди грибов этого рода наиболее распространен в природе вид . Ärthrobotrya oügospora Fr га. (Соцрунов, 1958; Кондакова. I960; Bairon,:. 1277;;;Мехтивва, 1979; tatsui , 1985). Нами выделен теамм i. a.oligoVpö'ra-BK№-3062Ä (а.с. 16Б8818, ТеплякОва к др., -1991), его отличительная" особенность - способность•образования ловчих

сргаьоп спонтанно (без присутствия иематсд) при роота на iгаркзо-.,а.ишх ппглтелышх средах.

По cparnetaa) о выделенными ними приставателяыи рода vrth.ro-l^lryj , U ЧЛьЗВ видами Других риДОВ (. Uui-vinia lu^totyla

-echt., Dactylariopaia tr ><Л jpo, i (Lracha.) ¡-é-ht.) SiTu-t. t.4Ur-3wô2JI характеризуется бохьь и*ссьои аттраки-внаи сяо-CCGJOlïLs , НСМатО^£ГОВОИ ЭффвКЧПВНОСТЫ) !" стабильностью морфоло-rc-;v3ua-c,i ических признаков.

11рй pi ВИТ НИ ХИ1ДНЫХ 1>РИС50Е рода irtl.i obotrys ьа штлельных

средах в гоьархносткой и глубинно»: t. льту^- , в сусшнзи нематод, х^гл гриродных условиях (потм) в их жизненно»,: цикла сыявта-1L, сп гулд-fö онтогенетические форм j: î^meшй, конидии, ло£уыа1, . «¿оспоры. '"^sho считать, что к^.талйо взаимосвязан» уеяду со-

«

СоП . ьК i. хльлидоспорь, коготь oi,ùcj^\.'r;..=QT l ¿с-

,-cn, JT ¡.kinLcüatu к p-cnpocTpcJ»fci"iü E>A-, a UM sc^ici^uiüi, î.::r.i xi.ij.rt i^rTjia.

Rj- t с h.puTjo<{.!OM питании (Cua i f j^tos) ь-блвд.я^тся ь^илнар с "тоге1 ça xiv^uix t*i лбов, жцспсм.л. t , JBaiiîOi.. „ upcipecu t" %vî . n»cvort, акта происходи! ль ая см^ьа ~ ^соСов

¡ni ». î . Cu.üT^oiHbfi CJOCOO, иыивхт.-, та . ] ;iapa ал*; пр ^ БЛИК г; о Ii MtAöHT его внедрения в .к.матоду еаяетоя уие^ч-

г.-ч. î зсяедкей ьа сапротрофный. jtc било доказано с пмицью ьл-: j ол m к î п с це « тно г о анализа Р.ш.>*хья-.-оде U-37) и подтвьредено : .ля на ультраструктураом уровне (Тепляковс, Рябчикова, IbSX).

Наличие в онтогенезе хищных грибов хлсмидоспор (аоглиадахся структур) объясняет причину, по которой они практически не ввде-ляттся из гочвы обычными микробиологическими методами с использованием питательных сред. Для выделения хищных грибов сблзательг-но присутствие нематод-индуктора прорастания хламидоспор.

Хищные грибы при салротрофном питании могут усваивать разине источники углерода и азота,' но наилучший рост в глубинной культуре отмечен при использовании комплексных источников этих соединений - мелассы» кукурузного экстракта. На основе последних и была подобрана питательная среда для глубинного культивирования штамма БКМ>-306<Ц1, позволяющая получать 15 г/л биомассы по сухому веществу. -'

Разработанная нами методика определения неыатофаговой эффективности хищных грибов позволяет учитывать их аттрактивную и токсическую способности (Шатрова и 'др., 1989) и избавляет от трудоемкого процесса подсчета улавлнвалцкх приспособлений (Сопрунов, .1958; Акулин, 1969; Мацкевич, Удалова,-1970)» Суть методики сводится к помещению высечки культуры одного диаметра (3 мм) в суспензию некатод, содержащую 100*10 особей Р.геенуХуиз и подсчета живых нематод в свободном от гриба пространстве через I сутки. Нематофаговнй эффект определяется.по формуле: ,

где Нэ г нематофаговая эффективность, %

Кц - число живых нематод до внесения гриба ^ К1 — число,живых особей после внесения гриба через I.сутки ■ К^ - число живых особей в контроле до внесения гриба %2" " ^исло живых особей в контроле после внесения гриба че-рез;1;сутки.'-_ '

В случав глубинной культуры в суспензию некатод вносят 3) ыг мицелиальной массы. Тестировали© проводят на часовых или предметных стеклах с парафиновыми колы'^шш или в маленьких чашках Петри.

- Т4 -

2. Экологические особенности хищных грибов и приспособленность тс популяций к обитанию в почве

Методами прямого микроокопирования и мембранных камер установлено, что при помещении в почву конидий или шшелия хищных грибов рода АгъыоЬоггув на 2-3-я сутки формируются хламидоспо-ра - жизненная форма существования этих грибов в^ природных условиях.

Под влиянием конкурентной микрофлоры конидии и минелий под-вергаютоя деградации, тогда как хлаыидоспоры и ловушки разрушаются значительно медленнее. Это объясняется тем, что хлаыидоспоры имеют мощную меланизированную оболочку, а ловушки покрыты клейким веществом с растворенными в нем токсинами (Ееккер, 1Э7~; Теплякова, Рябчикова, 19»1).

Для жизнедеятельности хищных гвфомицетов в почве характерна периодичность в формировании ловчих органов. Первый пик активности (число ловушек) наблюдается на 3-й сутки, второй - на 14-е су-тгаГ после интродукции конидий в почву (см. рис.). Появление пиков не зависит от колебаний температуры воздуха и влажности почвы. Максимум ловушек у всох штампов, помещенных в почву в виде конидий, наблюдается на 14-е сутки. Б этот ае период продолжается к формирование хламидоспор.

Хотя в лабораторных условиях все исследованные штаммы проявляли высокий нематодаговый аффект и хороший рост на питательных средах, наиболее активными по численности ловушек и хламидоспор оказались штаммы А.оПеоарога 0Ш»-ЗОо2Д и БКМВ-.2461Д. У неактивных в почве штаммов (4/27-33, К-9, Ш-.2) конидии быстро лизирова-лись; мицелий,ловушки к хламидоопоры выявлялись в небольших количествах.

- Г6 -

Высокий уровень численности хламидоспор через меш*ц после помещения хищных грибов в почву свидетельствует о их приспособленности к существованию в этих условиях (Кожевин, 19Ь5, 19йЭ).

Различая в проявлении жизнеспособности и иематофаговой эф-^активности разных штаммов хищных гулбов, помещаемых в почву, свидетельствуют о необходимости скрининга штаммов не только в лабораторных, но и природных условиях.

Характер взаимодействия хищных грибов с почвенными грибами ИЗ родов Trichoderma, Rnizopus, Aapersillua, Pénicillium, IViaa-jrium как в условиях почвы, так и на питательных средах на одинаков. Так, A.aiger, P.expauaum, P.ohriaobel»unif ï.solani прекра— ы иш развиваться в местах контакта с хищными грибами. В сравнении С ЭТИМ R.uigrioana, T.lignorum, f.cjolopium На1 Присутствие ХИЩНЫХ грибов на реагировали и продолжали расти.

В местах соприкосновения культур видны многочисленные хлами-д»споры, а у некоторых штаммов и улавливающие приспособления.

Если для штамма Кир-4 и 2д формирование спонтанных ловушек отмечалось впервые, а кслыда были немногочисленны, то у штамма ЕККР-ЗСь2Д, которому это явление присуще, отмечалась массовость их образования.

Через 2-3 недели на колониях A.amavori некоторые штаммы хищных грибов разрастались в виде тонкого белого паутинистого мицелия, на котором формировались структуры, похожие на хламидо-споры.

Представляет интерес поведение активного штамма ВКЫВ-3062Д, который В совместной культуре С Trichoderma ар. В СуСПеНЗИИ H6-катод и почве образует большое число улавливающих приспособлений, несмотря на присутствие многочисленных спор гриба-антагониота. Зто подтверждает возможность совместного использования препаратов

■ • • " : . Т7 -

на основе хжтшх градов и триходермк дяя задатн овощных культур от нематод и корневых гнилей (Гущин к др., 1982).

Существование оообод' экологической веша, в которой хндныэ грибы трофически связанна нематодами, делает их малоувзвидами а ' для кикогальмингов. Если влабораторяых условиях нами было показано размножение нематод-микофагов Aphelenehoidss spk, Aph.sapro-phillúa franklin, Aph.besseyi Christie, Aphelenehus avenad Bastion Ha культурах хшцных грибов (Шцвдвич, Тешмкова а др., I98lji, то в условиях почвы их численность под действием эффективных пгтам-мов грибов-нзматофагов снижалась вдвое и больше (Шлапатзке, ГЛац— ковяч» Тегоипсова, 1992).

'■■ 3. Некоторые аспекты механизма хищничества гриОов-гифо-

ШЦ0ТОВ РОДА Artbrobotry-B *

- Установлено {Теяиякова а др., 1985), что гибель нематод p.reiivivua под воздействием культуралькой зждкости хившнх грибов составляет не выне 2Ц(,что согласуется (¡результатами и других исследователей (Сидорова,, 1967; Ю-Ван-Кыу, 1968). В рввудь-там изучения действия метаболитов культуры хяцгасс грибов а.оП-goapora , дйф£0гадарухвр£х через целаюфаи к щрояаляввдх токсический для наматод эффект, йилоусгаяоазеао.чго хяята ттшбы яродуцврр-... ют токсические для нематод ведества, одно на сьойств которых -, слайаа раотворимость э водв (Гудан, Йаайов, Гэдяжова, 1Э83). .' Воздействие ванататод содержюам laroacus глубинной культуры ■ втанмов "и ВКИ¥-3062Д показало, что ьнутриклеточные ме-

таболиты, грибов прививка»? нематод p.redtvivua и оказывав» таа-хе, как и даффундирупцие через дайлофви летаболиты, токоичастшй эффект. Через 2-е суток содержимое нематоды становилось звряво-тым. V* ' ' -i

- Т8 -

Представление об участии в механизме хищничества нематофаго-вих грибов токсинов, растворенных не в воде, а а клейком веществе типа латекса (Раджабова, IS7I; Беккер, 1972) было подтверждено нами о помощью сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии (Теплякова и др., I9d5; Теплякова, Рябчикова, 1991). В сканирующей микроокопе на ловушках и мицелии видны многочисленные капли и нити выделенных клейких веществ, на срезах ори исследовании о помощью трансмиссионного электронного шкроокова эти вещества представлены в виде глыбок или нитей на поверхности клеточной стенки.

Испытание экстрактов поверхностных и глубинных культур ai зима ВКМЕ-ЗОбЗД, полученных о помощью органических растворителей -хлороформа и хлористого метилена, показали их аттрактивный и токсический эффекты, что ташке свидетельствует о присутствии как в мицелии, так и в культуральной жидкости токсичеоких метаболитов.

Изучение на ультратонких срезах механизма взаимодействия БКМУ-3062Д о нематодой f.redivivus , особи которой были добавлены к недельной культуре хищного гриба на пептонно-кукурузком агаре, показало, что уже через 2,5 ч выявляется большое количество аморфного вещества средней электронной плотности ("клея"), формирующегося в вида нитей или глыбчатых скоплений на поверхности ловушек и вегетативных гиф. Основная масса этого вещества связана о ловушками, отложения его на вегетативных гифах незначительны. Анализ образцов показывает, что предшественником этого вещества ("клея") является электронно-прозрачное содержимое вакуолей ловушек гриба.

Выброо "клея" ловушками, по-видимому, осуществляется черев отверстия при слиянии плазмахеюш о оболочкой вакуоли, аналогично процессу экструзии гранул секреторными клетками млекопитающих. В

пользу данного предположения свидетельствует отсутствие мелких 8ЦД0ЦИГ0зных пузырьков и появление длинных нитей "клея" в среде.

- Через 2,5 ч на препн|>атах набявдаются разные стадии, проникновения гриба в нематоду.что свидетельствует о значительной скорости втого процесса. Процесс проникновения гифы в нематоду не.. связан с лизисом ее покровов, так как не наблюдается растворения ^ кутикулы, нет признаков выделения гидролитических ферменте». ~ Контакт гриба о поверхностью теланвматодыосуществляетск ; яри участии своеобразного мостика, названного нами "клещей воякой", образованной тонкогранулярным веществом более высокой плот, ности, чем "алей", вкаеллемый ловушками. Этот шстикоСразует своеобразный связующий слой между грибом и нематодой.. На части срезов в нем видан, тонкиефибраялн, ориентированные пврпендику- . . лярно поверхности нематода. На сре аах проолвливаютоя также участки нарушения четкой гранях» между овя»упям веществом я кутику- . лой. где происходит слияние кутикулы ж ваделонного грибом вещества. Вэонеконтакта.в проотранотве под пхааыадвшой гриба, обна-. руяваигея радию мелкие граяулн о содержимым выоокой и средней влектронной плотностн. ;

J. Начальные стадии пенатреции кутикулы нематода грибом, по-видимому, происходят, очень быстро.. Удалось зарегистрировать лаю. . -, момвнты.^когда клетки гриба частично находятся ухе в теле нематода. Анализ такихоревов свидетельствует о своаобрааномраздвига-• tan гифой клетоккутихулы нематода, вместе с которой дроникает я I связующее.в^омо^^В;Лфспюорв^цровопйоммж«;цява происходит, во^шдаи^й'ойй^^гв^б!^1««« ояаэмаямвюй клеток: нематода; благодаря чему клетка гриба оказываете* внутри цитоплазмы клетки нематода* ; Оболочке граба,; очевидноè .п&яааящт важная .роль..в 'вроцеевв'-" через к^куду»: Об этом еввдетель-

сгвует появление в ней фибриллярных структур в зоне пенетрации. £ые этой области фибрилл нет« осмиофилыюе вещество оболочки образует тонкую сетку.

Кроме фибриллярных структур, свидетельствующих о наличии процессов, обеспечивающих механизмы движения микрорентгеновоким анализом установлено повышенное содержание кальция в мицелии и ловушках хищных грибов, формирущцихся в присутствии нематод 1Теп-ллкова и др., 19ь5). По сравнению о сапротрофным мицелием содержание кальдая в ловчих кольцах увеличивается в 38 раз.

Осуществление двигательных функций у хищных грибов может, наг и у животных (Болдырев, 1277) осуществляться при помощи оо-Iратительного болка-аятомиозина о участием кальция.

Наличие михрофиламентов и повышенное содержание кальция в ловушках свидетельствуют о роли сократительных структур, которые участвуют в активном и быстром ввдавливании клея на поверхность колец и переиздании оболочки гриба к шшзмалемме клеток нематоды при проггикьовении гриба чероз ее кутикулу.

Ь нематоде гриб локализуется, как указано выпе, внутри цитоплазму , тс есть по сути является внутриклеточным паразитом. На начальных этапах в клетках нематоды заметных изменений не регистрируется, затеи начинаются деструктивные изменения: просветление штопдааматического матрикса, разбухание митохондрий , разрушение крист. Эти изменения захватывают все клетки нематоды, Воя-гриба нет зоны лизиса, что указывает на отсутствие выделения ж гидролитических ферментов. Переход гриба, к сапротрофноыу питанию совершается без каких-либо дополнительных изменений в жизнедеятельности.

4. Явление микофюши в жизнедеятельности хищных

грибов-гкфомицетов В колониях разных штаммов хищных грибов на агаризованшх

средах появляется сектора или пятна более светлого или Оолоа пушистого ыицелия с одноклеточными конидиями размером 3-5 мкы, названными нами "микроконидияыи", формирующимися на конусовидных ко-иидааносцвх или простых ответвлениях мицелия. Денное явление рассматривалось сначала нами (Мацкевич, Андреева и др., 1973; Тешш-кова, Гущин, 19с43) как фактор выщепления сапротрофной формы нвыдг тофаговах гриоов, потерявшей способность к хищничеству. Однако при более детальном изучении этого явления было установлено присутствие в культурах хищных немаюфагов микофшгьннх грибов.

Иногда гифы микофила обвивали мицелий гриба-наыатофага дли находились в его клетках. Ьикофил наблвдаяся и при прорасташш конвдий. В этом случае гифы и конидии хищного гриба вследствие паразнтирования в них микофила лишаются своего содержимого, что подтверждается и при электронно-шкроскопичесхаи исследовании (Тешшкова, Рябчикова, 19У1).

Полного уничтожения культур хищных грдбов клкофилышми грибами не происходит при хранении таких смешанных культур даже в течение ¿-5 лет без пересевов. В то й время контроль ка наличие микроконидай не всегда дает л'иааость обнаружить микофкл, так как он гожет присутствовать а К1льтуре только в мицелиальной Форме.

При пересевах долго хранившихся грибов-неыатофагов

шкофилыше грибы иногда получают преимущества в развитии и пол-ностыз вытесняют хищные грибы.

Чаще всего выделенные микофнльныэ грибы принадлежали к родам Сцрн&1озрог1ил1, Уаг^слщига, РаесНощ'свз. Разделение Х1шщого гифомицета и мшсофила гриба происходило при определенных условиях. При пересеве на агаризованную среду могли возникнуть, как "у*азцвалось выше, секторы или пятна с исцеляем, отличахщнмся от

' ; ■ ''' — - •. .'. :' , ..-

основной культуры морфологическими особенностями. В других случаях многократные пасоахи на агаризованиых спадах не выявляли таких изменений» но в стучав глубинного культивирования,наряжу о ваяя-••■" чн«м характерных для градов рода Аг^гоЬоггув широких гиф мицелия. развитие получая и длительно маскировавшийся микофил.

, Соответственно, для обнаружения микофильных грибов в культурах хищных гифомицатов предлагается проводить глубинное культивирование, при котором молат происходить размножение микофила одноклеточными конидиями или в виде тонкого мицелия, а также его фрагментов, в то время как для хищных грибов вглубинной культуре характерен только нитчатый рост. Необходим также микроскопический контроль .культур, оообенно длительно хранившихся грабоз-ыематофа-ров,ва наличие хонвдй *1гиф микофаяьша грибов. г

. Изучение морфологических ифизиолого-биохимических особенностей штамма Л.1 А.1оп«в (а.с.,74593, 1ЭЮ), авдаяенного нами в,: $ Новосибирской обйаоти я используемого в лаборатории антибиотиков 1СУ в качестве продуцента фибринсиштячвских ферментов показало» что даякш свойство» обладает яв хищнкй грий, амхоОрлът&гр&б свр!ий.оврог1<1щ ер. г цриоутствувдий в его клетках. ~ -

' '. При оценке вновь выделенных из хищных гифомицетов микофяль-. анзс грибов показано, - что грибн обладают высокой протеолитячесхой • *, в' частности, фибринолитической ахяганостью,' что дозволяет, .ре-, Л ксыендовать проведение целенаправленного отбора.среди них штаммов--дродуцентов аяос ферментов." ...- . ; , •

, На основании изучения характера взаимодействия активного -> *" 1гееша ВШМ06ЗД и некоторых штаммов энтомопатогенных грибов «■ .

Тв* К8 рОДОВ. ЧТО К МИКОфШШ < СерКа1озрог1ша, Гаес:11отусвв< ) ТС- ; тановлено, что.как в условиях культуры, так / почве эятомопато-геиные грибн могут размножаться за счет мицелия и конидий хищных

гриббЬ-

Такиы образом, микофллыше грибы могут не являтьоя спецаали-

t ■ '

зироваюраш паразитами jqjnjmu грибов. Это могут быть грибы различных экологических групп, чз трм числе и грибы энтоыопатогены, дм

ко-аорых клетки, хтгщадс гнфоыи^етов при отсутствии насегомых явля-*

стоя источником дитания.

5. Цринцйпы и методы отбора, полдерзания и оценки перспективных штаммов хищных грибов

На основании исследований микроморфалогических и кариологи-ческих особенностей, активного и относительно стабильного штамма ВКМ1*-^и62Д (Тешшкова и др., I9tí9) сделали вывод, что данный штамм предотавляет ообой гомотип (Мацкеаич, I9tíü) и для сохранения его исходных признаков к нему необходимо применять монокони-диальный отбор по основному морфологическому типу колоний с тщательной выбраковкой всех отличающихся вариантов. Наличие у штамма ВКИР-ЗОбЗД спонтанных ловчих приспооослений дозволяет контролировать его активность при рассеве. При этом предпочтение следует отдавать вариантам, у которых ловушки активно образуются непосредственно на проростках конидий.

Селекционный штамм ВКМ?-2461Д (Удалова, Ыацкевич и др., I9tí2) следует поддерживать также путем iоноконидиального отбора активных вариантов, которые тестируют только в суспензии нематод, так xas данный штат редко образует в культуре спонтанные ловушки. Оцнако, поскольху основная масса конидий этого штамма формируется из многоядерных гетерокариотических базальных клеток с ядрами, различающимися по величине и форме (Андреева, Мацкевич, 1976; Теплякова, 1977) к нему может быть применен метод рассева фрагментами мицелия. То же относится и к штамму XIX 4/27 - исход-

нсшу до отношению к .штамму ВКМУ-2461Д.

Пассирование.через питательные среда дало возможность установить, что среди изолятов штамма XII 4/27, полученных путем фра 1*ентацта мщагая, могут быть отобраны,культуры, характеризующие ся высоко* хищноотью, стабильно сохраняющиеся в течение нескольких переоевов (Теплякова к да., 1Э89).

: Оценку выделенных культур и шташов-продуцентов необходимо проводить не только в лабораторных условиях, но и в условиях,почвы на нематофаговую эффективность, устойчивость к фунгистазиоу и приспособленность существования в ней. ,г;

. Сопоставление ряда штаммов позволило установить,что наи-бсаьшей нематофаговой эффективностью, учитываемой на.14-в оутки о помощью мембранных камер,. ойпадает штамм БК№и-30б2Д, который, образовал 920 ловушек. В сравнения с ни» штамм БКМ**-2461Д я XIX 4/27-33 в тех же условиях образовали 546 я 51 ловушку соответст-' венао (см. рис). Штам* ВКЫг-3032Д характеризуется и большей устойчивостью к фунгистатичности почвы. Относительно большое количество хдаиидоопор, характерных для этого шташа, свидетельствует о его лучшей адаптации ж условиям почвы и приживаемости в ней. - - ■ , -,'- • ■•.'■•

. Для длительного хранения активных штаммов можно рэкомендо- . вать способ лиофализациа и хранения в стерильной почзе » Повшение нвматофаговой эффективности культур после хранения в почве возможно сея за) ю с наличием бсишюго количества хламадоспор, формирую-якхоя в этих условиях изклеток мицалия и конидий. Способность хламидоснор формировать многочисленные ловчие приспособления объясняет я усиление нематофагевой эффективности кульгурпосяедая-тельного хранения в холодильнике, где найгадавтея активное обра-зевание хламидоснор. .Возможно, в этом сдучаепроисходит как би

мЬавлирйвацгчй--ср11родашс условий, в которых гриб существует только & виде хламидоспор.

6. Разработка биотехнологии препаратов на основа хищных грибов-гифомицетов с экологических позиций

С учетом имевшегося оборудования и сырьевых ресурсов в разных регионах страны нами разработан технологический регламент шь-лученпя в условиях биолаборатории препарата "нематофагнн ЫГ,продуцентами которого служат штвшн ВКМ&-3062Д а БКМЯ-2461Д (Технологический регламент на производство нематофагина-Ш, М., 1990).

Согласно этому регламент! процесс производства неыатофаги-на-ЕИ осуществляется поверхностным способом. В качестве посевного материала используют поверхностные или глубинные маточных культуры, в качестве субстратов - подсолнечную лузгу, торф, солому, биоперегной я другие. Препарат может быть получен за 12—15 суток, срок его хранения составляет не менее 0,5 г. при комнатной температура и до I г. в условиях полаженной температуры. Цейств>¡а.шм началом препарата являются споры и мицелий.

На основании экологичеегаэс исследований, свидетельствующих о приживаемости в почве хищных грибов, вносимых в нее не только в виде конидий, но и мицелия, било выдвинуто предположение о возможности получения препарата хищных грисов на основе мицелия глубинной культуры.

Экспериментально установлено, что в развитии хищных грибов на примере штата ВКЫв-ЗОбЭД при глубинном культивировании наблюдается 2 этапа развития, которые легко различаются по морфологическим особенностям мицелия. Каждый этап соответствует определенному физиологическому состоянию культуры.

Разработан, экспресс-метод определения динамики развития гри-

tía, позволяющий оценивать пригодность различных питательных ■ сред для биотехнологии препаратов на оонове хищных гифомицетов.' Ыетод, оонованный на химическом титровании и определении вещоотв-восста- ; новителей в средах, подтвердил полученные ранее данные об оптима-¡ льных овойствах оредн.* 19 (ом. выше),ках наиболее доступной по. |, составу и экономически выгодной для производства препарата. ■ ;

Оценка жизнеспособности и нематофаговой эффективности сухих, пастообразных и жидких препаративных форм на оонове глубинного . j мицелия показала, что. лучшей сохранностью обладает сухие превара- t тивные формы, хранящиеся.при пониженной температуре. Хорошую жиа-неопособнооть и нематофаговый эффект после 5 мес хранения показали образцы; получешше с помощью каолина. Через 6 сут в суспензии . 'нематод найвдцалась IOO^-ная гибель, на 4-6 сут появилооь опороно-^ шение. ' , - " • ' ' -' . ~ -

- Заслуживает внимания относительно длительный срок хранения .. мицелия глубинного культивирования в условиях холодильника (до 5 мео)и при комнатной температуре (1-2 мес).

. v/В условиях гфошшленного производства получение жидкой формы-препарата целесообразно не только о экономической, но и экологи- .; ческой точки зрения, так хак исключаются затраты энергии на про- V\ «eco сушки я уменьшается выброс отходов в окружающую среду,'

. 7¿ Испытание вэавдоденном грунте рааличных препаративных ; . форм хищных грибов против галловых нематод ." : \',,'

ч Испытания различных препаративных форм хищных грибов дали возможность сделать .заключение об их эффективности в отношении ' s " галловых нематод... JB?*Méróobtt'Vribiia»iw в' *

, 1,5-3 раза в зависшюсти от дозы» срока, применения и качества препарата. Обвая чнолевнооть лематод. в-почвв;поддействием препа-

рата уменьшалась на 46-86$, галловых нематод втрое и больше (Шлв-

потено, Мацкевич, Теплякова, 1952). Урожайность огурца при этом

о

повышалась не менее, чем на и,Ь кг/м .

Большое практическое значение имеют штаммовые особенности хищных грибов - продуцентов биопрепарата. При равных дозах препарат на основе штампа ШМг^ЗОбйД превзошел по снижению интенсивности поражения растений огурца галловыми нематодами препарат на основе шташа БКМР-2461Д на 0,4 балла и на ¿6, в-35,по снижению общей численности нематод в почве (см. табл.).

Таблица

Влияние препарата хищных грибов на общую численность нематод в почве

-г

Вариант

,Средняя . Число н-,числен- }ность не-,ность но-,матод по ¡ыатод в ,отношению '1см3почвШк чистому

I I У>

J_1_

] '¿ислвн-

. ность не-г атод по от ноше шш к чистому контролю с гвтеро-

,(10с0м, %

Снижение численности нематод (в %)

по отноше-.'по отношению к чис-(нию к чистому кон- .тому контролю ¡тралю о ге-

• с

терофосом

Препарат на основе штамма ВКМР-2461Д

Препарат на основе штамма ВКМВ-3064Д

Контроль (чистый)

Контроль (с гетерофо-сои)

71,3

40, Ь

Ь3,5

59,4

46,5

24,2 13,а со,2 о1,9

176,8 1о0,и Ш,с1 О

133,4 75,с 100,и 24,2

О

Оптимальными дозами сухого биопрепарата на отходах сельско-

V; . . --28 - •

хозяйственного производства являются 100-150 г/м^, что согласуется с результатам испытаний аналогичного препарата хищных грибов во Франции (Cayrol , .1983).

Дробное внесение препарата не уменьшает дозы при первом, основном внесении, которое необходимо проводить не менее, чем за 3 неделя до высадки рассада.

падкая форма препарата на основе мицелия глубинной культуры оказалась эффективной для уничтожения нематод в почве. При ее внесении в дозе 2 яг на I м^ общее количество нематод в почве снижается в 13 раз по сравнению с контролем и в 3 раза по сравнению с формой препарата на основе соломы и торфа. Это свидетельствует о перспективности предлагаемой нами мицелнальной формы, выпуск которой может быть налажен на заводах, выпускающих биологические средства защиты растений.

Эффект последействия препарата на основе хищных грибов позволяет эффективно использовать его в нескольких культурооборотах овощных культур защищенного грунта. Снижение количества препарата в борьбе с гавловими, нематодами при одновременно высокой эф- . • фективкости его применения может быть достигнуто и при внесении препарата в сосуда о рассадой. За время роста рассады хищный ' гриб адаптируется к почвенным условиям, происходит его размножение за счет хламвдоспор. '■"...*. ; > . Особенности выращивания растений в халдом конкретном хозяйстве (сосгав грунта; сроки и вида профилактических работ, плодосмен, способы получения рассади и др. У додана быть учтены при планирования технологии получения и применения препарата на основе ХИЩНЫХ.грибов. ' ' Д " V. '

w'w.iiu 1л.ый .5 „и^ОдУ

vir iCTpois'HccKOG ухудьеш t л "иогич^кой слтуациц вызывает .1ео(К^дыюсть зоыеьы хотя Си , условиях защищенного грунта широко прашкяачасс в заците 1 астсь, л пестицидов.

Развития и соввг^енстБОГиШие отологических методов борьбы с водителями и возбудителями баловней растений рас ci :атрава отся как один к2 аспектов охраны orpysaiL,e.. среда, ото относится и к мик-^оапологическому методу зашиты ^стшыл от неи.атод при помола! х;-лдшх грчбов-гк,о-жцотов, изуче которых все больше актавг'зи-р^ется.

С чатдим дяе" з пропав:! . ic овощеводство возрастает р^-ь j ...зчч'шного гт1нта, где г 1 отялчля-ся высокой ст'.алльыо-

c.fOT.iMt-cufx л асi ат."«^.- ..г/ ivroroj. Щн ¡ro &rогоприлт!сьга : i л'и ;th ке to.IL" v ,-иш .i»:, ...) z возбудителен

Оалйзней uisunicr . иоохсдр -с.ь с. сти^тл' ^е^зя в^лдптц tuj. ¡-чных ульгур от fj | Д|П»х орг и uc^iu

: LKOUw'o^t ■• его nv i i i ui.:л1 на шг-атод л

, ,iw4i « »./чроорга) v чл. . i a, I'.tio), hj дллссльли н. ояо

rj г тг: i^uhx . ca-inoEaiW. г >c .о х:щцьы г;

П iirtt; tuJauu ираптЕ'.'-С"! i. .о псех пасхах во многих

..тш-ничесг jjc зонах, что и -и< п -lcthjc-t ли тслъьо о лх коичипо-ллтизьс, но и оодшоц ovaaor лсско». рол.» в утшызсц^л огрслнои бис <ассы нематод, кпвузих в no"w .1 юлже широко распространенных ( Gray, Iitt£; »ritach titul Ьуьы , c.cW).

Приспособленность подугли.**. .а.даих грибов к существованию в природных условиях за счет хлахэдоспор и способность продуцировать биологически активнее мотаоаглты обуслоадлвают процессы xiщ-ничества и определяют усго!члвость этих грлбов к иочвонному ун~

..... ' - зо- , ■ л / :: . ' .■■-:.

гиотаэису, грибам-антагонистам и микогельминтам! , i- Знание биоэкологических особенностей хищных грибов делает возможным разработку стратегии производства и применения юс препаративных форм в практика защиты растений от вредонооных фито- . гельминтов. Эта стратегия включает необходимость. наличия стабильно-активных штамюв-продуцентов, знание особенностей их поддержания и сохранения, питательных потребностей и оптимальных условий культивирования. • ' , ■

■ Направление борьбы с фитонематодами о'использованием хищных, грибов-ги$омидатов должно складываться иа реальных условий (наличия необходимого количества биопрепарата, организационных и агротехнических возможностей хозяйства и др.), которые могут быть индивидуальными в каддом конкретном случае.' . ' . >

(,v>Полученные в,настоящем исследовании результаты можно представить : в виде следующих, выводов. ' • v'' .-

Из природных популяций вьщеленоовыше 70шташов хищных Грибов-гифомицетов, относящихся к родам Arthrobotrys Corda emend ; Meoht., Daótylariopais Jtecht., Golovlnia Mecht. Из НИХ При проверке на нематофаговую эффективность отобран и рекомендован'для ; производства штамм Arthrobotrys oligospora ЖМУ-3062Д (а.о. I6888I8, 1991), отличающийся от других шташов этого вида' стаби- . льно-активннми свойствами и способностью формировать улавливающие приспособления спонтанно.. : - . ' . ;

2.'Проведены биоэкологические исследования рада штаммов'хищ- . ных грйбов, относящихся К роду; Arthrobotrya. : -

•;; - 2.1..' Установлено, что хищные •• грибьг;яри внесении' в почву не}; только выживают в ней,: но н размножается за счет хламидоспор^. ко-" торые .являются жизненной формой существования этих грибов в;при-• -.' роде. ' '• ■ " . ''/Г/.-

- ЗТ -

4.2. Обнаружена периодичность в формировании ловчих колец хищных грибов и разница между штаммами по их нематофаговой эффек-т.тности и устойчивости к фунгистазису почвы.

¿.3. Трофические связи пагщу хищными грибами и нематодами определяют в условиях почвы их устойчивость к грибам-антагонио-там, в том числе и рода Тг1споаегта , широко применяемого в за— ли те растений, а также нематофаговый эффект в отношении мико-^ гельминтов, которые в культуре могут питаться их мицелием и конидиями.

3. Изучены циклы развития хищных грибов рода Аг^гоьоггуа при сапротрофном и биотрофном питании, а электронномикроокопичео-кими исследованиями в сочетаь.ш с рентгеновским микроанализом выявлены некоторые аопекты механизма хищничества.

3.1. остановлено, что большую роль в маханиаме хищничества играют аттрактивные вещества и токсины, слабо растворимые в воде, а в теле нематоды гриб проходит биотрофную и сапротрофную стадии развития.

3.<:. Впервые показано, что проникновение хищного гифомицета в тело нематоды происходит путем раздвигания гифальным отроотком клеток кутикулы о участием в этом процессе фибриллярных структур оболочки гриба.

3.3. ьаличие микрофпламентов и повь~еннов содержание кальция в ловчих приспособлениях свидетельствуют о их роли в механизмах клеточных сокращений, направленных на выделение токсических клейких веществ и на перемещение оболочки гриба к плазмалемме клеток нематоды.

4. Изучение явления микофилии позволило разработать методы обнаружения очистки культур не: атофаговых грибов от грибов-мико-¿плов. ¡11 о?'с. . лкроскопнчоского контроля и пассирования через не-

матод, рекомендуется обязательное проведение глубинного культивирования, провоциругагего размножение микофильных грибов, находя-, шихся в клетках хищных гифомицетов.

5. Данными дато-карнологических исследований и усовершенствованием методов оценки Обоснованы и разработаны приемы отбора к длительного поддержания активных свойств штаммов - продуцентов биопрепарата. .

6.1. ЫэвокоЕидиалыщЯ • отбор в сочетании о приемами хранения при помощи лиофшгазации пли в стерильной почве обеспечивают стабильность культур.

5.2. Для оценки.неыатофаговой эффективности предложены простые методики, основанные на взаимодействии нематод с метаболитами завдннх грибов. * ,

6. Обоснованы о экологических позиций пути создания препаративных фора хищных грибов на основе поверхностной и глубинной культур: ,

- твердо-фазная ферментация, при которой используются отходы производства (солома, подсолнечная лузга и другие продукты биоконверсии) предназначена для биолабораторий при тешгачных комбинатах и станциях защиты растений;

- глубинная культура, которая может быть использована для получения препарата в промышленных масштабах на заводах, выпускающих биологические средства защиты растений.

6.Х. Разработан для биолабораторий технологический регламент производства препарата ("нематофагин-ЕЯ") на основе спорово-шце-лиального комплекса эффективных штаммов БШ?-3062Д и НШР-2461Д.

6.2. Получены исходные данные для разработки регламента получения биопрепарата на основе мицелия глубинной культуры. Для контроля за развитием гриба и оценки яздаих штателышх сред раз-

- Я* -

7-аботав метод, основанный на -азлическом титровании.

7. Лроведено попытают различных зрепарагивныг форм хипщых грибов на галловых и других почвинных нематодах в условиях лабораторных и вегетационных опытов, а также производственной культуры огурца Р томата в защищенном грунте.

Установлено, что интенсивность поражения растений мелоцдого-позоы может снижаться в 1,5-2 раза в зависимости от дозы и качества препарата.

Общая численность нематод в почве под действием препарата хищных грибов уменьшается на 46-йо£, число галловых некатод -втрое и больше.

.наиболее оптимальными iasam cvxoro препарата, полученного «а отходах сагьскохозяйст! енгого производства, являшся ICO-IEO ./ч", жидкою (мицелиальной магск) - «.кгУм".

3. На основании проведенных дслытангй разработана стратегия :~имснения препаратов хишгах грнбол з 7а.*овнях защищенного грунта гритив галловых нематод, зораз^злх ог.спгц в растения.

Lo тьме диссертации ovrjl ;;-ог гц слодуищиа работы

1. п. с. ft Cuwi". tTOj~vi irtiirobotrya longa MecbtJ I -продуцент [ибринолитлческах 4 е^мнктсв (¿".^.Аадреешсо, ^.А.'.акси-

Т.п.О^ребрчкова, л.а.Силиав, 1.С.каркова, С.л.Гаврилов, п.С.к'урадова л Т.В.Теплякова): ..«двлено ~'d.Üb.76 № 26Cd4Q7.o у 1.7.J?.¿О, Бш. й ¿5»

2. A.C. ü IbBüdie, СССР, ктаии Axthrobotrya oligoopora rrci. для получения препарата против галловых нематод (.iепля-кэва 1.В., .яцкевич ti.B., й.с.трсза Г.Л. :* налепина Л.Л.): заявлено ju.CS.cc S «с.54132, сод. 41.

Ir; ^ ., ; - 34 -

3. Мацкевич H.B., Теплякова Т.В., Приходько B.C., Стабшшза-" ция нематофпговых свойств хищных грибов* при их развитии в культуре // Микробиологические методы борьбы о вредителями;раотений. ~ Новосибирск. -, 1980; - Вып.2. - С.-25-29. „ • ;.

: ; , 4. Гулий В.В., Теплякова Т.В., Иванов Г.М. Микроорганизмы, полезные для биометода. - Новосибирск : Наука, Сибирское отделение, 1981. -^О'о.. ;

, б. Теплякова Т.В., Кошегов C.B. Морфологические и цитологические, оообеннооти фаз, развития гриба Artbrobotry в oligospora

Fres, при глубинном культивировании // Гиикроорганизмы в защите ' растений. - Новосибирск.:- 1981. - С. aI-84¿: - .

. 6. 1\1ацкевич Н.В., ,Теплякова T.B., ЛИестеперов АЛ. Характер : поведения нематод-микофагов на различных по активности и возрасту культурах хищных грибов // Микроорганизмы в заката растений. -:• Новосибирск.".,-ISai.,-С. 77-tíI. : . • • , •. , •

' 7. Теплякова Т.В., Гумин Ф.Л. Изменчивость хищных грибов, // Использоваоте микроорганизмов в сельском хозяйстве и промышленности. - Новосибирск.-- 1982. - 0. 65-90. _ ; ■ .; 8. Теплякова Т.В., Гущин Ф.Л., - Бедин Д.Ш Испытание препарата хищных грибов против галловой нематода //.Шкроби алогическая защита растений в Сибири. - Новосибирск. - 1982. - С..31-35,.

9. Гущин Ф.Л., ' Иванов Г.М. Теплякова Т.В. Токсинообразую- . иая способность ХИЩНОГО гриба Arthrobotrya oligoapora Fr. // Сибирский bucth.c.tXw науки. - Новосибирск. - 1983. - J6 2, * -, С. ■ ICO-IC2, ' . ;

. : 10. Теплякова Т.В., .Гущин.Ф.Л. Изменчивость хищных грибов рода, Arthrobotrya ■■ по типу спороношенкя // Интегрированная защита растений от вредных организмов. - Новосибирск. - 1903. С.. 112- . 124. ■ V -•.■'".'.■■' ' • ■■'

11. Теплякова Т.В» Возмо-ьоаги и состояние биологической борьбы с галловыми нематодами р за^ф-иенном грунте // биологически;! метод защиты" растений от, ¡-родителей и болеадей и охрана окру-хааде'й среды. - Кишинев, -'i-ol. - С. 42-45.

12.Теплякова Т.Б. Пути использования хищных грибов-гифомице-тов в борьбе с галловыми нематодами // Биологический метод защиты растений. - Uihck. - Ii>t34. - 0. 122.

.3. Гущин v.Ji., Теплякова Т.В. Взаимодействие хищных грибов с некоторыми антагонистами почвенной микофлоры // 1!нтегрированная залита растений от болезней и вредителей в Сибири. - Новосибирск. - iüo5. - С. 15d-IbI.

14. Теплякова Г.В., а., Сухоруков A.A. Исследование

ловчих колец хлщного гриб«. Arti.robotrys oligoapora, штамма XIX 1/^7 методами рентгеновского андлиза и электронной микроскопии // .лкрсорганизмы в защите растении. - Кишинев. - Штиинца. - i'Jab. -24-о1.

1а. .шологическая защита, овошкых кугьтур в защищенном грунте // атодические рекомендации. - l, - 1ъа5. - у! о.

1и. Культивирование л пр.и пение грибов против врэдиаелей и болезней в защищенном гранте // •втодические рекомендации. -Кишинев. - Ibk-5. - ьь с.

1?. Теплякова Т.В., Гущин *.JI. Ирсиемы в использовшши хищных грибов-гифомицетов против галловых нематод // Лнформ.окщ.ШС ..ОБЕ, JI., 18ао. - Л 12. - С. о*.-Ь5.

18. Максимова P.A., Шаркова Т.С., Теплякова Т.В. Физиологические особенности хищного гриба rtrthrobotrya longa, штамма Л I при образовании протеолитических <рерментов о фибринолитичаским действием // лстественные враги насекомых-фитофагов. - Кишинев. • - и.типяцц. - iSo6, - С. ob-oü.

19.Теплякова Т.В. Микробиологические средства зашиты растений от фитодаразитичееких нематод // Биологическая регуляция численности вредных организмов. - Ы.: Агроцромиздат. - 1966. -С. 178-187.

.; 20. Шаркова Т.С., Максимова P.A., Теплякова Т.В.'Физиологи-" ; ческие особенности Arthrobotrys longa läecht. в связи с образованием фибринолитических ферментов У/ Микология и фитопатология. • -1988. - Т.22, &2. - С.,149-152. ; , . '

21. Кальвиш Т.К., Теплякова Т.В., Шоргашова Л.П. Особенности развития энтомопатогенных и хищных грибов в почве // Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений. :

- М.. - 1989. — С. ¿07.

22. Теплякова Т.В., Шорникова Л.П. Скрининг штаммов'хищных ррибов-гифомацетов // Тез.докл. II симпозиума стран - членов СЭВ по микробным пеепщвдам. - М. - 1990. .- С, 202.

' ; 23. Тедлякова Т.В., Степанова Е.В., Кальвиш Т.К. Селекция г поддержание активных и стабильных шташов нематофатовых грибов // Микробкологачесвие исследования в Западной Сибири. - Новосибирск. - Наука. - Сибирское отделение. - 1989, - C.7I-74.

24. Шатрова Г.1., Ходухарь Г.Г., Тэплякова Т.В., Мацкавич • й.В., Гладкова И.А., Ротару С.П. Ввдалешз и отбор стабильных и высокоэффективных штаммов нематофаговых грибов D Микробиологический метод защиты растений от вредителей, болезней и сорняков.

- Кишинев.' - Штзпшца; - 1989. - С. 3-12.

-25..Теплякова Т.В;, Залешсзв В.Н., Салодаий В.В., Зздотнх С.И. Возможности получения .препарата хищных грибов на основа мицелия // Тез.докл. II Симпозиума стран-членов СЭВ по микробным пестнцвдам. - М. - 1990. - С. .147; •

26. Шатрова ГЛ.. Теплякова Т.В;, Кояухарь Г.Г. Получение

S .

• '

глопренарата юкатофагошд на шзо ^рлба рода -rthrobotryo // Гез.дскл. II Симпозиума -членов СОВ 20 млкробнш дести-

ллги-j. - leCO. - С. 14Ь.

~7. .Мацкевич И.В,, Косовец B.C., Иосселиани Д.А., Карат тян Л.А., Прлходько В.П., Удалова л.Е., Теплякова Т.З. Характеристики немзтофэговых свойств блопреглрата хищных грабов, полупенного опитно-прошшленкш способом // Utuwmrna и фитопатология. - Т.24,4 И I. - 1990. - С. 22-i,6.

23. Налегала Л.И., Маир^влч Н.В., Кожухарь Г,Г., Теояякова Т.В. йикгае j пха'ьщ способов хранения на хаанедолтельность не-мйтс4агопых xincux грлбзв // 1~Л1~1логия к фитопктология. - 1990. -Т.24, J I. - С. JI2-3T4,

СЗ. . гдада. Т.»>,, л"1 1,ч с „а Г.Л. лл'дкио грлба - ; лфо.аод^ты - ответрвыше г^ 1ГЛ нематод J J »^¿ата растений. - Ц. - 11*91. -I. - С. 10-12.

Ча~ъг и Т.К., Гчщкно i -".3., гакоал Л.П. Ыанедоятель-»о-^ь Jii."t).-o:'aTo;uHJiKx ! 1 оьин«' и" тих г^лб^п в со чье // Унюдо-* '.я и 4и?ггатил.*гик. - - Г..«, 6. - С. 40^-501.

CI. i»ieittTi «а i-'.A., '¿¿с иыч х'.З., Тицллксви Т.В. (<±>аьнлтель-иак ка^чтеркстпса всчдойстиш хлщных гр«-0ов и кеыатицидов на по-чвеннно нематоды// А<Л.и raraJitulo,;tca Litvanica. - 1992. -

32. SSaokevic K.V. , TepljttAOva T.V. Connection 01 morphological and physiological variability of soma imperfect fungi in their microevolution // International jympoeiuai " involution and- Environment " ( Brno, 17-22 , VIII ,I'jdl ) Abstracts of communications t-raha , 1981,- p. 224 .

О') ьем 2 п л

Заказ 1Ь29

Тлрал 100

lHn„rp«Jri я V\o ковскои с х академии им К А 1>\п рязева 1С7С50 Москва И 550 Thv, р ue-^кая ^л , 44