Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальное получение активных штаммовгрибов рода ARTHROBOTRYS CORDA и применение их против фитопаразитических нематод

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное получение активных штаммовгрибов рода ARTHROBOTRYS CORDA и применение их против фитопаразитических нематод"

российская академия наук ордена ленина сибирское отделение центральный сибирский ботанический сад

На правах рукописи

Степанова Елена Викторовна

Экспериментальное получение активных штаммов грибов рода ARTHROBOTRYS CORDA и применение их против фитопаразитических нематод

03.00.05 - Ботаника 06.01.11 - Защита растений от вредителей и болезней

автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 1994

Работа наполнена в Центральном сибирском ботаническом саду Сибирского отделения РАН

Научные руководители:

- доктор биологических наук, профессор Н.Д.Тарасенко

- кандидат биологических наук Н.А.Боико

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, профессор М.В.Штернпшс

- кандидат биологических наук Н.В.Перова

Ведущая организация:

Институт систематики и экологии животных СО РАН

Защита состоится лЧ час.

на заседании диссертационного совета Д 002.90.01 по защите диссертаций на соискание степени доктора наук при Центральном сибирском ботаническом саде СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск - 90, ул. Золотодолинская, 101

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центрального сибирского ботанического сада СО РАН

Автореферат разослан

Учеши секретарь диссертационного совета, кандидат биологически наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность темы. Нематоды являются вторыми после насекомых главными беспозвоночными вредителями растений. Потери продукции растениеводства от нематод составляют от 50 до 100% Нематоды являются пореносчиками йитопатогенных вирусов, приводящих к вырождению овощных, зерновых, ягодных и других культур, способствуют возникновению у растений грибных л бактериальных болезней.

До недавнего времени дая борьбы с галловыми нематодами использовали высокотоксичные дая людей, животных, полезной энто-мофаунн химические наматициды. В настоящее время использование пестицидов в защищенном грунте ограничено, нематицидов - запрещено.

Возникшее в промышленно развитых странах мира движение "биологическое земледелие" Еыступает за полное исключение в земледелии удобрений, ядохимикатов и других химических 'факторов интенсификации растениеводства. Отсутствие токсичности для теплокровных, полезной энтомофауны и высокая избирательность нема-тофаговых грибов-гифомицетов рода Arthrototrys Corda делает их идеальными с„экологической точки зрения агентами для контроля фитопатогенных нематод.

Цель и задачи исследования. Целью работы является получение активных против нематод штаммов грибов-гийэиицетов рода Arthrobotrys и разработка технологии получения к применения биопрепаратов на их основе. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: изучить морфологические и биологические особенности нематофаговых грибов рода Arthrobotrys, получить активные штаммы нематоюаговых грибов, разработать технологию получения биопрепаратов на их основе, провести испытания биопрепаратов в защищенном грунте.

Научная новизна. Из природных местообитаний выделены и описаны новые штаммы грибов рода Arthrobotryc. Впервые в отечественной я зарубежной практике в селекции грибов А.olirospora Fres, был использован метод химического мутагенеза с целыз получения стабильных высокоэффективных штаммов против нематод.

Вачвлены особенности действия химического мутагена этилметан-сульфоната (ЭМС) на данные объекты. Используя моноконидиальный и моноклеточный отбор, а также химический мутагенез получили штаммы, значительно превышающие по активности и скорости роста исходный штамм. Впервые для культивирования нематофаговых грибов предложена новая питательная среда. Оптимизирован технологический процесс глубинного культивирования. Впервые предложена новая технология получения биопрепаратов против нематод с низкой нормой внесения.

Практическая значимость. Получены активные штаммы нематофаговых грибов рода Аг-ььгоЪо-Ьгуз, которые отвечают требованиям, предъявляемым к промышленным штаммам - растут на дешевых и доступных питательных средах, обладают высокой скоростью накопления биомассы. Штаммы стабильны по морфологическим и физиологическим признакам и активности по отношению к нематодам, обладают устойчивостью к посторонней микрофлоре, безвредны. Подобраны оптимальные условия для выращивания штаммов в условиях глубинного культивирования, позволяющие за максимально короткий срок (3-5 суток) получить продукт ферментации. Целевой продокт биосинтеза имеет экономическую и народнохозяйственную ценность. Новые препараты прошли успешные промышленные испытания (получены акты) в тепличных хозяйствах г.Новосибирска.

Активные штаммы и технология получения биопрепаратов могут быть использованы различными биолабораториями, а таюге для дадьаейших работ по селекции, генетике, биотехнологии штаммов грибов-продуцентов биологически активных веществ.

Защищаемые положения. I. Штаммы грибов рода Аг-ььгоъоъгуз, Еццэленные из природных местообитаний - основа селекции нематофаговых грибов. 2. Экспериментальное получение мутаций с помощью ЭМС оказалось более эффективным направлением в селекции нематофаговых грибов, по сравнению с традиционными методами (мо-ноконидиальный и моноклеточный отбор). 3. Разработана новая технология получения биопрепаратов против нематод.

Апробация работы. Основные положения диссертации долонены и обсуздены на Первой отраслевой конференции - конкурсе молодых ученых "Актуальные проблемы биотехнологии", пгт.Кольцово, НПО "Вектор", 1989. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура работы. Диссертащя общим объемом в 98 страниц состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, заключения, выводов, списка использованной литературы (174 источника ), включает 16 таблиц и 16 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЕАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объектами исследования были виды и штаммы нематофаговых грибов, выделенные в основном на территории Новосибирской области, относящиеся по классификации Н.А.Ыехтиевой (1979) к видам рода Arthrobotrys Corda emend Mecht., а также штамм Arthrobotrys oligospora xix 4/27 селекции ШГИС (Нацкевич, Удалова, 1970). Нематофаговые грибы выделяли методом Ф.0.Сопрунова(1958), культивировали на ПКА. (пептонно-кукурузном агаре). Разштие грибов и формообразовательные процессы изучали на питательных средах при использовании общепринятых методов поверхностного и глубинного культивирования, а такие в суспензии нематод (Ыехтиева, 1979).

Нематофаговая эффективность определялась по показателям хищности (среднее число ловчих приспособлений в поле зрения микроскопа при увеличении 9x10) п активности (количество умернц-ленных нематод В качестве тест-объекта использовали культуру овсяной нематоды Panagrellus redivivus (L.) Guddey, культивируем на толокне (Ыехтиева, 1979), а таксе паразитические нематоды Meloidogyne incognita (Kofoid et iíite) Chitwood. Селекция активных штаммов проводилась с помощью моноконидиального и моноклеточного отбора (¡Лацкевич, 1977), химического мутагенеза (Степанова, Тарасенко, 19946,г). Применяли химический'мутаген этилметансульфонат (ЭИС). Для обозначения морфологических биотипов применяли классификацию Н.В.Мацкевич (1977). Биомассу разных штаммов выращивали на качалке марки ag сн-40-15, Basel, typ etr-1 , клеточную суспензию встряхивали на пвйкере марки vortex-genie , labomed. Для разделения клеток мицелия применяли ультразвуковой дезинтегратор марки ксе pg-1365 code 6/77 мх. Массовую наработку биомассы проводили в закрытых системах с объемом аэрации 1:3 в-течение 3-4 дней.

Производственные опыты по испытанию биологических препара-

toe на основе активных штаммов нематофаговых грибов проводили в условиях защищенного грунта агрофирмы "1'1ня", ЦСБС СО РАН в культуре огурца и томата. Оценку эффективности действия препаратов осуществляли по показателям интенсивности поранениости растений "елойдогинозом и урожайности овощей.

Оитодатсгенные бактерии и грибы определяли по справочной литературе (Флетчер, 1987; Микроорганизмы - возбудители болезней растений, 1988 и др.).

Статистическая обработка, проверка степени достоверности выполнены на компьютере марки IBM 386 dx, применены программы Qvattro Pro И Statgraph.

Морфологические и физиологические особенности нематофаговых грибов-гифомлцетов

Представлены описания морфологических и физиологических особенностей грибов видов рода Arthrobotrys и проведен сравнительный анализ выделенных нами новых штаммов из различных местообитаний, дана оценка их нематофаговой способности.

Нематофагсвые грибы-гифомицеты относятся к классу несовершенных грибов Fungi imperfect!, порядку Hyphomycetales Sacc., семейству Mucedinaceae Link., родам Arthrobotrys Corda, Golovi-nia Mecht. и др. (Сопрунов, 1958; Ыехтиева, й79).

Род4 Arthrobotrys содержит 27 видов, в СНГ описано 18. Представители этого рода хорошо растут на искусственных питательные средах, имеют крупные, конические, грушевидные, яйцевидные, двухклеточные, собранные в головки на простых или ветвящихся конидиеносцах конидии, ловчие приспособления в виде колец, петель и их сплетений, образуют хламидоспоры. Описаны биохимические и физиологические особенности грибов (выделение токсинов, аттрактивные и нематофаговые свойства, синтез протеолитического комплекса). Среди грибов этого рода наиболее распространен вид A.oligospora Fres.

Из природных местообитаний наш было выделано 30 штаммов, один из которых относится к роду Goio-vinia Mecht., остальные -к роду Arthrobotrys (Степанова, 1989).

Для калдого шташа и вида были сделаны описания его морфологических особенностей, при росте на искусственных питательных средах и в суспензии нематод проведены необходимые измерения

конидий, определена нематофаговая эффективность.

Отобраны активные штаммы аз рода Аг-ььгоЪс^гуз-К^, д.Р. и проведены работы ло изучению морфологических особенностей этих грибов на различных средах - СА, ПКА, Чсах>, Чглюк> (среда Чапека с сахаром и глюкозой).

Наиболее благоприятными для роста, спороношения и проявления нематофаговой активности изучаемых штаммов являются среды СА и ПКА, которые содержат природные продукты типа пивного сусла, кукурузного экстракта, пептона, богатые витаминами, азотом,, микроэлементами. Хотя скорость роста на средах Чапека но усту- -пала скорости роста на средах СА и ПКА, по морфологии культуры значительно отличались - на среде Чапека колонии были едва заметны на поверхности сред. Штамм А.г. опережал другие штаммы до скорости роста (прирост мицелия составлял 17 мм в сутки).

Подробно описана морфология штаммов на средах СА и ПКА, отмечено наличие большого количества хламидоспор у штамма д.р. в чистой культуре и в суспензии нематод. Другие штаммы не проявили этих особенностей. Интенсивность спороношения этого штамма оказалась также высокой - 584 кон/мм^ на среде СА.

У исследуемых штаммов определяли нематофаговую активность, аттрактивность, в зависимости от йозраста культуры. Отмечена наибольшая нематофаговая активность у штамма а.р.,у которого даже молодые шестисуточные культуры проявляют свой привлекающий и нематофаговый эффект, образуя большое количество улавливающих нематод приспособлений, 100^-ная биологическая эффективность у этого штамма отмечена на вторые сутки.

Изучение возможности искусственного получения эффективных штаммов нематофаговых грибов

Наличие в пределах видов грибов-продуцентов селекционных штаммов с наследственно стабилизированной биосинтетической активностью определенного уровня обусловливает возможности их лроиаводственного использования (Мацкешч, 1981). В исследованиях Ф.Ф.Сопрунова (1958), Н.В.Мацкевич (1981), а также в наших собственных работах (Степанова,и др., 1283, .19946,г) были предложены и испытаны разные приемы отбора для получения стабильно активных штаммов нематофаговых грибов.

В .работе использовали штамм популяции н.ематофаговых гри-

бов-гифомицетов A.oligospora xix 4/27, который бал получен пути! многоступенчатого моноконидиального отбора в ВИГиСе (Мацке-шч и др., 1970). В нашей коллекции он с 1982 года и после многократных пересевов без поддерживавдего отбора утратил первоначальные характеристики. На поверхности колоний в культуре часто возникали сектора и пятна мицелия, отличающиеся по своей морфологии от основного типа.

Спонтанная вариабельность культуры проявлялась в неоднородности споровых изолятов штамма и их постоянной дифференциации при дальнейших рассевах на различные морфологические типы. Наблюдалась такае изменчивость по числу улавливающих приспособлений и активности в ряде пересевов.

В наших исследованиях было выявлено три визуально отличных морфологических биотипа грибов, на которые дифференцировалась популяция штамма A.oligospora XIX 4/27 и доказана корреляция между этими биотипами и проявлением нематофаговой активности у штамма.

"Пушистый" биотип (хищный) - имеет обильное спороношение, пушистый мицелий, проявляет максимальную активность по отношению к нематодам, стабилен в течение 3-4 пересевов.

"Голый" биотип (сапрофитный) - имеет прижатый мицелий, незначительное спороношение, слабо активен по отношению к нематодам.

"Смешанный" биотип - сочетание первого и второго биотипов (промежуточный). Имеет показатели активности и хищности низе, чем у "пушистого" биотипа, менее стабилен.

Для выявления благоприятных условий культивирования и сохранения активных свойств культуры наш впервые, кроме среды СА, была предложена среда АСД.

На средах СА и АСД в результате рассева штамма A.oligospora xix 4/27 и четырехкратного пассирования получены стабильные и нестабильные по нематофаговой активности изоляты. Большой процент стабильных изолятов наблвдали в опытах на галловых нематодах и.incognita, по сравнению с овсяными нематодами, что, очевидно, связано с избирательностью культур. Среда АСД способствовала усилению биологической активности и положительно влияла на проявление нематофаговых свойств грибом.

Среда стабильных культур дая дальнейшей работы был отобран изолят № 33, обладавший на протяжении 4-х пассагей во всех дов-торностях высокой нематофаговой активностью и образовывающий более 100 колец в поле зрения микроскопа. Другие изоляты не сохранили этих свойств при пересевах. Разница активности между исходным штаммом 4/27 и вариантом № 33 составила 29$ (на среде СА) и 22$ (на среде АСД), что позволяет сделать вывод об идентификации варианта № 33 как самостоятельного штамма и отобрать его для дальнейших производственных испытаний.

Алкшшрущие соединения в настоящее время считаются одними из наиболее перспективных в химическом мутагенезе. Способность алкилирующих соединений при действии их на фазу в 1 (предсинтети-ческая фаза, когда хромосома представлена одной эффективной нитью) вызывать так называемые полные мутации, то есть завершенные изменения генов, охватывающие обе нити в молекуле ДНК, в настоящее время подтверждена на дрозофиле, мышах, нейроспоре и др. На грибах-гельминтофагах эти соединения не использовались.

Споровую суспензию штамма а.оп^озрога хгх 4/27, обработанную различными концентрациями ЭМС, дозироЕанно рассевали на чашки Петри (с ПКА), проращивали при температуре 24-25°С. Микроколонии подсчитывали через 3-4 суток, контроль - проросшие споры, не обработанные ЭМС. Сразу га после подсчета опытные и контрольные микроколонии изолировались в отдельные чашки Петри с ПКА для дальнейшего изучения их свойств.

При изучении индуцированной изменчивости с помощью ЭМС вы- , явлена большая вариабельность в индукции морфологических мутаций, а также биологической активности. При изучении естественной изменчивости, в отличие от индуцированной, не было выявлено дегенеративных колоний, изменений в структуре клеток мицелия и конидий, что отмечалось у мутантных штаммов.

Выявлено 7 основных морфологических типов, отличных от исходной культуры (штамм л.оИвозрога XIX 4/2$ по показателям прироста мицелия, размеру конидий и другим морфологическим признакам, биологической эффективности, кольцеобразованию. Было отмечено, что ряд изолятов при пересевах теряют способность к росту и спороношению.

Для повторной обработки ЭМС нами был отобран стабильно активный штамм № I, обладающий высокой скоростью прироста мицелия

(почти в 2 раза превышающей исходный штамм), обильным кольцеоб-разованием и 100#-ной биологической эффективностью через 18 часов контакта с нематодами (данные признаки сохранились у штамма в течение ряда пересевов), в то время, как контрольный штамм показал 100$-ную эффективность через 43 часа.

Характерной обобенностыэ изолятов-мутантов, полученных при повторной обработке ЗМС, явилось не только изменение морфологии колоний, но и усиление аттрактивности гриба.

При изучении индуцированной изменчивости нематофаговых грибов с помощью химического мутагена'ЭМС наш впервые были получены следупцие результаты:

Был выявлен ряд мутаций: а) видалые мутации (изменения морфологических и физиологических свойств); б) мутации, нарушающие жизнеспособность особей:

- летальные - гибель 100$ клеток (1,5-2$-ный ЭМС),

- близкие к летальным - гибель 98,7$ клеток (1$-ный ЭМС),

- сублетальные - гибель 23,6$ клеток (0,5$-нвй ЭМС).

При обработке низкими концентрациями ЭМС (0,015$) наблюдались мутации, повышающие виживаемость клеток до 110,5$ по сравнению с контролем. Получены штаммы, стабильные•по морфологическим признакам и биологической активности.

Наличие селекционных штаммов с наследственно стабилизированной биосянтетической активностью является важнейшим условием их производственного использования.

Таким образом, нами были получены с помощью селекции активно стабильные штаммы, которые в дальнейшем использовались для разработки технологии получения и применения биопрепаратов против нематод в защищенном грунте.

Разработка технологии получения и применения биологических препаратов против нематод на основе активных штаммов

Известные ранее способы производства препаратов основывались на использовании в качестве наполнителя навоза, биоперегноя, а рекомендуемые большинством авторов зерновые субстраты не только дороги, но и токсичны для растений (Мацкешч, 1977).

Использование новой препаративной формы на основе активного инокулята позволяет снизить сроки изготовления препарата

е 10 раз, резко сократить технологическую схему, значительно снизить экономические затраты и себестоимость его производства. Уменьшение нормы расхода более, чем в 10 раз, позволяет сделать применение биопрепарата более рентабельным, по сравнению с химическими нематицидами.

Препараты допытывались в условиях защищенного грунта г.Новосибирска (агрофирма "Имя", ЦСБС СО РАН).

В результате использования препаратов выявлено:

1) препараты оказывают стимулирующее действие на рост растений;

2) отмечено снижение заболеваемости растений мелойдогино-

зом;

3) урожайность культур, обработанных биопрепаратами, превышала контроль, шксимальная прибавка урожайности получена при применении биопрепарата на основе штамма № 6 - на 2,3 кг Еыше, чем в контроле. Прибавка от применения химических препаратов, по литературным данным, составляет только 0,1 кг/м^.

4) выявлено комплексное действие препаратов на основе активных штаммов на нематода и фитопатогенные грибы и бактерии. Наблюдается снижение титра фитопатогенных бактерий после использования препаратов на 1-2 порядка, грибов - в 3-10 раз.

Заключение

Использование активных и стабильных штаммов нематофагоЕых грибоЕ, дошевых питательных сред, оптимизация процессов культи-Еирования, разработка новой препаративной формы позволяют значительно сократить и удешевить технологический процесс производства биопрепаратов. Антибиотическое и нематицидное действие активных штаммов грибов-гифомицетов, стимулирующее влияние на рост побегов растений, низкие нормы внесения позеоляют комплексно использовать их против нематод и опасных возбудителей болезней растений, делают их конкурентноспособныыи с химическими пестицидами и нематицидами.

Настоящая работа монет быть полезна для исследований по селекции и генетике грибов, биотехнологии и разработки методов биологического контроля возбудителей болезней растений.

Общие выводы

1. ПроЕвдено изучение и описание-морфолого-культуральных особенностей грибов рода Arthrobotrys.

2. Выделены новые штаммы грибов рода Arthrobotrys из природных местообитаний, проведен сравнительный анализ и дана не-матофаговая оценка этих штаммов.

3. Изучены цроявления спонтанной изменчивости нематофаго-вых грибов при развитии в культуре, выявлена дифференциация популяции грибов на биотипы и корреляция морфологических признаков и физиологической активности.

4. Впервые в отечественной и зарубежной практике был предложен и использован метод воздействия химическим мутагеном ЗМС с целью получения наследуемых (высокая нематофаговая активность) изменений у грибов-гельминтофагов. Выявлены особенности действия SMC на данные объекты.

5. При использовании глубинного культивирования выявлены следующие фазы роста у нематофаговых грибов: экспоненциальная, стационарная и фаза отмирания, характеризующиеся определенной морфологией и состоянием клеток.

6. Оптимизация процессов глубинного культивирования и применение физиологически активного инокулята с высокой скоростью накопления биомассы (до 23 г/л) на 4-е сутки культивирования позволило создать новую препаративную форму и сократить технологический цикл производства биопрепарата в 10 раз.

7. Получены биопрепараты против фитопаразитических нематод, 'проведены испытания их в защищенном грунте.

8. В лабораторных условиях биологическая эффективность биопрепаратов на основе мутантных штаммов составляет 100$ ужа через 18 часов, у исходного штамма - через двое суток, споро-ношение у этих же штаммов отмечали на вторые сутки, у исходного штамма - через пять суток.

9. Биологическая эффективность препаратов е защищенном грунте составила от 61 до 100% на огурпах и от 63,7 до 86,7$ на томатах. Применение биопрепаратов в культуре томатов обеспечивало црибавку урожая в среднем на 37,8$ за один цикл.

10. Биопрепарат на основе мутантных штаммов нематофагоЕых грибов оказывает стимулирущее действие на прирост побегов растений.

II. Препарат на основе активных штаммов снижает титр фитопатогенных грибов и бактерий в почве.

Практические рекомендации

Г. Для получения высокоэффективных стабильных штаммов считаем, что по сравнению с традиционными метода»',га селекции наиболее целесообразно использовать метод химического мутагенеза (обработка клеток A.oiigospora ЭМС впервые предложена нами).

2. Критериями оценки активности штаммов являются: морфологический биотип, нематофаговая активность, а также скорость накопления биомассы.

3. Для производства биопрепаратов следует использовать методы глубинного культивирования.

4. Обработки необходимо проводить за 1-2 недели до высадки растений в грунт, затем повторно - через 1-2 месяца.

5. Для снижения зараженности овощных культур закрытого грунта фитопаразитическими нематодами, бактериями и грибами норма расхода биопрепарата должна быть не ниже 50- 100 г/м2.

Работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Степанова Е.В., Теплякова Т.В. К вопросу отбора активных и стабильных штаммов хищных грибов // Тезисы докладов Областной научно-практической конференции молодых ученых и спец. с/х.- Тюмень, 1983.- С. 48-49.

2. Степанова Е.В. Новые штаммы нематофагових грибов // Материалы I отраслевой конференции - конкурса молодых ученых.-Москва, 1989.- С. 45-46.

3. Степанова Е.В., КальвишТ.К., Теплякова Т.В. Селекция и поддержание активных и стабильных штаммов нематофаговых грибов// Сборник научных трудов СО АН СССР, БИН, Всесоюзн. микробиол. общ., Новосиб. отд. "Микробиологические исследования в Западной Сибири".- Новосибирск: Наука, 1989.- С. 71-74.

4. Степанова Е.В., Тарасенко Н.Д. Подавление галловых нематод биологическими препаратами на основе грабов рода Arthrototrys corda // Интродукция и акклиматизация растений (селекционно-генетические аспекты).- Новосибирск, ЦСБС СО РАН, 1994а.-

С. 68-69.

5. Степанова Е.В., Тарасенко Н.Д. Искусственное получение

эффективных штаммов нематсфаговых грибов // Интродукция и акклиматизация растений (селекционно-генетические аспекты).-Новосибирск, ЦСБС СО РАН, 19946.- С. 70-73.

6. Степанова Е.В., Тарасенко Н.Д. Биологическое подавление галловых нематод с помощью активных штаммов нематофагоЕых грибов // Интродукция и акклиматизация растений (селекционно-генетические аспекты).- Новосибирск, ЦСБС СО РАН, 1994в.~

С. 73-77.

7. Степанова S.B., Тарасенко Н.Д. Исследование формообразовательного процесса у хищных грибов (Arthrobotrys oligospora Fres.) под действием этилметансульфоната (ЭМС) // Интродукция и акклиматизация растений (селекционно-генетические аспекты).- Новосибирск, ЦСБС СО РАН, 1994г.- С. 78-83.

Отпечатано на ротапринте Института катализа СО РАН,Новосибирск90.

Подписано в печать 25.11.94. Печ.листов.0,8 Заказ

Заказ № 158

Формат 60x84/16 Тираж 100