Бионематицид на основе гриба-гельминтофага Duddingtonia flagrans F-882

Ананько, Григорий Григорьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бионематицид на основе гриба-гельминтофага Duddingtonia flagrans F-882
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Бионематицид на основе гриба-гельминтофага Duddingtonia flagrans F-882"

На правах рукописи

005055/УО

АНАНЬКО Григорий Григорьевич

БИОНЕМАТИЦИД НА ОСНОВЕ ГРИБА-ГЕЛЬМИНТОФАГА шюотстомл РЬАвЯАт Р-882

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 9 НОЯ 2012

Кольцове - 2012

005055796

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Теплякова Тамара Владимировна

Официальные оппоненты:

Аликин Юрий Серафимович, доктор биологических наук, Институт медицинской биотехнологии ФБУН Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор», старший научный сотрудник лаборатории нуклеиновых кислот и рекомбинантных белков

Ашмарина Людмила Филипповна, доктор сельскохозяйственных наук, Государственное научное учреждение Сибирское отделение Россельхозакадемии, начальник отдела земледелия, растениеводства и селекции

Ведущая организация

Новосибирский государственный аграрный университет, г. Новосибирск

Защита состоится «21» декабря 2012 г. в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, 630559; тел: (383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан «16» ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор ' Трошкова Галина Павловна

Актуальность исследования. Защита сельскохозяйственных культур от вредителей и болезней является неотъемлемой частью современного сельскохозяйственного производства. Известно свыше 3000 видов фитопаразитических нематод, поражающих практически все виды культурных растений, что приводит к ежегодным потерям 10 % мировой растительной продукции или около 120 млрд. долларов в денежном выражении. В 50-70-х гг. XX века численность нематод, как правило, контролировали с помощью химических нематицидов. В последующие годы в полной мере выявились такие недостатки химических препаратов, как токсичность для человека и животных и снижение эффективности вследствие возникновения резистентных рас гельминтов. В развитых странах ряд химических препаратов был запрещен к использованию, что привело к ограничению ассортимента разрешенных нематицидов. Возникла настоятельная необходимость в создании альтернативных нетоксичных средств защиты растений.

Замена химических нематицидов биопрепаратами позволяет получать экологически чистую продукцию, снизить степень загрязнения окружающей среды, успешно бороться с фитопаразитическими нематодами, резистентными к химическим нематицидам. Но ассортимент бионематицидов на сегодняшний день крайне ограничен, а технология их производства далека от совершенства. Поэтому повышение конкурентоспособности биопрепаратов на основе совершенствования технологии их производства и применения остается актуальной задачей (Монастырский O.A., 2006). В 60-80-х гг. прошлого века в ряде регионов Советского Союза предпринимались попытки налаживания производства бионематицидов на основе грибов-гельминтофагов (Теплякова Т.В., 1999). Известные технологии были рассчитаны на производство небольших партий грибных нематицидов в условиях биолабораторий, располагавших ограниченным набором технологического оборудования. Однако с современной точки зрения эти технологии обладают рядом недостатков: большая продолжительность производственного цикла (4-6 недель), высокие затраты ручного труда, колебания качества различных партий биопрепарата из-за нестандартности субстратов и контаминации посторонними микроорганизмами, трудности масштабирования применяемых технологий.

В качестве перспективной основы для получения бионематицида был выбран штамм хищного гриба Duddingtonia ßagrans F-882, выделенный ранее (патент РФ 2253671, 2004). Последнее десятилетие D. ßagrans активно изучался

за рубежом с точки зрения его применения для профилактики гельминтозов у животных и был признан перспективным в этом плане (Рагаис! С. Й а1., 2005). Проведенные исследования подтвердили возможность использования D.J¡agrans в ветеринарии: было показано, что он эффективен против стронгилят (Е1ар1ю$1гоп£у1№ рапйсоШ) желудочно-кишечного тракта маралов (Ефремова Е.А., Теплякова Т.В., Ананько Г.Г., 2007). Но возможности его применения для контроля фитопаразитических нематод ранее не исследовались. Имеющаяся в литературе информация содержит отрывочные данные по физиологии этого гриба. Основное содержание представленной работы составляют результаты исследования переходных процессов в жизненном цикле Б. /1ацгапв и описание разработанных на основе этих данных новых способов получения и применения различных препаративных форм.

Цель и задачи исследования. Целью нашего исследования было создание технологии производства и применения биопрепарата на основе нематофагового гриба £>. flagrans Р-882, предназначенного для регулирования численности фитопаразитических нематод. В процессе исследования решали следующие задачи.

1. Выявление основных факторов, контролирующих жизненный цикл А /Iа^ат.

2. Создание более эффективных, по сравнению с существующими, способов получения споросодержащих препаративных форм на основе хищного гриба по таким показателям, как продолжительность производственного цикла и возможность масштабирования процесса.

3. Проведение испытаний бионематицида против фитопаразитических нематод.

4. Оптимизация процесса применения биопрепарата с целью снижения его расхода при сохранении эффективности.

Научная новизна. Впервые показано, что в глубинной культуре D.f¡agrans формирование хламидоспор индуцируется разбавлением среды водой в 2 и более раз. Впервые установлено, что для индукции процесса формирования ловушек у этого гриба необходимо снижение концентрации источников азота и углерода ниже критического уровня, а также определены критические значения содержания таких веществ, как питательная среда МК

(на основе мелассы и кукурузного экстракта), сахароза и триптон, полностью ингибирующие процесс.

Предложено три новых способа получения бионематицида на основе хламидоспор й. flagrans. Один из способов впервые позволяет реализовать процесс получения хламидоспор в биореакторе, при этом процесс спорообразования индуцируется стрессом при разбавлении водой. Второй способ позволяет получать препарат с высоким содержанием хламидоспор (4х10б спор/г) на частицах вспученного вермикулита в поверхностной культуре (патент РФ 2366178, 2009). Третий оригинальный способ сочетает технологии поверхностного и глубинного культивирования, позволяя параллельно осуществлять процессы созревания хламидоспор и высушивания препарата. Все три указанных способа позволяют снизить затраты времени на производственный цикл в 4-6 раз по сравнению с известными способами выращивания хищных грибов на твердых органических носителях. Кроме того, первый и третий способы открывают возможности для эффективного масштабирования процесса, так как здесь количество производимой продукции зависит от объема сосуда, а не от площади.

Впервые продемонстрирована нематофаговая активность бионематицида на основе О. /1а^ат в отношении галловой, цистообразующей и стеблевой нематод, а также ростостимулирующий эффект в отношении таких растений, как бегония, огурец, картофель и земляника.

Впервые показано пролонгирование нематофагового и ростостимулирующего действия препарата на 3 года после однократного применения на огурцах и землянике.

Практическая значимость. Предложенный спектр технологий производства бионематицида может быть адаптирован к различным техническим возможностям производителя, что подтверждается разработкой технологической схемы получения жидкой формы препарата на заводе ООО ПО «Сиббиофарм». Экспериментальная партия биопрепарата объемом 5 тонн, наработанная там же, прошла успешные производственные испытания в ОАО «Суховский» Кемеровской области, по результатам которых был составлен акт испытаний. В плане практического применения грибных нематицидов важно то, что за счет оптимизации сроков внесения и добавок нитрата аммония (из

расчета 30 г/м2) можно снизить расход препарата в 4-8 раз при сохранении его эффективности.

Положения, выносимые на защиту. Формирование хламидоспор в мицелии глубинной культуры D. ßagrans индуцируется резким снижением концентрации питательных веществ при разбавлении среды водой. Для индукции процесса образования ловушек у этого гриба необходимо, чтобы концентрация источников азота и углерода в среде была ниже определенного критического уровня: для среды МК, сахарозы и триптона критические значения составляют, соответственно, 45 %, 1,6 % и 1,0 %.

Новый способ получения препарата на основе хламидоспор D. ßagrans в биореакторе, где процесс спорообразования инициируется разбавлением среды водой, позволяет получать (1-2)*105 хламидоспор/мл глубинной культуры.

Ускоренный способ получения препарата с высоким содержанием хламидоспор D. ßagrans (4х 10б хламидоспор/г сухого препарата), с использованием добавок растворимых питательных веществ и вспученного вермикулита в качестве носителя, позволяет сократить продолжительность производственного цикла в 4-6 раз по сравнению с ранее известными способами выращивания хищных грибов на твердых органических носителях.

Оригинальный способ получения хламидоспор D. ßagrans, сочетающий технологии поверхностного и глубинного культивирования, открывает возможности для эффективного масштабирования процесса. Экспериментальная установка, созданная для его реализации, позволяет параллельно осуществить процесс получения хламидоспор на частицах вспученного вермикулита и высушивание препарата, урожай составляет 4><106 хламидоспор/г сухого препарата.

Биопрепарат на основе D. ßagrans:

- проявляет нематицидное действие в отношении галловой Meloidogyne incognita (снижение зараженности растений до 0,5 балла), цистообразующей Globodera rostochiensis (снижение зараженности на 70 %) и стеблевой Anguillulina dipsaci (снижение численности в 17 раз) нематод;

- обладает ростостимулирующим действием в отношении таких культур, как бегония королевская (Begonia rex), огурец {Cucumis sativus), картофель (Solanum tuberosum) и земляника садовая (Fragaria ananassa), выражающийся в

увеличении длины корней и площади листовой поверхности на 15^5 % и увеличении урожая плодов на 10—53 %;

- пролонгирует нематицидный и ростостимулирующий эффекты на 3 года после однократного применения на растениях огурца и земляники.

Внесение биопрепарата до наступления пиковой численности нематод, также как и применение стимулирующих добавок (нитрата аммония) позволяет снизить расход грибного нематицида в 4-8 раз, при сохранении его эффективности.

Апробация работы. Результаты работы представлены на международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений, перспективы и роль в фитосанитарном оздоровлении агроценозов и получении экологически безопасной сельскохозяйственной продукции» в Краснодаре (2008 г.); на 5 съезде общества биотехнологов России в Москве (2008 г.); на международной конференции «Биология — наука XXI века» в Москве (2012 г.); на 3 съезде микологов России в Москве (2012 г.). Имеется патент на способ получения препарата на основе микроскопического гриба для борьбы с паразитическими нематодами растений и животных (патент РФ 2366178, 2009). Проведение исследований было поддержано грантом С1ШР (ИЮ -11029).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 1 патент и 6 статей, из них 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), описания материалов и методов (2-я глава), изложения результатов и их обсуждения (3-5-я главы), заключения и выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 149 страницах, включая список литературы на 16 страницах и приложения на 15 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и 23 таблицами. Список цитированной литературы включает 163 источника, в том числе 125 - иностранных авторов.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Разработка технологической схемы и наработка крупной партии жидкого препарата для производственных испытаний проводилась совместно с Т.В. Тепляковой и сотрудниками ООО ПО «Сиббиофарм». Испытания препаратов проводились совместно с Т.В. Тепляковой, сотрудниками ГНУ

ВНИИ биологической защиты растений (г. Краснодар) и сотрудниками ФБГУН Сибирского ботанического сада СО РАН (г. Новосибирск).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования: штамм гриба-гельминтофага Duddingtonia flagrans F-882, выделенный T.B. Тепляковой, депонирован в «Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и защищен патентом РФ (№ 2253671, 2004); тест-обьекты — свободноживугцая нематода-бактериофаг (Panagrellus redivivus), галловая (Meloidogyne incognita), цистообразующая золотистая картофельная (Globodera rostochiensis) и стеблевая (Ditylenchus dipsaci) нематоды. Выделение нематод из почвы производили модифицированным методом Бермана (Ruess L., 1995).

Вспученный вермикулит использовали в качестве носителя (ООО "Ангарский вермикулит", г. Красноярск).

Культивирование D. flagrans. Посевной мицелий получали в 0,75 л колбах на круговой качалке при 180 об./мин, температуре 28 С на питательной среде МК, содержащей мелассу и кукурузный экстракт (патент РФ № 2253671, 2004). Наработку биомассы для проведения испытаний производили в глубинной культуре (ГК) в биореакторе БИОК - 022с (ООО «Саяны», г. Новосибирск), объемом до 10 л (Теплякова Т.В. и др., 2005).

Для исследования процессов спорообразования в поверхностной культуре использовали агаризованную среду МК и водный агар (Теплякова Т.В., 1999). Получение хламидоспор в погруженной культуре осуществлялось в конических колбах объемом 200 мл на круговой качалке при 180 об./мин, температуре 28°С, объем жидкости составлял 25 мл. Для индукции спорообразования культуру, выращенную на среде МК, разводили водой в 2-5 раз и инкубировали до завершения процесса созревания спор (4-7 суток).

Индукцию процесса образования ловушек в погруженной культуре осуществляли в конических колбах объемом 200 мл на круговой качалке при 180 об./мин, температуре 28°С в течение 2-х суток, объем жидкости составлял 25 мл. Для индукции процесса формирования ловушек (для нематод) культуру D. flagrans, выращенную на среде МК, разбавляли водой в три раза и добавляли нематод или кондиционированную среду, содержащую метаболиты нематод.

Подсчет ловушек в полях зрения производился под микроскопом (*400), результаты усреднялись по 40 полям зрения.

Жидкий препарат для производственных испытаний (5 т) был произведен на линии ферментеров ООО ПО «Сиббиофарм» (г. Бердск). Его использовали для проведения испытаний в тепличном комбинате ОАО «Суховский» (г. Кемерово) на овощных культурах против галловой нематоды; во Всероссийском институте биологической защиты растений (ВНИИ БЗР, г. Краснодар) для полевых испытаний на землянике, пораженной стеблевой нематодой. Различные дозы сухой и жидкой форм препарата были испытаны также против: галловых нематод овощных культур в теплице Новосибирского метрополитена; галловых нематод в горшечных культурах бегонии (ФБГУН Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, г. Новосибирск); золотистой картофельной нематоды (Новосибирская область, Мошковский район).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Большинство исследований хищных грибов проводится на поверхностных культурах, выращиваемых на агаризованных средах (ОгопуоИ .1. й а1., 1996, 1999). Основной их недостаток - гетерогенность условий и самих культур, так как разные участки культуры имеют различный возраст и физиологическое состояние.

Рис. 1. Жизненный цикл 0./1а^ат

В наших экспериментах культивирование £). flagrans проводилось в колбах в термостатированном шейкере или в биореакторе, где обеспечивается равномерное распределение питательных веществ и, соответственно, единство состояния всей культуры. Глубинная культура В. Аа^ат является хорошей моделью для количественных исследований факторов, контролирующих переход от одной стадии жизненного цикла к другой (рис. 1). Были изучены следующие переходы: вегетативный мицелий <-> формирование спор; мицелий —> образование ловушек для нематод; а также особенности процесса спорообразования при зоотрофном способе питания.

1. Условия получения хламидоспор

В глубинной культуре. В качестве пусковых факторов спорообразования использовали различного рода стрессы, которые индуцировали процесс спорообразования у других видов грибов (Феофилова Е.П. и др., 2012). Ранее на примере хищных грибов рода АгЛгоЬо¡гуя, родственных даддингтонии, было показано, что стимулирование формирования хламидоспор происходило при помещении мицелия в воду, почву, в присутствии нематод, а также при длительном хранении в холодильнике (Теплякова Т.В., 1992, докт. диссер.). Выяснилось, что у Б. flagrans наилучшим индуктором процесса спорообразования является лимитирование культуры по питательным веществам, что достигается разбавлением глубинной культуры водой в 2—4 раза. При разбавлении культуры хламидоспоры формировались гораздо быстрее (за 4 суток, вместо двух недель), и их количество было на 1-2 порядка больше, чем в неразбавленной культуре (табл. 1).

Таблица 1

Выход хламидоспор в глубинной культуре (ГК) в зависимости от степени ее _разбавления__

Варианты Количество хламидоспор х104

в 1 мл разбавленной ГК В пересчете на 1 мл исходной ГК

ГК 0,40 ± 0,05 0,4 ±0,05

ГК, разбавление в 2 раза 4,6 ± 0,4 9,2 ± 0,8

ГК, разбавление в 3 раза 7,8 ± 0,6 23,4 ± 1,8

ГК, разбавление в 4 раза 6,2 ± 0,5 24,8 ± 2,0

Оказалось, что варьирование значений остальных факторов (температуры, рН и интенсивности аэрации) лишь модулирует эффект разбавления и не способно самостоятельно индуцировать процесс спорообразования. Таким образом, можно получить (1-2)х105 хламидоспор в расчете на 1 мл исходной (не разбавленной) глубинной культуры. Параллельная с разбавлением добавка глицерина (до 2 %) позволяет увеличить выход хламидоспор в 2-3 раза, до (2,8-3,6)х105 хламидоспор/мл глубинной культуры.

В поверхностной культуре. Согласно нашим данным, при нанесении на частицы наполнителя (торф, силикагель, цеолит, керамзит, почва) вегетативной биомассы О. flagrans, выращенной в глубинной культуре, из клеток мицелия в течение 4 суток формируется множество хламидоспор, при этом конидии почти не образуются. Наилучший урожай хламидоспор был получен на частицах вспученного вермикулита (табл. 2).

Таблица 2

Выход хламидоспор в зависимости от соотношения глубинной культуры (ГК)

и вспученного вермикулита

Описание варианта Число хламидоспор х 10ь

на 1 г вермикулита на 1 мл исходной ГК

1 мл ГК на 1 г вермикулита 1,7 ± 0,2 1,7 ± 0,2

2 мл ГК на 1 г вермикулита 3,2 ±0,3 1,6 ±0,2

3 мл ГК на 1 г вермикулита 4,9 ± 0,5 1,6 ±0,2

В данном интервале концентраций выход хламидоспор прямо пропорционален количеству биомассы, нанесенной на вермикулит. При формировании хламидоспор очевидно используются вещества, запасенные в клетках мицелия в процессе роста в глубинной культуре. Поэтому представляло интерес исследование влияния добавок различных питательных веществ на выход хламидоспор (табл. 3). Добавки ряда источников азота и углерода действительно способствовали увеличению выхода хламидоспор в 7-10 раз в сравнении с контролем. Характер субстратов оказал заметное влияние на продолжительность процесса формирования хламидоспор. При добавлении растворимых источников углерода и азота (мелассы и кукурузного экстракта) процесс формирования хламидоспор происходит в те же сроки, что и в контроле (4 суток). При этом мицелий почти не растет, добавка расходуется на формирование дополнительных хламидоспор. При добавлении нерастворимого

субстрата (муки или крахмала) происходит мощный прирост мицелия, и процесс формирования хламидоспор завершается лишь через 13 суток.

Таблица 3

Динамика прироста хламидоспор на вспученном вермикулите при добавлении

в глубинную культуру (ГК) различных источников углерода и азота

Описание образцов Продолжительность инкубации, суток / количество хламидоспор х106в 1 г сухого препарата

4 7 10 13

Контроль - ГК без добавок 0,5 ±0,1 0,5 ±0,1 0,5 ±0,1 0,5 ±0,1

ГК с 6 % мелассы и 0,6 % кукурузного экстракта 3,5 ± 0,4 3,7 ± 0,4 3,7 ± 0,4 3,7 ±0,3

ГК с 10 % крахмала 0,5 ±0,1 2,2 ± 0,3 3,1 ±0,3 3,8 ± 0,4

ПС с 10% муки 0,6 ± 0,05 2,7 ± 0,2 4,4 ± 0,4 5,4 ± 0,4

Примечание: 3 мл ГК на 1 г вермикулита во всех вариантах.

В результате проведенных исследований установлено, что переход культуры в состояние гипобиоза происходит при наиболее существенных изменениях среды обитания. Было показано значение двух стресс-сигналов (рис. 2), индуцирующих переход мицелия D.flagrans к спорообразованию.

Рис. 2. Факторы, управляющие переходом от стадии вегетативного роста к спорообразованию в глубинной и поверхностной культурах.

Первый - естественный или искусственно созданный дефицит питания, индуцирующий процесс спорообразования как в поверхностной, так и в глубинной культуре. В молодой глубинной культуре (до 3-х суток) этот

процесс может быть обращен вспять посредством добавок питательных веществ. Второй значимый фактор - непосредственный контакт глубинного мицелия с кислородом воздуха. Он запускает два параллельных процесса: преобразование глубинного мицелия в воздушный и формирование хламидоспор. В этой ситуации переход необратим, добавки питательных веществ не прерывают спорообразование, но приводят к увеличению числа образующихся спор.

2. Три новых способа получения хламидоспор D.flagrans

На основе полученных данных об индукторах процесса спорообразования были разработаны новые методы получения хламидоспор (рис. 3), необходимых для приготовления бионематицида с достаточно длительным сроком хранения (не менее 1 года). Первая стадия во всех трех способах реализуется одинаково: выращивание необходимого количества вегетативного мицелия в биореакторе или на качалке на среде МК до концентрации биомассы по сухому веществу не менее 10 г/л (30-40 часов). Далее описаны последующие стадии трех технологий (Ананько Г.Г., Теплякова Т.В., 2008).

Выращивание вегетативного мицелия в биореакторе

+добавки + вспученный вермикулит

Применение жидкой препаративной формы

Получение хламидоспор в глубинной культуре в биореакторе

Стационарная поверхностная культура

Активно перемешиваемая поверхностная культура

Созревание хламидоспор на частицах вермикулита

ьт^р

Созревание хламидоспор и параллельное высушивание препарата

Концентрирование и сушка препарата

Высушивание препарата

Рис. 3. Способы получения препаративных форм.

2.1. Получение хламидоспор в глубинной культуре (1-й способ)

Индукция процесса спорообразования (2-я стадия) осуществляется посредством разбавления глубинной культуры водой в 2-3 раза, после чего разбавленная ГК культивируется в биореакторе в течение 4 суток при температуре 28°С, интенсивном перемешивании и аэрации. Полученную биомассу, содержащую хламидоспоры и мицелий, концентрируют фильтрованием. Концентрат смешивают со вспученным вермикулитом (в качестве наполнителя) и высушивают, получая сухой споро содержащий препарат. В отличие от поверхностного способа культивирования, данная технология открывает возможности для эффективного масштабирования, крупные партии препарата можно производить на стандартном ферментационном оборудовании существующих микробиологических производств.

2.2. Получение хламидоспор на вспученном вермикулите в

стационарных условиях (2-й способ)

Процесс спорообразования (2-я стадия) запускается после смешивания глубинной культуры, выращенной в биореакторе, со стерильным вермикулитом в соотношении 3:1, смесь инкубируют в полипропиленовых мешках при температуре 28°С в течение 4 суток до созревания хламидоспор. Благодаря высокой влагоемкости вспученного вермикулита (около 400 %) можно варьировать количество наносимого посевного материала и добавок питательных веществ в широком диапазоне. Так, добавка растворимых питательных веществ, мелассы (6 %) и кукурузного экстракта (0,6 %) позволяет на порядок увеличить выход хламидоспор, от 4х105 до 4х106 спор/г сухого препарата. Продолжительность производственного цикла составляет 6—7 суток, тогда как при использовании твердых органических субстратов для этого требуется 4-6 недель. Два вышеописанных способа получения хламидоспор были запатентованы (патент РФ 2366178,2009).

2.3. Получение хламидоспор на активно перемешиваемых частицах

вспученного вермикулита (3-й способ)

Основным недостатком процесса получения хламидоспор в стационарной поверхностной культуре является ограничение на допустимую высоту слоя носителя (не более 10-15 см), при которой еще осуществима пассивная аэрация всего объема культуры. Разработан новый способ получения хламидоспор D.flagrans, который сочетает технологии глубинного и поверхностного культивирования, и пилотная установка для его реализации. Данную установку можно классифицировать как биореактор с клетками грибов, иммобилизованными на частицах носителя (вспученного вермикулита): жидкая фаза (питательная среда) заключена внутри частиц носителя, а сам носитель инкубируется в газовой фазе. Установлено, что медленное пересыпание субстрата при вращении сосуда не препятствует развитию хламидоспор на частицах вермикулита. Поток воздуха, стерилизуемый на воздушных фильтрах, обеспечивает аэрацию мицелия, теплообмен и постепенное высушивание препарата. Таким образом, параллельно реализуется сразу две стадии технологического процесса - созревание спор и высушивание препарата. В итоге получается стерильный сухой продукт, который можно сразу фасовать. Поскольку количество производимой продукции зависит от объема сосуда, а не от площади, снимаются препятствия для эффективного масштабирования процесса, позволяющего снизить себестоимость продукции. Данное оборудование может быть использовано также для производства споровых препаратов других видов грибов, споры которых невозможно получить в глубинной культуре.

По сравнению с известной схемой получения грибного нематицида на твердых органических субстратах (Теплякова Т.В., 1999), в нашей технологии сокращаются затраты времени на первую стадию. В глубинной культуре посевной материал можно получить за 1-2 суток, тогда как на зерновом субстрате на это требуется около 2 недель (Сопрунов Ф.Ф., 1958). Вторая стадия, получение хламидоспор, во всех трех разработанных технологиях реализуется за 4 суток, вместо 3—4 недель. Это достигается за счет

использования достаточного количества посевного материала и использования растворимых питательных веществ. В целом, предлагаемые технологии позволяют сократить затраты времени на производственный цикл в 4-6 раз.

3. Условия перехода к зоотрофному типу питания

D. ßagrans относится к группе грибов миксотрофов, которые могут выбирать способ питания и, в зависимости от условий, питаются либо мертвой органикой (как типичные сапротрофы), либо почвенными нематодами (как хищники). Целью данного раздела является исследование основных факторов, управляющих переходом от сапротрофного к зоотрофному способу питания, что необходимо для разработки эффективной технологии применения бионематицида.

Переход к зоотрофии в глубинной культуре D. ßagrans. Штамм D. ßagrans F-882 продуцирует аттрактант, ациклический сесквитерпеновый альдегид 3,7,11-триметил-додека-2,4,6,10-тетраеналь, привлекающий нематод Panagrellus redivivus (Ананько Г.Г., Теплякова Т.В., Ткачев A.B., 2012). При определенных условиях данный штамм также образует клейкие петли для улавливания нематод, как в поверхностной, так и в глубинной культуре. Было показано, что максимальное количество ловушек образуется при оптимальных концентрациях питательной среды МК (20 %), сахарозы (0,4 %) и триптона (0,2 %), тогда как в высоких концентрациях эти же вещества ингибируют их образование. Были определены критические концентрации указанных питательных веществ (соответственно, 45 %, 1,6 % и 1,0 %), полностью ингибирующие процесс образования ловушек. Таким образом, для индукции процесса формирования ловушек необходимо выполнение двух обязательных условий: снижение концентрации источников азота и углерода ниже критического уровня и контакт мицелия с метаболитами нематод (Ананько Г.Г., Теплякова Т.В., 2011). В богатой среде D. ßagrans питается как сапротроф, но если переход к зоотрофии произошел, то гриб ведет себя подобно облигатному хищнику, используя нематод как полноценный источник питания.

Активность бионематицида в почве, в зависимости от способа его применения. С использованием данных, полученных в глубинной культуре О, Аа^гат, было проведено сравнительное исследование различных вариантов применения сухого препарата (табл. 4). Выяснилось, что внесение препарата в почву до наступления пиковой численности нематод, также как и добавка нитрата аммония, позволяют снизить расход биопрепарата в 4-8 раз при сохранении его эффективности (Ананько Г.Г., Теплякова Т.В., 2010). В данном случае внесение азотных удобрений приносит двойную пользу, как стимулятор образования ловушек и роста растений.

Таблица 4

Динамика гибели нематод в почве при использовании различных технологий _применения сухой формы бионематицида_

№ Технология применения Описание образца *Доля погибших нематод, %

10 суток 20 суток

1 Одновременное внесение в почву сухого препарата и нематод 0,25 % препарата 0 33 ±21

2 0,5 % препарата 44 ±25 77,3 ±10

3 1,0% препарата 55,8 ± 12,4 92,5 ± 0,5

4 2,0 % препарата 88,5 ± 0,7 93,5 ± 1,9

5 Сначала вносили препарат в почву, затем через 4 суток добавляли нематод 0,25 % препарата 83,1 ±3,0 90,5 ± 5,6

6 0,5 % препарата 93,3 ± 1,0 94,1 ±3,4

7 1,0 % препарата 94,4 ±0,1 95,0 ± 0,4

8 Одновременно вносили 0,5 % препарата от массы почвы, нитрат аммония и нематод 0,25 % раствор ЫН4ЫОз 47,5 ± 23,5 85,5 ± 7,3

9 1,0 % раствор ЫЩЫОз 93,5 ± 3,8 99,5 ± 0,5

10 Одновременно вносили 1,0 % препарата от веса почвы, нитрат аммония и нематод 0,25 % раствор МН41ЧОз 88,3 ± 2,2 91,5 ±0,2

11 1,0 % раствор ЫН4Ы03 97,7 ± 2,3 99,5 ± 0,5

Примечание: *в процентах от количества нематод в контроле (почва без препарата).

4. Испытания препаративных форм на основе D.flagrans

Были проведены испытания (табл. 5) жидкой и сухой препаративных форм против: галловой нематоды на бегониях {Begonia rex) и огурцах (Cucumis sativus), цистообразующей золотистой нематоды на картофеле (Solanum tuberosum) и стеблевой нематоды земляники садовой (Fragaria ananassa), в различных климатических зонах (в Сибири и Краснодарском крае). Крупномасштабные испытания жидкой формы препарата в условиях реального

производства были проведены в теплицах ФГУП «Суховский» в Кемеровской области на площади 3000 м2.

В результате применения препарата наблюдалось существенное снижение зараженности растений нематодами, а также проявление ростостимулирующего эффекта, а именно, увеличение вегетативной массы растений и повышение урожайности культур. На овощных и ягодных культурах показано пролонгированное действие препарата в течение всего срока наблюдения, 3 года, после однократного внесения в почву (Теплякова и др., 2008; Агасьева И.С. и др., 2008).

Таблица 5

Объект контроля: Растение Результаты испытаний

Галловая нематода Meloidogyne incognita Бегония королевская (Новосибирск) - Снижение зараженности растений до 0,5 балла (в контроле все растения погибли). - Продление периода вегетации растений.

Огурцы сорта «Королек» (Новосибирск) - Снижение зараженности растений до 1 балла (в контроле - 5 баллов). - Ростостимулирующий эффект - увеличение площади листовой поверхности на 17-45 %.

Огурцы сорта «Эффект» (Кемерово) - Ростостимулирующий эффект: увеличение высоты растений на 25-30 см и урожая на 0,7-2,8 кг/м2. - Пролонгирование указанных эффектов на три года после однократного внесения препарата.

Цистообразующая золотистая нематода Globodera rostochiensis Картофель: «Свитанок киевский», «Любава» (Новосибирск) - Снижение зараженности на 52-70 %. - Ростостимулирующий эффект на стадии проростков. - Повышение урожайности картофеля в 1,5-2 раза.

Стеблевая нематода AnguilluUna dipsaci Земляника садовая (Краснодар) - Уменьшение количества нематод в 2-17 раз в зависимости от дозы и формы препарата. - Снижение инвазии нематод в здоровые растения. - Ростостимулирующий эффект: увеличение количества листьев на 37-50 % и высоты растений на 51-73 %; увеличение урожая на 10-53 %, в том числе фракции крупных ягод на 5-19 %. - Пролонгирование вышеуказанных эффектов на три года после однократного внесения препарата.

выводы

1. Впервые показано, что формирование хламидоспор О. Аа^аю индуцируется естественным или искусственно созданным дефицитом питания, либо при контакте глубинного мицелия с воздушной средой. Показано также, что для инициации процесса формирования ловушек необходимо выполнение двух условий: снижение концентрации источников азота и углерода ниже критического уровня и контакт мицелия с метаболитами нематод. Для ряда питательных веществ, таких как питательная среда МК, сахароза и триптон, выявлены оптимальные концентрации, стимулирующие процесс образования ловушек (соответственно, 20 %, 0,4 % и 0,2 %), и критические концентрации, полностью ингибирующие этот процесс (45 %, 1,6 % и 1,0 %).

2. Разработан способ получения препарата на основе хламидоспор Б. Аа^ат в биореакторе, где процесс спорообразования инициируется разбавлением среды водой, который позволяет получать (1-2)* 105 хламидоспор/мл глубинной культуры.

3. Разработан способ получения препарата с высоким содержанием хламидоспор £>. flagrans (4><106 спор/г) с применением добавок растворимых питательных веществ и вспученного вермикулита в качестве носителя. Продолжительность производственного цикла сокращается в 4-6 раз по сравнению с известными способами выращивания хищных грибов на твердых органических носителях.

4. Разработан способ культивирования О. flagrans, который сочетает технологии поверхностного и глубинного культивирования, открывающий возможности для эффективного масштабирования процесса. Создана экспериментальная установка для его тестирования, позволяющая реализовать процесс получения хламидоспор на частицах вспученного вермикулита с одновременным высушиванием препарата. Урожай составляет 4x106 хламидоспор/г сухого препарата.

5. В результате испытаний бионематицида в Новосибирской, Кемеровской областях и Краснодарском крае показаны его нематофаговая активность и ростостимулирующий эффект:

• зараженность бегонии галловой нематодой снизилась до 0,5 балла (в контроле все растения погибли), был продлен период вегетации растений;

• зараженность растений огурца галловой нематодой снизилась до 1 балла (в контроле - 5 баллов), увеличилась длина корней и площадь листовой поверхности на 15—45 %, прибавка к урожаю составила 0,7-2,8 кг/м2;

• зараженность картофеля цистообразующей золотистой нематодой снизилась на 52-70 %, урожайность картофеля повысилась в 1,5-2 раза;

• численность стеблевой нематоды на землянике снизилась в 2-17 раз, при увеличении количества листьев на 37-50 % и урожая ягод на 10-53 %.

6. Установлено, что действие биопрепарата после однократного применения на растениях огурца (галловая нематода) и земляники (стеблевая нематода) пролонгируется на 3 года (срок наблюдения).

7. Показано, что расход грибного нематицида можно снизить в 4-8 раз, при сохранении его эффективности, за счет оптимизации сроков внесения бионематицида (за две недели до наступления пиковой численности нематод), а также использования стимулирующих добавок (нитрата аммония).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендуемых ВАК РФ

1. Ефремова Е.А., Теплякова Т.В., Ананько Г.Г. Лярвицидные свойства глубинной культуры хищного гриба Оис1е1^1ота /1а^ат при элафостронгилезе маралов // Сибирский вестник с.-х. науки. 2007. № 6. С. 87-91.

2. Теплякова Т.В., Ананько Г.Г. Хищные грибы-гифомицеты против паразитических нематод // Защита и карантин растений. 2009. № 6. С. 22-25.

3. Ананько Г.Г., Теплякова T.B. Способы повышения эффективности препарата на основе нематофагового гриба Duddingtonia flagrans II Защита и карантин растений. 2010. № 7. С. 20-22.

4. Ананько Г.Г., Теплякова Т.В. Факторы, определяющие переход от сапротрофного к зоотрофному типу питания у хищного гриба Duddingtonia flagrans II Микробиология. 2011. № 2. С. 200-206.

Патенты

5. Теплякова Т.В., Ананько Г.Г. Способ получения препарата на основе хламидоспор микроскопического гриба для борьбы с паразитическими нематодами растений и животных: патент РФ № 2366178, опубл. 10.09.2009. Бюл. № 25. 12 с.

Статьи в сборниках и журналах

6. Теплякова Т.В., Кислых В.И., Ананько Г.Г., Ибрагимова Ж.Б. Использование хищного гриба Duddingtonia flagrans против нематод // Коммерческая биотехнология: интернет-журнал. 20.10.2005. Т. 5. URL: http://www.cbio.ru/page/43/id/2108/.

7. Ананько Г.Г., Теплякова Т.В. Биотехнология получения препарата против паразитических нематод сельскохозяйственных культур // Сборник научных трудов «Достижения современной биотехнологии» под ред. Дроздова И.Г. Новосибирск. 2008. С. 328-335.

Материалы конференций

8. Агасьева И.С., Федоренко Е.В., Теплякова Т.В., Ананько Г.Г. Испытание нематофагового препарата на основе гриба Duddingtonia flagrans против стеблевой нематоды земляники Anguillulina dipsaci Ritz. // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений, перспективы и роль в фитосанитарном оздоровлении агроценозов и получении экологически безопасной сельскохозяйственной продукции». 23-25 сентября 2008 г., Краснодар. Вып. 5. С. 189-193.

9. Теплякова Т.В., Ананько Г.Г., Агасьева И.С., Федоренко Е.В. Пролонгированное действие нематофагового препарата на основе гриба Duddingtonia flagrans против галловых нематод на огурцах // Материалы

международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений, перспективы и роль в фитосанитарном оздоровлении агроценозов и получении экологически безопасной сельскохозяйственной продукции». 23-25 сентября 2008 г., Краснодар. Вып. 5. С. 303-306.

10. Ананько Г.Г., Теплякова Т.В. Биотехнология получения препарата против паразитических нематод сельскохозяйственных культур // Материалы 5 съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Москва. 2 -4 декабря 2008 г. С. 11-12.

11. Теплякова Т.В., Ананько Г.Г., Свириденко А.Н. Исследование устойчивости нематофаговых грибов рода Arthrobotrys к действию ультрафиолетового излучения // Материалы 5 съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Москва. 2-4 декабря 2008 г. С. 290-291.

12. Ананько Г.Г., Теплякова Т.В. Новые методы получения спор грибов-гельминтофагов для производства бионематицидов на их основе // Материалы международной конференции «Биология — наука XXI века». Москва. 24 мая 2012 г. С. 42-43.

13. Ананько Г.Г., Ибрагимова Ж.Б., Мазуркова H.A., Теплякова Т.В. Перспективы использования хищных грибов-гифомицетов в производстве противопаразитарных и противовирусных препаратов // Материалы международной конференции «Биология - наука XXI века». Москва. 24 мая 2012 г. С. 44-46.

14. Ананько Г.Г., Теплякова Т.В., Ткачев A.B. Идентификация аттрактантов для нематод, продуцируемых хищным грибом Daddingtonia ßagrans // Материалы 3-го съезда микологов. Москва. 10-12 октября 2012 г. С. 62.

Подписано в печать 13.11.2012 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 100 экз. Заказ № 123.

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Введение Диссертация по биологии, на тему "Бионематицид на основе гриба-гельминтофага Duddingtonia flagrans F-882"

Актуальность исследования

Защита от вредителей и болезней является неотъемлемой частью современного сельскохозяйственного производства. Известно свыше 3000 видов фитопаразитических нематод, поражающих практически все виды культурных растений, что приводит к ежегодным потерям 10 % мировой растительной продукции или около 120 млрд. долларов в денежном выражении [10]. Снижение урожая полевых, овощных, технических, кормовых, плодово-ягодных культур, обусловленное фитогельминтозами, составляет от 6 до 25 %. В отдельных случаях потери урожая достигают 70-90 % [8]. Не менее значимы потери продукции животноводства от гельминтозов сельскохозяйственных животных.

В 50-70-х гг. XX века численность нематод, как правило, контролировали с помощью химических нематицидов. В последующие годы в полной мере выявились такие недостатки химических препаратов, как токсичность для человека и животных и снижение эффективности вследствие возникновения резистентных рас гельминтов. Под давлением общественных организаций в развитых странах ряд химических нематицидов был запрещен к использованию, что привело к ограничению ассортимента разрешенных препаратов. Возникла настоятельная необходимость в создании альтернативных нетоксичных средств защиты растений, и научное сообщество отреагировало на это интенсификацией исследований в данном направлении. Анализ мировой литературы показывает быстро растущий интерес к биозащите, в последние 10 лет число публикаций в области биопестицидов и биотехнологий защиты растений увеличилось более чем в 20 раз. Положительным стимулом для развития биозащиты является постоянное повышение спроса на так называемую «organic food», продукцию сельского хозяйства, не загрязненную химикатами. Так, только в США производство «organic food» за 10 лет выросло в 6 раз, а объем их продаж достиг 12 млрд. долларов в год. Соответственно, вырос спрос на биопестициды со стороны фермеров.

Биологическим средствам защиты уделяется все больше внимания, как альтернативе химическим пестицидам для их полной замены или использованию в интегрированных системах защиты растений. Замена химических нематицидов биопрепаратами позволяет получать экологически чистую продукцию, снизить степень загрязнения окружающей среды, успешнее бороться с фитопаразитическими нематодами, резистентными по отношению к химическим нематицидам [18]. Однако ассортимент бионематицидов пока крайне ограничен, а технология их производства далека от совершенства. Естественными антагонистами нематод в почве являются нематофаговые грибы, факультативные или облигатные хищники, имеющие приспособления для улавливания мелких беспозвоночных. Хищные грибы были описаны во второй половине 19 века, впервые их применили для защиты посадок ананасов от галловых нематод в 1930-х гг. [113]. Однако попытки применения хищных грибов для борьбы с фитогельминтозами не всегда были успешными. Повышение конкурентоспособности биопрепаратов на основе оптимизации технологии их производства и применения остается актуальной задачей.

В 60-80-х гг. прошлого века в ряде регионов Советского Союза предпринимались попытки налаживания производства бионематицидов на основе грибов-гельминтофагов [35]. Известные технологии были рассчитаны на производство небольших партий грибных нематицидов в условиях биолабораторий, располагавших ограниченным набором технологического оборудования. Однако, с современной точки зрения, традиционные технологии обладают рядом недостатков: высокие затраты ручного труда, большая продолжительность производственного цикла (4-6 недель), колебания качества различных партий биопрепарата из-за нестандартности субстратов и контаминации посторонними микроорганизмами. Кроме того, эти технологии малопригодны для масштабирования процесса. К недостаткам ранее известных препаратов можно отнести также тот факт, что их основой были конидии, необходимо снижение концентрации источников азота и углерода ниже критического уровня, а также определены критические значения содержания таких веществ, как питательная среда МК (на основе мелассы и кукурузного экстракта), сахароза и триптон, полностью ингибирующие этот процесс.

Предложено три новых способа получения бионематицида на основе хламидоспор В. flagrans. Один из способов впервые позволяет реализовать процесс получения хламидоспор в биореакторе, при этом процесс спорообразования индуцируется стрессом при разбавлении водой. Второй способ позволяет получать препарат с высоким содержанием хламидоспор (4x106 спор/г) на частицах вспученного вермикулита в поверхностной культуре (патент РФ 2366178, 2009). Третий оригинальный способ сочетает технологии поверхностного и глубинного культивирования, позволяя параллельно осуществлять процессы созревания хламидоспор и высушивания препарата. Все три указанных способа позволяют снизить затраты времени на производственный цикл в 4 - 6 раз по сравнению с известными способами выращивания хищных грибов на твердых органических носителях. Кроме того, первый и третий способы открывают возможности для эффективного масштабирования процесса, так как здесь количество производимой продукции зависит от объема сосуда, а не от площади.

Впервые продемонстрирована нематофаговая активность бионематицида на основе В. flagrans в отношении галловой, цистообразующей и стеблевой нематод, а также ростостимулирующий эффект в отношении таких растений, как бегония, огурец, картофель и земляника.

Практическая значимость

Предложенный спектр технологий производства бионематицида может быть адаптирован к различным техническим возможностям производителя, что подтверждается разработкой технологической схемы получения жидкой формы препарата на заводе ООО ПО «Сиббиофарм». Экспериментальная партия биопрепарата объемом 5 тонн, наработанная там же, прошла успешные производственные испытания в ОАО «Суховский» Кемеровской области, по результатам которых был составлен акт испытаний. В плане практического применения грибных нематицидов важно то, что за счет оптимизации сроков внесения и добавок нитрата аммония (из расчета 30 г/м2) можно снизить расход препарата в 4-8 раз при сохранении его эффективности.

Положения, выносимые на защиту

Формирование хламидоспор в мицелии глубинной культуры £). Аа%гат индуцируется резким снижением концентрации питательных веществ при разбавлении среды водой. Для индукции процесса образования ловушек у этого гриба необходимо, чтобы концентрация источников азота и углерода в среде была ниже определенного критического уровня: для среды МК, сахарозы и триптона критические значения составляют, соответственно, 45 %, 1,6 % и 1,0%.

Новый способ получения препарата на основе хламидоспор Э. flagrans в биореакторе, где процесс спорообразования инициируется разбавлением среды водой, позволяет получать (1—2)х 105 хламидоспор/мл глубинной культуры.

Ускоренный способ получения препарата с высоким содержанием хламидоспор £>. Аа%гат (4x106 хламидоспор/г сухого препарата), с использованием добавок растворимых питательных веществ и вспученного вермикулита в качестве носителя, позволяет сократить продолжительность производственного цикла в 4-6 раз по сравнению с ранее известными способами выращивания хищных грибов на твердых органических носителях.

Оригинальный способ получения хламидоспор Б. flagrans, сочетающий технологии поверхностного и глубинного культивирования, открывает возможности для эффективного масштабирования процесса. Экспериментальная установка, созданная для его реализации, позволяет параллельно осуществить процесс получения хламидоспор на частицах вспученного вермикулита и высушивание препарата, урожай составляет 4*106 хламидоспор/г сухого препарата.

Биопрепарат на основе D.flagrans:

- обладает ростостимулирующим действием в отношении таких культур, как бегония королевская {Begonia rex), огурец (Cucumis sativus), картофель (Solanum tuberosum) и земляника садовая (Fragaria ananassa), выражающийся в увеличении длины корней и площади листовой поверхности на 15-45 % и увеличении урожая плодов на 10-53 %;

Апробация работы

Результаты работы представлены на международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений, перспективы и роль в фитосанитарном оздоровлении агроценозов и получении экологически безопасной сельскохозяйственной продукции» в Краснодаре (2008 г.); на 5 съезде общества биотехнологов России в Москве (2008 г.); на международной конференции «Биология - наука XXI века» в Москве (2012 г.); на 3 съезде микологов России в Москве (2012 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 1 патент и 6 статей, из них 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), описания материалов и методов (2-я глава), изложения результатов и их обсуждения (3-5-я главы), заключения и выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 149 страницах, включая список литературы на 16 страницах и приложения на 15 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и 23 таблицами. Список цитированной литературы включает 163 источника, в том числе 125 - иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Ананько, Григорий Григорьевич

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что формирование хламидоспор О. flagrans индуцируется естественным или искусственно созданным дефицитом питания, либо при контакте глубинного мицелия с воздушной средой. Показано также, что для индукции процесса формирования ловушек необходимо выполнение двух условий: снижение концентрации источников азота и углерода ниже критического уровня и контакт мицелия с метаболитами нематод. Для ряда питательных веществ, таких как питательная среда МК, сахароза и триптон, выявлены оптимальные концентрации, стимулирующие процесс образования ловушек (соответственно, 20 %, 0,4 % и 0,2 %), и критические концентрации, полностью ингибирующие этот процесс (45 %, 1,6 % и 1,0 %).

2. Разработан способ получения препарата на основе хламидоспор £>. flagrans в биореакторе, где процесс спорообразования инициируется разбавлением среды водой, который позволяет получать (1-2)х10э хламидоспор/мл глубинной культуры.

3. Разработан способ получения препарата с высоким содержанием хламидоспор Э. flagrans (4х 106 спор/г) с применением добавок растворимых питательных веществ и вспученного вермикулита в качестве носителя. Продолжительность производственного цикла сокращается в 4-6 раз по сравнению с известными способами выращивания хищных грибов на твердых органических носителях.

4. Разработан способ культивирования Э. flagrans, который сочетает технологии поверхностного и глубинного культивирования, открывающий возможности для эффективного масштабирования процесса. Создана экспериментальная установка для его тестирования, позволяющая реализовать процесс получения хламидоспор на частицах вспученного вермикулита с одновременным высушиванием препарата. Урожай составляет 4><106 хламидоспор/г сухого препарата.

5. В результате испытаний бионематицида в Новосибирской, Кемеровской областях и Краснодарском крае. показаны его нематофаговая активность и ростостимулирующий эффект:

• зараженность картофеля цистообразующей золотистой нематодой снизилась на 52-70 %, урожайность картофеля повысилась в 1,5-2 раза; численность стеблевой нематоды на землянике снизилась в 2-17 раз, при увеличении количества листьев на 37-50 % и урожая ягод на 10-53 %.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основное содержание представленной работы составляют результаты исследования переходных процессов в жизненном цикле О. /1а^ат и описание разработанных на основе этих данных новых способов получения и применения различных препаративных форм.

Во-первых, для создания эффективной технологии производства и применения биопрепарата требуется детальное знание физиологии биологического агента. Поскольку имеющаяся в литературе информация содержит только отрывочные данные по физиологии этого гриба, постольку наша работа начиналась с количественного исследования факторов, контролирующих переходы между различными стадиями жизненного цикла. В модельной системе, глубинной культуре £>. Аа^гапБ, были изучены такие переходные процессы, как вегетативный рост мицелия спорообразование и сапротрофный —> зоотрофный тип питания. Знание условий перехода от вегетативного роста к спорообразованию необходимо для разработки технологии получения хламидоспор, являющихся основой биопрепарата с достаточно длительным сроком хранения. Оптимизация способов применения бионематицида была бы невозможной без знания условий прорастания спор и факторов, определяющих переход I). flagrans от сапротрофного к зоотрофному типу питания.

Проведенное исследование позволяет говорить о существовании сложной программы регулирования жизненного цикла у Л. flagrans, для описания которой не подходят линейные однофакторные схемы. Решение о переключении с одного способа питания на другой или переходе к иной фазе жизненного цикла определяется комплексом факторов. Наши исследования выявили целый ряд особенностей физиологии О. flagrans, присущих типичным сапротрофам, что подтверждает известную точку зрения о происхождении нематофаговых грибов от сапротрофов [15]. Как и у предков-сапротрофов, в регуляции цикла развития Э. flagrans ведущую роль играет содержание растворимых питательных веществ в среде. Резкое снижение концентрации источников азота в среде индуцирует процесс спорообразования, кроме того, повышается чувствительность мицелия к метаболитам нематод. Эти два фактора, бедная среда и наличие нематод (или их метаболитов), запускают программу зоотрофного поведения (образование ловушек). Имеет значение и текущее состояние культуры, зависящее от условий роста и ее возраста, или длительности ее хранения.

Полученные данные способствуют более глубокому пониманию роли зоотрофного типа питания в жизненном цикле D. flagrans. Было показано, что нематоды выступают полноценным источником питательных веществ, т.е. из тел пойманных нематод извлекаются все вещества необходимые для формирования зрелых хламидоспор, но отсутствующие в среде.

Во-вторых, мы проанализировали известные технологии производства препаратов на основе хищных грибов с целью выявления процессов, ограничивающих эффективность производства. Существенными недостатками традиционных технологий получения споровых препаратов являются: большая продолжительность производственного цикла (4-6 недель); преимущественно ручной труд; трудности масштабирования применяемых технологий. Разработанные нами более перспективные технологии предполагают получение хламидоспор D. flagrans в два этапа. Первая стадия является универсальной для всех трех технологий: наработка необходимого количества вегетативного мицелия в погруженной (глубинной) культуре в биореакторе или на качалке. Процесс культивирования в биореакторе обеспечивает асептические воспроизводимые условия, хороший массоперенос, создает возможности для эффективного масштабирования процесса, а также является наиболее быстрым способом получения биомассы гриба. В глубинной культуре посевной материал выращивают за 1—2 суток, тогда как при традиционной наработке посевного материала в поверхностной культуре затрачивют на это 1-2 недели. Вторую стадию получения хламидоспор гриба реализуют различными способами в зависимости от наличия необходимого оборудования, планируемых объемов производства и экономических критериев.

Первый способ осуществления второй стадии процесса получения хламидоспор основан на установленном нами факте: резкое снижение концентрации питательных веществ в глубинной культуре И. flagrans индуцирует процесс спорообразования. Для его реализации биомассу в форме вегетативного мицелия, выращенного в глубинной культуре до необходимой плотности, разбавляют водой для инициации процесса формирования хламидоспор. Таким образом, обе стадии, наработка биомассы штамма и процесс созревания спор, реализуются в стандартном биореакторе, затраты времени на производственный цикл сокращаются до 6-7 суток.

Второй способ основан на том, что перенос глубинного мицелия на поверхность субстрата индуцирует процесс формирования хламидоспор. На основе этих наблюдений был разработан способ получения хламидоспор £). flagrans на поверхности частиц неорганического носителя. Выбранный нами носитель (вспученный вермикулит) обладает подходящим комплексом свойств: невысокая цена, низкая насыпная плотность, производится в промышленных масштабах, высокая влагоемкость (до 4 г воды на 1 г носителя). Особенно ценным качеством является последнее, так как частицы вспученного вермикулита могут абсорбировать достаточное количество воды и питательных веществ, необходимых для процесса роста мицелия и спорообразования грибов. При этом обеспечивается свободный доступ кислорода к поверхности частиц, поскольку свободная вода отсутствует. Внешне данный способ похож на традиционную технологию получения грибного препарата на частицах твердого органического субстрата. Однако он лишен некоторых недостатков известной технологии. В последней частицы органического субстрата (кукурузная сечка, зерно и др.) выполняют сразу две роли, носителя и источника питания, тогда как в нашей технологии эти функции разделены. Функцию носителя выполняют частицы вспученного вермикулита, пропитанные растворимыми питательными веществами. Предварительно мы показали, что использование растворимых питательных веществ (меласса, кукурузный экстракт) позволяет в несколько раз ускорить процесс получения хламидоспор, по сравнению с нерастворимыми субстратами (мука, крахмал). Кроме того, мы проводим процесс культивирования в термостойких пластиковых мешках (полипропиленовых и др.) вместо стеклянной посуды, что упрощает процессы стерилизации и утилизации отходов. Таким образом, разработанная технология позволяет в 4-6 раз ускорить процесс получения хламидоспор на поверхности носителя (вспученного вермикулита), в сравнении с традиционной схемой.

Основным недостатком процесса получения хламидоспор в стационарной поверхностной культуре являются ограничения на допустимую высоту слоя носителя (не более 10-15 см), при которой еще осуществима пассивная аэрация всего объема культуры. Чем выше слой носителя, тем хуже снабжение кислородом нижнего слоя. Соответственно, снижается скорость роста грибов и увеличивается гетерогенность культуры. Масштабирование такого процесса осуществляется чисто экстенсивным путем, посредством увеличения производственных площадей и затрат ручного труда, т.е. не приводит к снижению себестоимости производства. Разработанная нами аппаратура сочетает преимущества глубинного и поверхностного способов культивирования. Это биореактор с клетками грибов, иммобилизованными на частицах носителя (вспученного вермикулита). Вращение сосуда и активная подача воздуха с помощью компрессора позволяют равномерно аэрировать весь объем иммобилизованных грибов. В то же время на микроуровне реализуется классический способ поверхностного культивирования: мицелий гриба располагается на частицах вермикулита, получая питание из раствора, абсорбированного в толще частиц. Как было установлено в ряде экспериментов, медленное пересыпание субстрата не препятствует развитию хламидоспор на поверхности частиц вспученного вермикулита. Данная аппаратура может быть масштабирована, подобно обычному биореактору, где количество производимой продукции зависит от объема сосуда, а не от площади. Следовательно, снимаются препятствия для эффективного масштабирования процесса, позволяющего снизить себестоимость продукции.

Данное оборудование может быть использовано также для производства споровых препаратов других видов грибов, споры которых невозможно получить в глубинной культуре.

Таким образом, внедрение новых технологий позволит сократить затраты времени на производственный цикл, существенно снизить затраты ручного труда, а также облегчит масштабирование производства препарата.

Сухой препарат на основе хламидоспор О. Аа^ат обеспечивает долговременное сохранение жизнеспособности гриба. Однако эффективность применения препарата зависит от того, какая доля хламидоспор прорастет при внесении препарата в почву. Это связано с тем, что ловушки для улавливания нематод образуются на гифах гриба после прорастания спор. Поэтому было также осуществлено исследование факторов, контролирующих прорастание спор, и условий перехода гриба к зоотрофному типу питания. Было показано, что при попадании во влажную почву прорастает лишь часть хламидоспор, тогда как остальные сохраняют состояние гипобиоза. С одной стороны, это несколько снижает эффективность препарата непосредственно после внесения в почву. Но, с другой стороны, сохранение части хламидоспор в покое создает предпосылки для длительного персистирования интродуцированного гриба в почве. Так, в экспериментах на овощных и ягодных культурах было показано, что нематофаговый и ростостимулирующий эффекты проявляются на протяжении всего срока наблюдения, 3 года, после однократного внесения препарата в почву. flagrans образует сети клейких ловушек и, соответственно, частота улавливания нематод зависит от плотности ловушек в почве. Нами были определены концентрации ряда веществ (сахарозы, триптона и ионов аммония), стимулирующие процесс образования ловушек. С практической точки зрения наиболее удобным представляется использование азотных удобрений, поскольку они также применяются для прямого стимулирования роста растений. Кроме того, было продемонстрировано, что заблаговременное, до достижения нематодами пиковой численности внесение в почву грибного препарата существенно увеличивает нематофаговый эффект. Данный прием, а также применение азотных удобрений, позволяют уменьшить дозу бионематицида в 4-8 раз, без снижения его эффективности.

Проведенные испытания позволили продемонстрировать нематофаговый и ростостимулирующий эффекты бионематицида на овощные, ягодные и декоративные культуры. Во всех проведенных испытаниях наблюдали существенное снижение количества нематод в почве, уменьшение числа инфицированных растений. Нематофаговый эффект проявлялся в отношении галловой нематоды на огурцах и бегониях, цистообразующей золотистой нематоды на картофеле и стеблевой нематоды земляники. Количество нематод в опыте снижалось по отношению к контролю в 2-17 раз. Ростостимулирующий эффект проявлялся в виде ускорения роста, увеличения вегетативной массы растений, повышения качества и количества урожая (до 50 %) овощных и ягодных культур.

Таким образом, в процессе исследования было решено несколько задач. Получена количественная информация о регуляции переходных процессов в жизненном цикле D. flagrans. На этой теоретической основе разработаны три новых способа получения спорового бионематицида, снимающих ряд технологических проблем, присущих ранее известным способам производства. Запатентован способ получения нематицидного препарата на основе D. flagrans в глубинной и поверхностной культуре [34]. Разработанный спектр технологий производства бионематицида может быть адаптирован к техническим возможностям производителя, с учетом требующихся объемов препарата. Так, небольшие партии сухого препарата могут производиться в биолабораториях, имеющих минимальный набор оборудования. Крупные партии препарата можно производить на заводской линии ферментеров в глубинной культуре. При условии капитальных вложений в создание специального оборудования, разработанного нами, можно производить требуемые объемы сухого препарата в «сухом» биореакторе. Проведенные испытания показали, что D. flagrans может использоваться для эффективного контроля численности фитопатогенных нематод тепличных и полевых культур. На основании результатов лабораторных и полевых испытаний препаративных форм разработаны способы оптимизации технологии применения препаратов на основе хищных грибов.

С целью внедрения технологии получения препарата на основе штамма Б. Аа§гаш Р-882 и его регистрации заключен договор о сотрудничестве с ООО ПО «Сиббиофарм».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ананько, Григорий Григорьевич, Кольцово

1. Ананько Г.Г., Теплякова Т.В. Биотехнология получения препарата против паразитических нематод сельскохозяйственных культур // Сборник научных трудов «Достижения современной биотехнологии» под ред. Дроздова И.Г. Новосибирск. 2008. С. 328-335.

2. Ананько Г.Г., Теплякова Т.В. Способы повышения эффективности препарата на основе нематофагового гриба Duddingtonia flagrans II Защита и карантин растений. 2010. № 7. С. 20-22.

3. Ананько Г.Г., Теплякова Т.В. Факторы, определяющие переход от сапротрофного к зоотрофному типу питания у хищного гриба Duddingtonia flagrans II Микробиология. 2011. № 2. С. 200-206.

4. Ананько Г.Г., Теплякова Т.В. Новые методы получения спор грибов-гельминтофагов для производства бионематицидов на их основе // Материалы международной конференции «Биология наука XXI века». Москва. 24 мая 2012 г. С 44-46.

5. Ананько Г.Г., Теплякова Т.В., Ткачев A.B. Идентификация аттрактантов для нематод, продуцируемых хищным грибом Daddingtonia flagrans // Материалы 3-го съезда микологов. Москва. 10-12 октября 2012 г. С. 62.

6. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. М.: Медицина, 1962. 180 с.

7. Вайшер Б., Браун Д.Д.Ф. Нематоды-паразиты растений. Меры борьбы с паразитическими нематодами растений // Знакомство с нематодами: общая нематология. София: Pensoft, 2001. С. 176-195.

8. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. М: Минсельхоз России, 2011.932 с.

9. Роль этилена и ауксина во взаимодействии растений и нематод / Гутиеррез O.A. и др. // Физиология растений. 2009. Т. 56. № 1. С. 3-7.

10. Ефремова Е.А., Теплякова Т.В., Ананько Г.Г. Лярвицидные свойства глубинной культуры хищного гриба Duddingtonia flagrans при элафостронгилезе маралов // Сибирский вестник с.-х. науки. 2007. № 6. С. 87-91.

11. Киньшакова Е.И. Некоторые результаты испытания хищного гриба в борьбе с галловой нематодой: тез. докл. V Всес. совещ. фитогельминтологов. Самарканд, 1962. С. 114-121.

12. Матвеева М.А. Защита растений от нематод. М.: Наука, 1989. 160 с.

13. Мехтиева H.A. Нематофаговые хищные грибы: автореф. дис. докт. биол. наук. Баку, 1969. 32 с.

14. Мехтиева H.A. Хищные нематофаговые грибы-гифомицеты. Баку: Наука, 1979.244 с.

15. Мехтиева H.A. Систематика и экология. В кн.: Грибы-гифомицеты-регуляторы численности паразитических нематод: Грибы-гельминтофаги и грибы рода Trichoderma, Алма-Ата: Наука, 1990. 176 с.

16. Мигунова В.Д. Методические рекомендации на способ производства биопрепарата Нематофагин МФ для борьбы с галловой нематодой в защищенном грунте // Российский паразитологический журнал. 2011. № 3. С. 125-128.

17. Монастырский O.A. Нужны ли биопрепараты и биологическая защита растений сельскому хозяйству? // Агро XXI. 2006. № 4-6. С. 14-17.

18. Нижегородов А.И. Новая концепция печей для обжига вермикулитовых концентратов // Строительные и дорожные машины. 2007. №10. С. 19-20.

19. Парамонов Е.С. Фитогельминтология, ее объекты и задачи // Вестник АН СССР. 1963. №2. С. 56-59.

20. Промышленная микробиология: Учеб. пособие для вузов / З.А. Аркадьева и др.. М.: Высш. шк., 1989. 688 с.

21. Прядко Э.И. Хищные грибы-гельминтофаги. Алма-Ата: Наука, 1972. 68 с.

22. Савотиков Ю.Ф., Шестеперов A.A., Тихонова JI.B. Рекомендации по выявлению и мерам борьбы с очагами глободероза картофеля. М.: Госагропром РСФСР, 1986. 123 с.

23. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. М.: ВО Агропромиздат, 1990. 240 с.

24. Сопрунов Ф.Ф. Хищные грибы-гифомицеты и их применение в борьбе с патогенными нематодами. Ашхабад: Изд-во АН Туркм. ССР, 1958. 366 с.

25. Сопрунов Ф.Ф., Шагалин С.Ф. Препарат хищных грибов и его применение в борьбе с круглыми паразитическими червями. Ашхабад: Изд-во АН Туркм. ССР, 1963. 19 с.

26. Способ выращивания мицелиальных форм организмов и аппарат для его осуществления: патент РФ № 1169359, опубл. 10.07.99. 11 с.

27. Теплякова Т.В., Беккер З.Э., Сухорукое A.A. Исследование ловчих колец хищного гриба Arthrobotrys oligospora штамма XIX 4/27 методами рентгеновского анализа и электронной микроскопии // Микроорганизмы в защите растений. Кишинев: Штиинца, 1985. С. 24-31.

28. Теплякова Т.В. Биологические аспекты изучения и использования хищных грибов-гифомицетов. Новосибирск: Наука, 1999. 252 с.

29. Теплякова Т.В., Кислых В.И., Ананько Г.Г., Ибрагимова Ж.Б. Использование хищного гриба Duddingtonia flagrans против нематод // Коммерческая биотехнология: интернет-журнал. 20.10.2005. Т. 5. URL: http://www.cbio.ni/page/43/id/2108/.

30. Теплякова Т.В., Ананько Г.Г. Хищные грибы-гифомицеты против паразитических нематод // Защита и карантин растений. 2009. № 6. С. 22-25.

31. Теплякова Т.В., Ананько Г.Г. Способ получения препарата на основе хламидоспор микроскопического гриба для борьбы с паразитическими нематодами растений и животных: патент РФ № 2366178, опубл. 10.09.2009. Бюл. № 25. 12 с.

32. Удалова В.Б. Применение хищных грибов {Arthrobotrys oligospora Fres.) в борьбе с галловой нематодой огурцов в закрытом грунте // Бюл. Всес. ин-та гельминтологии. 1971. Вып. 6. С. 115-120.

33. Споры грибов: покой, прорастание, химический состав и значение для битехнологии (обзор) / Феофилова Е.П., и др. // Прикладная биохимия и микробиология, 2012, Т. 48. № 1. С. 5-17.

34. Шаталин С.Ф. Опыт применения хищных грибов в борьбе с галловой нематодой в условиях теплицы // Паразиты животных и растений в Туркмении. Ашхабад: Ылым, 1968. С. 62-70.

35. Штамм гриба Duddingtonia flagrans, проявляющий свойства против галловых нематод растений и паразитических нематод животных и стимулирующий рост и развитие растений: патент РФ № 2253671, опубл. 10.06.2005. 12 с.

36. Improving the pathogenicity of a nematode-trapping fungus by genetic engineering of a subtilisin with nematotoxic activity / Ahman J. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. 68. P. 3408-3415.

37. Low genetic diversity among isolates of the nematode-trapping fungus Duddingtonia flagrans: evidence for recent worldwide dispersion from a single common ancestor / Ahren D. et al. // Mycol. Res. 2004. 108. (10). P. 1205-1214.

38. Alex L.A., Borkovich K.A., Simon M.I. Hyphal development in Neurospora crassa: Involvement of a two-component histidine kinase // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. 93. (8). P. 3416-3421.

39. Disseminated zygomycosis due to Rhizopus schipperae after heatstroke / Anstead G.M. et al. // Journal of Clinical Microbiology. 1999. 37. (8). P. 2656-2662.

40. Atkinson B., Daoud I. Microbial floes and flocculation in fermentation process engineering //Adv. Biochem. Eng. 1976. 4. P. 41-124.

41. Balogh J., Tunlid A., Rosen S. Deletion of a lectin gene does not affect the phenotype of the nematode-trapping fungus Arthobotrys oligospora II Fungal Genetics and Biology. 2003. 39. P. 128-135.

42. Barran L.R., Schneider E.F., Seaman W.L. Requirements for the rapid conversion of macroconidia of Fusarium sulphureum to chlamydospores // Canadian Journal of Microbiology. 1977. 23. (2). P. 148-151.

43. Barron G.L. The nematode-destroying fungi. Lancaster, PA: Lancaster Press, 1977. 245 pp.

44. Barron G.L. Ligninolytic and cellulolytic fungi as predators and parasites // The fungal community: its organization and role in the ecosystem. New York: Marcel Dekker, 1992. P. 311-326.

45. Barron G.L., Thorn R.G. Destruction of nematodes by species of Pleurotus // Can. J. Bot. 1987. 65. P. 774-778.

46. Betina V. Photoinduced conidiation in Trichoderma viride II Folia Microbiologica. 1995. 40. (3). P. 219-224.

47. Colonization of plant roots by egg-parasitic and nematode-trapping fungi / Bordallo J.J. et al. //New Phytologist. 2002. 154. (2). P. 491-499.

48. Brana A.F., Mendez C., Diaz L.A. Glycogen and trehalose accumulation during colony development in Streptomyces antibioticus // Journal of General Microbiology. 1986. 132. (5). P. 1319-1326.

49. Chen Z. X., Chen S. Y., Dickson D. W. A Century of Plant Nematology // Nematology: Advances and Perspectives. Beijing: Tsinghua University Press, 2004. 1. P. 979-1032.

50. Chlamydospore-like cells of Candida albicans in the gastrointestinal tract of infected, immunocompromised mice / Cole G.T. et al. // Canadian Journal of Microbiology. 1991. 37. (8). P. 637-646.

51. Cooke R. C. The ecology of nematode-trapping fungi in the soil // Annals of Applied Biology. 1962. 50. P. 507-513.

52. Cooke R.C. Ecological characteristics of nematode-trapping Hyphomycetes // Annals of Applied Biology. 1963. 52. P. 431-437.

53. Cooke R.C. Relationships between nematode-destroying fungi and soil-borne phytonematodes // Phytopathologia. 1968. 58. P. 909-913.

54. Couteaudier Y., Alabouvette C. Survival and inoculum potential of conidia and chlamydospores of Fusarium oxysporum in soil // Canadian Journal of Microbiology. 1990. 36. (8). P. 551-556.

55. Colonization and digestion of nematodes by the endoparasitic fungus Drechmeria coniospora / Dijksterhuis J. et al. // Mycological Research. 1991. 95. (7). P. 873-878.

56. Nematophagous fungi: Physiological aspects and structure-function relationships / Dijksterhuis J. et al. // Advances in Microbial Physiology. London: Academic Press Limited, 1994. V. 36. P. 111-144.

57. Drechsler C. Some hyphomycetes that prey on free-living terricolous nematodes // Mycologia. 1937. 29. P. 447-552.

58. Nematicidal effect of freshwater fungal cultures against the pine-nematode, Bursaphelenchus xylophilus / Dong J.Y. et al. // Fung Divers. 2004. 15. P. 125— 135.

59. Duddington C.L. The ecology of predacious fungi. I. Preliminary survey // Trans. Br. Mycol. Soc. 1951. 34. P. 322-331.

60. Modulation of host defence systems / Dumas-Gaudot E. et al. // Arbuscular mycorrhizas: physiology and function. Dordrecht: Kluwer, 2000. P. 173-200.

61. Duponnois R., Kisa M., Plenchette C. Phosphate-solubilizing potential of the nematophagous fungus Arthrobotrys oligospora // Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 2006. 169. (2). P. 280-282.

62. Elmayergi H. Mechanisms of pellet formation of Aspergillus niger with an additive // J. Ferment. Technol. 1975. 53. P. 722-729.

63. Friman E., Olsson S., Nordbring-Hertz B. Heavy trap formation by Arthrobotrys oligospora in liquid culture / FEMS Microbiology Letters. 1985. 31. (1). P. 17-21.

64. White collar-1, a circadian blue light photoreceptor, binding to the frequency promoter / Froehlich A.C. et al. // Science. 2002. 297. (5582). P. 815-819.

65. Fungi in biological control systems / ed. by Burge M. N. Manchester University Press, 1988. 269 pp.

66. Gallagher L.A., Manoil C. Pseudomonas aeruginosa PAOl kills Caenorhabditis elegans by cyanide poisoning // Journal of bacteriology. 2001. 183. (21). P. 62076214.

67. Effects of a non-chemical nematicide combined with soil solarization for the control of root-knot nematodes / Giannakou I.O. et al. // Crop Protection. 2007. 26. (11). P. 1644-1654.

68. Granules containing filamentary fungi and method of preparation thereof: патент EP2223600, опубл. 01.09.2010. 15 pp.

69. Gray N.F. Ecology of nematophagous fungi: Panagrellus redivivus as the target organism // Plant and Soil. 1983. 73. (2). P. 293-297.

70. Gray N.F. Nematophagous fungi from the maritime Antarctic: Factors affecting distribution//Mycopathologia. 1985.90. P. 165-176.

71. Gray N.F. Nematophagous fungi with particular reverence to their ecology // Biol. Rev. 1987. 62. P. 245-304.

72. Gray N.F. Fungi attacking vermiform nematodes // Diseases of nematodes. Florida: CRC Press., 1988. 2. P. 3-38.

73. Greasham R. Growth kinetics and fermentation scale-up // Biotechnology of filamentous fungi, technology and products. MA: Butterworth-Heinemann, 1991. P. 65-87.

74. Induction of traps by Ostertagia ostertagi larvae, chlamydospore production and growth rate in the nematode-trapping fungus Duddingtonia flagrans / Gronvold J. et al. // Journal of Helminthology. 1996. 70. (4). P. 291-297.

75. Biotic and abiotic factors influencing growth rate and production of traps by the nematode-trapping fungus Duddingtonia flagrans when induced by Cooperia oncophora larvae / Gronvold J. et al. // Journal of Helminthology. 1999. 73. (2). P. 129-136.

76. Hadley G., Harrold C.E. The sporulation of P.enicillium notatum Westling in submerged liquid culture. I. The effect of calcium and nutrients on sporulation // J. Exp. Bot. 1958. 9. P. 408-417.

77. Hagedorn G, Scholler M. A reevaluation of predatory orbiliaceous fungi. I. Phylogenetic analysis using rDNA sequence data // Sydowia. 1999. 51. P. 27^18.

78. Haydock P.P.J., Evans K. Management of potato cyst nematodes in the UK: an integrated approach // Outlook Agr. 1998. 27. P. 253-260.

79. Hansberg W., Aguirre J. Hyperoxidant states cause microbial cell differentiation by cell isolation from dioxygen //Journal of Theoretical Biology. 1990. 142. (2). P. 201-221.

80. White collar-1, a DNA binding transcription factor and a light sensor / He Q. et al. // Science. 2002. 297. (5582). P. 840-843.

81. Bacillus nematocida sp. nov., a novel bacterial strain with nematotoxic activity isolated from soil in Yunnan, China / Huang X.W. et al. // Syst. Appl. Microbiol. 2005. 28. (4). P. 323-327.

82. Jackson M.A. Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 1997. 19. (3). P. 180-187.

83. Jaffee B.A. Wood, nematodes, and the nematode-trapping fungus Arthrobotrys oligospora / Soil Biology and Biochemistry. 2004. 36. (7). P. 1171-1178.

84. Kerry B.R., Crump D.H., Mullen L.A. Studies of the cereal cyst-nematode, Heterodera avenae, uder continuous cerals. 1975-1978. II. Fungal parasitism of nematode females and eggs // Annals of Applied Biology. 1982a. 100. P. 489499.

85. Kerry B.R., Crump D.H., Mullen L.A. Natural control of the cereal cyst-nematode, Heterodera avenae Woll., by soil fungi at three sites // Crop protection. 19826. l.P. 99-109.

86. Kerry B.R., Simon A., Rovira A.D. Observations on the introduction of Verticillium chlamydosporium and other parasitic fungi into soil for control of the cereal cyst-nematode Heterodera avenae II Annals of Applied Biology. 1984. 105. P. 509-516.

87. Blue light overrides repression of asexual sporulation by mating type genes in the basidiomycete Coprinus cinereus / Kertesz-Chaloupkova K., et al. //Fungal Genetics and Biology. 1998. 23. (1). P. 95-109.

88. Tobacco agar, a new medium for differentiating Candida dubliniensis from Candida albicans / Khan Z.U. et al. // Journal of Clinical Microbiology. 2004. 42. (1)0. P. 4796^798.

89. Knipling E.F. The basic principles of insect population suppression and management // USD A Agriculture Handbook № 512. Washington, DC: US Government printing office, 1979. 213 pp.

90. Kossen N.W.F. The morphology of filamentous fungi // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2000. 70 P. 1-33.

91. Regulation of citric acid production by oxygen: effect of dissolved oxygen tension on adenylate levels and respiration in Asperillus niger / Kubicek C.P. et al. // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1980. 9. P. 101-115.

92. The A mating type and blue light regulate all known differentiation processes in the basidiomycete Coprinus cinereus / Kües U. et al. // Molecular and General Genetics. 1998. 260. (1). P. 81-91.

93. Kües U. Life history and developmental processes in the basidiomycete Coprinus cinereus //Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2000. 64. (2). P. 316353.

94. Biological control of gastro-intestinal nematodes—facts, future, or fiction? / Larsen M. et al. // Veterinary Parasitology. 1997. 72. P. 479^185.

95. Larsen M. Prospects for controlling animal parasitic nematodes by predacious microfungi//Parasitology. 2000. 120. P. 121-131.

96. Lauter F.-R., Yamashiro C.T., Yanofsky C. Light stimulation of conidiation in Neurospora crassa: Studies with the wild-type strain and mutants wc-1, wc-2 and acon-2 // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 1997. 37. (3). P. 203-211.

97. Lee B.N., Adams T.H. FluG and flbA function interdependently to initiate conidiophore development in Aspergillus nidulans through brlA(3 activation // EMBO Journal. 1996. 15. (2). P. 299-309.

98. Proteases from Bacillus: A new insight into the mechanism of action for rhizobacterial suppression of nematode populations / Lian L.H. et al. // Letters in Applied Microbiology. 2007. 45. (3). P. 262-269.

99. Lilley C.J., Atkinson H.J., Urwin P.E. Molecular Aspects of Cyst Nematodes // Mol. Plant Pathol. 2004. 6. P. 577-578.

100. Lin X., Heitman J. Chlamydospore formation during hyphal growth in Cryptococcus neoformans II Eukaryotic Cell. 2005. 4. (10). P. 1746-1754.

101. Linford M. B. Stimulated activity of natural enemies of nematodes // Sciences. 1937. 85. (123). P. 121-130.

102. Linford M. B., Oliveira J. M. Reduction of soil populations of the root-knot nematode during decomposition of organic matter // Soil-Sci. 1938. 45. P. 127-135.

103. Linford M.B., Japp F. Root-knot injury restricted by a nematode-trapping fungus // Phytopathology. 1939. 27. (7). P. 596-609.

104. Macia-Vicente J.G., Jansson H.B., Lopez-Llorca L.V. Assessing fungal root colonization for plant improvement // Plant Signal Behav. 2009. 4. (5) P. 445-447.

105. Rco-3, a gene involved in glucose transport and conidiation in Neurospora crassa / Madi L. et al. // Genetics. 1997. 146. (2). P. 499-508.

106. Mankau R. Utilisation of parasites and predators in nematode pest management ecology: proceedings, Tall Timbers conference on ecological animal control by habitat management. 1972. 4. P. 129-143.

107. Mauchline T.H., Kerry B.R., Hirsch P.R. The biocontrol fungus Pochonia chlamydosporia shows nematode host preference at the infraspecific level // Mycological Research. 2004. 108. (2). P. 161-169.

108. Meyer W.J., Wiebe M.G. Enzyme production by the nematode-trapping fungus, Duddingtonia flagrans II Biotechnology Letters. 2003. 25. P. 791-795.

109. Chitin amendments for control of Meloidogyne arenaria in infested soil / Mian L.H. et al. //Nematropica. 1982. 12. P. 71-84.

110. Migunova V.D., Byzov B.A. Determinants of trophic modes of the nematophagous fungus Arthrobotrys oligospora interacting with bacterivorous nematode Caenorhabditis elegans // Pedobiologia. 2005. 49. (2). P. 101-108.

111. Morton A.G. The induction of sporulation in mould fungi // Proc. R. Microscop. Soc.B. 1961. 153. P. 548-569.

112. Müller J. The Economic Importance of Heterodera schachtii in Europe // Helminthologia. 1999. 36. P. 205-213.

113. Myconematicides and methods for using the same: патент США № 5989543, опубл. 23.11.99. 19 pp.

114. Nematocidally active chitin-protein complex: патент США № 4536207, опубл. 20.08.85. 17 pp.

115. Nematode-active toxin from a Bacillus thuringiensis isolate: патент США № 5322932, опубл. 21.06.94. 12 pp.

116. Noel G.R., Atibalentja N., Domier L.L. Emended description of Pasteuria nishizawae II International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2005. 55. P. 1681-1685.

117. Nordbring-Hertz В., Stälhammar-Carlemalm M. Capture of nematodes by Arthrobotrys oligospora, an electron microscope study // Can. J. Bot. 1978. 6. (10). P. 1297-1307.

118. Nordbring-Hertz B. Action of a nematode-trapping fungus shows lectin-mediated host-microorganism interaction //Nature. 1979. 281. P. 477-479.

119. Novel isolates of Bacillus thuringiensis having activity against nematodes: патент EP0303426, опубл. 26.08.92. 12 pp.

120. Two glucose transporters in Saccharomyces cerevisiae are glucose sensors that generate a signal for induction of gene expression / Ozcan S. et al. // Proc Natl Acad Sci U S A., 1996. 93. (22). P. 12428-12432.

121. Administration of Duddingtonia flagrans chlamydospores to goats to control gastro-intestinal nematodes: Dose trials / Paraud C. et al. // Veterinary Research. 2005.36. (2). P. 157-166.

122. Production of leucinostatins and nematicidal activity of Australian isolates of Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson / Park J.O. et al. // Letters in Applied Microbiology. 2004. 38. (4). P. 271-276.

123. Pazout J., Pazoutova S., Vancura V. Effects of light, phosphate, and oxygen on ethylene formation and conidiation in surface cultures of Penicillium cyclopium Westling // Current Microbiology. 1982. 7. (3). P. 133-136.

124. Peloille M. Selection of nematode-trapping fungi to use in biological control // Working Group "Integrated control of soil pests" Methods for studying nematophagous fungi. IOBC/WPRS, Bulletin. 1991. P. 13-17.

125. Persmark L, Jansson H-B. Nematophagous fungi in the rhizosphere of agricultural crops // FEMS Microbiology Ecology. 1997. 22. P. 303-312.

126. Persmark L., Nordbring-Hertz B. Conidial trap formation of nematode-trapping fungi in soil and soil extracts // FEMS Microbiology Ecology. 1997. 22. (4). P. 313-323.

127. Persson C, Jansson HB. Rhizosphere colonization and control of Meloidogyne spp. by nematode-trapping fungi // J. Nematol. 1999. 31. (2). P. 164-171.

128. Peterson E.A., Katznelson H. Studies on the relationships between nematodes and other soil microorganisms. IV. Incidence of nematode-trapping fungi in the vicinity of plant roots // Can. J Microbiol. 1965. 11. P. 491^195.

129. Poromarto S.H., Nelson B.D., Freeman T.P. Association of binucleate Rhizoctonia with soybean and mechanism of biocontrol of Rhizoctonia solani II Phytopathology. 1998. 88. P. 1056-1067.

130. Regulez P., Ponton J., Dominguez J.B. Lipid composition and the transition from yeast-like to chlamydospore cells of Pullularia pwllulans // Canadian Journal of microbiology. 1980. 26. (12). P. 1428-1437.

131. The influence of maintenance energy and growth rate on the metabolic activity, morphology and conidiation of Penicillium chrysogenum / Righelato R.C. et al. // Journal of General Microbiology. 1968. 50. (3). P. 399-412.

132. Conidiation in Penicillium cyclopium is induced by conidiogenone, an endogenous diterpene / Roncal T. et al. // Eukaryotic Cell 2002. 1. (5). P. 823829.

133. Roncal T., Ugalde U. Conidiation induction in Penicillium II Research in Microbiology. 2003. 154. P. 539-546.

134. Rubner A. Revision of predacious hyphomycetes in the Dactylella-Monacrosporium complex // Stud. Mycol. 1996. 39. P. 1-134.

135. Ruess, L. (1995). Nematode fauna in spruce forest soils: a qualitative/quantitative comparison //Nematologica. 41. P. 106-124.

136. Schmidt A.R., Dorfelt H., Perrichot V. Carnivorous fungi from cretaceous amber// Science. 2007. 318. P. 1743-1748.

137. Scholler M., Rubner A. Predacious activity of the nematode-destroying fungus Arthrobotrys oligospora in dependence of the medium composition // Microbiological Research. 1994. 149. P. 145-149.

138. Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne javanica by Trichoderma harzianum / Sharon E. et al. // Phytopathology. 2001. 91. (7). P. 687-693.

139. Sivasithamparam K. Root cortex the final frontier for the biocontrol of root-rot with fungal antagonists: a case study on a sterile red fungus // Annual Review of Phytopathology. 1998. 36. P 439^152.

140. Skromne I., Sanchez O., Aguirre J. Starvation stress modulates the expression of the Aspergillus nidulans brlA regulatory gene //Microbiology. 1995. 141. (1). P. 21-28.

141. Promotion of conidial head formation in Aspergillus oryzae by a salt / Song M.H. et al. // Biotechnology Letters. 1987. 23. (9). P. 689-691.

142. Stadler M., Anke H., Sterner O. Linoleic acid the nematocidal principle of several nematophagous fungi and its production in trap-forming submerged cultures // Arch. Microbiol. 1993. 160. P. 401-405.

143. Strain of Trichoderma harzianum useful as nematode inhibitor, fungicide and plant growth promoter and a process for the isolation thereof: патент США № 6475772, опубл. 05.11.2002. 7 pp.

144. Tewari, D. N. Monograph on neem (Azadirachta indica A. Juss.). Dehra Dun, India: International Book Distributors. P. 123-128.

145. Thorn R. G., Barron G. L. Carnivorous mushrooms // Science. 1984. 224. P. 7678.

146. Ophiobolin M and analogues, noncompetitive inhibitors of ivermectin binding with nematocidal activity / Tsipouras A. et al. // Bioorganic and Medicinal Chemistry. 1996. 4. P. 531-536.

147. Purification and characterization of an extracellular serine protease from the nematode-trapping fungus Arthrobotrys oligospora / Tunlid A. et al. 11 Microbiology. 1994. 140. P. 1687-1695.

148. United States Environmental Protection Agency, US EPA // http://www.epa.gov/oppbppdl/biopesticides/.

149. Veenhuis M., Harder W., Nordbring-Hertz B. Occurrence and metabolic significance of microbodies in trophic hyphae of the nematophagous fungus Arthrobotrys oligospora // Antonie van Leeuwenhoek. 1989. 56. (3), P. 241-249.

150. Waller P.J., Faedo M., Ellis K. The potential of nematophagous fungi to control the free-living stages of nematode parasites of sheep: towards the development of a fungal controlled release device // Veterinary Parasitology. 2001. 102. P. 299308.

151. Wessels J.G.H. Hydrophobins: Proteins that change the nature of the fungal surface // Advances in Microbial Physiology. 1997. 38. P. 35^15.

152. Wrather J.A., Stienstra W.C., Koening S.R. Soybean disease loss estimates for the united states from 1996 to 1998 // Can. J. Plant Path. 2001. 23. P. 122-131.

153. Zhang K.Q., Liu X.Z., Cao L. Nematophagous species of Monacrosporium from China // Mycol Res. 1996. 100. P. 274-276.

154. Zubkov M.V., Tarran G.A. High bacterivory by the smallest phytoplankton in the North Atlantic Ocean // Nature. 2008. 455. P. 224-226.

Информация о работе

Ананько, Григорий Григорьевич
кандидата биологических наук
Кольцово, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Бионематицид на основе гриба-гельминтофага Duddingtonia flagrans F-882 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы