Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЫБОР ТРОФИЧЕСКОЙ СТРАТЕГИИ ХИЩНЫМ НЕМАТОФАГОВЫМ ГРИКОМ ARTHROBOTRYS OLIGOSPORA

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ВЫБОР ТРОФИЧЕСКОЙ СТРАТЕГИИ ХИЩНЫМ НЕМАТОФАГОВЫМ ГРИКОМ ARTHROBOTRYS OLIGOSPORA"

Я-ЗЗМЗ

Иа правах рукописи

Мигу нова Варвара Дмитриевна

ВЫБОР ТРОФИЧЕСКОЙ СТРАТЕГИИ ХИЩНЫМ НЕМАТОФАГОВЫМ ГРИБОМ АКТНЮВОТКУЗ OLIGOSPORЛ

Специальность 03,00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидат он »логических наук

МОСКВА - 2002

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета поч повеления Московского Государственного Университета им. MB, Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических нау к,

профессор Д.Г.Звягинцев

Официальны« оппоненты: доктор биологических наук.

Д. Д. Покаржевский

кандидат биологических h;ivk. A.B. Кураков

Ведущая организация: Институт биохимии н физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

Зашита диссертации состоится « ff, ¡ш&х 2оаД. в 15 ч 30 мин в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета К501.001.05 в МГУ им, М.П. Ломоносова по адресу; 119992. Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ. факультет почвоведения.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета по микробиологии и афохимин в МГУ v i-ч прислать отзывы на автореферат »двух экчрм ■ л по адреса У ва. ГСП - 2.

Ленинские горы, МГУ им. М.В, Ломо^; Ученый

совет.

С диссертацией можно ознакомь и-е* . . ■■<:■ тения МГУ,

Автореферат разослан «'Иу^--

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук ■'■■■

: Актуальность. Большинство почвенных грибов - сапротрофы. ко-некоторые проявляют биотрофию, паразитизм, некротрофию или способны менять свой тип питания. Примером тгого являются хншные нематофаговые грибы, которые мотут растя и на мертвом органическом веществе, и питаться живыми нематодам« (Dijkslerbuis. i 993). Феномен хищничества до сих пор не получил достаточного объяснения е точки зрения энергетического и конструктивного обмена хишных грибов. Остаются не ¡Шестыми трофические потребности грибов в нематодах и механизмы, определяющие предпочтительное использование грибами хищной стратегии питания.

Существует ряд гипотез, объясняющих хищное поведение почвенных грибов. Согласно одной из »их тела мертвых нематод обеспечивают хищные трибы углеродом и (или) азотом (Olthoí'and Estey. 1966; Thorn and Barron, 1983; Scholler and Rubtier, 1994), и эта стратегия дает им преимущество в конкуренции за субстрат с сапротрофнымн грибами. Другая гипотеза предполагает, что причиной хищничества у грибов является дефицит в среде физиологически активных веществ • витаминов или аминокислот (Hayes and Blackburn. 1966). Среди хищных грибов обнаружены ауксотр1>фы но незаменимым аминокислот) гистнднну и метионину (Zachariah and Victor. 1983). Предлагается гипотеза, объясняющая хищничество, как защитную реакцию триба от микотрофных нематод (Gray, 1987), Наконец, некоторые авторы считают, что у разных 1рибов мот существовать различные причины лля проявления хищничества (Cooke, 1968),

Одним in наиболее широко распространенных и часто встречающихся в почве хищных грибов является Anhroboirys oligospora Fres, (Den Beider, 1994), В болы™ниве работ, носвяшениых данному виду, расслгагривается его роль как регулятора численности ф i ггопаразш и чески х нематод и й связи с ним потенциальная возможность использования его. как агента биологического контроля (Мапкевич, Тепля кова. 1999). Но. поскольку A. oligospora является факультативным хищником и может обходиться без нематод, его использование для борьбы с фнтопаразитаческимн нематодами не всегда успешно {Бедокуре кая и др..

A- otigospom проявляет определенную специфичность при взаимодействии с

1973).

но

нет

Моск. са^ьспсжоз ;:i:v;fW*i¡i j ■ ьм. К. a 1

сведений о его специфичности по отношению к свободноживу шим почвенным нематодам.

Неоднозначность трактовки феномена хищничества, а также недостаток данных о жизнедеятельности хищного гриба А. о1що$рога в почве послужили предпосылкой для проводимых нами исследований. Знания в этой области необходимы для развития фундаментального направления исследований по проблеме функциональной роли межорганизменных взаимодействий, в почве, а также для разработки способов биологического, контроля вредителей растений.

Цель работы - охарактеризовать популяционную динамику, активность и стратегию развития Аг&гоЬонух оИ^озрога в почве при комбинации биотрофного (нематофагового) и сапротрофного типа питания.

Задачи;

1. Охарактеризовать рост и развитие популяции, и проявление хищных свойств по отношению к бактсриоядной нематоде С. е^апя у хищного гриба А, оИ%о$рога в стерилизованной дерново-подзолистой почве в присутствии С.

■ ек^апл в условиях с естественным содержанием доступного углерода и азота и при1 обогащении почвы (добавление остатков люцерны).

2. Охарактеризовать рост, развитие и проявление хищных свойств по отношению к С ск^ат у А. o¡igospora на твердых питательных средах, имитирующих разные условия обеспеченности углеродом, азотом и физиологически активными веществами при его развитии из конидий и мииелия.

3. Оцёнитй роулягорное действие нематоды С ?1е£ат как источника питания на минералиЗационную активность (дыхание) А. оИ^оарога в процессе разложения остатков люцерны в почве.

4. Дать количественную и качественную оценку действия А. о^озрога на естественный комплекс нематод, формирующийся в прикорневой зоне винограда и пшеницы ■"'■•■'■■

Научная новнша. Показано стимулирующее действие бактериоядной нематоды СаепогкаЬЛии е^апз на росг и конидисобразование хищного нематофагового фиба АгЖгоЬо/гух оНцпярога в почве.

Установлено, что^при взаимодействии с нематодами у А.оИ^озрог'а происходит увеличение ре продукционно! о потенциала.

На основании изучения взаимодействия А, оИ^охрога с нсматолой С, г^апз на питательных средах и в почве сделан вывод, что нематоды при их обычной численности не могут быть основным источником энергии и питательных веществ ;и1Я хищного гриба. Оки представляют скорее ресурс ростовых факторов (физиологически активных веществ), стимулирующих рост и развитие А.оЬ^озрога Л18 в почве.

Впервые проведено исследование влияния А. о1щоьрога на естественные комплексы почвенных нематод, формирующихся в ирикорпевой зоне винограда и пшеницы. Усыновлено сокращение численности нсматол, принадлежащих к разным экодого-трофическим группам, ири внесении Л. оИ^озрога.

Результаты работы позволяют сделать заключение о том, что внесенный в почву хищный нематофаговый гриб А. оН%о$рога способен выступать в качестве регулирующего фактора по отношению к биотическому сообществу.

Практическая значимость. Создана коллекция хищных почвенных грибок из 57 штаммов, выделенных из разных типов почв и субстратов. Большинство грибов было ознесено к роду АпЬгоЬоггуз.

Поддерживается в культуре почвенная бактериоядная нематода СаепогИаЬЛги.ч е/е^яги. которая может быть использована в учебном процессе. Разработана методика концентрирования спор и фрагментов мицелия, выделенных из почвы при их низком содержании. Штамм АгЛгоЬо/гуз о1щозрога А18 может быть использован для контроля численности нематод в почве.

Материалы диссертации могуг быгь использованы при планировании .мероприятий по биологическому контролю фитопаразитических нематод в естественных и искусственных агрозкосистемах.

Материалы диссертации не польз) ются в курсе лекций на кафедре биологии почв факультета почвоведения МГУ им. М,В. Ломоносова. Результаты работы позволяют оценивать перспективы и планирован, направления дальнейших исследований но проблеме межорганизменных взаимодействий в почве.

Апробация. Результаты работы были иредегаилепы на II международном нематологнческом симпозиуме (Москва. 1997), на Всероссийской научной конференции «Взаимоотношения паразита и хозяина» (Москва, 1998), на II (XII) Всероссийском совещании по почвенной зоологии (Москва, 1999), на 9

международном симпозиуме по микробной экологи (Амстердам, 2001) на заседаниях и научных семинарах кафедры биологии почв факультета почвоведения MI "У.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов экспериментов и их обсуждения, заключения, выводов, и списка упоминаемых в

тексте л итературных источников. Работа изложена на _ страницах текста,

иллюстрирована_рисунками, включает_таблиц. Список литературы состоит из

_наименований, из них___- зарубежные,

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность в.н.с. Б.А. Вызову. A.B. Хрусталеву, в.н.с, Л,М, Полянской, в.н.с. Т.Г. Добровольской, доц. JI.В. Лысак, в.11,с, O.E. Марфенииой, доц. A.B. Куракову, проф. И.Ю. Чернову за помощь в экспериментальной рабочей обсуждение результатов.

Отдельно мы выражаем благодарность проф. Н.Д. Романенко за консультирование натоящей работы в области идентификации почвенных нематод.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В обзоре литературы анализируются достижения в области изучения распространения хищных нематофатвых грибов, строения ловчих приспособлений и механизмы взаимодействия с нематодами, гипотезы, объясняющие причины перехода к хищному образу жизни, особенности роста и развития на питательных средах и в почве, специфичность по отношению к нематодам.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Почва. Использовали образны, отобранные из i-оризопта А| дерново-подзолистой лесной почвы (Московская обл., Чашниково) (содержание общего углерода 23 мг/г. общий азот 0,9 мг/г почвы, pl 1 ш - 4.6), Почну высушивали на воздухе в течение 7 дней, удаляли корни, просеивали через сито диаметром 2 мм. Затем почву раскладывали по 5 - 10 г в пластиковые флаконы, объемом 14 - 23 см^ и с терилизовали у-излучен нем (2,5 Мрад). В отдельных экспериментах почву обогащали люцерновой мукой (1%), представляющей измельченные остатки ве1Стативш>1х частей растений (C:N = 29.7).

Для опытов с растениями винограда использовали неечсрилизовант ю бурую лесную почву, для растений пшеницы - окультуренную садовую.

Хищный гриб. Хищный нематафаговый гриб Arthrobotrys oligospora Fres., был выделен из дерново-подзолистой почвы на среду Гетчинсона с целлюлозными фильтрами (Великанов и др., 1980). Культуру хищного гриба поддерживали в лаборатории на сусло-агаре с добавлением молочной кислоты (2 мл/л среды). Способность ловить и утилизировать нематод Caenorhabditis etegans была установлена при их совместном культивировании на картофельном агаре.

Нематоды. Культура бакгериоядных нематод Caenorhabditis etegans была любезно предоставлена сотрудниками центра "Биоинженерия" РАН. Нематод содержали на агаризоваккой картофельной среде, предварительно засеянной Micrococcus sp,

Бактернн. Бактерии а экспериментах служи ли пищей для нематод. В предварительных опытах определили пищевой преферендум С. elegans. Для модельного эксперимента была выбрана культура Micrococcus sp. Cohn, выделенная из городской почвы.

Растения, В вегетационных опытах использовали растения винограда сорта Ранний Магарач и пшеницу (сорт Московская -37).

Методы. Перед внесением в почву хишный гриб Á oligospora A¡8 культивировали на среде Чапека с \% дрожжевого экстракта 2,5 неделя до интенсивного конидиеобра зовд н i > я, Затем гриб счищали с поверхности агара, готовил и волную суспензию, которую отфильтровывали через тройной слой марли. В филырате преобладали конидии, обрывки мицелия встречались редко. Суспензию фильтровали под вакуумом через мембранный фильтр SYNPOR с диаметром пор 2.5 мкм. Сконцентрированные на фильтре конидии смывали в 10 мл стерильной водопроводной воды. Концент рация конидий в конечной суспензии составила З.бхКР кониднЙ/ мл. Подсчет длины мицелия и концентрации конидий проводили в световом И люминесцентном микроскопе. Почву из флакона (5 - 10 i) переносили в 90 мл воды и обрабатывали на УЗ-устанонке (1 мин, 0,4 А; 15 кГц). Суспензию отстаивали,4 мин. отбирали 10-60 мл (в зависимости от срока снятия •экспериментальной точки) надосадочноЙ жидкости, центрифугировали 2 мин при 5000 об./мин и затем концентрировали на мембранные фильтры. Осадок с фильтров смывали в 1 мл волы. Из полученного объема отбирали 90 мкл и наносили иа предметные спекла. Препараты окрашивали калькофлюором белым.

Бактерию Micrococcus sp. выращивали в жидкой среде Луриа Берграни (LB, Difco) при 13° С 2-е суток до поздней экспоненциальной фазы на качалке при 150 об,/мин. Скорость роста бактерии определяли по изменению оптической Четности суспензии при 590 нм и по численности колониеобраэующих единиц на агарнзойанной среде LB. Численность бактерий в почве определяли с помощью люминссцёй шой микроскопии, окрашивая бактериальные клегкн раствором акридина1 оранжевого. Число клеток на грамм почвы рассчитывали по формуле, аналогичной формуле ;пя расчета конидий и мицелия. Площадь поля зрения составляла 1038 мшэ (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Выделение живых нематод нз почвы производили методом воронки Вор манна (Ваелпапп, 1917) или центрифугированием в растворе сахарозы (Southey, 1986). Выделенных нематод подсчитывали под световым микроскопом. Для таксономической характеристики комплексов нелгатод использовали метод Флегга (Flegg, 1967), который позволяет выделять как живых, так и мертвых нематод. Подсчет численности нематод проводили под бинокулярной лупой. Препараты готовили по методу Сайнхорста (Seinhorst, 1962). Нематод определяли под световым ми крое ко! юн до рода по анатом о-морфологическим признакам н относили к разным трофическим группам согласно классификации Иитса (Ycates et al., 1993): 1) фитонематоды (фитопаразитические), 2) потребители гиф грибов (грибоядные). 3) потребители бактерий, одноклеточных эукариот и детрита и 4) хищники. Использовали определители; Кирьянова, Краать (1969), Элиава (1982,1984), Тейлор, Браун (Taylor, Brown, 1997). Подсчитывали долю каждой группы (в %).

У растений винограда и пшеницы измеряли длину стеблей, количество листьев и побегов, расстояние между узлами, длину и массу корневой системы (в конце эксперимента), пятнистость и морщинистость листьев.

Дыхание в почвенных микрокосмах измеряли по скорости эмиссии СО; из почвы. Для этого навеску, эквивалентную 5 г абсолютно сухой почвы, помещали и пеници л липовые флаконы, герметично закрывали И инкубировали в течение суток при 23° С. Определение количества СОг проводили на газовом хроматографе ЛХМ-80 с детектором по теплопроводности. Длина колонок 2,7 м, заполнены'' адсорбентом Полисорб-1, температура термостата 40° С, расход газа-носителя (гелий) 35 мл/мин. объем анализируемой пробы газа 0,5 см3 (Маыилов. 1999)

б

Для определения развития A.vligospora и его хищной активности в зависимости от состава субстрата использовали табор стандартных агаршнрованны\ питательных сред (Difco Laboratories) для таксономического определения дрожжей, которые отличались по содержанию основных и дополнительных 'элементов питания.

Для всех измеряемых величин производили оценку среднего и стандартного отклонения, определяли доверительные интервалы значений при уровне значимости 0,95, Сравнения пар средних проводили с использованием распределения Стьюдента для отношения разности этих средних к оценке стандарта разности (Дмитриев, 1995). Результаты опытов но изучению действия нематод на развитие A.oligospora в почве подвергали однофакторному дисперсионному анализу при помощи пакета "STATISTICА 6,0"

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Развитие и проявление хищных свойств гриба Arthrobotrys otigospora A IS в дерново - подзолистой почве в присутствии нематод Известно, что нематофаговый гриб A.oligospora регулирует численность нематод в почве как хищник (Теилякова, 1999). В экспериментах с микрокосмами мы проверяли гипотезу о возможной регуляции нематодами, как жертвами, роста и развития /t.atigospora в почве,

1.1. Развитие в нативиой почве

Результаты опытов но тучекию влияния нематоды С.elegant на развитие хищного ipn6a A otigospora А18 в стерильной почве из конидий свидетельствуют о юм. что нематоды стимулируют прирост грибного мицелия. Так, в вариантах с добавлением немаки на )ровне, соответствующем их естественной численности (1050 осЛ) продукция мицелия была в L4 - 2,4 раза выше, чем без нематод. При добавлении повышенного количества нематод (100 и 1000 ос./г почвы) наблюдали снижение продукции грибного мицелия в 1.4-1.8 раза по сравнению с контролем (Рис. t. Табл. 1), Увеличение продукции мицелия после добавления естественного количества нематод нельзя объяснить только зрофичеекнм механизмом, поскольку биомасса ж и нотных (как источника субстратов для роста) в несколько раз ниже, чем продукция биомаесы гриба (Табл. 1),

Вероятно, большое количество нематод активизирует процесс хищничества, что в свою очередь оказывает затормаживающее влияние на сапротрофный рост гриба. Последующее снижение длины мицелия в вариантах с нематодами может быть объяснено образованием ловчих структур и вылавливанием нема! од (Табл. 2)

Контроль

10 нематод/г почвы

г

к

к

5

я я Е

-Контроль 50 нематод/г почвы

Контроль

100 нематод/г почвы

12 15 18 21 24 27 30

4".

2;

О*

К -*'

к ч:

' Контроль 1000 немагод'1 почвы

0 3 <5 9 12 15 18 2! 24 27 30 с\т.

Рис. I Динамика длины мицелия АпкгоЬоПух о1щохрога, внесенною в виде конидий в стерилизованную дерново-подзолисчую почву, в присутствии нематоды СаепогЬаЬс1Ш5 е1е$ап$ и бактерии Мкгососсш ар.

Очевидно, к этом случае происходит стимуляция роста A.oligospora веществами.* содержащимися в телах нематод, высвобождающихся при их поимке грибом. При: этом прирост мицелия обеспечивается органическим веществом почвы.

Для характеристики репродуктивных свойств гриба в присутствии нематод был введен показатель удельной продукции колидий Ь. равный отношению их количества (Табл. 3) к длине мицелия (Рис. I). Во всех вариантах зксперимента показатель Ь оказался достоверно выше на 17-с сутки. (Рнс. 2). Показатель удельной продукции конидий (Ь) отражает экологическую стратегию гриба в почве.

Табл. 1 Прирост мицелии А, о\'що$рога А18 в дер ново-подзол и стой почве, не обогащенной органическим веществом, на 30-е сутки в зависимости от количества добавленных нематод СлЧерат

Bapnairr опыта Прирост мицелия, м/г ПОЧВЫ Биомасса мицелия. мкгС/г почвы Масса добавленных нематод*, мкг С

Контроль 3,3 4,8 0

L0 пематод/г 7.8 12,0 0.10

50 нематод/г 4,5 6.8 0.52

100 нематод-'г 2.4 3,6 1.04

1000 нематод/г 1,8 2.8 10,40

* - для расчета использовали среднюю сухую массу одной бактсриоядной нематоды 26 нг (40% углерода) (Griffiths. Caul. !993)

Табл. 2 Влияние хищного гриба Arthmbotrys oligospora А18 на динамику численности нематоды Caenorhabdilis ekgans при инокуляции стерильной дерново-подзолистой почвы (указана численность особей на 10 г почвы)

Вариант опыта Время после инокуляции. сутки 0 | 13 ! 17

, Численносгь живых нематод

Нематоды 100 80 ±15 5±2

Нематоды + А.окррЁрога 100 4 ± 1 0

Нематоды 500 58 ill 68 ± 14

1 (емагоды + А.оЯ^озрога 500 26 ± 5 15 ± 6

1 1сматоды 1000 714± 132 494 ± 123

Нематоды + АоИ^озрога 1000 19 ±5 13 ±4

Нематоды 5000 37 ±8 77 ± 19

Нематоды + А.оИщохрога 5000 49 ±10 8 ± 3 . г

Нематоды 10000 72 ±21 135 ± 33

Нематоды + А.оИцохрога 10000 10 ±2 2±2

Табл. 3 Динамика численности конидий (xtO2) гриба Arthrobotrys uligospora Л18 в микрокосмах с дерново-подзолистой почвой в зависимости от количества внесенных нематод Caenorhabditis elegam

Сутки Контроль-гриб без нематод 10 нематод 50 нематод 100 нематод 500 нематод 1000 нематод

3 36 ±5 27 ±11 60 ± 7 10±0 0* 0*

6 13 ±5 7 ± 5 7 ± 4 0 0 13 ± 9

10 34 ± 13 13 ±6» 15 ±7 7 ± 0.05" 6 ±0,05* 7 ±4*

14 13 ±9 7 ± 4 6 ± 4 0 0 0

п 55 ±0,21 380 ±28» 13 ± 12 50 i 10 30 i 10 76 ±88

* - Значения достоверно (Р < 0.05) отличаются от контроля.

45 -30 -15 -

0 t о ,

45 30 15 0 0

45 30 15 0 -

45, 30 15' О

-контроль

•10 нематод/г почвы

20 25 . 30 —■— контроль

'100 иематод/r почвы

20 25 ,,.;30

■ 509 иематод/г почвы «—контроль.

—•— контроль

-1000 нематод/г почвы

Рис. 1 Удельная продукция конидий Arthrobotrys oligospora в дерново-подзолистой почве в присутствии нематоды Caenorhabditis tlegans.

Чем больше эта величина, тем выше репродукционный потенциал вида, и стратегия фиба направлена скорее на выживание популяции, чем на активное освоение среды.

При появлении нематод стратегия хишного гриба направлена на процессы их поимки, умерщвления, проникновения в тело и использование физиологически активных веществ, содержащихся в нематодах, которых нет или мало в почве. Возможно, что на стадии конндиогенеза необходимость в физиологически активных веществах возрастает. Таким образом, хищничество может ускорять завершение жизненного цикла у ЛпЬгоЬоТгух оИ^мрога.

1.2. Развитие в почве, обогащенной органическим веществом

В вариантах с внесением нематод длина мицелия в почве имела более низкие значения, чем в контроле (Рнс. 3). Это выражается в снижении прироста мицелия в вариантах с добавлением нематод в 2-3 раза (Рис. 4). Величина удельной продукции конидий, напротив, была выше в присутствии нематод, причем тем больше, чем больше нематод было внесено (Рнс. 5). Таким образом, при отсутствии лимитирования по доступному субстрату (остатки люцерны) нематоды затормаживают процесс освоения окружающего пространства мицелием Лг1Ь-оЬ<мп $ оГ^ачрога.

Итак, хищный гриб Л. оИ§,о$рот проянляет свойства хишника по отношению к бактериоидной нематоде С,е1е^апз как в нативной дерново - подзолистой почве, так и в почве, обогащенной органическими остатками, содержащими много азота (С;Ы « 29,7). Результатом взаимодействия с нематодами может быть как повышенный рост мицелия в начальный период развития при уровне численности нематод, близкой к естественной в нативной почве, так и пониженный - в почве, обогащенный растительными остатками. Вероятно, при недостатке питательных элементов в почве, нематоды повышают конкурентоспособность А. оИ$озрога, стимулируя его рост. Во всех случаях нематоды вызывают повышение величины удельной продукции конидий за счет снижения продукции мицелия. Скорее всею, нематоды служат для хишного гриба дополнительным источником веществ (физиологически - активных), которые увеличивают его репродукционный потенциал в почве.

недели

Рнс. 3 Динамика длины мицелия Arthrobodys oligospora. внесенного в виде конидий в стерилизованную дерново-подзолистую почву, обогащенную мукой люцерны, в присутствии нематоды С'acnorhabditis etegans и бактерии Micrococcus sp. (rr=3)-

Коичроль 10 нематод 1СЮО нематод

Рис. 4 Прирост мицелия А. оИ^оярога в дерново-]шдзолистой почве, обогащенной органическим веществом, на 13-уто неделю в зависимости от количества добавленных нематод С.е^ат.

недели

Рис. 5 Удельная продукция конидий Arihrohotrys o/igospora А18 в дерново-подзолистой почве, обогащенной остатками люцерны, в присутствии нематоды Caenorhabditis elegans.

2. Влияние состава питательной среды на развитие и хищную активность Arthrobotrys ofigospora А18. В экспериментах проверяли являются ли нематоды основным или дополнительным источником питания для A.oligoípora. Для этого проводили имитацию различных условий обеспеченности питанием (равные питательные среды)■ Обнаружено, что развитие гриба и его хищная активность при инокуляции сред мицелием н конидиями имели отличный характер (Рис. 6, Рис. 7, Табл. 4,Табл. 5). Так. при инокуляции конидиями гриб быстрее рос на бедных и несбалансированных по питательным элементам средах, таких как голодный агар и на среде, лимитированной по азоту. Более медленный рост наблюдали на среде, лимитированной по углероду и на среде с углеродно-азотной основой (Рис. 6). Плотность колонии была меньше на бедных средах.

УСВ

Рис. 6 Рост Аг>)1гоЬо{гу$ оИ§озрога на среде, лимитированной по углероду - УЫВ (азотная основа с аминокислотами и витаминами): на среде, лимитированной но азоту - УСВ (углеродная основа с аминокислотами и витаминами); на полноценной среде -УСЫВ (углеродно-азотная основа с аминокислотами и витаминами) и на среде, лимитированной по углероду, азоту, аминокислотам и витаминам - голодный агар. Гриб циркулировали конидиями (п=10).

-голодный агар

О т.............1_I__I---„—I

О 4 8 12 16 20

сут.

Рнс. 7 Рост АгЖгоЬоиуз oíigospora на среде, лимитированной по углероду - ¥N8 (азотная основа с аминокислотами и витаминами); на среде, лимитированной по азоту

- УСВ (углеродная основа с аминокислотами и витаминами); на полноценных средах

- УСНВ и УМА (углерошю-азотная основа с аминокислотами и вигамннами. дрожжевой морфологический агар) и на срелс, лимитированной по углероду, азоту, аминокислотам и витаминам - голодный агар. Гриб инокулировали мицелием (п=Ю),

При инокуляции мицелием .. но аналогичном наборе сред. наблюдали противоположный эффект: более быстрый рост отмечали на богатых средах, таких как дрожжевой морфологический агар и углеродно - азотная основа. На бедных средах (голодный а)ар) и несбалансированных (углеродная и азотная основы) рост колоний шел медленнее (Рнс. 7).

Проявление хищной активности на: тгтательных средах положительно коррелировало с развитием мицелия. При развитии из коиидий хищная активность наблюдалась на голодном агаре и среде с углеродной основой, а также на среде Чапека (Табл. 4), а при развитии из мицелия - на среде с углеродно- азотной основой и морфологическом агаре (Табл. 5).

Табл. 4 Влияние состава среды на хищную активность A. otigospora А18 при развитии из конидий

Кол-во пойманных нематод (па 100 мм1) Кол-во ловчих органов • • (на 100 мм )

Среда Живые Мертвые \ Кольца Сети

1 день после добавления нематод

Голодный агар 53 ± б 43 ±2 122 ±3 0

YCB YNB 0 0 0 0

0 0 0 0

YCNB 0 0 0 0

Среда Чапека 0 0 0 0

2 дня после прибавления нематод :

Голодный агар 3 ± 5 14 ±27 16*31 1351 ±181

YCB 2 i 4 13 ± 21 0 17 ±33

YNB 0 0 0 0

YCNB 0 0 0 0

Среда Чапека 0 0 0 0

3 дня после прибавления нематод

Голодный агар 0 83 ± 23 | 41±11 1400 ±235

YCB 47 ±7 94 ± 15 35 ±49 174 ±47

YNB 0 0 0 0

YCNB 0 0 0 0

Среда Чапека 3 ± б 14 -± 17 | 19± 3 7 ± 13

УС В - декстроза, набор витаминов и аминокислот (Г-гистидии, ОЬ-метионин. триптофан). макро- и микроэлементы;

тав - сернокислый аммоний, набор витаминов и аминокислот, макро- и микроэлементы;

УСЙВ - декстроза, сернокислый аммоний, набор витаминов и аминокислот, макро- и микроэлементы;

Очевидно, что хищная активность может быть связана с недостатком каких-то специфических,-' соединений, которые отсутствуют в средах. Хищничество усиливается при наличии в среде легкодоступных углеводов и проявляется при достижении определённой биомассы.

Полученные результаты противоречат гипотезе, согласно которой, нематоды являются основным источником азота и углерода для гриба, поскольку на среде, содержащей и азот, и углерод, А.о1щозрога образовывал ловчие приспособления и улавливал нематод (Табл, 5).

■ ■<■■.■,. »i. -

Табл. 5 Влияние состава среды па хищную активность A. oligospora Al К при его развитии из мицелия

Среда Кол-во пойманных нематод (на 100 мм1) Кол-во ловчих органов (на 100 мм*)

Живые | Мертвые Кольца 1 Сети

1 день после добавления нематод

Голодный агар 0 0 0 0

YCB 0 0 0 0

YNB 0 0 0 0

YCNB 7*3 293 ± 55 23 ± 40 613 ± 254

УМА 18 ± 4 228 ± 145 0 3082 ± 277

2 дня после добавления нематод

Голодный агар 0 0 0 0

YCB 0 0 0 0

YNB 0 0 0 0

YCNB 2 ± 3 157 ±53 0 1737 ±435

л;ма 15 ±7 153 ±8 0 5025 ± 296

4 дня после добавления нематод

Голодный агар 0 0 0 0

YCB 0 0 0 0

YNB 0 0 0 0

YCNB 0 7 ± 3 0 1зоо ±463 :

YMA 18 ± 45 13 ±3 0 4465 ± 205

УС В - декстроза, набор витаминов и аминокислот (Ыистидин, Ш.-метнопин, 01-Трнгггофан), макро- и микроэлементы;

ТОВ - сернокислый аммоний, набор витаминов и аминокислот, макро- и микроэлементы;

УСИВ - декстроза, сернокислый аммоний, набор витаминов и аминокислот, макро- и микроэлементы;

УМА - декстроза, сернокислый аммоний, аспарагин, набор витаминов и аминокислот, макро- и микроэлементы;

3. Минералиюционная активность Arihrohotrys o/ilgospora А18 в почве,

обогащенной люцерновой мукой В присутствии нематод скорость дыхания была на 15 - 25% ниже на 12 сутки после инокуляции почвы конидиями A.oligospora и бактерией Micrococcus sp. во всем интервале численности внесенных нематод (ОТ 50 jio 300 осУ5 г)

—■—Контроль - 300 нематод

я г

S

О

V и £

Рис. 8 Динамика эмиссии ССЬ после инокуляции стерилизованной дерново -подзолистой почвы, обогащенной люцерновой мукой, конидиями A.oligospora,А1В и бактерией Micrococcus sp. в присутствии нематоды С. clegans

Со снижением интенсивности дыхания (Рис. 8) совпадает резкое падение численности живых нематод в почве на 13-е сутки (Табл. 2), а также образование конидий на поверхности почвы. Снижение интенсивности дыхания, по-видимому,

связано с активизацией хищной стадии у гриба A. oíigospora и переключением его на питание нематодами. Это означает, что при взаимодействии с нематодами гриб становится менее активен как минерализатор мертвого органического вещества. Снижение активности минерализации углерода в присутствии нематод совпадает с более низким приростом мицелия (Рис. 3). Таким образом, нематоды контролируют сапротрофную активность A.oíigospora.

4. Влияние Arthrobotrys oíigospora Л18 на комплекс почвенных нематод

Внесение Л. oíigospora в почву оказало влияние' на-морфологические и физиологические показатели растений. Так. число побегов у винограда в варианте с A.oíigospora было достоверно больше, чем в контроле. Высота растения была достоверно выше па 5-ю неделю, а длина корневой системы - в кокке эксперимента превышала контрольную (Табл. 6). Общее состояние корневой системы в контроле было хуже, чем в варианте с 1рибом: отмечали небольшое количество придаточных корней, некрозы и клювовидные вздутия - типичные признаки поражена ости фигоиаразигическими нематодами.

В опыте с пшеницей не было обнаружено достоверных отличий в морфологических показателях растений.

Табл. 6 Влияние хищного немато фагового гриба Arthrobotrys oíigospora, внесенного в виде конидий (10й конидий/г почвы) на рост и развитие растений винограда.

Варна! гт Высота растений, см Количество побегов, шт. Длина корневой системы, см

5 недель после начала эксперимента

Контроль 21 ±2 1 н/о

A.oíigospora 51 ± 13* 3* н/о

16 недель после начала эксперимента

Контроль 63 i 13 1 9± 1

A.oíigospora 68 ± 14 3* 14 ± 1*

* .-.Значения достоверно (Р < 0,05) обличаются от контроля, н/о - не определяли

К! '5-6-й неделям численность нематод в почве, обработанной А о^ояроги* под виноградом и пшеницей была ниже, чем в контроле'без обработки (Рнс. 9), Через 2 месяца численность нематод в опытных вариантах наоборот была выше, чем в контроле. Это увеличение численности можно объяснить как компенсаторный эффект после резкого снижения популянионной плотности нематод ниже естественного, уровня.

Всего из прикорневой зоны винограда было выделено 40 родов нематод, образующих естественный комплекс. Из них 6 родов фитопаразитических нематод (Яо1у1епсЬш, НеИсо1у1епс!>1л, Ту1епскогупсНш, СгкопеюоШез, Рга1уЫпски.ч, • Х^р/ипета), 24 рода бакгериоядных и сапробионтных (МезЫогуШтш, А$то<к>гт, ■■■ ОогуЫтш, Dorylaimoid.es, Еш!ог)>!ати&, АрогсеЫтш, Рго4огуЫтш, Епскоёека, ШрЫегйркога. IаЬгопета, Quadsшnema, АШтия, СЬготаЛоп'Ла), 4 рода хищные нематод (Му!опски1т, \iononchus, Т^гопскш, ВгаскопскиЫз) и 6 родов 1рибоядных {Ме1арке1епс1ш5, РагарЬс1ег>с1ш1, Ту1епсНи$, РИепсИш, Арке!еис)гш, Земига).

Первый срок взятая образцов из прикорневой зоны винограда показал резкие отличия количества фитопаразитических и хищных нематод в контроле, и в варианте с грибом (Рис, 10). Внесение А. оН%о$рога снизило количество фитопаразитических нематод в 5 раз но сравнению с контролем. Хищные нематоды составляли П% в варианте с грибом и отсутствовали в контроле. Численность бакгериоядных и сапробионтных нематод достоверно не отличалась во все сроки анализа в варианте с А, оН^озрога и в контроле. Различия ио ]рибоядным нематодам в этот срок также не были обнаружены. Во второй срок численность фитопаразитических нематод в варианте с грибом была в 2 раза меньше, чем в контроле. Численность |рибоядных нематод в варианте с грибом превышала в 2 раза контрольную. Значительной разницы не наблюдали для хищных и бакгериоядных нематод. К конку эксперимента (13 неделя) доля хищных нематод в варианте с грибом уменьшилась до 28% по сравнению с контролем (40%); доля фибоядмых в вариате с грибом также превышала контрольную, как и на второй срок. Процентное отношение бактериоядных и сапробионтных нематод относительно других групп нематод снизилось по сравнению с предыдущими сроками отбора, но различия между вариантом с грибом и контролем были незначительными.

Таким образом, зафиксировано достоверное влияние А. aligospora на фитопаразитических, хищных и фнбоядиых нематод в прикорневой зоне винограда, которое к концу эксперимента ослабевало.

Из прикорневой зоны пшеницы было выделено 49 родов нематод. Из них 8 родов фитопаразитнческих {Aphelenchoides, Hclicotylenchus, Paratrichodorus, Paratyhnchwi, Pratvlenchus, Trichodorus. Trophurm, Tylenchonmchus) 33 рода бактериоялных и сапробиоптов (Acrobeles, Acrobeioides, Aglenchus, Alaimus, Anaplectus, Anatonchus, AporcetaimuSf ■ Cephalobus, Cervtdelliis, Chihplacus, Chromadorida. Diplogaster, Dorylaimoidts, Doryiaimm, Enchodelus, Eucephalobus, Eudorylaimus, Kohinema, Labronema, Mesodotylaimus, Mesarhabditis, Monchystera, Myionchulus, Onchultis, Panagrolaimus, Plecrus, Prodorylaimus, Protorhabdim, Tripila. Quadsiamma, Rhabdiiis, Trischistoma, Wilsonema) 3 рода хищных нематод (Brachonchidiis, Mononchits. Tigronchus) а 5 родов грибоядных (Aglenchus, Aphetenchus, Metaphelenchus, Paraphe lenchux, Tylench usj.

Влияние Aoligospora на комазекс нематод прикорневой зоны пшеницы было незначительным. Достоверное отличие на уровне эколого-трофических групп было обнаружено только в конце эксперимента (18 неделя) для грибоядных нематод, В этот период их численность в варианге е грибом достоверно превышала численность в контроле (Рне. 11),

Значительное увеличение грибоядных нематод при внесении хищного гриба как в нематокомплексе винограда, так и в нематокоплексе пшенины, позволяет предположить, что Л. oiigospora развиваясь В почве, стимулирует размножение грибоядных нематод.

400

А

Рис. 9 Влияние Аг1ИгоЬа!гуз о1^о$рога Л18 на обшую численность нематод к прикорневой зоне вино!рада (А) и пшеницы (Б) (п=3).

Различная реакция комплекса нематод прикорневой зоны винограда и пшеницы на действие А. оИ^охрога - что свидетельство в пользу специфичности иематофагового эффекта хищных грибов и может быть связана с разным исходным составом родов (видов) внутри юго-трофических групп нематод. Так, среди фитопаразитических нематод под виноградом и пшеницей общими были только 3 из 8 родов, а в группе грнбоядных - 4 из 6 родов. Различная реакция комплекса может быть также следствием разной эффективности действия иематофагового гриба в почве, зависимой от уровни его внесения.

контроль

23.3

21,6

4

9.4

A, oügospora

21 5

неделя

20.3* 9 неделя

21.3

13 неделя

|фнтонематоды Q Баюериоядные и сапробнонты | Хншные| Грибожаные

Рне, 10 Влияние Arthrobotrys oligospora А18 на соотношение эксдого-трофнчсских групп нематод в прикорневой зоне винограда (%). * - значения достоверно (n~3. Р < 0.05) отличаются от контроля.

Также наибольшая подверженность фнтопаразитич ески х нематод действию А.о1^о$рога может быть связана с более длиггельиым циклом развития этой 1рупны по сравнению с другими группами нематод, меньшей подвижностью и присутствием фазы, связанной с обитанием в тканях растения хозяина или в прикрепленном состоянии. Все эти свойства мо1ут обусловливать более медленное восстановление фитопаразигов в естественных комплексах нематод.

контроль

60.<5

О

74.7 -^

3.2 8.6

A. oligospora ' .23

12.6

3 неделя

22.4 ] 1 неделя

21 неделя

^Фитонематоды [] Бактериоядные и сапробкоиты | Хищны Грибоядные

Ряс. 11 Влияние Arthrobotrys oligospora А18 на соотношение зколого-трофических групп немагод в прикорневой зоне пшеницы {%). * - значения достоверно (n=3. Р < 0.05) отличаются от контроля.

ВЫВОДЫ:

1. Нематоды даже при низкой плотности (!0 особей/ г) спекулируют рост и развитие хищного гриба АгЖгоЬоггуз о^озрога А18 из конидий в нативиоЙ дерново-подзолистой почве. При этом развитие хищного гриба в почве сопровождается нематофаговым эффектом. При отсутствии^! имитирован и я по

А:' -

основным питательным элементам нематоды ограничиваю1^рост А.о1щозрога А18 в почве.

2. Нематоды стимулируют репродукционный процесс у А. oligospora

3. При взаимодействии с нематодам^снижается минерализационная активность А. оИ%о$рога при разложении растительных остатков,

4. При естественной плотности нематоды не могут быть основным источником энергии для хищного гриба А, оИ^озрога, Они представляю1]' скорее ресурс ростовых факторов (физиологически активных веществ), стимулирующих рост и развитие гриба в иочве,

5. Под действием хищного гриба А.оИ%о$рога снижается общая численность нематод в прикорневой зоне пшеницы и винограда в 1,5 - 2 раза. Эффект сохраняется в течение 2-х месяцев

6. Хищный гриб А. о1<%о$рога влияет на изменение структуры комплекса нематод на уровне э кол ого-трофических групп. Наибольшему влиянию подвергаются фитопаразитарные формы нематод. Внесение хищного гриба в почву вызывает стимуляцию развития грибоядных нематод.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

!. Migunova V.D.. I'oLyanskaya Г.М., Byzov В.A, A reeding strategies of the nematophagous fungus Arlhroboihrys otigospora in soddy-podzolic soil, Russian Journal ofNematology, 1998. Vol. 6. №L pp. 67-68.

2. Романеи ко П.Д.. Карапетян Д. А., Мигу нова В.Д, Изучение пематицпдноп активности хищного гриба Arihroboirys otigospora па тест-растепиях-хозяевах винофада. "Взаимоотношения паразита м хозяина" всероссийская научная конференция; тезисы докладов. Москва, 8-10 декабря, 1998. Москва. 1998, с, 52.

3. Мигу нова В.Д.. Вызов Б.А,. Полянская Л.М., Звягинцев Д,Г. Трофические стратегии хищного гриба Anhroboirys oligospora в почве. Проблемы почвенной зоологии. Материалы II (XII) всероссийского совещания по почвенной зоологии; тезисы докладов. Под ред. Б.Р. Стригановой, Москва, 1999, Изд-во КМК. 1999, с. 197,

4. Migunova V.D., Byzov В .A. Selection of' trophic strategy by predacious fungi, "Interaction in the microbial world": abstracts of 9th international symposium on microbial ecology. Amsterdam. 26-31 August, 2001. The Netherlands, Amsterdam, 2001. p. 262,

5. Мигунова В.Д.. Вызов К.А.. Полянская Л.М., Звлшнцев Д.Г, Развитие хищного нематофагового гриба Arthrobotrys otigospora в дерново-подзолистой почве. Вестник Московского Университета, серия 17. Почвоведение, 2002, № 3. с. 44 -47.

Отпечатано в отделе оперативкой печати Геологического ф-та МГУ Тираж 18 С экз. Заказ № 7<3