Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Безопасность и противоопухолевая активность кандидатного терапевтического препарата "Канцеролизин", созданного на основе делеционного аденовируса человека 5-го типа

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Безопасность и противоопухолевая активность кандидатного терапевтического препарата "Канцеролизин", созданного на основе делеционного аденовируса человека 5-го типа"

005055559

На правах рукописи

ВДОВИЧЕНКО Галина Владимировна

БЕЗОПАСНОСТЬ И ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ КАНДИДАТНОГО ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА «КАНЦЕРОЛИЗИН», СОЗДАННОГО НА ОСНОВЕ ДЕЛЕЦИОННОГО АДЕНОВИРУСА ЧЕЛОВЕКА 5-ГО ТИПА

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 НОЯ 2012

КОЛЫДОВО - 2012

005055559

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Научные руководители:

Сергеев Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор Святченко Виктор Александрович, кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

Коровкин Сергей Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН», ведущий научный сотрудник Рыжиков Александр Борисович

кандидат биологических наук, ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», зав. отделом изучения вакцин и противовирусных препаратов, старший научный сотрудник

Ведущая организация

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится «14» декабря 2012 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, 630599; тел: (383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан «9» ноября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета ,

доктор биологических наук, профессор ' ¿у Трошкова Галина Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблема заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований - одна из основных в современной медицине. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, ежегодно в мире умирает от рака более 7 млн. человек [СМИ ВОЗ, 2012]. Онкологические заболевания имеют полиэтиологичное происхождение. Причинами могут быть канцерогенные вещества, вирусы, производственные процессы, ультрафиолетовое и ионизирующее излучение, радон и др. [Трапезников H. Н., Аксель Е. М., 1996; Белицкий Г.А., 2006]. Канцерогенез представляет многоэтапный процесс накопления различных генетических повреждений, возникающих под действием мутагенных факторов. Клеточный ген супрессор р53 (tumor supressor gene) кодирует специфический транскрипционный фактор, функция которого заключается в поддержании целостности генома путем предотвращения накопления в организме аномальных клеток [Чумаков П.М., 2007; Вардосанидзе К.В., 2010; Levine A.J., 1997; Zauberman A. et al., 1995; Waterman J.L. et al., 1995]. Наиболее типичными для злокачественных новообразований человека являются соматические мутации в гене р53. Они обнаружены в ДНК более 50% всех раковых опухолей человека различной локализации [Киселев C.JL, 2003; Nemunaitis J. et al., 2010; Lubin R. et al.,1995; Chang F. et al., 1995; Prives С., 1994]. Опухоли, в которых экспрессируется мутантный белок р53, более агрессивны, труднее поддаются лечению, чем те, в которых полностью отсутствует эндогенный р53 [Levine A.J., 1997; Harris С.С., 1996].

Тот факт, что мутации в гене р53 являются наиболее частыми генетическими повреждениями опухолевых клеток человека, обусловил проведение широких исследований, направленных на поиск эффективных подходов к терапии этого рода опухолей. Активация гена р53 происходит и в случае заражения клеток вирусами. Однако ряд ДНК-содержащих вирусов, таких как аденовирусы, SV40 и вирус папилломы человека, кодируют белки, которые инактивируют ген р53 и тем самым позволяют эффективно реплицироваться им в клетке [Хансон К.П., Имянитов Е.Н., 2002].

Геном аденовирусов содержит ген Е1В, который кодирует белок Е1В55К, способный связываться с р53 и его инактивировать. Именно это

3

уникальная особенность репликации аденовирусов стала основой для создания принципиально новых противоопухолевых препаратов. Дефектные по гену белка Е1В55К аденовирусные варианты должны потерять способность к эффективному инфицированию и лизису нормальных р53 функциональных клеток, но в тоже время, сохранить репликативную и литическую активность дикого типа аденовируса в отношении опухолевых клеток с дефектами в р53 гене [Nemunaitis J. et al., 2000; Heise С. et al., 1997; Bischoff J.R. et al., 1996]. Таким образом, создание лечебных препаратов на основе мутантных аденовирусов, избирательно размножающихся в р53-дефицитных клетках, позволит успешно лечить ряд опухолевых заболеваний, связанных с дефектами в р53 гене.

Путем проведения сайт-направленного мутагенеза аденовируса 5-го серотипа в ГНЦ ВБ «Вектор» был получен штамм, который несет делецию фрагмента 2309 - 3427 п.о. гена Е1В55К и избирательно размножается в р53-дефицитных раковых клетках, вызывая их разрушение. По предложению авторов этот мутантный штамм аденовируса получил название Adel2 [Качко A.B. и др., 2003]. Данный мутантный штамм аденовируса использован нами для создания лечебного противоопухолевого препарата «Канцеролизин». В связи с этим в данной работе были поставлены следующая цель и задачи исследования.

Цель исследования. Целью настоящих исследований явилась разработка и доклиническое изучение кандидатного аденовирусного противоопухолевого препарата "Канцеролизин".

Задачи исследования:

1. Изучить возможность использования культуры клеток 293 для производства препарата «Канцеролизин» согласно требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим препаратам.

2. В соответствии с проектом ЭПР получить экспериментально-производственные серии препарата «Канцеролизин».

3. Изучить подлинность и стабильность мутантного штамма Adel2 аденовируса, входящего в состав препарата «Канцеролизин».

4. Изучить инфекционную активность препарата «Канцеролизин» как в опухолевых, так и в нормальных клетках человека in vitro.

5. Исследовать эффективность и безопасность кандидатного аденовирусного противоопухолевого препарата "Канцеролизин" в экспериментах на животных.

6. Установить возможные сроки хранения и условия транспортировки препарата «Канцеролизин».

Научная новизна работы. Впервые проведена аттестация культуры клеток 293, которая не является туморогенной, обладает высокой чувствительностью к мутантному штамму Adel2 аденовируса 5-го серотипа, позволяет нарабатывать вирусную биомассу штамма до высоких концентраций при низкой множественности заражения и разрешена для производства лечебного противоопухолевого вирусного живого культурального очищенного концентрированного жидкого препарата «Канцеролизин» на основе данного штамма аденовируса.

Мутантный штамм Adel2 аденовируса 5-го серотипа, входящий в состав препарата «Канцеролизин» исследован в процессе многократного пассирования (18 пассажей) на культуре клеток 293. Данный штамм сохраняет свою генетическую стабильность и способность селективно инфицировать и лизировать культуры р53-дефектных опухолевых клеток человека.

Получены три лабораторно-экспериментальные серии препарата «Канцеролизин».

Препарат «Канцеролизин» не обладает пирогенностью, токсичностью, не влияет на центральную нервную систему и иммунологически безопасен.

При исследовании специфической активности лабораторно-экспериментальных серий противоопухолевого препарата «Канцеролизин» показана его избирательная инфекционная активность в отношении р53-дефектных опухолевых клеток человека in vitro, а на модели иммунодефицитных мышей с привитыми опухолями эпидермоидной аденокарциномы человека (А431) показана его способность достоверно ингибировать прогрессию опухолей при интратуморальном введении.

Препарат «Канцеролизин» сохраняет свою специфическую активность в процессе его хранения в течение двух лет при температуре минус 70 °С, в то же время транспортировка препарата с сохранением его специфической активности в течение 5 суток возможна при температуре минус 10-13 °С.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований отработана технология производства кандидатного противоопухолевого препарата «Канцеролизин», подготовлен проект производственного регламента. Для контроля качества производимого препарата разработан проект фармакопейной статьи предприятия. С целью обеспечения безопасности производимого препарата аттестованы посевной и рабочий банки культуры клеток 293, используемой в качестве биосубстрата для получения препарата «Канцеролизин» [протокол №14 от 28.10.03. заседания Ученого Совета ГИСК им. JI.A. Тарасевича; протокол №9 от 20.11.03. Комитета МИБП]. Таким образом, созданы все необходимые условия для производства стандартизованных, качественных и безвредных серий препарата «Канцеролизин», которые в дальнейшем могут быть использованы в клинических исследованиях у онкологических больных. Результаты работы позволили успешно пройти 1-ю фазу клинических испытаний и получить разрешение на проведение 2-ой фазы клинических испытаний, что делает возможным последующее внедрение данного препарата в медицинскую практику.

Положения, выносимые на защиту:

1. Культура клеток 293 не является туморогенной, обладает высокой чувствительностью к мутантному штамму Adel2 аденовируса 5-го серотипа и позволяет нарабатывать вирусную биомассу до высоких концентраций при низкой множественности заражения.

2. Препарат «Канцеролизин» не обладает пирогенностью, токсичностью (острой и хронической), не влияет на центральную нервную систему и иммунологически безопасен.

3. Препарат «Канцеролизин» обладает избирательной инфекционной активностью в отношении р53-дефектных опухолевых клеток человека in vitro, а на модели иммунодефицитных мышей с привитыми опухолями человека достоверно ингибирует прогрессию опухолей при интратуморальном введении.

Апробация материалов диссертации. Результаты основных разделов диссертации были представлены на отечественных и зарубежных конференциях: 2-ой Международной конференции «Наука - Бизнес -Образование Биотехнология - биомедицина - Окружающая среда» (Россия,

Пущино, 10—13 мая 2005 г.); 1-ой Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» (Россия, г. Санкт-Петербург, 29-31 мая 2005 г.); XIII International Congress of Virology, San Francisco, California, USA, July 23-28, 2005.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научных статьи, из них 2 — в журнале Биотехнология, 1 - в журнале Вопросы вирусологии и 1 - в журнале Антибиотики и химиотерапия.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах, содержит 11 рисунков, 20 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 38 отечественных и 180 зарубежных источников.

Вклад автора в диссертационную работу. Материал диссертации получен и проанализирован лично автором с помощью научных руководителей д.м.н. профессора Сергеева А.Н. и к.б.н. Святченко В.А., а также зав.отделом к.б.н. Шищкиной JI.H. Постановку ПЦР и анализ полученных данных проводил автор совместно с к.б.н. Терновым В.А. Статистическая обработка данных произведена при участии к.м.н. Сергеева A.A. Наработка, ультрацентрифугирование в градиенте плотности CsCl, диализ, фильтрация и разведение трех экспериментально-производственных серий препарата, а также оценка его показателей качества проведена автором работы при участии к.б.н. Плясунова И.В. и к.б.н. Богрянцевой М.П. Световая микроскопия препаратов проведена при помощи и непосредственном участии профессора Рябчиковой Е.И. и н.с. Таранова О.С. Вирусологические исследования проведены лично автором с помощью н.с. Петрищенко В.А. и ст.лаборантов Прудниковой Н.В., Коптевой Е.А.

Всем перечисленным сотрудникам автор выражает огромную благодарность.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирус. В работе использовали штамм Adenoid 75 аденовируса человека 5-го серотипа, полученный из Алабамского университета (г. Бирмингем, США) в 1996 году и его мутантный вариант Adel2, сконструированный в ГНЦ ВБ «Вектор» путем сайт-направленного мутагенеза, обладающий

селективной онколитической активностью в отношении ряда линий р53-дефектных опухолевых клеток человека.

Препарат. Приготовление серий кандидатного противоопухолевого препарата «Канцеролизин» на основе мутантного штамма Adel2 аденовируса осуществляли путем его культивирования на перевиваемой культуре клеток 293 с последующим концентрированием и очисткой согласно ранее разработанному проекту экспериментально-производственного регламента на препарат. Одна доза препарата содержала 9,5±0,5 lgTIXQso мутантного штамма Adel2 аденовируса.

Клетки. В работе использовали перевиваемые культуры клеток 293 (клетки почки эмбриона человека, трансформированные генами Е1В и El А аденовируса 5-го серотипа), р53-дефектные опухолевые клетки (А431 -эпидермоидная карцинома человека, SW480 - аденокарцинома толстой кишки человека, Нер2 - эпидермоидная карцинома гортани человека и СЗЗА - цервикальная аденокарцинома человека) [American Type Culture Collection, 1998], полученные из Алабамского университета (г. Бирмингем, США). Эти культуры клеток были наработаны и заморожены на 5-м пассаже после поступления. Кроме того, в работе использовали нормальные (р53-позитивные) первичные культуры клеток взрослого человека (фибробласты кожи), приготовленные в НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор» согласно ранее описанной методике [Rheinwald J., 1975].

Животные. В качестве лабораторных животных использовали разнополых морских свинок (массой 200 - 230 г), кроликов породы «Шиншилла» (массой 1,5 - 2,0 кг), крыс линии Low (массой 200-250 г), мышей линии BALB/c и BALB/c nude (массой 15 - 17 г) и беспородных мышей (массой 15 - 17 г). Животные содержались на стандартном рационе, с достаточным количеством воды. Животные не имели экзогенной патологической микрофлоры. Все манипуляции с животными при проведении эксперимента проводили с применением седативных средств в соответствии с ветеринарным законодательством.

Исследование инфекционности вирусов. Титрование инфекционности аденовирусного штамма Adenoid 75 и его мутантного варианта Adel2 в составе препарата «Канцеролизин» проводили на культурах клеток 293, SW480, А431, Нер2 и СЗЗА, а также на первичной культуре фибробластов

кожи человека микрометодом на 96-луночных культуральных планшетах (Costar, США); инфекционный титр вируса выражали в ТЦД50/мл (50%-я тканевая цитопатогенная доза/мл).

Доклиническое изучение препарата. Целью доклинических исследований, в соответствии с ФЗ «О лекарственных средствах» №86-ФЗ от 22.06.1998 г., ст. 36 является получение научными методами оценок и доказательств эффективности и безопасности препарата. Препарат «Канцеролизин» исследовали в соответствии с требованиями РД 42-28-10-90 и СП 3.3.2.561-96, изучая его специфическую активность, токсичность, специфическую безопасность, аллергизирующее действие и влияние на иммунную систему. Работу выполняли в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации», утвержденными приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003.

Статистическая обработка результатов. Оценивали М - среднее, SM — ошибку среднего и доверительный интервал (195) для 95%-й вероятности общепринятыми методами [Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962].

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Исследование перевиваемой культуры клеток 293 как субстрата для производства кандидатного противоопухолевого препарата «Канцеролизин»

Культура клеток 293 представляет собой наиболее оптимальный субстрат для культивирования мутантного штамма аденовируса Adel2, так как существующая трансформация генома клеток этой культуры генами El А и Е1В аденовируса обеспечивает оптимальные условия для полноценной репликации мутантного штамма с высокой урожайностью.

С целью получения экспериментально-производственных серий препарата «Канцеролизин» были созданы рабочий и посевной банки культуры клеток 293 и проведены исследования кариотипа, возможной микробиологической контаминации и онкогенных потенций данной культуры клеток [Вдовиченко Г.В. и др., 2006; Колокольцова Т.Д., 2008]. На основании полученных результатов ФГУН ГИСК им. JI.A. Тарасевича аттестовал посевной и рабочий банки перевиваемой культуры клеток 293, планируемые для использования в производстве аденовирусного препарата, предназначенного для лечения онкологических больных.

Одним из важнейших свойств культуры клеток, используемой в качестве субстрата для производства вирусных медицинских препаратов, является ее высокая вируспродуктивная способность. В связи с этим были изучены вируспродуктивные свойства культуры клеток 293 (табл. 1).

Таблица 1. Оценка урожая штамма аденовируса Ас1е12 при инфицировании культуры клеток 293 разными дозами вируса _

Доза заражения культуры клеток (ТЦД50 на клетку) Время наступления 50-75%-го ЦПД (часы после заражения) Концентрация вируса в клеточном лизате, в ^ ТЦЦ50/мл (1,5=+0,5 1ё ТЦЦ50/мл)

100 24 10,0

10 48 9,75

1 72 10,25

0,1 120 10,0

0,01 144 9,75

Примечание: ТЦЦ50- 50% тканевая цитопатическая доза вируса

Наличие вируспродуктивной инфекции отмечено во всем диапазоне используемых инфицирующих доз Ас1е12. Количество получаемого вирусного урожая (при отборе на указанные сроки для соответствующей множественности инфицирования) не зависит существенным образом от используемых инфицирующих доз.

В результате проведенных исследований показано, что культура клеток 293, заложенная на хранение в виде посевного и рабочего банков, использованная для наработки аденовирусного противоопухолевого препарата имеет: типичную для данной линии морфологию, кариотип и энзимограмму; культура не контаминирована бактериями, грибами, микоплазмами, вирусами, в том числе онкогенными; не является туморогенной; обладает высокими вируспродуктивными свойствами; сохраняет стабильность биологических свойств в течение длительного культивирования.

2. Получение противоопухолевого препарата «Канцеролизин» и оценка показателей его качества

Согласно разработанному проекту экспериментально-производственного регламента приготовлены три экспериментально-производственные серии препарата «Канцеролизин» ("Сапсего1у$тит ").

10

Качество приготовленных препаратов мутантного варианта аденовируса оценивали по ряду показателей, согласно требованиям, предъявляемым к медицинским иммунобиологическим препаратам. Внешний вид, герметичность, механические включения, рН, стерильность, плотность соответствовали нормам [МУК 4.1/4.2.588-96, с.63; МУК 4.1/4.2.588-96, с.126; ГФ XI, вып.1, с.113.; ГФ XI, вып.2 и МУК 4.1/4.2.588-96, с. 25]. Три серии препарата «Канцеролизин» были исследованы методом ПЦР с целью установления подлинности штамма, входящего в состав препарата. В результате при использовании видоспецифичных (по последовательности аденовируса человека 5-го серотипа ОепВапк N£0010960) олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих амплификацию фрагмента 2048-4582 п.о. аденовирусного генома и ДНК Ас1е12, выделенной из препарата «Канцеролизин» трех экспериментально-производственных серий в качестве матрицы, были амплифицированы фрагменты длиной 1458 п.о. с делецией 1118 п.о. в последовательности гена Е1В55К, что свидетельствует о том, что в состав серий препарата «Канцеролизин» входит именно мутантный штамм Ас1е12. Кроме того, в составе трех серий препарата были оценены содержание остаточной клеточной ДНК, концентрация бычьего сывороточного альбумина, концентрация общего белка [МУК 4.1/4.2.588-96, с. 95, МУК 4.1/4.2.588-96, с. 72].

Результаты проведенных исследований свидетельствовали о том, что все три приготовленные экспериментально-производственные серии препарата «Канцеролизин» соответствуют требованиям, изложенным в нормативно-технической документации (НТД) и могут быть использованы для дальнейшего лабораторно-экспериментального (доклинического) изучения. Данные серии препарата «Канцеролизин» были аттестованы в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

3. Доклинические исследования кандидатного противоопухолевого

препарата «Канцеролизин» 3.1 Исследования генетической стабильности мутантного штамма аденовируса Ас1е12, входящего в состав препарата «Канцеролизин»

На первом этапе доклинических исследований противоопухолевого лечебного препарата «Канцеролизин» на основе мутантного штамма аденовируса Ас1е12 была изучена стабильность мутантного штамма

аденовируса Adel2, используемого в препарате, в процессе его многократного пассирования.

Методом частичного секвенирования генома мутантного аденовируса Adel2 в образцах культуральных жидкостей, полученных после 5, 10 и 18-го пассажей на культуре клеток 293 было подтверждено наличие внесенных мутаций. Установлено, что нуклеотидная последовательность гена Е1В55К мутантного варианта Adel2 содержит делецию 1118 п.о. (длина интактного гена 1488 п.о.) после сигнала терминации трансляции гена Е1В19К. Кроме того, в районе делеции было показано наличие сайта для эндонуклеазы рестрикции Sali, внесенного в процессе конструирования мутантного штамма Adel2.

Для дополнительного подтверждения генетической стабильности штамма Adel2 и отсутствия дикого типа аденовируса в вирусной популяции был проведен ПЦР-анализ ДНК, выделенных из отдельных вирусных клонов после 18-ти последовательных пассажей. Во всех случаях (10 клонов) показано наличие делеции ожидаемой длины в гене Е1В55К и отсутствие амплификации фрагмента ДНК, соответствующего родительскому аденовирусу. На основании этих результатов можно утверждать, что в процессе многократного пассирования мутантного штамма Adel2 (до 18 пассажей) в монослое культуры клеток 293 не происходит спонтанного появления дикого варианта аденовируса, что свидетельствует о стабильности штамма Adel2.

На следующем этапе была исследована стабильность инфекционных свойств штамма Adel2, входящего в состав препарата «Канцеролизин», при пассировании на культуре клеток 293. Образцы культуральной жидкости, содержащие штамм Adel2, из 5, 10, 18 пассажей на культуре клеток 293 были использованы для изучения их литической активности на опухолевых р53-дефектных и нормальных р53-позитивных культурах клеток человека. Инфекционность аденовируса оценивали по цитопатогенному воздействию на культуры клеток (инфекционный титр выражали в ^ТЦД50/мл). Результаты представлены в таблице 2. Показано, что мутантный штамм Adel2 после 5, 10 и 18-го последовательных пассажей на культуре комплементарных клеток 293 сохранил способность селективно инфициро-

Таблица 2. Цитолитическая активность мутантного (А<3е12) и дикого штаммов аденовируса на панели р53 дефектных опухолевых и нормальных клеток человека

Штамм аденовируса Титр вируса на соответствующей клеточной культуре (М± I95 lgTIUWM.'i)

293 SW480 А431 ФКЧ

Adenoid 75 9,3±0,4 8,5±0,4 5,5±0,3 5,4±0,2

Adel2 (5-й пассаж) 9,3+0,4 8,3+0,5 5,2+0,4 3,3+0,4

Adel2 (10-й пассаж) 9,3+0,4 8,4+0,2 5,5±0,4 3,2+0,3

Adel2 (18-й пассаж) 9,3+0,4 8,4+0,3 5,5±0,3 3,2+0,3

Примечание: ТЦД50 - 50% тканевая цитопатическая доза вируса, 1§ТЦД5о/мл определяли по методу Кербера; Adenoid 75 - штамм аденовируса человека 5-го серотипа (дикий тип); Adel2 - мутантный штамм аденовируса человека 5-го серотипа с делецией в гене Е1В55К; 293 - клетки почки эмбриона человека, трансформированные генами Е1А и Е1В аденовируса 5-го серотипа; р53-дефектные опухолевые клетки: А431- эпидермоидная карцинома человека, SW480- аденокарцинома толстой кишки человека: Нормальные (р53-позитивные) клетки человека: ФКЧ- фибробласты кожи человека.

вать и лизировать культуры р53-дефектных опухолевых клеток человека.

Таким образом, проведенные исследования показали высокий уровень генетической стабильности мутантного штамма аденовируса Adel2, входящего в состав препарата «Канцеролизин» при многократном пассировании. Полученные данные свидетельствуют о возможности и перспективности использования мутантного штамма Adel2 в качестве основного действующего компонента противоопухолевого препарата «Канцеролизин».

3.2 Исследование реактогеииости препарата «Канцеролизин»

Одной из важных характеристик препарата, планируемого для лечения людей, является его безопасность при применении или ареактогенность. В исследованиях были использованы три серии препарата «Канцеролизин». Показатели, полученные при определении реактогенности различных серий препарата, не отличались достоверно друг от друга.

Оценку пирогенности препарата «Канцеролизин» проводили в тестах на кроликах, в результате было показано, что все серии препарата апирогенны, так как не было отмечено повышения температуры тела у кроликов более, чем на 0,6 °С при внутривенном введении препарата [Вдовиченко Г.В. и др., 2006].

Определение токсичности трех серий препарата «Канцеролизин» проводили на беспородных мышах-самцах массой 15 - 17 г и крысах линии

13

Low массой 200-250 г. При определении «острой» токсичности значимой потери веса, а также каких либо видимых клинических признаков интоксикации или гибели у животных, инъецированных препаратом, по сравнению с контролем на всем сроке наблюдения не наблюдали [Вдовиченко Г.В. и др., 2006].

При исследовании «хронической» токсичности препарата в тестах при пятикратном подкожном его введении лабораторным животным клинических признаков интоксикации, а также патологических изменений в структуре органов изъятых через 24 часа и 7 суток после последнего введения препарата (головной и спинной мозг, легкие, печень, почки, надпочечники, желудок, тонкий и толстый кишечник, поджелудочная железа, тимус, эпифиз, щитовидная железа, селезенка, региональные лимфатические узлы и ткань в месте введения препарата) выявлено не было.

Разрабатываемый препарат «Канцеролизин» может влиять на ЦНС, конкретно на функциональные процессы в головном мозге, торможение и возбуждение. При оценке влияния препаратов на эти процессы был использован тест - коразоловая проба [СП 3.3.2.561-96, п. 5.2, с.24]. При постановке коразоловой пробы мышам линии BALB/c вводили внутрибрюшинно 0,5 мл препарата (активность 109,2 ТЦЦ50/мл). Коразол животным вводили через 48 часов и через 7 суток после введения препарата «Канцеролизин». Время начала судорог, выраженность судорог и время наступления гибели в опытных группах не отличались достоверно от аналогичных показателей в контрольной группе, на основании чего можно сделать заключение, что препарат мутантного варианта аденовируса не оказывает патологического влияния на функцию ЦНС.

Введение в организм исследуемого препарата неизбежно будет вызывать ответные реакции со стороны иммунной системы, так как в основе препарата «Канцеролизин» находится вирус. В связи с этим очень важно оценить степень выраженности этих реакций организма в ответ на его введение, чтобы исследовать безопасность применения препарата. С этой целью был проведен ряд исследований, направленных на изучение иммунологической безопасности препарата.

Гематологическое и морфологическое исследования органов иммунной системы у животных, обработанных препаратом «Канцеролизин»

При проведении гематологических и морфологических исследований использовали беспородных мышей-самцов, массой 17 г, которым подкожно вводили препарат в дозе Ю9 0 ТЦД50 однократно и пятикратно с интервалом 1 сутки. Через 1, 7, 10 или 14 суток после введения препарата у животных брали кровь из ретроорбитального синуса для проведения гематологических исследований, а также брали органы иммунной системы для их морфологического исследования.

В крови подсчитывали количество эритроцитов, общее количество лейкоцитов, процент и абсолютное количество форменных элементов крови. По результатам исследований концентрации эритроцитов в крови у контрольных и опытных животных достоверно не различались между собой при различных кратностях введения препарата «Канцеролизин», также не наблюдалось отличий у контрольных и опытных групп животных в концентрации лейкоцитов. Результаты микроскопического исследования препаратов крови животных показали, что введение препарата «Канцеролизин» не вызывает значимых изменений лейкоцитарной формулы.

При морфологическом исследовании органов иммунной системы (селезенка, тимус, толстая кишка, бронхиальные и мезентериальные лимфатические узлы) в экспериментальных и контрольных группах мышей при однократном и пятикратном введении препарата «Канцеролизин» основное внимание обращалось на параметры, которые могли свидетельствовать о патологических процессах, нарушениях иммунного ответа и нарушениях гемопоэза.

Результаты исследования клеточного состава красного костного мозга у мышей, как однократно так и пятикратно обработанных препаратом «Канцеролизин», не выявили значимого отклонения от нормальных значений показателей через 1, 7 и 14 суток после последнего введения препарата Проведенное гематологическое и морфологическое исследования органов иммунной системы не выявило значительных отличий в контрольных и опытных образцах. Отмеченные отличия характеризовали реакцию лимфоидных органов на антигенное воздействие. Данные структурные изменения не носили специфического характера и не содержали признаков

патологического повреждения органов и тканей. Часть отмеченных особенностей носила видоспецифический характер и являлась нормой для данного вида экспериментальных животных. К этим особенностям можно отнести мегакариоцитоз и лимфоцитоз красной пульпы селезенки; преобладание малых лимфоцитов в лимфатических узлах и фолликулах кишечника; преобладание в красном костном мозге зрелых нейтрофилов. В процессе опыта в красном костном мозге наблюдалась стимуляция миело- и лимфопоэза, клеточный состав красного костного мозга варьировал в пределах видовой нормы. Таким образом, структура лимфоидных органов у экспериментальных животных отражала активацию иммунного ответа.

Исследование фагоцитарной активности макрофагов у инъецированных препаратом «Канцеролизин» мышей

Фагоцитарную активность макрофагов оценивали по активности клеток перитонеального эксудата по отношению к инактивированным клеткам пекарских дрожжей. Для постановки реакции были использованы три группы мышей линии ВАЬВ/с. Животным однократно и двукратно были введены внутрибрюшинно серии препарата. Определение фагоцитарной активности макрофагов проводили на 3, 5 и 7-е сутки после инфицирования. Были определены процент фагоцитирующих клеток и фагоцитарное число. В результате показатели фагоцитарной активности макрофагов животных, инъецированных препаратом «Канцеролизин», достоверно не отличались от показателей контрольной группы животных (р>0,05), которым внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Внутрибрюшинное введение препарата лабораторным животным не приводит к негативным изменениям фагоцитарной активности макрофагальной системы.

Изучение изменений содержания ядросодержащих клеток, Т- и В-клеток при применении препарата «Канцеролизин»

Определение количества ядросодержащих клеток (ЯСК), Т- и В-лимфоцитов в селезенке проводили в экспериментах на мышах линии ВАЬВ/с, внутрибрюшинно инъецированных, однократно и двухкратно с интервалом в сутки, препаратом в дозе Ю9,0 ТЦЦ5о. Определение количества ЯСК в селезенке проводили на 3, 5 и 7-е сутки после последнего введения препарата. Контрольная группа животных была инокулирована физиологическим раствором. Результаты исследования представлены в

таблице 3. Результаты определения абсолютного количества ЯСК в селезенке животных опытных и контрольных групп свидетельствуют об отсутствии супрессирующего эффекта исследуемого препарата на клетки селезенки.

Определение количества Т- и В- клеток проводили с использованием цитотоксического теста. Для постановки реакции использовали взвеси лимфоцитов, полученных от вышеотмеченных опытных и контрольных групп мышей. Из полученных результатов следует, что введение мышам высоких доз препарата не приводит к значительным сдвигам в процентном содержании лимфоцитов и не вызывает супрессивного воздействия на Т- и В-клеточное звено иммунитета животных. Эксперименты по определению количества ЯСК, Т- и В- лимфоцитов в селезенке животных были проведены с тремя сериями препарата «Канцеролизин» при этом результаты были сходными.

Таблица 3. Оценка количества ЯСК в селезенке инъецированных препаратом «Канцеролизин» мышей (М±5м)__

Группа животных Сутки после инъецирования Количество ЯСК в селезенке (х107)

Однократно инъецированная препаратом 3 6,95+0,35

5 7,30+0,40

7 6,80±0,35

Двукратно инъецированная препаратом 3 7,15±0,30

5 7,50±0,45

7 7,30+0,35

Контрольная (не инъецированные препаратом) 3 6,80+0,30

5 7,05+0,35

7 6,95±0,35

Примечание. Клетки селезенки каждой мыши анализировали индивидуально, в таблице приведены среднегрупповые значения.

Исследование функциональной активности регуляторных субпопуляций Т- лимфоцитов с определением спонтанно формирующихся АОК в ответ на введение препарата «Канцеролизин»

Исследование проводили на мышах линии ВАЬВ/с подкожно инъецированных сериями препарата «Канцеролизин». Количество АОК в селезенке животных определяли через 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 суток после инфицирования (на каждую точку использовали по 3 мыши) (табл. 4).

Установили, что на протяжении всего времени наблюдения животных после введения исследуемого препарата, статистически достоверного его влияния на активность регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов не наблюдается. Таким образом, внутрибрюшинное введение животным препарата не оказывает выраженного влияния на функциональную активность регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов.

Исследование гшмунореактивности на неродственные антигены у животных, обработанных препаратом «Канцеролизин»

Исследование проводили на мышах линии ВАЬВ/с подкожно инъецированных препаратом в дозе 109 ТЦД50. Спустя 7 суток животным вводили внутривенно эритроциты барана, 2x107 кл/животное.

Таблица 4. Определение функциональной активности регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов ВАЬВ/с мышей, инфицированных препаратом Ас1е12 (М+8м)

Сутки после введения препарата Число АОК

Контроль Опыт

1 75,2±5,3 74,8±5,0

3 76,4±5,8 71,3±5,9

5 75,9+5,5 67,3+5,1

7 72,7+6,2 71,1+6,5

9 76,7±6,0 74,1+5,5

11 76,7+6,0 74,1±5,5

13 73,4±5,2 77,8±6,5

Примечание. Показатели приведены в пересчете на 10 клеток селезенки.

Иммунный ответ на гетерологичный антиген оценивали через 4 суток после введения эритроцитов. При определении иммунореактивности у животных, обработанных препаратом, на гетерологичный Т-зависимый антиген - эритроциты барана, было установлено, что количество АОК на селезенку составляло 41535±2320. В контрольной группе животных этот показатель не отличался и составил 42780±2450. Аналогичного рода эксперименты с подобными результатами были проведены на других сериях препаратов мутантного варианта аденовируса.

Таким образом, введение препарата «Канцеролизин» животным в дозе 109 ТЦЦ50 не угнетает иммунный ответ на гетерологичный антиген.

Изучение аллергизирующего действия и аутоиммунных реакций организма в ответ на введение препарата «Канцеролизин»

Для изучения возможного аллергенного действия и патологических аутоиммунных реакций организма в ответ на введение исследуемого препарата были проведены исследования по определению способности препарата вызывать анафилактическую реакцию, продукцию реагиноподобных антител Е) у животных, обработанных препаратом и вызывать косвенный сенсибилизирующий эффект, которые характеризуют реакции гиперчувствительности немедленного типа.

При воспроизведении анафилаксии у морских свинок препарат вводили трехкратно в дозе 109'5 ТЦД50 в следующей схеме: первая инъекция была выполнена подкожно, две последующие - внутримышечно. Интервал между инъекциями составлял одни сутки. Двум группам контрольных животных (положительной и отрицательной) подкожно вводили гетерологичную (лошадиную) сыворотку в объеме 0,1 мл и трехкратно подкожно инъецировали физ. раствором соответственно. Спустя 21 сутки после последней инъекции животным повторно внутривенно вводили исследуемый препарат в той же дозе, а группе положительного контроля вводили гетерологичную сыворотку. Результаты исследования приведены в таблице 5.

Как следует из приведенных в таблице данных, исследуемый препарат «Канцеролизин» не вызывает анафилактической реакции, сравнимой с группой животных положительного контроля. Аналогичного рода эксперименты с подобными результатами были проведены с использованием трех серий препарата «Канцеролизин». Таким образом, инфицирование препаратом «Канцеролизин» не приводит к сенсибилизации организма животных, проявление которой при повторной встрече с ним выражается в реакции гиперчувствительности немедленного типа.

Возможность аллергизирующего влияния препарата «Канцеролизин» на организм оценивали по продукции реагиноподобных антител (1й Е) у инфицированных животных. Исследование проводили на мышах линии ВАЬВ/с, которым подкожно двукратно вводили препарат в дозе 109ТЦД5о с интервалом в 21 сутки.

Животные контрольной группы были инокулированы физ. раствором. Начиная с пятых суток после повторного инфицирования, у животных с недельным интервалом пятикратно отбирали кровь.

Таблица 5. Изучение реакций гиперчувствительности немедленного типа у морских свинок, сенсибилизированных препаратом «Канцеролизин»_

Группа Сенсибилизирую Количество Количество Индекс

животных щий агент животных павших животных Вейгла

Опытная группа Препарат «Канцеролизин» 10 0* 0,20

Положительный Лошадиная 10 6 4,30

контроль сыворотка

Отрицательный Физ. раствор 10 0 0,15

контроль

Примечание: * - отсутствие павших животных в опыте свидетельствует о том, что изучаемый препарат не вызывает анафилаксии у морских свинок.

Полученные данные свидетельствуют о том, что у животных, которым вводили препарат «Канцеролизин», титр реагиноподобных антител не превышает показатели контрольной группы на протяжении всего срока наблюдения. Таким образом, инфицирование животных препаратом не сопровождается формированием аллергического состояния.

Для исследования косвенного сенсибилизирующего эффекта препарата использовали мышей линии ВАЬВ/с, мышей подкожно иммунизировали овальбумином дозой 2,0 мкг, спустя 11 суток животным вводили препарат в дозе 109 ТЦД50. На 7, 12, 17 и 22-е сутки после введения препарата у животных отбирали кровь и определяли в полученных образцах сыворотки титры антител к овальбумину. Положительный контроль представлял собой группу животных, иммунизированных овальбумином и инокулированных через 11 суток после иммунизации физ. раствором. Отрицательным контролем являлись животные, иммунизированные культуральной жидкостью (среда культивирования неинфицированных клеток 293) и впоследствии инфицированные препаратом. В результате установили, что титры антител к овальбумину в группе, получавшей препарат «Канцеролизин» не отличались от таковых в группе положительного контроля, что свидетельствует о том, что препарат не ингибирует

гуморальный иммунный ответ на предварительную иммунизацию модельным антигеном.

Определение реакции гиперчувствительности замедленного типа при применении препарата «Канцеролизин»

Оценку развития гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) проводили по методике, основанной на изменении массы конечности животных. С этой целью мышам линии BALB/c подкожно вводили препарат в дозе 109 ТЦД5о. Спустя 5 суток в подушечку задней правой лапки вводили 2х108 ТЦД5о препарата, а в подушечку задней левой лапки вводили физ. раствор. Отрицательным контролем являлась группа мышей, инокулированная физ. раствором. Умеренный отек конечности развивался только у тех животных, которые были предварительно сенсибилизированы препаратом, что свидетельствует о том, что физиологический уровень ГЗТ обусловлен аденовирусным антигеном. Аналогичного рода эксперименты с подобными результатами были проведены на других сериях препарата «Канцеролизин».

3.3 Специфическая оиколитическая активность препарата «Канцеролизин»

Селективная репликативная активность препарата in vitro

Основным свойством препарата «Канцеролизин» является его специфическая инфекционная активность, избирательная в отношении р53-дефектных опухолевых клеток.

Были проведены сравнительные исследования инфекционности препарата «Канцеролизин» для нормальных фибробластов человека и различных р53-дефектных опухолевых клеток (рисунок 1). В результате установили, что препарат обладает способностью к селективной репликации на культурах р53-дефектных опухолевых клеток человека (имеющихся в нашем распоряжении) и является перспективным для проведения дальнейших исследований в системе in vivo.

Оиколитическая активность препарата in vivo

Исследование терапевтической эффективности препаратов мутантного штамма аденовируса проводили на 8-недельных безтимусных nude мышах, Для прививки животным использовали культуру опухолевых клеток А431.

По достижению опухолями, необходимого объема (100 мкл), который позволял осуществить интратуморальное введение, была проведена их

Цроцект от дкхого типа (вкусный урожай )

50403020 — 10 -

Ш

Рисунок 1. Оценка репликации штамма аденовируса AdeI2 в р53-дефектных опухолевых клетках в сравнении с нормальными фибробластами кожи человека.

Примечание: Концентрация штамма Adel2, через 72 ч культивирования в клетках была нормализована к концентрации дикого типа аденовируса, продуцированного теми же клетками за тот же период времени и результат представлен в процентном отношении; количественное определение инфекционного вируса проводили титрованием на культуре клеток 293; A43I, SW480, Нер2 и СЗЗА - р53-дефектные опухолевые клетки человека; ФКЧ- фибробласты кожи человека.

обработка тремя сериями препарата «Канцеролизин». С этой целью в каждую опухоль был инъецирован исследуемый препарат с инфекционной активностью 108'5 ТЦД50/ЮОмкл (по 25 мкл в каждый квадрант опухоли). Инъекции проводились ежедневно в течение 5 дней.

Опухоли, привитые контрольным животным, обрабатывали по той же схеме препаратом «Канцеролизин», инактивированным ультрафиолетовым облучением. Полученные результаты свидетельствуют о том, что обработка опухолей препаратом приводит к выраженному ингибированию роста опухолевых клеток, как по средним значениям объемов опухолей, так и по кратности увеличения их объемов с начала наблюдения до его завершения (рисунок 2).

о

Время после введения вируса в опухоли (дни)

Рисунок 2. Противоопухолевая активность препарата «Канцеролизин» ¡n vivo при интратуморальном введении.

Примечание: А431- клетки эпидермоидной карциномы человека (107 клеток в 150 ц1 DMEM) инъецировали подкожно в боковую поверхность бестимусных nude мышей, В опухоли (п=5) вводили 1083 ТЦЦзо препарата «Канцеролизин» в 100 мкл фосфатно-солевого буфера ежедневно в течение 5 дней В контрольные опухоли (п=5) по той же схеме вводили инактивированный ультра фиолетовым излучением препарат «Канцеролизин»( Щ ).

3.4 Изучение сохранения активности препарата «Канцеролизин» при хранении

При использовании препарата «Канцеролизин» для лечения онкологических заболеваний немаловажным критерием, характеризующим его эффективность в процессе лечения, является способность препарата сохранять свою специфическую активность при хранении и транспортировке. Для оценки изменения активности препарата при хранении определяли изменение титра мутантного штамма Adel2 в составе препарата «Канцеролизин» в контрольные временные промежутки при его хранении в различных температурных условиях (табл. 6). Исходя из полученных результатов, хранение препарата без снижения его активности может осуществляться при температуре минус 40 °С в течение не более 12 месяцев или при температуре минус 70 °С в течение двух лет.

Были проведены эксперименты, имитирующие транспортировку «Канцеролизина» при температуре минус 10 — 13 °С в течение 5 суток. При этом замороженный при минус 70 °С препарат (3 ампулы с исходной активностью 9,5±0,5 lg ТЦД50/мл) переместили в морозильный отдел

холодильника для хранения при температуре минус 10 - 13 °С на 5 суток, контролируя один раз в сутки температуру в нем после его кратковременного открытия.

Таблица 6. Оценка изменения биологической концентрации вируса в препарате «Канцеролизин» в зависимости от времени его хранения при

разных температурных условиях.

Срок экспериментал ьного хранения, месяцы Концентрация вируса ^ ТЦД50/мл (195 < ±0,5 ^ ТЦЦ50/мл) в процессе хранения при разных температурах:

Минус 20°С Минус 40°С Минус 70°С

1 7,5* 9,5 н.о.

2 7,2* н.о. н.о.

3 7,2* 9,2 9,2

4 7,2* н.о. н.о.

5 7,0* н.о. н.о.

6 6,6* 9,2 9,2

9 н.о. 9,2 н.о.

12 н.о. 8,8 9,1

15 н.о. 8,5** 9,0

24 н.о. н.о. 9,0

Примечание: специфическую активность штамма Ас1е12 в составе препарата определяли с помощью стандартного метода титрования вирусных частиц по 50% цитопатическому действию на культуре клеток 293; титр исходного исследуемого препарата на 0 месяцев составил 9,5±0,5 ^ ТЦЦ50/МЛ.; * - концентрация вируса в препарате в 100 и более раз ниже по сравнению с концентрацией вируса в исходном препарате на 0 месяцев; ** -концентрация вируса в препарате в 10 раз ниже по сравнению с концентрацией вируса в исходном препарате на 0 месяцев (уровень достоверности отличий р<0,05); и.о. -концентрацию в данной точке не определяли.

По истечении 5-ти суток в образцах препарата определяли концентрацию инфекционного вируса. В результате не было отмечено достоверного снижения концентрации вируса в трех ампулах. Транспортировка препарата без достоверного снижения его активности может быть осуществлена при температуре минус 10 — 13 °С в течение 5 суток.

выводы

1 Культура клеток 293 не является туморогенной, обладает высокой чувствительностью к мутантному штамму Adel2 аденовируса 5-го серотипа, позволяет нарабатывать вирусную биомассу штамма до высоких концентраций при низкой множественности заражения и разрешена для производства лечебного противоопухолевого вирусного живого культурального очищенного концентрированного жидкого препарата «Канцеролизин» на основе данного штамма аденовируса.

2 В соответствии с проектом ЭПР получены три экспериментально-производственные серии препарата «Канцеролизин».

3 Показано, что штамм Adel2 аденовируса, входящий в состав противоопухолевого препарата «Канцеролизин» при многократном пассировании (18 пассажей) на культуре клеток 293, характеризуется высокой степенью генетической стабильности и сохраняет способность селективно инфицировать и лизировать культуры р53-дефектных опухолевых клеток человека.

4 Препарат «Канцеролизин» не обладает пирогенностью, токсичностью (острой и хронической), не влияет на центральную нервную систему, не проявляет аллергизирующего действия, не вызывает аутоиммунных реакций и является иммунологически безопасным. Показана его избирательная инфекционная активность в отношении р53-дефектных опухолевых клеток человека in vitro. На модели иммунодефицитных мышей с привитыми опухолями эпидермоидной аденокарциномы человека (А431) показана его способность достоверно ингибировать прогрессию опухолей при интратуморальном введении.

5 При моделировании условий хранения и транспортировки препарата «Канцеролизин» показано, что он сохраняет свою специфическую активность при хранении в течение двух лет при температуре минус 70 °С, в то же время транспортировка препарата с сохранением его специфической активности в течение 5 суток возможна при температуре минус 10-13 °С.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Вдовиченко Г.В., Радаева И.Ф., Сергеев A.A. и др. Создание банков перевиваемой культуры клеток 293 для производства антиракового вирусного лечебного препарата «Канцеролизин» //Биотехнология. 2006. №1. С.62-67.

2. Радаева И.Ф., Вдовиченко Г В., Сергеев A.A. и др. Аттестация перевиваемой культуры клеток 293, используемой для культивирования антиракового лечебного препарата «Канцеролизин» //Антибиотики и химиотерапия. 2005.Т.50., №5-6. С.7-10.

3. Вдовиченко Г.В., Петрищенко В.А, Сергеев A.A. и др. Доклинические исследования противоракового лечебного препарата «Канцеролизин» //Вопросы вирусологии. 2006. №6. С.39-42.

4. Вдовиченко Г.В., Петрищенко В.А., Сергеев A.A. и др. Изучение реактогенности, безопасности и специфической активности на животных противоракового лечебного препарата «Канцеролизин» //Биотехнология. 2006. №2. С. 66-72.

5. Вдовиченко Г.В., Шишкина Л.Н., Сергеев A.A. и др. Разработка лечебного противоракового препарата на основе мутантного штамма аденовируса человека //2-я Международная конференция «Наука - Бизнес - Образование Биотехнология -биомедицина - Окружающая среда», тезисы докладов — 10 — 13 мая 2005 г., Пущино, С. 60.

6. Вдовиченко Г.В., Петрищенко В.А., Сергеев A.A. и др. Доклинические исследования противоракового лечебного аденовирусного препарата «Канцеролизин» //1-я Российско-американская конференция «Биотехнология и онкология» - 29-31 мая 2005 г., Санкт-Петербург, Россия, С. 94 - 95.

7. Сергеев A.A., Вдовиченко Г.В., Радаева И.Ф. и др. Аттестация перевиваемой культуры клеток 293, используемой для культивирования антиракового лечебного препарата //1-я Российско-американская конференция «Биотехнология и онкология» - 2931 мая 2005 г., Санкт-Петербург, Россия, С. 131.

8. Терновой В.А., Петрищенко В.А., Вдовиченко Г.В. и др. Изучение возможности культивирования мутантного варианта Adel2 аденовируса на культуре клеток 293 //1-я Российско-американская конференция «Биотехнология и онкология» - 2931 мая 2005 г., Санкт-Петербург, Россия, С. 138.

9. Шишкина Л.Н., Сергеев А Н., Вдовиченко Г.В. и др. Проведение 1-й фазы клинических испытаний противоопухолевого препарата «Канцеролизин», созданного на основе мутантного аденовируса 5-го серотипа // Международная научно-практическая конференция «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», посвященной 50-летию Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности НЦБ МОН PK, Алматы, 20-22 мая 2008, С. 476-477.

10. Вдовиченко Г.В., Шишкина JI.H, Михайлова И.Н. и др. Доклинические и клинические исследования противоракового лечебного аденовирусного препарата «Канцеролизин»// Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения. 2012. С.318-325.

11. Иванова М.Ю., Шишкина Л.Н., Шевцов А Р. и др. Определение токсичности цезия хлорида на животных, перевиваемых и первичных культурах клеток» // Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения. 2012.С.331-338.

12. Vdovichenko G.V., Radaeva I F., Sergeev A.A. et al. The certification of the continuous cell culture 293 for the cultivation of the mutant adenoviral therapeutic anticancer preparation //Abstracts of the XIII International Congress of Virology, San Francisco, California, USA, July 23 - 28,2005. -187.V.560. P. 183.

13. Vdovichenko G.V., Sergeev A.A., Shishkina L.N. et al. The development of the therapeutic anticancer preparation based on the Mutant strain of human adenovirus //Abstracts of the XIII International Congress of Virology, San Francisco, California, USA, July 23 - 28, 2005. - 187.V.561. P. 184.

Подписано в печать 07.11.2012 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ № 122.

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383)217-43-46, 8-913-922-19-07

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Вдовиченко, Галина Владимировна

Обозначения и сокращения

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Злокачественные новообразования: генетические изменения в клет- 11 ках, как основная причина возникновения опухолей

1.2 Вирусные векторы как перспективный подход для разработки совре- 23 менных противоопухолевых препаратов

1.2.1 Генная терапия

1.2.2 Вирусные векторные системы для суицидной терапии опухолевых 29 клеток-м ишеней

1.2.3 Вирусы, избирательно инфицирующие и лизирующие опухолевые 31 клетки

1.3 Характеристика аденовирусов человека: аденовирусы как векторная 38 система

1.4 Онколитические аденовирусы

2 Материалы и методы

3 Результаты собственных исследований

3.1 Исследование перевиваемой культуры клеток 293 как субстрата для 65 производства кандидатного противоопухолевого препарата «Канце-ролизин»

3.2 Получение препарата «Канцеролизин» и оценка показателей его ка- 71 чества

3.3 Доклинические исследования кандидатного противоопухолевого 75 препарата «Канцеролизин»

3.3.1 Исследование генетической стабильности мутантного штамма аденовируса Adel2, входящего в состав препарата «Канцеролизин»

3.3.2 Исследование реактогенности препарата «Канцеролизин»

3.3.3 Специфическая онколитическая активность препарата «Канцероли- 102 зин»

3.3.4 Изучение сохранения активности препарата «Канцеролизин» при 105 хранении

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Вдовиченко, Галина Владимировна

ВЫВОДЫ

1 Культура клеток 293 не является туморогепной, обладает высокой чувствительностью к мутантному штамму Adel2 аденовируса 5-го серотипа, позволяет нарабатывать вирусную биомассу штамма до высоких концентраций при низкой множественности заражения и разрешена для производства лечебного противоопухолевого вирусного живого культурального очищенного концентрированного жидкого препарата «Канцеролизин» на основе данного штамма аденовируса.

2 В соответствии с проектом ЭПР получены три экспериментально-производственные серии препарата «Канцеролизин».

3 Показано, что штамм Adel2 аденовируса, входящий в состав противоопухолевого препарата «Канцеролизин» при многократном пассировании (18 пассажей) на культуре клеток 293, характеризуется высокой степенью генетической стабильности и сохраняет способность селективно инфицировать и лизиро-вать культуры р53-дефектных опухолевых клеток человека.

4 Препарат «Канцеролизин» не обладает пирогенностью, токсичностью (острой и хронической), не влияет на центральную нервную систему, не проявляет аллергизирующего действия, не вызывает аутоиммунных реакций и является иммунологически безопасным. Показана его избирательная инфекционная активность в отношении р53-дефектных опухолевых клеток человека in vitro. На модели иммунодефицитных мышей с привитыми опухолями эпидермо-идной аденокарциномы человека (А431) показана его способность достоверно ингибировать прогрессию опухолей при интратуморальном введении.

5 При моделировании условий хранения и транспортировки препарата «Канцеролизин» показано, что он сохраняет свою специфическую активность при хранении в течение двух лет при температуре минус 70 °С, в то же время транспортировка препарата с сохранением его специфической активности в течение 5 суток возможна при температуре минус 10-13 °С.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Онкологические заболевания встречаются повсеместно на всех континентах земного шара и являются одними из самых распространенных видов болезней. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, ежегодно в мире от рака умирает более 7 млн. человек [СМИ ВОЗ, 2012]. По уровню заболеваемости злокачественными новообразованиями среди других стран мира Россия занимает 16-е место у мужчин и 28-е - у женщин [Трапезников Н. Н., Аксель Е. М., 1996; Бармина Н. М., Трапезников Н. Н., 1997; СМИ ВОЗ, 2009].

Более 50% всех опухолей человека состоят из клеток, несущих дефект в р53-гене, включая клетки легкого (60%), ободочной кишки (50%), грудной клетки (40%), головы и шеи (60%) и яичек (60%) [Hollstein М. et al., 1991; Lubin R. et al.,1995; Chang F. et al., 1995]. Как правило, потеря р53-функции у клеток часто ассоциируется с их резистентностью к химиотерапевтическим препаратам и облучению. Таким образом, чрезвычайно важной, актуальной и значимой задачей современной медицины является создание новых высокоэффективных препаратов для лечения опухолей, вызванных мутациями в гене р53 у клеток.

Путем проведения сайт-направленного мутагенеза аденовируса 5-го сероги-па в ГНЦ ВБ «Вектор» был получен мутантный штамм Adel2, который несет де-лецию фрагмента 2309 - 3427 п.о. гена Е1В55К и избирательно размножается в р53-дефицитных опухолевых клетках, вызывая их разрушение. Именно благодаря наличию селективной инфекционной активности в отношении опухолевых клеток, штамм Adel2 был нами использован при создании противоопухолевого препарата «Канцеролизин».

Целью настоящих исследований явилась разработка и доклиническое изучение кандидатного противоопухолевого аденовирусного препарата «Канцеролизин».

Первоначально при создании препарата был наработан сток производственного штамма Adel2, благодаря использованию перевиваемой культуры клеток 293. В свою очередь, данная культура клеток 293 была нами исследована по ряду характеристик, позволяющих использовать ее в качестве биосистемы для производства противоопухолевого лечебного препарата «Канцеролизин». Посевной и рабочий банки культуры клеток 293 были исследованы в отношении безопасности и эффективности их использования при производстве препарата. В результате установили, что заложенные на хранение банки культуры клеток, предназначенные в дальнейшем для производства препарата, имеют типичную для данной линии морфологию, кариогип и энзимограмму, характерную для клеток человека. Культура клеток банков не контамипирована бактериями, грибами, мико-плазмами, вирусами, в том числе и онкогенными, обладает высокими вируспро-дукгивными свойствами, сохраняет стабильность всех биологических свойств в течение длительного культивирования. По итогам исследований банки перевиваемой линии клеток 293 были аттестованы в ГИСК им. Л.А. Тарасевича для производства противоопухолевого препарата «Канцеролизин».

Согласно ранее разработанным инструкциям по приготовлению и контролю препарата - экспериментально - производственному регламенту (ЭПР) и фармакологической статьи предприятия (ФСП), используя посевной штамм Ас1е12, были приготовлены три серии препарата «Канцеролизин». Полученные серии были оценены по ряду показателей (внешний вид, герметичность, механические включения, рН, стерильность, плотность, состав, подлинность, специфическая активность), характеризующих их качество. Определили, что все три приготовленные экспериментально-производственные серии препарата «Канцеролизин» соответствуют требованиям, изложенным в нормативно-технической документации (НТД) и могут быть использованы для дальнейшего лабораторно-экспериментального (доклинического) изучения. По итогам исследований серии препарата «Канцеролизин» были аттестованы в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

При производстве вируссодержащих препаратов, особенно на основе генно-модифицированных штаммов, необходимо иметь информацию о стабильности свойств вируса, входящего в состав препарата, в процессе его многократного пассирования (до 10 пассажей) на биосистеме, которая применяется для наработки препарата. Нами была проведена оценка генетической стабильности му-тантного штамма аденовируса Ас1е12 после проведения 5, 10 и 18-го пассажа на культуре клеток 293, моделируя тем самым процесс производства противоопухолевого препарата «Канцеролизин». При определении нуклеотидной последовательности El региона генома делеционного варианта аденовируса Adel2 в образцах культуральных жидкостей, полученных после 5, 10 и 18-го пассажей на культуре клеток 293 было подтверждено наличие внесенных мутаций. С помощью ПЦР анализа ДНК выделенных из отдельных клонов штамма Adel2 после 18-ти последовательных пассажей в геномной ДНК всех исследованных вирусных клонов показано наличие делеции ожидаемой длины в гене Е1В55К и отсутствие амплификации фрагмента ДНК соответствующего родительскому аденовирусу, что свидетельствует об отсутствии реверсии к дикому типу аденовируса при многократном пассировании. Кроме того, было показано, что штамм Adel2 после 5, 10 и 18-го последовательных пассажей на культуре комплементарных клеток 293 сохранил способность селективно инфицировать и лизиро-вать культуры р53-дефектных опухолевых клеток человека. Таким образом, показан высокий уровень генетической стабильности и стабильности инфекционных свойств штамма аденовируса Adel2, входящего в состав препарата «Канцеролизин».

При проведении доклинических исследований противоопухолевого препарата «Канцеролизин» крайне важно оценить безопасность его применения. В связи с этим в серии экспериментов была изучена реактогенность препарата, как одна из характеристик безопасности. В первую очередь оценивалась его пиро-гепиая активность в опытах на кроликах, которым внутривенно вводили препарат в дозе 109'5 ТЦД50/животное. Проведенные исследования показали, что внутривенное введение препарата не вызывает подъема температуры тела кроликов более, чем на 0,6 °С, данный факт свидетельствует об отсутствии пирогенности изучаемых серий препарата.

Изучение токсичности препарата, также является важнейшим критерием оценки его безопасности или ареактогенности. При изучении острой токсичности препаратов в тестах на мышах и крысах, которым внутрибрюшинно вводили образцы серий препарата в дозе 109"0 ТЦД50 для мышей и в дозе 109-5 ТЦД50 Для крыс было показано, что ни одно из животных не теряло в весе на всем сроке наблюдения (7 суток) и не проявляло видимых клинических признаков интоксикации. Полученные данные подтверждают отсутствие «острой» токсической реакции у животных на введение препарата. В тестах по определению «хронической» токсичности на мышах, инъецированных подкожно сериями препарата, в течение всего срока наблюдения (12 суток) за экспериментальными животными не было отмечено каких-либо внешних клинических симптомов интоксикации и достоверных различий по массе в опытной и контрольной группах животных при подневном сравнении их показателей. Проведенное гистологическое исследование изменений в органах и тканях животных через 1 и 7 суток после многократного введения препарата не выявило значительных отличий в контрольных и опытных образцах. Отмеченные отличия в структуре тимуса, селезенки и лимфатических узлов характеризовали реакцию лимфоидных органов на длительное антигенное воздействие, были закономерными, не носили специфического характера и не содержали признаков патологического повреждения органов и тканей.

При оценке влияния препарата «Канцеролизин» на функциональные процессы в головном мозге (торможение и возбуждение) был использован тест - ко-разоловая проба. В результате оценки времени начала судорог, выраженности судорог и времени наступления гибели в опытных и контрольных группах животных достоверных отличий установлено не было, что свидетельствует об отсутствии у препарата патологического влияния на функцию ЦНС.

В серии экспериментов была изучена иммунологическая безопасность препарата. На первом этапе оценили гематологические показатели и морфологические характеристики иммунной системы у мышей, которым подкожно вводили препарат в дозе 10У ТЦД50 однократно и пятикратно с интервалом в 1 сутки. Результаты микроскопического исследования образцов крови животных, взятой через 1, 7 и 14 суток после введения препарата, свидетельствовали об отсутствии достоверных отличий между гематологическими показателями в соответствующих экспериментальных и контрольных группах животных. Результаты морфологического исследования органов иммунной системы животных (селезенка, тимус, костный мозг, толстая кишка, бронхиальные и мезентериальные лимфатические узлы), взятых через 1, 7 и 14 суток после введения препарата подтвердили отсутствие патологических изменений. Отмеченные отличия морфологии органов иммунной системы у животных опытной и контрольной групп характеризовали реакцию лимфоидных органов на антигенное воздействие. Данные структурные изменения не носили специфического характера и не содержали признаков патологического повреждения органов и тканей.

В следующей серии экспериментов исследовали иммунокомпетентные клетки после воздействия препарата. На первом этапе оценивали фагоцитарную активность макрофагов перитонеального эксудата мышей линии BALB/c по отношению к инактивированным клеткам пекарских дрожжей. Животным вводили внутрибрюшинио препарат в дозе 109,0ТЦД5о однократно и двукратно с интервалом в сутки. Определение фагоцитарной активности макрофагов проводили на 3, 5 и 7-е сутки после инфицирования. Показатели фагоцитарной активности (процент фагоцитирующих клеток и фагоцитарное число) макрофагов животных, инфицированных препаратом, достоверно не отличались от показателей контрольной группы животных. Таким образом, введение лабораторным животным препарата «Канцеролизин» не приводит к негативным изменениям фагоцитарной активности макрофагальной системы.

Определение количества ЯСК, Т- и В- лимфоцитов проводили в селезенке мышей линии BALB/c, инъецированных внутрибрюшинио (одно- и двукратно с интервалом в сутки) сериями препарата в дозе 109()ТЦД5о. Результаты определения абсолютного количества ЯСК, Т- и В-клеток в селезенке животных опытных и контрольных групп, взятых на исследование через 3, 5 и 7 суток после введения препарата, свидетельствовали об отсутствии супрессирующего эффекта исследуемого препарата на клетки селезенки.

Исследование функциональной активности регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (в гесте in vitro) с определением спонтанно формирующихся АОК проводили на мышах линии BALB/c, которым подкожно вводили серии препарата в дозе 109"° ТЦД50. Количество АОК в селезенке животных (клетки, продуцирующие антитела к эритроцитам барана) определяли через 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 суток после инфицирования. На протяжении всего времени наблюдения после введения препарата у животных не выявляли статистически достоверного влияния препарата на активность регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов. Можно говорить лишь о возможной тенденции к повышению супрессирующей активности регуляторных Т-лимфоцитов па 3-5 сутки после введения препарата.

Исследование иммунореактивности на неродственные антигены проводили на мышах линии ВАЬВ/с, которым подкожно вводили серии препарата в дозе 10<ло Тцд.о и ЧСрез 7 СуТ0К внутривенно вводили эритроциты барана. Установили, что через 4 суток после введения эритроцитов количество АОК на селезенку достоверно не отличалось для кош рольной и опытной групп животных, что свидетельствовало об отсутствии угнетающего действия препарата на иммунный ответ на гетерологичный антиген.

В серии экспериментов было изучено аллергизирующее действие и аутоиммунные реакции организма при введении препарата. При изучении возможных анафилактических реакций морских свинок инфицировали трехкратно с интервалом в одни сутки препаратом в дозе 109"5 ТЦД5(). Спустя 21 сутки после последней инъекции проводили разрешение животных исследуемым препаратом в дозе используемой для сенсибилизации. Препарат «Канцеролизин» не вызывал анафилактической реакции сравнимой с группой животных положительного контроля. Результаты этих исследований свидетельствовали о том, что инфицирование препаратом не приводит к сенсибилизации организма животных, проявление которой при повторной встрече с антигеном выражается в реакции ГНТ.

Возможность аллергизирующего влияния препарата на организм оценивали также по продукции реагиноподобных антител (^ Е) у двукратно подкожно инъецированных с интервалом 21 сутки мышей линии ВАЬВ/с. Титры реагиноподобных антител оценивали через 5, 12, 19, 26, 33 суток. Полученные данные показали, что у животных, инфицированных препаратом, титр реагиноподобных антител не превышает показатели контрольной группы на протяжении всего срока наблюдения, что говорит об отсутствии формирования аллергического состояния у животных, обработанных препаратом.

Для исследования косвенного сенсибилизирующего эффекта препарата использовали мышей линии ВАЬВ/с, которых иммунизировали овальбумином и через 11 суток вводили серии препарата в дозе Ю9,0 ТЦД50. На 7, 12, 17 и 22-е сутки после инфицирования у животных отбирали кровь и определяли в полученных образцах сыворотки титры антител к овальбумину методом ИФА. Установили, что у животных опытной группы не наблюдалось снижения титра антител к овальбумину после введения препарата (по сравнению с группой животных положительного контроля), что свидетельствовало об отсутствии ингибирующе-го действия препарата на гуморальный иммунный ответ при предварительной иммунизации модельным антигеном.

Оценку развития ГЗТ проводили по методике основанной на изменении массы конечности животных. С этой целыо мышам линии Ва1Ь/с подкожно вводили серии препарата в дозе Ю9,0 ТЦД50 и спустя 5 суток в подушечку лапки вводили 2хЮ8,0 ТЦД50 препарата. Умеренный отек конечности развивался только у тех животных, которые были предварительно сенсибилизированы препаратом, что свидетельствует о том, что физиологический уровень ГЗТ обусловлен аденовирусным антигеном.

Немаловажным при проведении доклинических испытаний является оценка специфической активности и эффективности разрабатываемого препарата. В связи с этим были проведены сравнительные эксперименты по определению ре-пликативной активности мутантного штамма Ас1е12, входящего в состав препарата «Канцеролизин» на опухолевых р53-дефекгных и нормальных р53-позитивных культурах клеток человека. Аденовирусный препарат обладает инфекционной активностью дикого типа аденовируса 5-го серотипа для комплементарных клеток 293 и р53-дефектных опухолевых клеток (А431, 8\¥480, Нер2, СЗЗА) и в тоже время имеет существенные ограничения по репликации в нормальных фибробластах кожи человека. Таким образом, аденовирусный препарат

Канцеролизин» обладает селективной инфекционной активностью в отношении р53-дефектных опухолевых клеток человека.

В экспериментах на бестимусных nude мышах, при интратуморальном введении препарата «Канцеролизин» было показано выраженное ингибирование роста привитых р53-дефектных опухолей А431 (эпидермоидная карцинома человека).

Эффективное использование препарата «Канцеролизин» в медицинской практике связано с правильными условиями его хранения и транспортировки. В связи с этим необходимо было выбрать оптимальные условия для хранения и транспортирования препарата, позволяющие удерживать его специфическую активность в неизменном виде.

Как показали наши исследования, хранение препарата при температуре минус 20 °С приводит к значимому тысячекратному снижению специфической активности препарата уже через полгода хранения. При температуре хранения препарата минус 40 °С в течение года и минус 70 °С в течение двух лет не происходит снижения его специфической активности. Таким образом, препарат следует хранить при температуре минус 70 °С два года или при температуре минус 40 °С не более года.

В экспериментах, имитирующих транспортировку замороженного при минус 70 °С препарата «Канцеролизин» (3 ампулы с исходной активностью 9,5±0,51g ТЦДзо/мл) в термоконтейнере в условиях тающего льда термоэлементов в течение 8 часов, а также в морозильной камере при температуре минус 10 -13 ()С в течение 5 суток было показано, что транспортировка препарата без достоверного снижения его активности может быть осуществлена при температуре минус 10—13 °С в течение 5 суток. В тоже время нахождение препарата в условиях тающего льда термоэлементов сопровождалось значимым снижением его специфической активности в среднем на 1,2 lg за 8 часов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Вдовиченко, Галина Владимировна, Кольцово

1. Ашмарин И. П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962. 173 с.

2. Белицкий Г.А. Химический канцерогенез // Проблемы клинической медицины. 2006. № 1 (5). С. 10-15.

3. Борхсениус С.П., Чернова O.A. Микоплазмы: молекулярная и клеточная биология, патогенность, диагностика. Л.:Наука, 1989. 156 с.

4. Вардосанидзе К.В., Блинов В.М., Белявская В.А. и др. Соматические мутации в гене р53 у больных раком желудка // Вопросы онкологии. 2010. №2. С. 156161.

5. Вдовиченко Г.В., Петрищенко В.А, Сергеев A.A. и др. Доклинические исследования противоракового лечебного препарата «Канцеролизин» // Вопросы вирусологии. 2006. №6. С.39-42.

6. Вдовиченко Г.В., Радаева И.Ф., Сергеев A.A. и др. Создание банков перевиваемой культуры клеток 293 для производства антиракового вирусного лечебного препарата «Канцеролизин» // Биотехнология. 2006. №1. С.62-67.

7. Вирусология. Методы /Под ред. Б.Мейхи. М: «Мир», 1988. 384 с.

8. Вредные химические соединения. Неорганические соединения элементов IV групп. Справочник /Под ред. В.А. Филова. Л.: «Химия», 1988. 512 с.

9. Государственная фармакопея. XI издание. -М.: Медицина, 1990.

10. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов: Санитарные правила.- М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998.-127 с.

11. Доклинические испытания новых медицинских иммунологических препаратов. Основные положения. РД 42-28-8-89. М., 1989.

12. Злокачественные новообразования в России в 2009 году (заболеваемость и смертность) /Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Минздравсоцразвигия России», 2011. 260 с.

13. Ильина Т.В., Семенова Е.А., Проняева Т.Р. и др. Ингибирование обратной транскриптазы ВИЧ-1 арилзамещеными нафто- и антрахинонами //Доклады Академии Наук. 2002. Т. 382, №6. С. 829-832.

14. Имянитов E.H., Хансон К.П. Фундаментальная онкология: наиболее примечательные события 2004 года // Практическая онкология. 2005. Т.6, №1. С.1.

15. Качко A.B., Святченко В.А., Терновой В.А. и др. Варианты аденовируса типа 5 с делециями в ранних генах: способность к селективной репликации в р53-дефектных опухолевых клетках человека // Молекулярная биология клетки. 2003. Т.37, №5. С.868-875.

16. Киселев C.J1. Современная генная терапия: что это такое и каковы ее перспективы? // Практическая онкология. 2003. Т.4, №3. С. 167-174.

17. Колокольцова Т.Д. Создание аттестованных коллекций и банков культур клеток для научных исследований, производства препаратов, диагностики и лечения : дис. д-ра биол. наук : 03.00.23 / Колокольцова Т.Д. Щёлково, 2008.296 с.

18. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. 2002. Т.65. С.5-33.

19. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения // Российский онкологический сервер. 2001. URL: http://www.rosoncoweb.ru/libraiy/pub/01/index.htm (дата обращения 23.07.2009).

20. Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Юдина К.В. и др. Онколитические поксви-русы // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012. №1. С.8-15.

21. Методические указания. Аттестации перевиваемых клеточных линий-субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов. ГИСК им. J1.A. Тарасевича РД -42-28-10-89, 1989. 33 с.

22. Методические указания. Аттестации перевиваемых клеточных линий-субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов. Москва. ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича. МЗиСР РД -42-28-10-89, 2011.-33 с.

23. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям: Методические указания 4.1/4.2.588-96. М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. - 128 с.

24. Минздрав РФ. Госдоклад о состоянии здоровья населения в 1999 году.

25. Раджабли С.И., Крюкова Е.П. Сравнительный анализ дифференциальной окраски хромосом двух видов хомячков даурского и китайского // Цитология. 1973. Т. 15. №. 9. С. 1527-1531.

26. Рак // СМИ ВОЗ: Информационный бюллетень №297. 2009. URL:http://www.who.int7mediacentre/factsheets/fs297/ru/index.html (дата обращения 29.09.10).

27. Рак // СМИ ВОЗ: Информационный бюллетень №297. 2012. URL: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/ru/ (дата обращения 17.10.12).

28. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Хабриева Р.У. М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. 832с.

29. Святченко В. А., Тарасова М. В., Нетесов С. В. и др. Онколитические аденовирусы в терапии злокачественных новообразований: современное состояние и перспективы // Молекулярная биология. 2012. Т. 46, № 4. С. 556-569.

30. Порядок контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы. РД 42-28-10-90. М., 1989.

31. Трапезников II. Н., Аксель Е. М. Заболеваемость злокачественными новообразованиями и смертность от них населения стран СНГ в 1996 г. М.: ОНЦ РАМН. 1997.

32. Тюляндин С.А. Основные причины злокачественных опухолей: перспективы ближайшего будущего // Российский онкологический сервер. 1999. URL: http://www.rosoncoweb.ru/congress/eu/ecco/01.htm (дата обращения: 24.07.2009).

33. Тюляндин С.А. Мишени лекарственной терапии будущего // Российский онкологический сервер. URL: http://www.rosoncoweb.ru/congress/ru/03/14.htm (дата обращения 03.06.2010.).

34. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Современные представления о канцерогенезе рака шейки матки //Практическая онкология. 2002. Т.З, №3. С.145-155.

35. Чумаков П.М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме // Успехи биологической химии. 2007. Т.47. С.3-52.

36. Якубовская Р.И. Современные подходы к биотерапии рака // Российский биотерапевтический журнал. 2002. Т.1, №3. С.5-14.

37. Abonour R., Williams D.A., Einhorn L. et al. Efficient retrovirus-mediated transfer of the multidrug resistance 1 gene into autologous human long-term repopulating hematopoietic stem cells // Nat. Med. 2000. V.6. P.652-658.

38. Agapova L.S., Ivanov A.V., Sablina A.A. et al. p53-dependent effects of RAS oncogene on chromosome stability and cell cycle checkpoints // Oncogene. 1999. V. 18. P. 3135-3142.

39. Agarwal M.L., Taylor W.R., Chernov M.V. et al. The p53 network // J.Biol.Chem. 1998. V. 273. P. 1-4.

40. Agarwal M.L., Agarwal A., Taylor W.R. et al. A p53-dependent S-phase checkpoint helps to protect cells from DNA damage in response to starvation for pyrimidine nucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 14775-14780.

41. Alemany R. Cancer selective adenoviruses // Mol. Aspects Med. 2007. V. 28. P. 42-58.

42. Altaner C. Prodrug cancer gene therapy // Cancer Letters. 2008. V. 270 (2). P. 191 -201.

43. American Type Culture Collection, Catalogue of cell lines and hybridomas, 6th edition, Washington, 1988. Cell repository lines CRL, ATCC CRL 1573.

44. Amundson S.A., Myers T.G. and Fornace A.J.Jr. Roles for p53 in growth arrest and apoptosis: putting on the brakes after genotoxic stress // Oncogene. 1998. V.17. P. 3287-3299.

45. Angioli R., Estape R., Mason M. et al. Hereditary and sporadic ovarian cancer: genetic testing and clinical implications//Int. J. Oncol. 1998. V. 12. P. 1029-1034.

46. Au T., Thorne S., Korn W.M. et al. Minimal hepatic toxicity of Onyx-O15: spatial restriction of coxsackie-adenoviral receptor in normal liver // Cancer Gene Ther. 2007. V. 14. P. 139-150.

47. Bateman A., Bullough F., Murphy S. et al. Fusogenicmembrane glycoproteins as a novel class of genes for the local andimmune-mediated control of tumor growth // Cancer Research. 2000. V. 60. P. 1492-1497.

48. Bauzon M., Castro D., Karr M. et al. Multigene expression from a replicating adenovirus using native viral promoters // Mol. Ther. 2003. V. 7. P.526-534.

49. Benedict C.A., Norris P.S., Prigozy T.I. et al. Three adenovirus E3 proteins cooperate to evade apoptosis by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor-1 and -2 // J Biol. Chem. 2001. V.276. P.3270-3278.

50. Berk A.J. Adenoviridae. In: Fields Virology; eds. Knipe D.M. & Howley P.M. Philadelphia: Lippincott Williams&Wilkins, 2007. P. 2355-2394.

51. Bertwistle D. and Ashworth A. Functions of the BRCA1 and BRCA2 genes // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. V. 8. P. 14-20.

52. Bhat M.K., Yu C., Yap N. et al. The tumor suppressor p53 is a negative regulator in thyroidhormone receptor signaling pathways // J Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 28989-28993.

53. Bischoff J.R., Kirn D.H., Williams A. et al. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53 deficient human tumor cells // Science. 1996. V. 274. P. 373-376.

54. Blackwood M.A. and Weber B.L. BRCA1 and BRCA2: from molecular genetics to clinical medicine//J. Clin. Oncol. 1998. V. 16. P. 1969-1977.

55. Bol S.A., van Steeg H., Jansen J.G. et al. Elevated frequencies of benzo(a)pyrene-induced Hprt mutations in internal tissue of XPA-deficient mice // Cancer Res. 1998. V. 58(13). P. 2850-2856.

56. Brunori M., Malerba M., Kashiwazaki H. et al. Replicating adenoviruses that target tumors with constitutive activation of the wnt signaling pathway // Journal of Virology. 2001. V. 75. P. 2857-2865.

57. Cahill D.P., Lengauer C., Yu J. et al. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers // Nature. 1998. V. 392. P. 300-303.

58. Campbell R.B., Ying B., Kuesters G.M., Hemphill R. Fighting cancer: from the bench to bedside using second generation cationic liposomal therapeutics // J Phann Sci. 2009. V. 98(2). P.411-29.

59. Cassel W.A., Murray D.R. & Phillips M.S. A phase II study on the postsurgical management of stage II malignant melanoma with a Newcastle disease virus oncoly-sate // Cancer. 1983. V.52. P. 856-860.

60. Cerullo V., Pesonen S., Diaconu I. et al. Oncolytic Adenovirus Coding for Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor Induces Antitumoral Immunity in Cancer Patients // Cancer Res. 2010. V. 70. P. 4297-4309.

61. Chang F., Syrjanen S., Syrjanen K. Implications of p53 tumor suppressor gene in clinical oncology//J. Clin. Oncol. 1995. V. 13. P. 1009-1012.

62. Chase M., Chung R.Y. & Chiocca E.A. An oncolytic viral mutant that delivers the CYP2B1 transgene and augments cyclophosphamide chemotherapy // Nature Biotechnology. 1998 V.16. P. 444-448.

63. Chen L., Yu L.J. & Waxman D.J. Potentiation of cytochrome P450 cyclophosphamide-based cancer gene therapy by co-expression of the P450 reductase gene // Cancer Research. 1997. V. 57. P. 4830-4837.

64. Chou J., Kern E. R., Whitely R. et al. Mapping of herpes simplex virus neurovirulence to gamma 34.5, a gene nonessential for growth in culture // Science. 1990. V.250. P. 1262-1266.

65. Clarke L. & Waxman D.J. Oxidative metabolism of cyclophosphamide: identification of the hepatic monooxygenase catalysts of drug activation // Cancer Research. 1989. V. 49. P. 2344-2350.

66. Cleaver J.E. Defective repair replication of DNA in xeroderma pigmentosum // Nature. 1968. V.218. P.652-656.

67. Colombo M.P., Ferrari G., Stoppacciaro A. et al. Granulocyte colony-stimulating factor gene transfer supresses tumorigenicity of a murine adenocarcinoma in vivo // J. Exp. Med. 1991. V. 173(4). P. 889-897.

68. Crystal R.G., Mcelvaney N.G., Rosenfeld M.A. et al. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis // Nat. Genet. 1994. V. 8. P. 42-51.

69. Crompton A.M., Kirn D.II. From ONYX-O15 to armed vaccinia viruses: the education and evolution of oncolytic virus development // Curr. Cancer Drug'Targets. 2007. V. 7. P.133-139.

70. Di Leonardo A., Linke S.P., Clarkin K. et al. DNA damage triggers a prolonged p53-dependent G1 arrest and long-term induction of Cipl in normal human fibroblasts // Genes Dev. 1994. V. 8. P. 2540-2551.

71. Doronin K., Kuppuswamy M., Toth K. et al. Tissue-specific, tumor-selective, replication-competent adenovirus vector for cancer gene therapy // Journal of Virology. 2001. V. 75. P. 3314-3324.

72. Elledge S.J. Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis // Science. 1996. V. 274. P. 1664-1672.

73. Freytag S.O., Strieker H., Peabody J. et al. Five-year follow-up of trial of replication-competent adenovirus-mediated suicide gene therapy for treatment of prostate cancer//Mol. Ther. 2007. V. 15. P. 636-642.

74. Freytag S.O., Khil M., Strieker H. et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 4968-4976.

75. Forni G., Parmiani G., Guarini A. et al. Gene transfer in tumor therapy // Ann. Oncol. 1994. V. 5. P. 789-794.

76. Fujiwara T., Grimm E.A., Mukhopadhyay T. et al. Induction of chemosensitivi-ty in human lung cancer cells in vivo by adenovirus-mediated transfer of the wild-type p53 gene // Cancer.Res. 1994. V. 54. P.2287-2291.

77. Fukasawa K., Choi T., Kuriyama R. et al. Abnormal centrosome amplification in the absence ofp53 // Science. 1996. V. 271. P. 1744-1747.

78. Fukasawa K., Wiener F., Woud G.F.V. et al. Genomic instability and apoptosis are frequent in p53 deficient young mice // Oncogene. 1997. V. 15. P. 1295-1302.

79. Garber K. China approves world's first oncolytic virus therapy for cancer treatment // J. Natl. Cancer Inst. 2006. V. 98. P. 298-300.

80. Galanis E., Bateman A., Johnson K. et al. Use of viral fusogenic membrane gly-coproteinsas novel therapeutic transgenes in gliomas // Human Gene Therapy. 2001. V. 12. P. 811-821.

81. Galanis E., Abbruzzese J., Sze D. et al. Hepatic arterial infusion of a replication-selective oncolytic adenovirus (dl 1520): phase II viral, immunologic, and clinical endpoints // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 6070-6079.

82. Gallardo D., Drazan K.E., McBride W.H. Adenovirus-based transfer of wildtype p53 gene increases ovarian tumor radiosensitivity // Cancer Res. 1996. V. 56. P.4891-4893.

83. Graham F.L., Smiley J., Russell W.C. at al. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5 // J. Gen. Virol. 1977. V.36. P. 59-72.

84. Graham F.L., Harrison T., Williams J. et al. Defective transforming capacity of adenovirus type 5 host-range mutants // Virology. 1978. V. 86. P. 10-21.

85. Giaccia A.J. and Kastan M.B. The complexity of p53 modulation: Emerging patterns from divergent signals // Genes Dev. 1998. V.12. P. 2973-2983.

86. Gooding L.R. Regulation of TNF-mediated cell death and inflammation by human adenoviruses // Infect. Agents Dis. 1994. V. 3. P.106-115.

87. Golumbek P.T., Lazenby A.J., Levitsky H.I. et al. Treatment of established renal cancer by tumor cells engineered to secrete interleukin-4 // Science. 1991. V. 254 (5032). P. 713-716.

88. Gromeier M., Lachmann S., Rosenfield M.R. et al. Intergenic poliovirus recombinants for the treatment ofmalignant glioma // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2000. V. 97. P.6803-6808.

89. Grote D., Russell S.J., Corni T.I. et al. Live attenuated measles virus induces regression of human lymphoma xenografts in immunodeficient mice // Blood. 2001. V.97. P. 3746-3754.

90. Hackett N.R., Crystal R.G. Adenovirus vectors for gene therapy. In: Templeton NS, Lasic DD, eds. Gene Therapy. New York: Marcel Dekker, 2000. P. 17-39.

91. Hallenbeck P.L., Chang Y.-N., Hay C. et al. A novel tumor-specific replication restricted adenoviral vector for gene therapy of hepatocellular carcinoma // Human Gene Therapy. 1999. V. 10. P. 1721-1733.

92. Harrach B., Benko M., Both G.W. et al. Adenoviridae. In: Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses; eds. King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.B. & Lefkowitz E.J. San Diego: Elsevier Academic Press, 2011.

93. Harris C.C. Structure and function of the p53 tumor supressor gene: clues for rational cancer therapeutic strategies // Cancer. Inst. 1996. V. 88. P. 1442-1455.

94. Harvey M., Sands A.T., Weiss R.S. et al. In vitro growth characteristics of embryo fibroblasts isolated from p53-deficient mice // Oncogene. 1993. V.8. P. 24572467.

95. Heise C., Ganly I., Kim Y.T. et al. Efficacy of a replication-selective adenovirus against ovarian carcinomatosis is dependent on tumor burden, viral replication and p53 status//Gene Ther. 2000. V.7. P. 1925-1929.

96. Hermiston T.W., Kuhn I. Armed therapeutic viruses: strategies and challenges to arming oncolytic viruses with therapeutic genes // Cancer Gene Ther. 2002. V.9. P.1022-1035.

97. Hollstein M., Sidransky D., Vogelstein B. et al. p53 mutations in human cancers // Science. 1991. V.253. P. 49-53.

98. Jiang G., Xin Y., Zheng J.-N. et al. Combining conditionally replicating adenovirus-mediated genetherapy with chemotherapy: a novel antitumor approach // Int.J.Cancer. 2011. V. 129. P. 263-274.

99. Jia II., Kling J. China offers alternative gateway for experimental drugs // Nat. Biotechnol. 2006. V. 24. P. 117-118.

100. Jia W.W., McDermott M., Goldie J. et al. Selective destruction of gliomas in immunocompetent rats by thymidine kinase-defective herpes simplex virus type I // Journal of the National Cancer Institute. 1994. V. 86. P. 1209-1215.

101. Katayose D., Gudas J., Nguyen I.IL et al. Cytotoxic effects of adenovirus-mediated wild-type p53 protein expression in normal and tumor mammary epithelial cells//Clin. Cancer Res. 1995. V. 1. P. 889-897.

102. Kelly E. and Russell S.J. History of oncolitic viruses: genesis to genetic engineering // Molecular Therapy. 2007. V. 15 (4). P. 651-659.

103. Khan S.H. and Wahl G.M. p53 and pRb Prevent Rereplication in Response to Microtubule Inhibitors by Mediating a Reversible G1 Arrest // Cancer Res. 1998. V. 58. P. 396-401.

104. Kirn D., Thorne S. Targeted and armed oncolytic poxviruses: a novel multi-mechanistic therapeutic class for cancer // Nature reviews. Cancer. 2009. V. 9(1). P. 64-71.

105. Ko L.J. and Prives C. p53: puzzle and paradigm // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 1054-1072.

106. Kolodner R. Biochemistry and genetics of eukaryotic mismatch repair // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 1433-1442.

107. Kurihara T., Brough D.E., Kovesdi I. et al. Selectivity of a replication-competent adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUC1 antigen // Journal of Clinical Investigation. 2000. V. 106. P. 763-771.

108. Lanni J.S. and Jacks T. Characterization of the p53 dependent postmitotic checkpoint following spindle dis- ruption // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 10551064.

109. Lee J.M., Abrahamson L.A., Kandel R. et al. Susceptibility to radiation-carcinogenesis and accumulation of chromosomal breakage in p53 deficient mice // Oncogene. 1994. V. 9. P. 3731-3736.

110. Lengauer C., Kinzler K.W. and Vogelstein B. Genetic instabilities in human cancers // Nature. 1998. V. 396. P. 643-649.

111. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division // Cell. 1997. V. 88. P. 323-331.

112. Linke S.P., Clarkin K., Di Leonardo A. et al. A reversible, p53-dependent G0/G1 cell cycle arrest induced by ribonucleotide depletion in the absence of detectable DNA damage // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 934-947.

113. Linke S.P., Harris M.P., Neugebauer S. et al. p53-mediated accumulation of hypophosphorylated pRb after the G1 restriction point fails to halt cell cycle progression // Oncogene. 1997. V.15. P. 337-345.

114. Livingstone L.R., White A., Sprouse J. et al. Altered cell cycle arrest and gene amplification potential accompany loss of wild-type p53 // Cell. 1992. V. 70. P. 923935.

115. Lowe S.W., Bodis S., McClatchey A. et al. p53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo // Science. 1994. V. 266. P. 807-810.

116. Lu W., Zheng S., Li X.F. et al. Intra-tumor injection of H101, a recombinant adenovirus, in combination with chemotherapy in patients with advanced cancers: a pilot phase II clinical trial // World J. Gastroenterol. 2004. V. 10. P. 3634-3638.

117. Lynch H.T., Fusaro R.M. and Lynch J.F. Cancer genetics in the new era of molecular biology // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997. V. 833. P. 1 -28.

118. Lubin R., Zalcman G., Bouchet L. et al. Serum p53 antibodies as early markers of lung cancer // Nat. Med. 1995. V. 1. P. 701 -702.

119. Marmorstein L.Y., Ouchi T. and Aaronson S.A. The BRCA2 gene product functionally interacts with p53 and RAD51 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95. P. 13869-13874.

120. Martinez-Salas E., Ramos R., Lafuente E. et al. Functional interactions in internal translation initiation directed by viral and cellular IRES elements // Journal of General Virology. 2001. V. 82. P.973-984.

121. Martuza R., Malick A. & Markert J.M. Experimental therapy of human gliomas by means of a genetically-engineered virus mutant // Science. 1991. V. 252. P. 854855.

122. Marbert J. M., Malick A., Coen D. M. et al. Reduction and elimination of encephalitis in an experimental glioma therapy model with attenuated herpes simplex mutants that retain susceptibility to acyclovir // Neurosurgery. 1993. V.35. P. 597-603.

123. Mineta T., Rabkin S. D. & Martuza R. L. Treatment of malignant gliomas using ganciclovir hypersensitive ribonucleotide reductase deficient herpes simplex virus mutant // Cancer Research. 1994. V. 54. P. 3963-3966.

124. Miyatake S.-I., Tani S., Feigenbaum F., et al. Hepatoma-specifc anti-tumor activity of an albumin enhancer promoter regulated herpes simplex virus in vivo // Gene Therapy. 1999. V.6. P. 564-572.

125. Mullen J.T., Tanabe K.K. Viral oncolysis // Oncologist. 2002. V.7. P.106-119.

126. Murakami H. and Okayama H. Cell cycle checkpoint control // Exp. Mol. Med. 1997. V. 29. P. 1-11.

127. Murray A.W. The genetics of cell cycle checkpoints // Curr. Opin. Genet. Dev. 1995. V.5. P. 5-11.

128. Nemunaitis J., Khuri F., Ganly I. et al. Phase II trial of intratumoral administration of ONYX-O15, a replication-selective adenovirus, in patients with refractory head and neck cancer// J Clin. Oncol. 2001. V.19. P.289-298.

129. Nemunaitis J., Swisher S.G., Timmons T. et al. Adenovirus-mediated p53 gene transfer in sequence with cisplatin to tumors of patients with non-small-cell lung cancer//J. Clin. Oncol. 2000. V.18. P. 609-622.

130. Nokisalmi P., Pesonen S., Escutenaire S. ct al. Clinical data from cancer patients treated with triple modified oncolytic adenovirus Ad5/3-Cox2L-D24 // Human Gene Ther. 2008. V. 19. P. 1076.

131. Nokisalmi P., Pesonen S., Escutenaire S. et al. Oncolytic Adenovirus ICOV1R-7 in Patients with Advanced and Refractory Solid Tumors // Clin. Cancer. Res. 2010. V. 16. P. 3035-3043.

132. Orr-Weaver T.L. and Weinberg R.A. A checkpoint on the road to cancer // Nature. 1998. V. 392. P. 223-224.

133. Ouchi T., Monteiro A.N.A., August A. et al. BRCA1 regulates p53-dependent gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 2302-2306.

134. Paulovich A.G., Toczyski D.P. and Hartwell L.H. When checkpoints fail // Cell. 1997. V. 88. P. 315-322.

135. Pawlik T.M., Nakamura H., Yoon S.S. et al. Oncolysis of diffuse hepatocellular carcinoma by intravascular administration of a replication competent, genetically engineered herpesvirus // Cancer Research. 2000. V. 60. P.2790-2795.

136. Peng Z. Current status of gendicine in China: recombinant human Ad-p53 agent for treatment of cancers // Hum.Gene Ther. 2005. V.16. P. 1016-1027.

137. Pesonen S., Helin H., Nokisalmi P. et al. Oncolytic adenovirus treatment of a patient with refractory neuroblastoma // Acta Oncol. 2010. V. 49. P. 120-122.

138. Pesonen S., Nokisalmi P., Escutenaire S. et al. Prolonged systemic circulation of chimeric oncolytic adenovirus Ad5/3-Cox2LD24 in patients with metastatic and refractory solid tumors // Gene Ther. 2010. V. 17. P. 892-904.

139. Pirollo K.F., Hao Z., Rait A. et al. p53 mediated sensitization of squamous cell carcinoma of the head and neck to radiotherapy // Oncogene. 1997. V. 14. P. 17351746.

140. Prives C. Signalling to p53: breaking the p53: Mdm2 circuit // Cell. 1998. V.95. P. 5-8.

141. Prives C. How loops, P sheets, and a2 helices help us to understand p53 // Cell. 1994. V.78. P. 543-546.

142. Pruckler J.M., Pruckler J.M., Ades E.W. Detection by polymerase chain reaction of all common mycoplasma in a cell culture facility // Pathobiology. 1995. V.63. P. 9-11.

143. Ponder B.A.J. Cancer genetics // Nature. 2001. V.411. P.336-34.

144. Rheinwald J., Green I I. Serial cultivation of strains of human epidermal kerati-nocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells // Cell. 1975. V. 6. P.331-343.

145. Ring C.J.A. Cytolytic viruses as potential anti-cancer agents // Journal of General Virology. 2002. V.83. P. 491-502.

146. Rodriguez R., Schuur E.R., Yeong Lim H. et al. Prostate attenuated replication competent adenovirus (ARCA) CN706: a selective cytotoxic for prostate-specific antigen-positive prostate cancer cells. Cancer Research. 1997. V.57. P.2559-2563.

147. Rosenberg S.A., Yanneli J.R., Yang J.C. et al. Treatment of patients with metastatic melanoma with autologous tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin 2 //J. Natl. Cancer. Inst. 1994. V. 86. P. 1159-1166.

148. Russell W.C. Update on adenovirus and its vectors // J. Gen.Virol. 2000. V. 81. P. 2573-2604.

149. Sablina A., Ilyinskaya G., Rubtsova S. et al. Activation of p53-mediated cell cycle checkpoint in response to micronuclei formation. // J. Cell Science. 1998. V. 111. P. 977-984.

150. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989. V. 1 3.

151. Seino K.I., Kayagaki N., Okumura K. et al. Antitumor effect of locally produced CD95 ligand//Nature Med. 1997. V. 3. P. 165-170.

152. Seth P. Vectors for cancer gene therapy In: Gene therapy in the treatment of cancer: Past accomplishments and future prospects; eds. Huber B.E. and Magrath I. Cambridge: Cambridge University Press, 1998. P.41-77.

153. Seth P., Katayose D., Li Z. et al. A recombinant adenovirus expressing wild type p53 induces apoptosis in drug-resistant human breast cancer cells: A gene therapy approach for drug-resistant cancers // Cancer Gene Ther. 1997. V. 4. P.383-390.

154. Sherr C.J. Cancer cell cycles // Science. 1996. V. 274. P. 1672-1677.

155. Shinoura N., Yoshida Y., Tsunoda R. et al. Highly attenuated cytopathic effect of a fiber-mutant EIB-defective adenovirus for gene therapy of gliomas // Cancer Research. 1999. V. 59. P. 3411-3416.

156. Shirakawa T. The current status of adenovirus-based cancer gene therapy // Mol. Cells. 2008. V. 25. P. 462-466.

157. Springer C.J., Niculescu-Duvaz I. Prodrug-activating systems in suicide gene therapy//J Clin. Invest. 2000. V.105.P. 1161-1167.

158. Stojdl D.F., Lichty B., Knowles S. et al. Exploiting tumor-specific defects in the interferon pathway with a previously unknown oncolytic virus // Nature Medicine. 2000. V. 6. P. 821-825.

159. Strong J.E., Coffey M.C., Tang D. et al. The molecular basis of viral oncolysis : usurpation of the Ras signaling pathway by reovirus // EMBO Journal. 1998. V.12. P. 3351-3362.

160. Stubdal I I., Perin N., Lemmon M. et al. A prodrug strategy using ONYX-O15-based replicating adenoviruses to deliver rabbit carboxylesterase to tumor cells for conversion of CPT-11 to SN-38 // Cancer Res. 2003. V.63. P. 6900-6908.

161. Sze D.Y., Freeman S.M., Slonim S.M. et al. Young Investigator Award: intraarterial adenovirus for metastatic gastrointestinal cancer: activity, radiographic response, and survival // J. Vase. Interv. Radiol. 2003. V. 14. P. 279-290.

162. Taylor W.R., Agarwal M., Agarwal A. et al. P53 inhibits entry into mitosis when DNA synthesis is blocked // Oncogene. 1999. V. 18. P. 283-295.

163. Teng M.N., Park B.N., Koeppen K.W. et al. Long-term inhibition of tumor growth by tumor necrosis factor in the absence of cachexia or T-cell immunity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 3535-3539.

164. Tepper R.I., Pattengale P.K., Leder P. Murine interleukin-4 displays potent antitumor activity in vivo // Cell. 1989. V.57. P. 503-512.

165. Todo T., Rabkin S.D., Sundaresan P. et al. Systemic antitumor immunity in experimental brain tumor therapy using a multimutated, replication-competent herpes simplex virus // Hum Gene Ther. 1999. V.10. P. 2741-2755.

166. Toth K. and Wold William S.M. Increasing the Efficacy of Oncolytic Adenovirus Vectors // Viruses. 2010. V.2. P. 1844-1866.

167. Tollefson A., Scaria A., Hermiston T.W. et al. The adenovirus death protein (E3-11±6K) is required at late stages of infection for efficient lysis and release of adenovirus from infected cells // Journal of Virology. 1996. V. 70. P. 2296-2306.

168. Tollefson A.E., Ryerse J.S., Scaria A. et al. The E3-11.6-kDa adenovirus death protein (ADP) is required for efficient cell death: characterization of cells infected with adp mutants // Virology. 1996. V. 220. P. 152-162.

169. Triozzi P.L., Allen K.O., Carlisle R.R. et al. Phase I Study of the Intratumoral Administration of Recombinant Canarypox Viruses Expressing B7.1 and Interleukin 12 in Patients with Metastatic Melanoma // Clin. Cancer Res. 2005. V. 11. P.4168.

170. Qing He, Yang Liu, Qing Zou et al. Transarterial injection of H101 in combination with chemoembolization overcomes recurrent hepatocellular carcinoma // World J. Gastroenterol. 2011. V. 17(18). P. 2353-2355.

171. Qin Z. and Blankenstein T. Tumor growth inhibition mediated by lymphotoxin: evidence of B lymphocyte involvementin the antitumor response // Cancer Res. 1995. V. 55. P. 4747-4751.

172. Reid T., Galanis E., Abbruzzese J. et al. Intra-arterial administration of a replication-selective adenovirus (dl 1520) in patients with colorectal carcinoma metastatic to the liver: a phase I trial // Gene Ther. 2001. V. 8. P. 1618-1626.

173. Reid T.R., Freeman S., Post L. et al. Effects of Onyx-O15 among metastatic colorectal cancer patients that have failed prior treatment with 5-FU/leucovorin // Cancer Gene Ther. 2005. V. 12. P. 673-681.

174. Requirements for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals (Requirements for Biological Substances №.50). World Health Organization Technical Report Series, №878, 1998. 57 p.

175. Ring C.J.A. Adenovirus vectors In Gene Therapy: Oxford: Bios Scientific Publishers; eds. N. R. Lemoine & D. N. Cooper: 1996. P. 61-76.

176. Rommelaere J. & Tattershall P. Oncosuppression by parvoviruses: In Handbook of Parvoviruses; eds. P. Tijssen. Boca Raton, FL: CRC Press, 1990. P. 41-57.

177. Rudner A.D. and Murray A.W. The spindle assembly checkpoint // Curr. Opin. Cell Biol. 1996. V.8. P. 773-80.

178. Vaillancourt M.T., Atencio I., Quijano E. et al. Inefficient killing of quiescent human epithelial cells by replicating adenoviruses: potential implications for their use as oncolytic agents // Cancer Gene Ther. 2005. V.12. P. 691-698.

179. Vattemi E. and Claudio P.P. Adenoviral gene therapy in head and neck cancer // Drug News Perspect. 2006. V.19. P. 329-337.

180. Vogelstein B., Kinzler W.K. X-rayes strike p53 again // Nature. 1994. V.370. P. 174-175.

181. Volpert OV, Stellmach V, Bouck N. The modulation of thrombospondin and other naturally occurring inhibitors of angiogenesis during tumor progression // Breast Cancer Res. Treat. 1995. V. 36. P.l 19-126.

182. Vorburger S.A. & Hunt K.K. Adenoviral gene therapy // The Oncologist. 2002. V.7. P. 46-59.

183. Wang H., Prasad G., Buolamwini J.K. et al. Antisense anticancer oligonucleotide therapeutics // Curr Cancer Drug Targets. 2001. V.l (3). P. 177-196.

184. Wang Q., Zhang H., Kajino K. et al. BRCA1 binds c-Myc and inhibits its transcriptional and transforming activity in cells // Oncogene. 1998. V. 17. P. 19391948.

185. Waterman J.L., Shenk J.L., Halazonetis T.D. The dihedral symmetry of the p53 tetramerization domain mandates a conformational switch upon DNA binding // EMBOJ. 1995. V.14. P. 512-519.

186. Weber J.S., Jeffery G., Marty V. et al. A phase I trial of GPlOO/tyrosinase peptide-pulsed dendritic cells for metastatic melanoma Abstract 1664. American Society of Clinical Oncology 35th Annual Meeting, Atlanta, 1999.

187. Wei M.X., Tamiya T., Chase M. et al. Experimental tumor therapy in mice with the cyclophosphamideactivating cytochrome P450 2B1 // Human Gene Therapy. 1994. V. 5. P. 969-978.

188. Wildner O. & Morris J.C. The role of E1B 55 kDa gene product in oncolytic adenoviral vectors expressing herpes simplex virus tk: assessment of antitumor efficacy and toxicity // Cancer Research. 2000. V. 60. P.4167-4174.

189. Wildner O. & Morris J.C. Therapy of peritoneal carcinomatosis from colon cancer with oncolytic adenoviruses // Journal of Gene Medicine. 2000. V. 2. P.353-360.

190. Yin Y., Tainsky M.A., Bishoff F.Z. Wild-type p53 restores cell cycle control and inhibits gene amplification in cells with mutant p53 alleles // Cell. 1992. V.70 (6). P. 937-948.

191. Yu D.-C., Chen Y., Seng M. et al. The addition of adenovirus type 5 region E3 enables calydon virus 787 to eliminate distant prostate tumor xenografts // Cancer Research. 1999. V. 59. P.4200-4203.

192. Yu W., Fang H. Clinical trials with oncolytic adenovirus in China // Current Cancer Drug Targets. 2007. V. 7. P. 141-148.

193. Zabng J.Y. Apoptosis-bsed anticancer drugs // Nat.Rev.Drag.Discov. 2002. V. 1(2). P. 101-102.

194. Zauberman A., Lubp A., Oren M. Identification of p53 target genes through immune selection of genomic DNA: The cyclin G gene contains two distinct p52 binding sites // Oncogene. 1995. V. 10. P. 2361 -2366.

195. Zhang H., Tombline G. and Weber B.L. BRCA1, BRCA2, and DNA Damage Response: Collision or Collusion? // Cell. 1998. V. 92. P. 433-436.

196. Zhang H., Somasundaram K., Peng Y. et al. BRCA1 physically associates with p53 and stimulates its transcriptional activity // Oncogene. 1998. V. 16. P. 1713-1721.

197. Zhang L., Kashnachi F., Zhan Q. et al. Regulation of insulin like growth factor II P3 promoter activity by p53: A potential mechanism for tumorigenesis // Cancer Res. 1996. V.56. P. 1367-1373.

198. Zhang L., Zhan Q., Zhan S. et al. Regulation of human insulin-like growth factor-II P4 promoter by p53 //DNA Cell Biol. 1998. V. 17. P. 125-131.