Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белок DAXX и механизмы его локализации в ядерных доменах ND10

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сотников, Алексей Геннадьевич

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Функциональная компартаментализация клеточного ядра

1.1.1. Ядрышко

1.1.2. Расположение хромосом и их участков в интерфазе

1.1.3. Локализация транскрипции и сплайсинга РНК

1.1.4. Организация, состав доменов ND10 и их клиническое значение

1.1.4.1. Заболевания, связанные с ядерными доменами ND

1.1.4.2. Белок PML

1.1.4.3. Белок SP

1.1.4.4. Антиген NDP

1.1.4.5. Белок INT

1.1.4.6. Белок СВР

1.1.4.7. Белок DAXX

1.2. Модификация белков малыми убиквитин-подобными белками

SUMO )

1.3. Получение моноклональных антител - современное состояние проблемы

1.3.1. Гибридомная технология

1.3.2. Получение моноклональных антител с помощью фагового дисплея

1.3.3. Получение моноклональных антител в препаративных количествах

2. Материалы и Методы

2.1. Реактивы

2.2.Амплификация и клонирование

2.3. Получение слитных белков

2.4. Иммунизация мышей

2.5. Слияние спленоцитов

2.6. Скрининг клонов методом твердофазного иммуноферментного анализа ELISA

2.7. Иммуноблотинг

2.8. Иммуноцитохимическое окрашивание

2.9. Трансфекция эукариотических клеток

2.10. Экспрессия в эукариотических клетках

2.11. Дрожжевая дигибридная систем

3. Результаты и Обсуждение

3.1. Анализ данных группы Жалино о накоплении белка INT-6 в ядерных доменах

3.2. Проверка данных группы Эванса о накоплении гистонацетилазы СВР в ядерных доменах ND

3.3. Исследование взаимодействия белка DAXX с белками PML и SP10 0 в дрожжевой дигибридной системе

3.4. Локализация белка DÄXX в клетках с отсутствием экспрессии белка SP

3.5. Локализация белка DAXX в мышиных фибробластах дикого типа и мутантных по гену белка PML

3.6. Значение модификации малыми убиквитин-подобными белками-модификаторами белка PML для накопления белка DAXX в ЫБЮ

3.7. Получение и характеристика моноклональных антител к белку Ш\ХХ человека

3.7.1. Выделение слитного белка БАХХ для иммунизации

3.7.2. Получение гибридомы, продуцирующей МКА к белку ШХХ человека

3.7.3.

Определение аминокислотной последовательности, узнаваемой полученными МКА

3.7.4. Получение препарата МКА для экспериментов по иммунопреципитации

3.7.5. Характеристика антител в тесте иммунопреципитации

Выводы Литература

Введение Диссертация по биологии, на тему "Белок DAXX и механизмы его локализации в ядерных доменах ND10"

Ядерные домены ND10, называемые также PML тела (PML bodies), являются дискретными интерхроматиновыми образованиями, которые впервые были обнаружены цитохимически при помощи антител, случайно полученных на аутоантиген неизвестной природы (Ascoli and Maul,1991). В дальнейшем, было показано, что ND10 являются местами локализации целого ряда белков (PML, SplOO, pRB) , (Sternsdorf et al,1997 Kamitani et al., 1998), большинство из которых модифицированы убиквитин-подобными малыми белками-модификаторами (small ubiquitin-like modifiers SUMO) (Maul et al,2000). Кроме того, было обнаружено, что ND10 служат местами первичной локализации, транскрипции и репликации некоторых ДНК-вирусов (вируса SV4 0, вирус простого герпеса, аденовируса V) (Ishov and Maul,1996, Ishov et al, 1997). Все эти вирусы за исключением SV40 продуцируют белки, накопление которых либо модифицирует ND10, либо ведет к деградации белков, ассоциированных с ND10 (Maul, 1998). Деградация ND10, в свою очередь, сопровождается гидролизом изопептидных связей между белками-модификаторами SUMO и белками, ассоциированными с ND10, а, в дальнейшем, и их деградацией по убиквитин-протеосомному пути (Everett et al., 1998,1999). Инкубация клеток с интерфероном ведет к увеличению числа и размеров ND10 за счет повышенния экспрессии SplOO и PML (Lavau et al,1995;Grotzinger et al.,1996). В совокупности эти данные позволяют выдвинуть гипотезу, что ND10 являются своеобразным клеточным белковым «депо», регулируемым по принципу «накопление-сброс» (Maul, 1998;Ishov et al,) . Однако, эта гипотеза до сих пор не получила достаточного фактического обоснования.

Разноплановые исследования ND10, в первую очередь, -анализ их функции и механизма формирования, могут пролить свет на многие неясные в настоящее время общие принципы становления, как внутриядерной, так, в общем, и внутриклеточной компартаментализации.

В этой связи представляется черезвычайно важным исследование свойств и функций отдельных белков, ассоциированых с ND10, в частности, недавно описанного белка DAXX (death domain associated protein). Данный белок DAXX был впервые обнаружен в дрожжевой дигибридной системе, как взаимодействующий с белком fas, одним из ключевых белков апоптоза (Yang et al, 1997). В дальнейшем, в дрожжевой дигибридной системе было показано взаимодействие DAXX с центромерным белком CENP-C (Pluta et al, 1998), транскрипционным фактором РахЗ (Hollenbach et al.,1998) и ДНК-метилтрансферазой I (Michaelson et al.,1999). Поликлональные антитела к DAXX узнают ND10 при иммуноцитохимическом окрашивании клеток.

Данная работа посвящена изучению белка DAXX в смысле его отношений к другим белкам, ассоциированным с ND10, механизма локализации в ND10, возможной функции. Цели и задачи исследования.

Главной целью работы являлось выяснение структурных особенностей белка DAXX, обеспечивающих его локализацию в ядерных доменах ND10. Кроме того, предстояло исследовать, взаимодействует ли DAXX с белками, ассоциированными с ND10 и, если взаимодействует, то с какими. Исходя из этого были поставлены следующие конкретные экспериментальные задачи:

1. Исследовать взаимодействие белка DAXX с PML и SP100 с использованием дигибридной системы.

2. Исследовать локализацию различных делеционных вариантов DAXX в ядре с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP).

3. Получить моноклональные антитела к белку DAXX и с их помощью подтвердить данные о локализации DAXX в ND10.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Локализация белка DAXX в ядерных доменах ND10 зависит от наличия в клетке белка PML.

2. Белок PML способен к взаимодействию с DAXX и обеспечивает локализацию последнего в ND10, только будучи модифицирован малыми убиквитин-подобными белками модификаторами SUMO.

Научная новизна. В данной работе впервые был картирован участок белка DAXX, ответственный за локализацию в ND10. Установлено, что этот же участок отвечает за взаимодействие с PML в дигибридной системе.

Была показана прямая зависимость внутриядерной локализации DAXX от наличия в клетке PML. Установлено, что в отсутствие PML, DAXX локализуется на гетерохроматине. Кроме того, представлены новые данные, выясняющие возможный механизм формирования ядерных доменов: в случае образования ND10 существенным является предварительная модификация PML малыми убиквитин-подобными белками-модификаторами (SUMO).

Впервые были получены моноклональные антитела, специфичные к белку DAXX человека. Эти антитела были всесторонне охарактеризованы, показана возможность их использования для экспериментов по непрямой иммунофлуоресценции, иммунопреципитации, Вестерн-блоттингу. Методом делеционного анализа картирована область белка, содержащая зпитоп, узнаваемый полученными антителами.

Дополнительно проведены эксперименты по разработке и апробированию оригинального метода, позволяющего быстро и с минимальными затратами получать в высоких концентрациях моноклональные антитела любых классов без стадии афинной хроматографии.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в работе результаты важны для понимания механизмов формирования ядерных доменов и локализации белков в клетке.

С практической точки зрения полученные моноклональные антитела уже сейчас широко используются для исследований белка БАХХ в ряде лабораторий. Предложенный метод получения моноклональных антител в высоких концентрациях имеет преимущества перед применяемым в настоящее время методом моноклонального асцита с последующей очисткой на носителях с белками А , С или Ь. Результаты и основные теоретические выводы работы могут быть использованы при чтении лекций по клеточной биологии (ее частных разделов, касающихся биологии ядра) на биологических факультетах университетов и медицинских институтов, а также в аудиториях с биотехнологической специализацией.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 38 и 39 конференциях Американского Общества клеточной биологии (Сан-Франциско, 1999, Вашингтон,2000), а также на семинарах Лаборатории Структурной Организации Генома, Лаборатории Защитных Механизмов Клетки и Лаборатории Морфологии Клетки Института Цитологии РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано три печатных работы.

Структура и обгьём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертация изложена на 8 8 страницах машинописного текста, иллюстративный материал включает 7 рисунков и 2 таблицы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сотников, Алексей Геннадьевич, Санкт-Петербург

1. Келер Г. Метод получения гибридом.//Методы исследования в иммунологии. М., 1983. С.402-406

2. Ascoli, С.A., and G.G. Maul. 1991. Identification of a novel nuclear domain.J.Cell Biol.112:785-795.

3. Andris-Widhopf J., Rader C., Steiberger P., Fuller R., Barbas C.F. Methods for the generation of chiken monoclonal antibody fragments by phage display. Journal of immunological Methods 242 (2000) 159-181

4. Barbas C.F. 3rd, Kang A.S., Lerner R.A.,Benkovic S.J., Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site.Proc Natl Acad Sci USA. 1991 Sep 15;88 (18) :7978-82.

5. Beck J.S.: Variations in the morphological patterns of "autoimmune" nuclear fluorescence. Lancet 1961, 1: 12031205.

6. Bernstein R.M. 1984 Antinuclear antibodies in primary biliarycirrhosis. Lancet 1, 508 Letter.

7. Bernstein R.M., Neuberger J.M., Bunn C.C., Callender M.E.,Hughes G.R. and Williams R. 1984 Diversity of autoantibodies in primary biliary cirrhosis and chronic active hepatitis, Clin. Exp.Immunol. 55, 553-560

8. Bjorck L.1988. Protein L. A novel bacterial cell wall protein with affinity for Ig L chains. J.Immunology 140(4) 1194-7

9. Boddy M.N., Howe K., Etkin L.D., Solomon E., Freemont P.S.1996.PIC1, a novel ubiquitin-like protein which interacts with the PML component of a multiprotein complex that is disrupted in acute promyelocytic leucaemia. Oncogene 13:971-82

10. Buschmann T, Fuchs S.Y., Lee C.G., Pan Z.Q., Ronai Z. SUMO-1 modification of Mdm2 prevents its self-ubiquitination and increases Mdm2 ability to ubiquitinate p53. Cell. 2000 Jun 23;101 (7):753-62.

11. Carmo-Fonseca M., Pepperkok R., Carvalho M.T., Lamond A.I. 1992. Transcription-dependent colocalization of the Ul, U2, U4/U6 and U5 snRNPs in coiled bodies. Journal of Cell Biology 117:1-14

12. Cho Y.,Lee I., Maul G.G., Yu E. 1998. A novel substructure, ND10: Distribution in normal and neoplastic human tissues. International Journal of Molecular Medicine 1: 717-724

13. Daujat S., Neel H. And Piette J. MDM2: life without p53. Trends in Genetics Vol.17 No.8 August 2001

14. Devor E.J., Molecular archeology of an SP100 splice variant revisited: dating the retrotranscription and Alu insertion events. Genome Biology 2001, 2(9)

15. Desterro JM., Rodriguez M.S.,Hay R.T. 1998. SUMO-1 modification of I B inhibits NF-B activation. Mol. Cell 2:233-39

16. Duprez E., Saurin A.J., Desterro J.M., Lallemand-Breitenbach V., Howe K., et al. 1999. SUMO-1 modification of the acute promyelocytic leucaemia protein PML: implications for nuclear localisation. J. Cell Sci. 112:381-93

17. Everett, R.D., P.Freemont, H.Saiton, M.Dasso, A.Orr M.Kathoria, and J. Parkinson. 1998. The disruption of ND10 during herpes simplex virus infection correlates with the VmwllO- and proteasome-dependent loss of several PML isoforms. J.Virol.72:6581-6591

18. Falkenberg, F.W. 1998. Production of monoclonal antibodies in the miniPERM bioreactor: comparison with other hybridoma culture methods. Res Immunol. Jul-Aug;149(6):560-70.

19. Ferguson M., Ward D.C.: Cell cycle dependent chromosomal movement in pre-mitotic human T-lymphocyte nuclei. Chromosoma 1992, 101:557-565

20. Gall J.G.,2000. Cajal bodies: The first 100 years. Annu.Rev.Cell Dev.Biol. 16:273-300

21. Gall J.G., Bellini M., Wu Z., Murphy C. 1999. Assembly of the transcription and processing machinery. Cajal bodies (coiled bodies) and transcriptosomes. Mol. Biol. Cell. 10: 4385-4402

22. Gall J.G., Tsvetkov A.G., Wu Z.,Murphy C. 1995. Is the sphere organelle/coiled body a universal nuclear component? Develop. Genet. 16:25-35

23. Glover D.M. DNA cloning. A practical approach. London, 1994

24. Grotzinger,T.,T.Sternsdorf, K.Jensen, and H.Will. 1996. Interferon-modulated expression of genes encoding the nuclear dot-associated proteins SP100 and promyelotic leukemia protein (PML). Eur.J.Biochem. 238:554-560

25. Ed Harlow, David Lane. Antibodies, a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York,1998.

26. Guldner H.H., Szostecki C., Grotzinger T., Will H.: IFN enhance expression of SplOO, an autoantigen in primary biliary cirrhosis. Journal of Immunology 1992, 149: 40674073.

27. Hollenbach, A.D.,J.E.Sublett, C.J. McPherson, and G.Grosveld. 1999. The Pax3-FKHR oncoprotein is unresponsiveto the Pax3-associated repressor hDaxx. EMBO J. 18:37023711.

28. Hofmann H, Floss S, Stamminger T. Covalent modification of the transactivator protein IE2-p86 of human cytomegalovirus by conjugation to the ubiquitin-homologous proteins SUMO-1 and hSMT3b. J Virol. 2000 Mar;74(6):2510-24.

29. Iborra F.J., Pombo A., Jackson D.A.,Cook P.R.: Active RNA polymerases are localized within discrete transcription factories in human nuclei. Journal of cell sciences 1996, 109: 1427-1436.

30. Ishov, A.M., and G.G. Maul. 1996. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J.Cell Biol.134: 815-826.

31. Ishov, A.M.,R.M.Stenberg, and G.G. Maul. 1997. Human cytomegalovirus immediate early interaction with host nuclear structures:definition of an immediate transcript environment. J.Cell Biol.138:5-16

32. Johnson ES, Schwienhorst I, Dohmen RJ, Blobel G. The ubiquitin-like protein Smt3p is activated for conjugation to other proteins by an Aoslp/Uba2p heterodimer. EMBO J 1997 Sep 15;16 (18) :5509-19

33. Johnson E.S., Blobel G. 1999 Cell cycle regulated attachement of the ubiquitin-related protein SUMO to the yeast septins. J.Cell Biol. 147: 981-94

34. Kamitani T., Nguyen H.P., Kito K., Fukuda -Kamitani T., Yeh E.T., 1998. Covalent modification of PML by the sentrin family of ubiquitin-like proteins. J. Biol. Chem.273:3117-20

35. Khan MM., Nomura T., Kim H., Kaul SC., Wadhwa R., Shinagava T., Ichikawa-Iwata E., Zhong S., Pandolfi PP., Ishii S. Role of PML and PML-RARalpha in Mad-mediated transcription repression. Molecular Cell 2001 Jun; 7(6) : 1233-40

36. Khan MM, Nomura T, Kim H, Kaul SC, Wadhwa R, Zhong S, Pandolfi PP, Ishii S. PML-RARalpha alleviates the transcriptinal repression mediated by tumor suppressor Rb. J Biol Chem. 2001 Oct 2

37. Kiriakidou,M., D.A.Driscoll, J.M. Lopez-Guisa, and J.F.Strauss III. 1997. Cloning and expression of primate Daxx cDNAs and mapping of the human gene to chromosome 6p21.3 in the MHC region. DNA Cell Biol. 16:12 8 9-1298.

38. Klement I.A., Skinner P.J.,Kaytor M.D.,Yi H., Hersch S.M., Clark H.B., Zoghbi H.Y., OrrH.T.: Ataxin-1 nuclearlocalization and aggregation: role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell 1998, 95:41-53

39. Kohler G.,Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity//Nature.1975.Vol. 256. 495-497

40. Koken M.H., Puvion-Dutileul F., Guilemin M.C., Viron A., Linares-Cruz G., Stuuman N. , de Jong C., Calvo F., Chomienne C et al. : The t(15-17) translocation alters a nuclear body in a retinoic acid-reversible fashion. EMBO Journal 1994, 13:1073-1083.

41. Koprowski H, Yusibov V. The green revolution: plants as heterologous expression vectors. Vaccine. 2001 Mar 21;19(17-19):2735-41.

42. Kurz A., Lampel S., Nickolenko J.E., Bradl J., Benner A., Zirbel R.M., Cremer T.,Lichter P: Active and inactive genes localize preferentially in the perifery of chromosome territories. Journal of Cell Biology 1996, 135: 1195-1205

43. Kwek SS, Derry J, Tyner AL, Shen Z, Gudkov AV.Functional analysis and intracellular localization of p53 modified by SUMO-1. : Oncogene 2001 May 3;20(20):2587-99

44. Lamond AI, Earnshaw WC. Structure and function in the nucleus. Science. 1998 Apr 24;280 (5363) :547-53. Review.

45. LaMorte V.J., Dyck J.A., Ochs R.L., Evans R.M. : Localization of nascent RNA and CREB binding protein withthe PML-containing nuclear body. Proc.Natl.Acad Sci USA 1998, 95:4991-4996

46. Lavau,C., A.Marchio,M.Fagioli, J.Jansen, B.Falini, P.Lebon, F.Grosveld, P.P.Pandolfi, P.G.Pelicci, and A.Dejean.1995. The acute promielotic leucaemia-associated PML gen is induced by interferon. Oncogene. 11:871-876.

47. Lapenta V.P., Chiurazzi P., van der Spec A., Pizzuti F., Hanaoca F. And Brahe C.1997.SMT3A, a human homologue of the S.cerevsiae SMT3 gene, maps to chromosome 21qter and defines a novel gene family. Genomics. 40;362-366

48. Li S.J., Hochstrasser M. 1999. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature 398:246-51

49. Lin R.J., Nagy L., Inoue S., Shao W., Miller W.H., and Evans R.M. Role of the histone deacetylase complex in acute promyelotic leucaemia. Nature Vol.391, 1998

50. Manuelidis L. Different central nervous system cell types display distinct and nonrandom arrangements of sattelite DNA sequences. Proc Natl Acad. Sci USA 1984, 81:31: 3123-3127

51. Mahajan R., Gerace L., Melchior F. 1998. Molecular characterization of the SUMO-1 modification of RanGAPl and its role in nuclear envelope association. J.Cell Biol.140:259-70

52. Maul, G.G. 1998. Nuclear domain 10, the site of DNA virus transcription and replication. Bioessays. 20:660-667.

53. Maul G., Negorev D., Bell P. and A. Ishov. 2000. Review:Properties and Assembly Mechanisms of ND10, PML bodies, or PODs. Journal of Structural Biology 129, 278-287 (2000)

54. Matera AG. Nuclear bodies: multifaceted subdomains of the interchromatin space. Trends Cell Biol. 1999 Aug;9(8):302-9. Review.

55. Melcak I, Melcakova S, Kopsky V, Vecerova J, Raska I. Prespliceosomal assembly on microinjected precursor mRNA takes place in nuclear speckles. Mol Biol Cell. 2001 Feb;12(2):393-406.

56. Melchior F. 2000. SUMO- nonclassical ubiquitin.Annu Rev Cell Dev Bioll6:591-626. Review

57. Michaelson J.S. The DAXX enigma. Apoptosis 2000 Jun; 5(3) : 217-20

58. Michaelson, J.S., D.Bader, F.Kuo, C.Kozak, and P.Leder.1999. Loss of daxx, a promiscuosly interacting protein, results in extensive apoptosis in early mouse development. Genes Dev. 13:1918-1923.

59. Mintz PJ, Patterson SD, Neuwald AF, Spahr CS, Spector DL. Purification and biochemical characterization of interchromatin granule clusters. EMBO J. 1999 Aug 2; 18 (15) :4308-20.

60. Misteli T., Spector D.L. The cellular organization of gene expression. Current opinion in Cell Biology 1998, 10: 323-331

61. Monneron A., Bernard W: Fine structural organization of the interphase nucleus in some mammalian cells. Journal of Ultrastructural research 1969, 27: 266-288.

62. Muller S., Matunis M.J.,Dejean A., 1998. Conjugation with the ubiquitin-related modifier SUMO-1 regulates the partitioning of PML within the nucleus. EMBO J. 17:61-70

63. Negorev D., Ishov A.M., Maul G.G. Evidence for separate NDlO-binding and homo-oligomerization domains of SP100

64. Pandolfi PP. Histone deacetylases and transcriptional therapy with their inhibitors. Cancer Chemother Pharmacol 2001 Aug;48 Suppl l:S17-9

65. Parfenov VN, Davis DS, Pochukalina GN, Kostyuchek D, Murti KG. Dynamics of distribution of splicing components relative to the transcriptional state of human oocytes from antral follicles. J Cell Biochem. 1998 Apr 1;69 (1) :72-80.

66. Pederson T. 1998 The plurifunctional nucleolus. Nucleic Acids Res. 6(17): 3871-3876.

67. Petrenko V.A., Smith G.P., Phages from landscape libraries as substitute antibodies. Protein Eng. 2000 Aug;13(8):589-92.

68. Pluta, A.F., W.C.Earnshaw, and I.G.Goldberg.1998. Interphase specific association of intrinsic centromere protein CENP-C with HDaxx, a death domain binding protein implicated in Fas-mediated cell death. J.Cell Sci.Ill : 20292041

69. Rader C, Barbas C.F. 3rd Phage display of combinatorial antibody libraries. Curr Opin Biotechnol 1997 Aug;8(4) : 5038

70. Rodriguez M.S., Desterro J.M., Lain S.,Midgley C.A., Lane D.P.,Hay R.T. 1999. SUMO-1 modification activates the transcriptional responce of p53. EMBO J. 18:6455-61

71. Rogalla P., Kazmierczak B., Flohr A.M., Hauke S., and Bullerdek J. Back to the roots of a New Exon The Molecular Archaeology of a SP100 Splice Variant. Genomics 63, 117-122 (2000)

72. Sawano,A. and Miyawaki,A. Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis Nucleic Acids Res. 28 (16), E78 (2000)

73. Scheer U, Hock R. Structure and function of the nucleolus. Curr Opin Cell Biol. 1999 Jun;11 (3) :385-90. Review.

74. Seeler J.-S., Dejean A.The PML nuclear bodies: actors or extras? Current Opinion in Geneticsand Development 1999, 9:362-367

75. Seufert W., Futcher B.,Jentsch S. 1995. Role of a ubiquitin-conjugating enzyme in degradation of S- and M-phase cyclins. Nature 373: 78-81

76. Skinner P.J., Koshy B.T., Cummings C.J., Klement I.A.,Helin K.,Servadio A.,Zoghbi H.Y., Orr H.T.: Ataxin-1 with an expanded glutamine tract alters nuclear matrix-associated structures. Nature 1997, 389:971-974.

77. Spector D.L.: Macromolecular domains within the cell nucleus. Annual revue of Cell Biology 1993, 9: 265-315

78. Sternsdorf,T., K.Jensen, and H.Will. 1997. Evidence for covalent modification of the nuclear dot-associated proteins PML and SplOO by PIC1/SUM01. J.Cell.Biol.139 :1621-1634.

79. Strouboulis J, Wolffe AP. Functional compartmentalization of the nucleus. J Cell Sci. 1996 Aug;109 ( Pt 8):1991-2000. Review.

80. Tanaka AS, Sampaio CA, Fritz H, Auerswald EA. Related Articles Functional display and expression of chicken cystatin using a phagemid system.Biochem Biophys Res Commun. 1995 Sep 14 ; 214 (2) : 389-95

81. Verch T, Yusibov V, Koprowski H. Expression and assembly of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector.J Immunol Methods. 1998 Nov 1;220(1-2) : 69-75.

82. Wang Z.G., Ruggero S., Ronchetti S., Zhong S.,Gaboli M. ,Rivi R. And Pandolfi P.P. 1998. PML is essential for multiple apoptotic pathways. Nature Genetics 20:266-272

83. Wansink D.G., Schul W.,van der Kraan I., van Steensel B., van Driel R., de Jong L: Fluorescent labelling of nascent RNA transcription by RNA polymerase II in domains