Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ВТВ-содержащих белков Mod(mdg4) и GAF в функционировании инсулятора Su(Hw) у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль ВТВ-содержащих белков Mod(mdg4) и GAF в функционировании инсулятора Su(Hw) у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи УДК 533.9

Мазур Александр Михайлович

Роль ВТВ-содержащих белков Mod(mdg4) и GAF в функционировании инсулятора Su(Hw) у Drosophila melanogaster

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических паук

Москва 2004

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Института биологии гена РАН.

Научные руководители:

Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Георгиев Павел Георгиевич.

Кандидат биологических наук Головнин Антон Клименсович. Официальные оппоненты: Доктор физико-математических наук

Ведущая организация: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

диссертационного совета К 212.156.03 при МФТИ по адресу: 141700 Московская обл., г.Долгопрудный, Институтский переулок, д.9, МТФИ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Чернозатонский Леонид Александрович Кандидат биологических наук Прохорчук Егор Борисович

Защита диссертации состоится.

2004 года, в_часов на заседании

Автореферат разослан:

2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета.

кандидат

физико-математических наук

Братин В.Е.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Геном высших эукариот содержит огромное количество генов и их регуляторных элементов, таких как энхансеры, сайленсеры и инсуляторы. Энхансеры могут активировать транскрипцию гена независимо от ориентации и, находясь от промотора на расстоянии, которое может достигать нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов (Dorsett 1999). Многие энхансеры не имеют специфичности к определенному промотору и способны активировать транскрипцию с целого ряда генов. Так как в геноме гены располагаются часто достаточно близко друг к другу, то должны существовать механизмы, обеспечивающие взаимодействие энхансера с промотором своего гена и предотвращающие активацию чужих промоторов. В определении взаимодействий между энхансерами и промоторами важную роль играют инсуляторы и сайленсеры. Инсуляторы блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, находясь между ними, но, при этом не влияют на их активность, т.е. промотор может быть активирован любым неизолированным энхансером, а энхансер может активировать любой другой неизолированный промотор. В то же время репрессирующее действие сайленсеров не зависит от пространственного расположения по отношению к энхансеру или промотору.

В выяснении механизма действия инсуляторов большую роль сыграло определение белков, ответственных за функцию инсуляторов. Впервые белки, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, были охарактеризованы для инсулятора который находится в составе

мобильного элемента gypsy. Этот инсулятор содержит 12 сайтов связывания для одного белка, кодируемого геном

Инактивация данного гена приводит к потере инсуляции. Сила инсулятора напрямую зависит от количества сайтов связывания белка Su(Hw). Делеция даже нескольких сайтов связывания резко снижает эффективность действия инсулятора. Белок Su(Hvv) имеет на концах домены, обогащенные кислыми аминокислотными остатками и ДНК-связывающий домен, состоящий из 12 цинковых пальцев (Kim et al., 1996).

Рис I. Структура мобильного элемента gypsy и последовательность 12 сайтов связывания Su(Hw).

Недавно были получены мутации в регуляторном гене mod(mdg4) (Georgiev and Kozycina, 1996). Один из белков, который кодируется геном mod(mdg4), взаимодействует с доменом белка Su(Hw), отвечающем за инсуляиию (Gause et al., 2001). В общей сложности с гена mod(mdg4) транскрибируется около 20 различных мРНК, образующихся в рузультате альтернативного сплайсинга на 3'-конце (Dom et al., 2001). В двух лабораториях (Dorn et al., 1993) и (Waterman et al., 1988), было показано, что на N-конце всех белков, кодируемых геном mod(mdg4), находится так называемый BTB/POZ-домен, который был найден у целого семейства белков, являющихся регуляторами транскрипции. (Koonin et al., 1992; Numoto et al., 1993; Zollman et al., 1994). Таким образом, все белки, кодируемые геном mod(mdg4), имеют одинаковый ВТВ-домен на N-конце и разные С-концы. Предполагается, что именно С-концы определяют специфичность взаимодействия различных Mod(mdg4)- белков с другими белками.

Существующая модель работы инсулятора предполагает, что оба белка необходимы для работы инсулятора Однако не установлено, как именно в работе инсулятора участвует Mod(mdg4). Считается, что наличие высоко консервативного ВТВ домена у белка Mod(mdg4) позволяет нескольким инсуляторам собираться вместе в ядерные тельца, что приводит к выпетливанию ДНК и пространственному разделению промотора и энхансера, расположенных по разные стороны от инсулятора.

Цель и задачи исследования: Основной целью данного исследования являлось структурная и функциональная характеризация белка Mod(mdg4) и его работы в составе инсулятора.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Получение точечных аминокислотных замен наиболее консервативных аминокислот в ВТВ домене.

2. Изучить способность белков с полученными точечными аминокислотными заменами образовывать ядерные тельца и связываться с хромосомами в области расположения мобильного элемента gypsy.

3. Выяснение роли глутамин богатого домена белка Mod(mdg4) в функционировании инсулятора.

4. Проверить, может ли ВТВ домен белка GAF выполнять ту же роль, что и ВТВ домен белка Mod(mdg4).

Научная новизна и практическое значение работы.

В данной работе впервые показано наличие второго домена в белке Mod(mdg4), отвечающем за мультимеризацию. Установлено, что этот домен препятствует взаимодействию белка Mod(mdg4) с другими ВТВ содержащими белками.

Показано, что димеризация белка не является достаточным условием для его работы в составе инсулятора. Установлено, что делеция глутамин богатого домена приводит к отсутствию белка в ядре, но при этом это не сказывается на инсуляции. На основе полученных результатов можно сделать вывод, что Mod(mdg4) не нужен для инсуляции, но участвует в блокировании репрессии Su(Hw) инсулятором.

Апробация работы. Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции Advances in Molecular Cell Biology, Москва, 2004; на 45-ой ежегодной конференции по исследованиям на

дрозофиле (Annual Drosophila Research Conference), Вашингтон, 2004; и на межлабораторном семинаре ИБГ РАН, 2004. Структура и объем работы.

Диссертация изложена на_страницах, включает_таблиц и_рисунков и

состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Наличие определенных точечных замен в "заряженном кармане" не влияет на способность белка взаимодействовать с Su(Hw) и димеризоваться. Для изучения роли "заряженного кармана" (Ahmad et al., 1998) ВТВ домена белка Mod(mdg4) мы сделали точечные замены консервативных аминокислот в этом домене. Было показано (Melnick et al., 2002; Melnick et al., 2000), что такими аминокислотами являются аспартат в положении 35, гистидин в положении 46 и аргинин в 47.

Поэтому именно эти аминокислотные остатки были выбраны для мутагенеза.

S25A D33N Q41L H46DR47Q

* * * **

Mod 17 nTCsagfhesícrgdlvJ Bel б 17 dqlxnlnrlrsrdiltJ! Kaiso 17 SHLNSLÑEQRGHGLFcS GAF 19 SgVSAIQLLRCHGDLW Ttk 18 nhlsvfdqllhaetftp zid 18 vbeQKMNLLRQQNLFCI«

PLZF 19 GgLCKANQMRLAGTLo"

"k * it M27A D35N R49D

Рис. 3. Множественное выравнивание части ВТВ доменов различных белков (* отмечены сделанные замены). Каждый из мономеров в составе димера ВТВ доменов вносит свой вклад в формирование "заряженного кармана", образуемого этими остатками. При этом суммарный заряд кармана является нейтральным, т.к. в его состав входят два положительно заряженных аминокислотных остатка (аргинин) и по два отрицательных (аспартат), а гистидин не вносит вклад в заряд, потому что он не входит в состав "заряженного кармана", хотя и является высококонсервативным. Мутации аминокислотных остатков аргинина и аспартата у Вс1-6 и PLZF приводят к инактивации репресии, оказываемой этими ВТВ белками, однако, при этом сохраняется способность

б

мультимеризоваться. Поскольку белок Mod(mdg4)-67.2 содержит оба этих аминокислотных остатка, то мы сделали замены R47Q (положительно заряженный аргинин заменили нейтрально заряженным глутамином), D33N (аспартат на аспарагин), H46D (гистидин на аспартат) и различные их комбинации. Так же была сделана замена S25A (серии, расположенный по кристалической структуре на поверхности ВТВ домена, заменен на аланин), т.к. было показано для белка PLZF, что серии в этом положении важен для функционирования белка, хотя и не входит в состав "заряженного кармана". Каждый из белков, содержащих мутацию, был исследован в дрожжевой двугибридной системе на способность взаимодействовать с Su(Hw). Недавно мы обнаружили, что кислотный и ДНК связывающий домены белка Su(Hw) частично подавляют транскрипцию в дрожжах, на которой и основана эта система, что несколько усложняет интерпретацию данных, получаемых этим методом. Для преодоления этого мы использовали укороченную форму белка Su(Hw) - Su(Hw)M,D (Mod(mdg4) interaction domain), которая содержит только домен отвечающий за взаимодействие с белком

(аминокислоты 670-890). Su(Hw)MID и Mod(mdg4)-67.2 были "пришиты в рамку" на С-конец активаторного или ДНК связывающего доменов GAL4. Мы наблюдали взаимодействие между этими белками, независимо от того, какой домен пришит к (это взаимодействие в дальнейшем считалось

"положительным контролем").

5и(Н«0мю МлКпк^)0" +++ +++

Мо<1(та84)слг_5и(Н\у) _+++_ЫР

Таблица. I Обобщенные результаты вмнмодеПствия между Мси1(тс1£4) с точечными

амннокнслотными заменами и 5и(Н»)м|".

Количество "+" определяет относительную эффективность роста дрожжей, показывает отсутствие видимого роста дрожжей. Роста дрожжей не наблюдалось при трансформации любой одной плазмидой. ND-не тестировалось.

Так же сильное взаимодействие наблюдалось при взаимодействии

МосКтс^)40 (белок с делецией глутамин богатого района) и Мо^пк^)*40 ( делеция глутамин богатого района + замена в заряженном кармане 033Ы/Н460) и 8и(Нш)М1° (таблица I).

Однако, при исследовании взаимодействия между мутантными формами белка МсхКпкДО) и 8и(Н\у)М|1) была замечена направленность взаимодействия: если мутантные формы Мо<](т<1£4) содержали на Оконце ДНК связывающий домен бАМ, а 8и(Нш) - активирующий домен бАЫ, то рост дрожжей наблюдался, что предполагает взаимодействие между белками (таблица 1). Однако, когда AD был присоединен к ВТВ домену любого из мутантных Мо<1(т<^4) белков, мы наблюдали либо слабый рост дрожжей, либо его полное отсутствие. Для объяснения такой направленности взаимодействия было предположено, что непосредственный контакт между ВТВ доменом белка Мо<1(т<^4) и АО может оказывать негативное влияние на способность последнего активировать транскрипцию. Для проверки этой гипотезы в экспрессирующих плазм идах фрагмент ДНК, кодирующий активирующий домен GAL4, был присоединен к концу генов, кодирующих мутантные формы белка Mod(mdg4). После этого было проведено повторное тестирование взаимодействия мевду мутантными формами белка Мос1(тс^4), содержащими АО. и 8и(Н\у)М|°, соединенным с BD. В результате ко-экспрессии белков с плазмид наблюдался нормальный рост дрожжей, что подтверждает сделанный вывод, что точечные мутации в ВТВ домене меняют его способность активировать транскрипцию. При этом ВТВ домен негативно влияет на функциональность рядом расположенного активаторного домен белка GAL4, что приводит к снижению активации транскрипции репортерного гена, и, как следствие, к отсутствию роста дрожжей. Однако негативное действие мутантного ВТВ домена не распространяется на весь белок, и поэтому активность GAL4 восстанавливается при перемещение активирующего домена

белка GAL4 на противоположный конец ВТВ содержащего белка. Таким образом мы получили, что наличие точечных аминокислотных замен не приводит к потере способности взаимодействовать с 5и(Н\у). Далее мы изучили способность этих же белков к димеризации и взаимодействию мутантного с немутантным белком М<х1(гЫ§4)Так же для определения функциональной эквилентности ВТВ доменов из различных белков был сделан химерный белок Мос1(т(^4)САГ , содержащий ВТВ домен от белка GAF, т.к. ранее было показано, что ВТВ домен Mod(mdg4) может заменить ВТВ домен бАР в тестах по ВТВ зависимой активации транскрипции. так же был протестирован на способность

гомо- и гетеродимеризоваться и взаимодействовать с

Взаимодействующие белки Сила взаимодействия

ОАЫВО ОАЬАО АО вставлен до белка АО вставлен после белка

Мо<1(тс1£4) М +++ +++

Mod(mdg4) М<хЮЗЗМ/Н460 +++

Моа033Ы/Н460 М )d(mdg4) +++

М<хШЗЗЫ/Н4бО КМиЗЗМ/Н460 +

ModH46D ++ ^

М<х1Н460 М «1(п^4) +++

М<хШ460 V М460 +

Mod(mdg4) Мой ,25АЯ)ЗЗЫ ++

Мо4Б25А/ОЗЗЫ М d(шdg4) ++

Ь^525А/ОЗЗЫ \^;>.25АЛ>ЗЗН

Mod(mdg4) М<хЮЗЗЫ ++

ModDЗЗN Mod(mdg4) ++

МскЮЗЗЫ МсхЮЗЗК -

Mod(mdg4) Мсх1(ггк^4)'1<3 +++ N0

МоаОж^)"3 Мо4(пи^4) ++ N0

КЫ*!^)"5 +++ N0

Mod(mdg4) МоаО^)*4" • +++"

Мо4(1г^4),4(г Mod(mdg4) - +++

Мсх^л^)*40 - +

МскШ7(5 +++ +++

ModR47Q Mod(шdg4) ++ +++

\ЫЯ47<} ModR47Q ++ +++

Mod(mdg4) МсхШЗЗЫЛШ«} + +++

ModDЗЗN/R47Q Mod(mdg4) + +++

1кМОЗЗМ/Я47(} ModDЗЗN/R47Q - +++

Мск)(гт^§4) М<х1(п^4)СА': • +++

Mod(шdg4) - +++

Моа(тс1)!4)с" М(к)(так4)йА,: - +++

Таблица 2. Обобщенные результатыт гомо- и гетероднмеризацин мутантных белков Мсх1(т(]£4}-67.2 Количество"+'*определяетOTiiociue.ii.nt.it: »фф^кпникчи. (\м.1 лро**ей ' показывает отсутствие видимого роста дрожжей. Роста дрожжей не наблюдалось при трансформации любой одной плазмкдой. ИС)-не тестировалось.

Таким образом, белки с аминокислотными заменами разделились на 2 класса по своей способности димеризоваться, при этом химерный белок пока еще сохраняет все свойства нормального белка Мо<1(т(1£4)

(таблица 2).

2. Белок Mod(mdg4) содержит второй домен, отвечающий за днмернзацню. Ранее Coгces и др. показал, что при делеции ВТВ домена белка Mod(mdg4) он утрачивает способность димеризоваться и взаимодействовать с полноразмерным белком Mod(mdg4). При этом была использована стандартная двугибридная система, описанная выше. Для проверки отсутствия взаимодействия независимо от положения GAL4 AD (активациониого домена) при делеции ВТВ домена была сделана конструкция, в которой отсутствовал

Взаимодействующие белки Сила взаимодействи I

бАМЕЮ ОАЬАЭ АО вставлен до АО вст зелен

белка после >елка

+++ +4 £

+

+ +-

+++

+++ N1)

ВТВ домен и AD был в конце белка.

Таблица 3 Результаты взаимодействия белков при делеции ВТВ домена (обозначения как и ранее).

Таким образом мы видим что левая колонка полностью совпадает с тем, что ранее получил Coгces и др., а правая ей противоречит, т.е. при делеции ВТВ домена способность белка гомо- и гетеродимеризоваться сохраняется. Для разрешения этого противоречия было решено провести дополнительное исследование для определения, есть ли еще один домен в белке Mod(mdg4), отвечающем за димеризацию. Было решено использовать электрофоретические разделения белковых форм в нативном полиакриламидном геле.

Мск)(гж^4) Мо<)(т<^4)

Мсх)(тс^4) Мой48™

Моа4™ Мо<1(т<1$4)

МоГТВ Мое!4313

5и(Н«0мю Мо<)4816

МоГтв 5и(Н<у)мю

Рис.4 Вестерн-блон анализ белков поел« электрофореза в нативном

полиакриламкдном геле. I-белок "дикого типа", 2 - МоКтОД0", 3 - Мо<Л47<3, 4 -МоаОЗЗЫЛШ«), 5 - Мо<1{^4)м', 6 -МскЮЗЗ№Н460, 7 - "отрицательный контроль", 8 • Мод4*™. Использованы антитела на С-конец белка, любезно предоставленные Р.Оеуег. Слева указан примерный молекулярный вес маркера в кДа

Для этого белки, содержащие мутации и 6 гистидинов на С-конце, были экспрессированы в бактериях, очищены на метал-хелатном носителе и разделены в нативном акриламидном геле.

Мы видим, что при делеции ВТВ домена в геле образуются 2 полосы, различающиеся по подвижности (рис 4, дорожка 8) Что подтверждает наличие второго домена, отвечающего за димеризацию. Для его более точной локализации было решено использовать несколько делеционных вариантов белка Mod(mdg4) и протестировать их на взаимодействие в дрожжевой двугибридной системе

1 120 132 26« 2М 322 МО «1 910 «0В

ВТВ домен Глугамин-богатый № иелый

домен Домен домен

Рнс4. Уточненная доменная структура белка Мо<1(т<1{4) Цифрами указаны позиции

аминокислот ZF домен- домен "цинковый палец", предположительно связывающий ДНК Делеционные варианты для нахождения второго домена были таковыми (числа в скобках обозначают из чего делалась делеция, верхний индекс - что удалили, по номерам аминокислот в последовательности: N40(1(290-608), Мо«1(322-608), Мо<1(322-390), Мо^О-бОв)4"1510, Мо(1(420-608). Полученные делеционные варианты были протестированы на взаимодействие против самого себя, полноразмерного белка, полноразмерного с делецией ВТВ и полноразмерного с делецией глутамин богатого района. Проверку так же производили на взаимодействие т к это взаимодействие происходит через кислый

домен и его наличие косвенно доказывает правильное, функциональное сворачивание укороченного белка.

1-608 I-6084'"'™ 1-6084ШМ* 290-608 322-608 322-390 290-60844"-í" 420-608

1-40« +++ *+ +++ ■т- +++ ++ +++ •

i-««"-'» ++ ++ ++ +++ ++ ++ +++ •

l-60t">"" +++ ++ +++ ■Н+ +++ ++ +++ •

290401 +++ ++ +++ +++ ND ND ND ND

32240t +++ ++ +++ ND ++ ND ND ND

322-390 ++ ++ ++ ND ND ++ N0 ND

29040I""-'" +++ +++ +++ ND ND ND +++ ND

420-60* • • • ND ND Nd ND N0

Таблица 4. Обобщенные результаты взаимодействия делеционных вариантов белка Mod(mdg4). Числа • позиции в аминокислотной последовательности белка (Обозначения как и ранее).

Полученные данные позволяют картировать второй домен в районе аминокислот 320- 400. Так же было показано, что при отсутствии этого домена улучшается гетеродимеризация различных мутантных форм белка. 3. Функциональная активность мутантных форм белка в работе инсулятора Su(Hw).

Для определения in vivo эффекта мутаций в ВТВ домене и при делеции глутамин богатого района мы использовали аллели генов yellow, scute и cut, вызванные инсерцией мобильного элемента gypsy. Взаимодействие белков как было показано, имеет 2 функциональных последствия: участие в блокировании энхансера от промотора и стимуляции транскрипции. Инактивация Mod(mdg4)-67.2 В мутациях mod(mdg4)ul или приводит к неспособности Su(Hw) блокировать некоторые энхансеры и подавлять промотор-специфическую транскрипцию (Georgiev and Gerasimova, 1989; Gerasimova et al., 1995; Georgiev and Kozycina, 1996; Gdula et al., 1997; Cai and Levine, 1997).

В мутации мобильный элемент gypsy встроился между промотором и энхансерами гена yellow, контролирующими его экспресию в теле и крыльях.(Оеуег et al., 1986) (Рис. 5). Как результат 8и(Нж)инсулятор блокирует энхансеры тела и крыльев, которые расположены в нитронах (Geyer et al., 1986; Geyer and Corees, 1987). Мутации mod(mdg4)"' and mod(mdg4)n усиливают фенотип у1, репрессируя экспресиию гена yellow в шитинках (Georgiev and Gerasimova, 1989; Gerasimova et al., 1995). В то же время mod(mdg4)ul вызывает

частичную потерю энхансер-блокирующей активности инсулятора 8и(Н«<). Самцы мух, гемизиготные по' У аллелю, демонстрируют коричневую окраску 5 и 6 брюшного сегмента вместо черной, наблюдаемой у самцов дикого типа из-за эффекта 8и(Н«<) инсулятора на расположенные в 5' области энхансеры.

Рис.5 Схематичное изображение мутации /. En-w,En-b и En-br - энхансеры крыльев, тела и щетинока соответственно.

При мутации самцы демонстрируют неоднородный

фенотип брюшка из-за различного уровня экспресии гена в прилегающих группах клеток брюшковых сегментов. Эффект инсулятора su(Hw) в одних клетках кутикулы приводит к нормальной экспресии гена yellow, в других наоборот - эффект усилен из-за прямой репресии гена yellow инсулятором su(Hw). Таким образом, в у аллеле связывание белка Mod(mdg4)-67.2 защищает ген yellow от репрессии и усиливает способность инсулятора su(Hw) блокировать энхансер.

Второй модельной системой, на которой мы изучали эффект мутаций, был Achaete-Scute комплекс (AS-C), который расположен поблизости с геном yellow [Campuzano, Carramolino, et al. 1985]. Экспрессия генов ас и sc ограничена proneural кластерами, которые определяют точную позицию макрощитинок {Modolell & Campuzano 1998 #2690}. Очень сложный пэтерн экспрессии обусловлен действием сайт-специфических энхансер-подобных элементов, распределенных на участке генома дрозофилы размером примерно 90 т.п.н. AS-С кластера. Мутация sc1" вызвана инсерцией мобильного элемента МДГ4 на расстоянии 20 т.п.н. за п. .юм sc, что блокирует взаимодействие между многими энхасерами, специфичными для многих щетинок, и промотором гена sc (рис.6). Мутация только частично подавляет фенотип,

указывая, что Mod(mdg4)-67.2 не критически важен для блокирования энхасеров генов sc инсулятором su(Hw). Недавно был обнаружен первый эндогенный инсулятор в области 1А2, содержащий два сайта связывания для белка Su(Hw).

70 M SO 40 ЭО 20 10 I О .10 .30.30

1 Л ' ' ' ' ' '_¿J_' ' 1

Рис. б. Схема мутаций в Achaete-Scute комплексе. ас, sc, I'sc, ase - гены в составе Achaete-Scute, определяющие точное положение щетинок. s<T' мутации, вызванные дупликацией yellow. 1A-2 insulator-эндогенный инсулятор, обнаруженный в конце гена yellow.

Он разделяет ген yellow от генов Achaete-Scute комплекса {Golovnin, Birukova, et al. 2003 } {Pamell, Viering, et al. 2003 }. В мутациях scml И 5Ст,гэтот инсулятор дуплицирован между геном sc и его энхансерами. В отличие от аллеля мутация mod(mdg4)ul почти полностью подавляет мутантный

фенотип ic"" аллелей. Для дальнейшего исследования функциональной значимости мутаций в белке Mod(mdg4)-67.2 мы использовали мутацию которая получилась инверсией с разрывам и расположена очень близко к 3' концу кодирующей части гена ас (Gomez-Skarmeta, Campuzano, et al. 2003). He смотря на близость центромерного гетерогроматина, мутация In(l)sc"} вызывает только слабый мутантный фенотип. Однако на фоне modfmdgty'1 эта инверсия усиливает ас- и sc-фенотип, что показывает вовлеченность белка Mod(mdg4)-67.2 в блокирование репресионного действия хроматина. Таким образом, AC-S комплекс позволяет нам протестировать мутации в белке Mod(mdg4)-67.2 на функции эндогенного инсулятора.

Третей генетической системой, в которой мы исследовали мутантные формы белка Mod(mdg4)-67.2, было два аллеля - которые вызваны

инсерцией мобильного элемента gypsy в локус cut. В случае аллеля С? gypsy встроился близко к энхансеру, который расположен на растоянии примерно 85 т.п.н. до промотора гена cut (Dorsett 1993 , Jack, Dorsett, et al. 1991) и полностью блокирует взаимодействие между промотором и этим энхансером, что приводит к cut фенотипу (рис. 8). почти полностью

подавляют d6 фенотип, что указывает на необходимость белка Mod(mdg4)-67.2

для блокирования энхансеров, тканеспецифичных для крыльев. В случае аллеля Ct* gypsy, только частично блокирует энхансер гена cut, приводя к промежуточному cut фенотипу (рис. 8), возможно из-за того, что там находиться меньше сайтов связывания для белка Su(Hw), чем у большинства мобильных элементов gypsy (Hoover, Gerasimova, et al.). Фенотип CÍ* наиболее чувствителен к степени активности белков по

сравнению с остальными иисерциями мобильного элемента gypsy и больше всего подавляется гетерозиготными мутациями su(Hw) ИЛИ mod(mdg4)ul (Gause, Morcillo, et al. 2001).Таким образом, et представляет собой модель, очень сильно реагирующую на изменение функциональных свойств мутантных форм белка в блокировании тканеспецифичных энхансеров крыльев.

Для выяснения роли мутантных белков были получены трансгенные мухи, экспрессирующие белки под промотором

67.2; Modímdg^, МофкДО)*44, ModH46D, ModH46D/D33N и

ModS25A/D33N) или под повсеместно экспрессируемым промотором Su(Hw) (для белков Mod(mdg4)-67.2; ModR47Q, ModD33N, ModD33N/R47Q и Mod(mdg4)°*f). Исследование функции этих белков производили на фоне мутации Для исключения эффекта положения по крайней мере 8

независимых линий были протестированы. В 14 трансгенных линиях, экспрессирующих белок дикого типа под контролем промотора hsp7O или полностью восстанавливает фенотип, вызванный

Далее мы исследовали действие мутаций в "заряженном кармане". ModR47Q действует аналогично белку дикого типа, более того эта мутация индуцирует более сильное блокирование энхансеров крыльев в случае чем действие белка "дикого типа" на эту же мутацию. Таким образом, изменение положительного заряда аминокислотного остатка на нейтральный не приводит к ухудшению свойств белка в работе инсулятора.

И напротив - нейтрализация отрицательно заряженного аминокислотного остатка аспартата в положении 33 заменой на нейтральный аспарагнн приводит почти к полной инактивации инсуляционных и антирепрессорных свойств белка (рис. 7-9).

ModD33N лишь слегка восстанавливает энхансер блокирующую акивность SU(Hw) инсулятора в ал л е л е (рис. 9), но не изменяет фенотип

IS

мутаций и"" , 1п(1)5сп (рис.7) и сг* (рис. 9). Двойная мутация ModS25A/D33N, содержащая дополнительную аминокислотную замену на поверхности ВТВ домена приводит к полной инактивации белка в инсуляции и

SC___SC

WH **ас n WK М ШЯ JOIN (VMM

+/+ ■ ■ ■ ■ ■ stf" ; +/+ вваавввв

тоШМ^ЛшКта^Г BDB В В тиДОГММИИГ ■□□□□□□□

ModlMWU В ■ ■ ■ ■ Uo«Me4)47j вввввввв

модам»tf ■ ■ ■ ■ ■ IMmdgd Г вввввввв

ModOUMMO В ■ ■ ■ ■ мовоззшмт вввввввв

НММ70 в ■ ■ в в ММЯ4ГО вввввввв

Modomuura в а в в в MMD33N/R470 BDQQDBBD

ШМ) во в ■ в uodmao

ими» BQSII Mad D33N ■anSDODD

ММ&М/ОЭЭН мои»«*«Г в □ В В В во в в в UodHMj4r в □□ a □□ о о

т млн ллкж w к шелгаеан

с"; +/+ □□□□□□BOO □

xvdTuv^^^nodf'no^^ QQB BQQB В В В

Mod(md»W2 □ 00 oa OB В О □

Itedtmngir QQB В □ 0 0 В В а

м«ишн/н«о □□OBOOaao □

Mod FM7Q □□□BDDQOO a

ModOU№R47Q ООО ПОПОИВ a

ModMeO 99ESEBEIB в

Mod033N BOB BQQB В В В

_ UddllMg«Г BBBBBBIII □

стимуляции транскрипции.

Рис. 7. Эффект мупнгиых форм белка Мос1(пк^4) на гены Ас1ме1с-5си1с комплекса ш все щетинки отсутствуют, 0 я частичное присутствие щетинок, все щетин* присутствуют.

Рис.8 Эффект мугантных форм белка Mod(mdg4) на ген yellow. В скобках • окраска щетинок: 5 - черные,

I- желтые, var промежуточный фенотип.

Так как оба белка ModD33N и ModS25A/D33N неспособны гомодимеризоваться и частично теряют способность взаимодействовать с немутантной формой белка Mod(mdg4)-67.2, был сделан вывод, что целостность ВТВ домена нужна для всех активностей (инсуляционной и стимуляции транскрипции) белка Mod(mdg4)-67.2.

В двойной мутации ModD33N/R47Q оба • отрицательный и положительный - заряды аминокислотных остатков заменены на нейтральные. Это приводит к умеренному уровню инсуляционной активности и способности стимулировать транскрипцию (рис. 7-9). Например, ModD33N/R47Q восстанавливает энхансер блокирующую активность SU(Hw) инсулятора на аллеле аллелей,

подавляет пеструю пигментацию брюшка, но лишь частично подавляет ингибирование экспресии yellow в щепшках. Так же ModD33N/R47Q только слегка подавляет репрессию, вызванную гетерохроматином в аллеле In(I)scn.

С?

Рис.8 Эффект мутантных форм белка Mod(mdg4) на ген cut

исхЦгк&Г

Таким образом, восстановление баланса зарядов в белке ModD33N/R47Q, добавлением к замене D33N еще и R47Q, лишь частично восстанавливает функциональную активность белка.

Далее мы исследовали функциональную активность белка ModH46D, содержащего замену в наиболее консервативной аминокислоте ВТВ домена. При этой замене положительно заряженый гистидин меняется на отрицательно заряженный аспартат. Как и ожидалось, эта аминокислотная замена приводит к полной функциональной инактивации белка (рис. 7-9). Однако дополнительная аминокислотная замена отрицательно заряженного остатка аспартата в положении 33 на нейтрально заряженный аспарагин приводит к тому, что белок ModD33N/H46D полностью восстанавливает все свои функциональные свойства. Более того, подобно замене ModR47Q, ModD33N/H46D сильнее влмяет на фенотип сР чем Mod(mdg4)-67.2, что говорит о возросшей силе белка в инсуляции. Таким образом двойная замена усиливает функциональность белка, в то время как каждая замена наиболее консервативных (рис. 3) аминокислот по отдельности приводит к функциональной инактивации белка.

Также была исследована способность ВТВ домена белка GAF выполнять роль ВТВ домена белка Mod(mdg4). В противоположность тому, что сообщалось ранее (Read et al., 2000), когда ВТВ домен Mod(mdg4) выполнял функции такового из GAF, был полность неактивен на всех

трех модельных системах, что показывает отсутствие у этого белка инсуляционной активности и способности стимулировать транскрипцию. В дрожжевой двугибридной системе Mod(mdg4)c,f показал способность образовывать гомодимеры и взаимодействовать с

Поэтому предполагается, что ВТВ домен белка Mod(mdg4) опосредует специфическое взаимодействие с неидентифицированными белковыми комплексами, необходимыми для функционирования белка Mod(mdg4)-67.2.

Далее мы исследовали роль глутамин богатого домена белка Mod(mdg4)-67.2 в блокировании энхансеров и в стимуляции транскрипции, Mod(mdg4)iQ полностью восстанавливает блокирование энхансеров аллелей генов с/ и sc (рис. 7-9). Более того, сильнее, чем это делает

белок "дикого типа" Mod(mdg4)-67.2 (рис. 9). Mod(mdg4)4Q также блокирует энхансеры тела гена yellow в аллеле у1; modfmdgj)"1 (рис. 8): черные точки на

брюшке исчезают. Однако Modimdg^4*3 не подавляет ингибирование транскрипции гена yellow в щетинках, вызванную Su(Hw) инсулятором. Так же Mod(mdg4)AQ неспособен подавлять репрессию, вызванную гетерохроматином, что видно на аллелях ас и sc в мутации ln(lJsc'1. Эти результаты предполагают, что делеция глутамин богатого домена сохраняет способность белка Mod(mdg4)A<} блокировать энхансеры, но не сохраняет способности белка Mod(mdg4)-67.2 подавлять репрессию, вызванную инсулятором su(Hw). При одновременной делеции глутамин богатого района и 2 точечных мутаций в "заряженом кармане" D33N/H46D происходит полная функциональная инактивация белка и в стимуляции транскрипции и в инсуляции.

4. Локализация различных форм белка на политенных хромосомах и в ядерных тельцах диплоидных клеток.

Для выяснения клеточных аспектов работы инсулятора было решено исследовать наличие мутантных форм белка, описанных ранее на хромосомах, и их присутствие в специфических структурах ядерных тельцах, которые, как считается, и определяют работу инсулятора. Для этого из личинки третьей стадии были выдернуты политенные хромосомы слюнных желез, зафиксированы и окрашены антителами к С-концу белка Mod(mdg4) и затем вторичными антителами с флюорисцентной краской.

Мутации свойство "дикий тип" D33N S25A/ D33N D33N/ H46D H46D D33N/ R47Q R47Q ДО D33N/ H46Q + AQ CAF

Наличие белка в ядре + + + + + + + + +

Наличие белка на хромосоме + - - + - + + - - -

Наличие белка в ядерных тельцах + - - + - + + - + +

Таблица 5. Обобщенные данные о клеточных свойств« белков.

Похожая процедура была применена и для исследования ядерных телец. Личинка третьей стадии подверглась препарированию, после чего были извлечены имагинальные диски - специфические ткани из эпителиальных клеток, из которых в процессе линьки развиваются крылья, ноги и другие органы. Извлеченные имагинальные диски фиксировались парафармальдегидом и окрашивались первыми , а затем и вторыми антителами. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Обсуждение результатов. Несмотря на структурную аналогию ВТВ доменов многих транскрипционных факторов, белки, которые их содержат, могут функционировать и как репрессоры, и как активаторы транскрипции, и ВТВ домен играет центральную роль в этих процессах. Различные ВТВ содержащие белки вовлекают различные белковые комплексы. Например, гомодимер ВТВ домена белка Вс1-6 взаимодействует с ко-репрессорами SMRT и N-CoR, в то время как структурно похожий ВТВ домен белка PLZF может слабо реагировать с ними. К тому же транскрипционные факторы с ВТВ доменом могут образовывать гетеродимеры, что определяет различие в собираемых комплексах.

Mel nick и другие (2000, 2002) показал, что расположение зарядов внутри "заряженного кармана" ВТВ домена критически важно для осуществления автономной репрессии транскрипции, вызываемой гомодимерами PLZF и Вс1-6. При замене наиболее консервативных аминокислот, D35 и R49, на нейтральные наблюдалась полная инактивация репрессионной активности белков, при этом они продолжали образовывать гомодимеры и локализовываться в ядерные тельца. Мы показали, что белок Mod(mdg4)-67.2, содержащий те же мутации в ВТВ домене, становиться гораздо менее функциональным в составе инсулятора сохряняя в то же время способность димеризоваться и образовывать ядерные тельца. Замена отрицательно заряженного аминокислотного остатка аспартата в положении 33 на нейтрально заряженный аспарагин полностью лишает белок функциональной активности, что указывает на важность общего заряда "заряженного кармана" ВТВ домена. Противоположная замена положительно заряженного гистидина 46 на отрицательно заряженный аспартат также полностью инактивирует белок Mod(mdg4)-67.2. И хотя гистидин в положении 46 не вовлечен в формирование "заряженного кармана", добавление второй аминокислотной замены D33N уменьшает общий отрицательный заряд,

формируемый этими аминокислотными остатками, что приводит к восстановлению функциональной активности белка. Так как D33 и Н46 являются наиболее консервативными аминокислотными остатками в ВТВ домене различных белков, мы предполагаем, что они играют роль в поддержании общего строения ВТВ домена, а не в образовании специфических белок-белковых взаимодействий.

Ранее было показано, что белок Mod(mdg4)-67.2 облегчает связывание Su(Hw) с последовательностью инсулятора in vivo (Gerasimova and Corees, 1998). Мы показали, что инактивация ВТВ домена точечными аминокислотными заменами H46D или D33N/S25A приводит к неспособности связываться с сайтами Su(Hw) на политенных хромосомах ¡n vivo. Однако эти же самые замены позволяют мутантным белкам взаимодействовать в дрожжевой двугибридной системе с Su(Hw) . Поэтому мы предполагаем, что специфическое белок-белковое взаимодействие, за которое отвечает ВТВ домен белка с еще неидентифицированными белками, опосредует

связывание комплекса Su(Hw)/Mod(mdg4) с ДНК последовательностью инсулятора на хромосоме. Эта модель так же подтверждает неспособностью химерного белка Mod(mdg4)°"f , содержащего ВТВ домен белка GAF, взаимодействовать с сайтами связывания Su(Hw) in vivo, в тот время как Mod(mdg4)orf продолжает взаимодействовать в двугибридной системе с белком Su(Hw). Вероятно, этого взаимодействия недостаточно для вовлечения комплекса на политенные хромосомы.

Основываясь на гистоиммунном окрашивании имагинальных дисков дрозофилы, было предположено, что ВТВ домен белка Mod(mdg4)-67.2 формирует большие олигомерные комплексы, которые помогают множеству отдельных инсуляторных сайтов собираться вместе в большие агрегаты. При этом образуются хроматиновые петли, которые, как полагают, и определяют функциональное разделение промотора от энхансера и, таким образом, инсулирование. В этой работе, мы продемонстрировали что делеция глутамин-богатого района инактивирует способность белка проникать в ядро (вероятно этот домен содержит сайт ядерной локализации), но при этом мы тем не менее видим инсуляцию на фоне ' mod(mdg4)"'l Для объяснения этого, мы предположили, что белок взаимодействует с белком

через ВТВ. В результате количество белка Mod(mdg4)nl, проникающего в ядро, уменьшается. Используя аллель с/* как модельную систему Gause и др. (2001) показала, что белок Mod(mdg4)"' (который является урезанной с С-конца версией белка| Mod(mdg4)-67.2) проявляет доминантно негативный эффект на способность Su(Hw) инсулятора блокировать энхансер крыльев гена yellow. Так же было показано, что мутация mod(mdg4)"' и suQiwf" или su(Hwf мутации имеют дополнительный негативный эффект на способность инсулятора Su(Hw) блокировать энхансер. (Georgiev and Kozycina, 1996). Известно, что белок Mod(mdg4)-67.2 не способен взаимодействовать с белками SuiHw)42" или Su(Hw)'7 (Gause et al., 2001; Ghosh et al., 2001), поэтому мы предполагаем, что белок Mod(mdg4)u ингибирует способность блокировать энхансер из-за того, что он не взаимодействует с белком Su(Hw). Так как Mod(mdg4)4Q нейтрализует то инсуляторная активность восстанавливается, и мы предполагаем, что Mod(mdg4)-67.2 не участвует в непосредственном блокировании энхансеров в составе Su(Hw) инсулятора. Однако, экспрессия

опосредованного ингибирования экспресии гена yellow в мухах с мутацией mod(mdg4)"'. Mod(mdg4)4Q так же не компенсирует Мсч1(пиЛ4)-зависимую защиту экспрессии генов ас и sc от гетерохроматина в случае мутации Таким образом, роль белка

Mod(mdg4)-67.2 в составе инсулятора Su(Hw) состоит в защите от репрессирующего действия гетерохроматина и вовлечения других белков в формирование инсуляторного комплекса.

В случае наличия дополнительных аминокислотных замен D33N/H46D помимо делеции глутамин богатого района мы наблюдаем присутствие белка в ядре и ядерных тельца, но, тем не менее, он не связывается в составе комплекса Mod(mdg4)/Su(Hw) с инсуляторной последовательностью на хромосоме. Для объяснения этого мы предположили, что указанная замена способствует одному из видов посттрансляционной модификации • самуилированию (сайт для которой и образуется в результате точечных аминокислотных замен), что позволяет белку проникать в ядро. Однако, эти же мутации или предполагаемое самуилирование белка не позволяет ему собираться на хромосоме в нужный комплекс, хотя сам по себе белок в двугибридной системе показал способность к взаимодействию с белком Su(Hw). Более того, это не препятствует

образованию специфических структур в ядре - ядерных телец, что указывает на то, что образование ядерных телец это свойство самого белка и никак не комплекса Mod(mdg4)/Su(Hw)/xpOMOCOMa, как считалось ранее. Это также подтверждается тем, что в линиях мух, экспрессия мутантного белка, в которых находится под контролем промотора теплового шока, мы наблюдаем существенно большее количество ядерных телец, и по сравнению с линиями, где экспрессия под контролем неиндуцибельного промотора и по

сравнению с мухами "дикого типа", при этом очевидно, что число сайтов посадки комплекса на хромосому в результате теплового

шока увеличиться не может.

В заключение хотелось бы отметить, что результаты, представленные в диссертации, указывают на факт, что взаимодействие белков Mod(mdg4)-67.2 и Su(Hw) необходимо для эффективного связывания белка Su(Hw) с инсуляторной последовательностью и для антирепрессорного действия белка Mod(mdg4). Однако образование ядерных телец не является необходимым для блокирования энхансеров, как считалось ранее.

ВЫВОДЫ

1. С помощью модификации метода анализа взаимодействия белков в дрожжевой двугибридной системе показано, что в белке содержится второй домен, который, помимо BTB/POZ домена, приводит к димеризации белка. Продемонстрировано, что идентифицированный домен белка Mod(mdg4) необходим для эффективной гетеродимеризации с ВТВ-содержащим GAF белком.

2. Продемонстрировано, что ВТВ домен необходим для связывания белка Mod(mdg4) с Su(Hw) инсулятором. Замена ВТВ домена белка Mod(mdg4) на аналогичный из белка GAF приводит к потери взаимодействия химерного белка с Su(Hw) инсулятором in vivo и неспособности образовывать ядерные тельца, которые характерны для нормального белка

3. С помощью точечного мутагенеза наиболее консервативных аминокислот в ВТВ домене продемонстрировано, что функциональность ВТВ домена во многом определяется суммарным зарядом, а не структурными особенностями наиболее консервативных аминокислот.

4. Показано, что делеция глутамин богатого домена приводит к неспособности мутантного белка Mod(mdg4)AQ входить в ядро. На основе восстановления

»2 52 48

ядерной локализации Modtrndg-*)40 белка при частичной инактивация ВТВ домена был сделан вывод, что Q домен необходим для транспорта ВТВ содержащих белков в ядро.

5.На основе полученных результатов создана модель, которая предполагает роль белка Mod(mdg4) не в инсуляции, а в способности Su(Hw) инсулятора блокировать репрессионный хроматин.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Interaction between the GAGA factor and Mod(mdg4) proteins promotes insulator bypass in Drosophila. Melnikova L, Juge F., Gruzdeva N., Mazur A., Cavalli G., Georgiev P., PNAS , 2004, vol. 101, no. 41, p. 14806-14811.

2. Drosophila Su(Hw) insulator can stimulate transcription of a weakened yellow promoter over a distance. Golovnin A., Melnick E., Mazur A., Georgiev P. Genetics, 2004, vol. 168, no. 4, p.

3. BTB/POZ mutation of Mod(mdg4) in mediating Su(Hw) insulator action in Drosophila melanogaster. Mazur A., Georgiev P., Golovnin A. Advances in Molecular Cell Biology, 2004, p. 126-136.

4. A. Golovnin, A. Mazur, E. Melnik, P. Georgiev Role of Mod(mdg4) in mediating of Su(Hw) insulator action in Drosophila melanogaster. 45th Drosophila annual conference, 2004, p. 286A

5. P. Georgiev, A. Golovnia E. Melnik, R. Kostuchenko, A. Mazur The gypsy insulator can compensate for an upstream activating region in Drosophila yellow gene promoter. 45th Drosophila annual conference, 2004, p. 284A

Роль ВТВ-содертищш белков Mod(Bdg4) ■ CAF ■ ^тюиориипп икулатора Si(Bw) у DnupUt mthnofaur

Подписано s петт 1Ы12004 Форшг 60 * 84 '/« Б>шга офсетная. Печать офсспи» Уел печ 1 3 Уч-издл 19,1 Тираж 70 1кэ

Гос\ дарственное оОратоватсиное )чрсждсние высшего профессионального образования Московский физга,о-те\ннческий инептт

Отдел автоматизированных издательских систем

141700, Московская оРл, г Долгопрудный, Инстотскнй пер, 9

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Мазур, Александр Михайлович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Модели экспрессии генов.

2.2. Структура и функции инсуляторов.

2.3. Модели действия инсуляторов.

2.4. Белки с ВТВ доменами.

2.5. Структура и свойства белков 5и(Н\у) инсулятора.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Реактивы.

3.2. Ферменты.

3.3. Праймеры.

3.4. Бактериальные и дрожжевые штаммы и плазмидные ДНК.

3.5. Культивирование бактерий и дрожжей.

3.6. Получение компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК методом электропорации.

3.7. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК (электропорация).

3.8. Выделение плазмидной ДНК.

3.9. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.10. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

3.11. Лигирование ДНК.

3.12. Тупление выступающих концов ДНК.

3.13. Получение мутаций в гене mod(mdg4).

3.14. Получение делеции в гене mod(mdg4).

3.15. Получение векторов для двугибридной системы.

3.16. Трансформация дрожжевых клеток.

3.17. Анализ взаимодействий в двугибридной системе.

3.18. Синтез и выделение белков.

3.19. Электрофорез белков в денатурирующем 8% ПААГ.

3.20. Электрофорез белков в нативном 7% ПААГ.

3.21. Перенос и детекция белков на мембране.

3.22. Генетические скрещивания.

3.23. Детекция белков на политенных хромосомах дрозофилы.

3.24. Детекция белков в клетках имагинальных дисков дрозофилы.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Наличие точечных замен в "заряженном кармане" не влияет на способность белка взаимодействовать с 8и(Н\у) и димеризоваться.

4.2. Белок Мо<3(тс^4) содержит второй домен, отвечающий за димеризацию.

4.3. Функциональная активность мутантных форм белка в работе инсулятора Би(Нш).

4.4. Локализация белков на политенных хромосомах и в ядерных тельцах диплоидных клеток.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль ВТВ-содержащих белков Mod(mdg4) и GAF в функционировании инсулятора Su(Hw) у Drosophila melanogaster"

Геном высших эукариот содержит огромное количество генов и их регуляторных элементов, таких как энхансеры, сайленсеры и инсуляторы. Энхансеры могут активировать транскрипцию гена независимо от ориентации, находясь при этом от промотора на расстоянии, которое может достигать нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов. Многие энхансеры не имеют специфичности к определенному промотору и способны активировать транскрипцию с целого ряда генов. Так как в геноме гены располагаются часто достаточно близко друг к другу, то должны существовать механизмы, обеспечивающие взаимодействие энхансера с промотором своего гена и предотвращающие активацию чужих промоторов. В определении взаимодействий между энхансерами и промоторами важную роль играют инсуляторы и сайленсеры. Инсуляторы блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, находясь между ними. При этом они не влияют на активность самих энхансеров и промоторов, т.е. промотор может быть активирован любым неизолированным энхансером, а энхансер может активировать любой другой неизолированный промотор. В то же время, репрессирующее действие сайленсеров не зависит от пространственного расположения по отношению к энхансеру или промотору.

В выяснении механизма действия инсуляторов большую роль сыграло определение белков, ответственных за функцию инсуляторов. Впервые белки, блокирующие взаимодействие между энхансером и промотором, были охарактеризованы для инсулятора su(Hw), который находится в составе мобильного элемента МДГ4 {gypsy). Этот инсулятор содержит 12 сайтов связывания для одного белка, кодируемого геном su(Hw).

Инактивация данного гена приводит к потере инсуляции. Сила инсулятора напрямую зависит от количества сайтов связывания белка Su(Hw). Делеция даже нескольких сайтов связывания резко снижает эффективность действия инсулятора. Белок Su(Hw) имеет на концах домены, обогащенные кислыми аминокислотными остатками и ДНК-связывающий домен, состоящий из 12 цинковых пальцев. Ранее были получены мутации в регуляторном гене mod(mdg4). Один из белков, Мос1(т(1§4)-67.2, который кодируется геном mod(mdg4), взаимодействует с доменом белка 8и(Н\у), отвечающем за инсуляцию. На Г^-конце белка Мос1(тс^4)-67.2 находится ВТВ/РОг домен, который может мультимеризоваться и взаимодействовать с другими белковыми комплексами. На С-конце белка Мос1(тс1£4)-67.2 находится кислый домен, который взаимодействует с доменом белка 8и(Н\у), являющийся критичным для инсуляции. Мутация mod(mdg4)ul, приводящая к инактивации взаимодействия белков Мос1(т(%4)и1 и 8и(Н\у), в одних случаях снижает активность 8и(Н\у) инсулятора, а в других - превращает 8и(Н\у) инсулятор в репрессор транскрипции. Существующая модель работы инсулятора предполагает, что оба белка необходимы для работы инсулятора. Считается, что в результате взаимодействия между ВТВ доменами белков Мос1(тс^4)-67.2, связанных с разными 8и(Н\у) инсуляторами, происходит формирование инсуляторных комплексов, которые создают независимые домены транскрипции. Основной целью настоящего исследования было изучение структуры белка Мос1(тс1§4) и его функциональных свойств в составе инсуляторного комплекса.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Мазур, Александр Михайлович

6. выводы.

1. Белок Mod(mdg4) в составе инсуляторного комплекса блокирует репрессионное действие хроматина и не нужен непосредственно для блокирования энхансеров.

2.Показано, что в белке Mod(mdg4) содержится второй домен, который, помимо BTB/POZ домена, приводит к димеризации белка. Продемонстрировано, что идентифицированный домен белка Mod(mdg4) необходим для эффективной гетеродимеризации с ВТВ-содержащим GAF белком.

3. Продемонстрировано, что ВТВ домен необходим для связывания белка Mod(mdg4) с Su(Hw) инсулятором. Замена ВТВ домена белка Mod(mdg4) на аналогичный из белка GAF приводит к потери взаимодействия химерного белка с Su(Hw) инсулятором in vivo и неспособности образовывать ядерные тельца, которые характерны для нормального белка Mod(mdg4).

4. Функциональность ВТВ домена в работе инсулятора во многом определяется суммарным зарядом, а не структурными особенностями наиболее консервативных аминокислот.

5. Глутамин-богатый домен необходим для транспорта ВТВ содержащих белков в ядро.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Мазур, Александр Михайлович, Москва

1. Adams, M.D., et al (2000) The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science 287, 2185-95

2. Ahmad, K.F., Engel, C.K., Prive, G.G. (1998) Crystal structure of the BTB domain from PLZF. Proc Nail Acad Sci USA 95, 12123-8

3. Alcalay, M., Tomassoni, L., Colombo, E., Stoldt, S., Grignani, F., Fagioli, M., Szekely, L., Helin, K., Pelicci, P.G. (1998) The promyelocytic leukemia gene product (PML) forms stable complexes with the retinoblastoma protein. Mol Cell Biol 18,1084-93

4. Aravind, L., Koonin, E.V. (1999) Fold prediction and evolutionary analysis of the POZ domain: structural and evolutionary relationship with the potassium channel tetramerization domain. J Mol Biol 285, 1353-61

5. Arriza, J.L., Weinberger, C., Cerelli, G., Glaser, T.M., Handelin, B.L., Housman, D.E., Evans,

6. R.M. (1987) Cloning of human mineralocorticoid receptor complementary DNA: structural and functional kinship with the glucocorticoid receptor. Science 237,268-75

7. Ball, H.J., Melnick, A., Shaknovich, R., Kohanski, R.A., Licht, J.D. (1999) The promyelocyticleukemia zinc finger (PLZF) protein binds DNA in a high molecular weight complex associated with cdc2 kinase. Nucleic Acids Res 27,4106-13

8. Bard well, V.J., Treisman, R. (1994) The POZ domain: a conserved protein-protein interactionmotif. Genes Dev 8,1664-77

9. Beaster-Jones, L., Okkema, P.G. (2004) DNA binding and in vivo function of C.elegans PEB-1require a conserved FLYWCH motif. J Mol Biol 339, 695-706

10. Bell, A.C., Felsenfeld, G. (1999) Stopped at the border: boundaries and insulators. Curr Opin1. Genet Dev 9,191-8

11. Bell, A.C., West, A.G., Felsenfeld, G. (1999) The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell 98, 387-96

12. Bender, M.A., Reik, A., Close, J., Telling, A., Epner, E., Fiering, S., Hardison, R., Groudine,

13. M. (1998) Description and targeted deletion of 5' hypersensitive site 5 and 6 of the mouse beta-globin locus control region. Blood 92,4394-403

14. Bernassola, F., Salomoni, P., Oberst, A., Di Como, C.J., Pagano, M., Melino, G., Pandolfi, P.P.2004) Ubiquitin-dependent Degradation of p73 Is Inhibited by PML. J Exp Med 199, 1545-57

15. Bi, X., Broach, J.R. (1999) UASrpg can function as a heterochromatin boundary element inyeast. Genes Dev 13,1089-101

16. Bickel, S., Pirrotta, V. (1990) Self-association of the Drosophila zeste protein is responsible fortransvection effects. EMBO J 9, 2959-67

17. Blondel, D., Regad, T., Poisson, N., Pavie, B., Harper, F., Pandolfi, P.P., De The, H., Chelbi

18. Alix, M.K. (2002) Rabies virus P and small P products interact directly with PML and reorganize PML nuclear bodies. Oncogene 21, 7957-70

19. Blumenthal, T. (1995) Trans-splicing and polycistronic transcription in Caenorhabditis elegans.1. Trends Genet 11, 132-6

20. Bonifer, C. (2000) Developmental regulation of eukaryotic gene loci: which cis-regulatoryinformation is required? Trends Genet 16, 310-5

21. Bonifer, C., Yannoutsos, N., Kruger, G., Grosveld, F., Sippel, A.E. (1994) Dissection of thelocus control function located on the chicken lysozyme gene domain in transgenic mice. Nucleic Acids Res 22,4202-10

22. Buchner, K., Roth, P., Schotta, G., Krauss, V., Saumweber, H., Reuter, G., Dorn, R. (2000)

23. Genetic and molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila. Genetics 155,141-57

24. Cai, H., Levine, M. (1995) Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the

25. Drosophila embryo. Nature 376, 533-6

26. Cai, H.N., Levine, M. (1997) The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencerin the Drosophila embryo. EMBOJ16, 1732-41

27. Campuzano, S., Carramolino, L., Cabrera, C.V., Ruiz-Gomez, M., Villares, R., Boronat, A.,

28. Modolell, J. (1985) Molecular genetics of the achaete-scute gene complex of D. melanogaster. Cell 40, 327-38

29. Cavalli, G., Paro, R. (1999) Epigenetic inheritance of active chromatin after removal of themain transactivator. Science 286, 955-8

30. Chong, S., Riggs, A.D., Bonifer, C. (2002) The chicken lysozyme chromatin domain contains asecond, widely expressed gene. Nucleic Acids Res 30,463-7

31. Chung, J.H., Whiteley, M., Felsenfeld, G. (1993) A 5' element of the chicken beta-globindomain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell 74, 505-14

32. Cuvier, O., Hart, C.M., Laemmli, U.K. (1998) Identification of a class of chromatin boundaryelements. Mol Cell Biol 18,7478-86

33. Daniel, J.M., Reynolds, A.B. (1999) The catenin pl20(ctn) interacts with Kaiso, a novel

34. BTB/POZ domain zinc finger transcription factor. Mol Cell Biol 19, 3614-23

35. David, G., Alland, L., Hong, S.H., Wong, C.W., DePinho, R.A., Dejean, A. (1998) Histonedeacetylase associated with mSin3 A mediates repression by the acute promyelocytic leukemia-associated PLZF protein. Oncogene 16, 2549-56

36. RAR alpha fusion mRNA generated by the t(15;17) translocation in acute promyelocytic leukemia encodes a functionally altered RAR. Cell 66, 675-84

37. Deltour, S., Guerardel, C., Leprince, D. (1999) Recruitment of SMRT/N-CoR-mSin3A-HDACrepressing complexes is not a general mechanism for BTB/POZ transcriptional repressors: the case of HIC-1 and gammaFBP-B. Proc Natl Acad Sci USA 96, 148316

38. Dhordain, P., et al (1995) The BTB/POZ domain targets the LAZ3/BCL6 oncoprotein tonuclear dots and mediates homomerisation in vivo. Oncogene 11,2689-97

39. Dhordain, P., Albagli, O., Lin, R.J., Ansieau, S., Quief, S., Leutz, A., Kerckaert, J.P., Evans,

40. R.M., Leprince, D. (1997) Corepressor SMRT binds the BTB/POZ repressing domain of the LAZ3/BCL6 oncoprotein. Proc Natl Acad Sci USA 94, 10762-7

41. Dillon, N., Sabbattini, P. (2000) Functional gene expression domains: defining the functionalunit of eukaryotic gene regulation. Bioessays 22,657-65

42. Dillon, N., Trimbom, T., Strouboulis, J., Fraser, P., Grosveld, F. (1997) The effect of distanceon long-range chromatin interactions. Mol Cell 1,131-9

43. Dong, S., et al (1996) Ami no-terminal protein-protein interaction motif (POZ-domain) isresponsible for activities of the promyelocytic leukemia zinc finger-retinoic acid receptor-alpha fusion protein. Proc Natl Acad Sci USA 93, 3624-9

44. Donze, D., Adams, C.R., Rine, J., Kamakaka, R.T. (1999) The boundaries of the silenced HMRdomain in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev 13, 698-708

45. Donze, D., Kamakaka, R.T. (2002) Braking the silence: how heterochromatic gene repressionis stopped in its tracks. Bioessays 24, 344-9

46. Dorn, R., Reuter, G., Loewendorf, A. (2001) Transgene analysis proves mRNA trans-splicingat the complex mod(mdg4) locus in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U SA 98, 9724-9

47. Dorsett, D. (1993) Distance-independent inactivation of an enhancer by the suppressor of

48. Hairy-wing DNA-binding protein of Drosophila. Genetics 134, 1135-44

49. Dorsett, D. (1999) Distant liaisons: long-range enhancer-promoter interactions in Drosophila.

50. Curr Opin Genet Dev 9, 505-14

51. Dunaway, M., Droge, P. (1989) Transactivation of the Xenopus rRNA gene promoter by itsenhancer. Nature 341, 657-9

52. Ellis, J., Talbot, D., Dillon, N. Grosveld, F. (1993) Synthetic human beta-globin 5'HS2constructs function as locus control regions only in multicopy transgene concatamers. EMBOJ12, 127-34

53. Elsholtz, H.P., Mangalam, H.J., Potter, E., Albert, V.R., Supowit, S., Evans, R.M., Rosenfeld,

54. M.G. (1986) Two different cis-active elements transfer the transcriptional effects of both EGF and phorbol esters. Science 234, 1552-7

55. Espinas, M.L., Jimenez-Garcia, E., Vaquero, A., Canudas, S., Bernues, J., Azorin, F. (1999)

56. The N-terminal POZ domain of GAF mediates the formation of oligomers that bind DNA with high affinity and specificity. J Biol Chem 274,16461-9

57. Eul, J., Graessmann, M., Graessmann, A. (1995) Experimental evidence for RNA transsplicing in mammalian cells. EMBO J14, 3226-35

58. Farkas, G., Gausz, J., Galloni, M., Reuter, G., Gyurkovics, H., Karch, F. (1994) The Trithoraxlike gene encodes the Drosophila GAF factor. Nature 371, 806-8

59. Farrell, C.M., West, A.G., Felsenfeld, G. (2002) Conserved CTCF insulator elements flank themouse and human beta-globin loci. Mol Cell Biol 22, 3820-31

60. Filippova, G.N., Fagerlie, S., Klenova, E.M., Myers, C., Dehner, Y., Goodwin, G., Neiman,

61. P.E., Collins, S.J., Lobanenkov, V.V. (1996) An exceptionally conserved transcriptionalrepressor, CTCF, employs different combinations of zinc fingers to bind diverged promoter sequences of avian and mammalian c-myc oncogenes . Mol Cell Biol 16, 2802-13

62. Ford, A.M., Bennett, C.A., Healy, L.E., Navarro, E., Spooncer, E., Greaves, M.F. (1992)1.munoglobulin heavy-chain and CD3 delta-chain gene enhancers are DNase I-hypersensitive in hemopoietic progenitor cells. Proc Natl Acad Sci USAS9, 3424-8

63. Forsberg, E.C., Downs, K.M., Christensen, H.M., Im, H., Nuzzi, P.A., Bresnick, E.H. (2000)

64. Developmentally dynamic histone acetylation pattern of a tissue-specific chromatin domain. Proc Natl Acad Sci USA 97,14494-9

65. Furukawa, M., He, Y.J., Borchers, C., Xiong, Y. (2003) Targeting of protein ubiquitination by

66. BTB-Cullin 3-Rocl ubiquitin ligases. Nat Cell Biol 5,1001-7

67. Gaszner, M., Vazquez, J., Schedl, P. (1999) The Zw5 protein, a component of the scschromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction. Genes Dev 13,2098-107 ,

68. Gause, M., Morcillo, P., Dorsett, D. (2001) Insulation of enhancer-promoter communication bya gypsy transposon insert in the Drosophila cut gene: cooperation between suppressor of hairy-wing and modifier of mdg4 proteins. Mol Cell Biol 21,4807-17

69. Gdula, D.A., Corces, V.G. (1997) Characterization of functional domains of the su(Hw) proteinthat mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations. Genetics 145,153-61

70. Georgiev, P., Kozycina, M. (1996) Interaction between mutations in the suppressor of Hairywing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations. Genetics 142, 425-36

71. Georgiev, P.G., Gerasimova, T.I. (1989) Novel genes influencing the expression of the yellowlocus and mdg4 (gypsy) in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet 220, 121-6

72. Georgiev, P.G., Murav'eva, E.E., Golovnin, A.K., Gracheva, E.M., Belen'kaia, T.I.u. (2000)1.sulators and interaction between long-distance regulatory elements in highereukaryotes. Genetika 36, 1588-97

73. Gerasimova, T.I., Byrd, K., Corces, V.G. (2000) A chromatin insulator determines the nuclearlocalization of DNA. MolCell6, 1025-35

74. Gerasimova, T.I., Corces, V.G. (1998) Polycomb and trithorax group proteins mediate thefunction of a chromatin insulator. Cell 92, 511-21

75. Gerasimova, T.I., Gdula, D.A., Gerasimov, D.V., Simonova, O., Corces, V.G. (1995) A

76. Drosophila protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation. Cell 82, 587-97

77. Geyer, P.K., Corces, V.G. (1987) Separate regulatory elements are responsible for the complexpattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genes Dev 1, 996-1004

78. Geyer, P.K., Corces, V.G. (1992) DNA position-specific repression of transcription by a

79. Drosophila zinc finger protein. Genes Dev 6,1865-73

80. Geyer, P.K., Spana, C., Corces, V.G. (1986) On the molecular mechanism of gypsy-inducedmutations at the yellow locus of Drosophila melanogaster. EMBO J 5, 2657-62

81. Geyer, R., Wee, S., Anderson, S., Yates, J., Wolf, D.A. (2003) BTB/POZ domain proteins areputative substrate adaptors for cullin 3 ubiquitin ligases. Mol Cell 12, 783-90

82. Ghosh, D., Gerasimova, T.I., Corces, V.G. (2001) Interactions between the Su(Hw) and

83. Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. EMBO J 20, 2518-27

84. Giguere, V., Evans, R.M. (1990) Identification of receptors for retinoids as members of thesteroid and thyroid hormone receptor family. Methods Enzymol 189,223-32

85. Giguere, V., Hollenberg, S.M., Rosenfeld, M.G., Evans, R.M. (1986) Functional domains ofthe human glucocorticoid receptor. Cell 46, 645-52

86. Glazkov, M.V. (1998) Boundaries of structure-functional units (domains) of eukaryoticchromosomes. Genetika 34, 593-604

87. Glover, D.M., Leibowitz, M.H., McLean, D.A., Parry, H. (1995) Mutations in aurora preventcentrosome separation leading to the formation of monopolar spindles. Cell 81, 95-105

88. Godt, D., Couderc, J.L., Cramton, S.E., Laski, F.A. (1993) Pattern formation in the limbs of

89. Drosophila: brie a brae is expressed in both a gradient and a wave-like pattern and is required for specification and proper segmentation of the tarsus. Development 119, 799-812

90. Golovnin, A., Birukova, I., Romanova, O., Silicheva, M., Parshikov, A., Savitskaya, E.,

91. Pirrotta, V., Georgiev, P. (2003) An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the Achaete-scute gene complex in Drosophila. Development 130, 3249-58

92. Gomez-Skarmeta, J.L., Campuzano, S., Modolell, J. (2003) Half a century of neuralprepatterning: the story of a few bristles and many genes. Nat Rev Neurosci 4, 587-98

93. Gorczyca, M., Popova, E., Jia, X.X., Budnik, V. (1999) The gene mod(mdg4) affects synapsespecificity and structure in Drosophila. JNeurobiol 39,447-60

94. Granok, H., Leibovitch, B.A., Shaffer, C.D., Elgin, S.C. (1995) Chromatin. Ga-ga over GAFfactor. Curr Biol 5, 238-41

95. Greaves, D.R., et al (1989) The beta-globin dominant control region. Prog Clin Biol Res316A, 37-46

96. Grignani, F., et al (1998) Fusion proteins of the retinoic acid receptor-alpha recruit histonedeacetylase in promyelocytic leukaemia. Nature 391, 815-8

97. Grosveld, F., van Assendelft, G.B., Greaves, D.R., Kollias, G. (1987) Position-independent,high-level expression of the human beta-globin gene in transgenic mice. Cell 51, 97585

98. Guerardel, C., Deltour, S., Leprince, D. (1999) Evolutionary divergence in the broad complex,tramtrack and brie a brac/poxviruses and zinc finger domain from the candidate tumor suppressor gene hypermethylated in cancer. FEBS Lett 451,253-6

99. Guo, A., Salomoni, P., Luo, J., Shih, A., Zhong, S., Gu, W., Paolo Pandolfi, P. (2000) Thefunction of PML in p53-dependent apoptosis. Nat Cell Biol 2, 730-6

100. Hamaguchi, M., et al (2002) DBC2, a candidate for a tumor suppressor gene involved in breastcancer. Proc Natl Acad Sci US A 99, 13647-52

101. Hanscombe, O., Whyatt, D., Fraser, P., Yannoutsos, N., Greaves, D., Dillon, N., Grosveld, F.1991) Importance of globin gene order for correct developmental expression. Genes Dev 5,1387-94

102. Harrison, D.A., Gdula, D.A., Coyne, R.S., Corces, V.G. (1993) A leucine zipper domain of thesuppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function. Genes Dev 7, 1966-78

103. Hatzis, P., Talianidis, I. (2002) Dynamics of enhancer-promoter communication duringdifferentiation-induced gene activation. Mol Cell 10,1467-77

104. He, L.Z., Merghoub, T., Pandolfi, P.P. (1999) In vivo analysis of the molecular pathogenesis ofacute promyelocytic leukemia in the mouse and its therapeutic implications. Oncogene 18, 5278-92

105. Hoatlin, M.E., et al (1999) A novel BTB/POZ transcriptional repressor protein interacts withthe Fanconi anemia group C protein and PLZF. Blood 94, 3737-47

106. Hoover, K.K., Gerasimova, T.I., Chien, A.J., Corces, V.G. (1992) Dominant effects ofsuppressor of Hairy-wing mutations on gypsy-induced alleles of forked and cut in Drosophila melanogaster. Genetics 132, 691-7

107. Huynh, K.D., Bardwell, V.J. (1998) The BCL-6 POZ domain and other POZ domains interactwith the co-repressors N-CoR and SMRT. Oncogene 17, 2473-84

108. Ishii, K., Laemmli, U.K. (2003) Structural and dynamic functions establish chromatin domains.1. Mol Cell 11, 237-48

109. Ishov, A.M., Sotnikov, A.G., Negorev, D., Vladimirova, O.V., Neff, N., Kamitani, T., Yeh,

110. E.T., Strauss, J.F. 3rd, Maul, G.G. (1999) PML is critical for ND10 formation and recruits the PML-interacting protein daxx to this nuclear structure when modified by SUMO-1. J Cell Biol 147, 221-34

111. Jack, J., Dorsett, D., Delotto, Y., Liu, S. (1991) Expression of the cut locus in the Drosophilawing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer. Development 113, 735-47

112. Kakizuka, A., Miller, W.H. Jr, Umesono, K., Warrell, R.P. Jr, Frankel, S.R., Murty, V.V.,

113. Dmitrovsky, E., Evans, R.M. (1991) Chromosomal translocation t(15;17) in human acute promyelocytic leukemia fuses RAR alpha with a novel putative transcription factor, PML. Cell 66, 663-74

114. Kandel, E.S., Skeen, J., Majewski, N., Di Cristofano, A., Pandolfi, P.P., Feliciano, C.S., Gartel,

115. A., Hay, N. (2002) Activation of Akt/protein kinase B overcomes a G(2)/m cell cycle checkpoint induced by DNA damage. Mol Cell Biol 22, 7831-41

116. Katsani, K.R., Hajibagheri, M.A., Verrijzer, C.P. (1999) Co-operative DNA binding by GAFtranscription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology. EMBO J18, 698-708

117. Kellum, R., Schedl, P. (1991) A position-effect assay for boundaries of higher orderchromosomal domains. Cell 64, 941-50

118. Kellum, R., Schedl, P. (1992) A group of scs elements function as domain boundaries in anenhancer-blocking assay. Mol Cell Biol 12, 2424-31

119. Kenne, M., Djieto-Lordon, C., Orivel, J., Mony, R., Fabre, A., Dejean, A. (2003) Influence ofinsecticide treatments on ant-hemiptera associations in tropical plantations. JEcon Entomol 96, 251-8

120. Kim, C.A., Gingery, M., Pilpa, R.M., Bowie, J.U. (2002) The SAM domain of polyhomeoticforms a helical polymer. Nat Struct Biol 9,453-7

121. Kim, C.A., Phillips, M.L., Kim, W., Gingery, M., Tran, H.H., Robinson, M.A., Faham, S.,

122. Bowie, J.U. (2001) Polymerization of the SAM domain of TEL in leukemogenesis and transcriptional repression. EMBOJ20,4173-82

123. Kim, J., Shen, B., Rosen, C., Dorsett, D. (1996) The DNA-binding and enhancer-blockingdomains of the Drosophila suppressor of Hairy-wing protein. Mol Cell Biol 16, 338192

124. Klenova, E.M., Nicolas, R.H., Paterson, H.F., Carne, A.F., Heath, C.M., Goodwin, G.H.,

125. Neiman, P.E., Lobanenkov, V.V. (1993) CTCF, a conserved nuclear factor required for optimal transcriptional activity of the chicken c-myc gene, is an 11-Zn-finger protein differentially expressed in multiple forms. Mol Cell Biol 13, 7612-24

126. Kmita, M., Fraudeau, N., Herault, Y., Duboule, D. (2002) Serial deletions and duplicationssuggest a mechanism for the collinearity of Hoxd genes in limbs. Nature 420, 145-50

127. Kmita, M., Kondo, T., Duboule, D. (2000) Targeted inversion of a polar silencer within the

128. HoxD complex re-allocates domains of enhancer sharing. Nat Genet 26,451-4

129. Koonin, E.V., Senkevich, T.G., Chernos, V.I. (1992) A family of DNA virus genes thatconsists of fused portions of unrelated cellular genes. Trends Biochem Sci 17,213-4

130. Krebs, J.E., Dunaway, M. (1998) The scs and scs' insulator elements impart a cis requirementon enhancer-promoter interactions. Mol Cell 1,301-8

131. Krek, W. (2003) BTB proteins as henchmen of Cul3-based ubiquitin ligases. Nat Cell Biol 5,950.1

132. Kreusch, A., Pfaffinger, P.J., Stevens, C.F., Choe, S. (1998) Crystal structure of thetetramerization domain of the Shaker potassium channel. Nature 392, 945-8

133. Labrador, M., Corces, V.G. (2002) Setting the boundaries of chromatin domains and nuclearorganization. Cell 111, 151-4

134. Labrador, M., Mongelard, F., Plata-Rengifo, P., Baxter, E.M., Corces, V.G., Gerasimova, T.I.2001) Protein encoding by both DNA strands. Nature 409, 1000

135. Larsson, J., Chen, J.D., Rasheva, V., Rasmuson-Lestander, A., Pirrotta, V. (2001) Painting offourth, a chromosome-specific protein in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA98, 6273-8

136. Lavau, C., et al (1995) The acute promyelocytic leukaemia-associated PML gene is induced byinterferon. Oncogene 11,871-6

137. Le, X.F., Yang, P., Chang, K.S. (1996) Analysis of the growth and transformation suppressordomains of promyelocytic leukemia gene, PML. J Biol Chem 271, 130-5

138. Leach, K.M., Nightingale, K., Igarashi, K., Levings, P.P., Engel, J.D., Becker, P.B., Bungert, J.2001) Reconstitution of human beta-globin locus control region hypersensitive sites in the absence of chromatin assembly. Mol Cell Biol 21,2629-40

139. Li, G., Lim, K.C., Engel, J.D., Bungert, J. (1998) Individual LCR hypersensitive sitescooperate to generate an open chromatin domain spanning the human beta-globin locus. Genes Cells 3,415-29

140. Li, Q., Harju, S., Peterson, K.R. (1999) Locus control regions: coming of age at a decade plus.1. Trends Genet 15,403-8

141. Li, X., Lopez-Guisa, J.M., Ninan, N., Weiner, E.J., Rauscher, F.J. 3rd, Marmorstein, R. (1997)

142. Overexpression, purification, characterization, and crystallization of the BTB/POZ domain from the PLZF oncoprotein. J Biol Chem 272, 27324-9

143. Li, X., Peng, H., Schultz, D.C., Lopez-Guisa, J.M., Rauscher, F.J. 3rd, Marmorstein, R. (1999)

144. Structure-function studies of the BTB/POZ transcriptional repression domain from the promyelocytic leukemia zinc finger oncoprotein. Cancer Res 59, 5275-82

145. Lin, R.J., Nagy, L., Inoue, S., Shao, W., Miller, W.H. Jr, Evans, R.M. (1998) Role of thehistone deacetylase complex in acute promyelocyte leukaemia. Nature 391, 811-4

146. Mahmoudi, T., Katsani, K.R., Verrijzer, C.P. (2002) GAF can mediate enhancer function intrans by linking two separate DNA molecules. EMBOJ21, 1775-81

147. Mansfield, S.G., Kole, J., Puttaraju, M., Yang, C.C., Garcia-Blanco, M.A., Cohn, J.A.,

148. Mitchell, L.G. (2000) Repair of CFTR mRNA by spliceosome-mediated RNA trans-splicing. Gene Therl, 1885-95

149. Mazo, A.M., Mizrokhi, L.J., Karavanov, A.A., Sedkov, Y.A., Krichevskaja, A.A., Ilyin, Y.V.1989) Suppression in Drosophila: su(Hw) and su(f) gene products interact with a region of gypsy (mdg4) regulating its transcriptional activity. EMBOJ 8, 903-11

150. Melnick, A., Ahmad, K.F., Arai, S., Polinger, A., Ball, H., Borden, K.L., Carlile, G.W., Prive,

151. G.G., Licht, J.D. (2000) In-depth mutational analysis of the promyelocyte leukemia zinc finger BTB/POZ domain reveals motifs and residues required for biological and transcriptional functions. Mol Cell Biol 20, 6550-67

152. Melnick, A., Carlile, G., Ahmad, K.F., Kiang, C.L., Corcoran, C., Bardwell, V., Prive, G.G.,1.cht, J.D. (2002) Critical residues within the BTB domain of PLZF and Bcl-6 modulate interaction with corepressors. Mol Cell Biol 22, 1804-18

153. Melnick, A., Licht, J.D. (1999) Deconstructing a disease: RARalpha, its fusion partners, andtheir roles in the pathogenesis of acute promyelocyte leukemia. Blood 93, 3167-215

154. Melnikova, L., Gause, M., Georgiev, P. (2002) The gypsy insulators flanking yellow enhancersdo not form a separate transcriptional domain in Drosophila melanogaster: the enhancers can activate an isolated yellow promoter. Genetics 160,1549-60

155. Mihaly, J., et al (1998) Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex. Cell Mol Life1. Sci 54, 60-70

156. Milot, E., et al (1996) Heterochromatin effects on the frequency and duration of LCR-mediatedgene transcription. Cell 87, 105-14

157. Modolell, J., Campuzano, S. (1998 ) The achaete-scute complex as an integrating device. Int J1. Dev Biol 42, 275-82

158. Morcillo, P., Rosen, C., Baylies, M.K., Dorsett, D. ( 1997) Chip, a widely expressedchromosomal protein required for segmentation and activity of a remote wing margin enhancer in Drosophila. Genes Dev 11,2729-40

159. Mu, Z.M., Chin, K.V., Liu, J.H., Lozano, G., Chang, K.S. (1994) PML, a growth suppressordisrupted in acute promyelocytic leukemia. Mol Cell Biol 14, 6858-67

160. Muller, S., Matunis, M.J., Dejean, A. (1998) Conjugation with the ubiquitin-related modifier

161. SUMO-1 regulates the partitioning of PML within the nucleus . EMBOJ11, 61-70

162. Muravyova, E., Golovnin, A., Gracheva, E., Parshikov, A., Belenkaya, T., Pirrotta, V.,

163. Georgiev, P. (2001) Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291,495-8

164. Murphy, W.J., Watkins, K.P., Agabian, N. (1986) Identification of a novel Y branch structureas an intermediate in trypanosome mRNA processing: evidence for trans splicing. Cell 47,517-25

165. Muto, A., et al (1998) Identification of Bach2 as a B-cell-specific partner for small mafproteins that negatively regulate the immunoglobulin heavy chain gene 3' enhancer. EMBOJll, 5734-43

166. Mutskov, V.J., Farrell, C.M., Wade, P.A., Wolffe, A.P., Felsenfeld, G. (2002) The barrierfunction of an insulator couples high histone acetylation levels with specific protection of promoter DNA from methylation. Genes Dev 16, 1540-54

167. Nappi, R.E., Guo, A.L., Petraglia, F., Bonati, M.E., Criscuolo, M., Ficarra, G., Zara, C.,

168. Genazzani, A.R. (1994) Pituitary and ovarian interleukin-1 alpha content changes according to estrous cycle and acute stress exposure. Gynecol Endocrinol 8, 259-64

169. Numoto, M., Niwa, O., Kaplan, J., Wong, K.K., Merrell, K., Kamiya, K., Yanagihara, K.,

170. Calame, K. (1993) Transcriptional repressor ZF5 identifies a new conserved domain in zinc finger proteins. Nucleic Acids Res 21, 3767-75

171. Ohtsuki, S., Levine, M., Cai, H.N. (1998) Different core promoters possess distinct regulatoryactivities in the Drosophila embryo. Genes Dev 12, 547-56

172. Okabe, S., Fukuda, T., Ishibashi, K., Kojima, S., Okada, S., Hatano, M., Ebara, M., Saisho, H.,

173. Tokuhisa, T. (1998) BAZF, a novel Bcl6 homolog, functions as a transcriptional repressor. Mol Cell Biol 18,4235-44

174. Orivel, J., Servigne, P., Cerdan, P., Dejean, A., Corbara, B. (2004) The ladybird Thalassasaginata, an obligatory myrmecophile of Dolichoderus bidens ant colonies. Natunvissenschaften 91,97-100

175. Parnell, T.J., Viering, M.M., Skjesol, A., Helou, C., Kuhn, E.J., Geyer, P.K. (2003) Anendogenous suppressor of hairy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila. Proe Natl Acad Sei USA 100, 13436-41

176. Pintard, L., et al (2003) The BTB protein MEL-26 is a substrate-specific adaptor of the CUL-3ubiquitin-ligase. Nature 425, 311-6

177. Pirrotta, V. (1999) Polycomb silencing and the maintenance of stable chromatin states. Results

178. Probl Cell Differ 25, 205-28

179. Pointud, J.C., Larsson, J., Dastugue, B., Couderc, J.L. (2001) The BTB/POZ domain of theregulatory proteins Brie a brae 1 (BAB1) and Brie a brae 2 (BAB2) interacts with the novel Drosophila TAF(II) factor BIP2/dTAF(II)155. Dev Biol 237, 368-80

180. Quignon, F., De Bels, F., Koken, M., Feunteun, J., Ameisen, J.C., de The, H. (1998) PMLinduces a novel caspase-independent death process. Nat Genet 20, 259-65

181. Ramos, S., Khademi, F., Somesh, B.P., Rivero, F. (2002) Genomic organization and expressionprofile of the small GTPases of the RhoBTB family in human and mouse. Gene 298,147.57

182. Read, D., Butte, M.J., Dernburg, A.F., Frasch, M., Kornberg, T.B. (2000) Functional studies ofthe BTB domain in the Drosophila GAF and Mod(mdg4) proteins. Nucleic Acids Res 28, 3864-70

183. Recillas-Targa, F., Bell, A.C., Felsenfeld, G. (1999) Positional enhancer-blocking activity ofthe chicken beta-globin insulator in transiently transfected cells. Proc Natl Acad Sci U SA 96,14354-9

184. Regad, T., Saib, A., Lallemand-Breitenbach, V., Pandolfi, P.P., de The, H., Chelbi-Alix, M.K.2001) PML mediates the interferon-induced antiviral state against a complex retrovirus via its association with the viral transactivator. EMBO J 20,3495-505

185. Rego, E.M., Pandolfi, P.P. (2002) Reciprocal products of chromosomal translocations inhuman cancer pathogenesis: key players or innocent bystanders? Trends Mol Med 8, 396-405

186. Reitman, M., Lee, E., Westphal, H., Felsenfeld, G. (1993) An enhancer/locus control region isnot sufficient to open chromatin. Mol Cell Biol 13, 3990-8

187. Rice, J.C., Allis, C.D. (2001) Histone methylation versus histone acetylation: new insights intoepigenetic regulation. Curr Opin Cell Biol 13,263-73

188. Richard, F.J., Dejean, A., Lachaud, J.P. (2004) Sugary food robbing in ants: a case of temporalcleptobiosis. C R Biol 327, 509-17

189. Rippe, K. (2001) Making contacts on a nucleic acid polymer. Trends Biochem Sci 26, 733-40

190. Rollins, R.A., Morcillo, P., Dorsett, D. (1999) Nipped-B, a Drosophila homologue ofchromosomal adherins, participates in activation by remote enhancers in the cut and Ultrabithorax genes. Genetics 152, 577-93

191. Ruggero, D., Grisendi, S., Piazza, F., Rego, E., Mari, F., Rao, P.H., Cordon-Cardo, C.,

192. Pandolfi, P.P. (2003) Dyskeratosis congenita and cancer in mice deficient in ribosomal RNA modification. Science 299,259-62

193. Sabatino, D.E., Cline, A.P., Gallagher, P.G., Garrett, L.J., Stamatoyannopoulos, G., Forget,

194. B.G., Bodine, D.M. (1998) Substitution of the human beta-spectrin promoter for the human agamma-globin promoter prevents silencing of a linked human beta-globin gene in transgenic mice. Mol Cell Biol 18, 6634-40

195. Sabbattini, P., Georgiou, A., Sinclair, C., Dillon, N. (1999) Analysis of mice with single andmultiple copies of transgenes reveals a novel arrangement for the lambda5-VpreBl locus control region. Mol Cell Biol 19, 671-9

196. Schubeler, D., Groudine, M., Bender, M.A. (2001) The murine beta-globin locus control regionregulates the rate of transcription but not the hyperacetylation of histones at the active genes. Proc Natl Acad Sci USA98, 11432-7

197. Schulman, B.A., et al (2000) Insights into SCF ubiquitin ligases from the structure of the Skpl

198. Skp2 complex. Nature 408, 381-6

199. Scott, K.S., Geyer, P.K. (1995) Effects of the su(Hw) insulator protein on the expression of thedivergently transcribed Drosophila yolk protein genes. EMBO J14, 6258-67

200. Seeler, J.S., Dejean, A. (2001) SUMO: of branched proteins and nuclear bodies. Oncogene 20,7243-9

201. Shehee, W.R., Oliver, P., Smithies, O. (1993) Lethal thalassemia after insertional disruption ofthe mouse major adult beta-globin gene. Proc Natl Acad Sci USA 90, 3177-81

202. Shopland, L.S., Hirayoshi, K., Fernandes, M., Lis, J.T. (1995) HSF access to heat shockelements in vivo depends critically on promoter architecture defined by GAF factor, TFIID, and RNA polymerase II binding sites. Genes Dev 9,2756-69

203. Sigrist, C.J., Pirrotta, V. (1997) Chromatin insulator elements block the silencing of a targetgene by the Drosophila polycomb response element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes. Genetics 147,209-21

204. Sipos, L., Mihaly, J., Karch, F., Schedl, P., Gausz, J., Gyurkovics, H. (1998) Transvection inthe Drosophila Abd-B domain: extensive upstream sequences are involved in anchoringdistant cis-regulatory regions to the promoter. Genetics 149, 1031-50

205. Sippel, A.E., Schafer, G., Faust, N., Saueressig, H., Hecht, A., Bonifer, C. (1993) Chromatindomains constitute regulatory units for the control of eukaryotic genes. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 58, 37-44

206. Spana, C., Harrison, D.A., Corees, V.G. (1988) The Drosophila melanogaster suppressor of

207. Hairy-wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon. Genes Dev 2,1414-23

208. Stebbins, C.E., Kaelin, W.G. Jr, Pavletich, N.P. (1999) Structure of the VHL-ElonginC

209. ElonginB complex: implications for VHL tumor suppressor function. Science 284, 455-61

210. Sternsdorf, T., Jensen, K., Will, H. (1997) Evidence for covalent modification of the nucleardot-associated proteins PML and SplOO by PIC1/SUMO-1. J Cell Biol 139, 1621-34

211. Strouboulis, J., Dillon, N., Grosveld, F. (1992) Developmental regulation of a complete 70-kbhuman beta-globin locus in transgenic mice. Genes Dev 6,1857-64

212. Sun, F.L., Elgin, S.C. (1999) Putting boundaries on silence. Cell 99, 459-62

213. Tashiro, S., Muto, A., Tanimoto, K., Tsuchiya, H., Suzuki, H., Hoshino, H., Yoshida, M.,

214. Walter, J., Igarashi, K. (2004) Repression of PML nuclear body-associated transcription by oxidative stress-activated Bach2. Mol Cell Biol 24, 3473-84

215. Tewari, R., Gillemans, N., Harper, A., Wijgerde, M., Zafarana, G., Drabek, D., Grosveld, F.,

216. Philipsen, S. (1996) The human beta-globin locus control region confers an early embryonic erythroid-specific expression pattern to a basic promoter driving the bacterial lacZ gene. Development 122, 3991-9

217. Tremml, G., Domínguez, C., Rosti, V., Zhang, Z., Pandolfi, P.P., Keller, P., Bessler, M. (1999)1.creased sensitivity to complement and a decreased red blood cell life span in mice mosaic for a nonfunctional Piga gene. Blood 94,2945-54

218. Trimborn, T., Gribnau, J., Grosveld, F., Fraser, P. ( 1999) Mechanisms of developmentalcontrol of transcription in the murine alpha- and beta-globin loci. Genes Dev 13, 11224

219. Tsukiyama, T., Becker, P.B., Wu, C. (1994) ATP-dependent nucleosome disruption at a heatshock promoter mediated by binding of GAF transcription factor. Nature 367, 525-32

220. Udvardy, A., Maine, E., Schedl, P. (1985) The 87A7 chromomere. Identification of novelchromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains. JMol Biol 185,341-58

221. Uren, A.G., Vaux, D.L. (1996) TRAF proteins and meprins share a conserved domain. Trends1. Biochem Sci 21,244-5

222. Vyas, P., Vickers, M.A., Simmons, D.L., Ayyub, H., Craddock, C.F., Higgs, D.R. (1992) Cisacting sequences regulating expression of the human alpha-globin cluster lie within constitutively open chromatin. Cell 69, 781-93

223. Wai, A.W., Gillemans, N., Raguz-Bolognesi, S., Pruzina, S., Zafarana, G., Meijer, D.,

224. Philipsen, S., Grosveld, F. (2003) HS5 of the human beta-globin locus control region: a developmental stage-specific border in erythroid cells . EMBO J 22,4489-500

225. Wang, Z.G., Ruggero, D., Ronchetti, S., Zhong, S., Gaboli, M., Rivi, R., Pandolfi, P.P. (1998)

226. PML is essential for multiple apoptotic pathways. Nat Genet 20,266-72

227. Waterman, M.L., Adler, S., Nelson, C., Greene, G.L., Evans, R.M., Rosenfeld, M.G. (1988) Asingle domain of the estrogen receptor confers deoxyribonucleic acid binding and transcriptional activation of the rat prolactin gene. Mol Endocrinol 2,14-21

228. Wei, W., Brennan, M.D. (2001) The gypsy insulator can act as a promoter-specifictranscriptional stimulator. Mol Cell Biol 21, 7714-20

229. West, A.G., Gaszner, M., Felsenfeld, G. (2002) Insulators: many functions, many mechanisms.1. Genes Dev 16, 271-88

230. Wijgerde, M., Grosveld, F., Fraser, P. (1995) Transcription complex stability and chromatindynamics in vivo. Nature 377, 209-13

231. Xie, W., Radominska-Pandya, A., Shi, Y., Simon, C.M., Nelson, M.C., Ong, E.S., Waxman,

232. D.J., Evans, R.M. (2001) An essential role for nuclear receptors SXR/PXR in detoxification of cholestatic bile acids. Proc Natl Acad Sci USA 98, 3375-80

233. Xu, H., Hoover, T.R. (2001) Transcriptional regulation at a distance in bacteria. Curr Opin1. Microbiol 4,138-44

234. Xu, Q., Li, M., Adams, J., Cai, H.N. (2004) Nuclear location of a chromatin insulator in

235. Drosophila melanogaster. J Cell Sci 111, 1025-32

236. Xue, F., Cooley, L. (1993) kelch encodes a component of intercellular bridges in Drosophilaegg chambers. Cell 72, 681-93

237. Xystrakis, E., Bernard, I., Dejean, A.S., Alsaati, T., Druet, P., Saoudi, A. (2004) Alloreactive

238. CD4 T lymphocytes responsible for acute and chronic graft-versus-host disease are contained within the CD45RChigh but not the CD45RClow subset. Eur J Immunol 34, 408-17

239. Yang, J., Cai, H., Tan, X. (1999) A model of closed epidural balloon inflation brain injury inrats. Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao 24, 516-20

240. Yoshida, C., et al (1999) Long range interaction of cis-DNA elements mediated byarchitectural transcription factor Bachl. Genes Cells 4, 643-55

241. Zhao, K., Hart, C.M., Laemmli, U.K. (1995) Visualization of chromosomal domains withboundary element-associated factor BEAF-32. Cell 81, 879-89

242. Zhong, S., Hu, P., Ye, T.Z., Stan, R., Ellis, N.A., Pandolfi, P.P. (1999) A role for PML and thenuclear body in genomic stability. Oncogene 18, 7941-7

243. Zhong, S., Muller, S., Ronchetti, S., Freemont, P.S., Dejean, A., Pandolfi, P.P. (2000) Role of

244. SUMO-1-modified PML in nuclear body formation. Blood 95, 2748-52

245. Zhou, J., Ashe, H., Burks, C., Levine, M. (1999) Characterization of the transvection mediatingregion of the abdominal-B locus in Drosophila. Development 126, 3057-65