Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

белки-регуляторы структуры хроматина HIRA и ASF1a человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "белки-регуляторы структуры хроматина HIRA и ASF1a человека"

На правах рукописи

ПУСТОВОЙТОВ МАКСИМ ВАЛЕРЬЕВИЧ

Белки-регуляторы структуры хроматина HIRA и ASFla человека: их взаимодействие и участие в процессе старения фибробластов in vitro

03 00 03 - Молекулярная биология 03 00 25 - Гистология, цитология и клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I

ь

МОСКВА 2005 год

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии ГОУ ВПО "Российский государственный медицинский университет" и в лаборатории биологии опухолевых клеток Фокс-Чейзовского Онкологического центра, Филадельфия, США.

Научные руководители: 1

Защита состоится 30 ноября 2005 года в 11 часов на заседании диссертационного' совета К208 073.02 в ФГУ "РКНПК" Росздрава по адресу 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15 А.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗСР РФ.

Доктор биологических наук, профессор Доктор

Ольга Олеговна Фаворова Питер Адаме (Peter Adams)

Официальные оппоненты Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук Ведущая организация'

Иткес Александр Вениаминович Прасолов Владимир Сергеевич Институт Биологии Гена РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

2/П972

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сгарение - это необратимое прекращение пролиферации клеток при достижении определенного числа удвоений популяции (числа Хайфлика), контролируемое уровнями экспрессии специфических генов Выяснение природы этих генов является принципиальным для создания стратегии подавления неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток.

Недавно проведенные исследования С Лова (S Lowe) и соавторов показали, что в стареющих клетках гены, ответственные за пролиферацию, кластеризованы в

транскрипционно неактивный хроматин, при этом включение генов в подобный хроматин обуславливает стабильную репрессию их транскрипции Конститутивный гетерохроматин находится в конденсированном состоянии на протяжении всего клеточного цикла и располагается в участках ДНК, содержащих многочисленные повторы, таких как перицентромерный район. Обычно данное состояние хроматина характеризуется гипоацетилированием гистонов, метилированием лизина 9 гистона НЗ (Ме'-К-НЗ) и связыванием белков НР1 Факультативный гетерохроматин является индуцибельным и наиболее часто может быть найден на одной их Х-хромосом человека, удерживаемой в состоянии транскрипционного покоя в процессе эмбриогенеза (способ инактивации X-хромосомы)

Было показано, что ОГ, образование которого индуцируется в стареющих клетках, относится к факультативному типу гетерохроматина При этом формирование ОГ связывается с передачей сигнала по рЯВ-пути и, следовательно, ингибирует экспрессию генов-мишеней фактора гранскрипции ЕР2, таких как циклин А, ПНРЯ и МсшЗ За исключением общих маркеров гетерохроматина, таких как Ме9-К-Н3 и НР1 белков, молекулярные компоненты ОГ являются мало охарактеризованными К тому же на I сегодняшний день мы не знаем перечня факторов, способствующих формированию ОГ, вклад которого в процесс старения также остается неизвестным

Дрожжевые белки Н1г1р, Ни2р, А8Р1р и их эволюционно консервативные ортологи обладают способностью к сборке хроматина т уИго и были выделены из клеточных

транскрипционно неактивном районе гетерохроматина, получившего назвайие островков гетерохроматина - ОГ Как известно, гетерохроматин представляет собой

лизатов в виде комплекса, содержащего новосинтезированные гистокш В дополнение к этому, в литературе было описано участие данных белков в процессе формирования гетерохроматина, сайленсенге теломер и центромер Белки Hirlp, Hir2p и ASFlp взаимодействуют между собой, и данное взаимодействие является основополагающим в процессе сайленсинга теломер, регулируемого активностью ASFlp. Известно также, что данные белки являются репрессорами генов гистонов, экспрессируемых во время S-фазы клеточного цикла Все вместе эти данные свидетельствуют о роли этих белков в процессе формирования структуры транскрипционно неактивного гетерохроматипа через процессы сборки и/или компактизации, а также репрессии как минимум одного класса генов, ответственных за пролиферацию клетки - репликационно зависимых гистонов. В клетках человека содержится единственная изоформа белка HIRA, представляющая собой слияние дрожжевых белков Hirlp и Hir2p, и два ортолога белка ASF1 - ASFIa и ASFlb В процессе выполнения диссертационной работы мы задались вопросом, определяет ли взаимодействие HIRA, ASFIa и ASFlb сборку ОГ и как следствие процесс старения?

Цели и задами. Выяснить, взаимодействуют ли человеческие белки семейства ASF1 с

HIRA, и в случае положительного ответа, изучить структурные основы взаимодействия

белков человека HIRA и ASFIa и их участия в изменении состояния хроматина в процессе

I

старения фибробластов человека Задачи исследования •

1 Установить, способны ли белки ASF1 и HIRA к взаимодействию т vitro и ш vivo.

2 В случае подтверждения этой гипотезы, проанализировать участки связывания белков HIRA и ASFIa.

3. Выявить варианты распределения HIRA и ASFIa в культуре фибробластов человека в зависимости от фазы клеточного цикла и возраста клеточной популяции.

4 Изучить влияние белков HIRA и ASFIa и их взаимодействия на формирование островков гетерохроматина как одного из важнейших этапов процесса старения

Научпая новизна. Все представленные в работе результаты имеют научную новизну В ходе проведения диссертационной работы мы разработали уникальный вариант двухгибридной системы, позволяющий находить белки, взаимодействующие с конкретной последовательностью аминокислот в исследуемом белке С помощью данной методики мы впервые показали, что белок человека ASFIa взаимодействует с коротким, эволюционно консервативным доменом В человеческого белка HIRA. Нами был проведен

всесторонний мутационный анализ участков взаимодействия белков HIRA и ASFla и установлены аминокислоты, необходимые для взаимодействия данных белков Используя эти результаты, впервые была получена кристаллическая структура взаимодействия этих белков Используя метод иигоиммунофлуоресцеиции с применением уникальных анти-ASFIa анппел, полученных в ходе данной работы, мы впервые показали, что белок ASFla 'имеет внутриядерное распределение, изменяющееся в зависимости от фазы клеточного цикла и возраста популяции первичных фибробластов человека Также, в ходе данной работы нами впервые была всесторонне изучена роль белков HIRA и ASFla в индукции процессов старения и увеличения компактизации хроматина в культуре человеческих фибробластов

Практическое значение. Как широко известно, большинство раковых клеток обладает

высоким темпом пролиферативного роста и неограниченным сроком жизни, что является

бледствием нарушения процессов старения клеточной популяции Действие большинства

фармакологических препаратов, применяемых в онкотерапии, направлено на остановку

деления опухолевых клеток При длительном приеме таких препаратов у пациентов

|наблюдаются множественные нежелательные побочные эффекты В дополнение к этому

клетки злокачественных новообразований с большой частотой вырабатывают

резистентность к применяемым препаратам Вот почему в настоящее время перед

учеными стоит задача поиска новых лекарственных препаратов, действующих по

принципиально другим механизмам Одним из путей ингибирования пролиферации

опухолевых клеток может быть индукция процессов старения Первым шагом на пути

создания таких лекарственных препаратов является поиск факторов, регулирующих этот

процесс в нормальный клетках В данной работе мы подробно изучили роль белков HIRA

и ASFla в индукции процессов старения, используя популяции первичных фцбробластов

человека Мы показали, что при сверхэкснресси этих белков в растущей популяции клеток

i

преждевременно индуцирует процесс старения Так же мы показали, что этот процесс ингибирустся при отсутствии белка ASFla в клетках вследствие невозможности компактизации хроматина Авторы выражают надежду, что полученные в ходе этой работы результаты мопт стать еще одним шагом в понимании индукции процесса старения и могут помочь в разработке нового поколения онкотерапевтических препаратов Так, например, мы полагаем, что применение препаратов, стимулирующих функцию белков HFRA и ASFla, может вызывать преждевременную индукцию процесса старения и полную остановку пролиферации опухолевых клеток

Апробации. Материалы работы были представлены на Ежегодной конференции "Хроматин и транскрипция", Сноумас, Колорадо, Июль, 2003; на 8-ой ежегодной научной

конференции имени Эдварда Д Лайстбайдера, Филадельфия, США Диссертационная работа была апробирована па кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии Российского государственного медицинского университета и Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и два тезисных сообщения, одно из которых было представлено в виде симпозиального доклада на международной конференции

Структура работы. Диссертационная работа состоит из следующих глав введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, благодарности, список литературы Диссертация изложена на 105 страницах и включает в себя 10 рисунков и 1 таблицу Список литературы содержит 246 источников

(

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Двухгибридная система. Выполнение двухстадийной двухгибридной системы подробно описано в статье Poustovoitov М, Serebriiskii 1, Adams PD A two-step| two-hybrid system to identify fiinctionally significant protein-protein interactions Methods 2004 Apr;32(4)'371-80 Получение полноразмерной копии гена ASFla. 1 мкл дрожжевой суспензии использованной для аналитического сиквенса и определения белка взаимодействующего с HIRA, был использован для ПЦР реакции с целью получения полноразмерной копии гена ASFla Для ПЦР реакции использовались праймерьг прямой содержащий сайт BamHl -5'GCGCGGATCCATGGCAAAGGTTCAGGTGAACAAT3' и обратный, содержащий сайт EcoRl - 5'GCGCGAATTCTCACATGCAGTCCATGTGGGATTC3' ПЦР продук! очищался на колонке для очистки ПЦР продуктов (Queagen, США). Длина продукта анализировалась с помощью агарозного гельэлектрофореза Полученный продует обрабатывался рестриктазами EcoRl и BamHl и клонировался в вектор pSGL5-Myc (Invitrogen, США) Правильность клонирования последовательности гена подтверждалась сиквенированием

Система транскрипции и трансляции in vitro. Реакция транскрипции и трансляции in vitro проводилась с использованием набора TNT Т7 Coupled Reticulocyte Lysate System согласно протоколу фирмы-производителя (Promega,CIIIA) в присутствие ^-метионнна В 1 Омкл реакции использовалось 0 2 мкг ДНК, при использовании одной плазмиды или по 0 1мкг каждой плазмиды при использовании двух плазмид. Реакция проводилась в течение двух часов при 30°С После чего 5мкл реакционной смеси использовалось для иммунопреципитации и 1мкл для подтверждения экспрессии белков

Культивирование клегок U20S и WF38. Человеческие остеосаркомные клетки U20S (АТСС клеточный банк, США, номер в каталоге ПТВ-96) выращивались в среде DMEM с добавлением 10% ФБС, при 37°С, с содержанием С02 5%

Первичные легочные фибробласты W138 (АТТТ клеточный банк, США номер в каталоге CCL-75) выращивались в среде DMEM с добавлением 20% ФБС и не основных аминокислот, при 37°С, с содержанием ССЪ 10%

Кратковременная сверхэкспрессня белков в культуре эукариотнческих клеток. Для

экспериментов с кратковременной сверхэкспрессией белков использовались клетки U20S Для этого, клерки рассеивались за день перед трансфекцией По достижении плотности в 40-60% среда на клетках заменялась на свежую Через четыре часа после замены среды проводилась трансфскция кальцийфосфатным методом Для этого в 500мкл 0 25М раствора СаС1 добавлялось ЗОмкг ДНК, после чего капельно добавлялся 500мкл 2xBBS рН 6 99 1 мл трансфекционной смеси инкубировался в течение 20 мин при комнатной температуре После этого смесь аккуратно перемешивалась путем барбитурации Затем смесь добавлялась к клеткам и аккуратно перемешивалась со средой. Через 12 часов инкубирования среда заменялась, еще чере! 24 часа клетки фиксировались для проведения реакции иммунопреципитации

Инфекция клеток WI38 ретровирусами. Селекция мнфнцнрованмх клеток с помогаыо аншбиотиков пуромнцнна и G418 (неомицина). Для создания ретровирусов использовались плазмидные вектора pBABE-puro-HA-RasV12 (были любезно предоставлены др Р А Вейнбергом (RA Weinberg)), на основе вектора pQCXIP (Clontech США) были созданы вектора- pQCXIP-HA-ASFla, pQCXIP-HA-ASFlb, pQCXIP-HA-HIRA, pQCXIN(Clontech CUIA)-Myc-H1RA, pQCXIP-GFP с кассетой для экспрессии малой шпилечной РНК для подавления экспрессии ASFla (промотер U6 и последовательность мшРНК-алгоритм создания описан др Г Ханноном-G Hannon), клонированной в 3'LTR Вирусные частицы производились,' используя пакующие клетки Феникс (Phoenix-G Nolan, Stanford University) Клетки Феникс рассаживались на 6 см культуральные чашки, по достижении 60% конфлуэнтности они котрансфецировались одним или двумя ретровирусными векторами и плазмидой, кодирующей G-гликопротеин оболочки вируса везикулярного стоматита человека, придающих значительну(о дополнительную стабильность, широкий тропизм и высокий титр получаемым вирионам Через 12 часов после грансфекции среда заменялась на свежую 24 часа спустя вируссодержащий супернатант собирался, фильтровался, к нему добавлялось 3 мл среды для клеток W138 и полибрен до конечной концентрации 8мкг/мл Первичные фибробласш W138

инкубировались с вируссодержащим супернатантом в течение 24 часов, после чего среда менялась на свежую, содержащую пуромицин (Змкг/мл) и/или G418 (500мкг/мл) Оценка динамики роста клеток н меченне клеток 5*-BrdlJ (бромдеюксиурндином). Для мечения клегок 5'-BrdU, к культуре клеток через 10 дней после инфекции и селекции в соответствующем антибиотике добавляли 5'-BrdU в конечной концентрации ЮмкМ Через один час клетки фиксировались и количество клеток, положительных на 5'-BrdU, оценивалось методом цитоиммунофлуоресценции

Иммунопрецнпитация. На одну реакцию иммунопреишштацин брали 5мкл реакции транскрипции трансляции in vitro, либо лизат клеток со сверхэкспрессированным белком/ами, содержащий 40мкг общего белка Для лизиса клеток использовали NP40 лизирующий буфер (50 шМ Tris-НС!, pH 8 0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 1 шМ PMSF, и 10 мкг/мл ингибиторы протеаэ [леупептин, апротинин и пепсгатин]) Для лизаюв, содержащих только эндогенные белки, на одну реакцию брали до 2мг общего белка При необходимое™ объем доводился до 500мкл ЫР40-буфером К раствору добавляли 1мкг соответствующих антител и инкубировали при 4°С от одного до четырех часов Затем добавляли при необходимости вторичные антитела и частицы сефарозы, покрытые протеином Л Инкубировали один час при 4°С Не связавшиеся белки отмывались путем 5-ми кратной промывки ЫР40-буфером Комплексы кипятились 5мин в 1х буфере Лэмли и наносились на полиакриламидный гель

ПААГ и иммуноблотинг. Анализ белков проводился с использованием Г1ААГ Перенос осуществлялся на PVDF мембрану (Millipore, C1JIA) Поликлональные антитела к ASFla использовали в разведении I 1,000 в 4% КСА Моноклональные антитела к HIRA использовали в разведении 1 20 в 4% растворе БСА Поликлональные антитела kiHIRA использовали в разведении 1 1,000 в 4% растворе БСА Моноклональные антитела к эпитопу Мус (Sigma, США) использовали в разведении 1 1,000 в 5% растворе БСА Моноклональные антитела к эпитопу НА использовали в разведении 1 '20 в 4% растворе БСА Поликлональные антитела к ß-актину (Sigma, США) использовали в разведении 110,000 в 4% БСА

Дизайн и производство полнклональиых антител к белку Asfla. Двух самок новозеландских белых кроликов иммунизировали рекомбинантным белком GST-ASFIa путем подкожного введения 750 мкг белка путем подкожного введения Антитела очищались путем аффинной хроматографии

ЦнтоиммунофлуоресцентныП анализ. Антитела к белку CENP-F были любезно предоставлены профессором Т Еном (Т. Yen, Fox Chase Cancer Center, США), антитела к белку NPAT были любезно предоставлены профессором В. Харпером (W Harper)

Использовали также антитела к белкам PCNA (РС10 и FL261) и PML (PG-M3) производства фирмы Santa-Cruz (США), антитела к PML (AB 1370) производства Chemicon (CIIJA) и антитела к 5'-BrdU, меченные FITC, фирмы Bectön-Dickinson (США) Антитела к белку ASFla (А87 и А88) были получены при иммунизации кроликов химерным белком Gst-ASFla, согласно описанной выше процедуре Для проведения цитоиммунуфлуоресцентного анализа клетки фиксировались в 4% парафармальдегиде в течение 10 минут и пермабилизировались в 0 2% растворе Tween20 в течение Змин После ^его производилась забивка в 3% растворе ВСА в течение часа или на ночь Затем проводилась обработка первичными и вторичными антителами ДНК окрашивалось с помощью DAPI Фотографии клеток получепы методом эпифлуоресцентной микроскопии I на микроскопе Nikon Eclipse 2600, используя охлаждаемую CCD камеру, или методом конфокальной микроскопии, используя микроскоп Nikon Microphot SA Анализ клеточного цикла. Клетки фиксировали в 70%-ном этаноле при 4'С и затем ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере с добавлением иодисгого пропидия Окрашенные клетки анализировали методом проточной цитофлоуриметрии на сортере FACScan и проводили математическую обработку данных с использованием пакета Cell Quest (Becton Dickinson).

ПЦР и ПЦР мутагене!. Для стандартной ПЦР реакции объем реакционной смеси составлял 100 мкл и содержал lxNative PFU буфер, 1 пМ прямого и обратного праймеров, 0,5 мМ каждого дезоксирибонуклеотида, и 1 единицу полимеразы PFU (Clontech, США) После исходной денатурации при 95°С в течение 4 минут, ДНК амплифицировали 35 циклов Каждый цикл состоял из 1 минуты дена1урации при 94°С, 2 мин отжига при 65°С, и 3 минут синтеза при 72°С Реакция завершалась инкубацией при 72°С в течение 10 мин Для ПЦР мутагенеза использовались две последовательные ПЦР реакции В первой реакции использовались один внешний праймер и один мутагенезный, для каждой мутации проводится две реакции для получения продуктов с 5' и с 3' конца от сайта мутации Во второй реакции происходит объединение двух продуктов предыдущих реакций с образованием полноразмерного продукта Правильность мутагенеза проверялась сиквенированием

I РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ' 6

Белок MIRA взаимодействует с белком ASFla в культуре клеток человека. Как было показано ранее в нашей лаборатории, функционирование белка H1RA полностью зависит от наличия в нем домена В - эволюционно консервативного участка из 36 аминокислот (а к 439-475), не имеющего гомологии с другими белками Чтобы дать оценку

функциональной значимости данного участка белка мы использовали метод двухстадийного двухгибридного исследования для нахождения белков, взаимодействующих с HIRA, но не взаимодействующих с HIRA с отсутствующим доменом В (HIRAdelB) Одним белком, для взаимодействия которого требовался домен В HIRA, был белок человека ASFIa (рис 1Б, IB)

Этот результат был подтвержден методами транскрипции т vitro и сверхэкспрессии НА-HIRA и Myc-ASFla в стабильной клеточной линии U20S При коэкспрессии HA-HIRA и Myc-ASFla и последующей иммунопреципитации, испопьзуя антитела к эпитопам НА или Мус, мы показали, что эти белки взаимодействуют между собой Так же мы не наблюдали взаимодействия при коэкспрессии HA-HIRAdelB и Myc-ASFla, что липший раз подтверждает результаты двухгибридного анализа

.ASFIa

ASF la

* - / ^ HIRA ИП ^^

H1RA»-ASFla»-

к'

ASFIa

Д ASFla ИП 4" 4"

HIRA» ASFIa»

ASFIa»-

ASF le миРНК

PlICyilOK 1 А) Положительный контроль на взаимодействие Б) Первая стадия двухгибридного исследования В) Вторая стадия двухгибридного исследования Г) Подтверждение взаимодействия эндогенных белков HIRA и ASFIa в клеточных экстрактах с использованием монокпональных (WCI19, контроль 9Е10) и полнклональных (D34, контроль преиммунное AT D34) Д) Подтверждение взаимодействия эндогенных белков HIRA и ASFIa в клеточных экстрактах с использованием полученных в ходе работы антител против ASFIa - А87 и А88, для контроля использовалась преиммунная сыворотка от тех же кроликов Е) Подтверждение специфичности AT против ASF I а Специфичная Полоска пропадает при нокдауне белка с помощью миРНК

В дополнение к этому мы показали взаимодействие HIRA и ASFIa in vivo В частности нами были получены высокоспецифичные кроличьи полигональные антитела к белку ASFIa Иммунопреципитации из клеточных экстрактов, используя анти-ASFla и анти-HlRA антитела с последующим Вестерп блотингом, показали, что эндогенные белки HIRA и ASFIa копреципитируют из экстрактов первичных и трансформированных клеточных линий (рис 1Г, 1Д) Таким образом,

методами in vitro и in vivo

мы показали, что белки HIRA и ASFIa стабильно взаимодействуют в человеческих

HA-HIRA*-

взаимодеиствие g <

контроль i> экспрессии Е

Во взаимодействии белков HIRA u ASFla принимают участие как электростатическое, так и гидрофобное взаимодействие.

I д Мы провели мутационный анализ

Ш^Р^ШЧЦ участков связывания белков HIRA и

^Цр г-

• «■> ASFla При анализе панели мутантов ASFla на способность взаимодействовать с HIRA, только мутанты ASFla(ED36-37AA) и ASFla(VGP62-64AAA), не взаимодействовали с HIRA (рис 2А). Мутанты ASF 1 а(ЕЕ 121,124 АА), ASFla(P,V144,146A,A) и ASFla(V45A), не нарушали способность , ASFla взаимодействовать с H[RA (рис 2А). На основании кристаллической структуры дрожжевого белка ASF 1 р, была построена трехмерная _ структура белка человека ASFla

Wf* Н- ^щш

y^J г t jMfL ЩЩшШтшШ^л (рис 2Б). Анализируя данную

структуру и, исходя из данных ~£)37 Е36 мутационного анализа, мы

предположили, что во

взаимодействии с HIRA принимают

участие отрицательно заряженные аминокислотные остатки 36F и 37D Так же, помимо

. t

электростатического взаимодействия, которое не является стабильным, в контакте с HIRA, скорее всего, участвует и гидрофобная инвагинация (карман) на поверхности ASFla (рис 2Б) Мутационный анализ аминокислотных остатков, образующих данную инвагинацию затруднен, так как они так же играют важную роль в образовании структуры белка

Так же был проанализирован участок связывания ASFla на белке HIRA (рис 3-5) Как уже говорилось ранее, домен В (а к. 439-475) в белке HIRA необходим для взаимодействия с ASFla Для того чтобы оценить наименьший участок HIRA, достаточный для взаимодействия с ASFla, была создана панель мутантов HIRA, содержащих постепенно уменьшающуюся последовательность аминокислот данного

D37

Рисунок 2.

белка (HA-HIRA421-729, HA-H1RA42I-709, HA-HIRA421-659, HA-HIRA421-609, НА-H1RA421-559, HA-H1RA421-509, GFP-HIRA421-499, GFP-HIRA421-489, GFP-H1RA421-479, GFP-HIRA421-469, GFP-HIRA421-459) (рис 3) Наименьшим участком H1RA, взаимодействующим с ASFIa, был GFP-HIRA421-479, то есть участок содержащих полный домен В белка HIRA (рис 3) Из этого можно сделать вывод, что домен В белка H IRA не только необходим, но и достаточен для взаимодействия с ASFIa

контроль эклресип

i iff 9)

if iff

ИП используя AT кяшотуНА

$$$$$$

f П

s $ $

t/ffff ////// ///

/

i i s i

mye ASFIa«* ASF1«

JÊÊfr myeASFli AÍF1|

Ш

Рисунок 3 Анализ панели мутантов HIRA, с целью нахождения наименьшею учаегка необходимого для взаимодействия с ASFIa

д

алее мы создали панель мутантов в домене В белка HIRA Как было сказано рыше, деления домена В (а к 439-475) полностью блокирует связывание HIRA с ASFIa Для более точного определения участка, необходимого для взаимодействия с ASFIa, были созданы четыре дслиции внутри домена В (HA-HIRA 421-729del439-448, HA-IIIRA 421 -

I

729del449-458, HA-HIRA 42J-729dcI459-468, HA-HJRA 421-729del469-475) (рис 4) Только

делеция а.к. 459-468 полноаью

tu«TO 421-72» d.1 4)»-«M 1 ........--£лтат«!6ЙЛ«|И£1М!1ЙОТ5

imiM »11-7» éti 44»-«« г впшл---------mimciMincws

hrtira 421-7?» del 4W-4M 4 HXBSIUlOtSmKrMlS..........ШЮТ5

hdIM 421-72» del 449-479 3 ECIMOfLUiKQVtT*TADCP.e.4TFL"IAG......

!ий1РА S EDin«l.tJtRQnTltTAS«WAItn£IACl£7S>FS

12 3 4 5

12 3 4 7

Рисунок 4 Делецнонный ппшпп В-домена HIRA

предотвращала взаимодействие IIIRA и ASFIa (рис 4).

При анализе данных аминокислот выяснилось, что па последовательность на своем ЫНг-конце содержит два высококонсервативных положительно заряженных api ининовых

аминокислотных остатка, а на своем СООН-конце отрезок

<е <r с? j

J? &

высококонсервативных гидрофобных аминокислотных остатков Сопоставляя эти данные с мутационным анализом ASFla и трехмерной моделью ASFla, построенной на основании кристаллической структуры дрожжевого белка ASFlp, мы пришли к выводу, что именно эти аминокислотные остатки могут быть важны для взаимодействия с ASFla Для проверки этой гипотезы была создана панель точечных мутантов на отрезке от а к 456-468 (HA-HIRA421-729 D456A, HA-HIRA421-729 G457A, HA-HIRA421-729 R458A, НА-HIRA421-729 R459A, HA-HIRA421-729 R460A, HA-HIRA421-729 I451D, HA-HIRA421-^ jr 729 L464D, HA-HIRA421-729

^ I466D, HA-HIRA421-729 1,L464,466D,D) (рис 5) Согласно нашей гипотезе, мутации в положительно заряженных аргениновых остатках R459, R460 и в гидрофобных остатках 1461, L464, 1466, полностью блокировали связывание с ASFla. Так же, подтверждая данную гипотезу, пептид, содержащий последовательность белка HIRA а к 453-467 эффективно блокировал взаимодействие между HIRA и ASFla в экспериментах т vitro (рис 6)

luHIIU 421-729

mycASFIa 1 ASFU ,

КОНТРОЛЬ i

внесения

ASF1. я» 4

чн^ тш "Щ^уф ф т

Шк am Ш»**

щвтт шт Ш Щ&-4** т* тл-т^Ш

¿ж* ¿ъ . ** г <т* mm

Рисунок 5 Мутационный анализ В-домена HIRA

ИЛ лслользуя AT к эт толу НА

контроль экспрессии

fiOug 1U0 lOug Wufl

EDIRKHt LKKOM TR TAOÖÄЦЯ1ТР1С1 AQLQTOOf t

Пептид на основе HIRA

rtadgrrritplcia

mm ть-ть **

ASFU «л*, mtm

Рисунок 6 Проверка эффективности пептида на основе последовательности НИ?А Для контроля использовался пептид того же состава, но произвольной последовательности в максимальной концентрации

Исходя из данных мутационного анализа участков связывания белков HIRA и ASFla и анализа их последовательности и структуры, был выбран участок HIRA (а к 421-729) для

создания кристалла комплекса ASFla и HIRA (рис 7) Анализ кристаллической структуры, полностью подтвердил результат мутагенезного анализа 1

На этой модели мы можем видеть, что во взаимодействии HIRA и ASFla важную роль играют электростатические взаимодействия между R459, R460 HIRA и D37 ASFla, помимо этго большую роль играет гидрофобное взаимодействие между 1461 и Р463 и гидрофобной инвагинацией на ASFla

Формирование ОГ связано с релокализяцней белкоп IURA Ii ASFla Предположение о том, что HIRA участвует в формировании ОГ, было впервые выдвинуто на основе анализа его локализации в первичных и трансформированных культурах клеток человека 1ак в асинхронно растущей кулыуре трансформированных клеток человека различного происхождения, таких как U20S, HCT! 16, WI38-VA13, SAOS2, MDAMD435, MCF7, IleLa и HL60 белок H1RA имел диффузное распределение в ядрах Напротив, в определенной части клеток в культурах первичных человеческих клеток, таких как WI38, IMR90 и MRC5 HIRA формировал от 10 до 30 (на одну клетку) ядерных тельца (Рис 8) Одним из ключевых отличий между первичными и трансформированными клеточными линиями является то, что только первичные клеточные линии могут подвергаться процессу старения

Рисунок 7 Модель взаимодействия HIRA и ASFla полученная на основании кристаллической стру ктуры

IMR90 (Р), |WI3B(Pi IMRC5 (Р) IWI38VA13 (Т)

М0АМВ435 (Т

Исходя из этого, мы

предположили, что

ядерные I ельца (ят),

компонентом которых

яутяегся Н1КА, могут

быть связаны с

запуском процесса

старения Процесс

старения популяции

Рисунок 8 (Р) - линии первичных клеток (Т) - линии трансформированных клеток Окрашивание моноклональными АТ к

НША первичных клеточных

культур может быть запущен активированными онкогенами или продолжительной пролиферацией в культуре Для проверки того, сможем ли мы индуцировать появление

ядерных телец НША активированными онкогенами, мы инфицировали культуру первичных фибробластов \VI38 ретровирусом, экспрессиругощим онкоген Яа8У12 Это индуцировало появление ятНША в практически 100% инфицированных клеток Для подтверждения гипотезы о том, что появление ятНША может быть индуцировано продолжительной культивацией, фибробласты \V138 пассировались начиная от удвоения популяции (У П) 29 до начала процесса старения популяции при У П 55, далее клетки анализировались на наличие в них ятН1ЯА и известных маркеров процессов старения (рис 9), таких как ассоциированная со старением активность р-галактозидазы (рис 9В), наличие ОГ (рис 9Б) и включение в ОГ варианта гистона макроН2А

А.

Яокусы ЮМ

5АН?

0-гал

Сокусы ма1фоН2А

># «э 01

" V " * 4>

Количеств уд»о«иий популяции фивровлаегм ^<38

в.

29 удвоений

'рош

1

/

55 удвоений Р0155 -

\

т

29 удвоений 5В удвоений

шикни (им)

Рисунок 9 Л Динамика изменения относительного количества клеток с различными маркерами старения Б Окраска молодых (29 УП) и стареющих (55 УП) клеток антителами к ИIК Л и ДЛПИ В Окраска молодых (29 УП) и стареющих (55 УП) клеток на активность Р-гал Г Культура клеток среднего позраста (УП 40) метилась 5'-ВгсШ в течение I 18 и 24 часов Подсчигывалось количество клеток содержащих или не содержащих ятН1ЯА положительных на 5'-Вг(Ш

Количество клеток с активной р-галактозидазой и наличием ОГ, в том числе и с макроН2А, увеличивалось экспоненциально в начале старения культуры клеток (рис 9А) Количество клеток с ятЬНЯА также увеличивалось при культивировании фибробластов XV13 8 , но они появлялись раньше и их количество увеличивалось не экспоненциально, а

линейно (рис 9А) При этом мы не наблюдали солокалвзащщ^ежду ятН1ЯА и ОГ (рис9Б) Для того, чтобы показать зависимость между образованием ятНГКА и выходом клеток из клеточного цикла, связанным со старением, асинхронно растущая культура фибробластов WI38 метилась химическим агентом, являющимся аналогом тимидина, 5'-BrdU в течение 1,18 или 24 часов, после чего клетки фиксировались и анализировались на включение 5'-BrdU (рис 9Г) Нами было показано, что в культуре клеток среднего возраста (УП 40), примерно 20% клеток всегда находится в S-фазе клеточного цикла За 24 часа практически все клетки, не содержащие axHIRA, прошли через S-фазу и содержали включения 5'-BrdU Клетки, содержащие ¡itHIRA, также метились 5'-BrdU, но с гораздо меньшей эффективностью. Исходя из этого, можно сделать вывод, что клетки с наличием ятШЯА вступают в S-фазу намного реже, чем клетки без ятШЯА Подводя итог, можно сказать, что в клетках, приближающихся к началу процесса старения и выходу из клеточного цикла, часть молекул белка HIRA в ядре клетки формирует ядерные тельца 10-30 ядерных телец HIRA, наблюдаемых нами в ядре индивидуальной клегки перед началом процесса старения, очень напоминают по размерам и своему количеству другие ядерные тельца - ядерные тельца PML Эти ядерные тельца разменом 0 2-1 0 мкм содержат белок PML и большое количество других белков Считается, что они участвуют во многих процессах в ядре клетки, в том числе в индукции процесса старения Я т PML становятся больше, и их количество увеличивается в клетках с началом процесса старения, так же сверхэкспрессия белка PML индуцирует процесс преждевременного старения, а его нокдаун нарушает процесс старения. Таким образом, кожно

предположить, что htIIIRA- это

Рисунок 10 Клетки окрашивались аитителами к белкам HIRA и

PML Композитная картинка (merge) получалась путем ятРМЬ В состав которых ВХОДИТ наложения канала HIRA на канал PML Наблюдается полное

совпадение каналов HIRA Действительно, при

" окрашивании клеток анштелами

против HIRA и PML и аналше их распределения с помощью )пифлуорссценгнои и

конфокальной микроскопии, мы 1 наблюдали полную

солокализацию между HIRA и PML (рис 10)

При инфекции клеток ретровирусом, экспрессирующим HA-HIRA, окраска с помощью антител против НА, так же подтвердила полную солокализацию с hiPML Как было показано ранее, ятРМЬ присутствуют во всех человеческих клетках, но HIRA «¡локализуется с ятРМЬ только в клетках, в которых, как мы предполагаем, скоро

начнется или уже начался процесс старения Таким образом, в клетках, приближающихся к инициации старения, часть молекул белка НЖЛ перераспределяется из нуклеоплазмы в ятРМЬ

ASFla имеет внутриядерное распределение тип которого меняется в зависимости от фазы клеточного цикла.

Белки семейства Hir (к которым относится HIRA) в дрожжах И дрозофиле физически и функционально взаимодействуют с ASFlp и т vivo регулируют процесс сайленсинга Таким образом, мы решили выяснить, каковы функциональные основы солокализации белков HIRA ASFla в человеческих клетках

Мы исследовали внутриклеточное распределение белка ASFla при помощи иммунофлуоресцентного анализа с использованием двух афинно-очищенных анти- ASFla кроличьих антител А87 и А88 полученных в ходе этой работы Независимо от типа анти-ASFla антител, ASFla всегда локализовался в ядрах клеток асинхронно растущей популяции первичных легочных фибробластов WH8 (рис ПА, 11Б-окраска ДАПИ на ДНК) и имел один из трех типов распределения находился в одном или в двух ядерных

доменах (рис 11В), имел гранулярное распределение (рис IIГ) или ASFla распределяется диффузно в ядре клетки (рис 11Д)

Окрашивание антителами не наблюдалось при подавлении экспрессии белка в клетках с помощью малой интерферирующей РНК (ми РНК), объектом воздействия которой была мРНК ASFla, что подтверждает специфичность антител к данному белку Гетерогенность распределения белка ASFla в ядрах асинхронно растущей популяции клеток может определяться тем, что распределение ASFla зависит от фазы клеточного цикла, что объясняется возможной ролью этого белка в регуляции экспрессии гистонов Для проверки этой гипотезы мы анализировали распределение белка ASFla в ядре на различных фазах клеточною цикла, используя для определения последних известные фазоспецифичные маркеры (рис 12). Клетки в S-фазе, выявляемые по кратковременному мечению ДНК 5'-BrdU практически никогда не содержали ASFla в

Рисунок 11 А, В-Д) Фибробласты WI38 окрашивались антителами к ASFla А) Типичный вид в поле зрения микроскопа при окраске фибробластов WI38 антителами на ASFla Б) Окраска DAPI на ДНК В) Ядерные домены формируемые ASFla Г) I ранулярный тип распределения ASFla Д) Диффузный тип распределения ASFla

составе ядерных доменов и очень часто -> вцдещ^ши ASFla с гранулярным распределением Клетки в 02-фазе клеточного цикла, определяемые по экспрессии белка CENP-F (Liao et а! 1995), в основном имели диффузное распределение ASFla

70, —_- -

□ ОЛР1(контроль) И ВпЛ»(5-фаза) Q СЕМР-Р(б2-фаза)

Рисунок 12 В 100 KjiL'i ка\ окрашенных ДАПИ (контроль), положительных на 5'-BrdU (маркер S-фазы) н положительных на CENP-F (маркер С2-фазы) обсчитывалось количество клеток с ядерными доменами ASFla, гранулярным типом и диффузным типом распределения ASFla Для каждого маркера проводилось три независимых эксперимента, показан средний результат со стандартным отклонением от среднего

Ядерный йомены Грйн/Сярный тип Дмфф/знь^тнл ASM« распределения распределения

4 КП ц NPAT.5 !&1Э>1( еявца UFA;

Другим известным маркером фаз клеточного цикла в первичных культурах человеческих

клеток является

регулятор транскрипции гистоновых генов белок NPAT (Ma et al 2000, Zhao et al 2000) В Gl-фазе клеточного цикла он выявляется в виде двух маленьких ядерных телец, расположенных на главных кластерах репликационно-

зависимых гистоновых генов в обласги р21 хромосомы 6, а в S-фазе формирует четыре ядерных тельца, солокализующихся с те же кластерами гистоновых генов хромосомы 6 и в области q21 хромосомы 1 (Ma et al 2000, Zhao et al 2000) Как и ожидалось, клетки с

Рисунок 13 А) Асинхронно растущие фибробласты 138 были зафиксированы и окрашены антителами к белкам А8Р1 а и ЫРАТ Б) В 100 клетках с двумя или четырьмя тельцами МРАТ обсчитывалось количество клеток с различным распределением А N КI ¿1

*-V ^к?*^

/ -ч.

_z домены ASFla Гранулярный и диффузный тип распределения б'-Вг<Ш-положительные juapnep S-фазы} ■ -

Рисунок 14 Клетки WI38 были арестованы в GO-фазе в среде без сыворотки, после добавления сыворотки клетку метились S'-BrdU, фиксировались и окрашивались антителами на ASFla, затем обсчитывалось количество клеток с различными типами распределения ASFla

18)l 20h 221) 24h 26h 28h 30h Часы после добавления сыворотки

двумя тельцами NPAT (т е клетки в G1 -фазе клеточного цикла) в основном содержали ядерные домены ASF1, а клетки с четырьмя тельцами NPAT (клетки в S-фазе клеточного цикла) - ASFla с гранулярным распределением (рис 13А и 13Б)

Так же мы провели эксперимент по остановке популяции клеток WI38 в GO фазе с помощью инкубации в клеточной среде без сыворотки в течение 24 часов После добавления сыворотки в среду; клетки синхронно входили в фазу G1 и далее синхронно проходили клеточный цикл Мы проанализировали распределение белка ASFla в ядрах клеток через различные промежутки времени после вступления в клеточный цикл Как показано на рисунке 14, при выходе клеток из фазы G1 и вхождении в S-фазу клеточного цикла (что оценивалось по включению 5'-BrdU) наблюдалось уменьшение клеток с ядерными доменами ASFla и увеличение суммарного количества клеток с гранулярным и

Суммируя полученные

результат, можно сделать выводы о гом, что в Gl-фазе клеточного цикла пролифирирующих клеток белок ASF 1 а А формирует один или два ядерных домена Напротив, в S-фазе и 02-фазе клеточного цикла белок ASFla распределен более равномерно, имея в основном гранулярное распределение в S-фазе и диффузное распределение в □2-фазе клеточного цикла.

При сравнении локализации ASFla и PML в асинхронно растущей популяции клеток человека наблюдалась взаимодействие между ядерными доменами, формируемыми ASFla в Gl-фазе клеточного цикла и htPML При иммунофлуоресцентном анализе было показано, что более 98% ядерных доменов ASFla диаметром более 2мкм находились в непосредственном контакте с одним ядерным тельцем PML (рис 15А). Так как HIRA мигрирует в htPML перед началом процесса старения, в таких клетках HIRA находился в непосредственном контакте с ядерными доменами ASFla (рис 15Б) При стимуляции преждевременного старения путем заражения клеток ретровирусом, кодирующим онкоген RasV12, и анализе расположения HIRA, ASFla и наличия ОГ (рис 16), выяснилось, что после заражения, количество клеток с ятНША, находящихся в непосредственном контакте с ядерными доменами ASFla, и клеток, содержащих ОГ,

диффузным распределением ASFla в ядрах клеток.

Рисунок 15 А Окрашивание клеток антителами к А8Р!а и РМI. Б Окрашивание клеток антителами к РМЬ, А8Р!а и НША

"острмш гатарохроматина

//////////

Рисунок 16 Преждевременное старение стимулировалось путем заражения культуры клеток ретроверусом кодирующим RasV12 , затем каждый день после инфекции подсчитывалось количество клеток содержашнк erHIRA, домены ASM а и ОГ

■ »астощт росло При этом увеличение количества клеток с ядерными доменами ASFla и как следствие, с частичной

солокализацией ядерных доменов HIRA и ASFla, было транзиторным, совпадающим с динамическим формированием ОГ Таким образом, в клетках с формирующимся ОГ, ядерные гельца PML, содержащие HIRA, находятся во временном контакте с ядерными доменами содержащими ASFla Исходя из этого, можно предположить, чго IURA и ASF 1 а играют важную роль в сборке ОГ В то время как ортологи H1RA и ASFla участвуют в формировании гетерохромазина в дрожжах и дрозофиле, мы предположили, что они участвуют в формировании ОГ в стареющих клетках человека С другой стороны, изменение локализации этих белков в стареющих клезках может быть отражением процесса, не имеющего отношения к структуре хроматина Для того чтобы проверить, приводят ли воздействия нарушающие , структуру хроматина к релокализации HIRA в ятРМГ, мы

a 1

обработали кулмуру клеток WI38 трихостагином A (TSA) или бутиратом нагрия (NaBu), являющимися ингибиторами деацетилаз гистонов, усиливающих ацетилирование гистонов и разрушение гетерохроматина (рис 17) При воздействии обоих веществ наблюдалась релокалиция HIRA в ятРМЬ. Таким образом, локализация HIRA в ядерные зельца PML коррелирует с изменением структуры хроматина

Sj

Is Л'

Ч" IК

//У //

Рисунок 17 Клетки обрабатывались ТБА или ЫаВи, затем иодсчитывалось количество клеток содержащих ятНША

HIRA u ASFla, но не ASFlb могут индуцировать формирование ОГ Для прямой проверки того, могут ли HIRA и ASFla индуцировать появление ОГ, первичные человеческие фибробласты были инфицированы' ретровирусами, экспрессирукмцими либо HIRA, либо ASFla, либо оба белка вместе И HIRA, и ASFla вызывали появление маркеров старения в популяции фибробластов Этот эффект был еще больше выражен при инфекции клеток двумя белками одновременно При этом белок ASFlb неактивен в

ASFla ► ASF1Ь ►

данных экспериментах (рис 18) Данные результаты подтверждагог гипотезу о том, что H1RA и ASFla играют важную роль в индукнии ОГ и процесса старения

Для индукции образования ОГ необходимо взаимодействие между HIRA и ASFla. Ранее было опубликовано, что дрожжевые ортологи HIRA и ASFla физически взаимодействуют между собой, так же мы показали выше, что человеческие белки формируют стабильный внутриклеточный комплекс Впервые нами было показано, что HIRA взаимодействовал с ASFlb во много раз слабее, чем с ASFla как в экстрактах человеческих клеток, так и т vitro Факт того, что ASFla способен эффективно взаимодействовать с HIRA и индуцировать ОГ, в то время как ASFlb не способен на это. может говорить о том, что для индукции ОГ необходимо взаимодействие между двумя белками

Для проверки этой гипотезы, мы провели мутационный анализ участков связывания белков HIRA и ASFla При анализе панели мутантов ASFla на способность взаимодействовать с HFRA и индуцировать ОГ, нами было отмечено, что только мутанты ASFla(ED36-37AA) и ASFla(VGP62-64AAA), не взаимодействующие с HIRA (как было показано ранее в начале исследования см рис 2), были не способны индуцировать ОГ Мутанты, не нарушающие способность ASFla взаимодействовать с HIRA (ASF 1 а(ЕЕ 121,124АА). ASFla(P,V144,146A,A) и

„■Г лГ >\» л

V»* ^ $ / ^

Рисунок 18 Клетки заражались ретровирусамн кодирующими Н1ЯА, А8Р1а, Н1КА и АЯПа, А8Р!Ь и пустым ретровирусом в качестве контроля

Подсчет количества клеток активных на СС-В-гал

!!

Ill

у . s/s

if'

it ^ -у

Варианты ¿8Р1э

Рисунок 19 Клетки заражались рстровирусами содержащими различные мутанты А5Р1а и контрольным ретровирусом, затем подсчигывалось количество клеток содержащих ОГ

ASFla(V45A)), сохранили способность индуцировать ОГ (рис 19) Таким образом, нами наблюдалась строгая корреляция между способностью ASFla взаимодействовать с HIRA и его способностью индуцировать ОГ

Для подтверждения гипотезы о том, что для индукции»^ зависит от взаимодействия

HIRA и ASFla, описанные выше точечные мутанты HIRA были реклонированы в ретровирусный вектор pQCXIP-HA При инфекции фибробластов WI38 ретровирусами, содержащими данные мутанты HIRA, наблюдалась полная корреляция между способностью мутангного белка

взаимодействовав с ASFla и индуцировать преждевременное старение популяции клеток и ОГ (рис 20)

LL

-j- 454 t

О 3»

S 30* о

Iii 254

5 20»

h 15*

О 10% J

о 5% а

С 0!4 t-' мутанты HIRA

I

_ i

✓ / У / //

Рисунок 20. Клетки заражались ретровирусами кодирующими различные мутанты }Ш<А, затем определялся процент клеток содержащих ОГ (БАНЕ)

ASFla необходим для формирования ОГ

Для того чтобы оцепить необходимость формирования комплекса HIRA/ASFla для изменения структуры хроматина в стареющих клетках, мы заражали культуру W138 ретровирусом, экспрессирующим онкоген RasVl2. и

ретровирусом, экспрессирующим мшРНК, подавляющую экспрессию ASFla Как контроль использовались либо два пустых ретровируса (отрицательный контроль на индукцию ОГ), либо ретвирусы, экспрессирующие RasV12 и мшРНК, подавляющую экспрессию люциферазы (положительный контроль на индукцию ОГ) Подавление экспрессии ASFla нрактчески предотвращало обраювание ОГ (рис 21) Таким образом, мы показали, что ASFla необходим для формирования ОГ

В ходе диссертационной работы, нами было получено три независимых доказательства ключевой роли HIRA и ASFla в процессе формирования ОГ в стареющих клетках Во-первых, сходная внутриклеточная локализация эндогенных HIRA и ASFla во времени привязывается к

ü-

I SO" <

э 70*

I

S

Ь 40

3- 20*» 8.

С «•/.

чР

у

Рисунок 21 Клетки заражались ретровирусами кодирующими Яа$У12 и мшРНК к Люцифер азе, ИазУИ и мшРНК к АБР^а, и контрольным ретровирусом, затем клетки окрашивались ДАГШ После этого подсчитывалось количество клеток содержащих ОГ (вАНИ) Проводилось три независимых эксперимента, подсчшывался среди и и результат и отклонение от среднего

моменту формирования ОГ В растущих клетках первичной культуры H1RA имеет диффузный тип распределения внутри нуклеоплазмы Однако, по мере достижения клетками стадии старения, HIRA накапливается в ятРМЬ (рис 8, 9, 10) На этом этапе локализация ятРМГ. перекрывается с ядерными доменами ASFla, и количество клеток, содержащих ядерные домены ASFla, увеличивается пропорционально формированию комплексов ОГ Подобная согласованная релокализация HIRA и ASFla проявляется в резком увеличении клеток, содержащих ассоциированные с HIRA ятРМЬ, перекрывающиеся с доменами ASFla, способствующих формированию ОГ (рис16) Во-вторых, эктопическая сверхэкспресиия HIRA и ASFla в клетках первичных культур способствует формированию ОГ (рис 18) Так же, нами была отмечена строгая корреляция между способностью HIRA и ASFla инициировать формирование ОГ и их способностью взаимодействовать друг с другом, указывающая на необходимость физической ассоциации HIRA и ASFla в процессе формирования структуры ОГ (рис 19, 20) Данная особенность хорошо иллюстрируется на примере корреляции отсутствия взаимодействия между ASFlb и HIRA и его неспособностью инициировать ОГ То есть, полученные нами данные свидетельствуют о неспособности ASFlb инициировать ОГ из-за отсутствия взаимодействия с H1RA В-третьих, нокдаун ASFla при помощи кшРНК блокирует формирование ОГ (см рис 21), что еще раз подтверждает первичную роль ASFla в инициации формирования ОГ Выводы:

1 Разработан двухэтапный вариант двухгибридной системы, позволяющий вычленять из совокупности белковых партнеров, взаимодействующих с исследуемым белком -"наживкой", те белки, которые взаимодействуют с определенными элементами структуры исследуемого белка

2 С помощью этого метода показано, что белок человека ASFla взаимодействует с белком HIRA через домен В последнего Методом коиммунопреципитации H1RA и ASFla в лизате фибробластов человека специфическими полиАТ к каждому из белков показано, что эти белки взаимодействуют in vivo.

3 Направленный мутагенез аминокислотных остатков домена В белка HIRA и аминокислотных остатков белка ASFla, предположительно локализованных на его поверхности (по аналогии с дрожжевым ASF1), позволил детализировать участки взаимодействия двух белков Результаты направленного мутагенеза получили полное подтверждение при исследовании комплекса ASFla с пептидом, соответствующим домену В белка HIRA, методом ядерною магнитного резонанса в растворе

4 Используя метод иммуноцитофлуоресценции^прщл^нением анти-ASFIa антител, установили, что белок ASFla имеет, по крайней мере, три варианта внутриядерного распределения, изменяющееся в зависимости от фазы клеточного цикла

5 Иммунитонофлуоресцентный анализ показал, что на ранних этапах старения первичных фибробластов человека белок HIRA локализуется в ядерные тельца PML, которые временно находятся в тесном контакте с ядерными доменами ASFla Период этого контакта совпадает со временем формирования островков гетерохромагина в стареющих клетках

6 Показано, что сверхэкспрессия белков ASFla и H1RA в первичных фибробластах человека индуцирует их преждевременное старение Сверхэкспрессия мутантных форм ASFla и HIRA, утративших способность взаимодействовать с белковым партнером, не вызывает старения фибробластов Таким образом, взаимодействие белков HIRA и ASFla необходимо для индукции процесса старения

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 М В Пустовойтов, О О Фаворова, П Д Адаме Внутриядерное распределение белка ASF1 а зависит от фазы клеточного цикла Вестник РГМУ 2005 Ноябрь 7

2 Zhang R, Poustovoitov MV, Ye X, Santos HA, Chen W, Daganzo SM, Erzberger JP, Serebrnskii IG, Canutescu AA, Dunbrack RL, Pehrson JR, Berger JM, Kaufman PD, Adams PD Formation of MacroH2A-contaming senescence-associated heterochromatin foci and senescence driven by ASFla and IIIRA Dev Cell 2005 Январь (1)19-30

3 Ye X, Poustovoitov M, Santos H, Nelson DM, Adams PD Biochemical analysis of the cell cycle and cell cycle checkpoints in transiently transfected cells after collection with magnetic beads Methods Mol Biol 2004;281 261-70

4 Poustovoitov M, Serebriiskil I, Adams PD A two-step two-hybrid system to identify functionally significant protein-protein interactions Methods 2004 Апрель ;32(4) 37180

5 Maxim Poustovoitov, Ilidelita Santos, Xiaofen Ye, David Nelson, Olga Favorova and Peter Adams Human HIRA, the chromatin assembly factor ASFla, and PML nuclear bodies collaborate to control histone gene expression during the cell cycle, differentiation and senescence Ежегодная конференция "Хроматин и транскрипция" Сноумас, Колорадо, Июль, 2003

6 Maxim Poustovoitov, Hidelita Santos, Xiaofen Ye, Ilya Serebrnskii, David Nelson, Erica Golemis and Peter Adams Human HIRA, the cromatin assembly factor ASFla, and PML nuclear bodies collaborate to control histone gene expression during the cell cycle,

differentiation and senescence Восьмая ежегодная научная конференция имени Эдварда Д Лайстбайдера Филадельфия, США, Июнь 2003, СИМПОЗИАЛЬНЫЙ ДОКЛАД

№ 19 9 50

РНБ Русский фонд

2006-4 17123

»•"•"-"«•к

•»?% i i » #

/

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пустовойтов, Максим Валерьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Уровни компактизации хроматина.

1.1 Гистоновые белки, первичный уровень укладки хроматина.

1.2 Нуклеосомные фибриллы.

1.3 Петельно-доменный уровень компактизации хроматина.

1.4 Негистоновые белки хроматина.

Глава 2. Регуляция структуры хроматина и ее влияние на экспрессию генов.

2.1 Факторы, регулирующие структуру хроматина.

2.1.1 АТФ-зависимые ремоделирующие комплексы.

2.1.2 Сравнение ремоделирукмцих комплексов по способности ремоделировать хроматин.

2.1.3. Механизм ремоделирования хроматина.

2.2 Регуляция структуры хроматина белком Rb.

2.2.1 pRb и деацетилазы гистонов.

2.2.2 pRb и ремоделирующие комплексы SWI/SNF.

2.2.3 Взаимодействие между ферментами модификации гистонов и АТФ-зависимыми комплексами, ремоделиующими нуклеосомы.

2.2.4 Роль отдельных pRb содержащих репрессорных комплексов на разных фазах клеточного цикла.

2.2.5 pRb и другие корепрессоры.

Глава 3. Модели и механизмы клеточного старения.

3.1 Репликативное старение, модель Хайфлика (Hayflick's model).

3.2 Регуляция клеточного цикла и теломерные последовательности.

3.3 Дисфункция теломер и нндуция клеточного старения.

3.4 Репликативное старение как ответ на стресс при культивировании.

3.5 Дополнительные пути клеточного старения.

Глава 4. Регуляция процессов старения: роль ядерных телец PML.

4.1 Роль белка PML в процессе старения.

4.2 PML как супрессор канцерогенеза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Культивирование клеток U20S и WI38.

Инфекция клеток WI38 ретровирусами. Селекция инфицированных клеток с помощью антибиотиков пуромицина и G418 (неомицина).

Оценку динамики роста клеток в культуре.

Кратковременная гиперэкспрессия белков в культуре эукариотических клеток.

Синхронизацию культуры клеток WI38.

Получение поликлональных антител к белку ASFla.

Сочетанную реакцию транскрипции-трансляции in vitro.

Им мунопреципитация.

Кратковременная гиперэкспрессия белков в культуре эукариотических клеток.

Имму ноб л отинг.

Дрожжевая двухгибридная система.

Цитоиммунофлуоресцентный анализ.

Анализ клеточного цикла.

ПЦР и направленный мутагенез.

Получение полноразмерной копии гена ASFla.

Анализ структуры комплекса белка ASFla с пептидом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Белок HIRA взаимодействует с белком ASFla.

Во взаимодействии белков HIRA и ASFla принимают участие как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия.

Формирование островков гетерохроматина связано с изменением ядерной локализации белков HIRA.

ASFla имеет внутриядерное распределение, тип которого меняется в зависимости от фазы клеточного цикла.

HIRA и ASFla могут индуцировать формирование ОГ.

Для индукции образования ОГ необходимо взаимодействие между HIRA и ASFla.

Обсуждение.

HIRA и ASFla определяют частоту и необходимость формирования ОГ.83 ЯтРМЬ, HIRA, ASFla и супрессия туморогенеза.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "белки-регуляторы структуры хроматина HIRA и ASF1a человека"

Старение - это необратимое прекращение пролиферации клеток при достижении определенного числа удвоений популяции (числа Хайфлика), контролируемое уровнями экспрессии специфических генов. Выяснение природы этих генов не только необходимо для понимания молекулярных основ жизнедеятельности, но и является принципиальным для создания стратегии подавления неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток.

Недавно проведенные исследования (Narita et al, 2003) показали, что в стареющих клетках гены, ответственные за пролиферацию, кластеризованы в районе гетерохроматина, получившем название островков гетерохроматина (ОГ). Как известно, гетерохроматин представляет собой транскрипционно неактивный хроматин, и включение генов в подобный хроматин обуславливает стабильную репрессию их транскрипции. Различают конститутивный и факультативный типы гетерохроматина. Конститутивный гетерохроматин находится в конденсированном состоянии на протяжении всего клеточного цикла и располагается в участках ДНК, содержащих многочисленные повторы, таких как перицентромерный район хромосом. Обычно такое состояние хроматина характеризуется гипоацетилированием гистонов, метилированием гистона НЗ по остатку Lys9 и связыванием белка 1 гетерохроматина (НР1) (Maison at al, 2004). Факультативный гетерохроматин является индуцибельным и наиболее часто присутствует в одной из Х-хромосом женщин, удерживаемой в состоянии транскрипционного покоя в процессе эмбриогенеза (способ инактивации Х-хромосомы).

Показано, что гетерохроматин островков относится к факультативному типу, поскольку его образование индуцируется в стареющих клетках. Известно, что в инициацию процесса клеточного старения вовлечены два сигнальных пути, один из которых (так называемый ретинобластомный, или pRB-путь) включает подавление экспрессии генов, необходимых для прохождения клеточного цикла, в частности, таких как циклин А. За исключением общих маркеров гетерохроматина, к которым относятся Ьуз9-метилированный гистон НЗ и белок НР1, молекулярные компоненты ОГ недостаточно охарактеризованы. Кроме того, на сегодняшний день мы не знаем совокупности факторов, способствующих формированию ОГ, и их роли в процессе старения.

Дрожжевые белки Hirlp, Hir2p, ASFlp и их эволюционно консервативные ортологи способствуют сборке хроматина in vitro и были выделены из клеточных лизатов в виде комплекса, содержащего новосинтезированные гистоны. В литературе описано участие этих белков в процессе формирования гетерохроматина, в том числе на теломерных и центромерных участках хромосом (Krawitz et al, 2002; Tagamiet al, 2004). Белки Hirlp, Hir2p и ASFlp взаимодействуют между собой, и это взаимодействие является основополагающим в процессе образования гетерохроматина теломер (Sharp et al, 2001). Известно также, что эти белки являются репрессорами генов гистонов, экспрессируемых во время S-фазы клеточного цикла (Nelson et al, 2002). В совокупности эти данные свидетельствуют об участии белков Hirlp, Hir2p и ASFlp в формировании структуры транскрипционно неактивного гетерохроматина через процессы сборки и/или компактизации, а также путем репрессии, ответственных за пролиферацию клетки.

В клетках человека к настоящему времени обнаружена единственная изоформа белка HIRA, который содержит последовательности, гомологичные дрожжевым белкам Hirlp и Hir2p, и два ортолога белка ASF1 - ASFla и ASFlb (Lorain et al, 1996; Sillje et al, 2001). Однако до сих пор остается открытым вопрос, взаимодействуют ли человеческие белки семейства ASF1 с HIRA? Цель исследования: Выяснить, взаимодействуют белки человека из семейства ASF1 с белком HIRA, по аналогии с процессами, выявленными у дрожжей, и в случае положительного ответа изучить структурные основы взаимодействия белков HIRA и ASFla и их участие в изменении состояния хроматина в процессе старения фибробластов человека. Задачи исследования:

1. Установить, способны ли белки ASF1 и HIRA человека к взаимодействию in vitro и in vivo.

2. В случае подтверждения этой гипотезы, проанализировать участки связывания белков HIRA и ASFla.

3. Выявить варианты распределения HIRA и ASFla в культивируемых фибробластах человека в зависимости от фазы клеточного цикла и возраста клеточной популяции.

4. Изучить влияние белков HIRA и ASFla и их взаимодействия на формирование ОГ - один из важнейших этапов старения.

Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Пустовойтов, Максим Валерьевич

выводы

1. Разработан двухэтапный вариант двухгибридной системы, позволяющий вычленять из совокупности белковых партнеров, взаимодействующих с исследуемым белком, те белки, которые взаимодействуют с определенными элементами структуры исследуемого белка.

2. С помощью этого метода показано, что белок человека ASFla взаимодействует с белком HIRA через домен В последнего. Методом коиммунопреципитации HIRA и ASFla в лизате фибробластов человека специфическими антителами к каждому из белков показано, что эти белки взаимодействуют in vivo.

3. Направленный мутагенез аминокислотных остатков домена В белка HIRA и аминокислотных остатков белка ASFla, предположительно локализованных на его поверхности (по аналогии с дрожжевым ASF1), позволил детализировать участки взаимодействия двух белков. Результаты направленного мутагенеза получили полное подтверждение при исследовании комплекса ASFla с пептидом, соответствующим домену В белка HIRA, методом ядерного магнитного резонанса в растворе.

4. Используя метод иммуноцитофлуоресценции с применением анти-ASFla антител, установили, что белок ASFla имеет, по крайней мере, три варианта внутриядерного распределения, изменяющееся в зависимости от фазы клеточного цикла.

5. Иммуцитонофлуоресцентный анализ показал, что на ранних этапах старения первичных фибробластов человека белок HIRA локализуется в ядерных тельцах PML, которые временно находятся в тесном контакте с ядерными доменами ASFla. Период этого контакта совпадает со временем формирования островков гетерохроматина в стареющих клетках.

Показано, что гиперэкспрессия белков ASFla и HIRA в первичных фибробластах человека индуцирует их преждевременное старение. Гиперэкспрессия мутантных форм ASFla и HIRA, утративших способность взаимодействовать с белковым партнером, не вызывает старения фибробластов. Таким образом, взаимодействие белков HIRA и ASFla необходимо для индукции процесса старения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям проф. д.б.н. Ольге Олеговне Фаворовой за внимательное руководство и конструктивную критику и др. Питеру Адамсу за предоставленную возможность выполнения работы в его лаборатории и консультативную помощь в осуществлении проекта.

Автор выражает глубокую благодарность проф. д.б.н. Ольге Олеговне Фаворовой и проф. Эрике Големис за организацию программы сотрудничества между Россиийским Государственным Медицинским Университетом и Фокс-Чейзовским Онкологическим Центром.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пустовойтов, Максим Валерьевич, Москва

1. Жимулев И.Ф. Хромомерная организация политенных хромосом. Наука. 1993. 564

2. Alcalay М, Tomassoni L, Colombo Е, Stoldt S, Grignani F, et al. 1998. The promyelocytic leukemia gene product (PML) forms stable complexes with the retinoblastoma protein. Mol Cell Biol 18: 1084-93

3. Alcorta DA, Xiong Y, Phelps D, Hannon G, Beach D, Barrett JC. 1996. Involvementof the cyclin-dependent kinase inhibitor pi 6 (INK4a) in replicative senescence ofnormal human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci US A 93: 13742-7

4. Ascoli CA, Maul GG. 1991. Identification of a novel nuclear domain. J Cell Biol 112:785.95

5. Atadja P, Wong H, Garkavtsev I, Veillette C, Riabowol K. 1995. Increased activity of p53 in senescing fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA 92: 8348-52 Borden KL. 2000. RING domains: master builders of molecular scaffolds? J Mol Biol 295: 1103-12

6. Borden KL, Campbell Dwyer EJ, Salvato MS. 1998. An arenavirus RING (zinc-binding) protein binds the oncoprotein promyelocyte leukemia protein (PML) and relocates PML nuclear bodies to the cytoplasm. J Virol 72: 758-66

7. Brehm A, Nielsen SJ, Miska EA, McCance DJ, Reid JL, et al. 1999. The E7 oncoprotein associates with Mi2 and histone deacetylase activity to promote cell growth. Embo J 18: 2449-58

8. Chen TT, Wang JY. 2000. Establishment of irreversible growth arrest in myogenic differentiation requires the RB LXCXE-binding function. Mol Cell Biol 20: 5571-80

9. Cohen N, Sharma M, Kentsis A, Perez JM, Strudwick S, Borden KL. 2001. PML RING suppresses oncogenic transformation by reducing the affinity of eIF4E for mRNA. Embo J 20: 4547-59

10. Dick FA, Sailhamer E, Dyson NJ. 2000. Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins. Mol Cell Biol 20: 3715-27

11. D'Orazi G, Cecchinelli B, Bruno T, Manni I, Higashimoto Y, et al. 2002. Homeodomain-interacting protein kinase-2 phosphorylates p53 at Ser 46 and mediates apoptosis. Nat Cell Biol 4: 11-9

12. Dunaief JL, Strober BE, Guha S, Khavari PA, Alin K, et al. 1994. The retinoblastoma protein and BRG1 form a complex and cooperate to induce cell cycle arrest. Cell 79: 119-30

13. Dyson N. 1998. The regulation of E2F by pRB-family proteins. Genes Dev 12: 224562

14. Ecsedy JA, Michaelson JS, Leder P. 2003. Homeodomain-interacting protein kinase 1 modulates Daxx localization, phosphorylation, and transcriptional activity. Mol Cell Biol 23: 950-60

15. Fagioli M, Alcalay M, Pandolfi PP, Venturini L, Mencarelli A, et al. 1992. Alternative splicing of PML transcripts predicts coexpression of several carboxy-terminally different protein isoforms. Oncogene 7: 1083-91

16. Ferbeyre G, de Stanchina E, Querido E, Baptiste N, Prives C, Lowe SW. 2000. PML is induced by oncogenic ras and promotes premature senescence. Genes Dev 14: 2015-27

17. Grande MA, van der Kraan I, van Steensel B, Schul W, de The H, et al. 1996. PML-containing nuclear bodies: their spatial distribution in relation to other nuclear components. J Cell Biochem 63: 280-91

18. Grobelny JV, Godwin AK, Broccoli D. 2000. ALT-associated PML bodies are present in viable cells and are enriched in cells in the G(2)/M phase of the cell cycle. J Cell Sci 113 Pt 24: 4577-85

19. Grunstein M. 1997. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature 389: 349-52

20. Guo A, Salomoni P, Luo J, Shih A, Zhong S, et al. 2000. The function of PML inp53-dependent apoptosis. Nat Cell Biol 2: 730-6

21. Harbour JW, Luo RX, Dei Santi A, Postigo AA, Dean DC. 1999. Cdkphosphorylation triggers sequential intramolecular interactions that progressivelyblock Rb functions as cells move through Gl. Cell 98: 859-69

22. Harley CB, Futcher AB, Greider CW. 1990. Telomeres shorten during ageing ofhuman fibroblasts. Nature 345: 458-60

23. He J, deCastro CM, Vandenbark GR, Busciglio J, Gabuzda D. 1997. Astrocyte apoptosis induced by HIV-1 transactivation of the c-kit protooncogene. Proc Natl Acad Sci USA 94: 3954-9

24. Jensen K, Shiels C, Freemont PS. 2001. PML protein isoforms and the RBCC/TRIMmotif. Oncogene 20: 7223-33

25. Jiang WQ, Ringertz N. 1997. Altered distribution of the promyelocytic leukemia-associated protein is associated with cellular senescence. Cell Growth Differ 8: 51322

26. Kentsis A, Borden KL. 2000. Construction of macromolecular assemblages in eukaryotic processes and their role in human disease: linking RINGs together. Curr Protein Pept Sci 1: 49-73

27. Kingston RE, Narlikar GJ. 1999. ATP-dependent remodeling and acetylation as regulators of chromatin fluidity. Genes Dev 13: 2339-52

28. H, Leo C, Zhu J, Wu X, O'Neil J, et al. 2000. Sequestration and inhibition of Daxxmediated transcriptional repression by PML. Mol Cell Biol 20: 1784-96

29. M, Chen D, Shiloh A, Luo J, Nikolaev AY, et al. 2002. Deubiquitination of p53 by

30. Ma T, Van Tine BA, Wei Y, Garrett MD, Nelson D, et al. 2000. Cell cycle-regulated phosphorylation of p220(NPAT) by cyclin E/Cdk2 in Cajal bodies promotes histone gene transcription. Genes Dev 14: 2298-313

31. Magnaghi-Jaulin L, Groisman R, Naguibneva I, Robin P, Lorain S, et al. 1998. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature 391: 601-5

32. Matsuoka S, Huang M, Elledge SJ. 1998. Linkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2 protein kinase. Science 282: 1893-7

33. Melnick A, Licht JD. 1999. Deconstructing a disease: RARalpha, its fusion partners, and their roles in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia. Blood 93: 3167215

34. Meyerson M, Counter CM, Eaton EN, Ellisen LW, Steiner P, et al. 1997. hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization. Cell 90: 785-95

35. Misteli T. 2001. The concept of self-organization in cellular architecture. J Cell Biol 155:181-5

36. Mu ZM, Chin KV, Liu JH, Lozano G, Chang KS. 1994. PML, a growth suppressor disrupted in acute promyelocytic leukemia. Mol Cell Biol 14: 6858-67

37. Muller H, Helin К. 2000. The E2F transcription factors: key regulators of cell proliferation. Biochim Biophys Acta 1470: Ml-12

38. Muratani M, Gerlich D, Janicki SM, Gebhard M, Eils R, Spector DL. 2002. Metabolic-energy-dependent movement of PML bodies within the mammalian cell nucleus. Nat Cell Biol 4: 106-10

39. Nakamura TM, Morin GB, Chapman KB, Weinrich SL, Andrews WH, et al. 1997. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science 277: 955-9

40. Nayler O, Stratling W, Bourquin JP, Stagljar I, Lindemann L, et al. 1998. SAF-B protein couples transcription and pre-mRNA splicing to SAR/MAR elements. Nucleic Acids Res 26: 3542-9

41. Nibu Y, Zhang H, Levine M. 1998. Interaction of short-range repressors with Drosophila CtBP in the embryo. Science 280: 101-4

42. Nicolas E, Morales V, Magnaghi-Jaulin L, Harel-Bellan A, Richard-Foy H, Trouche D. 2000. RbAp48 belongs to the histone deacetylase complex that associates with the retinoblastoma protein. J Biol Chem 275: 9797-804

43. Pearson M, Carbone R, Sebastiani C, Cioce M, Fagioli M, et al. 2000. PML regulates p53 acetylation and premature senescence induced by oncogenic Ras. Nature 406: 207-10

44. Perlman R, Schiemann WP, Brooks MW, Lodish HF, Weinberg RA. 2001. TGF-beta-induced apoptosis is mediated by the adapter protein Daxx that facilitates JNK activation. Nat Cell Biol 3: 708-14

45. Robles SJ, Adami GR. 1998. Agents that cause DNA double strand breaks lead to pl6INK4a enrichment and the premature senescence of normal fibroblasts. Oncogene 16: 1113-23

46. Sahlas DJ, Milankov K, Park PC, De Boni U. 1993. Distribution of snRNPs, splicing factor SC-35 and actin in interphase nuclei: immunocytochemical evidence for differential distribution during changes in functional states. J Cell Sci 105 ( Pt 2): 347-57

47. Salomoni P, Pandolfi PP. 2000. Transcriptional regulation of cellular transformation. Nat Med 6: 742-4

48. Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe SW. 1997. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a. Cell 88: 593-602

49. Shanahan F, Seghezzi W, Parry D, Mahony D, Lees E. 1999. Cyclin E associates with

50. BAF155 and BRG1, components of the mammalian SWI-SNF complex, and alters theability of BRG1 to induce growth arrest. Mol Cell Biol 19: 1460-9

51. Shay JW, Pereira-Smith OM, Wright WE. 1991a. A role for both RB and p53 in theregulation of human cellular senescence. Exp Cell Res 196: 33-9

52. Shay JW, Wright WE, Werbin H. 1991b. Defining the molecular mechanisms ofhuman cell immortalization. Biochim Biophys Acta 1072: 1-7

53. Shiels C, Islam SA, Vatcheva R, Sasieni P, Sternberg MJ, et al. 2001. PML bodiesassociate specifically with the MHC gene cluster in interphase nuclei. J Cell Sci 114:3705-16

54. Strober BE, Dunaief JL, Guha, Goff SP. 1996. Functional interactions between the hBRM/hBRGl transcriptional activators and the pRB family of proteins. Mol Cell Biol 16: 1576-83

55. Stuurman N, de Graaf A, Floore A, Josso A, Humbel B, et al. 1992. A monoclonal antibody recognizing nuclear matrix-associated nuclear bodies. J Cell Sci 101 (Pt 4): 773-84

56. Takahashi Y, Rayman JB, Dynlacht BD. 2000. Analysis of promoter binding by the E2F and pRB families in vivo: distinct E2F proteins mediate activation and repression. Genes Dev 14: 804-16

57. Wong AK, Shanahan F, Chen Y, Lian L, Ha P, et al. 2000. BRG1, a component of the SWI-SNF complex, is mutated in multiple human tumor cell lines. Cancer Res 60: 6171-7

58. Wu S, Huang J, Dong J, Pan D. 2003. hippo encodes a Ste-20 family protein kinase that restricts cell proliferation and promotes apoptosis in conjunction with Salvador and warts. Cell 114: 445-56

59. Zhang HS, Gavin M, Dahiya A, Postigo AA, Ma D, et al. 2000. Exit from G1 and S phase of the cell cycle is regulated by repressor complexes containing HDAC-Rb-hSWI/SNF and Rb-hSWI/SNF. Cell 101: 79-89

60. Zhang HS, Postigo AA, Dean DC. 1999. Active transcriptional repression by the Rb-E2F complex mediates G1 arrest triggered by pl6INK4a, TGFbeta, and contact inhibition. Cell 97: 53-61

61. Zhao J, Kennedy BK, Lawrence BD, Barbie DA, Matera AG, et al. 2000. NPAT links cyclin E-Cdk2 to the regulation of replication-dependent histone gene transcription. Genes Dev 14: 2283-97

62. Zhu J, Woods D, McMahon M, Bishop JM. 1998. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes Dev 12: 2997-3007