Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние анаэробиоза на свойства хроматина и состав его негистоновых белков в проростках пшеницы и риса

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние анаэробиоза на свойства хроматина и состав его негистоновых белков в проростках пшеницы и риса"

РГ6 од

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДЛРСТВЕЮШЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ВОЙЦЕХОВСКАЯ Светлана Анатольевна

ВЛИЯНИЕ АНАЭРОБИОЗА 11А СВОПСТВА ХРОМАТИНА И СОСТАВ ЕГО НЕШЛОНОПЫХ БЕЛКОВ 8 ПРОРОСТКАХ ПШШЩ1 и РКСА

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 1996

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений Санкт-Петербургского университета и в лабораГоркн фотосинтеза Биологического научно-исследовательского института Санкт-Петербургского университета

Научный руководитель доктор биологических наук

профессор Т.О. Чиркова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

и.П. Гаврилок кандидат биологических наук, , оодуций научный сотрудник

В.И. Иаслов

Подуцая организация: Паучно-исслодоватольский

институт биологии и биофизики Томского государственного университета

Завита состоится "АС" 1996 г.

на заседании диссертационного совета К,063.57.12 по заците диссертации на соискание ученой степони кандидата биологических наук в Санкт-Паторбургскоы государственном унноерситоте по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, биолого-почвенный факультет СПбГУ.

С диссертацией ыоено ознакомиться о библиотеке им. Горького Санкт-Петербургского университета.

диссертационного совета, р а

кандидат биологических наук ✓ Ер"ИЛОва

Автореферат разослан "/¿_" _____ 1996 г

Учений секретарь

Актуальность темы. Ответная реакция организма ка неблагоприятное действие факторов внешней среды включает формирование как общих, так и специфических систем. Общей реакцией является синтез стрессовых белков, появление которых отмечено у эукзриот, в том числе и у растений, при различных экологических стрессах: водном, солевом, температурном, раневом, а также при действии тяжелых металлов. Недостаток,кислорода, возникающий при вымокании, выпрева-нии растений, при образовании ледяной корки, при создании асфальтовых покрытий в городах:, индуцирует синтез анаэробных полипептидов. Они представлены в основном цитоплазматическими белкзми -ферментами анаэробного обмена (Ricard et al., 1994). Синтез стрессовых белков связан с активацией их кодирующих генов, что в свою очередь б большой степени зависит от особенностей структурной организации хроматина ядра (Георгиев, 1989; Гранстайн, 1992). По современным представлениям существенная роль в регуляции генетического ответа организма отводится негистоновым белкам хроматина (НГБ) (Караванов, Афанасьев, 1983). Вместе с тем, в связи с анаэробным воздействием хроматин и его КГБ остаются маю исследованными (Чиркова, 1988). Поэтому для изучения ответа генетического аппарата растения на стрессоры необходимо проанализировать изменения, которые происходят в свойствах, структуре и составе ДНК-белковых комплексов ядрз. Ранее было показано, что после ансксическо-го воздействия а злектрофоретических спектрах НГБ хроматина пшеницы и риса появлялись полипептидные зоны, отсутствовавшие в условиях аэрации, что могло указывать на возможность синтеза при аноксии и некоторых ядерных белков (Чиркова и др., 1986). Однако, это предположение требовало более разностороннего и глубокого экспериментального рассмотрения.

Цель и основные задачи исследования. Целью работы являлось исследование влияния анаэробиоза на свойства хроматина и состав его НГБ в проростках растений, контрастных по устойчивости к недостатку кислорода.

В задачи работы входило изучение влияния указанного фактора на фракционный состав хроматина, его растворимость, количественные изменения в НГБ, а также на электрофоретический состав НГБ хроматина пшеницы и риса.

С целью выявления возможности синтеза ядерных белков при ано-ксии анализировали:

- влияние ингибиторов синтеза белка актиномицина Д (Акт. Д) и

- г -

циклогексимида (ЦТ) на содержание белка и состав НГБ хроматина в различных условиях аэрации;

- включение меченой аминокислоты во фракцию общего, растворимого белка и в НГБ хроматина пшеницы и риса в различных условиях газового режима.

Научная новизна. Проведено исследование влияния анаэробиоза на свойства хроматина и состав его НГБ у растений, различающихся по чувствительности к недостатку кислорода. Впервые показано, что по мере увеличения срока пребывания в бескислородной среде у пшеницы от 1 до 3 суток, а у риса от 3 до V суток наблюдались изменения фракционного состава хроматина, снижение растворимости его "тяжелой" фракции и возрастание в ее составе количества лабильно связанных с ДНК белков, что раньше проявлялось у неустойчивого растения. После анаэробного воздействия в составе НГБ "легкой" и "тяжелой" фракций хроматина растений обнаружены количественные и качественные изменения. Сопоставляя данные электрофоретического, ингибиторного анализов и результаты опытов по включению меченого глицина в ядерные белки проростков пшеницы и риса в различных условиях аэрации, впервые показана возможность синтеза при кратковременной аноксии некоторых НГБ хроматина. У устойчивого риса способность к синтетическим процессам сохранялась в течение более длительного, чем у пшеницы, срока аноксии (3 и 1 сутки соответственно) .

Практическая ценность. Результаты проведенных исследований дополняют сведения о механизмах адаптации растений к неблагоприятным внешним воздействиям и об участии в этих процессах генетического аппарата клетки. Полученные данные могут быть использованы для включения в общий курс лекций по физиологии и биохимии растений, а также в спецкурс физиологии устойчивости растений.

Апробация работы. Результаты, представленные в диссертации, обсуждались на 3 съезде ЕОФР (Санкт-Петербург, 1993), международном симпозиуме "Symposium of the International Society for Plant Anaerobiosis (Финляндия, 1995), международной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды" (Томск, 1995), международном симпозиуме "Физико-химические методы в физиологии растений" (Пенза, 1996) и на заседании кафедры физиологии растений Томского и Санкт-Петербургского госуниЕэрситетов (1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из вве-

дения, трех глаз, заключения, выводов, списка литературы (250 источников, из них 113 на русском и 137 на иностранных языках) и приложения. Материал изложен на 140 страницах, включающих 5 таблиц и 19 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты. В работе использованы 7-суточные проростки пшеницы (Tritio™ aestivum L.) сорта Ленинградка и 10-суточные проростки риса (Oryza sativa L.) сорта Краснодарский 424, различающиеся по устойчивости к недостатку кислорода. Растения выращивали на свету интенсивностью 80 Вт/мг при 20-22°С с фотопериодом 17 ч на модифицированной, аэрируемой среде Кнопа.

Постановка опытов. Для создания анаэробных условий растения помещали в эксикаторы объемом 2-3,5 л, с приемниками-поглотителями С0'2 (20% КОН), заполняемые в течение 1,5 ч газообразным азотом, в котором содержание кислорода не превышало 0,01%. Для исключения фотосинтеза растения помещали в темноту. Проростки пшеницы выдерживали в атмосфере азота 1 и 3 суток, а риса 1, 3 и 7 суток, согласно их разной устойчивости к дефициту кислорода (Чиркова, 1988).

В экспериментах с ингибиторами синтеза белка проводили 3-часовую предобработку контрольных и опытных вариантов растворами Акт. Д (80 мг/л) и ЦТ (10 мг/л). В качестве контрольных служили растения, прединкубированные 3 ч в дистиллированной воде, а затем помещенные в нормально аэрируемые, или анаэробные условия. В опытах о радиоактивным предшественником синтеза белка 2-14С-глицином (1 мкКи/мл) проростки пшеницы и риса выдерживали на нем в различных условиях газового режима в течение последних 3 ч экспозиции.

Выделение хроматина иэ растительного материала проводили путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, содержащем неионный детергент тритон К-100 ( Евдокимова, Маслов, 1989). В дальнейшей работе использовали ДНК-белковый материал из нижних слоев градиента сахарозы, концентрация 50-69% ("легкая" фракция), и образов

авшийся на дне осадок хроматина, концентрация 70% ("тяжелая" фракция). "Легкую" фракцию ДНП анализировали, на колонке с сефадек-сом G-200. Гистсны экстрагировали из хроматина 0,2 М H2SO4. НГБ "тяжелой" фракции разделяли на лабильно связанные с ДНК белки (ЛНгб). выделяемые 0,35 М NaCl, приготовленном на 20 мМ трис-буфе-ре pH 7,5 и прочно связанные с ДНК белки (ПНге)> оставшиеся после

удаления ЛНгб и гистоное.

Содержание белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).■

Содержание ДНК анализировали по методу Джильса и Мейерса (Giles, Meyers, 1955). ДНК и РНК разделяли по методу Шмидта и Тангау-зера (Schmidt, Tannhauser, .1945).

Электрофорез НТВ хроматина осуществляли в пластинах 7,5Z геля полиакриламида с 0,1% додецилсульфатсм натрия по методу Лэммли (Laemrnli, 1970). Гели, окрашенные 0,1% Кумасси G-250, регистрировали на ультраоканирующем лазерном денситометре. Для определения молекулярной массы полипептидов проводили электрофорез нескольких чистых белков с известной.молекулярной массой.

Включение радиоактивной аминокислоты 2-14С- глицина определяли как во фракцию общего белка, так и в НГЕ хроматина пшеницы и риса. Гели с электрофоретическиш спектрами белков "легкого" и "тяжелого" хроматина разрезали на три зоны, каждую из которых экстрагировали 1% раствором дсдецилсульфата натрия г 0,1 N NaOH. Интенсивность окраски полипептидных зон измеряли спектрофотометри-чески при 595 нм. Радиоактивность определяли на жидкостно сцинтил-ляциснном счетчике фирмы "Бекман" LS-luOC и - рассчитывали удельную активность каждой полипептидной зоны.

Статистическая обработка данных. Повторность биологических опытов - 3-5-кратная. Все результаты обработаны статистически (Плохинский, 1970). Определяли среднеквадратическую ошибку среднего арифметического, для оценки достоверности использовали критерий Стьюдента при 5%-нсм уровне значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ К ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние анаэробиоза на свойства и"состав хроматина

проростков пшеницы и риса

В ходе анаэробного воздействия происходило изменение свойств хроматика и его состава у обоих растений. После кратковременной аноксии (1 сутки для пшеницы и 1 и 3 суток для риса) наблюдалось:

- увеличение доли "легкого" и уменьшение доли "тяжелого" хроматина пшеницы и риса (рис. 1);

- уменьшение количества белков и нуклеиновых кислот в "легкой" фракции хроматина по сравнению с контролем при аэрации для

Fîîc. 1. Влияние анаэробиоза на распределение хроматина пшеницы (а) и риса (б) по фракциям градиента сахарозы.

cri à-

Экспозиция, сут

пшеницы - в два раза, а у риса - незначительно;

- высокое содержание легко извлекаемой, раствсримсй ДНК в "тяжелой" фракции хроматина обоих растений, как и в контроле при аэрации;

_ преобладание ПНге в составе белков "тяжелого" хроматина и пшеницы и риса, характерное и для условий нормальной аэрации (рис. 2).

Подобное возрастание процентного содержания ДНК во фракции "легкого" хроматина Еыявлено также и при действии других неблагоприятных факторов внешней среды (Генкель и др., 1979; Евдокимова, Маслов, 1990; Евдокимова и др., 1991).. Исходя из литературных данных (Line et. ai., 1974; Генкель и др., 1979 ), "легкий" хроматин содержит более лабильную и функционально активную ДНК, поэтому некоторое усиление обменных процессов вследствие адаптационных возможностей растения, по-видимому, ведет к увеличению доли "легкого" хроматина после 1-сугочного анаэробиоза и у пшеницы, и у риса. Однако, для риса в отличие от пшеницы зга тенденция сохранялась и после 3-суточной аноксии. Содержание белка и нуклеиновых кислот з "легком" хроматине риса после трехдневного анаэробиоза почти не изменилось по сравнению с контролем при аэрации, а содержание белка и нуклеиновых кислот в "легком" хроматине пшеницы уже после од-носутсчной аноксии снижалось вдвое. Сохранение при кратковременном пребывании в. атмосфере азота высокого содержания легко извлекаемой растворимой фракции ДНК "тяжелого" хроматина у обоих растений, характерного и для условий нормальной аэрации, связано с адаптивными

ДНК "легкой" фракции / ДНК "тяжелой" фракции

з L

Рис. 2. Влияние анаэробиоза на соотношение Лнгб и Пнге Фракции

хроматина'пшеницы (а) и риса (б).

-1_I_|_

С 1 3 7

Экспозиция, сут

перестройками. Преобладание ПНгб в составе белков нерастворимой фракции "тяжелого" хроматина пшеницы и риса в начале анаэробного воздействия, судя по литературным данным ( Левитина и др., 1982 ), свидетельствует об активной работе' генетического аппарата.

При длительном анаэробиозе (3 суток для пшеницы и 7 суток для риса) происходили иные процессы:

- увеличение процентного содержания' ДНК пшеницы и риса в верхней менее плотной фракции градиента сахарозы;

- значительное уменьшение количества белков и нуклеиновых кислот в "легкой" фракции хроматина обоих растений;'" ■

- изменение характера распределения ДНК-белкового комплекса при анализе "легкого" хроматина'пшеницы и риса на колонке с сефа-дексом 0-200; ' ■ ' "

- снижение растворимости "тяжелой" фракции хроматина обоих растений;

- увеличение содержания ЛНгб в'составе'нерастворимой фракции "тяжелого" хроматина пшеницы и риса по сравнению с контролем' при аэрации (рис. 2).

. Повышение процентного содержания ДНК в верхней менее 'плотной фракции градиента сахарозы и уплотнение "легкой" фракции хроматина,' обнаруженные после длительного'анаэробиоза, свидетельствуют с снижении функциональной активности хроматина. Преобладание нерастворимой фракции ДНП и Лиге в составе ее белков, характерное для "тяжелого" хроматина пшеницы и риса после продолжительного анаэробиоза, по всей видимости, отражает снижение общей метаболической активности клеток и тканей и связанное с этим изменение работы ге-

- -

нетического аппарата, выражающееся в возможных качественных перестройках в составе НГБ хроматина.

2. Электрофоретический состав НГБ хроматина пшеницы и риса

в аэробных и анаэробных условиях

После анаэробного воздействия в электрофоретических спектрах КГБ "легкой" л "тяжелой" фракций хроматина пшеницы и риса выявлены изменения, которые выражались в исчезновении многих полипептидных зон и появлении новых.в спектрах НГБ хроматина опытных вариантов. После односуточной аноксии в "легком" хроматине пшеницы отсутствовали шесть полипептидов по сравнению с контролем при аэрации, и появлялись гоны с относительной электрофоретической подвижностью (ОЗП) 0,37; 0,44; 0,53; 0,78 и 0,35 (соответственно с молекулярными массами 111,9; 79,5; 50,2; 15,1 и 7,1 кД). В "тяжелом" хроматине опытных растений исчезали пять полипептидных гон, и выявлялся полипептид с ОЭП 0,22 (229,1 кД) (рис. 3).

Более длительное пребывание в бескислородных условиях (до 3 суток) приводило к большему обеднению спектра у изучаемых фракций хроматина пшеницы. При этом в "легком" хроматине появлялись три новых полипептида. Два из них с ОЗП 0,37 и 0,78 обнаруживались и после суточной аноксии, а третий с ОЭП 0,89 (9,5 кД) - только после трехсуточного анаэробиоза. Из двух енсеь появившихся полипептидных зон с ОЭП 0,22 и 0,82 (229,1 и 13,5 кД) "тяжелой" фракции ДНП первая присутствовала в спектре НГЕ и после кратковременного аноксического воздействия. Аналогичные тенденции изменений в спектрах НГБ под влиянием трехсуточного анаэробиоза были характерны и для риса. Так, в "легком" хроматине наряду с исчезновением десяти полипептидных зон, тлелись полипептиды с ОЭП 0,24; 0,31; 0,34; 0,35 и 0,78 (соответственно о молекулярными массами 209,2; 148,2; 132,1; 112,4 и 15,1 кД), аналогов которым не было в соответствующей фракции хроматина из контрольных растений. По сравнению с "легкой" "тяжелая" фракция после. 3-суточной аноксии оказалась более стабильной. 3 спектре ее белков исчезали шесть зон, в основном с высокой ОЭП, и появились две новые с ОЭП 0, 27 и 0,74 (178,4 и 18,6 кД) (рис. 4).

Дальнейшее анаэробное воздействие (до 7 суток) приводило к уменьшению числа полипептидных зон от 23 в контроле до 20 в опыте для "легкого" и от 25 до 21 для "тяжелого" хроматина риса осот-

аэрация

имп.Ю3/^ин.мг балка) .ЪкШШШШйк .29.7*0,6 ,29,^.3 ,25:8*11,

анаэробяоз

Н20

Акт. Д

ЦТ оэл

КЦ

1! ь 1 г 1 1 ■ г 1 1 11 !! ■II1 II ч 1 1 1 1 1 1

3.440.1. ■ 0 , 0 . 0

счг

**

0,5 1 О 40 31 13,7

67 ' з£з 1^,4' Н

0,5 1

40 ,,31 13,7

67

Рис. 3. Электрофоретическое разделение НГБ "легкого" (1) и "тяжелого" (2) хроматина проростков пшеницы, предобработанных Акт. Д и ЦТ, и включение в эти белки 2-140-глицина в условиях односуточной аноксии.

Штриховые линии - полипептидные зоны, исчезнувшие в опытных вариантах по сравнению с контрольными. * - полипептидные зоны, появившиеся в опытных вариантах по сравнению с контрольными.

ветственно. При этом в "легком" хроматине обнаруживались три полипептидные зоны с высокой ОЭП 0,74; 0,79 и 0,91 (18,6; 15,0; 8,5 кД), отсутствовавшие в контрольном варианте.

Появление при анаэробиозе в спектрах НГБ хроматина обоих рас-

*

1

2

аэрация

ЯУЛ.ДО^иаН.МГ бзлка)

анаэробиоз

иш.Ю'^^лин.кг белка)

II! III г 1 1 г - " 1 II I ,_и 1! -п н и -т пт 41 III I 1 1

5Ч,2£2Д 15,1*0,5,21,04 0,6, 9,7ЩЗ

\

Акт. Д

ИГ оэл

кП

J и

О»5«- , < 1 0

•35 14,4 н—ш—н—ь

67 4С 31 13,7

Г

.35 14,4

67 4П 31

ш4

Рис. 4. Электрофоретическое разделение КГБ "легкого" (1) и "тяжелого" (2) хроматина проростков риса, предобработанных Акт. Д и ЦТ, и включение в эти белки 2-14С-глицина в условиях трехсуточной

ансксии.

Штриховые линии - полипептидные зоны, исчезнувшие в опытных вариантах по сравнен® с контрольными. * - полипептидные зоны, появившиеся в опытных вариантах по сравнении с контрольными.

тений зон, отсутствовавших в условиях аэрации, могло быть результатом перераспределения полипептидов вследствие распада белков в

экстремальных условиях. Это может быть также свидетельством изменения генетического контроля растения и, связанной с ним, миграции из цитоплазмы в ядро белков-регуляторов. Под влиянием аноксии они могут либо синтезироваться, либо быть результатом модификаций уже имеющихся белков. Для проверки этих предположений использовали ин-гибиторный анализ и включение в белки их меченых предшественников.

3. Влияние ингибиторов белкового синтеза на содержание белка

и состав НТВ хроматина в различных условиях аэрации

В работе применили Акт. Д, тормозящий транскрипцию на матрице ДНК, и ЦТ, подавляющий трансляцию синтеза полипептидов нз 80 э рибосомах. В условиях аэрации у обоих растений действие ингибиторов сказывалось нз содержании белка незначительно (рис. 5). При 1-оу-точком анаэробиозе после выдерживания на воде содержание белка в проростках пшеницы составляло 69% от содержания в контроле при аэрации. Под влиянием Акт. Д в тех же условиях оно снижалось до 44%, а при действии ЦТ - до 50%. После 3-суточкой аноксии в проростках пшеницы было обнаружено сильное (до 32% от контроля) понижение содержания белка, однако, ингибиторный эффект не проявлялся, в то время как в проростках риса он был значительным. Содержание белка составляло 67% от контроля, б опытах с Акт. Д снижалось до 42%, и с ЦТ - до 58%. После 7 суток анаэробиоза, при падении количества белка до 30% по сравнению с контролем при аэрации, ингибиторный эффект у риса не сохранялся. Эти результаты позволили предположить, что при более кратких сроках аноксии (1 сутки у пшеницы и 3 суток у риса) сохраняется возможность синтетических процессов.

Действие ингибиторов белкового синтеза на состав НГБ хроматика было обнаружено только для "легкой" фракции хроматина пшеницы после 1-суточного пребывания в бескислородной среде и для "легкого" и "тяжелого" хроматина риса после 3-суточной аноксии. Оно проявилось в сокращении числа зон белка, причем именно тех форм, которые появились после 1-суточного (у пшеницы) и 3-суточного (у риса) пребывания в бескислородной среде. Та-;, после 1-суточной аноксии в "легком" хроматине пшеницы из пяти вновь появившихся полипептидны;-: зон, под • влиянием Акт. Д исчезли две (с ОЗП 0,53 и 0,95), а в опыте с ЦТ - три (0,44; 0,53 и 0,95) ('рис. 3). У риса З-суточный анаэробиоз вызват появление в спектре НГЕ "легкого" хроматика пяти полипептидных зон, аналогов которым не было в конт-

Экспозиция, сут '■■•

Рис. 5. Динамика влияния ингибиторов белкового синтеза на содержание белка в проростках, пшеницы и риса б зависимости от условий газового режима.

Г, 2", 3' - анаэробиоз; 1, 2. 3 - аэрация;

1, 1' - вода; 2, 2' - Акт. Д; 3, 3' - ЦТ.

рольном варианте (рис. 4). После предобработки Акт. Д и в условиях аноксии четыре полипептидные зоны (ОЭП 0,24; 0,31; 0,35 и 0,78) з спектре НТВ отсутствовали, а в опыте с ЦТ исчезали все пять зон. Появление двух полипептидов с ОЭП 0,27 и 0,74 в "тяжелом" хроматине проростков риса, вызванное трехсуточной ансксией, ингибирова-лось предобработкой и Акт. Д, и ЦТ.

' Полученные данные 'по влиянию ингибиторов синтеза белка на состав КГБ в условиях аноксии указывают на возможность синтеза в этих условиях ^асти ядерных белков у обоих растений. 'Исчезновение большинства полипептидных зон, появившихся в опытных вариантах после предобработки их Акт. Д, вероятно, свидетельствует о регуляции синтеза этих белков на уровне транскрипции. Интересно, что в "легком" хроматине обоих растений полипептидные зоны с близкими значениями ОЭП (0,44 у пшеницы и 0,34 у риса), появившиеся после

кратковременной анокоии, присутствовали в опытном варианте, пре-добработанном Акт. Д, и исчезали после' предобработки ЦТ (рис. 3; 4). Это не исключает возможности их синтеза б бескислородных условиях, если предположить, что синтез их при анокоии регулируется на уровне трансляции.

4. Включение 2-14С-глицина во фракцию общего растворимого белка и в НГБ хроматина пшеницы и риса е различных условиях газового режима

В контроле при нормальной аэрации скорость включения радиоактивной аминокислоты 2-14С-глицина в белки проростков пшеницы и риса постепенно уменьшалась по мере увеличения Бремени пребывания растений на воздухе в темноте, что указывает на неблагоприятное действие на проростки длительной темноты (таблица). В результате действия 1-суточного анаэробиоза радиоактивность белковой фракции составляла 50% от аэрируемого контроля, и почти не изменялась при увеличении срокоЕ экспозиции до 3 суток. - Для риса, в отличие от пшеницы, 3-суточный анаэробиоз вызывал незначительное снижение скорости включения метки в белки (77% от контроля). При более длительной экспозиции - анаэробиоз до 7. суток - радиоактивность белковой фракции проростков риса составляла 32" от контроля.

После разделения меченых ядерных -белков в полиакриламидном геле и определения радиоактивности отдельных белковых фракций было выявлено относительно равномерное распределение метки в спектрах НГБ "легкого" и "тяжелого" хроматина проростков пшеницы и риса при аэрации (рис. 3; 4). Различия обнаруживались в анаэробных условиях. У пшеницы включение меченой аминокислоты после 1-суточной анокоии происходило только во фракцию НГБ "легкого" хроматина, .причем в. большей мере именно в те зоны электрофоретического спектра, где были сосредоточены полипептиды, появление которых вызвано действием .1-суточного анаэробиоза. Сопоставляя эти результаты с экспериментами по влиянию ингибиторов белкового синтеза, мы пришли к заключению, что вызванное 1-суточной аноксией появление полипептидов с ОЭП 0,44; 0,53; 0,95 (соответственно молекулярными массаж 79,5; 50,2; 7,03 кД) в спектре НГБ "легкого" хроматина пшеницы"может быть обусловлено синтезам последних в бескислородных условиях.

После 3-суточного воздействия угнетающего фактора не обнаружено поступления метки ни во фракцию НГБ "легкого", .ни "тяжелого"

Таблица

Включение 2-14С-глицина в белки проростков пшеницы и риса в различных условиях гззового режима

Условия опыта Радиоактивность.

ими.104/(мин.мг белка)

Пшеница

Аэрация, 1 сут 16,8 £ 0,8 100

Анаэробиоз, 1 сут 8,8 + 0,4 52

Аэрация,- 3 сут - 12,1 + 0,4 100

Анаэробиоз, З'Ьух Рис ' 5,8 ± 0,3 48

Аэрация, 3 сут 11,0 4- 0,6 100

Анаэробиоз, 3 сут 8,5 + 0,3 гчп ( 1

Аэрация, 7 сут 9,3 — 0,4 100

Анаэробиоз, 7 сут "3 П '-Jf W -1- 0,1 32

хроматина пшеницы. А для риса при такой экспозиции в атмосфере азота 2-14С-глицик включился в ядерные белки и "легкой" и "тяжелой" фракций. Для "легкой" - скорость поступления метки а зону электрофоретического спектра с вновь появившимися тремя полипептидами с ОЭП 0,24; 0,31; 0,34 в условиях ансксии даже значительно превышала соответствующие значения при аэрации (рис. 4). Радиоактивность остальных двух исследуемых зон этого спектра, содержащих по одному полипептиду (ОЭП 0,36 и 0,73), аналогов которым не было з аэрируемом варианте, была ниже, чем в соответствующем контроле. 3 "тяжелом" хроматине также обнаруживалась радиоактивность в зонах электрофоретического спектра, содержащих полипептиды с ОЭП 0,27 и 0,74, появившиеся после 3-суточной аноксии. При более длительном анаэробном воздействии* (7 суток) 2-14С-глицин не включился в белки ни "легкой", ни "тяжелой" фракций хроматина риса.

Эти результаты тоже явились аргументами в пользу синтеза некоторых ядерных белков при кратковременном (3 суток для риса) анаэробиозе. Для "легкого" хроматина это полипептиды с ОЭП 0,24; 0,31; 0,34; 0,35 и 0,73 (соответственно с молекулярными массами 209; 148; 132; 112 и 15,1 кД), а для "тяжелого" - с ОЭП 0,27 и 0,74 (соответственно с молекулярными массами 178 и'18.бкД). Возможность синтеза d& novo у обоих растений показана в большей мере

для "легкой" фракции хроматина, что согласуется с предположениями о его большей функциональной активности (Line et al., 1974; ' Ген-кель и др., 1979; Евдокимова и др., 1991).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование влияния анаэробиоза на хроматин пшеницы и риса показало, что аноксическое воздействие вызывает существенные изменения в составе и свойствах ядерных ДНК-белковых комплексов растений. При этом выявляется двухфазный характер ответа на аноксию. После кратковременного анаэробиоза (1 сутки для пшеницы и 1 и 3 суток для риса) наблюдалось увеличение доли "легкой" фракции хроматина, повышение содержания растворимой ДНК и преобладание ПНгй в составе его "тяжелой" фракции. Такие изменения в ядре, связанные, возможно, с некоторым усилением обменных процессов, являются, вероятно, адаптационными и коррелируют с физиологическими и метаболическими перестройками в клетках и растении в целом, показанными в ряде исследований (Чиркова, 1988). При длительном анаэробиозе происходили, процессы, свидетельствующие об угнетающем действии фактора у обоих растений: увеличивалось содержание ДНК в верхней менее плотной фракции градиента сахарозы, снижалась растворимость "тяжелой" фракции, превалировал процесс разрыхления связей НГБ с ДНК. Разница между объектами заключалась в том, что у неустойчивого растения - пшеницы - эти процессы происходили раньше (после 3 суток пребывания в атмосфере азота), а у устойчивого - рис - сохранялись вплоть до 7 суток.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что в анаэробных условиях у обоих растений происходит синтез не только цитоплазматических белков, как это было показано ранее (Чиркова, 1988), но и некоторых ядерных белков. Причем у риса способность к синтетическим процессам сохраняется в течение более длительного, чем у пшеницы срока аноксии (3 и 1 сутки соответственно). Регуляция синтеза НГБ в условиях аноксии, вероятно, возможна как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Таким образом, один из путей приспособления растений к гипо- и аноксии состоит в синтезе аноксических форм цитоплазматических и ядерных белков, который значительно дольше сохраняется в бескислородной среде у устойчивых растений.

ВЫВОДЫ

1. Под влиянием анаэробиоза изменялся состав хроматина проростков пшеницы и риса, контрастных по устойчивости к недостатку кислорода. При кратковременной аноксии (1 сутки для пшеницы и 1 и 3 суток для риса) увеличивалась доля "легкой" фракции хроматина, а при более длительной экспозиции в атмосфере азота возрастало количество ДНК в верхней менее плотной фракции градиента сахарозы.

2. По мере увеличения срока пребывания растений в бескислородной среде как у пшеницы, так и у риса наблюдалось снижение растворимости "тяжелой" фракции хроматина и одновременно происходило возрастание в ее составе количества лабильно связанных с ДНК белков, что раньше проявлялось у неустойчивого растения.

3. Обнаружены изменения в электрофоретическом составе негис-тоновых белков хроматина под действием анаэробиоза. Это выражалось в исчезновении ряда полипептидных зон и появлении новых белковых фракций у обоих растений в начале анаэробного воздействия и в большей мере в "легком" хроматине.

4. Установлено, что нарастание анаэробного воздействия приводило к понижению содержания общего белка у обоих объектов. Предобработка растений ингибиторами белкового синтеза актиномицином Д и циклогексимидом усиливала этот процесс на ранних сроках аноксии, причем у риса ингибиторный эффект был более длительным и сильным.

5. Действие актиномицина Д и циклогексимидз на состаЕ негис-тоноеых белков хроматина было выявлено только при кратковременной аноксии для "легкой" фракции хроматина пшеницы и "легкого" и "тяжелого" хроматина риса. Оно проявилось в сокращении числа зон белка, причем именно тех форм, которые появились при этих сроках экспозиции в бескислородной среде.

6. В анаэробных условиях интенсивность включения 2-14С-глицина в белки проростков пшеницы и риса уменьшалась по сравнению с аэрируемым контролем. У риса этот процесс шел значительно медленнее, чем у пшеницы.

7. Включение меченой аминокислоты в негистоновые белки "легкого" хроматина пшеницы и "легкого" и "тяжелого" хроматина риса происходило только на ранних сроках аноксии, причем в большей мере именно в те зоны злектрофоретического спектра, где были сосредоточены полипептиды, появившиеся в результате анаэробного воздействия.

8. На основании результатов ингибиторного анализа и включения

меченой аминокислоты предполагается возможность синтеза аноксичес-ких форм ядерных белков. У неустойчивого к аноксии растения пшеницы синтез негистонс-Еых белков хроматина выявлен лишь на ранних сроках кислородного голодания (1 сутки), в то время как у устойчивого риса он сохранялся в течение 3 суток.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Войцековокая С. А., Бады-ша Т. Г., Евдокимова И. В. Выделение и характеристика хроматина из проростков пшеницы и риса // Вестник ЛГУ. - 1991. - Вып. 4, N £4. - С. 81-85.

2. Войцековокая С. А., Чиркова Т. В. О возможности синтеза негистоновых белков хроматина в проростках пшеницы и риса при отсутствии кислорода // Вестник СЕбГУ. - 1992. - Вып. 3, N 17. - С. 73-79.

3. Войцековокая С. А., Бадьина I. Г., Чиркова Т. В. Влияние анаэробиоза на свойства хроматика и состав его негистоновых белков в проростках пшеницы и риса // Физиология и биохимия культурных растений. - 1992..- Т. 25, ÍJ 1. - С. 58-65.

4. Войцековокая С. А., Чиркова Т. Б. Синтез негистоновых белков хроматина в растениях в условиях аноксии // Тезисы докладов 3 съезда ЕОФР. - С.-Пб., 1993. - Т. 5. - С. 519.

5. Войцековокая С. А., Чиркова Т. В. Действие недостатка кислорода как экологического фактора на синтез ядерных белков в растениях // Тезисы докладов Международной конференции " Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды - Томск, 1995. - Т. 2. - С. £07.

■ 6. Chirkova Т. V., Voitzekovskaya S. A. About the possibility of nucleous protein synthesis under anoxia // Abstracts of the Symposium of the International Society for Plant Anaerobiosis. -Lammi Biol. Station. - Finland, 1995. - P. 15.

7. Voitzekovskaya S. A., Chirkova Т. V. The effect of anaero-biosis on the chromatin from seedling's of wheat and rice // Abstracts of annual .symposium "Physical-chemical basis of Plant Physiology". - Pushchino, 1996. - P. 93.