Белки теплового шока животных различных климато-географических зон

Ульмасов, Хаёт Абдушукурович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Белки теплового шока животных различных климато-географических зон
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Белки теплового шока животных различных климато-географических зон"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. И. КОЛЬЦОВА

на правах рукописи

УЛЬМАСОВ Хаёт Абдушукурович

УДК: 577.217.5:616—00.16: 612.391.1:636.295

БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА ЖИВОТНЫХ РАЗЛИЧНЫХ КЛИМАТО-ГЕОГРАФИЧЕСКИХ ЗОН

03.00.13 — физиология человека и животных

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена в Институте физиологии Академии наук Туркменистана, г. Ашхабад.

— академик АМН СССР,

доктор биологических наук, профессор И. Б. Збарский, ■*- член-корреспондент АН СССР, доктор биологических наук,

засл. деятель науки РСФСР, профессор И. С. Даревский,

— доктор биологических наук В. А. Спицын.

Ведущее учреждение: кафедра генетики биологического факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

специализированного сс г , , „ ¡гии разви-

тия им. Н. К. Кольцова АН СССР по адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н. К. Кольцова.

Автореферат разослан « 199

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Е, М. ПРОТОПОПОВА

Официальные оппоненты:

Защита состоится

заседании

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема адаптации человек и живот; ных к изменяющимся условиям внешней среды является одной из актуальных проблем биологической науки. Освоение человеком обширных территорий аридного - региона и других территорий с жарким климатом ставит задачу изучения влияния на организм различных факторов этих климато-географических зон, основным из которых является высокая внешняя температура,

В последнее время внимание специалистов широкого профиля привлекает так называемая система теплового шока, активируемая высокой температурой (тепловым шоком (ТШ )) и другими стрессовыми агентами. Основными компонентами этой системы являются гены теплового шока и кодируемые ими белки - белки теплового шока (БТШ) tLindquist, Craige, 1988]. Их такте называют стрессовыми белками. Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные свидетельствуют, что ответ [тетки на ТШ является примером более общей клеточной реакции на стресс, а БТШ в клетках самых различных организмов - ет Е. 'coli до человека - выполняют валные универсальные защитные функции, позволяющие им перевить стрессо-генное действие тепла и других агентов [Schlesinger et • al., 1982; Lindquist, 19863. Эксперименты проведенные в различных лабораториях продемонстрировали важную роль БТШ в формировании термотолерантности клеток СTanguay,' 1983; Laszlo, Li, 19851. Однозначные эксперименты в пользу адаптивней роли БТШ70 были получены, во-первых, благодаря исследованию ts-мутаций с нарушенной системой генов ТШ и, во-вторых, когда удавалось "ломать" те или иные гены этой системы и анализировать последствия таких нарушений [Jacobsen.Craige, 19843. Нарушения метаболизма, вызванные дефектами в функционировании системы генов ТШ и приводяедае к гибели клеток или снижению их тердаустойчивости, и другие К'-етабо-лические сдвиги блокируются увеличением внутриклеточной концентрации этих стрессовых белков [Lindquist, Craige, 1988; Walch, ;1990; Bukan et al., 1989; Van Dyk et al., 19893. В последние 2-3 года выяснилось, что БТШ и родственные им полипептиды интимно связаны с многими иганешювакными для клетки процессами и являются неотъемлемыми компонентами клеточного метаболизма в нормальных и стрессовых условиях. Генерализован«да функции БТШ из семейства БТП170 на основе выраженных Селок-Селковых взаиш-

действий реализуются на уровне блокирования агрегации денатурированных и абберантних белков, стабилизации компетентных форм вновь синтезированных подипептидов, их транспорта в различные компартменты клетки, сборки в мультимерные комплексы. Совокупность свойств БТИГ70 позволяет сегодня рассматривать их как белки широкого спектра действия, принимающих участие в контроле за состоянием, организацией и распределением пула внутриклеточных белков [Ellis, 1990]. В этой связи естественным представляется всё увеличивающееся число работ, доказывающих участие БТШ в разнообразных метаболических процессах [Hartle, Neupert, 1990; Goloubinoff et al. , 1989; Suhail et. al. , 1990; Flynn et al. , 1989; Van Dyk et al. , 1989; Gaitanaris et al. , 1990].

Однако, несмотря на очевидные успехи в •изучении защитных свойств БТШ70 на различных культурах клеток, практически отсутствуют работы, посвященные изучению роли БТШ, в частности основного стрессового белка (70 кДа), в естественной адаптации организма к высокой температуре. 'Тисгуальность таких исследований определяется способностью БТШ, пронизывающих весь клеточный объем и взаимодействующих потенциально с каждым или многими внутриклеточными полипептидаыи, поддерживать нормальное протекание белок-зависимых метаболических процессов при действии повышенных температур, что может быть одним из отобранных в процессе эволюции механизмов, обеспечивающих существование вида в регионах с жарким климатом. Особый интерес в этом плане представляют различные холоднокровные, обитающие в экологических нишах с различными температурами внешней среды. К сожалению, исследований, где бы сравнивалось .состояние компонентов системы теплового шока (БТШ, мРНК-БТШ) у нескольких достаточно близких видов, резко отличающихся по температурам естественных сред обитания, пока . крайне мало. В этой связи представляется интересным выяснить состояние некоторых компонентов системы ТШ у организмов, приспособленных в процессе эволюции к различным температурным режимам. Вопрос о.наличии закономерностей и положительных корреляций , ыевду способностью организма к высокотемпературной экспрессии' генов ТШ, уровнем содержания и синтеза БТШ, терко-устойчивостыо и температурными условиями обитания вида в природе приобретает сегодня особую актуальность. Его оешение позволит не только приблизиться к пониманию роли БТШ (70 кДа) в естественной адаптации органиаь(а к высокой температуре, но и способствовать

разработке особых режимов адаптации к различным стрессам и созданию новых форм с повышенной термоустойчивостью. Наши предварительные наблюдения и единичные работы других авторов [Bosch et al., 1988; Kimpel, Key, 1985] косвенно указывали на существование определённой закономерности между БТШ и температурными условиями существования вида. Критерием общебиологической значимости такой заг^тмерности, на наш взгляд, может Сыть комплесный сравнительный анализ некоторых компонентов системы ТШ, проведенный на достаточно большой выборке животных различных климато-географических зон, существенно отличающихся по температурным параметрам своих сред обитания.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Основной целью работы является установление закономерностей и коррелятивных связей между экспрессией, содержанием БТШ и кодирующих их мРНК, термоустойчивостью организма и температурными факторами среды его обитания. Исследования проводились на относительно близких группах видов, отобранных в пределах классов млекопитающих, рептилий, насекомых и простейших, отличающихся по температурам сред обитания, в условиях in vivo или на культивируемых клетках in vitro.

Используя эти группы уникальных природных моделей п кпчестге объектов для исследований, мы поставили перед собой следующие задачи: • •

1. У видов, обитающих в различных климато-географических зонах, изучить:

- спектры БТШ. их индукцию при ТШ in vivo и in vitro и комбинированных стрессовых воздействиях (ТШ и вирусная инфекция), температурные диапазоны синтеза.БТШ;

- уровень содержания и конститутивного синтеза БТШ, их тканевую специфичность, внутриклеточную локализацию;

- устойчивость общего белкового синтеза к действию высокой температуры.

2. Выявить наличие коррелятивных связей между внутриклеточным содержанием основного БТШ (70 кДа), температурными условиями естественных сред обитания организмов и их термоустойчивостью.

3. Оценить содержание МРНК-БТШ70 в норме и их экспрессию при повышенных температурах у видов, отличающихся по температурным параметрам своих экологических ниш; провести качественный анализ содержания генов БИГ70 у некоторых видов животных аридной зоны.

4. Провести структурно-иммунологический анализ белков из се-

мейства БТЦ/70. .. ■

5. Изучить температурно-временную динамику синтеза ВГ1И70 у некоторых организмов в естественных условиях обитания, в модельных экспериментах на природных площадках и в условиях лаборатории.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервиё на большом числе природных моделей проведен комплексный сравнительный анализ некоторых компонентов клеточной системы ТШ, формирующий новые представления о важной роли БТ1И (70 кДа) в естественной адаптации организма к высокой температуре среды:

- выявлена позитивная корреляция между уровнем экспрессии генов ТШ, содержанием и синтезом ЕГ11Г70-подобных белков, термоустойчивостью организма.и температурными условиями его обитания. Показано, что терморезистентные организмы отличается более высоким уровнем содержания и конститутивного синтеза БТШ70, они обладает более широким температурным диапазоном индукции и продол-жаюцзгося синтеза ЕТШ. В клетках этих видов синтез нормального набора клеточных белков сохраняется при более высоких температурах;

- обнаружено, что синтез БПШ'О и кодирующих их мРНК в" клетках южных видов шелкопряда и ящериц, в отличие от видов, обитающих в средних и северных широтах, наблюдается при значительно более высоких температурах, вплоть до 45+50°С, Высокоэффективная транскрипция мРНК-ШШО у тутового шелкопряда сохраняется и при комбинированном действии ТШ и вируса ядерного' полиздроза (ВЯЛ);

- впервые описаны БТШ ящериц, представляющих различные кли-•мато-географические зоны, и их эндогенных паразитов - лейшманий.

Покааано, что сравнительная устойчивость общего белкового, синтеза в клетках паразитов сходна с таковой у соответствующих им хозяев. Продемонстрированы высокий консерватизм БТШ ящериц, асинхронная темлературозависимая экспрессия различных членов семейства БТ11Г70, их структурно-иммуннологические характеристики. Проведен качественный анализ дозы генов БТИГО у ночных и дневных видов яшэриц аридной зоны;

- выявлена реальная значимость системы ТШ для ящериц, обитающих в условиях жаркой песчаной пустыни. В летнее время года высокая амплитуда колебаний температуры тела термофила песчаной круглоголовки сопрнжена с синхронными иаменсними синтеза основных БТШ (60 кДа). . В отличие от многих дру|их организмов, как

- б -

шстиутивные, так и индуцибелыше члены семейства BUM) у этого 1да зарегистрированы и при 25°С;

- обнаружен новый тип зрелых ядерных клеток - эритроциты Фблюда, - не способных синтезировать БТШ при Till Шесте с тем, •и клетки все же содержат некоторое количество конститутивного 'Ш73, хотя и в существенно меньших количествах, чем лимфоциты.

1 основе особенностей синтеза и содержания БТШ в различных ти-IX i"лоток верблюда выдвинута концепция о доминирующей роли шститутивной формы ВГ11ГГ0 в реализации защитных свойств 'ШГО-подоСных белков в клетках этого вида;

- продемонстрировано,, что в лимфоцитах человека конститутив-ш и индуцибельная формы БТИГ70 контактируют с большим числом ¡еточных белков; в очищенных ядрах, куда эти белки проникают юле ТШ, число таких контактов ограничено;

- предложи простой и безболезненный метод анализа индукции ¡нтеза БТШ в свежевыделенных лимфоцитах при гипертермии целого >ганизма;

- показано, что тканеспецифическая экспрессия основных БТШ различных типах клеток верблюда и гусениц тутового шелкопряда_ !ализуется на уровне отдельных членов семейств БТЙТО и BTUiJO.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕШОСТЬ. Результат работы существенно юширяют и углубляют представления о клеточных белковых факто-IX адаптации организма к высотой температуре. Совокупность поденных данных позволяет рассматривать систему теплового шока lk универсальную отобранную в процессе эволюции клеточную [стему, являющуюся неотъемлемым компонентом стратегии биохими-■ской адаптации клетки и целого "организма к температурки усло-[ям внешней среды. Высокая температура среды, как эволюционный lktop, способствует закреплению некоторых клеточных механизмов, [ним из которых является дозированная, в зависимости от значе-[й внешней температуры, активность системы генов белков теплого пока (70 кДа), реализующаяся в конечном счёте в повышенной ¡утриклеточной концентрации БТ11Г70 и кодирующих их мРНК. Очевид-

что высокая концентрация этих стрессовых белков у "южных" Иов, обитающих при высоких внешних температурах, в сравнении с еверными" видами, необходима для обеспечения возросших, в ответствии с высокими абсолютными значениями темлературы внеи-й среды и тела животных, нормальными клеточными и защитными •нкциями БТШ Это обстоятельство также отражает готовность ор-

ганизма к резкому изыененню температурных условий среды, что возможно при кратковременных перемещениях в пространству, добывании пищи, во8ни1щовении опасности и т. д.

Значимость представленных данных, впервые полученных на широком спектре видов, с чрезвычайно разнообразными температурами естественных сред обитания позволяют говорить о наличии реальной вшшноиернооти, связывающей температурные условия обитания вида с экспрессией генов ТШ, содержанием мРНК-ШГО и ВТШГО-подобныя белков. Проведение зксшгринеити свидетельствуют, что бедней из сеис-йства ВГИ70, особ5нцо конститутивно синтезируемы? стрессовиз белга, 'играет вишу» роль в естественной адаптации организма к теплу, I» повиданная экспрессия"является одним из неотъемлемы;: клеточных изшшзмов, обеспечивающих существование вида в условиях действия высоких внешних температур.

Прсзздешше исследования составляют основу нового перспективного направления в изучении адаптивных'свойств' системы теплового шока Они позволяет не soль ко расширить теоретичеазде представления о клеточных факторах адаптация к высокой температуре,- но и создать прздпосшга! для прогнозирования устойчивости организма'к гипертермии, внедрению соответствующих критериев профотбора при деятельности в экстремальных условиях, создания новых форм с повышенной rept,»устойчивостью.

Результаты исследований могут быть использованы при чтении курсов лекций по зкологичесгай Физиологии, общей биологии, молекулярной биологии.

ПУБЛИКАЦИЯ. Основное содержание диссертационной работы изло1 ■ яено в 2i опубликованных научных работах.

. АШРОЕАЩЩ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены обсуждении одобрены на различных семинарах, симпозиумах и съездах: I всесоюзное совещание по белкам теплового шока (Гатчина, 1986), IY и Y конференции биохимиков республик Средней Азии и 'Казахстана (Ашхабад, 1680; Ташкент, 1991), научные конференции институтов физиологии (1987) и зоологии (1991} All Туркменистана, васедание бюро биологического отделения Президиума All Туркменистана^ lgea), международный конгресс по СПИДу (Стокгольм, 1988), XI Европейское рабочее совещание по клеточному ядру (Суздаль, 1989), VII1 всесоюзная конференция по экологической физиологии (1989), 1 всесоюзная тошшологическая конференция (Ашхабад, 1991), Н съезд физиологов республик Средней Азии и Цй

захстана (Душанбе, 1991), заседание межлабораторного координационного совета института физиологии АН Туркменистана (1991), мек-лабораторный семинар Института биологии развития им. а К Кольцова АН СССР (1991). '

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на 280 страницах ма^лиописного текста Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов собственных ис-исследований и их обсуждения. Экспериментальные данные документированы 46 рисунками и 4 таблицами. Список цитированной литературы содержит 384 наименований, из них 32 работы отечественных и 352 зарубежных авторов.

Работа выполнялась в рамках научных программ института физиологии АН Туркменистана (номера госрегистрации 01860023443 и 01900005377), программы "Геном человека" (номер госрегистрации 01900050785) и договора о научном сотрудничестве с Институтом молекулярной биологии им. а А. Энгельгардта АН СССР.

Автор выражает глубокую благодарность д. б. н. М. Б. Бвгеньеву, инициировавшему дачные исследования и "оказавшему неоценимую консультативную и экспериментальную помощь. '

В экспериментах тагске принимали участие Б. А. Титарешсо (Ш> АН СССР), Е К. Дашкевич, И. Ю. Абрамова, М. Д. Худайбердиев' (ИФ АН Туркменистана),. С. Б. Акопов (ИВР АН СССР), К. К. Караев, А. Овезму-хамедов (ин-т зоологии АН Туркменистана), ЕЕЛяшко, В.К. Викуло-ва (ВИМГЦ АМН СССР). Большую'помощь в сборе биологического мате- ' риала и соответствующие консультации оказали С. Еаммаков, ЧАтаев (ин-т зоологии АН Туркменистана), Б.Туниев (Сочинский заповедник), ПЛ. Орлов, ЕБ.Ананьева (Зоологический ия-т АН СССР), В. А, Чзрлин (ИЭБМЯ АН СССР). Важную поддержку в продвижении экспериментальных исследований оказали Б. А. Мдргулис. (ия-т цитологии АН СССР), Т.Я. Брауде-Золотарева (ЙОГ АН СССР), Э. В. Караков (ин-т вирусологии АМН СССР), Е. В. Лесникова (НИИЭиГ МЗ Туркменистана), ЕИЛяпко, предоставившие для исследований соответствуют;; культуры клеток, антитела и другие препарата Всем перечисленным коллегам автор выракает искреннюю признательность и благодарность.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Реактивы и препараты.

В работе исшолььйьгиш различные радиоизотипы амшюкислот и нуклеи-тидтрифоофатов (Ainersliam (Англия), Spofa (ЧСФР), В/О ИЗОТОП (Ташкент)), применяемых для мечения белков и нуклеиновых кислот. Для выделения, очистки, электрофоретичеокого фракционирования биологических макромолекул и других процедур использовали реактивы и препараты фирм Sigtna, (США), Serva (ФРГ). Pharmacia (Швеция), Fluka (Швейцария), Reanal (Венгрия) и др.

Ыэноклональные антитела C92F3A-6 и N27F3-4, специфичные к индуцибельной и конститутивной формам БТШ70 человека соответственно, получены от д-ра V. Welch ( Колд Спринг Харбор, США) и предоставлены Ы. В. Евгеньевым.

Поликлональные антитела N7 к конститутивному БТШ73 телёнка и меченый белокJ-A любезно предоставлены В. - А. Маргудисом (Институт цитологии АН СССР).

В работе использовали клон 229.1 (87С1), содержащий ген БТ11Г70 D. melanogaster (получен из лаборатории Ktesélson, Гарвардский университет, США); клон pDPS, содержащий ген БГ11170 человека (получен от Д-ра С. Thomas (Колд Спринг Харбор,США); клон Л XL10-, содержащий ген ВТ UFO Xenopus laevis, (получен от д-ра М. Bienz (Лондонский центр медицинских исследований , Англия); клон Rvl66, содержащей'последовательность рибосомного гена мыши (получен от Э. Враги, ИМБ АН СССР). Все клоны любезно'предоставлены М. Б. Евгейьевым.

2.2. Животные. Условия тепловых воздействий.

В работе использовали различных представителей млекоти;ак> |дцх, насекомых и рептилий.

. В onuiaxl in vivo беспородных кроликов перегревали в специальном воздушном термостате при 44°С до значения ректальной температуры 40,5°С или 42,Б°С, которую поддерживали в течение 40 мин. Затем в пробирку, содержащую 0,2 мл 0,38% цитрата натрия, отбирали из ушной вены 1,8 мл крови, добавляли 35Б-метаотш до концентрации 60 мкКи/мл и инкубировали при 37°С в течение 90 мин. Дальнейшие операции по выделению лимфоцитов и т. д. вели как описано, ниже для лимфоцитов человека.

Гусениц тутового шелкопряда (гибрид Оедококоиний, грена по лучена на Амнауекоы грензаводе Туркменской СОР) весенней выкорм ки выращивали на свежих листьях шелковицы при 23-25°С. Уход за i уо(.1Шцамн, кормлише, определение пола, возраста и др. проводи

и согласно рекомендациям Михайлова [1950, 1953, 1958]. Белки гдельных органов гусениц метили радиоактивным метионином или лицином до или после ТШ in situ в фосфатном буфере для насеко-ых [Braude- Zolotareva et al. ,1986]), в течение 45 мин мин при 5°С.

В экспериментах использовали следующие виды ящериц: дневные иды - золотистая мабуя (Mabuya aurata, Linnaeus. 1758), кав-азская агама (Agama caucasica, Eichwald, 1831), азиатский го-оглаз (Ablepharus pannonlcus, Lichtenstein, 1823), песчаная руглоголовка (Phrynocephalus interscapular is, Lichtenstein, 856), закаспийская круглоголовка (Phr. raddei, Poettg?r, 1890), акырная круглоголов!» (Phr. helioscopus, Palla?, 1771), средняя щурка (Ere mi as interinadla, Strauch, 1876), линейчлтля ящургса Eremias lineolata, Nlkolsky, 1896), скальная Я1г>ринл (Lacerta axicola, Eversmann, 1834), прыткая ящерица (Lacerta agilis, innaeus, 1758), живородящая ящерица (Lacerta vivípaia, Jacquin, 787) i ночные виды: гребнепалый геккон (Crossobnnon evrsnannl, iegmann, 1834), каспийский геккон (Gymnodactilus caspius, ichwald, 1831), сцинковый геккон (Teratosc incur. scincus, chlegel, 1858). йивородяшую ящерицу отлавливали в Карелии и ок-естносгях Санкт-Петербурга, прыткую и скальную ясериц - в ок-естностях гг. Харькова и Сочи соответственно, азиатского голог-аза - на Юго-Западном Коиет-Даге на высоте 1500 м. Остальных щериц - в предгорной равнине Копет-Дага и в песчаной пустыне евернее г. Ашхабада.

В опытах по темлературнорму воздействию использовали ящериц бсего пола гесом 0,8-10 г. Животных перегревали при различных емпературах в течение 1 часа в специальной пластмассовой кювете полуторасантиметровой песчаной подложкой, помешенной в воздуш-ый термостат. Затем им вводили внутрибрюшинно 25-40 мкл физрас-вора, содержащего "^-метионин, из расчета 40-50 мкКи на 1 г еса и содержали еще один час при 25°С. Через 1 час после введе-ия метки животных забивали декапитацией. Печень и другие органы омогенизировали на холоду в буфере, содержащем 50 мм трис-НС1 pH 6,8) и 1 мм PKGF. Белки осаждали четырехкратным объемом хо-одного этанола и хранили при -2(5Ь.

В опытах на устойчивость к действию высокой температуры яще-иц перегревали при соответствующих температурах в течение 1 аса В качестве летальных принимали значения температур в каме-

ре. при которых погибало 80-100Х взятых в эксперимент рвотных.

2.3. Клетки. ■ •

Лимфоциты (и эритроциты в случае верблюда) выделяли из свежесобранной крови человека, лабораторной крысы, кролика и верблюда в ступенчатом градиенте Ficoll- Paque или фиколла-верогра-фина Cd - 1,078) по протоколу фирмы-изготовителя (Pharmacia).

В работе также использовали другие культуры клеток млекопитающих: культура клеток Hela (предоставлена Б. А. Шргулисом), культура лимфобластопдмк гаеток человека НО (предоставлена 3. Е Карэшвш), культура фибробластов ко;>и верблюда (предоставлена Е Н. Лягсно).

В anonepraAíítTax с илэткеми 'изсешлк использовал! следукиук-пэрслшваоыю лппии глоток: spcb МЗЗ - культура кйток яичников куколок тутового кэлкопряда ВолЬухтгоП; - культура клеток

пкчпиков куколок дубового шелкопряда Anterar.s- pernyi Guar; JELB-Ld65-2 -культура клеток яичркэв кутало к непарного шелкопряда Lymantria dispar (эти клетки, а также зараженная ВЯЛ культура клеток С. рогi били получены от Т. Я Ерауде-Золотаревой). В качестве, контроля '' использовали линии эмбрпонадькш. клеток Drosophila viril is 79f7Dv3g. Заражение культивируемых клеток В. irari V! гусениц тутового иелкэпряда вирусом ядерного 'полпздроза (ВЯЛ) кольчатого шелкопряда Malacosoírñ nmstria проводили по мэ-тодике Сухорада и соавт. С1984].

В опытах с культурами клето;: гейкгашЯ испрльэовали два пзо-*яте промзетйгот: 1. REPT (SU) 82/RlO-K-Lo lsh?an1 с (Sauroleishira-nia gymnödactyl 1 Chadukm et Sefieff 1040. Выделен из крови каспийского геккона, отловленного в 1983 г. в Ссрахскоы районе ТССР; г. 'REPT (81) 3214-КА-Lg i Shiran i a (Sauroleishmania) guluki Ovezrnu-cha-nsdov et Safjanova, 1987. Вцделен от кавказской агаш, пойманной в ущелье АЯ-Дере в Кара-Калинском районе Туркменистана. В работе эти клетки, полученные-и предоставленные А. Овезмуу. аредовым, иц называем изолятами R-19 и 3214 соответственно.

2. 4. КЬтоды исследования.

Одно- и двумерный электрофорез меченых ii>.vivo или in vitro белков в ■полиакриламидноы геле (ПААГ) проводили по :методау Laeiranli. [1970) и O'Farrell et аЦ (1977], флюорографий гелей согласно Bonner.и Lgskey [19741. В качестве маркеров мол. масс

использовали меченые ВТШ дрозофилы и стандартный набор белковых метчиков (Pharmacia). В соответствующих экспериментах на гели наносу-" равные кроличества белка или равные количества радиоактивности. Экспозиция на рентгеновскую пленку велась в соответствии с количеством нанесенной радиоактивности и уровнем естественного распада изотопа. Пятна и полосы, соответствующие БТШ на флюорограммах или иммунноэлектрофореграммах, сканировали на денситометрах типа "XL Ultrascan" (Швеция) и "Opton" (ФРГ).

Сшивание белков лимфоцитов при помощи бифункционального сшивающего реагента - диметил-З-З'-дитиобиспропиоимидата (DTP)- и последующее разделение продуктов химического сшивания диагональным электрофорезом проводили как описано ранее [Dashkevich et al., 1083).

Ограниченный протеолиз белков в ПААГе вели как описано в рабо те Cleveland et al. С1977).

Иммунный блоттинг вели по методу Towbin et al. [1979]. После обработки перенесенных на нитроцеллюлозу белков специфическими моно- или поликлональными антителами фильтр обрабатывали кроличьими IgG, полученными против иммуноглобулинов мыши, или козьими антикроличьими IgG," конъюгированными с пероксидазой. Полосы иммуннопреципитации регистрировали по пероксидазной реакции с хлорнафтолом или диаминобензидином в качестве субстратов". 'В некоторых случаях после инкубации с первыми и вторыц? антителами иммуннопреципитаты выявляли добавлением белка I-A (1000000 имп/мин, любезно предоставлен Б. А. Маргулиеом), с последующей авторадиографией.

Выделение нуклеиновых кислот-, мечение в реакции ник-трансляции, дот- и нозерн-гибридизацию проводили как описано в руководстве Маниатиса и соавт. (1984].

Включенную радиоактивность определяли при помощи жидкостного сцинтилляционного счетчика "Intertechnique SL-3Û" (Франция).

Концентрацию белка определяли по методу Lowry et al. t19513.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что внешняя температура оказывает наиболее мощное воздействие на организм среди прочих факторов окружающей среды [Parsons, 1987). В процессе эволюции различными организмами были выработаны соответствующие физиологические механизму защиты от

перегревания. Так, млекопитающие эффективно испольауш- различные гомеостатические механизмы [Султанов, 1978], хотя у некоторых ие них (например, верблюда), обитающих в регионах с высокой внешне? температурой, температура тела в летний период может достигать 40°С и выше [Шмидт-Нильсен, 19721. С другой стороны, температуре тела холоднокровных, варьирующая в гораздо более широком диапазоне (8-49°С), определяется температурой внешней среды и регулируется в основном чрезвычайно развитыми поведенческими реакцияму [Heatwole, Taylor, 1987; Черлин, 1989].

Для изучения роли ВТШ (70 кДа) в естественной адаптации организма к теплу нами был проведен сравнительный анализ реакциР на тепловой шок, состояния некоторых компонентов системы теплового шока у относительно близких групп видов в пределах классов млекопитающих, .рептилий, насекомых и простейших, отличающихся пс температурам естественных сред обитания, в условиях in vivo или на культивируемых клетках in vitro. Все использованные в данной работе клетки (за исключением лимфоцитов кролика, крысы и человека) и организмы являются впервые изученными в данном отношении моделями.

3.1. Синтез БТШ в клетках млекопитающих, от дичащихся пс температурам сред обитания

В наших исследованиях на млекопитающих, также как и па различных видах холоднокровных (см. ниже) эксперименты проводились с организмами исходно отличающимися по устойчивости к действии, высокой температуры. Одну группу организмов составили клетки .человека, кролика и лабораторной крысы.. Единственным представителем другой гр1шпы уникальных природных моделей теплокровных животных с относительно более высокой термоустойчивостью был изб-páH верблюд. Хорошо известна способность этого жиеотного - спутника песчаной пустыни - переносить длительные ежедневные тепловые нагрузки, сопровождающиеся повышением температуры тела вплоть до 40,7°С [ Шмидт-Нильсен, 1972].

Эксперименты проводили на лимфоцитах - удобном объекте для изучении синтеза БТШ при ТШ in vitro и in vivq. Как показали результаты одномерных электрофорезов при ТШ in vitro в лимфоцитах челиьека были выявлены БТШ с мол. массами 40, 48, 60, 70, 75, 88 95 и 110 кДа, из которых мажорными являются bTUf/ü и КТШгзб Авалей ичт*; MUJkopiitk; Will сиди ^регистрированы ti в лимфоцитах ерши

Эти данные в целом согласуются с результатами, полученными на различных культурах клеток млекопитающих tVelch, 19901.

Анализ двумерных флюорограмм (рис. 1, а, б) показывает, что синтез некоторых БТШ, в первую очередь КГ1!170 и в меньшей степени БТЩбО, ЕТ1ЮЗ и ГГГШ35 наблюдается и при 37°С. ТШ (42°0, 1 час) наряду со снижением общего белкового синтеза приводит к сильной индукции или усиления синтеза БТШ. Высокая разрешающая способность использованного метода повволила установить наличие по меньшей мере двух конститутивных' (синтезируемых и при ггсркзлыгсЛ тегае-ратуре) и нескольких индуцибельных (появляющихся при ТИ) форм основного белел теплового пока - ВТ170 (в послелирм случае одна из изоформ резко доминирует над другими).

В дальнейших экспериментах для анализа виутриклеточнчх "контактов" обоих форм БТШ70 нами бил попользован метод ковалелтного сшивания белков лимфоцитов при помощи бифункционального сшивающего реагента - димптил-3-3'-дитисбнспропконмидата (DTP). Из флиорограмш диагонального электрофореза белков, сшитых в препарате целых лимфоцитов, подвергнутых ТИ (рис. 2, а), видно, что ганститутивная и индуцибельнйл фор"» основного стрессового белка, ранее входивтах в состав сити белковых комплексов, образуют две сплошные горизонтальные полосы с примерно равной интенсивность*) на протяэтонии всей длин!'. ПэлучэняуЯ результат свидетельствует О МПОГОЧНСЛеНПНХ КОНТГГ-КТ^ КГ*!* КОНСТИТУТИВНОЙ, 7я! 1 и иилуцибельной формы БТПГ70 с счроккм спектром вкутрктточинх' полипептидоа с кол. масса»«? от 5 до 2С0 !?Лз н согласуется с концепцией, рассматривающей эти бмкп' как к^кутяргл'з спутники (chaperon? tEllis, 1990)) внутриклоточпнх белкоп. Однз!», кэрти-на сшивания белков, проведанного па изолировятн-'х из прогретых лимфоцитов ядрах (рис. 2, б), ставила наличие ограниченного числа "контактов" БТЕОТ с ядерными белкам?, в основном с белкой с мол. массой около 16 кДз, относящимся, по-видимому, к классу гистонов. Существенно, что в обоих типах "контактов" (в целых клетках и очищенных ядрах) принимают участие как индуцибелъный, тш? и конститутивный БТЕГ70, что свидетельствует о структур-по-функциональиом'"то»дестве этих .белков (Vfelch, 1990). Проведенные эксперименты показали, что в целых лимфоцитах обе формы БТ1!ГГ0 контактирует с различны.'!! клеточными полипептидеми, что согласуется с данными других авторов CBecknenn ót al., 1930]. Это дает основания предполагать их.потенциальное еродстгю к ваа-

- 14 ' +

. «а

.etv

'-.Ж

» fc

t . в

. в'

НО

"95ЧЧ, -А* .

■V <

V» « j ^ -

: а б

Рис. 1. Флазорограмш двумерных олэктрофорезов белков, синтезируемых в лимфоцитах человека.n vitro, при 37°0 (а, контроль) к после ТШ (0 - 42°С, 1 час). На гели наносили равные количества Селгл. Стрелками указаны осковпю РТИ1 н их мол. массы (кДа).

\ f /

70U

70 к

Рис. 2. Диагональный электрофорез продуктов химического сшивания DTP Оелков лимфоцитов человека. Белки метили in vitro ра-диоыетконином (37°С, 1 час) после ТШ (42°0, 1 час). 70к и_70и -конститутивная и индуцибельная формы ВТ1Я70. а - сшивание на целых клетках, б - сшивание на изолированных ядрах.

имодействию практически с каждым или многими клеточными белками и, таким образом, поддерживать нормальное протекание белок-зависимых реакций клеточного метаболизма в условиях действия высоких температур.

Изучение температурно-временных параметров синтеза БТШ в лимфоцитi* человека in vitro показало, что он наблюдается в достаточно узком интервале температур (39-44 °С) и максимально выражен при 42°С, при этом различные БТШ в условиях 1-часовой экспозиции индуцируются при разных температурах. Параллельно с индукцией новых компонентов белкового спектра повышение температуры до 42°С сопровождается заметным снижением общего белкового синтеза синтеза (табл. 1), прогрессирующим при дальнейшем её увеличении. Так, при 44вС основным синтезируемым в лимфоцитах белком остается БТШ70. Анализ вклада интенсивности и длительности ТШ на синтез БТШ показал, что нарастающий во времени синтез БТШ наблюдается лишь при достаточно высоких температурах 42°С)'. При умеренно высокой температуре (39°С) он остается на низком уровне даже при 2- или 3-часовой инкубации. Это обстоятельство указывает на доминирующую роль абсолютных значений высокой температуры в индукции БТШ, что, по-видимому, связано с термозависимыми конформационными перестройками в' белковом факторе транскрипции (HSF) генов ТШ.

На следующем этапе исследований закономерно возникал вопрос о том, на сколько обнаруженная в опытах in vitro способность лимфоцитов отвечать на тепловое воздействие синтезом определённого набора белков соответствует ситуации при гипертермии организма в целом. Действительно, как показали проведенные эксперименты в лимфоцитах, выделенных из крови .кролика, находящегося в состоянии гипертермии (ректальная температура 42,5°С) наблюдается индукция синтеза БТИГ70 и БТГО8. Вместе с тем, в реакциях лимфоидных клеток на повышение температуры in vivo и in vitro имеются некоторые отличия. Так, если в экспериментах in vitro индукция синтеза БТШ в той или степени была зарегистрирована при всех использованных значениях температур (39-42°С), то в опытах in vivo этот эффект наблюдался лш::ь на высоте гипертермии при экстремальных (4:>,5°С) значениях ректальной температуры животного. Другим отличительным свойством лимфоцитов при ТШ in vitro является способность синтезировать полный набор БТШ, тогда как при гипертермии целого организма наблюдается преимущественная

Таблица 1. Действие теплового шока на синтез, белка в клет ках организмов, отличающихся по температура« сред обитания

1 Тип клеток 1 и организм I (*) I Относительная устойчивость общего синтеза I белка к действию различных температур (2) 1

24-25 36 температура (í°C) 37 38 40 42 44 45 49 I

1 лимфоциты I верблюда 100 .93 27 1

1 лимфоциты I человека 100 66 16 I

I 79Г70УЗ* I (дрозофила) 100 52 12 0 0 I

I эрсЬ (тутовый I шелкопряд) 100 100 47 16 Ь 1

1 АрМз1 (дубовый 1 шелкопряд) 100 78 84 18 7 1

I звьв-1лбб-2: ( (непарный I шелкопряд) 100 . 76 14 3. 0 I

I 3214 (лейшмании 1кавказской агамы) 100 167 84 37

I К-19( лейшмании каспийского геккона) 100 138 67 16

(*) - длительность ТШ в случае лимфоцитов - ЬО мин, клеток шелкопряда - 120 мин, лейшманий - 75 мин. Представлены средние данные 4-5 вкспериментов. ,

индукция основных БТШ (70 и 88 кДа, а также БТ11В2), что согласуется с данными Brown et al. С1982] и Cosgrove and Brown И 983].

Особый интерес представлял вопрос о возможной индукции синтеза БТШ в лимфоцитах при действии высокой внешней температуры на оргё. .м человека Как показали проведенные эксперименты после комбинированного действия высокой внешней температуры (45°С) и физической нагрузки (100 вт) в течение 35-45 мин, у испытуемых ректальная температура возрастала в среднем от 37,2-37,5° С до 38,8-39,4°С, после чего их переводили в помещение с температурой 25°С и через 30 мин метили белки лимфоцитов в собранной крови. Однако, в данных экспериментальных условиях не удалось наблюдать индукции или усиления синтеза БТШ, что, по-видимому, связано с слишком низким значением температуры тела. Попытки достичь более высоких значений ректальной температуры в камеральных условиях не увенчались успехом и были связаны с риском теплового удара; вместе с тем, индукция БТШ возможна при некоторых патологических состояниях организма (лихорадка, вирусная инфекция), когда температура тела может достигать 40,0-40,5 С [Clark, Brown, 1986] и при некоторых других заболеваниях [Young, Elliot, 1989].

На следующем этапе был проведен сравнительный анализ реакции на ТШ в клетках млекопитающих с различной устойчивостью к действию высокой температуры, выявивший ряд интересных особенностей. Во-первых, общий белковый синтез в лимфоцитах верблюда, выбранного в качестве относительно терморезистентного вида, более устойчив к действию высокой температуры in vitro в сравнении с лимфоцитами человека (табл. 1). Во-вторых, различия наблюдаются и на уровне отдельных БТШ-. Интересно, что в трех типах изученных клеток верблюда (лимфоциты, эритроциты, фибробласты кожи) мы наблюдали различную реакцию на тепловое воздействие. Анализ двумерных флюорограмм показал, что в фибробластах при ТШ резко усиливается синтез БТИГ73 и индуцируется синтез БТИР2. Напротив, в лимфоцитах на фоне мощного усиления синтеза конститутивного БТ1У73 синтез de novo индуцибельной формы ШГО (мол. масса этого белка в лимфоцитах выше, чем в фибробластах), хорошо выраженный в лимфоцитах человека (рис. 1, б) и других клетках-млекопитающих [Welch. Minzen, 1988], остаётся практически незаметен. Эти данные были подтверждены соотретствугшини иммуннсэ-лектрофорограмюми (рис. 3, а-г). Что касается притрспитт верблюда, имеющих клеточное ядро, то в них, в отличи" ст •»ритроиитое

i ¿

в •

^вг

Á va

I Рис. 3. Иммунный блоттииг белков раилич .

них типов клцтои верблюда с полшшжшп. -ними антителами N7. Представлены одно- (Д -лимфициты (1), tíO миг белка; эритроциты (2), ' 180 мкг бежа) и двумерные (лимфоциты - а

— — 73 (37°С), б (42°С, 2 часа); фибриОлаети • и

(37°С), г (42°С, ü часа) иммуннозлектрифоро-граммы. На гели ь соответствующих парах клеток наносили равни; количества б^-лка.

!L i

птиц и амфибий [Atkinson, Dean, 1985; lleikkila et al. , 19851, при 37°C, 42° С или 44°С синтеза каких-либо белков (за исключением незначительного синтеза гло'бина) не наблюдалось. Таким образом, зрелые эритроциты верблюда являются интересным примером клеток, находящихся на конечной стадии своего развития, не способных ни синтезировать, ни индуцировать при ТЩ синтез БТШ. Ранее аналогичные случаи, за исключением меток прорастающей пыльцевой трубки растений [Moscaronhas, Altschular, 19851 и сперматоцитов [Bonner et al., 19841 были описаны лишь для клеток эмбрионов различных организмов, находящихся на ранних стадиях своего развития (до стадии бластулы) [lleikkila et al., 1985] и в некоторых недифференцированных культурах эмбриональных клеток [Wittlg et al. , 19831. Шесте с тем, иммунный блоттинг (рис. 3, д) показал, что эритроциты всё не содержат конститутивный БТ11173, хотя и значительно меньше в сравнении с лимфоцитами. Этот стрессовый белок, по-видимому, синтезируется и запасается на более ранних стадиях дифференцировки эритроцитов.

Здесь следует отметить, что несмотря 'на зарегистрированные отличия в реакциях на ТШ,. все изученные типы клеток всрблюдп подвергаются действию примерно разновысоких температур в условиях естественной гипертермии игвотного, наблюдаемой в природе [Шмидт-Нильсен, 1972]. Поэтому защиту клеток от перегревания должны, по-видимому, обеспечивать исходно имеющиеся и индуцируемые в этих условиях БТШ. Нетрудно заметить, что единственным общим компонентом, значительно превосходящим по уровню синтеза и содержания другие БТ11Г70-подобные белки, для всех изученных типов клеток в норме и при ТШ остается именно конститутивный БТШ73 (рис. 3). Таким образом, принимая во внимание выявленные особенности синтеза и содержания конститутивной и индуцибельной форм БТИГО. а также отмеченное другими авторами [Velch, 19901 высокое структурно-функциональное сходство этих белков, можно предположить, что в клетках такого адаптированного к условиям ¡¡аркой пустыни животного как верблюд обычные в летнее время тепловые экспозиции могут не сопровождаться индукцией de novo ВТШ72, а лишь компенсаторным усилением его исходно присутствующего конститутивного аналога - БТШ73, - несущего, таким образом, основную нагрузку в реализации защитных свойств этих стрессовых белков. Полученные данные согласуются с результатами другим авторов [Aujame, Firko, 19881, показавших, что индуцибельный БТШ58

1ш нужен в дополнение к конститутивному БТ1Я70 для приобретения терыоустойчивости клетками плазмацитоми мыши.

Относительно низкое содержание БТ11Г73 в эритроцитах .можно объяснить тем, что, в отличие от активно метаболиэирукяцих клеток CPeltiam, 1086] эритроциты не требуют высоких концентраций ВТШ для стабилизации структур большого числа вновь синтезированных полипептидов, их транслокации, сборки в мультимерные комплексы и т. д., а имеющегося количества ВТШ73 вполне достаточно для обеспечения этих процессов в условиях низких скоростей синтеза одного единственного белка - глобина.

3. 3. Анализ компонентов системы теплового шока у трех видов шелкопряда различного географического происхождения Если у млекопитающих температура тела в норме колеблется в узком интервале, то у холоднокровных он значительно шире. Здесь в зависимости от температурных условий внешней среды можно наблюдать довольно широкий спектр форм с различной устойчивостью к высокой температуре. В этой связи на следующем этапе было проанализировано состояние некоторых компонентов системы теплового шока у различных холоднокровных, отличных по температурам своих сред обитания, где ми обнаружили существенные отличия в реакциях на ТШ, связанных с изменениями в экспрессии генов ТШ на уровне транскрипции, трансляции и в конечном счете в различном внутриклеточном содержании ВТШ (70 кДа). ■

В классе насекомых для исследований били, выбраны клеточные линии трех видов шелкопряда различного географического происхождения: южные-виды - тутовый и дубовый шелкопряды и непарный шел копряд - вид, ; распространенный в средней полосе. В качестве сравнения использовали! также клетки D. viril i s.

■ В табл. 1 представлены данные по относительному включению S-метионина в белки клеток .различных видов шелкопряда и D. virilis при разных температурах. Видно, что у D. vin lis при 40° С включение меченного предшественника в 10-15 раз ниже, чем при 25°С. При более высоких температурах включение метки прекращается полностью. С другой стороны, в метках тутового шелкопряда при 40°0 меченый метиоиин включается практически также, как в контроле."более того, достоверное включение метки регистрируется при 45 С и даже при 4й°С. Исходя из этих данных, можно заклю-

чить, что клетки этого вида шелкопряда более термоустойчивы, чем клетки дрозофилы.

Флюорограммы белков, синтезируемых в клетках этих видов, представлены на рис. 4 (здесь и далее при работе с ¡теткам шелкопряда на гели наносили равные количества белка).

3 4 S 5 7 S

• до ругЭ^ЯГн

«-УМШГ

__ М». WMi

,0 ИИ

I £1 —

гг —

tt ¡'«ил--. •<■»'-••'5 -4 : КЗ M^fhl.-'l

IS IT wc

25 37 »J 03 15 17 US 49 |

б .

^Рис. 4. Флюорограммы белков, синтезируемых при различит температурах в' клетках культурах клеток дрозофилы (а), тутового (б), дубового (в, 1-4) и непарного (в, 5-8) шелкопрядов. После 1-часовой инкубации ¡щи соответствующих температурах белки метили (1 час) in vitro 0 S-метионином в этих те условиях. Маркеры мол. масс - ВТШ из личинок D. melanogaster.

Хорошо видно, что в клетках дрозофилы при повышении температуры до 37 0 С происходит индукция новых белков (БТШ) на фоне постепенного уменьшения синтеза нормальных щеточных белков (рис. 4, а), тогда как в клетках культуры тутового шелкопряда ситуация с синтезом БТШ иная. В последнем случае флюорограммы

белков, синтезируемых при 25°С и 37°С практически не .отличаются друг от друга Лишь при температуре 40°С и выше заметна индукция дополнительного белка в области 70 кДа при сохранении активного синтева белков с молекулярными массами 83, 68, 40 кДа (по-видимому, актина), 23 кДа и ряда других минорных белков (рис. 4, б). Аналогичную ситуацию мы наблЛдали и в культуре клеток дубового шелкопряда (рис. 4(B), дорожи 1-4). Клетки этого вида также характеризуются высокой термоустойчивостью, они продолжают синте-вировать белки даж при 49°С.

Двумерные электрофореграммы белков клеток В. nsori показали, что несколько изоформ BUM) синтезируются и при 25°С. Иными сло-ваш, при ТШ в метках В. mor i мы имеем дело в основном не с индукцией синтеза полипептидов de novo, как это происходит у дрозофилы, а с сохранением и усилением синтеза БТШ, образующихся в норме.

Способность клеток изученных видов шелкопряда ' синтезировать БТШ при экстремально высоких'температурах может объясняться но крайней мере двумя причинами. Ео-первых', поскольку эти виды шелкопряда южного происхождения САстауров, 1974), термоустойчивость может являться эволюционно выработанной особенностью; во-вторых, наблюдаемое явление мокет бить свойственно ' лишь культивируемы клеткам шелкопряда и объясняться, например, присутствием в среде каких-либо агентов, обусловливающих частичную индукции генов ТШ при нормальной температуре.

Для проверки последнего предположения мы"исследовали синтез БТШ в культуре клеток непарного шелкопряда Ц dispar - вида, широко распространённого в'средней полосе. Данные, приведенные на рис. 4(в) (дорркки'5-8), позволяет заключить, что в клетках этого вида синтез БТШ при-температуре рьше 40°С резко падает, напоминая в этом отношении ситуацию в клетках дрозофилы. Таким образом, вид шелкопряда, обитающий -в умзреиних широтах, чётко отличается по этому признаку от других видов южного происхождения. Замечательно, что если клетки культур тутового и дубового шелкопрядов били способны переносить несколько пассажей при температуре 37°С.(три пассажа, срок наблюдения; Т. Я Брауде-Золотаре-ва, неопубликованные данные), то клетки непарного шелкопряда при этой температуре быстро погибали.

Для того, чтобы выяснить, являются ли обнаруженные особенности синтеза ВТШ и ы^мкая' турмоустойчмвость специфическим свойст-

вом лишь культивируемых клеток В. morl, мы провели исследование синтеза белка в отдельных органах гусениц тутового шелкопряда при различных температурах. Эксперименты проводили на самцах.

Как можно видеть из флюорограммы, представленной на рис: 5 (а), тепловая обработка при 40° С не сказывается значительным образом 1 штенсивности синтеза нормальных белков в клетках жирового тела, хотя в тех же условиях в клетках дрозофилы практически прекращается синтез нормальных белков, так и синтез ВТШ tЛозовская, Евгеньев, 19843.

Самостоятельный интерес представляет синтез БТП1 в клетках фиброинового отдела шелкоотделительной железы (рис. 5,6). В этом специализированном органе в конце Y возраста гусениц синтезируется практически один единственный белок - фиброин СКуллыев, 19821. Поскольку в наших экспериментах для введения метки в белки мы использовали меченый метионин, составляющий очень малую долю в общем пуле аминокислот фиброина, то на флюорограмме в дорожке, соответствующей нормальной температуре, белковые полосы выражены довольно слабо. Однако, повышений температуры до 37-40°С (рис. 5, б) и даже до 42,5°С индуцирует в шелкоотделительной железе прогрессирующий синтез БТШ93, БТШ70 и некоторых других БТШ и параллельное снижение синтеза фиброина Вместе с тем, . активнейший синтез фиброина, наблюдаемый при нормальной температуре у гусениц конца Y возраста, по-видимому, диктует необходимость повышенной экспрессии БТШ, необходимых для стабилизации компетент- " них форм большого числа вновь синтезированных полипептидов, их последующего транспорта и сборки в высокомолекулярные структуры. В этой связи безусловный интерес- представляет тот факт, что подавляющую часть отличных от фиброина белков, синтезируемых в шелкоотделительной железе при 25°С, составляет именно белки из семейства БТШ70 (а также белок с мол. массой 25 кДа).

Проведенный одномерный электрофоретический анализ белков различных органов (жировое тело, половая и шелкоотделительная железы) гусениц тутового шелкопряда показал, что они обладают идентичными наборами БТШ и сходной динамикой их синтеза Однако двумерные флюорограммы меченных белков продемонстрировали, что тканеспецифическая экспрессия БТШ реализуется на уровне отдельных членов семейств БТШ70 и БТШ90, что,возможно, связанно с их различной посттрансляционной модификацией. Органной специфичностью характеризуется и тип экспрессии некоторых БТШ - консти-

"Ч. г

_ вз

= 74 70

Ч J' 40 U%

и » К

Рис. 6. Флюорографа белков, синтезируемых в клетках мирового тела (а) и шелкоотделительной железы (б) самцов гусениц тутового шелкопряда У возраста после действия различных температур. На дорожки наносили равные количества белка. Сбоку приведены мол. массы (кДа) основных БТШ

11 3 M 3 в

Рис.»6. Гибридизация суммарной РНК (по 10 мкг) клеток культур D. viril is (1, 2) и В. поп (3-6), инкубированных при различных температурах, с 3гР-ДНК клона 229.1 (87С1), содержащего структурный ген ЕТШ70 D. riela nogaster. .Клетки подвергали ТШ (1 час) при различных температурах, контрольные клетки инкубировали При 25°С. 1,3- 2б°С; 2, 4 -37°С; б - 40РС; 6 - 45°С.

тутивный или индуцибельный, - что согласуется с данными других авторов [Masing, Brown, 1989; Brown, Sprang, 1988; Zagvis, Matthopoulos, 19861.

Исследование синтеза БТШ в клетках жирового тела у гусениц II-Y возрастов не выявило отличий в индукции БТШ при ТШ. Основные БТШ. конститутивно синтезируются при нормальной температуре и их синтел усиливается при ТШ. Таким образом, отмеченная другими авторами „¿способность клеток в раннем развитии организма индуцировать синтез БТШ связана лишь с очень ранними стадиями развития (до стадии бластулы) CHeikkila et al., 19851 и не наблюдается у шелкопряда на стадии гусеницы.

На следующем этапе были проведены эксперименты, направленные на выяснение характера синтеза МРНК-ВТШ70 в клетках В. mort, а именно увеличивается ли синтез РНК, кодируемой генами ТШ при 40°С и выше, или происходит лишь избирательная трансляция предсушест-вующих в клетке матриц при этих температурах. Для этого равные количества суммарной РНК, выделенной из' культур клеток В. morí, подвергнутых действию различных температур, фракционировали в агарозных гелях, переносили на нитроцеллюлозу и гибридизовали с 32 Р-меченым клоном, содержащим ген ВТ НТО D. melanogaster. Для сравнения брали РНК, выделенную из клеток D. virili?, выращенных при 25°С и подвергнутых ТШ при 37 °С. На авторадиограмме, представленной на рис. 6, видно, что в клетках В. rrorí (дорожки З-б) происходит нарастание синтеза РНК, кодирующей BTIWO, при повышении температуры вплоть до 45°С. ' С другой стороны, известно, что в клетках дрозофилы, при температуре 40°С синтез мРНК для БТШ70 падает до нуля tAshbuner, Bonner, 19791. Таким образом, можно заключить, что в клетках В. morí индукция синтеза БТШ происходит как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Способность клеток В. morí транскрибировать мРНК-БТШ70 и транслировать соответствующий белок при экстремально высоких температурах коррелирует с их высокой термоустойчивостью. Так, например, Takada С19671 удавалось культивировать клетки В. iron при 37°С.

Интересно отметить, что способность клеток В. irori эффективно транскрибировать гены БТ11170 при температурах выше 40°С сохраняется и при комбинированном действии ТШ (42°С) и вирусной инфекции (ВЯЛ). Однако при этом блокируется синтез всех клеточных белков, включая БТШ, и наблюдается преимущественный синтез ви-

русного белка (полиэдрина), по-видимому, за счет насыщения полисом вирусными матрицами. Аналогичные результаты были получены при заражении ВЯЛ гусениц тутового шелкопряда Y возраста

Результаты, полуденные на культивируемых клетках различных видов шелкопряда и гусеницах тутового шелкопряда, характеризуются своей "экологической" направленностью, т. е. лучшей способностью клеток южных видов транскрибировать гены ТШ и транслировать соответствующие мРНК при высоких температурах; белковый синтез в этих клетках обладает более высокой устойчивостью к ТШ в сравнении с клетками видов, распространенных в средней полосе (непарный шелкопряд, дрозофила). Всё это свидетельствует в пользу существования определённой Закономерности мевду уровнем БТШ и температурными условиями существования вида Критерием общебиологической вначимости.такой закономерности, на наш взгляд, может быть проведенный на достаточно большой видовой выборке животных анализ, включающий как минимум определение содержания БТПГ70, относительных скоростей их синтеза, уровня МРНК-БТШ70 .экспрессии БТШ in vivo в естественных условиях обитания организма и др. Действительно, "спасающая" или адаптивная функция БТШ, продемонстрированная в экспериментах на клетках CLlndquiat, 1986; Lindquist, Craige, 1988], может быть отобранным в процессе эволюции механизмом, обеспечивающим существование тех или иных видов в регионах с повышенными температурами внешней среды. В этой связи нами был проведен сравнительный анализ некоторых компонентов системы теплового шока у расширенного спектра видов ящериц, занимающих чрезвычайно разнообразные по температурным характеристикам экологические ниши от Карелии до южного Туркменистана

3.4. Сравнительный анализ компонентов системы теплового шока у ящериц - представителей различных климато-географических БОН.

В экспериментах использовали 14 видов ящериц, относящихся к 9 родам в пределах семейств Agamidae, Gekkonidae, ^acertidae и Scinoidae. По своему происхождению они относятся к пяти фау-нистическим комплексам. Отбор животных- для анализа проводили с учётом различий температур их естественных сред обитания, которые чётко прослеживаются у видов различных фаунистических комп-

нексов и, в меньшей степени, внутри некоторых групп (табл. 2; ландшафтные характеристики среды обитания и температурные интерзалы активности ящериц приведены,из работ ЦЬммакова [1981], Ата-зва t19853, Богданова С19621, Яблокова [19763, Банникова и зоавт. [1977], Черлина [19893, Даревского [1967], Rustamov and Shammakov [19823).

Исследования проводили в сравнительном аспекте, для чего все изучаемые виды ящериц были подразделены на несколько групп в зависимости от климато-географических особенностей среды обитания и цикла суточной активности. Наибольшее число групп составили ящерицы южного происхождения, в том числе ночные (все гекконы) и днеЕные виды, обитаете в горах, предгорьях (гологлаз, мабуя, агама) и на равнине (все круглоголовки, линейчатая и средняя ящурки). Отдельную группу составили представители семейства Lacertidae (живородящая, прыткая и скальная ящэрицы), обитающие в средних и северных широтах.

В отдельных экспериментах был'также'изучен синтез БТШ у эндогенных паразитов (лэйшманий) некоторых видов ящериц.

3. -1.1. Спеотры БТШ, динашка и температурные диапазоны шг синтеза у различит видов ящериц

Проведении^ по данным одно- и двумерных злектрофоресов глга-лиз (табл. 2) показал, что у всех ¡пученных видов яг^ркц независимо от происхождения и условий среды обитания при ТШ " индуцируются идентичные БТШ (85; 68, 48, ' 35, 25 кДа)., кз гсоторнх основные являются BTSB5 и БТШ8. Увеличение внешней тсипергтури сопровождается усиленней синтеза основных БТШ, идупцш на фоне продолжающегося синтеза обычных клеточных белков и достигавши максимального при субкрнтнчеегах и критических температурах. В последнем случае обгг;гй клеточный белковый синтез падает if БТШ становятся основным! сютезкруемики компонентами. Шесте с тем, существенные различия были обнаружены п.температурных интервалах индукции и продолжающегося синтеза БТ11 В отличие от видов, обитающих в средних и северных широтах (.птородящзя, прыткая и скальная ящэрицы) у дневных ящериц южного'происхождения (песчаная, такырная и загаспийская круглоголовки, кавютзекая агама, золотистая мабуя) этот синтез индуцируется при температурах в среднем на 1-2°С выше и продолжается вплоть до 47-50°С. Промежуточное положение занимают ночные южные виды (гребнепалый н сцин-

ковый гекконы): имея сравнимую с "северными" видами температуру индукции БТШ68 (36-37°С), они обладают более высоким верхним пределом их синтеза (43-45°С). Единственным исключением из видов южного происхождения является азиатский гологлаз, отловленный на высоте 1500 м: по температурным характеристикам синтеза БТШ И устойчивости к действию высокой температуры он напоминает другой горный вид - скальную ящерицу. Полученные данные свидетельствуют, что температурные диапазоны выраженного синтеза БТШ, являются характеристическими величинами для каждого из изученных видов ящериц. Температурные перепады в 10-15°С при более низких температурах, например, от 1СРС до 25°С не приводят к специфической индукции ЕТЕ

Следует отметить, что зарегистрированные верхние температурные границы синтеза БТШ у различных видов ящериц фактически являются предельно высокими температурами, переносимыми животными в условиях 1-часовой экспозиции. Дальнейшее повышение температуры вызывало у животных состояние комы и приводило к гибели 60-100% взятых в эксперимент животных. Таким образом, прослеживается хорошая корреляция температурных параметров синтеза БТШ, термоустойчивости ящериц и температурных условий их обитания в природе: в отличие от видов, распространенных в средних и северных широтах, южные виды ящериц, обитающие при относительно более высоких температурах внешней среды, обладают более широким температурным диапазоном синтеза БТШ, существенно более высотами верхней температурной границей их синтеза и термоустойчивостью .(табл. 2).

Сопоставление данных температурной индукции БТШ с температурными интервалами активности изученных видов в природе позволяет заключить, что виды из семейства 1_асегис1ае, в частности живородящая и скальная ящерицы, в природе практически не ветре-, чаются при температурах воздуха, вызывающих у них индукцию БТШ (табл. 2). Иными словами такие температуры являются для.них экстремальными, а синтезируемые в ответ на это БТШ, по-видимому, полностью мобилизованы на защиту организма от гипертермии. В то хе время у теплолюбивых юлшых видов, таких как закасчийская, такырная и в особенности песчаная круглоголовка, оптимальная температура которой летом составляет 41-43°С (см. ниже), индукция и активный синтез БТШ как раз находятся в пределах температурного интервала активности этого вида (Черлин, 1989], что указывает на

Таблица 2. Сравнительные характеристики синтеза и содержания ЕТШ58, ландшцттных и температурных параметров сред обитания изученных видов ящериц

Вид'и фаунистическая группа

Среда обитания

Температурный интервал активности вида (I °С воздуха)

мин. I опт. I макс.

3 14 15

Температурный интервал синтеза БТШ (°С)

6(*)

Туранская группа

песчаная круглоголовка

закаспийская круглоголовка

такырная круглоголовка

каспийский геккон

гребкепалый геккон

песчаная пустыня

песчаная и ; глинистая пустыня

глинистая пустыня

глинистая и песчаная пустыня, развалины и трещины стрений, хол-могорье

песчаная пустыня

15-17 20-34 37-42

11-14" 17-30 . 38-40

7-10 15-30 36-42

10-12 18-25 28-32

10-13 16-23 24-29

39-50

38-47

37-47

37-45

го (О

Продолжение таблицы 2 .

I 2.

песчаная пустыня

песчаная и глинистая пустыня

каменистые склоны и ущелья

холмогорье, нагорная степь, склоны гор, долины рек

склоны гор, береговые обрывы, нагорная степь

13 1"4

сцинковый геккон

линейчатая яшурка

средняя ящурка

Ирано-афганская группа

кавказская агама

азиатский гологлаз

Сахаро-синдская группа

золотистая мабуя

8-10 16-22 26-30 I 36-43 I 72 I I

18-22 24-39 38-42 I I . 93

I I I

8-10 15-26 28-34 I I I I I I

8-10 20-26 28-38 I 37-47 I 91 I I 1

10-15 18-26 28-34 I 36-42 I I I I I

15-19 20-28 33-34 I 37-48 I

] 1 I 2 3 I 4 I 5 I 6 7 1

Европейская I

группа I

прыткая 1 горы, степи, овраги. 7-10 20-25 27-35 1 7 36-42 46 I

ящерица I лесные поляны, сады ]

1 живородящая 1 лиственные и 1

I ящерица I хвойные леса т 12-15 18-25 27-32 I 1 I 35-42 17 I

I Кавказо-малоазиат- » 1 1 I

I ская группа I I

I скальная I скалистые я каые- I

I яшерица I нистые участки гор 7-10 19-24 28-32 I 36-42 37 I

т I I I.

а - результаты приведены по данный одно- и двумерных электрофэрезов. Верхняя температурная граница синтеза БТШ58 в каждом конкретном случае являлась предельно высокой температурой, переносимой соответствующими видами ящериц при 1-часовом перегревании в камеральных условиях. Дальнейшее повышение температуры вызывало состояние коиы и гиОель 80-100Х взятых в эксперимент животных (6-8 шт.)

** - в каждом случае приведены средние (из 3-4' животных) данные сканирования полос иммунно-прецишггации при иммунном бдоттинге БТШ58 с ппликдпиальнши антителами Н7

участие этих белков в обеспечении нормального протекания метабо лических процессов в данном диапазоне температур.

Летальный анализ белков из семейства БТШ70 показал, что он; представлены двумя основными белками - БТШ58(-) и БТИБ8(+). И: приведенных фрагментов двумерных флюорограмм белков печени ящериц, обитающих в различных эколого-географических нишах , видно что в клетках песчаной круглоголовки при 25 °С хорошо выраже! конститутивный синтез одной изофорсмы (БТШ58(-)), тогда как i клетках прыткой ящерицы отмечен значительно меньший по величин» синтез другой (БТШ38(+)). При ТШ синтез стрессовых белков возрастает, особенно БТШ58( -) и его изоформ (рис. 7, а-г; рис. 10).

Асинхронный характер синтеза отдельных членов семейств; БТШ70 при различных температурах был обнаружен и у других ящерш туранской фаунистической группы. Так, у сцинкового геккона и за-каспийскбй круглоголовки (рис. 8, а, б) при соотвествующих умеренно высоких температурах первым усиливается синтез БТШ68(+), при дальнейшем повышении температуры синтез обоих белков выравнивается, а в условиях субкритических и критических температл синтез БТШ68(-) и его индуцированных изоформ существенно превосходит синтез БТШ58( +). Заметим, что именно БТШ58(-) являете? конститутивно синтезируемым белком в клетках печени особо термофильного вида - песчаной круглоголовки - при стандартной температуре (25°С), в то время как у умеренно теплолюбивых видов южных видов (такырная и закаспийская круглоголовки), а также прыткой ящерицы идет меньший по величине конститутивный синтес БТШ68(+) (см. рис. .10).

В свете отмеченных различий в синтезе белков семейства БТ11/7С можно предположить, что БТШ58(+) функционирует в диапазоне средних и умеренно высоких температур. В этом отношении он напоминает когнатные ВТШ млекопитающих и дрожжей [Welch et al. , 1989; Craige, 1989]. С другой стороны, БТШ68(-), активный синтез которого наблюдается при высоких и критических температурах (а у песчанной круглоголовки он хорошо выражен и при 25°С), по-видимому, ответствен за предотвращение гибельных для клетки и целого организма последствий жестких тепловых воздействий. Биологическое значение обнаруженного феномена может состоять в том, что высокое содержание (см. ниже) и постоянный синтез стрессорных белков ВТШ58(+) и в особенности БТШ58(-) в широком диапазоне температур (25-50 °С) отражает не только способность организма

м<->

.Г**

: ж- • •

til

*л

m л

■ •Г: :

hic. 7, Двумерные флюорограммы белков, синтезируемых in vivo в плетках печени песчаной круглоголовки (а, б) и прыткой ящерицы Сь. V) до (а, в - 25°С) и после ТШ (б - ьсРи, 1 час; г - 42°С, ) мае), и соответствующих экспериментах анализировались рашша I? личесгва радиоактивности.

Рис. 8. Асинхронный синтез различных членов семейства 8X1170 у некоторых видов ящериц арид-нс-о региона, а - сцинковый геккон, б - закаспийская круглоголовка, в - песчаная круглоголовка. На оси ординат отмечено относительное включение радиометионина в БТШ58(-) (о о) и те-3(+) (о----о), представлены средние данные сканирования соответствующих пятен на двумерных ¿жсрограммах. Штриховкой обозначена область температур, приводившая к гибели 80-1001

ОППт!:Ч'У ЛСТЪПТЧМУ Я ^/п ^ПР ьгл V 1 -ияппвпй ■п^г.гт^оглттгт^ а

чествовать в условиях действия высоких внешних температур, но его потенциальную готовность к относительно резкому кратковре-нному изменению температурных условий внешней среды (например, >и кратковременных перебезпках, добыче пищи или возникновении [асности и др.), во время которых он может обходиться без до-шштельного усиления синтеза стрессовых белков. Последнее, од-1Ко, становится необходимым при длительных высокотемпературных «¡позициях и позволяет, например, песчаной круглоголовке, в от-1 чие от всех других изученных видов ящериц, _ переносить саше Четкие температурные воздействия, использованные в эксперименте зплоть до 50°С в течение 1 часа). Действительно, эксперименты, доведенные в условиях, приближенных к естественниц условиям Зитания песчаной круглоголовки показали, что кратковременные 5-20 мин) тепловые нагрузки дал» при достаточно высоких темле-атурах среды (температура песка 42°0 и 52°С., - температура воз-уха 23°С и 35°С соответственно) не сопровождается выражзнной ндукцией КГ И, для чего, по-видиысыу, необходимы более длительно экспозиции. Это, возможно, связано с достаточно високии сходным виутршкеточиш содержанием БТШ у оесчшюД ¡адтлоголов-и (табл. 2), обеспечивающим термоустойчивость организма к рез-пм изменениям температурных условий среди. Влиянид предсущест-уюс.чх ВТШЯ) на их индукцию при повышении температуры бшо отменно и на клетках млекопитающих [Mizsen, Welch, 19881.

3.4.2. Структурно-ишуннологический анализ белков из семейства БТШ70

На следующем этапе был проведен структурно-нммуцнологич-зский шализ белков семейства БТ1ЮТ, продемонстрировавший их bucoiciiíI сонсерватизм, гомологию, так и определённые отличия. Результаты 1ерекрестной иммунной реакции между соответствующий! ¡.юпокло-1алышми антителами и антигенами у человека и ящериц приведены ia рис. 9 (а, б). В качестве контроля были использовали клетки lela, прогретые при 42°С в течение 90 мин. Видно, что монокло-залыше антитела N27F3-4 и C92F3A-5, специфичные к конститутивной и индуцибелыюй формам ШШ70 человек "соответственно [Welch st al., 1989), реагируют со своими антигенами в клетках Hela. В ю ж время с соответствующий антигенами у песчаной круглоголовки и гребнепалого геккона чёткая иммунная реакция наблюдается лишь в случае антител N27F3-4. Отсутствие взаимодействия конок-

лональных антител C9SF3A-6 с соответствующими белками у обоих видов ящериц можно объяснить отсутствием иммунной детерминанты, узнаваемой антитолами C02F3A-6 в соответствующих белках круглоголовки и геккона.

В других экспериментах были использованы поликлональные антитела N7, полученные против конститутивного БТ11Г73 телбнка. Эти антитела были применены для идентификации различных членов се-кшйства БТ11Г70 у песчаной круглоголовки. Как можно видеть из типичных двумерных иммуннозлострофореграмм, представленных на рис. О (D, г), БТШ68(-) и БТШ 68(-t) входят в состав семейства БТЫ70. В этой связи отметим, что другие белки с близкими мол. массами, усиленно синтеза которых также наблюдалось при повышении температуры, но является' истинными БТШ и не входят в семейство БШ70. Сравнений двумерных иммунно'зло.ктрофореграмм с соответствующими флюорогр*шмами вывило важный факт: у термофила песчаной круглоголовки, в отличие от многих других организмов, у которых инду-цибслыша БТШ обнаруживаются только при ТШ, как. конститутивно синтезируемые, тик и индуцируемые теплом белки семейства БТШ70 Исходно присутствуй в клетках иочони при С, а повышение температуры сопровождается лишь дифференцированным изменением • скоростей их синтеза

Еисокая'гомол;)ГИ1| стрессовых белков песчаной круглоголовка!, выявленная в реакциях иммунного блоттинга, была подтверждена ограниченным протеолиэом меченных радиомотионином БТ1ШС(+) ' и ЕТШбЗ(-) протоазой SV-8 ио StaphyloocccUo aureus. Обе изоформы образуют больиое число идентичных по мол, массам метиошш-содер-Х'ЛЩИХ пептидов. Вместе с том, в спектрах образованных пептидов присутствовали и некоторый негомологичныо пептиды. Полученный результат указывает как на высолю гомологию, так и на опреде-лонпыэ отличия в структуре БТШ38(+) и БТИЗЗ(-), являющихся, по-видимому, продуктами индивидуальных генов.

3.4.3. Внутриклеточное содержание и кокститугивныЛ'синтез BII1D0. Оценка уровня мРШ;-БТШ68 при различных температурах Внутриклеточное содержание БТИГ70-подобных белкгв является кардинальной характеристикой состояния системы ТШ. Приведенные в табл. Z количественные данные иммунного блоттинга белков печени различных видов ящериц с поликлональными антителами N7.однозначно свидетельствуют: содержание БТШ68 существенно еависит от тем-

I 2 3 4 5

1 2 3 4 5

\t/' t 6Ыг) '

68<+)

6&Í-) 68(f)

inc. Я. Иммунный o.flariiirii öejii'-cb fiw'jtiiH песчаной круглого-jiubMi ta, о - (2 - 2ЬьС, 3 • J3"C, 1 чао); в - 25°С, г - 45°С, ] чае.) н гребнепалого геккона (а, о (4 - 2Ь°С, 5 - 43°С, 1 чио) с моноклинальными (а H2VF3-4, о • U92F3A-6, одномерный óJk/ruiHi', дорожка 1 - клетки Hela 9и мин)) и поликлональ-

ншн ta, г - N7, дьумерный шюттнш ) атитглами к белкам из се-M»:fti:Tbd b'ilií'O. В ооответствущих ^кчлигришнтах анализировались [«¡шил* количества оелка.

пературных условий обитания вида, при этом чем выше температур; внешней среды, тем выше относительное содержание этих белко] Особенно ярко эти отличия проявляются у животных, занимающих п< лярные по температурным характеристикам экологические нипл Крайние значения относительного содержания БТШ58, различающие! в 5-6 раз, отмечены для песчаной круглоголовки (принято за 100;

- самого термофильного из всех изученных видов рептилий -им вородящей ящерицы, обитающей в северных широтах Европейскс части СССР. С увеличением средней характеристической температу) среды обитания наблюдается и увеличение содержания БТШ68. Tai для прыткой ящерицы, южная граница распространения которой дохе дит до Киргизии СЖлоков, 1976Í, характерно 2,5-кратное увеличе ние' содержания БТШ58, в сравнении с живородящей ящерицей; однг ко, онд в 1,5-2 раза уступает количеству БТШ58 у ящериц tj ранской фаунистической группы, обитающих в пустынях и полупусть нях Средней Азии.,

Интересно, что наряду с относительно высоким содержание БТШ68, свойственным всем ящерицам южного происхождения, опре делённые отличия этого показателя можно отметить у дневных ночных видов этой группы. Содержание БТШ58 у .сцинкового и греС непалого гекконов, .ведущих ночной образ жизни, характеризуете наименьшими значениями в рамках этой группы животных и в средне на 10-20Х уступает содержанию БТШ68 у термофильных дневных виде

- песчаной круглоголовки и линейчатой ящурки - но сравнимо с та ковым у умеренно теплолюбивого дневного вида - закасп.ийско круглоголовки.

Сходная зависимость содержания БТШ68 от температуры сред обитания наблюдается и для ящериц, обитающих в горах и предгорь ях. Как видно из табл. 2, скальная ящерица, обитающая во влажны ущельях Кавказа на высотах до 3000 м [Даревский, 19673, содержи примерно в 2,5 раза меньше ВТ11Б8, чем.кавказская агама, населяю щая хорошо прогреваемые предгорные холмистые участки южных сио нов Копет-Дага САтаев, 1985]. ■

Одной из причин столь дифференцированного содержания основ ного белка теплового шока в клетках различных видов лиериц може быть различный уровень конститутивного синтеза БТШ63, опр^деляе мого в стандартных условиях. Данные сканирования соответствующи участков двумерных флюорограмм, приведенные на рис. 10, наглядн отражают постепенное убывание относительных конститутивных ско

остей синтеза БТПБ8(-) и БТШ68(+) в клетках печени различных идов ящериц по мере снижения средней характеристической темпе-атуры среды обитания, и, таким образом, хорошо коррелируют с тносительным суммарным содержанием БТШ58 у этих организмов.

Особенности реакции южных видов ящериц на тепловое воздейст-ие могут быть, по меньшей мере, обусловлены изменением дозы оответствугацих генов и/или их экспрессии. Обнаруженные нами ка-ественные различия в реакциях дот-гибридизации ДНК дрозофилы и ПК различных видов ящериц туранской группы с клонированными ге-ами ВТ 1170 косвенно укасывак.т на относительное увеличение генов Т11Г70 з геноме южных видов яи-гриц и сравнении с дрозофилой. Од-ако, никаких различий не было обнаружено при гибридизации ДКК очхих и днеьша в::дев репеклпй. ГЬотсыу, допуская, что разшр енома у дне в: ас и нсших гидоа лг^-;рлц пр^Олхеител^нс одкп-^'.ое, оео зак&гш;ь, что количество генов БТ570 у сзаьк впдоз с раз-ичнш цш»и суточной актшюсхи к= претерпело существенны:: кз-енений в ходе зг^чюции, хотя оно,' по-видимому, Еыае, чем у дро-офилы.

Высокий уровень ВТ НТО-подобии;', белков у ящериц южного пронс-оэдення, продемонстрированный в реакции иммунного блоттинга, акха ¡-ег.ет Сыть следствием более аффективной транскрипции мРЕК соответствующих генов теплового шока, их накопления и последуй трзнеллцп;:. Уровень к?ИК-БТШЗЗ оценивали при г;с:,:оцд от-гибридизации суммарной Р11К с геном БТШ70 Хепориэ Хаэ'уЧэ. Еи-отшсс ' перегревала при раслачии* температурах (в завискиостн от сршустойчхшостк ыда) в течение СО млн. Далее их содержала 5 мин при сс°с, после чего забивали а выделяли сухарную РШ1. онтрольных л-пвотиих содержали при стандартной температуре 25°С.

Гибридизация суммарных РНК, выделенных из контрольных глвот-ых, с геном ЕТ070 лягушки выявила разительный отличия в- пулах Р1&-ШБ8 у некоторых представителей туранского и европейского аупиетичеегах комплексов (см. рис. 11 и табл. 2). Относительно исокий уровень мРНК-БТШ38 при 25°С отмечен у такырной, закаспийской и песчаной круглоголовое. Ц.меньшей степени он р.ура-ец у сцинкового геккона - вида о ночным циклом суточной актив-ости. Напротив, сигнал гибридизации значительно слабее выражен случае прыткой ящерицы.

Определённые отличия; были обнаружены и в экспрессии геной ТШ68 различных видов ящериц в условиях действия высоких внешних

Рис. 10. Относительный уровень конститутивного синтеза БТШБ8(-) и БТ1Ш8С+) в клетках печени различных видов ящериц при стандартной температуре (25°С). Приведены относительные средние значения данных сканирования соответствующих пятен на двумерных флюорограммах. Виды расположены в порядке убывания средних температур воздуха среды обитания: 1 - круглоголовка песчаная, 2 -круглоголовка закаспийская, 3 - круглоголовка такырная, 4 - геккон сцинковый, 5 - прыткая ящерица, б - скальная ящерица.

Рис. 11. Лот-гибридизация суммарной РНК (по 5 мкг) ящериц с клоном Дхыо, содержащим ген БТОРО X. 1ае-1 - .волотистая мабуя (25°С, 43йС), 2 - круглоголовка ■ песчаная (25°С, 42°С, 45°С), 3 - круглоголовка закаспийская (25°С, 43°С), 4 -геккон сцинковый (25°С, 37°С, 41°С); 5 - круглоголовка такырная (25°С, 43°С), 6 - прыткая ящерица (25°С, 42°С), 7 - дрожжевая тРНК

@ • © е> ©

1 2 3 4 5 6 7

температур (рис. 11). В условиях проведения.данного эксперимента у мабуи, такырной и закаспийской круглоголовок действие высокой температуры (43-45°С) приводило к некоторому увеличению содержания мРНК-БТШ68. Возможно, что вновь синтезированные транскрипты "маскируются" достаточно высоким исходным уровнем МРНК-БТШ68. Не исключено также, что у этих и других южных видов ящериц при ТШ происходит активация и трансляция предсуществующих МРНК-БТ11Б8, как это ь.шсано, например, для ооцитов лягушки [Bienz, Gurdon, 1982]. Вместе с тем, хорошо выраженная нарастающая экспрессия генов БТШ58 была обнаружена у сцинкового геккона при 37°С и 41°С и особенно ярко у песчаной круглоголовки при температурах 42°С и 45°С. Последнее обстоятельство позволяет предположить, что у песчаной круглоголовки аналогичная активная экспрессия мРНК-БТШ58 происходит и в естественных условиях обитания, так как температуры 41-44°С являются оптимальными для этого вида в летний период [Черлин, 19893. Увеличение содержания МРНК-БТШ58 было зарегистрировано и у прыткой ящерицы при 42°С, однако, оно было ниже, в сравнении- с южными видами. Таким образом, относительно высокий уровень мРНК-БТ1Ш8'И их экспрессия при высоких температурах у южных видов ящериц хорошо коррелируют 'с более высоким содержанием ВТ 1Я70-подобных белков у этих видов, их термоустойчивостью и температурными условиями обитания.

3. 4. 4, Синтез БТШ у лейшманий - паразитов кавказской агамы

и каспийского геккона Продемонстрированные выше отличия в реакциях на ТШ у различных видов ящериц, обитающих в экологических нишах с различными температурными характеристиками, позволяют предполагать наличие сходных изменений в реакциях на ТШ и у их эндогенных паразитов -лейшманий. Эти одноклеточные организмы, имеют довольно широкое распространение среди млекопитающих и рептилий. Недавно было показано, что при перемене хозяина у лейшманий (насекомое - млекопитающее) происходит индукция генов ТШ, которая, как предполагается, является сигналом дифференцировки паразитов и обеспечивает их существование в новых температурных условиях [Van der f'loe, 19853. В наших экспериментах мы изучали индукцию синтеза ВГШ у двух видов лейшманий - L. gymnodactyla (R19) и L. guliki (3214), выделенных от каспийского геккона и кавказской агамы соответственно. Интерес к этим организмам в первую очередь был

вызван тем обстоятельством, что они были получены от ящериц, отличающихся по температурным характеристикам своих сред обитания Выше (табл. 2), было показано, что Кавказская агама обладает относительно более высокой устойчивостью к действию высоких температур и более широким температурным диапазоном синтеза БТШ, чем каспийский геккон. Таким образом, в образовавшихся двух парах животных (хозяин-паразит) представилась возможность сравнить характер синтеза ВТШ в норме и при повышенных температурах.

Как показали проведенные эксперименты устойчивость общего белкового синтеза : к ТШ у лейшманий агамы оказалась выше, чем у лейшманий геккона (табл. 1).- Эти данные согласуются и с большей выживаемостью паразитов агамы при ТШ, в сравнении с паразитами геккона СОвезмухамедов, Сафьянова, 1986]. Вместе с тем, в отличие от позвоночных хозяев, в спектрах БТШ лейшманий агамы и геккона наиболее яркие отличия отмечены в синтезе БТШВ8 и БТШ48 И некоторых других БТШ. БТШ88, синтез которого лучше выражен у изолята 3214, является одним из характерных отличий двух видов лейшманий и может представлять интерес в плане проявления адаптивных функций в клетке. Как показали японские исследователи [Yahara et al., 19861, усиленная продукция БТ1Ю0- явлйется единственным отличием полученной . ими терморезистентной линии фибробластов китайского хомячка от исходной родительской линии. Представляет интерес и другой белок теплового шока - БТШ48; он также сильно индуцируется у паразитов агамы. Аналогичный БТШ48 у • дрожжей Saccharomyces cerevisiae является единственным белком, который индударуется при повышении температуры у термоустойчивого мутанта и, по мнению Иda и Yahara С19863 обеспечивает клеточную те^дэустойчивость.

Таким образом, полученные данные указывают, что основную "защитную" роль в клетках изученных паразитов играют, по-видимому, БТШ48 И БТЕ38. . ..

Следует такж отметить, что в термоустойчивых линиях млекопитающих часто наблюдали интенсивный синтез БТШ70 [Laszlo, Lí, 19853. Любопытно, что у обоих изучаемых видов лейшманий этот БТШ представлен лишь одной изоформой. Однако, из этогс не следует, что БТШ70 не играет присущей ему роли в клетках изученных паразитов. Как и в случае других стрессовых белков синтез БТШ70 усиливается В линиях 3214 и R-19 при ТШ. Следует также иметь ввиду, что у лейшманий, как и. других низших организмов CNoidhardt et

- 43 - .

al., 1984, 19871, 'дифференциация функций белков из семейств БТШ70 и ВТ1Ш0 может быть не столь выраженной Kaf? у высших организмов CLindquist, Craige, 19881. Таким образом, может иметь место некоторая взаимозаменяемость функций, тем более, что гены БТШ70 CMacfarlane et al., 19901 и ЕТШЗО CShapira, Pinell-l, 1989] в геномах лейшмшшй представлены тандемными повто-

ршии. Существенные же отличия в синтезе и содержании БТ11ГЛЗ-подобных белков, как упоминалось выше, наблюдаются лишь у организмов,' занимающих полярные по температурным харартеристикам зколо-гические ниши, в то время кг.к кавказская огама и каспийский геккон, несмотря на отличия в их экологии, всё ке является квшьтми видами и незначительно отличаются по содержанию БТЮТ (табл. 2).

3. 4. 5. Суточная динамика температуры тела и синтеза ВТДВЗ у песчаной круглоголовки в' естественных условиях обитания

Результаты.экспериментов по индукции синтеза БТШ у различных видов ящериц при повышении температуры внешней среди, проведенных в лабораторных условиях, позволяют предположить, что аналогичные изменении в синтезе основных БТШ у некоторых видов ящериц происходят и в природе, в естественных условиях ' обитания. Тем более, что тсиШьрсл'ура их тела тела в маркий период суток uoí.-.t достигать 44-43°С (Черлин, 1989; Ueatwole, Taylor, 1987].

В зтой связи представляло интерес выяснить, сопровождается ли действительно повышение температуры тела ящериц в жаркий период дня усилением или индукцией синтеза основных БТШ.

Исследования проводили в июле, месяце, в гачествз объегаа использовали один из наиболее термофильных; видов аридного региона - песчаную круглоголовку. Ящериц отлавливали ti а регулярных мара-рутах в песчаной, пустыне севернее г. Ашхабада. Сразу после отлова ящериц измеряли температуру в пищеводе при помощи специального термоэлектрода и через 30 паи метили in vivo бел:«'! печени (28°С, 1 час),

Профиль температуры тела песчаной круглоголовки (рис. 12, а) покааывает, что в течение светлого периода суток она колеблется в диапазоне 29-43°С, при этом в течение достаточно длительного "периода она поддерживается на уровне 40,5-43,0° С. По данным Черлина С1989] в этом оптимальном для данного вида интервале температур активно идёт переваривание пищи, ' гаметогенеэ, стабилизируются скорости многих физиологических процессов. Дан-

ные о включении радиоактивного метионина в БТШ58(-) и БТ1Ш8С+) в клетках печени песчаной круглоголовки в различное время светового периода суток (рис. 12, б, в) показывают, что изменение уровня синтеза основных БТ[11 сопряжено с синхронными колебаниями температуры внешней среды и непосредственно температуры тела яще-' риц. Таким образом, повышение температуры внешней среды и соответствующее ему увеличение температуры тела ящерицы в условиях жаркой песчаной пустыни приводит к усилению синтеза БТШ, продолжающегося, по меньшей мерс, в течение всего светлого периода суток и приходящего к исходному уровню в' течение ночного сна.

и ю сэ

800 700 600 500 400 300 200 100

8 10 12 14 16 18 20

1;0С 45 40 35 30

6 8

время суток

Рис. 12. Сопряженные колебания температуры тела (а) и синтеза основных БТШ (б - БТ1Ш8(+), в - БТШ58(-)) у песчаной круглоголовки в условиях жаркой песчаной пустыни

Вместе с тем, известно, что по мере повышения абсолютных температур тела повышается вероятность денатурации белков, . возникновения ошибок в процессах считывания информации с мРНК и, как следствие, появление аномальных полипептидов, и т.д. [Nover et al., 1984; Lindquist, 1986; Nguen et al. , 1989; Yost, Ltndquist, 1986, 1988; Александров, 1975]. С этой точки зрения вполне объясним наблюдаемый в этих условиях повышенный синтез БТШ, которые за счет эффективных белок-белковых взаимодействий с клеточными оелками способствуют нормальному протеканию этих процессов в условиях повышенных температур.

Суммируя все вышеприведенные данные следует отметить следующее. Комплексный сравнительный анализ некоторых компонентов системы теплового шока у расширенного спектра организмов, обитающих в различных климато-географических регионах позволяет заключить, что их адаптация в процессе эволюции к высоким температурам внешней среды наряду с развитием ряда поведенческих реакций, сопровождалась закреплением некоторых молекулярных механизмов, одним из которых является дозированная, в зависимости от значений внешней температуры, активность системы генов белков теплового шока (70 кДа), реализующаяся в конечном счёте в повышенной внутриклеточной концентрации МРНК-ВГШ70 и кодируемых ими BTWO-подобных белков. Очевидно, что высокая концентрация этих стрессовых белков у видов, обитающих в южных широтах, вг сравнении с "северными" видами/ ■ необходима'для обеспечения возросших, в соответствии с высокими абсолютными значениями температуры внешней среды и тела животных, нормальными клеточными и "спасающими" (ренатурация частично денатурированных белков'и др.) функциями БЛЮТ. Это обстоятельство также отражает готовность организма к резкому изменению температурных условий среды, что возможно при кратковременных перемещениях в пространстве, добывании пищи, возникновении опасности и т. д.

Значимость представленных данных, впервые полученных на широком спектре видов с чрезвычайно разнообразными температурами естественных сред обитания позволявг говорить о наличии реальной закономерности, связывающей температурные условия обитания вида с экспрессией генов ТШ, содержанием мРНК-БТ 11170 и БТИГ70-подобных белков и его чь-рмоустийчивостш. Проведенные эксперименты свидетельствуют, что оелки из семейства БТИГ/О, особенно конститутивно

синтезируемые стрессовые белки, играют ванную роль в естественной адаптации организма к высокой температуре среды, их повышенная экспрессия -является одним из неотъемлемых механизмов, обеспечивающих существование вида в условиях действия высоких внешних температур.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена позитивная корреляция между уровнем экспрессии генов теплового шока, синтезом и содержанием БПМЬподобных белков и температурными условиями существования вида-

а) терморезистентные организмы отличается более высоким уровнем содержания и конститутивного синтеза БТ11Г70. В клетках этих видов синтез нормального набора клеточных белков сохраняется при более высоких температурах.

б) синтез БТШ и соответствующих им мРИК в клетках южных видов шелкопряда и ящериц, в отличие от видов, обитающих в средних, и северных широтах, наблюдается при значительно более высоких температурах, вплоть до 45-5СРС;

2. Клетки пойкилотермных видов отличаются более широким температурным диапазоном индукции и продолжающегося синтеза БТШ, чем гомойотермные виды.

3. Обнаружен асинхронный температурозависимый синтез различных членов семейства БТИИ) у ящериц, указывающий на дифференциальную роль этих белков в клетке в широком диапазоне температур.

4. Высокая амплитуда суточных колебаний температуры тела, наблюдаемая у песчаной круглоголовки в условиях жаркой песчаной пустыни сопряжена с синхронными изменениями синтеза основных БТШ (68 кДа). .

5. Зависимость интенсивности общего белкового синтеза от температурных условий существования' вида сохраняется на уровне системы "хозяин - паразит" (ящерицы - лейшмании).

6. Обнаружены существенные различия в индукции, синтезе и содержании конститутивной и индуцибелыюй форм БТИРО при тепловом шоке в различных типах клеток верблюда, указывающие на доминирующую роль конститутивной формы в реализации защитных свойств ЕТНТО-подобных белков в клетках этого вида.

7. Тканеспецифическая экспрессия БТШ в различных органах и ипах клеток у верблюда и гусениц тутового шелкопряда реализу-тся на уровне отдельных членов семейств БТ1И70 и БТШЗО.

8. В лимфоцитах человека при тепловом шоке обнаружены еспецифические "контакты" индуцибельной и конститутивной форм !TUf70 с 'широким спектром клеточных полипептидов; в изолированных ;драх эти формы контактируют с ограниченным числом белков.

9. Эффективная транскрипция генов теплового шока сохраняется

I при комбинированном действии высокой температуры и Еирусной шфекции (ВЯЛ) на клетки тутового шелкопряда, при этом блокируйся синтез БТШ и других клеточных белков, по-видимому, за счет тсыщения полисом вирусными матрицами.

10. Совокупность полученных данных позволяет рассматривать зелки теплового шока как универсальные отобранные в процессе эволюции клеточные полипептиды, являющиеся неотъемлемым компонентом стратегии адаптации метки и целого организма к температурным условиям внешней среды.

Основные положения диссертаций отражены в следующих работах:

1. Евгеньев М. Б. , Шзйнкер В. Е , Левин А. В. , Караев К. К. , Ульмасов X А. , Бабаева А. X Синтез белков теплового шока в клетках ' культуры различных видов шелкопряда и в гусеницах// IY конференция биохимиков республик Средней Азии и Казахстана,. Ашхабад. - 1986,- С. 17-18.

2. Ульмасов X. А. , Акопов С. Б. , Бабаева А. X. , Караев К. К., Индукция белкового'синтеза в'Лимфоцитах человека при гипер-термии//Научная конференция, посвященная 70-летию ВОСР. Ашхабад. - 1987. - С, - 81-82.

3. Евгеньев М. Б., Шэйнкер R Е , Левин А. Е , Врауде-Золотаре-ва Т. Я., Щуппе Н. Г., Караев К. К. , Ульмасов X. А. Молекулярные механизмы адаптации к гипертермии у высших организмов. I. Синтез белков теплового шока в клетках культуры различных видов шелкопряда и в гусеницах//Молекулярная биология. - 1987. - Т. - 21. -N. 2. - С. 484-494.

4. Ульмасов X. А., Овезмухамедов А., Караев К. К., Евгеньев

II В. Молекулярные механизмы адаптации к гипертермии у высших организмов. II. Синтез белков теплового тока у двух видов лейшма-ний//Молекуля рная биология. - 1988. - Т. 22. - N. 6. - С. 1583-1580

5. Брауде-Золотарева Т. Я , Титаренко Е. А., Денисенко О. Е , Караев К. К , Ульмасов X. А., Левин А. Е , Евгеньев М. Б. Молекулярные механизмы адаптации к гипертермии у высших организмов. III. Действие теплового шдка на клетки тутового шелкопряда Bombyv mori, зараженных вирусом ядерного полиэдроза//Молекулярная биология. - 1988. - Т. 22. - N. 4. - С. 1128-1131.

6. Karamov Е. V., Ulmasov Kh. А., Rudneva I. А., Gorchakova Т.Д. Heat shock proteins (HSPs) and HIV infect Ion//Abstracts of the IYth International congress on AIDS. Stocholm. - 1988. P. 163

7. Ульмасов X A., Абрамова И. lü ,' Дашкевич В. К., Караев К. К. , Евгеньев М. Б. Синтез белков теплового шока у некоторых видов яшериц аоидной зоны и адаптация к гипертермии//Жур. общей биологии. - 1989. - L. 50. - N. 4. - С. 437-445.

8. М. В. Evgen'ev, Т. Y. Braude-Zolotareva, Titarenko Е. А., Levin А. V., 0. N. Denlsenko., Kh. A. Ulmasov, К. К. Karaev. Heat shock response in Bombyx mori cells infected by nuclear polyhedrosis virus (NPV) // Mol. Gen. Genet. - 1989. - V. 215. - P. 322-325. .

9. M. B. Evgen'ev, Kh. A. Ulmasov. The role of heat shock proteins in adaptation of an organism to hyperthermiaZ/Abstraots of the Xlth European nuclear workshop, Suzdal,. USSR.-1989.P. 71

10. Ульмасов X A., Дашкевич В. К., Абрамова И. Ю. , Овезмухаме-дов А., Караев К. К., Бабаева А. X , ■ Шаммаков С., Атаев Ч. , Евгеньев М. В. К вопросу о роли белков теплового шока в естественной адаптации к теплу некоторых видов ящериц аридной зоны и их эндогенных паразитов - лейшманий//УП I всесоюзная конференция по экологической физиологии. Ашхабад. 1989. - С. 324-325.

11. Абрамова И. Ю. , Ульмасов X. А., Акопов С. Б., Караев К. К. , Бабаева А. X , Евгеньев М. Б. Динамика синтеза фиброина и белков теплового шока в отдельных органах тутового шелкопряда Bombyx nerl при гипертермии// YIII всесоюзная конференция по экологической физиологии. Ашхабад. - 1989. - С. 11-12.

12. Ульмасов X А., Акопов С. Б., Худайбердыев 11 Д. Индукции белкового синтеза в лимфоцитах млекопитающих при гипертермии/-' Биохимия. - 1990. - Т. 55. - N. 5. - С. 801-807.

13. Ульмасов X А., ' Дашкевич В. К., Ляшко Е Н., Еьгеньев М. Б. Особенности синтеза белков теплового шока в клетках крови верблюда Caimlus dromsdar i ^//Доклады АН СССР. - 1990. - Т. 315. -N. 4. - С. 1021-1023.

14. Ульмасов X А., Дашкевич Е К., Шаммаков С., Караев К 1С ,

Бабаева А. X., Евгеньев Ы. Б. О роли белков теплового шока в гстественной адаптации организма к теплу//Доклады АН СССР. -1991. - Т. 316. - N. 3. - С. 749-753.

15. Абрамова И. КХ , Ульмасов X А., Акопов С. Б., Караев К. К. ; Бабаева ' X , Евгеньев М. Б. Динамика синтеза фиброина и белкоь теплового шока в отдельных органах и на разных стадиях онтогенеза тутового шелкопряда Bombyx шоп при гипертермии//Прикладная биохимия и микробиология. - 1991. - Т. 27. - N. 1. - С, 147-156.

16. Ульмасов X А., Дашкевич В. К , Шаммаков С., Бабаева А. X Асинхронная экспрессия различных членов семейства БТШ70 у сцин-кового геккона (Gekkonidge Sauriа)//Биохимия. - 1991. - T. 5S. -N. 5. - С. 874-878.

17. Ульмасов X А., Дашкевич В. К , Маргулис Б. А. , Пйммаков С. , Атаев Ч., Караев К К., Бабаева А. X Характеристика членов семейства БТ11Г70 у трёх видов круглоголовок аридного региона (Agamidae, Sauri а)//¡Кур. общей биологии. - 1991. - Т. 52. - N. 5. - С. 731-737.

18. Ульмасов X А., Дашкевич В. К., Шаммаков С., Бабаева А. X Суточная динамика температуры тела и синтеза белков теплового шока у песчаной круглоголовки ( Agamidae, Sauriа)//Известия АН ТССР (серия биол. наук). - 1991. - вып. 2. - С. 58-62.

19. Дашкевич В. К., . Ульмасов X А. , Бабаева А. X Химическое сшивание БТШ70 в лимфоцитах человека//Известия АН ТССР (серия биол. наук). - 1991. - вып. 5. - С. 73-75.

20. Каррыева Б. Ч., Ульмасов X А. , Ляшко В. Н. Белки теплового шока: роль в физиологических и патологических процессах//Тер. архив. - 199JL - T. 6J$ . - N. ,2. ' - С.

21. Ульмасов X А., Дашкевич R К. , Бабаева А. X , Евгеньев М. В. Динамика синтеза белков теплового шока (БТШ) у песчаной кругло; головки (Againida, Saur ¡а) в природе//У конференция биохимиков Средней Азии и Казахстана Ташкент. - 1991. - С. 112.

22. Дашкевич В. К. , Ульмасов X А. Внутриядерные "контакты" БТ1В70 в лимфоцитах человека//У конференция биохимиков Средней Азии и Казахстана. Ташкент. - 1991. - С. 279.

23. Ульмасов X А., Бабаева А. X , Евгеньев К В. Белки теплового шока и адаптация организма к теплу//II съезд Физиологов республик Средней Азии и Казахстана. Душанбе. - 1991. - с. 140.

24. Ульмасов X А. , Шаммаков С. Стрессовые белки яшорш//! всесоюзная токсикологическая конференция. Ашхабад. - 1091,- г. 41-42.

Информация о работе

Ульмасов, Хаёт Абдушукурович
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.13

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Белки теплового шока животных различных климато-географических зон ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Белки теплового шока животных различных климато-географических зон"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Белки теплового шока животных различных климато-географических зон
ВАК РФ 03.00.13, Физиология