Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние теплового шока на рост, морфологии и образование антибиотиков стрептомицетами

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Люй Хунцюнь, Москва

* /О-

л Д.

московский государственный университет

имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

ЛЮЙ ХУНЦЮНЬ

ВЛИЯНИЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА НА РОСТ, МОРФОЛОГИЮ И ОБРАЗОВАНИЕ АНТИБИОТИКОВ СТРЕПТОМИЦЕТАМИ

Специальность - микробиология

Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: к. б. н., доцент Захарчук Леонид Михайлович, к. б. н., доцент Нефелова Маргарита Васильевна

Москва 1999

Оглавление

Введение...................................................................................3

Обзор литературы

Глава 1. Стрептомицеты - грамположительные

мицелиальные эубактерии...............................................7

1.1. Общая характеристика стрептомицетов.................................7

1.2. Стрептомицеты в природе

Адаптация к экстремальным условиям.................................13

Глава 2. Защитные механизмы от шокового действия и стрессов......27

2.1. Внеклеточные адаптогенные факторы..................................28

2.2. Внутриклеточные защитные вещества..................................32

2.3. Белки теплового шока......................................................32

2.3.1 Группы БТШ............................................................33

2.3.2. Функции БТШ при оптимальных условиях.....................35

2.3.3. Функции БТШ при тепловом шоке...............................37

2.3.4. Регуляция синтеза белков теплового шока......................43

2.3.4.1. Регуляция синтеза БТШ у эукариотов...................43

2.3.4.2. Регуляция синтеза БТШ у прокариотов..................45

2.4. Белки теплового шока у стрептомицетов..............................47

Глава 3. Антибиотики (актиномицины и макротетралиды)............50

3.1. Антибиотики актиномицины.............................................50

3.1.1 Структура и свойства.................................................50

3.1.2. Механизм биосинтеза................................................51

3.2. Антибиотики макротетралиды...........................................56

3.2.1. Структуры и физико-химические свойства макротетралидов......................................................56

3.2.2. Механизм биосинтеза макротетралидных антибиотиков..........................................................57

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава. 4. Объекты и методы исследования....................................60

4.1. Объекты исследования......................................................60

4.2. Условия культивирования.................................................60

4.3. Условия теплового шока...................................................61

4.4. Методы анализа..............................................................62

4.4.1. Определение биомассы..............................................62

4.4.2. Определение выживаемости.......................................62

4.4.3. Микроскопирование..................................................62

4.4.4. Определение количества антибиотиков-актиномицинов......................................62

4.4.5. Выделение и хроматографический анализ актиномицинов........................................................63

4.4.6. Определение количества антибиотиков

нонактиновой группы................................................64

4.4.7. Выделение и хроматографический анализ антибиотического комплекса нонактиновой группы.........65

4.4.8. Масс-спектрометрический анализ.................................66

4.4.9. Выделение белковых фракций.....................................66

Глава 5. Влияние теплового шока на рост стрептомицетов........... . . .67

Глава 6. Влияние теплового шока на морфологию

стрептомицетов....................................... ....................79

Глава 7. Влияние теплового шока на биосинтез и

компонентный состав антибиотиков................................86

Глава 8. Реакция на тепловой шок в зависимости от

одновременного действия других факторов......................103

8.1. Действие постепенного повышения температуры шока...........103

8.2. Действие экзогенных белков и пептидов.............................113

8.3. Действие ингибиторов транскрипции и трансляции...............116

Обсуждение.............................................................................120

Выводы.................................................................................132

Список литературы..................................................................134

Приложение 1.........................................................................154

Приложение 2.........................................................................174

Введение

Все живые организмы, в том числе прокариоты, находятся в постоянно изменяющихся условиях внешней среды, достаточно сильное и резкое изменение каких-либо факторов действует как шок, вызывая стрессовое состояние организма.

Одним из актуальных вопросов биологии является проблема ответа клетки на стрессовые воздействия и адаптации организмов к резко измененных условиям среды. Организмы в процессе эволюции выработали определенные защитные механизмы, одним из которых является синтез стрессовых белков (в основном белки теплового шока - БТШ). Тепло-индуцибельные гены консервативны в процессе эволюции. Многие организмы, от примитивных прокариотов до высших эукариотов, имеют семейство генов, кодирующих структурно сходные, и участвующие в различных жизненно важных процессах, низкомолекулярные белки -белки теплового шока (БТШ) [Новиков, 1996].

Механизмы стрессовых реакций у бактерий изучали в основном на грамотрицательных организмах, таких как Escherichia coli и Salmonella typhimurium. И только в последние годы начали изучать стрессовые реакции на бактериях рода Streptomyces. Это грамположительные бактерии, жизненный цикл которых включает вегетативную мицелиальную фазу и репродуктивную спорообразующую стадию [Калакуцкий и др., 1977].

Бактерии рода Streptomyces являются важными продуцентами вторичных метаболитов — антибиотиков, пигментов, токсинов, которые используются в промышленности, медицине и т. д. Под влиянием стрессовых действий (например тепловой шок) у Streptomyces могут синтезироваться новые антибиотики [Doull, 1994]. Поэтому изучение стрессовых воздействий на бактерии рода Streptomyces имеет большое практическое значение.

В последнее время интенсивно изучают молекулярную биологию и биохимию синтеза БТШ. Литературы об изменении физиологии микроорганизмов при стрессовых воздействиях очень мало. Однако не меньший интерес представляет не только вопрос о молекулярных механизмах защиты организма от стрессового воздействия, но и что происходит при этом с организмом в целом, как меняется его физиология и морфология. Весьма перспективным может явиться сочетание молекулярно-биологического и физиологического подходов к изучению проблемы защиты организмов от стрессовых воздействий.

Стрептомицеты представляют интересный объект исследования, как продуценты многих антибиотиков, как одни из морфологически наиболее сложноорганизованных бактерий и как организмы, наименее изученные в аспекте шоковых воздействий. В связи с этим целью данной диссертационной работы явилось изучение физиолого-морфологических изменений мицелия стрептомицетов и связи их с образованием таких вторичных метаболитов, как антибиотики, после теплового шока разных стрессовых температур.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1). Определить толерантность разных штаммов стрептомицетов к тепловому шоку.

2). Исследовать особенности изменения развития и морфологии мицелия разных штаммов стрептомицетов после теплового шока разных температур.

3). Изучить количество и состав антибиотиков, синтезируемых стрептомицетами после теплового шока разных температур.

4). Проверить адаптационные способности разных штаммов к тепловому шоку.

5). Исследовать реакции стрептомицетов на тепловой шок при

добавлении различных защитных веществ.

5

6). Исследовать реакции стрептомицетов на тепловой шок при добавлении ингибиторов синтеза белков.

Обзор литературы

Глава 1. Стрептомицеты - грамположительные мицелиальные

эубактерии 1.1. Общая характеристика стрептомицетов

Стрептомицеты - грамположительные мицелиальные эубактерии, ДНК которых имеет высокое содержание ГЦ-оснований (69-78%), отличаются довольно сложной морфологией и определенными физиологическими особенностями [Korn-Wendisch, Kunzner, 1992]. Род Streptomyces насчитывает около 500 видов.

Стрептомицеты чрезвычайно широко распространены в природе и играют далеко не последнюю роль в круговороте веществ на Земле. Среди стрептомицетов мы встречаем возбудителей заболеваний человека, животных и растений, продуцентов многочисленных и весьма важных антибиотиков, подавляющих рост патогенных грибов, бактерий, вирусов и злокачественных опухолей, продуцентов витаминов, веществ, стимулирующих рост и развитие других микроорганизмов. Мы находим среди стрептомицетов штаммы, способные к осуществлению практически ценных и весьма сложных химических реакций [Красильников, 1970; Калакуцкий, Агре, 1977; Калакуцкий, Зенова, 1984].

Тридцать лет назад "Стрептомицеты" (,Streptomycetes) составляли один из самых больших и обширных родов порядка Actinomycetales, и в литературе под словом "актиномицеты" подразумевали стрептомицеты.

Актиномицеты - это группа морфологически разных, грамположительных бактерий, имеющих высокое содержание ГЦ-оснований в ДНК (выше 55%) [Ensign, 1992]. В систематике и разделении на группы актиномицетов широко используются морфологические, физиологические, цитохимические признаки. В последние годы концепция таксономии и естественных отношений между этими бактериями основана на результате анализа сходства последовательностей 16S субъединиц

рРНК. На этом основании актиномицеты были разделены на семь больших групп: actinobacteria, nocardioforms, actinoplanetes, thermomonospora, maduromycetes, streptomycetes, group with multilocar sporangia. В группу streptomycetes входит род Streptomyces с несколькими близкими родами: Intrasporangium, Kineosporia, Sporichthya, Streptoverticillium [Goodfellow, 1989].

По строению клетки и химическому составу ее компонентов стрептомицеты являются одной из своеобразных групп бактерий. Стрептомицеты образуют ветвящиеся клетки, которые развиваются в мицелий, редко распадающийся на фрагменты [Зенова, 1992]. Точки ветвления носят случайный характер, т. е. на любом месте поверхности мицелия может вырастать новая гифа. Диаметр гиф составляет от 0.5 до 2.0 мкм, обычно около 1.0 мкм. Поперечными перегородками, септами, гифы разделены на участки неравной длины [Allan, Prosser, 1983].

В гифе мицелия выявляются все компоненты, свойственные бактериальной клетке: ядерная область, цитоплазма с различной степенью базофилии, вакуоли, волютиновые гранулы, клеточная стенка. В клетке стрептомицетов отсутствует ядерная мембрана, митохондрии и цитоплазматический ретикулум. Ядерный материал (нуклеоид) граничит непосредственно с цитоплазмой и на электронных микрофотографиях представляет собой светлую область, в которой просматривается сеть тонких переплетающихся фибрилл. Нуклеоиды располагаются обычно в центральной части среза гифы и имеют вытянутую, удлиненную или округлую форму. Деление нуклеоидов не сопровождается какими-либо специфическими преобразованиями ядерного материала; оно часто наблюдается в гифе в области формирования поперечных септ [Locci, 1989; Korn-Wendisch, Kunzner, 1992].

Цитоплазматическая мембрана в клетке стрептомицетов - типичная

унитарная мембрана, подстилающая клеточную стенку. Внутриклеточные

выросты мембраны образуют типичные для стрептомицетов

8

образования - мезосомы, имеющие ламеллярную, везикулярную или тубулярную структуру [Терешин, Ефимова, 1981]. Клеточная стенка стрептомицетов состоит в основном из гликопептида (пептидогликана, муреина), тейхоевых кислот и полисахаридов и относится к I типу клеточной стенки среди представителей порядка Actinomycetales, т. е. содержащей диаминопимелиновую кислоту в пептидогликане и глицин в межпептидном мостике. Толщина стенки может значительно варьировать от 100 до 250 Ä и более, в ней иногда выделяют 2-3 слоя различной электронной плотности [Locci, 1989; Korn-Wendisch, Kunzner, 1992].

Цитоплазма включает рибосомальные гранулы приблизительно 12 нм в диаметре, которые бывают собраны в конгломераты разной величины. В зоне нуклеоида располагаются электроннопрозрачные области, называемые вакуолями [Locci, 1989; Korn-Wendisch, Kunzner, 1992]. Циркуляция цитоплазмы не наблюдается.

Стрептомицеты, как и другие актиномицеты, обладают широким диапазоном полиморфизма клеток, особенно в поздней стационарной фазе и фазе отмирания [Куимова, 1984]. Дифференциация мицелия - это изменение и усложнение мицелия в процессе развития культуры стрептомицетов. Дифференциация мицелия стрептомицетов может иметь различные проявления.

Рост, развитие и старение культур стрептомицетов сопровождается структурными изменениями постоянных клеточных компонентов, а в ряде случаев и появлением в вегетативных клетках новых структур. Цитоплазма клеток стрептомицетов с возрастом приобретает неравномерную электронную плотность, становится "пятнистой", в ней не различимы рибосомы. Границы нуклеоида, четко очерчивающие электронносветлую область с частой сеткой нитей ДНК, становится рыхлыми. Внутриплазматические системы клеток стрептомицетов при старении увеличиваются в размерах. Клеточная стенка вегетативных гиф у старых

клеток становится более рыхлой и часто более тонкой, вокруг нее

9

появляется слой микрокапсулы [Зенова, 1992].

На твердых средах дифференциация мицелия проявляется в разделении его на первичный (субстратный) и вторичный (воздушный). Субстратный мицелий врастает в среду и образует часть колонии, поднимающуюся над средой; воздушный мицелий образуется в результате простого ветвления субстратного, причем ветка воздушного мицелия может начать формироваться практически из любой точки поверхности колонии. Считается, что для субстратного мицелия характерным является рост вглубь среды, в то время как для воздушного - рост в воздух. Субстратный и воздушный мицелий различаются по строению их оболочек [Красильников, 1970; Locci, 1989; Зенова, 1992; Korn-Wendisch, Kunzner, 1992]. Стрептомицеты образуют разнообразные пигменты, определяющие цвет субстратного и воздушного мицелия. Могут также синтезировать пигменты, диффундирующие в среду [Зенова, 1997]. Воздушный мицелий обычно несколько (на 0.2 - 0.4 мкм) толще субстратного, в нем есть темный пигмент, связанный с оболочкой. Воздушный мицелий гидрофобен, меньше ветвится, на его поверхности выявляются элементарные структуры в виде палочковидных образований (Д 20 нм) и фибрилл (Д 10 нм) [Зенова, 1992]. Функции обмена веществ со средой несет субстратный мицелий, поскольку такой обмен возможен только в растворе [Красильников, 1970; Калакуцкий, Зенова, 1984].

Способность стрептомицетов к клеточной дифференциации

наиболее ярко проявляется в образовании репродуктивных структур -

спор. На воздушном мицелии, в результате процессов фрагментации или

сегментации, образуются, на определенном этапе развития, неподвижные

артроспоры [Красильников, 1970]. Число спор в цепочках от трех до

нескольких десятков. Поверхность спор бывает гладкая, шиповатая,

бородавчатая, с волосками [Зенова, 1992]. Спороносные ветви мицелия

прямые, волнистые или спиральные. Спороношение отдельных видов рода

может значительно отличаться от приведенного типового описания

[Калакуцкий, Агре, 1977]. На субстратном мицелии представителей рода $&ерктусея истинных спор не образуется.

В жидких средах стрептомицеты могут образовывать другой тип спор - глубинных. Структурные преобразования спорулирующих гиф четко отличаются от таковых у вегетативных клеток и сводятся к утолщению клеточных стенок (более 400 А), уплотнению внутреннего содержимого и формированию множественных септ по длине гифы. Разделение глубинных спор происходит путем растворения внутреннего электронно-плотного слоя, соединяющего стенки двух соседних спор [Куимова, 1984].

По физиологическим свойствам стрептомицеты также представляют своеобразную группу бактерий. Все они аэробные хемоорганогетеротрофы с дыхательным типом метаболизма. В лабораторных условиях способны расти на простых по составу средах, содержащих хотя бы одно органическое соединение. Особенностью этой группы бактерий является образование большого и разнообразного набора экстрацеллюлярных ферментов, способных разлагать различные органические вещества, в том числе и сложные полимеры.

Актиномицеты, как гидролитики, могут разлагать многие трудно разрушающиеся органические вещества: полисахариды (лигнин, целлюлоза, ксилоза, пектин и др.), белки, гумат, ароматические полимеры. Поэтому актиномицеты-симбионты обильно и преимущественно вырастают на поверхности пищеварительного тракта термитов, питающихся почвой, и накапливаются в кишечном тракте дождевых червей [Калакуцкий, Зенова, 1984; Зенова, Звягинцев, 1994; Звягинцев и др., 1996].

Актиномицеты участвуют в циклах углерода, кислорода, азота и

серы прежде всего в качестве деструкторов достаточно сложно

деградируемых молекул органических веществ и их комплексов

[Калакуцкий, Зенова, 1984; Зенова, Звягинцев, 1994; Звягинцев и др.,

11

1996].

Кроме этого стрептомицетам свойственны специфические внутриклеточные ферменты, катализирующие биосинтез большого числа низкомолекуляных органических соединений с высоким биологическим действием. К этим веществам относятся и многочисленные антибиотики, продуцентами которых являются стрептомицеты [Егоров, 1987, 1994].

Имеются две противоположные концепции о биологической роли антибиотиков в природе. Первая исходит из того, что образование антибиотиков следует рассматривать как специфическую особенность обмена веществ орг