Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез антибиотиков макротетролидов и его связь с ролью ктаионов у Streptomyces chrysomallus Subsp. Macrotetrolidi на ранних стадиях роста

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез антибиотиков макротетролидов и его связь с ролью ктаионов у Streptomyces chrysomallus Subsp. Macrotetrolidi на ранних стадиях роста"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 579.873.11.017.6/7:577.182.62

АГБЕНОКО Коджо

БИОСИНТЕЗ АНТИБИОТИКОВ МАКРОТЕТРОЛИДОВ И ЕГО СВЯЗЬ С РОЛЬЮ КАТИОНОВ У БТЛЕРТОМУСЕЗ СНЯУБОМАЬЬиЗ БиВБР. МАСКОТЕТЯОЬт1

НА РАННИХ СТАДИЯХ РОСТА

Специальность 03.00.07. — микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —1992

Работа выполнена в лаборатории антибиотиков кафедры микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научные руководители - доктор биологических наук, профессор Н.С.Егоров - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник А.Н.Свордлова

Официальные оппоненты:- доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация - Институт по изысканию новых

Защита диссертации состоится " 26 " марта 1992 года в 1.1 час 00 мин. на заседании специализированного совета Д 002.64.01 Института микробиологии РАН по адресу: 117811 МОСКВА проспект 60 - летия октября, дом 7, кор. 2.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Автореферат разослан "'18» февраля 1992г. Ученый секретарь

В.К. Плакунов, Институт микробиологии РАН

- кандидат биологических наук, В.А. Миронов, ВНИИА

антибиотиков

специализированного совета .сандидат биологических наук

Никитин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Антибиотики широко применяются в народном хозяйстве: в медицинской практике, животноводстве и растениеводстве. Некоторые антибиотически активные вещества нашли также нетрадиционное использование. К ним относятся соединения, обладающие ионофорными свойствами, такие как ма!сротетролиды, валиномицшш и другие (Овчинников и др. 1974).

Биологическое действие ионофорных соединений основано на способности образовывать гидрофобные комплексные соединения с гидрофильными неорганическими катионам! и переносить последние в различные липофильные среда. При этом ионофорние антибиотики имеют избирательность к определенному катиону. Макротетролиды являются к настоящему времени единственными соединениями, специфичными к ионам аммония.

Макротетролидн, используются в биологии как инструменты исследования при изучении естественных мембран и транспорта неорганических веществ в клетках, а также как сенсоры при изготовлении ионселективных мембранных электродов, применяемых для количественного определения ионов аммония.

На основе макротетролидов лаборатории антибиотиков биологического факультета МГУ, где выполнена настоящая работа, разработан и серийно выпускается на Тбилисском заводе Тбилприбор аммонийселективный электрод.

В связи с этим, изучение биосинтеза макротетролидов и, в частности, физиологии роста продуцента в начальной фазе, ответственной за продуктивность антибиотиков, представляет важную задачу. Это преж^э всего касается характера ферментативной активности, наличия внутриклеточного антибиотика и содержать неорганических катионов в клетках. Для продуцента антибиотиков с

ионофорными свойствами содержание катионов в клетках представляет особый интерес.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение биосинтеза антибиотиков макротетролидов и его связь с ролью катионов у Б.сЪгувотаНиа зиЬар. шсгоге4го7 Ш1 на ранних стадиях роста.

С этой целью для' периодической культуры и "покоящихся" .клеток, а также в зависимости от возраста стрептомицета и состава среды решались следующие экспериментальные задачи:

I.Определение внутриклеточного содержания макротетролидов;

2.Изучение активности специфического поликетидсинтазного (ГГКС) ферментного комплекса, ответственного за образование макротетролидов на конечных этапах биосинтеза.

3.Определение внутриклеточного содержания некоторых неорганических катионов (натрия, калия и кальция).

4.Г!орзичная идентификация наиболее известных транспортных систем натрия, калия и кальция.

Научная_новизна. В результате проведенного исследования показано, что, в течение всего лаг-периода роста в клетках продуцента существуют соединения с ионофорными свойствами -непосредственные биосинтетические продаю ствешшки

антибиотиков макротетролидов - олигомеры нактиновых оксикислот.

В начальной фазе роста стрептомицета наблюдается последовательное накопление в клетках катионов натрия, калия и калтля, которое значительно снижается к концу лаг-периода. Результаты йнгибиторного анализа позволяют предполагать существование в клетках к+/Иа+-АТФазной и Са++~АТФазной систем активного транспорта. Установлено взаимное влияние макротетролидов И неорганических катионов, при этом выяснено, что кальций

связывается с тримером нактиповых кислот.

В этот же период роста наблюдается изменение характера активности специфического ферментного ПКС комплекса в зависимости от содержания кальция в среде культивирования.

Практическая значимость. Получегаше результаты могут быть

полезны при разработке оптимальных условий ферментации продуцента макротетролидных антибиотиков.

Ащэобация_работц • Материалы диссертации доложены на заседаниях кафедры микробиологии биологического факультета МГУ во время обучения в аспирантуре.

Публикация. А.Н. Свердлова, К. Агбеноко, Л.Г. Яглова, Н.С. Егоров.-"Транспорт кальция в клетках Б-сЬтузотаНиа зиЬор. тасгогеггоИсИ - продуцента макротетролидных антибиотиков". Антибиотики и Химиотерапия, 1992, т.1, Ж.

5!ПШ?тура_и_объем_5иссертш_£-1и. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов.

Работа изложена на 147 стр., содержит 28 рисунков и 18 таблиц. Список цитированной литературы включает 123 наименования.

ЭКСПЕРЙШГГАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования

Объектом исследования явился продуцент макротетролидных антибиотиков Streptoa.\jcea сЬгузошЫиз аиЬзр. macrotetrolldt, синтезирующий смесь низших гомологов с преобладанием нонактина (Свердлова и др., 1976). Культивирование штамма проводили в колбах на качалке при 2ьэС на средах, содержащих овсяную муку (или крахмал), глицерин и минеральные соли.

Количественное определение макротетролидов проводили с

помощью модифицированного спектрофотометрического метода ( Suzuki ■st al., 1971) с использованием вместо щелочного хлористого натрия хлористого аммония.

Активность специфического ферментного комплекса, участвующего в биосинтезе макротетролидов, определяли по изменению количества антибиотиков в стандартном растворе под действием бесилеточного гомогената в инкубационной среде состава: 10мМ трис-нса (рН ~ 7,8-8,0,), 10% этанола, 10мМ NH4<31 и 1мМ СоС12.

Болок определяли по методу Петерсена (Petersen, 1977).

Содержание катионов в клетках определяли радиоиндикаторным методом с использованием изотопов 22на, 45Са и 86Rb (для калия).

Включение 214С-ацетата в молекулы макротетролидов и олигоморов нактиновых дсислот проводили инкубированием промытых клеток в трис-liCl буфере, с мече{шм ацетатом в течение пяти минут. После экстрагирования ацетоном получали аликвоты для проведения хроматографии на бумаге (2Б, Filtmk FN-2) последовательно в трех системах растворителей: вода, вода-ацетон (1:1) и вода-ацетон (1:9) с целью разделения олигомеров иактиношх кислот и макротетролидов. Пятна, соответствующие этим соединениям подвергали радиоактивному счету.

Результаты и обсуждение

I. Физиолого-биохимические особенности штамма

Рост S. chryaomalliLD зиЬэр. macrotetroj. idl изучали при глубинном культивировании на двух синтетических Средах, одна из которых в качестве источника углерода содержит только крахмал, а другая крахмал и глицерин (.42), и на сложной среде неопределенного

О:

«ч- Г ^ «3

/=о

%

Й1 «2 »4 ■

Нонактин СНд СНд СНд СНд

Монактин СНз СНд СНд С2%

Динактин СНз С2% СНд С2}!5

Гринактин СНз С2% С2Н5 °2Н5

Тетранактин С2% С2 % С2!% С2%

Вещество 0 СНд С2НБ СНд СН(СНд)2

П СНд СгЧ СН(СНд)2 С2%

0 СНд 0^2 () 2 СНд (СНд )2

ея,

Нонактиновая кислота

й » ОТд

Я

>?Р

си3

.соои

Гомононакткиовая кислота

н = с2%

Бисгомононактиповая кислота Н = СН(СНз)2

Рис Л. Антибиотики макротетролид^ и их биосинтетические предшественники нактиновые кислоты.

состава с овсяной мукой (#1).

Специфический макротетролидсинтазний ферментный комплекс был выделен только из изучаемого штамма. Очищенный в 176 раз но сравнению с клеточным гомогенатом этот ПКС комплекс in vitro в определенных условиях способен проявлять как синтазную (остеразную), так и гидролазную активность (Нефедова и др., 1989). Поэтому в наших экспериментах определение характера работы ПКС комплекса проводили с использованием раствора, содержащего субстраты для проявления и той, и другой активности.

При культивировании стрептомицета на синтетической среде, содержащей крахмал и минеральные соли (табл.1), только в культуре 48-ми часового возраста наблюдается появление синтазной активности форматного комплекса и резкое увеличение количества антибиотика.

Масс-слектрометрический анализ антибиотиков, выделенных из посевного материала, показал наличие массовых чисел с м/z 185, 369 и 553, которые могут принадлежать биосинтетическим предшественником мокротетролидов, соответственно мономеру, дамеру и тример;/ нактиновых кислот, в также массового числа с м/а 736, характерного для тетрамера или циклической молекулы макротетролидов. По маре увеличения возраста культуры в продуктах оиосинтзза наблюдается постепенный рост интенсивности массовых пиков о m/z 653 и 736.

Культура стрептомицета 48-ми часового возраста, обладающая эстеразной (синтазной) активностью специфического ПКС ферментного комплекса, в дальнейшем исследованиях была использована нами в качестве посевного материала.

При использовании сложной среды JH (рис.2) на протяжении всего лаг-периода и дальнейшего роста стрептомицета обнаружена эстераз1ия активность специфического ПКС ферментного комплекса и

увеличение внутриклеточного антибиотика.

Таблица I

Характеристика роста Б.сЬгузотНиз зиЬзр. тсго1егго\Ш1 на среде с крахмалом и минеральными солями.

Возраст, Белок, Анти- Ферментативная Выделенные

час мг/мл биотик, активность, макротетролида,

нМ/мг гидро- эсте- массовые интенсив-

белка лазная разная числа, ность,

нМ/мг белка М/й усл.ед.

29 0,067 133,6 136,0 « *

185 6.1

369 7,4

32 0,100 186,0 18,6 553 4,2

736 1.8

185 6,3

369 7,4

42 0,103 203,9 20,6 553 7,4

736 2,1

185 7,1

369 7,4

48 0,120 395,7 19,4 553 7.4

736 6,8

*

означает, что определение не проводилось.

Инокуляция посевного материала в синтетическую среду вызывает изменение характера ферментативной активности ПКС комплекса в клеточном гомогенате стрентомицета. Б двух ранних исследуемых точках наблюдается гидролизная, в 6-ти и 12-ти часовой

Время культивирования, часы Рис.2. Динамика роста Б.сЬгузотаНиз зиЬзр. ялсп^е! гоНсЦ на сложной среда £1.

1 ~ белок, мг/мл к.к.

2 - макротатролиды, нМ/мг белка 2'- макротатролиды, мг/мл к.ж.

3 - ферментативная активность, нМ/мг белка.

культуре - синтазная активность, уровень которой затем падает.

В точение лаг-периода роста культурц, несмотря на разный

характер и уровень ферментативной активности, количество внутриклеточного антибиотика для обеих исследованных сред сохраняется практически постоянным (порядка 20-40нМ/мг белка).

Препараты, выделенные из мицелия стрептомицета разного возраста в лаг-периоде, выращенного на сложной среде, такие

Таблица 2

Масс-спектрометрический анализ продуктов биосинтеза, Я.

сЬгузотаНиа аиЬэр. тасго1е1го11й1, выращенного на обогащенной среде

ВозрастМассовыеинтенсив-Белок,Антибиотик, культуры, числа, ности, мг/мл, мкМ/мг часы, м/ „„„ оп белка

шифр

(образца)

усл. ед.

Ферментативная

активность,

нМ/мг белка

гидро- эсте-лазная разная

185 - - 3,9

3 369 - - 4,8 0,589 22,41 0,065

(6-К) 553 ■ - 1.3

736 - - 0,0

185 - - 7Д

6 ЗбЭ - 7,5* 0,425 49,81 0,194

(2-К) 553 ■ - 2,7

736 - - 2,3

185 - - 6,6

12 369 - - 1.0 0,425 33,30 0,056

(41-К) 553 • - 2,7

736 - - 0,6

165 • 2,0

18 369 .- - 6,2 0,334 41,12 0.40

(Ю-К) 553 - - 1.3

736 - - 0,0

185 - - 2,7

24 369 - - 3,7

(8-К) 553 - - 1.1 0,442 19,12 0,49

736 - - 0,0

*1 - значение 7,5 соответствует 100%-ной интенсивности.

подвергали идентификации с помощью масс-спектромвтрш.

Как видно из табл.2, в клетках стрептомицета молодой культуры обнаруживаются фрагменты с молекулярными массаж, характерными для веществ макротетролидной природы, принадлежащими лшюйшм олигомерам нонактиновой кислоты. Практически отсутствуют ■Фрагменты с м/г 736, которые можно идентифицировать и как линейный тетрамвр, и как циклическую молекулу нонактина.

Следует обратить Енимание на то, что используемый сшктрофотометричвский метод, описанный для количественного опроделэния макротетролидов (Suzuki at al.,I97I), оказался пригоден и для обнаружения линейных олигомеров нактиноьах кислот.

Встает вопрос, обладают ли ионофорными свойствами, т.е способностью переносить неорганические катионы в гидрофобные среды найденные на ранней стадии роста стрептомицета линейные олигомеры нактиновых кислот? Мокроте тролиды образуют с катионами положительно заряженные комплексы, которые могут присоединять хромофорный анион, на чем основан упомянутый в» метод определо'лия этих соединений. Получещшй тройной комплекс является гидрофобным. Появление окрашенного соединения в гидрофобном растворителе (например в хлороформе) при встряхивании с водной фазой означает наличие в нем неорганического катиона, и, следовательно, ионофорных свойств его переносчика. Данные табл.3 показывают, что водными растворами этилового спирта из клеток стрептомицета экстрагируются вещества с ионофорными свойствами.

Из таблицы 4 видно, что экстрагируемые вещества принадлежат к соединениям макротетролидной природа. Количество более гидрофобных продуктов накапливается в метке с увеличением возраста культуры (данные приведены в диссертации).

Предварительная обработка клеток ионами аммония обогащает

Таблица 3

Наличие пикратных комплексов продуктов биосинтеза стрептомицета в хлороформе при экстрагировании 12-ти часовой культуры водным этанолом в присутствии хлористых солей неорганических катионов Добавки к Оптическая плотность, к = 377нм

экстрагенту Содержание спирта в экстрагенте, %

0 10 25 45 70 90

0 0,38 0,11 0,255 0,245 0х475_. ___0Д417

Са2+ 0,08 0,067 0,11 0г305_ ___0,575

К+ 0,048 0,070 0,125 __0А375_ ___0г575

0,048 0,068 0,095 0*397_ __0Х292_ ___0^465

КН + 0,048 0,10 0,202 0,380 0,430 0,560

экстракт более гидрофобными тримером и тетрамэром нонактиновоЛ кислоты, натрия - способствует обеднению экстракта соединениями нактиновой природы. А при обработке клеток ионами кальция самым гасшим извлекаемым олигомером из мицелия 18-ти часового возраста является тример нонактиновой кислоты. Но текого влияния кальция не наблюдается для культуры другого возраста.

Нактиновые кислоты обладают антибиотической активностью. Образец 6-К, (табл.2) подавляет, рост ВасШиз тусо1 сЗеэ при концентрации 2,5мкг/мл, а образец 49-К (табл.4) - 5мкг/мл.

2. Внутриклеточное содержание неорганических катионов

При исследовании особенностей продуцента ионофорных антибиотиков, оснс- шм свойством которых является образование комплексных соединений с неорганическими катионами, важно проследить взаимосвязь между внутриклеточным содержанием катионов,

и ионофоршми антибиотиками макротетролидами. Были выбраны катионы К\ На+ и Са+, к которым соответственно макротетролиды проявляют высокую и низкую специфичность.

Таблица 4

ч

Масс-спектрометрический анализ препаратов, выделенных из мицелия Б.сЬгуэотаИиэ виЬэр. тпасгогеггоИсИ 7016-ым этанолом

"Добавки к экстраганту, (образец)

Массовые числа, м7ъ й относительная интенсивность, усл.ед.

6 часов

18 часов

48 чесов

О

(36-К)

185 369 553 736

3,1 1.6 0,0 0,0

185 369 553 736

1.7

2,6 3,3 3,2

185 369 553 736

3,9 4,1 1.8 2,1

Са2+ (37-К)

ш4

(39-К)

185 369 553 736

3.3

1.4 0,0 0,0

185 369 553 736

I.I 1,0 1,0 0,0

185 369 553 736 185 369 553 736

2,8 2,6 I.I

0,0

2,6

4.4

2.5 3,3

185 369 553 736

4.0

4,0 2,8 2,4

185 369 553 736

2,7 5,6 3,2 3,6

Na (49-К)

185

369 553

1.9

0,7 0,0

<"-> но определяли

Внутриклеточное содержание катионов изучали в растущом мицелии, и "покоящихся" клетках (Demain et al.,1978). В первом

случав речь идет о накоплении катионов в процессе развития организма, во втором - о способности клеток определенного возраста включать катионы из окружающей среды.

Определение содержания катионов проводили радиоиндикаторным методом с использованием изотопов 86т>, 22№ и 45Са.

Предварительно с помощью синтезированных нами меченых 14С-макротетролидов была показана способность изучаемого стрептомицета поглощать дополнительные количества этого антибиотика из внешней среды (данные приведены в диссертации).

2.1. Внутриклеточное содержание натрия и калия

При выращивании стрептомицета на обогащенной среде (рис.3) натрий активно включается в клетки с момента инокуляции, но в дальнейшем происходит плавное вымывание его в окружающую среду. При использовании синтетической среды в культуре 3-х часового возраста можно наблюдать максимум накопления натрия.

Наличие максимумов накопления калия наблюдается при росте изучаемого стрептомицета на обеих средах, но в разном возрасте культуры (рис.3).

Макротетролиды вызывают (табл.6) небольшое увеличение внутриклеточного содержания натрия в 6-ти и 12-ти часовой культуре. Несколько больший эффект заметен для 24-х часового мицелия, в период минимального накопления клетками натрия. В случае калия действие макротетролчдов направлено на уменьшение его внутриклеточного содержания и в большей мере проявляется во время активного накопления этого катиона ¡меткой.

Какие же транспортные системы участвуют в накоплении катионов у изучаемого стрептомицета? Для Б.сПгуаотаНиа аиЬэр.

Время культивирования, часы Рис.З. Динамика накопления калия (I) и натрия (2) клетками Б.с1\гуаош11иа виЬзр. тасгсНеШИ(11. А - На синтетической среде *2 В - На сложной среде #1.

macrotetroltdl с использованием метода ингибиторного анализа была проведена первичная идентификация транспортных систем натрия и калия. К настоящему времени для микроорганизмов, как и для раститолышх и животных клеток показано наличие Na+-, К+-активируемых АТФ-азных транспортных систем этих катионов (Epstein,1985, Serrano et al.,1986, Solioz et al.,1987, Hafer et al.,1989).

К+/На+-АТФазная система осуществляет ввод двух ионов к+ в клетку за счет еыводэ трех ионов Na+ из клетки. Неблагоприятным условием работы этой системы является отсутствий хотя бы одного из этих катионов во внешней среде, специфическими ингибиторами -уобаин и ванадат (NaVOg).

Для изучаемого стрептомицета было показано повышение содержания внутриклеточного натрия, (что означает подавление работы К+/ла+-АТФазной системы), при концентрации уабаина 6,6 ЛО~4М. Ингибирущий эффект был заметен и в случав ванадвта. Действие уабаина при включении калия "покоящимися" клетками наблюдается только для 12-ти часовой культуры

Другой распространенной системой транспорта одновалентных ионов является фуросемид-чузствительный симпорт (одновременный

Таблица 5

Влияние фуросемида на включение калия "покоящимися" клетками S.chryeamallus зиЬзр. macrotetrolldi Возраст клеток, содержание калия в клетках, мкМ/мг белка

часы контроль фуросемвд

1/3 0,800 1,180

3 1,090 0,980

6 0,400_0,098

I& 21,650 21,500

ввод в клетку ) натрия, калия и хлора (ВегпЬагШ! ег а1.,1988). Для изучаемого стрептомицета действие фуросемида на включение калия обнаруживается лишь для 6-ти часовой культуры (табл.Б).

В опытах с "покоящимися" клетками изучали действие макротетролидов на включение натрия и калия стрзптомицетом разного

Таблица 6

Действие макротетролидов на содержание ионов натрия и калия (в мкМ/мг белка) в "покоящихся" клетках Б.сЬгцзотаНиа виЬзр. тасго1еХго11<И \

на фоне действия уабаина и фуросемида.

Возраст Опреде- кон- макро- уабаин уабаин фуро- фуро-

лив ток. ляемый троль тетро- + макро- семид семид

часы катион лида тетролида + макротетролида

6 Na+ 60,00 68,00

К+ 1,50 0,75 1,50 1,50 0,09 0,30

12 Na+ Б2.00 67,80 2,40 0,60

К+ 2,80 1,50 1,10 0,90

18 Na+ 66,00 65,00

К+ 1,30 1,00 1,70 1,50 21,12 18,78

24 Ка+ 53,00 88,00

К+ 0,60 0,55 1,40 0,80

При различном содержании калия в среде культивирования (12-ти часовая культура)

Добавки катион среда Ш, 10мМ KCl среда *4, 1мМ KCl

Контроль К+ 18,0 3,0

Макротетролида К+ 30,0 1,5

возраста в условиях блокирования возможно существующих К+/На+-АТФазно'й и фуросемид-зависимой транспортных систем (табл.6) специфическими ингибиторами и путем лимитирования калия в среде.

Макротетролиды неоднозначно действуют на содержание в клетках одновалентных катионов при различном содержании калия в среде культивирования (табл.6).

В присутствии уабаина макротетролиды практически не влияют на включение калия, клеткой того возраста, когда К+/На+-АТФазная система транспорта может работать активно. Наибольшее уменьшение включения калия в клетки наблюдается в 24-х часовой культуре.

Макротетролиды снимают действие уабаина на вывод 'натрия из клетки для 12-ти часовой культуры в условиях вероятного Функционирования К+/г/а+-АТФазной системы. Макротетролиды снимают действие и другого ингибитора включения калия - фуросемида, проявляющего заметный эффект на 6-ти часовой культуре (табл. 5).

2.2. Содержание кальция в клетках

При выращивании стрептомицета на двух средах с одинаковым содержанием кальция: - натуральной неопределенного состава и

Таблица 7

Действие специфических ингибиторов на включение кальция "покоящимися" клетками 5.сЬтузотаНиз зиЬзр. macrotetrol 1<И

Возраст клеток. содержат? в кальция в клетках, нМ/мг белка

часы контроль ванадат кверцетин лантан

6 11,0 7,5 5,3 4,0

13 7,0 6,0 4,0 3,0

10

«о 8

хи с

%

ф

5*

18 21,

Время культивирования, часы

¡-а

Рис.4. Л - Динамика накопления кальция.

. Б - Влияние внесенных в среду макротетролидов (7мМ/Ю0мл среди) на накопление кальция периодической культурой В.сЬгузотаНиа зиЬзр. тос^еггоХШ.

1 - Контрольный вариант (суспензия клеток + ацетон)

2 - Контроль + макротетролиды.

синтетической максимум накопления кальция наблюдается в мицелии 18-ти часового возраста (рис. 4А).

Уменьшение включения кальция в клетки (табл. 7) в присутствии трехвалентного лантана (Lacig), кверцетина и ванадата (KaVOg).специфических ингибиторов наиболее известной Са-АТФазной система, осуществляющей активный перенос кальция не только в животные, но и в клетки Е. coli (Evana, 1970), свидетельствует в пользу существования таковой и у изучаемого стрептомицета,

Макротетролиды (рис.4Б) вызывают неоднозначное действие: для G-ти и 12-ти часовой культуры они снижают содержание кальция в клетках, напротив, для 18-ти и 24-х часовой культуры, увеличивают (наиболее интенсивная работа Са2+-АТФазной системы проявляется в 18-ти часовой культуре).

2.3. Влияние кальция на жизнедеятельность стрептомицета

Материалы, предстазленные в предыдущих разделах, позволяют сделать предположение об активном взаимодействии в клетках продуцента ионофорных соединений нактиновой природы и неорганических катионов. Более детально влияние катионов на физиологическое состояние продуцента макротетролидов было изучено нами на примере кальция с использованием трех сложных (Мб, 7, 8) и трех синтетических (JWSII, 12, 13) сред, различающихся только содержащем кальция.

Увеличение содержания кальция в среде, не влияя на накопление общего белка (рис.5а) приводит к уменьшению макротетролидов в клетках для культуры 48-ми часового возраста (рис.5б). Это коррелирует с характером активности специфического ферментного комплекса при синтезе макротетролидов. Синтазная активность

1,0.

0:5-30

д 1 ' . «

\ уУ*

1В щ

Время культивирования, часы

Рис.5. - Влияние кальция на рост Б.&и-узотаНиа виЪе жю^е^о11й1, выросшего на «игетичесшвс срзд Ш1(0,1мМ СаС12), *12(5мМ СаС12), И #13(7мМ СаС12).

Рис.6. Включение 14с-ацетата в молоку-ы макротетролидов (I) и их Сиосинтетических предшествешшков нактиновых кислот (2) на синтетических средах #П(0,1мМ СаС12), *12(БмМ Са012) и НЗ(7мМ Са01?).

проявляется лишь у клеток 6-ти часового возраста (рис.бв) В культуре 18-ти и 24-х часового возраста присутствие кальция в среде вызывает появление гидролазной активности и уменьшение внутриклеточного антибиотика.

В этих же условиях изучали образование антибиотика de novo с помощью включения меченого 14С-ацетата в молекулы макротетролидов и его непосредственных биосинтетических предшественников линейных олигомеров нактиновых кислот. 1

Наличие гидролазной активности для мицелия ¡раннего ¿озраста коррелирует с уменьшением количества меченого ацетата в молекулах кок антибиотика, так и нактиновых кислот в 6-ти часовой культуре. По-видимому, в этом возрасте гидролиз антибиотика необходим для вывода кальция из клеток с помощью олигомеров нактиновых кислот.

С возрастанием содержания кальция в среде культивирования уменьшение включения 14С-ацэтата проявляется и у мицелия 12-ти часового возраста. Дальнейшее рост культуры характеризуется возрастанием общего количества антибиотика и синтезом антибиотика do novo, (увеличением включения 14С-ацетата). Максимальное значение для этих двух величин наблюдается для 12-ти или 18-ти часового мицелия.Однако, ото происходит на фоне возрастания гидролазной активности ферментного комплекса.

Обсувдение результатов

Суммируя полученные экспериментальные данные, .можно представить вероятную цепь событий при росте изучаемого продуцента ионофорных антибиотиков макротетролидов. В течение лат" периода в клетках стрептомицета обнаруживаются вещества нактиновой природа -олигомеры нактиновых кислот - ближайшие биосинтетические

предав ствешшки антибиотиков макротетролидов. Эти соединения обладают ионофорными свойствами и антибиотической активностью.

Несмотря на разный характер активности (синтазный или гидролазный) специфического ферментного комплекса количество олигомеров нактиновых кислот в клетках стрептомицета остается практически постоянном в течение всей начальной фазы роста. По-видимому, олигомеры нактиновых кислот могут образовываться как при синтезе макротетролидов, так и при гидролизе этих антибиотиков. Последнее, пвпример, имеет место в культуре 6-ти часового возраста при росте на синтетической среде.

В клетках 20-ти минутного эозраста обнаруживается 'наибольшее количество натрия, который, возможно, попадает туда диффузионным способом, так как по результатам кнгибиторного анализа наиболее распространенная - фуросемидзавпсимая система активного транспорта натрия в это время еще не работает. Избыток натрия может выводиться совместно с низшими олигомерами нактиновых кислот.

В 6-ти часовой культуре молено предполагать существование фуросемидзависимой системы активного симпортa Na+, К+, CL~, а также К+/Иа+-АТФазной системы транспорта натрия и калия. В результате - на фоне исчезающего натрия в клетки поступает калий.

Максимум нвкоплешм калия наступает в 12-ти часовой культуре, когда работа предполагаемой к+/На+-АТФ83ной системы транспорта, вводящей в клетки калий, может быть наиболее интенсивна. В это вромя наблюдается образование антибиотика de novo.

В 18-ти часовой культуре возможно активное функционирование Са+*-АТФазной системы, наблюдается максимальное накопление этого катиона и продолжение синтеза антибиотика de novo.

В клетках стрептомицета существует активное взаимодействие между олигомерами нактиновых кислот и неорганическими катионами.

Олигомеры нактиновых кислот регулируют ионный состав клеток, снижая или повышая внутриклеточное содержание неорганических катионов. Неорганические катионы имеют избирательное сродство к олигомерам нактиновых кислот. Натрий разлагает высшие олигомеры до мономера, нактиновой кислоты, кальций связывается с тримером. Избыточное количество катийов может обеднять клетку олигомерами нактиновых кислот и вызывать серию ответных реакций. Так, увеличение содержания кальция в среде ' культивирования, приводит к сдвигу равновесного состояния в системе нактиновых соединений - к появлению гидролазной активности специфического ферментного комплекса и разложению макротетролидов. Это, в свою очередь, может кратковременно стимулировать образование антибитика de novo. Однако, конечным итогом является потеря синтазной активности специфического ферментного комплекса и уменьшение количества внутриклеточного антибиотика.

Нахождение в мицелии стрептомицета всех олкгомэров нактиновых кислот от мономэра до тетрамера позволяет предположить, что образование конечного продукта - циклической молекулы макротетролидов может происходить несколькими способами:

- циклотетрамеризацией мономеров (Aehworth et al., 1989);'

- циклизацией двух молекул дамера, образованного из энантиомерных форм нактиновых оксикислот;

- последовательной конденсацией нактиновых кислот с образованием дамера, тримера и тотрамера, циклизуклцегося в макротетролид.

Конкретный катиошшй состав клетки может предпочтительно обеспечивать один из этих путей образования макротетролидов. Возможно, наименее вероятной является сборка молекулы макротетролида через пространственно затруднешшй тример. Последний скорее появляется в клетках в результате гидролиза

антибиотика, который может стимулироваться, например, избытком кальция.

Выводы

Изучение продуцента ионофорных антибиотиков макротетролидов S. chryoomallu3 зиЬзр. macrotetrolidl в начальной фазе роста показало:

1. В течение всего лаг-периода в клетках изучаемого стрептомицета присутствуют в основном ближайшие биосинтетические предшественники макротетролидов - олигомеры нактиновых кислот, обладающие ионофорными свойствами и антибиотической активностью;

2. Накопление в клетках катионов натрия, калия 'и кальция происходит в начальной фазе роста стрептомицета. Этот процесс возможно осуществляется фуросемидзависимой системой импорта Ыа+, К+ и Cif, а также K+/Na+- и Са++-АТФазными системами активного транспорта натрия, калия и кальция соответственно.

3. Олигомеры нактиновых кислот регулируют ионный состав клеток стрептомицета, снижая или повышая внутриклеточное содержание неорганических катионов.

4. Избыточное количество катионов обедняет клетку олигомерами нактиновых кислот, так повышение концентрации кйльция в среде культивирования вызывает образование антибиотика de novo на фоне появления гидролазной активности специфического ферментного комплекса; при этом общее количество внутриклеточного антибиотика уменьшается.

По материалам диссертации опубликована работа: А.Н.Свердлова, К.Агбеноко, Л.Г.Яглова, Н.С.Егоров -"Транспорт кальция в клетках S .сЬгузотаПиз зиЬзр. macrotetrolldi - продуцента макротетролидных антибиотиков", Антибиотики и химиотерапия. 1992, т.1.