Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БЕЛКИ-ИНГИБИТОРЫ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ ИЗ ФАСОЛИ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "БЕЛКИ-ИНГИБИТОРЫ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ ИЗ ФАСОЛИ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА. ИНСТИТУТ ШОИШ июне А.Н. Ш

. л На правах рукописи

ФЕЕУЕКША Наталья Вдадишровва

ВЕЛКИ-ШШШТОШ СЕГИНОШХ ПРОТЕИНАЗ - ' ИЗ ФАСОЛИ

03.00*04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биолошческкг наук

МОСКВА - 197Э

выполнена в ла<2ораторк£ белт и нуклеиновых кислот ордеиа денина Института бкохидаи юг, Л.Н.Бахз AJI СССР

Научный руководитель: доктор биологических иаук В.В.Мосолов

Офздаальные оппоненты: доктор биологических наук, дрофессор

А.М. Безборода в кандидат химических наук О.Г.ОГлоблина

Ведущее предприятие: Институт питания АМН СССР

Задала диссертации состоится 9¿U- fc f ISÜO г. в "/^гг." час. на заседании специалиэароБ^шого созета (К 002.93.01) по црасуедекик ученой степени кандздата наук в Пясгзтуте Стхяш км. А.Н.Баха АН СССР (II707X, Москва Ь-71, Ленинский проспект, 33, корп.2).

С диссертацией кожно ознакомиться в библиотеке «Экологической литература АН СССР (Ленинский пр.,33, гсорп.1),

Лморефарат разослан "•// " IS8G г.

(/

Учений секретарь специализированного совета

кандидат йхолоткчесшх наук М.И. Молчанов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблеэд. Настоящая работа посвящена изучению природных белковых ингибиторов трипсина и хшо-тршсана из Засола.

БолшоЗ интерес, которий проявляют исследователи в последние года к белкам-ингибиторам протеолитеческих ферментов, связан» в первую очередь, с той вааноЗ регуляторной ролью, которую протеолитическве ферменты играют в обмене веществ. Один из путей регуляции активности протеолитичес-кнх ^етаевтов in viva связан с существованием в растительных п животных тканях особых белков» способных специфически кнгибировать активность ферментов за счет образования устойчивых в физиологических условиях комплексов белка-ингибитора с ферментом. Комплексы лизгены как каталитической, так и ингибиторной активности. В связи с этик исследование взадглодействзи ингибиторов с ферлентама предоставляет такае шарокие шзиохкоств даш изучения обвдх механизмов внсокоспецгфкчных белок-белковых взашяодеЬзтвай.

Сравнительные исследования белков-ингибиторов, выделен шгх из объектов различного происхождения,открывает перспек-тзшшй дуть изучения эвалмдан структура и белковых

шлекул. Изучение взаимодействия белков-ингабаторов с про-теазаыл микроорганизмов, вызывающих различнее заболевания у растений, открывает новые перспективы в изучении механизмов взаимодействия растешш-хозяиш и паразита на молекулярном уровне, Ьелгл-шгга бит ори некоторых ферментов находят шрокое применение в кедацине в качестве терапевтических средств при леченеи ряда заболеваний. В связи с применением метода биоспецкфической хроматография для выделения и очистка протеиназ природные бедкоша ингибиторы протеоли-тгческах аерыентов приобрела важное практическое значение.

Цель та Дот». Целю настоящей работы явилось Еццеленке природных белковых лнпгбаторов протеиназ ез сеиян фасоли 0йшш0ёсш10й (1Ъаоео1ии vulgar i a L. J , изучение ИХ химического состава и свойств,физиологических фушдай, а также исследование возможности их применения дам шдеяекия и очистки сершовш: протеиназ методом аффднвоД хроматографии,

Иатчяая новизна работы. В результате проведенной работы из семян фасоли выделен новый, ранее не описанный в литературе, высокоактивный ингибитор трипсина и хтаотр:шсияа. Изучены его химический состав, взаимодействие с йерментамп, некоторые ¿азяко-хпкичесдие и биологические свойства. Показано, что днгпбктор представлен несноднагмз молеггуляршсгг формами,- Два изокнгибитораг выделены в високоотаценном состоянии ж охарактеризована Пагучены данные, позваяяжре сделать вывод о насичиа в иолежулах ингабиторов из фасолз двух реактивных центров связывания, едки из которых ответствен за связывание трипсина и другой - химотрипепна. Установлено,что в состав трапешевязыкшцего центра входит остаток лизива. Показана способность .ингибиторов протеаз, вццелешшх из шс-ш растений, подавать активности зкетранеллаяярных ферментов некоторых грибов - возбудителай заболеваний культурных растений» 11а этом основании высказано предположение о тоы, что б елки-иигябзторы принимают участие в обцем механизме защиты растения от поражения патогенными ьшфооршкизцами, Методом в^4инно2 хроматографии на кшобнлизозанпа?,; ингибиторе из фасоли кз суъсларкого препарата протеаз ^гер^туйее егХиеиа выделена в высоксочшцеинои состоянии трипсиноио-добкая иротеиназа.

Пиитическое значение ^работы. Иммобилизованный ингибитор из Засоли кожет бить широко использован в качестве био-специ^ического сорбента деш выделения и очистке сериновых протеаз кетодец а££гашой хроматограф ли.

Дашше, полученные при изучении взаимодействия белков-ингибкторов из растеккй с протеасамп патогенных кинроорга-низмов, вызывакцих различите заболевания у растений, когут бить использованы при шведетш новых сортов растений, устойчива к пора&ешеа кахро орпанизжши,

Апробзготя тботц. Результаты исследования доложены на I Всесоюзном сишгазнуме по хюша протеолитическад ферментов (Вшшшс, 1973), на 1-ом и 2-см Есессвзншс симпозиумах со Езкобиогзованкыи ферментам (Таллин, 1974; Абовян, 1977), на научных конференциях Института биоэзегии нм.Баяа Ш СССР.

Публикация. Но материалам дассертацги опубликовано 12 работ. .

Обгем таботн. Диссертационная работа с ос тост ез введения, обзора литературы, описания материалов а методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( г is ссылок). Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, включает 21 таблицу и 28 рисунков,

г ЭКСПЕР1ЕЯЖАЛЫ1АЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования

В работе применят трипсин фиргы "Spofa" , перекристал- ,> лпэовашшЗ из сульфата кагния, ß -трипсин получали по методу, используюцецу его более высокую термостабильность по Сравнению С oi -трипсином ( Beardslee, Zahnley , 1973), oi-химотрипсиц производства ОлаЯнского завода химических реактивов подвергали дополнительной очистке путем хроматографии на КМ-сефодексе 6-50 ( Kakagawa, Bender, 1970), S -хикогрЕП-сии получали активацией химотрипсиногена трипсином и очищали методом аффинной хроматографии ыа колонке с иммобилизовашшм белковым ингибитором. В ячестве источника протеаз микроорганизма Str.griseus использовали продаЕный препарат "Прояа-за" ( "Kaken" Япония), пепсин - препарат, получешпй кристаллизацией из старта, карбокешептпдазы А и В фирмы " WortHincton" , субтплизин ешь препарат фирки "Наказе" . Культура фнтопатогешшх грибов била получена в лаборатории микологии Всесоюзного института защити растений (г.Ленингрзд), Зстеразную активность протеолптических ферментов определяла потепцискетричесюпд методом (Schwert et al. 1948) или капельным колорпглотрическигл методом (Rhodes et al.,I957). В качество субстратов использовали: для ферментов с гркп-синоподоОпой специфичностью — этиловый эфир li oi —Бензоил— Ь -аргинина ( Bz-Arg-OEt ) и метиловый эфир Kot -Бензоил- 1 -аргзшша ( BZ-Arc-oi23t ), дал ферментов с хшотрипти-ческой специфичности) - этиловиЗ эфири -Ацетил- l -тирозина ( Ao-Tyr-ost ). Ашдазную активность ферментов определяли используя в качестве субстрата Kot -Бензоил-х>ь-аргинин п-нитроанилдд ( Вг-Arg-pKü ). Протеолитическую активность ферментов определяли спектрофотоыетрэтескаы методой о казе-

ином в качестве субстрата (Нортроп и др. 1950). Изоэлектри-ческое фокусирование белков проводили на колонке фирмы lkb (Швеция) типа 8100-Х в широком (3-10) и узком (4-6) интервале рН в течение 46-74 часов при 2°С. Концентрация амфоли-ноз составляла 1,1 %. В качестве стабилизирующей среды использовала градиент сахарозы от 0 до 40 %. Электрофоре ткч ес-кое ксследоЕакзе белков проводили в столбиках полиакрилаыцд-ного геля (ПАГ). Для полученкя иммобилизованного трипсина и хииотрппсида активацию носителя - сефарозы 4В проводалп брокцааногл при p!I II. Кьиобилизованный ингибитор из фасоли получали присоединяя белок к производному се^арозы со свободной алдшной группой (АН- Sepharose ) в присутствии водорастворимого карбодикмэда в соответствия с инструкцией Fai— jnacia Pine Chenicais . Аминокислотный состав белков определяли после гидролиза в 6 H. HCI в вакууме при 110° в течение 24 и 48 часов на амдаюхпсло тном анализаторе Eu г rua -500 иле к1а -3. Содерзанге цпстина с шзтпонина определяли после окисления белка над^уравыщой кислотой. Триптофан определяли спектрофотометрмч'еским методом, а такае по методу Симп-сона ( Sinpoon ot al., 1976). Определение SH -групп в белке проводили с реактивом Эллтна. Дксуль$1шше связи в . белке восстанавливали £>-кзркаптоэтаполом ( Anf insten, Haber, I9SI). Определение ЕН2 -копцешис а1л:цокпслот проводили с дансилхлорадса ( Cray, Hartley, 1963). Определение КН2 -концевой последовательности аглшоклслот в белке проводила по коди&стровашюыу методу Эдкана (Виноградова а др., 1973). Определение содеркян^п углеводов проводили спектро^отокет-ркчески с реактгзои ^енол-серная зелота. Определение С ООН-концевых аминокислотных остатков белка, предварительно окисленного надцуравышой кислотой, проводили с помощью обработка карболсЕпентидаза:.а1 А и В,

РЕЗУЛЬТАТЫ 1:ССЛЦ50ЕАИН Введение ингибиторов ппотеаа вз семян Насоли

Вцдэление белков-ингибиторов протеаз и? семян фмолз проводили согласно схеке, представленной ка рпс.1. Выход препарата спирторастворггмео ; ингибитора, полученного ка

*

осадок

раствор

Семена Зассши

изкелъчение

обезжиривание гексаном мука

экстракция 6035 этанолом при 55°С фильтрование

экстракт

| подкисленпе I Н HCl до pH 5,3 I осаждение ацетоном пра 0°С

50к

осадок

растворение в воде _Диализ

диализат

Балластные белки"

|лко$алытя сушка "исходный препарат" шгрябатора

гель-гроыатографвд на сефадексе 6 - 75 в 5? СНдСОСНЮ.б М KCl

Концентрат белков-ингибиторов

аффинная хроматография

Белки-ингибиторы трипсина

обессоливание на сефадексе 6-15 лиофилиэацпя

"сушаршй препарат" ингибитора

ч -Ионообменная хроматография на ДЭАЭ - се£одексе А-25

Изо:!нгж5игор П Изоинпхбитор Ш Б

Pzc.I. Схема выделения ингибиторов из семян фасоли

nepuofi стадии выделения и обозначенного как "исходный препарат" ингибитора, составил 10 г из I иг обеэкиреиной муки, 85 tatr препарата ингибитора снизала на 50$ эстеразнув активность 100 мкг трипсина и 45 ьясг хшотрипскна. Б результате последующей гел^-хроматографии на сефадексе бшга отделена значительная часть балластного белка (рас.2); выход активного препарата ингибитора составил 120-150 иг сухого продукта из 1000 мг ("сукулршй. препарат" ингибитора). 40 ыкг очищенного таким образов ингибитора достаточно для сиЕкения активности 100 ккг трипсина на 50J5. Для получения высокоочищенного препарата ингибитора бил применен метод аффинной хроматографии. В качестве диганда бшз: использоианц ферменты трипсин а хи-мотринеш!* Для проведения афишной хроматографии "сутл.арныД препарат" ннгибктора растворяли з 0,05 М трхс-HCI буфере, содержащем 0,2 М KCI, рН 8,0 и наносили на колонку с иг.мо-бшгазовашшм ферментом, уравновешенную тем же буфером. Нанесение продолжали до появления кигийаторной активности во фракциях элвата, колонку прогнивали исходным буфером и затем ингибитор олгкфовали 0,2 Ü KCI при рЫ 2,0 (рис.З).

Усл.ед,

О

20 50 40

50

60 ФРАКЦИИ

Расг.2, Гель-хроматография спирторастворишх белков из фасоли.

I - AggQ , 2 - ингибиторная активность.

А28о рн

Рис.3. Аффинная хроматография ингибитора на иммобилизованном зшмотрипсине. X - А^д. 2 - рН. Заштрихованы зоны с ингибиторной активность©.

Злектрофореткческкй анализ полученного препарата в по-лиакриламидпом геле (рН 8,9; 10%) показа», что он содержит по крайней мере три различающихся по элекгрофоретиче ской подвижности белковых компонента. Методом пзоэлектрического фокусирования в диапазоне 1Н от 4 до б выявлено 4 белкошх компонента со значениями р1 4,3; 4,5; 4,7; 4,9. Сравнение электрофореграьтл свободного ингибитора и смесей его с ферментами - трипсином и хиштрипепном - показало, что веделен-ний аффинной хроматографией препарат содержит только взаамо--действугацие с этими ферментами белки, которые образуют о ними стойкие комплексы.

В качестве концевых аминокислот найдены 3 основные аминокислоты; лизин, серии и глицин.

Получешше данные позволили сделать вывод о том, что в состав выделенного из семян фасоли препарата ингибитора входит несколько близкородственных молекулярных форм.

Взаимодействие таги бит ото, о (гешента>д

Ингибитор подавляет протеолитпческую, эстеразную и ами-дазную активности трипсина. 17,5 мкг ингибитора снимшг на 50$ эстеразную активность 100 мкг активного трипсина ( суб-

страт Bz-Arg-OEt ). Линейный характер подавления активности трипсина сохраняется вплоть до 90$ ингибирования | (рис.4). Етпашие ингибитора на эстеразяую активность трипсина проявляется одинаково как в случае использования суммарного препарата трипсина, так и в случае препарата, обогащенного JÍ -формой. Константа ингабирования ( Ki ), рас-считаш1ая по методу Грина ( Groen, Work, 1953), составляет 3,28.1СГ*^ М. В единицах, предложенных Верле ¿ др. ( Fritz ét al., 1970) антитриптическая активность вцделекного ингибитора соответствует содержанию 4 миллиединиц ингибитора на I ьжг препарата. Таким образом, спирторастворщяД ингибитор из фасоли могсно отнести к числу наиболее активных ингибиторов трипсина растительного происхождения. Ингибитор подавляет также активность хнштрппсина. Однако в этом случае линейная зависимость кекду количеством. ингибитора л размером угнетения активности фермента соблюдается только до 50^ днгибирования ферментативной активности.

Рис.4. Подавление ингаблторо« нэ фасоли эстеразноЯ ак-

20 40 60

мкг ингибитора/!00 ккг фермента

котрипсина (суб- „ страт ( Ac-Iyr—OEt)

(бТГ

а: 1-су:.г.1арнь!й препарат трипсина, У - Jb -трипсин,

б: 1-инп:битор очищен на иммобилизованном химотркпскне (I) или трипсине(3), 1-0; 2 - д ,3-е.

Выло исследовано влияние полученного ингибитора из фасоли на активность некоторых трипсино- и химстрешсиноподоб-ных прогеиназ различных микроорганизмов. Установлено, что ингибитор не влияет на активность субтилизина (ЕаоШив еиЬ1И1з ), но заметно подавляет активность протеаз кош-

лекса "Провазы", гидролязувдих Bs-irg-OEt и Ao-Tyr-OEt (ряс.5).Выделенный из фасоли ингибитор подавляет также про-теслитичесиуюиашщазную активность экзогенной тркпсиноподой-ноЙ протеииазы, выделяемой трибага рода Fuaariua.

Еис.5. Подавление ингибитором из фасоли ферментативной активности "Провазы"

1 - Субстрат Ви-Аге-С^

2 - Субстрат Ао-1уг-ОЕг

1/1 ПО 6ЕСУ

Опыты по химической модификации ингибитора малеино-вым ангидридом и 2,4,&-тршттробензосулкЕокислотой показали, что блокирование ашшных групп приводит к прокпгчески полной (на потере способности подавлять активность трипсина, но способность подавлять активность химотрипсина в .значительной степени (на 50/2) сохраняется. Эти результаты приводят к выводу, что все изоингибиторы, входящие в состав выделенного ингибитора из фасоли, относятся к группе "лизи-новых" ингибиторов, (т.е. в реактивной,центре, ответственном за сачзываиие трипсина, находятся остатки лизина). Полу-чешше результаты такие свидетельствуют в пользу того, что ингибитор кз фасоли гадает различные центры, ответствензше за связывание трипсина и хшотрипсина, т.е. он шкет бить отнесен к группе так называемых "двуглавых ингибиторов" протеаз.

/Наличие в ингибиторе двух различных центров связывания для трипсина и хиыотрипсина было подтверждено также опытами до выделению и исследованию комплексов» образованных ингибитором с указанными феркентами. Выделение комплексов прово-

дали при помогр: гель-хроматографии нп сефадексе & - 75, Для получеши комплексов брался избыток ингибитора с тем, чтобы исключить возможность протеолитической модификации белка в ходе опыта. Сшсп, содержащие ферменты и ингибитор, выдерживали при комнатной температуре 10 мин.и наносили на колошу, заполненную сефедекссм 6 - 75, уравновешенным 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 7,8, содержащим 0,1 М КаС1 . Во фракциях олюата определяли содержание белка по величине поглощения при 280 ел я активность ингибиторов трипсина и шо-трипсина. В обоих случаях обнаруживался один главный белковый компонент с молекулярный весом 37000 и 40000 соответственно. На основании величины молекулярных весов он мог быть идентифицирован как ко?.31лекс, содержащий одну молекулу ингибитора с молекулярным весом 10С00-12000 и одну молекулу трипсина либо химогр1тсш1а. Было ш^ено, что комплекс трипсин -ингибитор сохра;1яст способность подавлять активность химо-трнпснна. И, наоборот, комплекс хпмотргатснн-ивгкбитор обладает способностью подавлять актизность трипсина. При гель-хроматографии на сефадексе 6 - 100 смеси, состоящей из трипсина, ингибитора и хкмотркпсина в молярном отношении 1:1:1, преобладает кошонент с М.в. 54600 , что соответствует "трой-ногу" комплексу - комшгексу, состоящему из одной молекулы ингибитора, одной молекула трипсина и одной молекулы хпко-трипс1ша.

Вылелепие. пзонпгибитогюв и их хатеттегттстпка.

С целью выяснения природы множественных форм ингибиторов из фасоли било проведено ввделенпе отдельных компонентов. Поскольку белки различаются по величине заряда, для этой цели был использован метод покнообыенной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А - 25. В качестве исходного материала для ввделе-еия индивидуальных ингибиторов бил использован "суммарный препарат" ингибитора (см.схсглу взделения, рпс.1). Стадия аффинной ¡сроматографэт била опущена, чтобы исключить возмсйс-ность получения модп<1ицаровапнкх ингибиторов. Колонку уравновешивали 0,05 М имидазодьнкм буфером, рН 6,5,' содершщо* 0,05 М ЕаС1 . Разделение ингибиторов достигалось при алмциа

буфером с постепенно повышющеЗся концентрацией НаС1 (рис.6).

А 280

ИЗ Г

м

- ол

Рис.6. Ионнообменная хроматография суммарного препарата ингибитора на ДЭАЭ-сефодексе А-25

поглощение при 280 нм,---концентрация ЫаИ.

> Из пяти главных белковых фрашщй, содериашх ингаби-торную активность, дальнейшему изучению подвергались фракции II а III, которые составляли около 45$ от общего количества связанного на колонке белка (на рис.соответствующие фракции отмечены горизонтальной чертой).

¿¿атериал фракции III оказался гетерогенным и бил подвергнут рехроматографии при более пологом градиенте повышающейся концентрации ИаС1 . В результате были получены 2 компонента - ША а ШВ,

Диск-электрофорез в полиакршшгадиом геле при рй 8,9 показал, что ингибитор ШВ дает одну белковую полосу, а ингибитор II имеет незначительную примесь минорных компонентов.

Чистота полученных двух ингибиторов II и ШВ была подтверждена анализом ин2 -концевых аминокислотных остатков. В качестве иы2 -концевой аминокислоты ингибитор II содержал остаток глицина, ингибитор ШБ — остаток серена.

Аминокислотный состав выделенных белков характеризуется высоким содернаниеы аспарагиновой кислоты, серина и

цкстина, на доли которых приходится свыше 40% общего числа аминокислотных остатков (табл.1). В составе белков отсутствуют валин, триптофан и метионин. Определение содержания сульфпщрмышх групп в балках (определение проводилось на "суммарном препарате" ингибиторов) показало, что они не содержат свободных SH -групп. Следовательно, все остатки цистеина, определенные в форме цистеиыовой кислоты после окисления белка надмураввиной кислотой, связаны дисульфид-ными мостинами, число которых в молекуле каядого белка равно секи. Восстановление дисульфддкых связей меркаптоэтано-лом в 8 М мочевине приводило к инактивации ингибитора. При полпом реокислении белка кислородом воздуха активность не восстанавливалась.

Ингибитор IX содершт на 4 аминокислотных остатка боль-се (остаток серина, глицина и 2 остатка глутаминовой кислоты), чем ингибитор 111Б. ¡.'л1сп.*альны2 молекулярный вес, рассчитанный из аминокислотного состава, равен 10823 для ингибитора XXIE и II225 для ингибитора II.

Определение Щг ~ и С ООН-концевых последовательностей ингибиторов II и IIIE показало, что они имеют некоторое различие:

II .Gly-Gly-Leu-Pro-Aap-Sajr-Glac"....."lys-Rie-Ser-Leu

IIIE .Ser-Gly-Leu-Pro-Asp-Ser-Glx".....~Arg-Kie-Ser-Ieu

На осношгши полученных данных мояио сделать вывод, что Еыделетке белки являются истинными изоингибиторами, различающимися по своей первичной структуре.

Исследоганне устойчивости ингибитора IIIE к денатура-ционеым воздействиям ползало, что он сохраняет свою активность при нагревании при 100° в течение 15 мин, а такге при инкубации в кислоте, щелочи, обработке мочевиной и додецил-сулхватом натрия.

Бэпшолейстите отдельних кзоннглбитотюв с Ферментами

Исследование влияния изоингибиторов на активность трипсина показало, что они почти идентичны по характеру воздействия на эстеразну» активность трипсина. Линейный характер ингн-бпрования сохраняется вплоть до 90% подавления активности.

*

Таблица I

■ Амянокислотшй состав ингибиторов II в ШБ

Еелок

Аминокислота 1 И 1 ШБ

*шсло остатков ( ^ка ь'.олекулу^ | число остатков

на молекулу/

Асшрагиновая кислота 1 15,8 (16) \ . 16,2 (16)

Треонин ! 6,1 (6) ) 5,8 (6)

Серия 15,0 (15) I 13,9 (14)

Глутаминовая кислота , II,9 (12) 1 10.1 (Ю)

Пролин ■■ , 7,9 <8( « 7,8 (8)

Глицин 1 4,3 (4) ' 3,3 (3)

Ала1шн \ ■' 1 4,4 (4) ' 4,1 (4)

Цистпн/2 I 14,2 (14) 13,2 (14)

?я тин ' 0 (0) , , 0 (0)

Метионин 1 0 (0) 0 (0>

ИзолеЙцян 4,4 (4) I 4,2 (4)

Лейцин I зд (3) 1 2,8 (3)

Тирозин 1 д.о (I) ' 0,6 (I)

Сенилаланин 1 2,0 (2) 1 2,0 (2)

Лизин 1 5,2* (5) ' ' 4,8 (5)

Гестидш » '5,6 (6) ; ед (8)

Аргинин ' 3,3 <3) , 3,1 (3)

Триптофан 1 ( - 0

Всего остатков 1 103 1 99 '

Молекулярный вес 1 11.225 I 1 10.828

^ В пересчете на 2 остатка фенилаланина в молекуле.

Рио.7. Подавление эстеразной активности трипсина (субстрат ) (а) и хамотрипснна (субстрат Ас-Туг-С£М ) (б) ингибиторам из фасоли I. - изогнгибитор II, 2. - изоиншбитор 1Х1Б.

При действии ингибиторов на хи^отрипсин линейный характер ииггйкроваши сохраняется до 80^ подавления активности фер:,:ента для ингибитора II а до 75% - для ингибитора ШЕ. Значение К1 для ингибитора ШБ, рассчитанное по методу Грина на основании величины остаточной ферментативной активности в точке эквивалентности, равно I,6.10"^ М, что говорит об образовании веста прочного комплекса между ингибитором 1ПБ и трипсином.

0 биологических Дут»птяу ингибиторов поотеаз у тастенкй

Несмотря на то, что свойства мюгих ингибиторов протео-литических ферментов из растений исследовшп! достаточно подробно, их физиологическая роль остается практически не изученной. лишь очень негягогке из ингибиторов способна оказывать влияние на активность собственных протеаз растений, и, следовательно, участвовать в регуляции их активности.

Исследование вопросов влияния ингибиторов на рост и развитие флтопатогешшх игкро организмов и способности ингибиторов угнетать активность протеаз этих микроорганизмов представляет большой интерес, так как в процессе проникновения паразита в клетки хозяина и его способности использо-

вать белки хозяина ваяное значение имеют экзогенные проте-азн патогенов»

В качестве объектов исследования использовали $итопа-тогеннце грибы рода Pusariua л Botrytis, Было найдено, что ингибитор из фасоли угнетает рост кицелия грибов -возбудителей $узариоза и ботритиоза при вмрацивавип на искусственной питательной среде, а также задерживает прорастание спор (табл.2)«

Таблица 2,

Взсыпше ингибиторов из фасоли на развитие фитопатогенннх Грибов рода Fusarium и Botrytis.

Род гриба

.Fußarlu» eolani

"fgeW 67х/ SC^7 ~

•Fueas-iu« J Botrytis ( Условия раз-jculaorua вития гриба

62^ бб3^

7лхххГ

Диаметр колоний

в %

Ингибитор добавляли в суспензию спор до koi--------

ПИИ

щентра-

от нормы

43ХХ/

Ингибитор добавляли в пстательнуи среду до концентрации 0,1%

** измерение проведали на 2-х дневной культуре измерение проводили на 3-х дневной культуре измерение проводили на 4-х дневной культуре.

Для выяснения причины замедления развития-грибов -паразитов в присутствии ингибиторов из фасоли было исследовано влияние последних на активность экзопротеаз, выделяемых мицелием гриба в кулътуральлую ¿-ездкость. Для этого кулвтуральную яидкость инкубировали с ингибитором и определшга остаточную ферментативную активность. (Исследовали как вдяязпге на общую прогеодитическу® активности (субстрат казеин), так и на активность трзнсаиопо-добной иротепказц (субстрат Вг-Агз-ркА) )• Ешю найдено, что казеиЕолктгческая активность нультурадъкой жидкости Ft.8o3.aai подавляется ингибитором на 53^, Это говорит о

-ror.i, что около öOJTOBi'Jfar протеолитических экзофермектов фл-толатогена чу во теп тел иш к действа» ингибитора протеза аз фасоли. Активность трилсиноподобного фермента из культурадь-вой жидкости F. soiani ингибитор подавлял почти полностью (на ЭбуО (субстрат Вг-Аге-рКА).

Тают образок, угнетение роста мицелия гриба и прорастание его спор ингибитором растительного пролсхогдешш, по-Еэдгаогду, ыокно объяснить воздействием ингибитора на проте-азы граба, что приводит к нарушению его нормального питания. Подавление активности экзопротеаз, выделяемых мицелием гриба P.eoXani в культургльнузз жидкость, наблэдалось такзге в присутствии других хнгибяторов протеаз из растений - ингибитора Баукана-Взрк и иигибитора Кунитца из сов, ингибиторов из картофеля, пшеницу и лшскоЙ фасоли. Ингибитор кнвотного происхождения, такой как овоцукоид, не обладает способность» подавлять активность этих экзопротеаз. Таким образом, моено предположить, что способность подавлять экзогенные вротеази гриба является обдал свойством ингибиторов растительного проЕсхоздензд. На основании напученных данных высказано предположение о том, что белки-ингибиторы протеаз у расенкй приделают участие в специфическом защитном механизме растений от поранения патогенныг.а шжроорганкзмами.

ОЧИСТКа ТрИПСППОП ОД О бНОЙ протаяназы Strgptonycas рг!веав.'

Свойство ингибиторов пз фасоли избирательно и обратило связываться с трипсином и зсвлотршкашоа при нейтральных и слабощелочных значензях pH било использовано для выделения из препарата протеолитических ферментов микроорганизма Str. griaeua трипсиноподобной протеиназы. Б связи с тем, что в реактивном центре ингибитора из фасоли содержится остаток Lya , юллобшшзацко проводила с участком карбоксильных групп белка. Сорбент получали присоединением ингибитора к АН-сефарозе в присутствия карбодяпмзда. Колонку с идаобкли-эовашпш ингибитором уравновешивали трпс-КСХ буфером, pH . 8,0, содеркалдо 5 Ш CaCIg. Раствор препарата протеаз Str. grieeue в той ке буфере наносили на колонку. Зляшли материала, связанного с пмг/обидизованним ингибитором, проводили 0,01н HCl при рй 2,0. Результаты представлены в табл.З,

Таблица 3*

Очистка трипсиноподобного фераента 2гг.ег1ееие

1 Суммарная 1 Белок Препарат ¡активность^ г

1 Удельная »активность 1 ед/мг белка

йнтод,

%

Исходный препарат

12000

,1.0

12

100

Босле I очистки I

8800

1 0,0665 1 I I

133

75

_/ *

** I ед.= I ык Моль гидролизовагаого Вг-Дг£-ом за мин.

Приведенные дазпше свидетельствуют о том, что тркпсиЕо-додобшй фермент , содержащийся в ферментной

препарате,'избирательно связывается на колонке с тгдобплазо-вашшм ингибитором из фасоли. Макспшльиая удельная активность его достигает 130-150 ед/ыг бедна, что близко к удель- • ной активности выеокоочищенных препаратов трипсина з-Ьг#сг1Б«иа» полученных с помощью ионообменной хротт ографиа ( 01агеоа, £т±1Ие , 1975). Очищенная протеиназа гомогенна'при электрофорезе г полиакрилагяцщом геле при рН 4,3 и в ультрацент-риф-уге 2,4, Изоэлек^рическая точка белка 9,2. Молеку-

лярный вес, определенный методом гель-хрокатографпп, равен 19720. £Я2 -концевой аминокислотный остаток - валин. Активность фермента подавляется типичными ингибиторами сериновых протсаз - диизспропилфторфосфатои, хлоркетоном тоэил-Ь -лизина, ингибитором Кунитца из бобов сои.

ВЫВОДЫ

I. С помощь» истодов фракционирования на сефздексе и аф>-финной хрог/ат ографии на иммобилизованном трипсине и зашотрип-синс из семян фасоли обыкновенной (РЬааво1ив уи1еаг1о Ь.) выделен высокоактивный препарат ингибиторов трипсина и химо-трлпсииа.

2.. Показано, что ингибитора из фасоли представлены несколькими родственными формат, которые могут различаться по аминокислотному составу и первичной структуре. Два изоингибитора (белки П и Е-Б) были получены в гомогенном состоянии.

3» Аминокислотный состав ингибиторов из фасоли характеризуется высотам содержанием цкстина, аспарагпновой кислоты и серила. Они не содержат валина, метионина и триптофана. В белках отсутствуют свободные сульфгидрилъные группы и все остатки палудистпка участвуют в образовании дисулЕфвдкых мостиков, число которых равно семи в молекулах ингибиторов с молекулярным весом 11-12000.

4. Ингибиторы из фасоли принадленат к тину "двуглавых" ингибиторов протеиназ и содержат два реактивных центра, один из которых ответствен за ипгибирование трипсина, и другой —

за ингабирование хииотрипсина. В центре, ответственном за взаимодействие с трипсином, содержится остаток лизина.

5. Показано, что ингибиторы протеояптическпх ферментов из высаих растений способны подавлять активность протеаз фитопа-тогенных микроорганизмов, тормозить процессы их роста и разви- ' тия. Высказано предположение о том, что белки-ингпбиторц протеаз играют существенную роль в защите растений от пораяенпя патогешшми микроорганизмами.

6. Иммобилизованный ингибитор из фасоли может быть успешно использован в качестве сорбента для очистки протеолитичес-ких ферментов,.Методом аффинной хроматографии на ингибиторе, связанном с сефарозой, получена шсокоочиценная трипсиноподобная протеипаза микроорганизма 5*гер-Ьояусев £г1ееив.

Список работ. опубликованных по материалам диссертации:

1. йедуркина II.В., Мосолов В.В. 1973. Вццелеше специфического ингибитора трипсина из фасоли о помощью адсорбции на трнпсии-агарозе. - Материалы I Всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов. Вильнюс, стр.37.

2. Ыосолов В.В., йедуркина Н.В. 1974. Выделение ингибитора тршсина из фасоли с помощи» связывания на трипсин-ага-розе. Биохимия, 39, 624-629.

3. Мосолов В.В., Иевлева Е.В., Федуркина Н.В., Соколова Е.В. 1974. Некоторые свойства иммобилизованных ферментов трипсина и сС -химотрипсииа и их взаимодействие с природными ингибиторами. - Материалы I Всесоюзного симпозиума по применению и получешш иммобилизованных ферментов. Таллин, стр.64-66.

' 4. Иевлева Е.В., Седургаша Н.В., Мосолов В.В. 1974. Присоединение о£ -химотрипскна к ашшохяор- s -триазпнсл-сефа-дексу и использование иммобилизованного фермента для у'" очистки ингибиторов хпштрспсина. - Материалы I Всесоюзного симпозиума по применению и получению иммобилизованных ферментов. Таллин, стр.66.

5. Яушгкова В.В., Федуркина Н.В., Соколова Е.В., Кротова Л.И., Еосолов В.В. 1975, Получение биоспецпфическюс сорбентов. Биоспецифическая хроматография. Методы,современной биохимии. М., "Наука", стр,5-8. /

6. Мосолов В.В., Федуркша Н.В., Валуева Т.А., Соколова Е.В* 1976. Спарторастворпшй ингибитор трипсина из фасоли. Прпкл.бкохиы. н микроба ол., 12. вып.1, 37-44.

7. Бенкен И.И., Мосолов В.В., ¿едурхина Н.В. 1976. Влияние ингибитора протеаз из $ас<шг на фитопатогешше грибы* Шкодогия и фитопатология 10, 198-201.

8. Мосолов В.В., Федуркина Н.В.» Варева Т.Д. 1977. Выделение к свойства изоингабиторов трипсина из фасоли. Eiiq-

. ХИМИЯ, 42, вып. 7, 12Ш-12И.

9. Федуретна Н.В., Валуева Т.Д., Мосолов В.В. 1977. Выделение трипсиноподобной протекназц Str«ptoayoes erleeue с помоаью аффинной хроматографии. - Материалы II Всесоюзного симпозиума по получена» и щжкенепшо ишобилиэо-вашшх ф-ерментов. Абовда, стр.8.

10. Мосолов В,В., £едуркина Н.В, 1978. Стехиометрия взаимодействия белка-ингибитора протеаз из фасоли с трипсином

. и хиаотршсиаом. Докл,АН СССР, 241. 1214.

11. Но во 10 v V.V. , PedurklnG в.7. Slid 7alu«va Т.А. 1978. Interaction of trypein-like prot«asa froo Streptoayeee griseua with an immobilised inhibitor from kidney bean* Biocbis*Biophys Acta, ¿22, 1S7-194.

12. KoboIot V.V., Loginova И.О., Peduririna H.V., Broken J.J*

■ 1976. Ihe biological significance.of proteinase inhibitors la plants* Slant Sel:*X.&tt»rsv 7» 77-80»

gzg!1-1 З/^Г 1. £ 1________________

Типография X030 Госплана СССР _