Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Авторегуляция синтеза актина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Авторегуляция синтеза актина"

РГ'Б ОД 2 4 ЛПР 1995

московским государственный университет

имени М. И. ЛОМОНОСОВА

на правах рукописи СКЛЯРОВА Татьяна Вадимовна

УДК 547. 963. 3

АВТОРЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА АКТИНА

03. 00. 03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук .

Пущино - 1995

Работа выполнена в Институте белка Российской Академии наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук О. Н. Денисенко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Е. С. Надеждина,

доктор биологических наук Ю. Л. Дорохов.

Ведущая организация: Кардиологический Научный центр РАМН

ЗАЩИТА диссертации состоится << /Ь >> 1995 г.

часов на заседании Специализированного совета Д. 053. 05. 70 при Московском Государственном

Университете им. М. В. Ломоносова, по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан » .1995 г.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

В. Н. Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изменения в организации актинового скелета играют существенную роль в осуществлении многочисленных клеточных функций и процессов, включая клеточную подвижность, морфогенез тканей, экзоцитоз и передачу сигнала от мембраны в ядро. Реорганизации в сети микрофиламентов осуществляются, как правило, путем сборки и разборки актиновых филаментов, и контролируются внешними сигналами. Мишенями регуляторных воздействий могут служить как сам актин, так и актин-связывакицие белки, регулирующие события полимеризации-деполимеризации микрофиламентов,

гелеобразования и т.п..

Считается, что для осуществления быстрой сборки актиновых филаментов (F-актин) в ответ на внешние стимулы, клетки содержат значительное количество неполимеризованного, мономерного (G-) актина. G-актин сохраняется в клетке в комплексах со специфическими белками, таким образом, предотвращая спонтанную полимеризацию актина.

Предполагается, что для обеспечения быстрых изменений в актиновом скелете клеток, стимулированных внешними сигналами, количество неполимеризованного актина должно поддерживаться на постоянном уровне для компенсации его потерь вследствии полимеризации. Поэтому вполне вероятно существование специального механизма обратной связи, который бы связывал количество мономерного актина в клетке с его синтезом, и возможно, синтезом некоторых актин-ассоциированных белков.

Очевидным подходом для проверки этой гипотезы является изучение экспрессии актина в клетках, где изменено количество G: актина. Предварительные результаты, полученные с использованием этого подхода, согласуются с предлагаемой гипотезой регуляции по принципу обратной связи. Было показано, что обработка фибробластов фаллоидином, агентом, стабилизирующим актиновые филаменты и стимулирующим полимеризацию актина, уменьшает количество G-актина и приводит к увеличению количества актиновой мРНК и стимуляции синтеза, актина. С другой стороны, были получены данные о том, что С2 токсин из Clostridium botulinum, который ADP-рибозилирует G-актин и этим предотвращает его полимеризацию, ингибирует синтез актина.

В этих работах, хотя и указывавших на существование механизма авторегуляции синтеза актина, не было поставлено несколько важных вопросов, касающихся данной гипотезы.

Целью работы явилось исследование механизма авторегуляции синтеза актина посредством увеличения количества G-актина в клетке.

В связи с этим нами были поставлены следующие основные задачи:

1. исследовать количественную зависимость синтеза актина от соотношения мономерного актина к полимерному (G/F);

2. определить, являются ли изменения в синтезе актина следствием пертурбаций в клеточной морфологии и прикрепленности к субстрату или же следствием изменения количества мономерного актина;

3. исследовать, на каком уровне осуществляется G/F-зависимая регуляция эскпрессии актина;

4. исследовать как влияет деполимеризация актиновых филаментов на синтез белков в клетке.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований получены количественные данные о зависимости между степенью полимеризации актина и скоростью его синтеза. Показано, что изменения в синтезе актина не являются следствием пертурбаций в клеточной морфологии, а коррелируют с уровнем G-актина в клетках. Показано, что G/F-зависимая регуляция синтеза актина осуществляется посредством регуляции стабильности его мРНК. Установлено, что увеличение соотношения G/F актина, а не нарушение целостности актинового скелета, приводит к изменениям в экспрессии актин-связывающих белков: винкулина, тропомиозина и аннексина-I. Причем, регуляция синтеза аннексина осуществляется на трансляционном уровне, тропомиозина - как на трансляционном уровне (преимущественно), так и за счет изменения количества мРНК, а винкулина - за счет изменения количества мРНК. На основании полученных результатов высказано предположение о существовании координированного механизма G/F-актин зависимой регуляции синтеза актина и ключевых белков, ассоциированных с микрофиламентной сетью.

Обнаружено, что хронический иммобилизационный стресс у крыс приводит к протеолитической модификации актина в лимфоцитах, путем активации С2+-зависимой протеазы. Показано', что стресс индуцирует двухкратное увеличение количества G-актина в лимфоцитах и супрессию синтеза актина и других белков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. ЗАВИСИМОСТЬ СИНТЕЗА АКТИНА И АКТИН-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ОТ СТЕПЕНИ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ АКТИНА

1. С2-токсин, вызывающий деполимеризацию

микрофиламентов, приводит к ингибированию синтеза актина и винкулина

Для изучения взаимосвязи между внутриклеточной организацией актина и его синтезом уровень полимеризованого актина был уменьшен путем обработки ЗТЗ клеток С2-токсином. Этот токсин специфически ADP-рибозилирует мономерный актин. Модифицированный актин не способен полимеризоваться, но может связываться с быстрорастущим концом филаментов, что в итоге приводит к мономеризации актина.

С2-токсин был очищен из культуральной среды Clostridium botulinum как было описано ранее (Ohishi et al., 1980). Он ADP-рибозилировал актин in vivo и in vitro. Нами было показано, что модификация актина приводит к изменению его изоэлектрической точки и, следовательно, положения на двумерном геле. Эта особенность была в дальнейшем использована для оценки относительного количества ADP-рибозилированного актина в клетке. Обработка клеток С2-токсином индуцировала быстрые морфологические изменения. После одного часа обработки 50% ЗТЗ клеток было округлено, а после 8 часов приблизительно все клетки становились сферическими (рис 1D). Около 87% актина было ADP-рибозилировано в ЗТЗ клетках после 12 часов обработки С2 токсином. В округленных клетках наблюдались драматические изменения в актиновом скелете (рис. 1В). Вместо хорошо развитой системы параллельных актиновых тяжей, типичных для контрольных фибробластов, С2-токсин обработанные клетки едва ли содержали какой-либо F-актин.

Для определения уровня мономерного актина по отношению к полимерному, ЗТЗ клетки метили 24 ч [355]метионином, и в последние 12- часов мечения добавляли С2-токсин. Анализ распределения актина между Тритон Х-100 растворимой и нерастворимой фракциями показал, что после 4 часов обработки токсином количество G-актина увеличивалось вдвое по сравнению с контрольными клетками, при этом 38% актина было ADP-рибозилировано. После 12 ч обработки токсином 86% актина присутствовало в Тритон Х-100 растворимой фракции, при этом 87% актина было ADP-рибозилировано.Для исследования эффекта

деполимеризации актина на его синтез актина ЗТЗ клетки были пульс-мечены [355]метионином через разные промежутки времени после обработки С2-токсином; белки анализировали двумерным гель-электрофорезом. Было обнаружено, что синтез актина, а также,

^_____

■ П'

* <

* Чу

А ..

Рис. 1 Изменения в клеточной морфологии, индуцированные С2-токсином. Контрольные клетки (А, С) и клетки, обработанные С2-токсином в течении 12 ч (В, В), фиксировали и окрашивали Р1ТС-фаллоидином (А, В). С и Э, фазовый контраст.

и винкулина падал через 4 часа после обработки С2-токсином. Через 12 часов эффект на синтез актина и винкулина был более выраженным, но в это время уже отмечались изменения и в синтезе других белков (рис. 2). Тем не менее, синтез основных цитоскелетных белков, включая а- и р-тубулин и виментин, не был подавлен, что указывает на то, что обработка С2-токсином специфически воздействовала на белки микрофиламетов.

2. С2-токсин ингибирует синтез актина и винкулина независимо от изменения формы клетки

Токсин, который мы использовали для модуляции степени полимеризации актина, также вызывает вморфологические изменения, включая округление клеток. Было важно определить,

является ли эффект этого токсина на синтез актина и других актин-ассоциированных белков следствием деполимеризации актина, или же округления клеток и изменнения их адгезивности. Для выяснения того, какой из механизмов вызывает наблюдаемые изменения, ЗТЗ клетки были обработаны цитохалазином О. Это

.CON Т

/ /

. . ь: ■ -

act

ТОХ| . ' <3 . , V • / // 4 /

•

♦Л* ♦ *

Л ^»SF *act *

•

küa

.24

Рис. 2 Эффект С2-токсина на синтез актина и винкулина в ЗТЗ клетках. Контрольные клетки и клетки, обработанные С2-токсином в течении 12 ч , пульс метили 35S метионином и анализировали двумерным электрофорезом по O'Farrell. Равные количества радиоактивности были нанесены на каждый гель, act, актин; act*, ADP-рибозилированный актин; v, винкулин; h, белок теплового шока hsp 70; CON, контрольные клетки; ТОХ, клетки, обработанные токсином. Врезка, экспозиция тех же гелей, уменьшенная в 5 раз.

вещество приводит к дезорганизации актиновых филаментов и округлению клеток, не меняя при этом (Cooper, 1987) или увеличивая количество полимеризованного актина (Rao et al., 1992). Синтез актина и винкулина в таких клетках не уменьшался, а наоборот, возростал, что согласуется с предыдущими данными, полученными на других типах клеток (Brett и Tannenbum, 1985). Вместе взятые, эти результаты дают основания полагать, что уменьшение скорости синтеза актина

га К

а 5 к 2

к к и

150

о Ю0

50

• фаллоидин

.контроль

С2, 12 ч

50 100

Доля й-актина (%)

Рис. 3 Корреляция между количеством неполимеризованного актина и синтезом актина. Данные для точки "фаллоидин" получены ВегеЬа(1зку е! а1. (1994)

в клетке связано с увеличением количества неполимеризованного актина (рис. 3) и не является результатом опосредованного эффекта токсина на форму клетки.

3. Изменение количества мРНК актина и винкулина в клетках, обработанных С2-токсином

Для выяснения того, является ли подавление синтеза актина и винкулина результатом изменения количества соответствующих РНК, ЫоШегп блоты, нагруженные РНК из контрольных клеток и клеток, обработанных С2-токсином, гибридизовали с кДНК к [}-актину или винкулину (рис. 4). Количество РНК актина и винкулина значительно понижалось к 12 часу после добавления токсина (рис. 4А, дорожка 3), тогда как уровень РНК ГАФДГ оставался неизменным (рис. 4В). Этот результат свидетельствуют о том, что падение скорости синтеза актина и винкулина, наблюдаемое в клетках с деполимеризованным актином, является следствием уменьшения концентрации соответствующих мРНК. На этом основании можно выдвинуть предположение, что причиной подавления синтеза вышеупомянутых белков являются изменения на уровне транскрипции или стабильности мРНК.

4. Авторегуляция синтеза актина осуществляется за счет изменения времени полу-жизни мРНК актина

Чтобы исследовать возможность того, что уменьшение количества РНК актина РНК после увеличения количества мономерного актина является результатом ее дестабилизации, было проведено сравнение времен полу-жизни РНК актина в контрольных и токсин-обработанных клетках с помощью "pulse-chase" метода. Результаты экспериментов представлены на рис. 6. Хорошо видно, что время полу-жизни РНК актина резко уменьшается в клетках, обработанных С2-токсином. При этом стабильность мРНК ГАФДГ не меняется.

А

t 2 3

v • Ш

а • #t# Ш

Рис. 4 Количество РНК актина и винкулина в ЗТЗ клетках, обработанных С2-токсином. А, ЗТЗ клетки инкубировали с С2-токсином в течении 4 ч (дорожка 2) и 12 часов (дорожка 3). Мо1Ьегп блоты гибридизовали с 32Р-меченой кДНК (3-актина (а) и винкулина (у). Дорожка 1, контрольные клетки. В, Количество РНК ГАФДН в ЗТЗ клетках, обработанных С2-токсином в течении 12 ч (дорожка 2) и контрольных клетках (дорожка 1). С, Блот, использованный в А, покрашен метиленовым синим.

Кроме того, Бершадский и соавт. показали, что скорость транскрипции актинового гена в изолированниых ядрах из клеток, обработанных другим ядом, деполимеризующим актин,

-vector DNA -actin cDNA

В

Chase, hours

0 4 4 12

т • •

ф • m •

con tox con

tox

ад

с 100 .й 'й

а>

и

<

К

6

ь?

50

actin mRNA - П _L

Ik

-actin mRNA -GAPDH mRNA

GAPDH mRNA

0 4 12 0 4 12 chase, hours

Рис. 5 Дестабилизация РНК актина после обработки ЗТЗ клеток С2-токсином. Клетки метили 24 ч 32Р-ортофосфорной кислотой, затем делали "chase" в среде, содержащей избыток немеченного фосфата в течении 4 или 12 часов в присутствии или отсутствии С2-токсина. 32Р-меченную РНК выделяли в указанных временных точках и гибридизовали с кДНК р-актина и ГАФДН, иммобилизованной на фильтрах. А, контроль на специфичность гибридизации с РНК, выделенной из клеток после 24 ч мечения (0 временная точка). В, гибридизация Р-меченной РНК из контрольных (Со) и обработанных С2-токсином (Тх) через различные временные интервалы с фильтрами, содержащими кДНК и ГАФДН. С, денсиметрические измерения пятен, показанных в (В) из трех независимых экспериментов. Открытые столбики - контрольные культуры; закрытые столбики - культуры, обработанные С2-токсином.

2

латрункулином A (Lac А), не отличалась от таковой в контрольных клетках. Более того, эксперименты, проведенные на цитопластах, обработанных Lat А, показали, что синтез актина подавлялся в энуклеированных клетках в той же степени, что и в целых клетках. Учитывая все эти данные, полученные с использованием веществ, по разному деполимеризующих . актиновые филаменты, мы полагаем, что подавление синтеза актина в ответ на его деполимеризацию вызвано дестабилизацией мРНК актина в цитоплазме.

Такой способ регуляции синтеза актина удивительно похож на таковой, описанный для тубулина (Ben-Ze'ev et al., 1979; Cleveland et al., 1988). Возростание количества мономерного тубулина приводило к быстрой дестабилизации мРНК тубулина. Показано, что сигналом для деградации мРНК тубулиа служил N-концевой растущий пептид тубулина на полисомах (Yen et el., 1988; Theodorakis и Cleveland, 1992). Дальнейшие исследования необходимы для того, чтобы выяснить механизм авторегуляции стабильности мРНК актина.

5. Изменения в белковом синтезе, индуцированыые С2 токсином

Имеется большое количество данных относительно вовлечения акгинового скелета в пространственную и временную организацию белкового синтеза в живой клетке (Hesketh and Pryme, 1991; Singer, 1993). Однако, большинство полученных данных были либо корреляционными, либо были использованы яды (цитохалазин), которые не меняли G/F соотношение. С2 токсин оказался ценным инструментом для специфической деполимеризации актинового скелета in vivo.

Для исследования роли актинового скелета в белковом синтезе, вначале мы сравнивали кинетики белкового синтеза в контрольных клетках и в клетках, обработанных С2 токсином в течении 12 часов. Деполимеризация актиновых филаментов сопровождалась двухкратным ингибированием тотального белкового синтеза в клетках (рис. 6, вставка).Ингибирование хорошо коррелировало с изменением количества рибосом, вовлеченных в белковый синтез (рис. 6). Обрботка С2-токсином приводила к двухкратному возростанию пула неактивных 80S рибосом и к равному уменьшению количества полирибосом. При этом размеры полирибосомнеменялись. Аналогичные результаты были получены другими исследователями, которые использовали цитохалазин Д

для разрушения микрофиламентной сети . Резутьтатом этой обработки было ингибирование тотального белкового синтеза пропорционально увеличению количества свободных полирибосом, не связанных с цитоскелетом (ОгпеИ, 1986).

Учитывая эти данные, можно предположить, что общее

ингибирование белкового синтеза является результатом

освобождения полирибосом, ассоциированных с актиновым скелетом.

РИС. 6 Ценртифугирование полисом в сахарозном градиенте. Цитоплазматические экстракты (4 Ои, А2бо ) из контрольных клеток (сплошная линия) или из клеток, обработанных С2-токсином в течении 8 ч (прерваная линия) центрифугтровали в 15-50% градиенте сахарозы в течении 2 ч при 4°С в поторе БШ-41 ВЕСКМАЫ

Градиенты сканировали при Я=260 пш. 00, оптическая плотность при 260 пш. Вставка, кинетика включения [^С]лейцина в контрольные клетки (открытые кружочки) или клетки, обработанные токсином в течении 8 ч (закрытые кружечки). Перед добавлением [14С]лейцина клетки метили [3Н]лейцином в течении 4 ч. Соотношение ^С/ЗН общитывали в каждом образце.

10. С2-токсин влияет на синтез небольшой группы белков в ЗТЗ клетках

Как видно из рис. 7 обработка С2-токсином приводит к изменениям синтеза более чем десятка белков. Подавляется синтез не только актина, винкулина, но и тропомиозина (пятно №6, идентифицирован с помощью иммуноблотинга, а также неидентифицированных белков, обозначенных по положению на двумерном гель-электрофорезе (Mr/pi): рЗб/4.4 и р42/4.45. В то же время синтез р28/6.0, р32/4.5, р34/4.45, p36/6.3-6.8 (аннексин-I, идентифицирован по положению на двумерном электрофорезе), р38/4.5, р56/5.8 и р60/5.4 был стимулирован в клетках, обработанных С2-токсином.

Ю

Для того, чтобы определить, на каком уровне экспрессии генов произошли изменения, приведшие к переменам в скоростях синтеза этих белков, мы использовали систему трансляции in vitro. Равные количества РНК были добавлены в мРНК-зависимую бесклеточную систему из ретикулоцитов кролика. Т.к. используемые концентрации РНК были ненасыщающими, количество продуктов трансляции должны были отражать уровни их мРНК. На рис. 8 С и D показаны продукты бесклеточной трансляции тотальных препаратов РНК, экстрагированных из контрольных клеток и клеток, обработанных С2-токсином. Видно, что изменения количества синтезируемогоактина, винкулина, р28/б.О, р28/5.4, р43/4.45, и р56/5.8 подобны тем, что наблюдаются in vivo, указывая на то, что регуляция синтеза этих белков осуществляется за счет изменения количества мРНК. Напротив, количества белков р32/4.5, р34/4.45, р36/6.3-6.8, и р38/4.5 не отличались в обоих образцах. Из этого можно сделать вывод, что синтез р32/4.5, р34/4.45, p2C/6.4-f>.8 (аннексин-I) и р38/4.5 стимулируется на уровне трансляции в клетках, обработанных С2-токсином. Изменения в количестве тропомиозина (пятно No 6), синтезированного in vitro, незначительны, по сравнению с ситуацией in vivo. Это свидетельствует о том, что подавление синтеза этого белка осуществляется преимущественно за счет изменений на трансляционном уровне, и в меньшей мере - за счет изменения концентрации мРНК. р60/5.4 не был обнаружен среди продуктов in vitro трансляции; это может быть объяснено тем, что он синтезируется в митохондриях, или же его мРНК крайне нестабильна. Для того, что бы выяснить разрушение ли микрофиламентной сети, или увеличение G/F соотношения актина индуцирует вышеупомянутые изменения, мы р^-'отрели как • еняется спектр вновь синтезиру^мьи оел^иь и клетка,., обработанных цитохалазином Д. Как упоминалось ранее, это привело к слабой индукции синтеза актина и винкулина без каких-либо других изменений в наборе синтезируемых белков. Это указывает на то, что увеличение G/F соотношения актина, а не разрыв микрофиламентной сети вызывает изменения в наборе белков, синтезируемых клеткой.

Таким образом, экспрессия небольшого набора генов зависит от степени полимеризации актина в клетке; она контролируется как на трансляционом уровне, так и через ограничение количества мРНК.

il

Vis

к 1 у

4?Хд .

-Л -

V

Л.

IEF

к- . - -- *

AA_j

f

( T j;*

• st

*

6.6 6.0 5.4 4.5

Рис. 7 Эффект обработки С2-токсином на набор белков, синтезируемых в ЗТЗ клетках. Контрольные клетки (А) и клетки обработанные С2-токсином в течении 8 ч (В) пульс-метили [355]метионином и анализировали белки методом двумерного гель-электрофореза. Равные количества радиоактивности наносили на каждый гель. (С), (D), in vitro трансляция препаратов тотальной РНК из контрольных клеток (С) и клеток, обработанных С2-токсином в течении 8ч (D). 5pg каждой РНК транслировали системе из ретикулоцитов кролика. Равные количества системы наносили на каждый гель, а, актин; a*, ADPR- актин; v, виментин; h, белок теплового шока hsp 70; 1, р28/6.0; 2, р28/5.4; 3, р32/4.5; 4, р34/4.45; 5, р36/6.3-6.8; 6, рЗб/4.5 (тропомиозин); 7, р38/4.5; 8, р43/4.45; 9, р56/5.8; 10, р60/5.4.

II. СИНТЕЗ АКТИНА В ЛИМФОЦИТАХ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КРЫС, ПОДВЕРГАВШИХСЯ СТРЕССУ

1. Появление нового мажорного белка в лимфоцитах крыс, подвергавшихся стрессу

Сравнение набора белков лимфоцитов крыс, подвергавшихся стрессу (ЛСК) и контрольных крыс методом двумерного электрофореза (рис. 8 А,В) показало, что стресс приводит к появлению в этих клетках неизвестного мажорного белка (А*). По подвижности в двумерном геле белок А* располагался рядом с актином (Мг 42 кБа, р1 5.3): он обладал более кислой изоэлектрической точкой (рГ5.1) и чуть меньшей молекулярной массой (Мг~40,5). Тот же белок присутствовал также и в лимфоцитах из контрольных крыс , однако, в значительно меньшем

6

Рис. 8 Эффект хронического иммобилизационного стресса у крыс на набор белков периферических лимфоцитов крови. Клетки контрольных животных (А) и животных, подвергавшихся стрессу (В), лизировали в буфере для двумерного электрофореза и белки разделяли по методу ОТаггеН.(С), иммуноблоттинг белков из лимфоцитов опытных животных, окрашенный анти-актиновыми антителами. а, актин; а*, модифицированный актин; а-, [5-Ти, а- и р-тубулин, Тт, тропомиозин; продукт протеолиза актина, ЗЭкБа.

количестве. Статистический анализ показал, что возростание количества этого белка коррелирует с уменьшением количества актина. На основании вышеизложенных данных было выдвинуто

предположение, что интересующий нас белок является модифицированной формы актина.

2. Western-blot анализ и пептидное картирование актина и белка А*

Для того, что бы проверить, не является ли белок А* результатом модификации актина, нами был поставлен иммуноблоттинг белков J1CK с использованием анти-актиновых антител. На рис. 8С видно, что окрашивается как актин, так и белок А*.

Рис. 9 Пептидное

картирование актина и белка А* по Cleveland. Актин (1) и белок А* (4) обрабатывали V8

протеазой в

денатурирующих услових и полученные пептиды разделяли SDS-

электрофорезом. 2, 3 -продукты протеолиза

сравниваемых белков; 1-5, номера пептидов

сравниваемых белков; 5*, пептид № 5 белка А*.

Узнавание белка анти-актиновыми антителами еще не является достаточным основанием для его идентификации как актина. Поэтому мы использовали метод пептидного картирования для исследования гомологии двух белков. Обработка двух белков V8 протеазой и сравнение полученных наборов пептидов показали (рис. 10, дорожка 2 и 3), что оба белка содержат идентичные пептиды, но , кроме того, для каждого характерно наличие специфического пептида, отсутствующего в другом образце. Пептид 5 отсутствует в образце А*, но вместо него он содержит пептид 5*.

На основании полученных данных можно сделать предположение о том, что белок А* - модифицированная форма актина. Так как А* имеет меньшую Mr, то по-видимому, он является укороченным вариантом актина, а пептид 5* является укороченным вариантом пептида 5.

и

3. Протеолиз актина в экстрактах из JICK и лимфоцитах, обработанных Са-иоомофором

Для того, чтобы проверить предположение о том, что появление А* является результатом протеолиза актина, мы исследовали стабильность актина в лизате, приготовленном из JICK. Для этого, лизаты, полученные из контрольных лимфоцитов и JICK, инкубировали при 37°С в течении 1 ч. Анализ белкового состава лизатов после инкубации методом SDS-электрофореза показал (рис. IIA), что количество актина в лизате JICK было значительно уменьшено по сравнению с контрольным . Добавление Са2+-хелатирующего агента EGTA предотвращало деградацию актина (рис. 11, дорожка 2); при этом изменения количества других белков не наблюдалось. Обработка контрольных лимфоцитов Са2+-ионофором А23187 в присутствии Са2+ приводила к появлению аналогичной укороченной формы актина, А* (рис. 11В). А*

был стабилен in vivo, как минимум в течении 30 мин, что

*--- Ша В __1 ' 2

i г L

Рис. 10 А, Протеолиз актина в экстракте из лимфоцитов крыс, подвергавшихся стрессу. Лимфоциты лизировали, получали постядерный экстракт и инкубировали его 1ч при 37°С в присутствии (2) или в отсутствии (1) 1тМ ЕОТА с последующим фракционированием белков БОБ-электрофорезом; (3) протеолиз актина в лизате из контрольных лимфоцитов. В, Протеолиз актина в лимфоцитах, обработанных Са2+- ионофором А23187 (2), (1) -белки контрольных лимфоцитов.; а, актин; а*, модифицированный актин

свидетельствует о том, что он явлется не просто промежуточным продуктом деградации, а выполняет какую-то определенную функцию.

На основании вышеизложенных данных можно предположить, что стресс каким-то образом индуцирует активацию Са2+-зависимой протеазы (по-видимому, кальпаина), вызывающей селективную протеолитическую модификацию актина.

Наиболее вероятным сайтом протеолиза мог бы быть Asp363 (рис. 12), т.к. удаление именно 12-членного С-концевого пептида должно приводить к уменьшению Mr на 1,5 kDa и сдвигу pi на 0.2 единицы в кислую область. Интересно, что обнаруженная нами форма актина обладает точно такой же pl, как и ADP-рибозилированная форма актина. Эта модификация меняет pi актина на 0.2 единицы за счет двух фосфатов ADP-рибозы. Поэтому, чтобы pi

протеолизированного актина изменилась на такое же значение, a Mr на 1.5kDa, исходную актиновую молекулу надо лишить 12-членного С-концевого пептида, т.к. он содержит три положительно заряженных аминокислотных остатка и один отрицательно заряженный.

Интактность N-концевой части актина была подтверждена иммуноблоттингом с использованием антител, узнающих первые три аминокислотных остатка р-актина.

1 DDDIA ALVVD NGSGL CKAGF AGDDA PRAVF PSIVG RPRHQ GVMVG MGQKD 51 SYVGD EAQSK RGILT LKYPI EHGIV TNWDD MEKIW HHTFY NELRV АРЕЕН 101 PVLLT EAPLN PKANR EKMTQ IMFET FNTPA MYVAI QAVLS LYASG RTTGI 151 VMDSG DGVTH TVP1Y EGYAL PHA1L RLDIA GRDLT DYLMK 1LTER GYSFT 201 TTAER EIVRD IKEKL CYVAL DFEQE MATAA SSSSL EKSYE LPDDQ VIT1G 251 NERFR CPEAL FQPSF LGMES CGIHE TTYNS IMKCD VDIRK DLYAN TVLSG 301 GTTMY PGIAD RMQKE ITALA PSTMK IK1IA PPERK YSVWI GGSIL ASLST 351 FQQMW 1SKQE YD * ESG PSIVH RKCF

РИС. 12 Аминокислотная последовательность Р-актина крысы и предполагаемый сайт протеолиза (указано стрелкой)

t

4. ADP-рибозилирование белков в лизате из лимфоцитов

Не является ли изменение изоэлектрической точки актина результатом его ADP-рибозилирования? Для проверки этого предположения нами была проведена инкубация лизата лимфоцитов в присутствии [32P]NAD. Из рис. 13 видно, что субстратами эндогенного ADP-рибозилирования были белки с молекулярной массой 37 и 21-24 kDa; актин среди них не присутствовал. Для проверки того, не являются ли эти белки продуктами протеолиза актина, в инкубационную смесь был добавлен чистый актин. Усиления включения метки в белки 37 и 21-24 kDa не происходило, что говорит о том, субстраты АОР-рибозилтрансфераз(ы) имеют другую природу.

Рис. 10 Эндогенное ADP-рибозилирование белков в экстрактах лимфоцитов.

Экстракты контрольных

лимфоцитов (3) и JICK (1, 2) инкубировали в низкосолевом буфере в присутствии [32P]NAD 1 ч при 37°С. Белки анализировали SDS-

электрофорезом, гель

высушивали и радиоавтографировали. (2), как (1), в присутствии 50мМ NaCl. Стрелками указаны продукты эндогенного ADP-рибозилирования.

5. Увеличение G/F соотношения актина коррелирует с ингибированем его синтеза в JICK

Интересно было посмотреть, влияет ли протеолиз актина на степень полимеризации актина в лимфоцитах. Анализ субклеточного распределения актина с помощью экстракции Тритоном Х-100 показал (рис. 14), что G/F-соотношение актина в JICK было выше, чем в контрольных лимфоцитах: "45% от общего актина приходилось на мономерный, тогда как в контрольных клетках его было "25%. Однако, А* в тритон-растворимой и нерастворимой фракциях распределялся так же, ^эк и интактный актин. Эти результаты позволяют предположить, что протеолиз актина не является основной причиной возростания G/F соотношения актина в JICK. Какой же механизм мог бы обеспечить перераспределение актина из F- в G-форму ? Недавно проведенные исследования

]ГОз

-43

показали, что образование F-актина в клетке регулируют белки rho и гас.> относящиеся к Ras суперсемейству (Ridley и Hall, 1992; Ridley et al.,1992). Они являются мишенью для СЗ токсина из Clostridium botulinum (Aktories et al.,1989), представляющего из себя ADP-рибозилтрансферазу. В результате такой модификации происходит инактивация этих белков, что в итоге приводит к исчезновению F-актиновых структур в клетке (Chardin et al., 1989 ). Можно предположить, что субстратами обнаруженного нами возросшего эндогенного ADP-рибозилирования в ЛСК (рис. 10) являются именно rho и/или гас , обладающие тем же молекулярным весом ("21-24 kDa). Эта модификация и могла бы быть основной причиной

Рис. 11 Изменения в

субклеточном распределении актина в лимфоцитах

стрессированных крыс.

Контрольные лимфоциты (А) и ЛСК (В) обрабатывали цитоскелетным буфером,

содержащим Тритон Х-100. Тритон Х-100 растворимые (SOL) и нерастворимые (INSOL) фракции разделяли и равные обйемы из каждой фракции анализировали

двумерным гель-

электрофорезом.

деполимеризации актина в лимфоцитах, а также предпосылкой для последующего протеолиза актина, т.к. филаментный актин более устойчив к протеолизу. Таким образом, было обнаружно, что в ЛСК повышена концентрация мономерного актина.

Учитывая наши данные о подавлении синтеза актина в клетках, обработанных С2-токсином, было интересно проверить влияет ли стресс на синтез актина в ЛСК. Для этого, ЛСК и контрольные лимфоциты пульс-метили [355]метионином, и вновь синтезированные белки анализировали при помощи метода двумерного электрофореза (рис. 11). Скорость синтеза актина, а также и других белков была значительно снижена в ЛСК. Эти данные согласуются с нашей гипотезой о том, что синтез актина связан со степенью его

полимеризации в клетке. Однако, как было изложено выше, почти полная деполимеризация актина в ЗТЗ клетках под воздействием С2 токсина приводила к пятикратному подавлению скорости синтеза актина. В лимфоцитах же только 50% от общего количества актина приходилось на й-актин, но при этом синтез актина был подавлен в значительно большей степени, чем в ЗТЗ клетках, обработанных С2-токсином Поэтому мы полагаем, что среди причин, вызвавших супрессию синтеза актина и других белков, могли бы быть также и изменения на транскрипционном

Рис. 13 Набор вновь синтезированных белков в ЛСК. Лимфоциты контрольных крыс (А) и ЛСК (В) метили в течении 3 ч [355]метионином, лизировали и вновь снтезированные белки анализировали двумерным гель-электрофорезом.На гель (В) нанесено в 5 раза больше радиоактивных белков, чем на гель (А), а, актин.

уровне. В пользу этого предположения говорят данные о том, что О-актин, присутствующий в ядре, необходим для поддержания транскрипционной активности РНК-полимеразы II (БсЬеег е1 а1., 1984; Нип£§ег et а1., 1979). Для транспорта мономерного актина в ядро необходимо его связывание с актин-связывающий белком кофилином (Ма е! а!., 1992). В образовании этого комплекса

»

участвует С-концевая часть актина (Sutoh and Mabuchi, 1989). Так как мы полагаем, что именно С-концевой пептид отщепляется при стрессе, то логично предположить, что модифицированный актин неспособен связываться с кофилином и, следовательно, транслоцироваться в ядро.

ВЫВОДЫ

1. Исследована взаимосвязь между скоростью синтеза актина и его организацией в клетке. Показано, что:

а) деполимеризация актина под действием С2 токсина приводит к подавлению его синтеза, что сопровождается снижением уровня актиновой мРНК;

б) уменьшение количества актиновой мРНК в клетках является результатом ее дестабилизации;

в) изменение клеточной формы, вызванное обработкой С2-токсином, не является первичной причиной эффекта на синтез актина.

2. Изучено влияние деполимеризации микрофиламентов на синтез актин-связывающих белков. Обнаружено, что существует координирование экспрессии актина и ассоциированных с микрофиламентнами белков, винкулина, тропомиозина и аннексина-I. Показано, что мономеризация актина приводит к:

а) подавлению синтеза винкулина за счет уменьшения количества его мРНК;

б) подавлению синтеза тропомиозина преимущественно за счет изменений на трансляционном уровне;

в) индукции синтеза аннексина-1 и небольшой группы белков за счет активации трансляции их мРНК.

3. Изучено влияние хронического иммобилизационного стресса на состояние и синтез актина в лимфоцитах крыс. Обнаружено, что стресс индуцирует:

а) деполимеризацию актина в лимфоцитах;

б) протеолитическую модификацию актина в С-концевой части;

в) супрессию синтеза актина.

4. Показано, что стресс приводит к активации эндогенного АБР-рибозилирования белков с молекулярным весом 37 кРа и 21-24 кЭа.

5. Обнаружено, что протеолитическая модификация актина в лимфоцитах, вызванная стрессом, может быть промоделирована путем обработки клеток Са2+-ионофором А23187. Предполагается, что стресс индуцирует активацию Са2+-зависимой протеазы.

Основные результаты диссертации представлены в работах:

1. Denisenko, О., Sklyarova.T., Serpinskaya A, Bershadsky, А., Gelfand, V., Ben-Ze'ev, A.:"Autoregulation of Actin Synthesis", 22-nd Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, July 4-9, 1993, Stockholm, Sweden, Abstract, p. 116.

2. Denisenko, O., Sklyarova.T., Sharov, V., Kostyukovski, V., Prisyazhnoy, V., "Alterations in protein synthesis induced by actin skeleton depolimerization in 3T3 cells", Cell Biology International, v. 18, #5, 1994, p.391, Abstract.

3. Sklyarova, T.V. and Denisenko, O.N. "Proteolytic modification of rat lymphocyte actin in response to restraint stress", Cell Biology International, v.18, #5, 1994, Abstract, p.564.

4. T.Sklyarova, V. Sharov, A. Ben-Ze'ev, O. Denisenko. "Alterations in Protein Synthesis in 3T3 Cells Induced by C2-toxin", Meeting on Translational Control, Cold Spring Harbour, August 24-August 28, 1994, Abstract, p.217.

5. Bershadsky, A.D., Gluck, U., Denisenko, O.N., Sklyarova, T.V., Spector, I., Ben-Ze'ev, A. "The Actin Assembly Status Regulates Actin and Vinculin Expression by a Feedback Loop", J. Cell Science, in press.

6. T. Sklyarova, V. Kostyukovski,' V. Sharov, V. Prisyazhnoy and O. Denisenko, "Alterations in Protein Synthesis Induced by C2 Toxin in 3T3 Cells", FEBS Lett., in press.

29.IS.94 г. ЗПК.6427Р. Тир.TOO экз. Уч.-изд.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в ОКТЛ ЛИ! Р\Я

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Склярова, Татьяна Вадимовна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Введение

2.2. Деградация мРНК и экспрессия генов

2.2.1. Деградация мРНК и экспрессия генов домашнего хозяйства" (housekeeping)

2.2.2. Регуляция стабильности гистоновой мРНК

2.2.3. Концентрация тубулиновой мРНК регулируется посттранскрипционно

2.2.4. Концентрация мРНК трансферинового рецептора регулируется, отчасти на уровне деградации мРНК

2.2.5. Скорость деградации некоторых мРНК флуктуирует при смене скорости клеточного роста

2.3. Скорость деградации некоторых мРНК модулируется внешними факторами

2.3.1. Стабильность мРНК белков теплового шока

2.3.2. Гормоны и ростовые факторы модулируют стабильность многих мРНК

2.3.3. Воспалительный ответ и изменения стабильности мРНК

2.3.4. Вирусные инфекции могут воздействовать на время полу жизни мРНК

2.4. Роль распада мРНК в развитии и диференцировке клеток

2.5. Последовательности, определяющие скорость деградации мРНК

2.5.1. 5'-Ken структура и стабильность мРНК

2.5.2. 5'-UT последовательность и стабильность

2.5.3. У-нетранслируемый район (5'UTR) и необходимость в трансляции для деградации

2.5.4. Дестабилизирующие последовательности открытой рамки считывания

2.5.5. Преждевременная терминация и дестабилизация мРНК

2.5.6. Дестабилизирующие элементы, расположенные в З'-UTR последовательности

2.5.1. Поли(А) последовательности и ее роль в деградации мРНК

2.6. Пути деградации мРНК и трансдействующие факторы

2.6.1. Деаденилирование предшествует распаду многих эукариотических мРНК

2.6.2. Поли(А) независимая деградация мРНК

2.6.3. Родственны ли эти пути?

Введение Диссертация по биологии, на тему "Авторегуляция синтеза актина"

Актин является самым мажорным белком в большинстве эукариотических клеток. Его мономеры (G-актин) способны полимеризоваться, образуя филаменты (F-актин). Актиновые филаменты (микрофиламенты) вместе с микротрубочками и промежуточными филаментами формируют клеточный скелет.

Изменения в организации актинового скелета играют существенную роль в осуществлении многочисленных клеточных процессов, включая подвижность клетки, морфогенез тканей, экзоцитоз и передачу сигнала от мембраны в ядро (Cooper, 1991; Bray, 1992). Реорганизации в сети микрофиламентов осуществляются, как правило, путем сборки и разборки актиновых филаментов, и контролируются внешними сигналами. Таковыми являются хемотактические стимулы (Howard и Meyer, 1984), ростовые факторы (Paves et al., 1990), адгезия к внеклеточному матриксу (Hartwig, 1992), и агенты, воздействующие на пути проведения сигналов, такие как форболовые эфиры и СЗ ботулинический токсин (Sheterline et al., 1986; Ridley et al., 1993). Мишенями регуляторных воздействий могут служить как сам актин (Howard et al., 1993), так и актин-связывающие белки, регулирующие события полимеризации-деполимеризации микрофиламентов, гелеобразования и т.п. (Forscher, 1989; Morgan et al., 1993).

Считается, что для обеспечения быстрой сборки актиновых филаментов в ответ на внешние стимулы клетки содержат значительное количество неполимеризованного, мономерного актина. G- актин сохраняется в клетке в комплексах со специфическими белками, таким образом, предотвращая спонтанную полимеризацию актина.

Предполагается, что для обеспечения быстрых изменений в актиновом скелете, стимулированных внешними сигналами, количество G-актина должно оставаться постоянным для компенсации его потерь во время полимеризации. Поэтому вполне вероятно существование специального механизма обратной связи, который бы связывал количество мономерного актина в клетке с его синтезом, и возможно, синтезом некоторых актин-ассоциированных белков.

Очевидным подходом для проверки этой гипотезы является изучение экспрессии актина в клетках, где изменено количество G-актина. Предварительные результаты, полученные с использованием этого подхода, согласуются с предлагаемой гипотезой регуляции по принципу обратной связи. Было показано, что обработка фибробластов фаллоидином, агентом, стабилизирующим актиновые филаменты и стимулирующим полимеризацию актина (Wieland, 1977) уменьшает количество G-актина и приводит к увеличению количества мРНК актина и стимуляции синтеза актина (Serpinskaya et al., 1990). С другой стороны, были получены данные о том, что С2-токсин из Clostridium botulinum, который ADP-рибозилирует мономерный актин и этим предотвращает его полимеризацию (Aktories, 1990), ингибирует синтез актина (Reuner et al., 1991; Serpinskaya et al., 1991).

В этих работах, хотя и указывавших на существование механизма авторегуляции синтеза актина, не было поставлено несколько важных вопросов, касающихся данной гипотезы. Во-первых, количественная зависимость синтеза актина от соотношения мономерного актина к полимерному (G/F) не была исследована. Во-вторых, С2-токсин, как известно, вызывает изменения не только в О/Р соотношении актина, но и в клеточной морфологии, индуцируя арборизацию ламеллярной части клетки и округление клеточного тела. Ранее было убедительно показано, что изменения в клеточной морфологии и прикрепленности к субстрату, могут индуцировать изменения в экспрессии цитоске летных белков (Веп-2е'еу, 1986, 1991). Поэтому необходимо было определить, являются ли изменения в синтезе актина следствием пертурбаций в клеточной морфологии или же следствием изменения количества мономерного актина. В-третьих, не было исследовано, на каком уровне экспрессии генов осуществляется О/Р-зависимая регуляция экспрессии актина.

В данной работе, используя С2-токсин, мы получили количественные данные о зависимости между степенью полимеризованности актина и скоростью его синтеза. Мы показали, что изменения в синтезе актина не являются следствием нарушения клеточной морфологии, а коррелируют с количеством О-актина в клетках. Мы обнаружили, что регуляция синтеза актина осуществляется посредством регуляции стабильности его мРНК. И наконец, было определено, что увеличение соотношения О/Т актина приводит к изменениям в экспрессии актин-связывающих белков: винкулина, тропомиозина и аннексина-1. На основании полученных данных нами выдвинуто предположение о существовании О/Е-актин-зависимого регуляторного механизма, координирующего синтез актина и ключевых белков, ассоциированных с микрофиламентной сетью.

2. Обзор литературы

Скорость, с которой синтезируется определенный белок в единицу времени, зависит от количества его мРНК и эффективности, с которой эта мРНК транслируется. Количество мРНК, в свою очередь, зависит от скоростей ее синтеза, сплайсинга и процессинга, транспорта в цитоплазму и деградации. Этот обзор посвящен роли распада мРНК в регуляции экспрессии генов млекопитающих.

Регуляция стабильности матричной РНК у эукариот 2.1. Введение

Одним из механизмов регуляции экспрессии генов во всех организмах является контроль концентрации индивидуальных транскриптов генов в цитоплазме. Количество определенной мРНК может значительно флуктуировать в процессе клеточного роста, дифференцировки и адаптации к новым условиям внешней среды. Это является результатом изменений в транскрипции, РНК-процессинге, транспорте и распаде мРНК. За последние годы получено много данных о регуляции синтеза мРНК, но совсем немного известно о механизмах, которые контролируют ее деградацию. Тем не менее, проведенные исследования обнаружили, что экспрессия генов бактерий и, в большей степени, млекопитающих может модулироваться путем изменения стабильности мРНК (Ве1а8со и Higgins 1988; Вгауегтап, 1987).

Хотя уровень мРНК в равновесном состоянии является отражением скорости ее синтеза и распада, время полужизни большинства мРНК, по-видимому, выступает основной де-терминантой их относительного содержания в клетке. Чаще всего наблюдается большая корреляция между количеством транскрипта и тем, как долго он присутствует в цитоплазме, чем тем, насколько быстро он синтезируется. Время полу жизни задает временной интервал, необходимый для достижения нового равновесного состояния после изменения скорости транскрипции. Чем короче время полужизни, тем скорее устанавливается новое равновесное состояние (Hargrove и Schmidt, 1989). Время полужизни большинства мРНК определяется комплексом взаимодействий, которые зависят от первичной и вторичной структуры мРНК, скорости ее трансляции, а также от места локализации в цитоплазме. Конечно, время полужизни зависит также от типа и количества рибонуклеаз, РНК-связывающих белков и регуляторных факторов в клетке. Активность этих компонентов, в свою очередь, может варьировать в зависимости от скорости роста или в процессе дифференцировки клетки.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Склярова, Татьяна Вадимовна

4. Выводы

1. Исследована взаимосвязь между скоростью синтеза актина и его организацией в клетке. Показано, что: а) деполимеризация актина под действием С2 токсина приводит к подавлению его синтеза, что сопровождается снижением концентрации актиновой мРНК; б) уменьшение количества актиновой мРНК в клетках является результатом ее дестабилизации; в) изменение клеточной формы, вызванное обработкой токсином, не является первичной причиной эффекта на синтез актина.

2. Изучено влияние деполимеризации микрофиламентов на синтез актин-связывающих белков. Обнаружено, что существует координирование экспрессии актина и ассоциированных с микрофиламентнами белков, винкулина, тропомиозина и аннексина-I.

3. Показано, что мономеризация актина приводит к: а) подавлению синтеза винкулина и тропомизина и снижению концентрации соответствующих им мРНК; б) индукции синтеза аннексина-1 и небольшой группы белков за счет активации трансляции их мРНК.

4. Изучено влияние хронического иммобилизационного стресса на состояние актина в лимфоцитах крыс. Обнаружено, что стресс индуцирует деполимеризацию, Са2+-зависимый специфический протеолиз и супрессию синтеза актина.

Благодарности

Я выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю Олегу Денисенко за предоставление темы, повседневное внимание, советы и преподаную школу научного поиска.

Выражаю искреннюю признательность Петру Симоненко за помощь в выполнении некоторых экспериментов, рисунков и оформлении текста данной работы, а также за дружескую поддержку.

Глубоко благодарна Льву Павловичу Овчинникову и всему коллективу лаборатории регуляции биосинтеза белка за теплое отношение и каждодневную помощь.

Хочу поблагодарить также проф. Жоела Вандекеркхове из Государственного Университета г. Гента в Бельгии за предоставленую возможность выполнения некоторых экспериментов в его лаборатории и обсуждение результатов.

Благодарю Людмилу Петровну Волынкину и Андрея Чернявского за фотографическое оформление результатов моей работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Склярова, Татьяна Вадимовна, Пущино-на-Оке

1. Adams, L., Tomasselli,, A., Robbins, P., Moss, В., and Heinrikson, R. (1992) HIV-1 protease cleaves actin during acute infection of human T-lymphocytes. AIDS Res. Hum. Retroviruses 8, 291-295.

2. Adams S.A., Nakagava, А.Т., Swanson, M.S., Woodruff, Т.К., and Dreyfuss, G., (1986) mRNA polyadenylate-binding protein: gene isolation, sequencing and identification of a ribonucleoprotein consensus sequence, Mol. Cell. Biol., 6, 2932-2938.

3. Adams, J.M., Harris, A.W., Pinkert, C.A., Corcoran, L.M., Aleksander, W.S., Cory, S., Palmiter, R.D., and Brinster, R.L. (1985) The c-myc oncogene driven by immunoglobulin enhancers induces lymphoid malignancy in transgenic mice, Nature, 318, 533-536.

4. Adesnik, M. and Darnell, J.E. (1972) J.Mol.Biol., 67, 397-405.

5. Aharon, Т., and Schneider, R.J. (1993) Selective destabilization of shortlived mRNAs with the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor AU-rich 3'noncoding region is mediated by a cotranslational mechanism. Mol. Cell. Biol. 13 1971-1980.

6. Aktories, K. (1990). ADP-ribosylation of actin. J. Muscle Res. Cell Motil. 11, 95 97.

7. Aktories, K., Barmann, M., Ohishi, I., Tsuyama, S., Jacobs, K.H. and Habermann, E. (1986). Botulinum C2 toxin ADP-ribosylates actin. Nature 322, 390 392.

8. Aktories, K., Braun, S, Rosener, S., Just, I., Hall, A. (1989) The rho gene product expressed in E. coli is a substrate for botulinum ADP-ribisyltransferase C3. Biochem. Biophys. Res. Commun. 158, 209-213.

9. Almendral, J.M., Sommer, D., MacDonald-Bravo, R., (1988) Complexity of the early genetic response to growth factors, Mol. Cell. Biol., 8, 21402147.

10. Alterman, R.-B.M., Ganguly, S., Schulze, D.H., Marzluff, W.F., Schildkraut, C.L., and Skoultchi, A.I., (1984) Cell cycle regulation of mouse H3 histone mRNA metabolism, Mol.Cell.Biol., 4, 123-130.

11. Aullo, P., Giry, M., Olsnes, S., Popoff, M., Kocks, C., and Boquet, P. (1993) A chimeric toxin to study the role of the 21 kDa GTP binding protein rho in the control of actin microfilament assembly. EMBO J. 12, 921-931.

12. Aviv, H., Voloch, Z., Bastos, R., and Levy, S. (1976) Biosynthesis and stability of globin mRNA in cultured erythroleukemic friend cells. Cell 8, 495-503.

13. Aziz, N. and Munro, H.N. (1986) Both subunits of rat liver ferritin are regulated at a translational level by iron induction, Nucl.Acids Res., 14, 915-919.

14. Aziz, N., and Munro, H.N. (1987) Iron regulates ferritin mRNA translation through a segment of its 5' untranslated region. Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A., 84, 8478-8482.

15. Babich, A. and Nevins, J.R. (1981) The stability of early adenovirus mRNA is controlled by the viral 72 kD DNA binding protein, Cell, 26, 371378.

16. Babiss, L.E. and Ginsberg, H.S. (1984) Adenovirus type 5 early region 1 b gene product is required for efficient shutoff of host protein synthesis, J.Virol., 50, 202-209.

17. Bader, J.P., Hausman., F.A., and Ray, D.A. (1986) Intranuclear degradation of the transformation-inducing protein encoded by avian MC29 virus. J. Biol. Chem. 261, 8303-8310.

18. Bastow, K.F., Bouchard, J., Ren, X., and Cheng, Y. (1986) Synthesis of dihydrofolate reductase and metabolism of related RNA in methotrexate resistant human cell line infected with herpes simplex virus type 2, Virology, 149, 199-205.

19. Baumbach, L.L., Marashi, F., Plumb, M., Stein, G., and Stein, J. (1984) Inhibition of DNA replication coordinately reduces cellular levels of core and HI histone mRNAs: requirement for protein synthesis. Biochemistry 23, 1618-1623.

20. Baumbach, L.L., Stein,G.S., and Stein, J. (1987) Regulation of human histone gene expression: transcriptionsl and posttranscriptional control in the coupling of histone messenger RNA stability with DNA replication. Biochemistry 26, 6178-6183.

21. Bellas, R.E., Bendori, R. and Farmer, S.R. (1991). Epidermal growth factor activation of vanculin and bl integrin gene transcription in quiescent Swiss 3T3 cells. J. Biol. Chem. 266, 12008-12014.

22. Ben-Ze'ev, A. (1986). The relationship between cytoplasmic organization, gene expression and morphogenesis. Trends Biochem. Sci. 11, 478-481.

23. Ben-Ze'ev, A. (1990). Application of two-dimentional gel electrophoresis in the study of cytoskeletal protein regulation during growth activation and differentiation. Electrophoresis 11, 191-200.

24. Ben-Ze'ev, A. (1991). Animal cell shape changes and gene expression. BioEssays 13, 207-212.

25. Ben-Ze'ev, A., Farmer, S.R. and Penman, S. (1979). Mechanisms of regulating tubulin synthesis in cultured mammalian cells. Cell 17, 319-325.

26. Ben-Ze'ev, A., Reiss, R., Bendori, R. and Gorodecki, B. (1990). Transient induction of vinculin gene expression in 3T3 fibroblasts stimulated by serum-growth factors. Cell Regul. 1, 621-636.

27. Benecke, B.J., Ben-Ze'ev, A., and Penman, S. (1978). The control of mRNA production, translation and turnover in suspended and reattached anchorage-dependent fibroblasts. Cell 14, 931-939.

28. Bernstein, P.L., Herrik, D.J., Prokipcak, R.D., and Ross, J. (1992) Control of c-myc mRNA half-life in vitro by a protein capable of binding to a coding region stability determinant. Genes Dev. 6, 642-654.

29. Borun, T.W., Gabrielli, F., Ajiro, K., Zweidler, A., and Baglioni, C. (1975) Further evidence of transcriptional and translational control of histon messenger RNA during the HeLa S3 cycle. Cell 4, 59-66.

30. Bray, D. (1992). In Cell Movement pp. 1-406. Garland, NY.

31. Brawerman, G. (1987) Determinants of messenger stability. Cell 48, 5-7.

32. Brett, J.G. and Tannenbaum, J. (1985). Cytochalasin D-induced increase in actin synthesis and content in a variety of cell types. Cell Biol. Int. Rep. 9, 723-730.

33. Brewer, G. (1991) An A+U-rich element RNA-binding factor regulates c-myc mRNA stability in vitro. Mol.Cell. Biol.ll, 2460-2466.

34. Brewer, G. and Ross, J. (1989) Regulation of c-myc mRNA stability in vitro by a labile destabilizer with an essential nucleic acid component. Mol. Cell. Biol., 1996-2003.

35. Brock, M.L. and Shapiro, D. J. (1983) Estrogen stabilizes vitellogenin mRNA against cytoplasmic degradation. Cell 34, 207-214.

36. Brock, M. L., and Shapiro, D. J. (1983a) Estrogene regulates the absolute rate of transcription of the Xenopus Laevis vitellogenin genes. J. Biol. Chem. 258, 5449-5454.

37. Brower, P.T., Gizang, E., Boreen, S. and Schultz, R. (1981) Biochemical studies of mammalian oogenesis: synthesis and stability of various classes of RNA during growth of the mouse oocyte in vitro. Dev. Biol. 86, 373-378.

38. Brown, A. (1993) mRNA translation and turnover: a cellular perspective on j their relationship. Trends in Cell Biol. 3, 180-183. Burdon, R. H. (1986) , Heat shock and the heat shock proteins. Eur. J. Biochem. 240, 313-318.

39. Burridge, K., Fath, K., Kelly, T., Nuckolls, G. and Turner, C. (1988). Focal adhesions: Transmembrane junctions between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Ann. Rev. Cell Biol. 4, 487-525.

40. Campisi, J., Gray, H.E., Pardee, A.B., Dean, M., and Sonenshein, G.E. (1984) Cell-cycle control of c-myc but not c-ras expression is lost following chemical transformation. Cell 36, 241-248.

41. Capasso, O. and Heintz, N. (1985) Regulated expression of mammalian histone H4 genes in vivo requires a trans-acting transcrition factor, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5622-5646.

42. Caponigro, G., Muhlrad, D., and Parker, R. (1993) A small segment of the MATal transcript promotes mRNA decay in yeast: a stimulatory role for rare codons. Mol. Cell. Biol. 13, in press.

43. Caron, J., Jones, A.L., Rail, L.B. and Kirschner, M.W. (1985). Autoregulation of tublin synthesis in enucleated cells. Nature 317, 648-650.

44. Casey, J. L., Heintz, M.W., Koeller, D. M., Caughman, S.W., Roualt, T.A., Klausner, R.D., and Harford, J. B. (1988) Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science 240, 924-927.

45. Caughman, S.W, Hentze, M. W., Rouault, T.A., Harford, J. B., and Klasner, R.D. (1988) The iron-responsive element is the single element responsible for iron-dependent translational regulation or ferritn biosynthesis. J. Biol. Chem. 263, 19048-19054.

46. Cervera, M., Dreyfuss, G. and Penman, S. (1981) Messenger RNA is translated when associated with the cytoskeletal framework in normal and VSV-infected HeLa cells. Cell 23, 113-116.

47. Char din, P. Boquet, P. Maduale, P., Popoff, M., Rubin, E., and Gill, D. (1989) The mammalian protein rhoc is ADP-ribosylated by Clostridium botulinum exoenzyme C3 and affects actin microfilaments in Vero cells. EMBO J. 8, 1087-1092.

48. Chen, C.-Y.A., You, Y., and Shyu, A.-B. (1992) Two cellular proteins bind specifically to a purine-rich sequence necessary for the destabilization function of a c-fos protein-coding region determinant of mRNA instability. Mol.Cell. Biol. 12, 5748-5757.

49. Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159.

50. Clark-Adams, C.D., Norris, D., Osley, M.A., Fassler, J.S. and Winston, F. (1988) Changes in histone gene dosage alter transcription in yeast. Genes Dev. 2, 150-156.

51. Cleveland, D. W. (1977) Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis. J.Biol. Chem. 252, 11021106.

52. Cleveland, D. W. (1987) The multitubulin hypothesis revisited: what have we learned ? J Cell Biol. 104, 381-388.

53. Cleveland, D.W. (1988) Autoregulated instability of tubulin mRNAs: A novel eukaryotic regulatory mechanism. Trends Biochem. Sci. 13, 339-343.

54. Cleveland, D.W., Lopata, M.A., Sherline, P. and Kirschner, M.W. (1981). Unpolymerized tubulin modulates the level of tubulin mRNA. Cell 25, 537546.

55. Cole, M.D. (1986) The c-myc oncogene: its role in transformation and differentiayion. Annu. Rev. Genet. 20, 361-378.

56. Condeelis, J. (1993a). Life at the leading edge: The formation of cell protrusions. Ann. Rev. Cell Biol. 9, 411-444.

57. Condeelis, J. (1993b). Understanding the cortex of crawling cells: Insights form Dictyostelium. Trends Cell Biol. 3, 371-376.

58. Cooper, J.A. (1987). Effects of cytochalasins and phalloidin on actin. J. Cell Biol. 105, 1473-1478.

59. Cooper, J.A. (1991). The role of actin polymerization in cell motility. Ann. Rev. Physiol. 53, 585-605.

60. Coppola, T. and Morgan, J.I. (1986) Constitutive c-myc oncogene expression blocks mouse erythroleukemia cell differentiation but not commitment. Nature 320, 760-764.

61. Couw, M., Brenner, S.L., Spector, I. and Korn, E.D. (1987). Inhibition of actin polymerization by latrunculin A. FEBS Lett. 213, 316-318.

62. Curran, T. and Morgan, J.I. (1986) Barium modulates c-fos expression and post-translational modification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 85218525.

63. Dani, C. (1984). Characterization of the transcription products of glycerolaldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene in HeLa cells. Eur. J. Biochem. 145, 299-304.

64. Dani, C., Mechti, N., Piechaczyk, M., Lebleu, B., Jeanteur, P., and Blanchard, J.M. (1985) Increased rate of degradation of c-myc mRNA in interferon -treated Daudi cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 4896-4900.

65. DasGupta, B., and Tepp, W. (1993) protease activity of botulinum neurotoxin type E and its light chain : cleavage of actin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190, 470-474.

66. Decker, C. J., and Parker, R. (1993) A pathway for mRNA turnover in yeast:evidence for a requirement for deadenilation. Genes Dev. 7, 1632-1643.

67. Decker, C and Parker, R. (1994) Mechanisms of mRNA degradation in eukaryotes. TIBS 19, 336-340.

68. Demma, M., Warren, V., Hock, R., Dharmawardhane, S. and Condeelis, J. (1990). Isolation of an abundant 50,000-dalton actin filament bundling protein from Dictiostelium amoeba. J. Biol.Chem. 265, 2286-2291.

69. Devreotes, P.N. and Zigmond, S.H. (1988). Chemotaxis in eukaryotic cells: A focus on leukocytes and Dictiostelium. Ann. Rev. Cell Biol. 4, 649-686.

70. Diamond, D. J. and Goodman, H.M. (1985) Regulation of growth hormon messenger RNA synthesis by dexamethasone and triodothyronine: transcriptional rate and mRNA stability changes in pituitary tumor cells.J. Mol. Biol. 81, 41-46.

71. DiDomenico, B.J., Bugaisky, G.E. and Lindquist, S. (1982) The heat-shock response is self-regulated at both the transcriptional and postranscriptional levels. Cell 31, 593-599.

72. Dike, L.E. and Farmer, S.R. (1988). Cell adhesion induces expression of growth-associated genes in suspension-arrested fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6792-6796.

73. Dmitrovski, E., Kuehl, W. M., Hollis, G.F., Krisch, I, R., Bender, T.P., and Segal, S. (1986) Expression of a transfected human c-myc oncogene inhibits differentiation of a mouse erythroleukemia cell line. Nature 322, 748-752.

74. Farmer, S.R., Wan, K.M., Ben-Ze'ev, A. and Penman, S. (1983). Regulation of actin mRNA levels and translation responds to changes in cell configuration. Mol. Cell. Biol. 3, 182-189.

75. Fechheimer, M. and Zigmond, S.H. (1993). Focusing on unpolymerized actin. J. Cell Biol. 123, 1-5.

76. Fenwick, M.L. and Claek, J. (1982) Early and delayed shutoff of host protein synthesis in cells infected with herpes simplex virus. J.Gen. Virol. 61, 121-127.

77. Fenwick, M. L. and McMenamin, M.M. (1984) Early virion-associated suppression of cellular protein synthesis by herpes simplex virus is accompanied by inactivation of mRNA. J.Gen. Virol. 65, 1225-1232.

78. Forscher, P. (1989). Calcium and polyphosphoinositide control of cytoskeletal dynamics. Trends Neurosci. 12, 468-474.

79. Fujita, T., Shibuya, H., Ohashi, T., Yamanishi, K., and Taniguchi, T. (1986) Regulation of human interleukin-2 gene: functional DNA sequences in the 5' flanking region for the gene expression in activated T lymphocytes. Cell 46, 401-407.

80. Furuichi, Y., LaFiandra, A., and Shatkin, A. (1977) 5'-Terminal structure and mRNA stability. Nature 266, 235-238.

81. Garrels, J.I. (1989). The QUEST system for quantitative analysis of two-dimentional gels. J. Biol. Chem. 264, 5269-5282.

82. Geiger, B., Ayalon, O., Ginsberg, D., Volberg, T., Rodrhguez Fernsndez, J.L., Yarden, Y. and Ben-Ze'ev, A. (1992). Cytoplasmic control of cell-adhesion. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 57, 631-642.

83. Geiger, B. and Ginsberg, D. (1991). The cytoplasmic domain of adherens-type junctions. Cell Motil. Cytoskel. 20, 1-6.

84. Gick, O., Kramer, A., Vasserot, A., and Birnstiel, M.L. (1987) Heat-labile regulatory factor is required for 3'processing of histone precursor mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 8937-8941.

85. Gluck, U., Rodrhguez Fernsndez, J.L., Pankov, R. and Ben-Ze'ev, A. (1992). Regulation of adherens junction protein expression in growth-activated 3T3 cells and in regenerating liver. Exp. Cell Res. 202, 477-486.

86. Gordon, D.A., Shelness, G.S., Nicosia, M., and Williams, D.L. (1988) Estrogen-induced destabilization of yolk precusor protein mRNAs in avian liver. J. Biol. Chem. 263, 2625-2631.

87. Graves, R.A. and Marzluff, W.F. (1984) Rapid reversible changes i the rate of histone gene transcription and histone mRNA levels in mouse myeloma cells. Mol. Cell. Biol. 4, 351-357.

88. Green, L. L., Schroeder, M. M., Diggins, M. A., and Dove, W. F. (1987) Developmental regulation and identification of an isotype encoded by altB, an alpha tubulin locus in Phisarum polycefalum. Mol. Cell. Biol. 7, 33373343.

89. Greenberg, J. R. and Perry, R. P. (1972) J. Mol. Biol. 72, 91-97. Greenberg, M.E. and Ziff, E.B. (1984). Stimulation of mouse 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature 313, 433-437.

90. Hayward, M. A. and Shapiro, D. J. (1981) A middle-affinity estrogen-specific binding protein in livers of vitellogenic and nonvitellogenic Xenopus laevis. Dev, Biol. 88, 333-339.

91. Hereford, L. M., Osley, M. A., Ludwig, J. R., and McLaughlin, C. S. (1981) Cell-cycle regulationof yeast histone mRNA. Cell 24, 367-374.

92. Herman, B., and Pledger, W.J. (1985). Platelet-derived growth factor-induced alterations in vinculin and actin distribution in Balb/c-3T3 cells. J. Cell Biol. 100, 1031-1040.

93. Herrick, D., Parker, R., and Jacobson, A. (1990) Identification and comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 10, 2269-2284.

94. Hershka, A. and Ciechanover, A. (1982) Mechanismof intracellular portein breakdown. Ann. Rev. Biochem. 51, 335-351.

95. Hesketh, J.E. and Pryme, I.F. (1991) Interaction between mRNA, ribosomes and the cytoskeleton. Biochem. J. 277,1-10.

96. Hill, M.A. and Gunning, P. (1993). Beta and gamma actin mRNAs are differentially located within myoblasts. J. Cell Biol. 122, 825-832.

97. Honess, R. W. and Roizman, B. (1974) Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis. I. cascade regulation of the synthesis of three groups of viral porteins. J. Virol. 14, 8-14.

98. Hoock, T.C., Newcomb, P.M. and Herman, I.M. (1991). b actin and its mRNA are localized at the plasma membrane and the regions of movingcytoplasm during the cellular response to injury. J. Cell Biol. 112, 653664.

99. Howard, P.K., Sefton, B.M. and Firtel, R.A. (1993). Tyrosine phosphorylation of actin in Dictiostelium associated with cell-shape changes. Science 259, 241-244.

100. Ho ward, T.H., and Meyer, W.H. (1984). Chemotactic peptide modulation of actin assembly and locomotion in neutrophils. J. Cell Biol. 98, 1265-1271.

101. Jinno, Y., and Merlino, G. T. and Pastan, I. (1988) A novel effect of EGF on mRNA stability. Nucl. Acid. Res. 16, 4957-4961.

102. Jones, T. and Cole, M. (1987) Rapid cytoplasmic turnover of c-myc mRNA: requirement of the 3'-untranslated sequences. Mol. Cell. Biol. 7, 4513-4520.

103. Kabnick, K. S., and Housman, D.E. (1988) Determinants that contribute to cytoplasmic stability of human c-fos and b-globin mRNAs are located at several sites in each mRNA. Mol. Cell. Biol. 8, 3244-3250.

104. Kagan, R., Bratescu, D.V., Jonasson, O., Matsuda, T., and Teodorescu, M. (1989) The relationship between the persentage of circulating B cells,corticosteroid levels, and other immunologic parameters in termally injured patients. J. Trauma 29, 208-213.

105. Kearsey, S., and Kipling, D. (1991) Recombination and RNA processing: a common strand? Trends Cell Biol. 1, 110-112.

106. Kenna, M., Stevens, A., McCammon, M., and Douglas, M.G. (1993) An essential gene with homology to the exonuclease-encoding XRN1/KEM1 also encodes a protein with exoribonuclease activity. Mol.Cell. Biol. 13, 341-350.

107. Khalili, K. and Weinmann, R. (1984) Shutoff of actin biosynthesis in adenovirus serotype-2-infected cells. J. Mol. Biol. 175, 453-460.

108. Khalili, K. and Weinmann, R. (1984a) Actin mRNAs in HeLa cells. Stabilization after adenovirus infection. J. Mol. Biol. 180, 1007-1005.

109. Kindy, M. S. and Sonnenshein, G. E. (1986) Regulation of oncogene expression in cultured aortic smooth muscle cells. Post-transcriptional control of c-myc mRNA. J. Biol. Chem. 261, 12865-12872.

110. Koeller, D.M., Horowitz, J.A., Casey, J.L., Klausner, R.D., and Harford, J.B. (1991) Translation and the stability of mRNAs encoding the transferrin receptor and c-fos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7778-7782.

111. Larimer, F.W., Hsu, C., Maupin, M., and Stevens, A. (1992) Characterization of the XRN1 gene encoding a 5'-3' exoribonuclease: sequence data and analysis of disparate protein and mRNA levels of gene-disrupted yeast cells. Gene 120, 51-57.

112. Laso, M.R.V., et al. (1993) Inhibition of translational initiation in the yeast Saccharmyces cerevisiae as a function of the stability and position of hairpin structures in the mRNA leader. J. Biol.Chjem. 268, 6453-6462.

113. Lawrence , J.B. and Singer, R.H. (1986). Intracellular localization of messenger RNAs for cytoskeletal proteins. Cell 45, 407-415.

114. Lazaradis, I. A., Babich, A., and Nevims, J. R. (1988) Role of the adenovirus 72-kDa DNA binding protein in the rapid decay of early adeno mRNA. Virology, 165, 438-444.

115. Lee, S.W. et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 1204-1208.

116. Leeds, P., Peltz, S. W., Jacobson, A., and Culbertson, M.R. (1991) The product of the yeast UPF1 gene is required for rapid turnover of mRNAs containing a premature translational termination codon. Genes Dev. 5, 23032314.

117. Leeds, P., Wood, J.M., Lee, B.-S., and Culbertson, M.R. (1992) Gene products that promote mRNA turnover in Saccharomyces cerevisiae. Mol.Cell.Biol. 12, 2165-2177.

118. Lindsten, T., June, C. H., Ledbetter, J. A., Stella, G., and Thompson, C. B. (1989) Regulation of limphokine messenger RNA stability by a surface-mediated T cell activation pathway. Science 244, 339-343.

119. Lloyd, C., Schevzov, G. and Gunning, P. (1992). Transfection of non-muscle b- and g-actin genes into mioblasts elicits different feedback regulatory responses from endogenous actin genes. J. Cell Biol. 117, 787797.

120. Lowell,J.E., Runder,D.Z., and Sachs, A.B. (1992) 3'-UTR-dependent deadenylation by the yeast poly(A) nuclease. Genes Dev. 6, 2088-2099.

121. Martin, P. and Lewis, J. (1992). Actin cables and embryonic wound healing. Nature 360, 179-181.

122. Mellstrom, K., Heldin, C.-H. and Westermark, B. (1988). Induction of circular membrane ruffling on human fibroblasts by platelet-derived growth factor. Exp. Cell Res. 177, 347-359.

123. Moor, M. A. and Shenk, T. (1988) The adenovirus tripartite leader sequence can alter nuclear and cytoplasmic metabolism of a non-adenovirus mRNA with infected cells. Nucl.Acids Res. 16, 2247-2252.

124. Morgan, T.E., Lockerbie, R.O., Minamide, L.S., Browning, M.D. and Bamburg, J.R. (1993). Isolation and caracterization of regulated form of actin depolymerization factor. J. Cell Biol. 122, 623-633.

125. Morgan, J.I. and Curran, T. (1986) Role of ion flux in the control of c-fos expression. Nature 322, 552-555.

126. Morris, A. and Tannenbaum, I. (1980). Cytochalasin D does not produce net depolymerization of actin filaments in HEp-2 cells. Nature 287, 637-639.

127. Muhlrad, D., and Parker, R. (1992) Mutations affecting stability and deadenilation of the yeast MFA2 transcript. Genes Dev. 6, 2100-2111.

128. Mullner E. W. and Kuhn, L.C. (1988) A stem-loop in the 3' untranslated region mediates iron-dependent regulation of transferrin receptor mRNA stability in the cytoplasm. Cell 53, 815-822.

129. Nachmias, V.T. (1993). Small actin-binding proteins: the b-thymosin family. Curr. Opin. Cell Biol. 5, 56-62.

130. Nir, U., Cohen, L., and Revel, M. (1984) A human IFN-beta 1 gene deleted of promoter sequences upstream from TATA box is controlled post-transcriptionally by dsRNA. Nucl. Acids Res. 12, 6979-6983.

131. Ohishi, I., Iwasaki, M. and Sakaguchi, G. (1980) Infect. Immun. 30, 668673.

132. Paek, I. and Axel, R. (1987) Glucocorticoids enhance stability of human growth homone mRNA. Mol. Cell. Biol. 7, 1496-1503.

133. Parker, R., and Jacobson, A. (1990) Translation and a 42-nucleotide segment within the coding region of the mRNA encoded by the MATal gene are involved in promoting rapid mRNA decay in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 2780-2784.

134. Paynton, B., Rempel, R., and Bachvarova, R. (1988) Changes in the state of adenylation and time course of degradation of maternal mRNAs during oocyte maturation and early embryonic development in the mouse. Dev. Biol. 129, 304-311.

135. Paves,H., Neuman, T., Metsis, M. and Saarma, M. (1990). Nerve growth factor-induced rapid reorganization of microfilaments in PC12 cells: Possible roles of different second messengers systems. Exp. Cell Res. 186, 218-226.

136. Peltz, S.W., Brewer, G., Bernstein, P., Hart, P.A., and Ross, J. (1991) Regulation of mRNA turnover in eucaryotic cells. Crit. Rev. Euc.Gene Expr. 1, 99-126.

137. Peltz, S.W., Brown, A.H., and Jacobson, A. (1993) mRNA destabilization triggered by premature translational termination depends on at least three cis-acting elements and one trans-acting factor. Genes Dev. 7, in press.

138. Peltz, S.W., Donahue, J.L., and Jacobson, A. (1992) A mutation in the tRNA nucleatidyltransferase gene promotes stabilization of mRNA in Saccharamyces cerevisiae. Mol.Cell.Biol. 12, 5778-5784.

139. Peltz, S. W. and Ross, J. (1987) Autogenous regulation of histone mRNA decay by histone proteins in a cell-free system. Mol. Cell. Biol. 7, 43454351.

140. Pittenger, M.F. and Cleveland, D.W. (1985). Retention of autoregulatory control of tubulin synthesis in cytoplasts: Demonstration of a cytoplasmic mechanism that regulates the level of tubulin expression. J. Cell Biol. 101, 1941-1952.

141. Rao, K.M.K., Padmanabdhan, J. and Cohen, H.J. (1992). Cytochalasins induce actin polymerization in human leukocytes. Cell Motil. Cytoskel. 21, 58-64.

142. Reuner, K.H., Presek,P., Boschek, C.B. and Aktories, K. (1987). Botolinum C2 toxin ADP-ribosylates actin and disorganizes the microfilament network in intact cells. Eur. J. Cell 43, 134-140.

143. Reuner, K.H., Schlegel, K., Just, E and Katz, N. (1991). Autoregulatory control of actin synthesis in cultured rat hepatocytes. FEBS Lett. 286, 100104.

144. Ridley, A.J. and Hall, A. (1992) The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell 70, 389-399.

145. Ridley A.J., Paterson, H.F., Johnston, C.L., Diekman, D., Hall, A.1992) The small GTP-binding protein rac regulates growth factor-induced ruffling. Cell 70, 401-410.

146. Rijken, P.J., Haage, W.J., Henegouwen, P.M., Verkleij, A.J. and Boonstra, J. (1991). Epidermal growth factor induces rapid reorganization of the actin microfilament system in human A431 cells. J. Cell Sci. 100, 491-499.

147. Rodrhguez Fernsndez, J.L., Geiger, B., Salomon, D., Sabanay, I., Zoller, M. and Ben-Ze'ev, A. (1992a). Suppression of tumorigenicity in transformed cells following transfection with vinculin cDNA. J. Cell Biol. 119, 427- 438.

148. Rodrhguez Fernsndez, J.L., Salomon, D. and Ben-Ze'ev, A. (1992b). Overexpression of vinculin supresses cell motility in 3T3 cells. Cell Motil. Cytoskel. 22, 127-134.

149. Roos, F.J., Zimmerman, A., and Keller, H.U. (1987). Effect of phorbol myristate acetate and the chemotactic peptide fNLPNTL on shape and movement of human neutrophils. J. Cell Sci. 88, 399-406.

150. Sachs, A.B. (1990) The role of poly(A) in the translation and stability of mRNA. Curr.Opin.Cell Biol. 2, 1092-1098.

151. Sachs, A.B., and Davis, R.W.(1989) The poly(A) binding protein is required forpoly(A) shortening and 60S ribosomal subunit-dependent translation initiation. Cell 58, 857-867.

152. Sachs, A.B., and Deardorff, J.A. (1992) Translational initiation requires the PAB-dependent poly (A) ribonuclease in yeast. Cell 70, 961-973.

153. Sampath, P. and Pollard, T.D. (1991). Effects of cytochalasin, phalloidin, and pH on the elongation of actin filaments. Biochem. 30, 1973-1980.

154. Samstag, Y., Eckerskorn, C., Wesselborg, S., Henning, S., Wallich, R. and Meuer, S.C. (1994) Costimulatory signals for human T cell activation induce the nuclear translocatin of cofilin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 4494-4498.

155. Santos, G., Scott, G., Lee, M., Liu, E., and Benz, C. (1988) Estrogen-induced post-transcriptional modulation of c-myc proto-oncogene expression in human breast cancer cells. J. Biol. Chem. 263, 9565-9571.

156. Savant-Bhonsale, S., and Cleveland, D.W. (1992) Evidence for instability of mRNAs containing AUUUA motifs mediated through translation-dependent assembly of a >20S degradation complex. Genes Dev. 6, 19271939.

157. Schevzov, G., Lloyd, C., Hailstones, D. and Gunning, P. (1993). Differential regulation of tropomyosin organization and gene expression in response to altered actin gene expression. J. Cell Biol. 121, 811-821.

158. Segner, W.P. Shmidt,C.F., and Boltz, J.K. (1971) Appl. Microbiol. 22, 1017-1024.

159. Serpinskaya, A.S., Denisenko, O.N., Gelfand, V.I. and Bershadsky, A.D. (1990). Stimulation of actin synthesis in phalloidin-treated cells. FEBS Lett. 277, 11-14.

160. Serpinskaya, A.S., Denisenko, O.N., Gelfand, V.l. and Bershadsky, A.D. (1991). Autoregulation of actin synthesis. J. Muscle Res. Cell Motil. 12, 484.

161. Sheterline, P., Rickard, J.E., Boothroyed, B. and Richards, R.C. (1986). Phorbol ester induces rapid actin assembly in neutrophil leukocytes independently of changes in Ca i and pHi. J. Muscle Res. Cell Motil. 7, 405-412.

162. Shortle D., Haber, J., and Botstein, D. (1982) Lethal disruption of the yeast actin gene by integrative DNA transformation. Science 217, 371-373.

163. Shyu, A.-B., Greenberg, M.E., and Belasco, J.G. (1989) The c-fos transcript is targeted for rapid decay by two distinct mRNA degradation pathways. Genes Dev. 3, 60-72.

164. Shyu, A.-B., Belasco, J.G., and Geernberg, M.E. (1991) Two distinct destabilizing elements in the c-fos message trigger deadenylation as a first step in rapid mRNA decay. Genes Dev. 5, 221-231.

165. Singer,R. H. (1993) Spatial organization of mRNA within cells. J. Cell. Biochem. 52, 125-126.

166. Spector, I., Shochet, N.R., Kashman,Y. and Groweiss,A. (1983). Latrunculins: Novel marine toxins that disrupt microfilament organization in cultured cells. Science 214, 493-495.

167. Spector, I., Shochet, N.R., Blasberg, D. and Kashman,Y. (1989). Latrunculins- Novel marine macrolides that disrupt microfilament organization and affect cell growth: I. Comparison with cytochalasin D. Cell Motil. Cytoskel. 13, 127-144.

168. Stevens, A (1988) mRNA-decapping enzyme from Saccharamyces cerevisiae: purification and unique substrate specificity for long RNA chains. Mol.Cell.Biol. 8, 2005-2010.

169. Stossel, T.P. (1989). From signal to pseudopod. How cells control cytoplasmic actin assembly. J. Biol. Chem. 264, 18261-18264.

170. Stossel, T.P. (1993). On the crawling of animal cells. Science 260, 10861094.

171. Sundell, C.L. and Singer, R.H. (1991). Requirement of microfilaments in sorting of actin messenger RNA. Science 253, 1257-1277.

172. Taneja, K.L., Lifshitz, L.M., Fay, F.S. and Singer, R.H. (1992). Poly(A)RNA codistribution with microfilaments: evaluation by in situ hybridization and quantitative digital imaging microscopy. J. Cell Biol. 119, 1245-1260.

173. Tannenbaum, J. and Godman, G.C. (1983). Cytochalasin D induces increased actin synthesis in HEp-2 cells. Mol. Cell. Biol. 3, 132-142.

174. Theodorakis, N.G. and Cleveland, D.W. (1992). Physical evidence for cotranslational regulation of b-tubulin mRNA degradation. Mol. Cell. Biol. 12, 791-799.

175. Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.

176. Urlaub, G., Mitchell, P., Ciudac, C., Chasin, L. (1989) Nonsense mutations inthe dihydrofolate reductase gene affect RNA processing. Mol. Cell. Biol. 9, 2868-2880.

177. Vandekerckhove, J., Schering, B., Barmann, M. and Aktories, K. (1988). Botujinum C2 toxin ADP-ribosylates cytoplasmic beta/gamma- actin in arginine 177. J. Biol. Chem. 263, 696-700.

178. Vandekerckhove, J., and Weber, K. (1978) Actin-amino acid sequences. Comparison of actins from calf thymus, bovine brain, and SV40-transformedmouse 3T3 cells with rabbit skeletal muscle actin. Eur. J. Biochem. 90, 451462.

179. Volloch, V., Schweitzer, B., and Rits, S. (1987) Messenger RNA changes during differentiation of murine erytholeukemia cell. Exp. Cell. Res. 173, 38-44.

180. Vreken, P., Buddenlmeijer, N. and Raue, H.A. (1992) A cell-free extract from yeast cells for studying mRNA turnover. Nucl. Acids Res. 20, 25032510.

181. Wegner, A. and Aktiries, K. (1988) ADP-ribosylated actin caps the barbed ends of actin filaments. J. Biol.Che. 263, 13739-13742.

182. Wehland, J., Osborn, M. and Weber, K. (1977). Phalloidin-induced actin polymerization in the cytoplasm of cultured cells interferes with cell locomotion and growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5613-5617.

183. Wieland, T. (1977). Modifications of actin by phallotoxins. Naturwiss. 64, 303-309.

184. Wigler, M.M. and Weinstein, EB. (1975). A preparative method for obtaining enucleated mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 63, 669-674.

185. Wyllie, A.H. (1980) Glucocorticoid-induced thymocyte apoptopsis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature 284, 555-556.

186. Yang, F., Demma, M., Dharmawardhane, S. and Condeelis, J. (1990). Actin regulates the protein synthetic activity of ABP-50, the EF-la of Dictiostelium. J. Cell Biol. Ill, 160a.

187. Yen, T.J., Gay, D.A., Pachter, J.S., and Cleveland, D.W. (1988) Autoregulated changes in stability of polyribosome-bound b-tubulin mRNAs are specified by the first thirteen translated nucleotides. Mol.Cell.Biol. 8, 1224-1235.

188. Yen, T.J., Machlin, P.S. and Cleveland, D.W. (1988). Autoregulated changes in stability of b-tubulin mRNAs by recognition of the nascent amino terminus of b-tubulin. Nature 334, 580-585.

189. Yoshida, K. and Katoh, A. (1972) Crystallin synthesis by chicken lens. Ill mRNA stabilization under in vitro culture conditions. Exp. Cell. Res. 71, 361-368.

190. Yoshida, H., Murachi, T., and Tsukahara, I. (1984) Degradation of actin and vimentin by calpain II, a calcium-dependent cystein proteinase, in bovine lens. FEBS Lett. 170, 259-262.