Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Автофлуоресцентная диагностика онкологических заболеваний гортани и глотки

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Автофлуоресцентная диагностика онкологических заболеваний гортани и глотки"

на иранах^т^|

0046И5ЫИ

Афонина Ольга Игоревна

АВТОФЛУОРЕСЦЕНТНЛЯ ДИАГНОСТИКА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГОРТАНИ И ГЛОТКИ

03.01.02 - биофизика 14.01.03 - болезни уха, горла и носа

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 о ИЮН 2010

Саратов- 2010

004605610

Работа выполнена на кафедре оториноларингологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава»

Защита состоится 17.06.2010 г. в 15.30 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.243.05 при ГОУ ВНО «Саратовский Государственный Университет им. Н.Г. Чернышевского» в 34 аудитории III корпуса СГУ.

по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО « Саратовский государственный университет им. М.Г. Чернышевского»

Научные руководители

доктор медицинских наук, проф. Мареев Олег Вадимович кандидат химических наук, Правдин Александр Борисович

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, проф. Шахов Л.В. доктор физ.-мат. наук, нроф. Ульянов С.С.

Ведущая организация

ГОУ BIIO «Самарский Государственный Медицинский Университет Росздрава»

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физ.-мат. наук, профессор B.J1. Дсрбов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последние годы онкологическая заболеваемость неуклонно расчет, возрастает и смертность от злокачественных новообразований. Рак гортани среди опухолей лор-органои составляет 12%-26% [-П1] Для выявления опухоли разрабатывается и внедряется множество новых диагностических методик. Рутинные диагностические методы обнаружения опухолей относятся к традиционным, то есть на уровне клеток, тканей и органов, однако в последнее время усилилось внимание к микроскопическим методам диагностики - на молекулярном уровне. Одним из таких методов является спектральный анализ. Благодаря высокой чувствительности, этот метод позволяет определить содержание различных метаболитов в тканях человека (хотя в условиях измерений in vivo абсолютную концентрацию веществ достаточно точно, как правило, определить не удается) и связать их присутствие с состоянием метаболизма в норме и патологии.

В нашем исследовании использовался один из методой микродиагностики -флуоресцентная спектроскопия. Флуоресцентная спектроскопия - неинвазивный, высокочувствительный, универсальный и относительно простой в применении метод, допускающий комбинированную диагностику и возможность работы в реальном времени без повреждения исследуемой ткани. Его использование в диагностике различных заболеваний обусловлено тем, что в процессе развития патологий происходят биохимические изменения в ткани, а, следовательно, меняется относительное содержание основных флуорофоров и хромофоров, изменяются морфологические и гистологические параметры ткани и, как результат, их вклад в общий наблюдаемый спектр флуоресценции ткани.

Изучение автофлуоресценции биообъектов используется для диагностики атеросклеротических изменений сосудов [J12], |ЛЗ]. Флуоресцентные исследования ткани миокарда позволяют установить тонус сердечной мышцы [JI4], Автофлуоресцентная спектроскопия применяется для мониторинга заживления ран и ожогов [Л5], многие работы посвящены изучению лазерной флуоресцентной спектроскопии кожи,

дифференциальной диагностике новообразований эпидермиса [ Л6]-[Л12], исследованиям тканей глаза |Л13], [Л 14], проводятся исследования в области оптических свойств злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта [Л 15], шейки матки [Л 16], [Л 17].

Вместе с тем, метод автофлуоресцентной диагностики широкого применения в медицинской практике пока не получил. В литературе недостаточно представлены данные по исследованиям оптических свойств злокачественных новообразований гортани и глотки человека. Цель исследования:

Повышение эффективности ранней диагностики и профилактики онкологических заболеваний гортани и глотки с помощью метода автофлуоресцентной диагностики.

Поставленная цель достигалась путем решения следующих задач:

1. Разработка лабораторно-клинического спектрального комплекса для регистрации УФ-индуцированпрй авгофлуоресцепции слизистой оболочки гортани и глотки.

2. Проектирование и создание устройства для реализации возможности точечного зондирования слизистой оболочки гортани (гортанная насадка на световод).

3. Разработка, на основе собственных результатов биопсии исследуемых тканей и привлечения гистохимических данных, механизма (модели) изменения УФ- индуцированных спектров автофлуоресценции при развитии доброкачественных и злокачественных новообразований слизистой оболочки. Использование разработанной модели для сопоставления данных автофлуоресцентной спектроскопии новообразований слизистой оболочки гортани и глотки с результатами их гистологического исследования.

4. Сравнение характеристик полученных спектров автофлуоресценции слизистой оболочки гортани и глотки, злокачественных и доброкачественных новообразований гортани и глотки с целыо выбора коэффициента диагностической контрастности (КДК).

Научная новизна и практическая значимость работы Предложен новый, основанный па использовании лазерных технологий, способ точечного зондирования слизистой оболочки гортани и глотки, на основе получения, в выбранных локальных участках объекта, спектров автофлуоресценции, скорректированных с учетом спектральной чувствительности фотоприемной системы.

Разработанное устройство для реализации определения автофлуоресцентпых харак теристик слизистой оболочки гортани защищено патентом (Пат. РФ № 51847 от 10 марта 2006), и внедрено и ЛОР-клшшке СГМУ.

Определен диагностический критерий - КДК (коэффициент диагностической контрастности), позволяющий судить о степени злокачественности и границах новообразования, п том числе в случаях, когда визуально эти параметры неразличимы

Результаты работы и сформулированные в пей положения применяются в педагогическом процессе на кафедре оториноларингологии Саратовского государственного медицинского университета при обучении студентов, клинических ординаторов, клинических интернов и слушателей факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки (ФГ1К и ППС).

Достоверность результатов диссертации обеспечивается применением современных методов вариационной статистики, измерительной аппаратурой. При измерениях использованы стандартные спекрофлуометрические методики и приборы, калиброванные по спектральной чувствительности, проведен учет возможных погрешностей.

Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:

Основные экспериментальные результаты диссертации, прежде всего по исследованию автофлуоресцентпых свойств биотканей, забору исследуемого материала, проведению диагностических манипуляций пациентам были проведены лично соискателем. Постановка задач исследования и обсуждение экспериментальных результатов проведена под руководством профессора, д.м.н. Мареева О.В. и к.х.н., доцента Правдина А.Б. Гистологическое исследование экспериментального материала производилось совместно с заведующим патологоапатомическим отделением KB СГМУ им. Миротворцева С Р. Ивлиевым И.И.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на:

- 66-й научно-практической конференции студентов и молодых специалистов Саратовского государственного медицинского университета: "Молодые ученые -здравоохранению региона " 24 марта 2005г. Саратов.

- IX International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics September 27-30, 2005, Saratov, Russia.

- Национальном конгрессе ринологон Казахстана и международной конференции молодых оториноларингологов, 5-7 октября 2005г. Шымкепт-Туркестан.

заседании Саратовского отделения Всероссийского научного общества отоларингологов

имени профессора М.Ф. Цытовича, 10 марта 2006г. Саратов.

- заседании Саратовского отделения Всероссийского научного общества отоларингологов имени профессора М.Ф. Цытовича, 25 марта 2010г. Саратов.

- 71-й межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые - здравоохранению», посвященной 65-летию Победы в Великой Отечественной войне 22-24 апреля 2010г.

Публикации по теме диссертационной работы: опубликовано 11 печатных работ, в том числе 1 в журнале, включенном в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней кандидата и доктора паук. Получен патент на полезную модель № 51847 от 10 марта 2006 «11асадка к световоду».

Структура н обьем работы, Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками, 20 таблицами, 14 фотографиями. Состоит из: введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, главы о результатах собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 177 источник, из которых 56 отечественных и 121 иностранных источника.

Содержание работы.

Во введении обоснована актуальность выбранной темы диссертации, сформулирована цель работы, приведены основные положения, выносимые на защиту, описаны структура и объем работы.

В нервом разделе диссертации представлены результаты критического анализа известных методов диагностики онкологических заболеваний гортани и глотки, рассмотрены их достоинства и недостатки. Сделан вывод о том, что многие используемые методы диагностики являются длительными, недостаточно достоверными, связаны с большими материальными затратами, имеют ряд противопоказаний, травматичны для окружающих тканей, что в условиях онкологической патологии, требующей абластики, недопустимо. Определены основные проблемы, требующие дальнейших исследований.

Во втором разделе диссертации описаны материалы и методы исследования. Приведена схема лазерной установки, обеспечивающая возбуждение и регистрацию спектров автофлуорееценции слизистой оболочки гортани и глотки. Схема экспериментальной установки представлена на рис.1.

Для возбуждения флуоресценции использовался азотный лазер ЛГИ-505 (1) (длина волны возбуждения 337 им, частота повторения импульсов до 1 кГц, длительность

импульса 6-10 не). Регистрация спектров автофлуоресценции проводилась с помощью снектроанализатора с оптоволоконным вводом ЬЕ8А-7тес1 (7).

Волоконно-оптический зонд (3), представляет собой световод с двумя отводами. Один из них - центральное освещающее волокно, служит для подвода излучения к поверхности образца (рис.2). Вокруг центрального волокна размещены 6 световодов, предназначенных для сбора флуоресценции. Расстояние от центра освещающего волокна до центров принимающих волокон составляет 260 — 290 мкм. Собирающие люминесценцию волокна собраны во второй отвод, соединенный со спектроапализатором. Их торцы собраны в вертикальную линейную структуру, имитирующую входную щель спек трального прибора.

Рис.1 Схема экспериментальной установки. I- источник возбуждающего излучения - азотный лазер ЛГИ-505 (X. =337 им), 2- линза, 3 - волоконно-оптический зонд, 4 -гортанная насадка, 5 - пациент, 6 - фильтр, 7 - полихроматор ЬКА 7-МЕД, 8 -персональный компьютер.

ШХ]

Собирающие волокна

Освещающее волокно

Рис. 2 Структура рабочего торца волоконно-оптического зонда.

Для размещения оптоволоконного зонда в полости гортани разработана гортанная насадка на световод (4), с диетальным концом волоконно-оптического датчика. Насадка представляет собой полую металлическую трубку диаметром 0.4-0,6 см с ручкой-держателем, через которую проходит световод. Конец трубки изогнут на расстоянии 4-5 см от рабочего торца под углом 100-110 градусов, что соответствует анатомической форме гортани. Немаловажной является возможность стерилизации насадки и, как следствие, сс многократное использование у различных пациентов (5).

Управление режимами работы спектроанализатора, регистрация и накопление спектров осуществлялась с помощью программного обеспечения, работающего иод операционной системой Windows. Спектрограммы каждого пациента хранятся в архиве па базе ПК (8).

Для получения неискаженных спектров, перед началом экспериментов была проведена калибровка прибора па спектральную чувствительность и калибровка по длинам волн с использованием стандартных спектральных источников.

In vivo исследования, которые заключались в регистрации спектров автофлуоресценции новообразований слизистой оболочки гортани и ротоглотки, проводились на базе КБ СГМУ им. С.Р. Миротворцева г. Саратова по протоколам, рекомендованным комитетом по этике ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет».

При проведении серии измерений задавалась постоянная (по отношению к контрольному образцу) интенсивность азотного лазера, равная 1600 относительных единиц.

Спектры фиксировались путем прямого контакта (касания) световода с поверхностью слизистой оболочки под углом 90%. Таким образом, осуществлялся процесс точечного зондирования новообразования и слизистой оболочки по периферии. Дня исследования были выбраны 3 зоны: центральная часть новообразования; периферия новообразования (зона визуальной границы со здоровой тканью); видимо неизмененная ткань (здоровая). Для каждой локализации проводилось 3-4 измерения, полученные данные усреднялись.

Чтобы избежать болезненных ощущений и рвотных рефлексов у пациентов, исследования проводились под местной анестезией (лидокаин 10%).

Так как спектр автофлуорссценции ткани даже одной и той же локализации сильно варьирует от пациента к пациенту, при измерениях на каждом пациенте регистрировали в качестве реперпой точки спектры автофлуресцснции язычной поверхности надгортанника (при исследованиях гортани) или малого язычка (при исследованиях глотки).

Критерии включения в исследование:

- возраст от18 до 70 лет;

- новообразование гортани и (или) глотки (доброкачественное или злокачественное), верифицированное или требующее гистологического обследования;

хроническое заболевание гортани или глотки, требующее последующего гистологического исследования;

- согласие на участие в исследованиях;

- здоровые лица ( контрольная группа). Критерии исключения

- беременные и кормящие;

- подвергшиеся местному инвазивному методу лечения или диагностики по поводу перечисленных заболеваний в течение последних 3 педель;

- апатомо-физиологические особенности, препятствующие проведению исследования;

- применявшие антибиотики тетрациклипового ряда последние 2 педели (данный критерий связан с наличием сильной люминесценции тетрациклина);

- подвергшиеся диагностическим мероприя тиям с введением экзогенных флуорофоров.

В дополнительных мерах предосторожности до и после диагностическою измерения пациенты не нуждаются.

При ex vivo наблюдениях исследовались бионтаты новообразований слизистой оболочки гортани и глотки, полученные во время операции (биопсии), а также гортань и фрагменты слизистой оболочки глотки, полученные в результате ларннгэктомии и циркулярной резекции глотки.

Перед измерениями препараты отмывались от видимых следов крови физиологическим раствором.

Измерения проводились, по возможности, в таких же условиях касания образца торцом оптоволоконного зонда, как и измерения in vivo. Исследования проводились не позже, чем через 5 часов после удаления участков ткани. Образцы при этом хранились в физиологическом растворе.

Обработка полученных результатов

КДК - коэффициент диагностической контрастности параметр по численному значению которого выносится диагностическое решение. КДК вычислялся по соотношению значения интенсивности автофлуоресценции в подозрительном на наличие

новообразования участке, к значению интенсивности авгофлуоресцепции неизмененной слизистой оболочки, то есть:

КДК= 11/12,

где II- интенсивность автофлуоресценции новообразования, 12 - интенсивность автофлуоресценции здоровой слизистой оболочки обследуемого па той же длине волны. Для определения длины волны, при которой значение КДК наиболее информативно, в процессе исследований расчет проводился по всему спектру.

Важной особенностью КДК является то, что при его расчете сопоставляются измеренные значения физических параметров в опухолевых тканях и неизмененных тканях этого же пациента, что позволяет исключить влияние структурно-функционаш.ных особенностей тканей обследуемых лиц.

В связи с тем, что спектры флуоресценции могут зависеть как от особенностей структуры и состава исследуемого участка, так и от условий зондирования (угол наклона зонда, сила прижима и т.д.), для получения достоверных данных нами проводился набор статистики. При проведении флуоресцентной диагностики получали большое количество измеренных спектров (не менее 12 от каждого обследуемого). По полученным данным рассчитывались средние значения интенсивности флуоресценции нормальных участков (1фл.п.) и флуоресценции опухоли (1фл.о.) для каждого пациента. Эти значения использовались для определения КДК здоровой и пораженной новообразованием слизистой оболочки у каждого пациента.

Для регистрации и архивирования данных, полученных в результате исследования всех групп пациентов, был составлен протокол исследования, в который вносились паспортные данные, предварительный и заключительный диагнозы, дата исследования, номера файлов с результатами спектроскопии. Полученные в результате обследования спектры автофлуоресценции заносились в базу данных.

Вссь исследуемый материал, после произведенных измерений, направлялся в патологоапатомическое отделение КБ СГМУ им. С.Р. Миротворцсва, для гистологического исследования.

Эффективность автофлуоресцептной спектроскопии определяли на основании сравнения данных спектроскопии (расчет КДК, анализ формы спектра и значений интенсивности авгофлуоресцепции) с результатами, полученными при гистологическом исследовании. Статистическая обработка результатов исследования проведена с помощью компьютерной программы Mathcad 2001 Professional.

В исследовании принимали участие 50 больных от 18 до 70 лет, контрольную группу составили 10 человек без патологии со стороны гортани и глотки (таб. 1).

Таблица Ka 1. Группы исследования.

№ группы 1 11 III

Диагноз Злокачественное Доброкачественное Здоровые

новообразование новообразование

гортани или глотки гортани или глотки

Количество 31 19 10

Мужчины 31 16 8

Женщины 0 3 2

Исследования проводились в условиях ex vivo и ¡n vivo. Количественное соотношение видов исследования представлено в таблице 2.

Таблица №2.Количественное соотношение видов исследования.

Исследуемый орган Исследование ¡n vivo Исследование ex vivo

Гортань 24 11

Глотка 15 0

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В третьей главе проведен анализ данных, полученных при проведении метода автофлуоресцентной спектроскопии, а также их сопоставление с диагнозами, которые были установлены на основании клинических и гистологических результатов обследования.

При обследовании 31 пациента со злокачественными новообразованиями гортани и глотки (группа 1) получены характерные спектрограммы, представленные на рис.3.

а б

Рис.3 Спектр автофлуоресценции новообразования больного 16. а -

экспериментальные спектры, б — спектры, нормированные на максимальное значение

Величина интенсивности автофлуоресценции для каждого исследования усреднялась, как минимум, по трем измерениям.

Во всех рассмотренных случаях плоскоклеточпого рака регистрировались спектры с большой разницей интенсивностей автофлуоресцепции здоровой и опухолевой ткани и характерными максимумами па 370 им и 440 им. Характерной особенностью всех проведенных нами измерений является значительно сниженная интенсивность аптофлуоресцепции в очаге малигнизации. Интенсивности спектров автофлуоресцепции рака располагались в интервале от 0,1 до 0,5 относительных единиц.

Средняя интенсивность автофлуоресценции плоскоклеточного рака па длине волны 440 им равнялась 0,25±0,09 отн.ед., при коэффициенте вариации 36%. Средняя интенсивность визуалыю здоровой слизистой оболочки составляла 2,91 ±0,45 отн.ед., коэффициент вариации 15,1%.

Исходя из полученных данных, вычислялся коэффициент диагностической контрастности (КДК) - диагностический критерий, позволяющий предположить наличие злокачественного новообразования на конкретно взятом участке слизистой оболочки. Среднее значение КДК в группе обследованых со злокачественными новообразованиями гортани и глотки равнялось 14,56±5,59. Коэффициент вариации 37,8%. По спектру наблюдается незначительное изменение КДК, однако, наибольшие различия норма/патология получены в области 400 им.

Наряду с общим уменьшением интенсивности флуоресценции по мерс развития злокачественного новообразования наблюдается смещение максимальной интенсивности в спектре от 408-410 нм для нормы до 435-455 им в случае новообразования. По мере продвижения к центру опухоли это смещение становится более выраженным.

Характер спектров при изменении локализации зондирования проявляет явную корреляцию с морфологическим строением и соответствует понятию о гистологическом строении злокачественной опухоли и здоровой слизистой оболочки гортани и глотки

(рис.4), (рис.5).

Для всех обследованных образцов биопсии раковой опухоли, гистологически характерно резкое истончение и (или) изъязвление поверхностного эпителия, сама опухоль представляет собой скопление хорошо дифференцированных клеток плоского эпителия е обильной эозинофильной инфильтрацией. Ядра опухолевых клеток подвергаются дисплазии, количество фигур митоза незначительное. Наблюдаются очаги роговых кист (кератинизация). Соединительнотканная строма возле поверхности незначительно инфильтрирована лимфоцитами. В клеточной массе плоскоклеточпого рака

крайне малое количество коллагена и эластина - основных флуорофоров соединительной ткани, которые флуоресцируют при длине волны возбуждения 337,1 нм. Клетки нлоскоклеточного рака содержат кератиновыс включения, не характерные для клеток здоровой слизистой. Однако кератин является хромофором, интенсивность флуоресценции которого крайне мала, поэтому его наличие не приводит к значительному повышению интенсивности автофлуорссцспции опухолевой массы. Для центральной зоны зрелой плоскоклеточпой злокачественной опухоли характерна низкая митотическая активность, низкое содержание дыхательных ферментов. Перестройка в биоэнергетических процессах клетки (преобладание анаэробного гликолиза) приводит к уменьшению концентрации окисленных форм дыхательных коферментов НАДН и 11АДФ11. [Л 18]. Флуоресценция белков и коферментов НАДИ, ПАДФН находится в области длин волн 450-460 нм, и возбуждается излучением 337,1 нм. Низкое содержание НАД11 в опухолевых клетках, а также развивающаяся при злокачественных заболеваниях дисмротсинемия также являются причиной снижения интенсивности спектра автофлуорссцспции. Как уже отмечалось, спектр автофлуорссцспции состоит в совокупности из автофлуорссцспции флуорофоров как самой слизистой оболочки, так и флуорофоров подлежащих тканей. Однако, вследствие гистологических особенностей, указанных выше, опухолевая масса является экраном для самого лазерного возбуждающего излучения, т.к. рассеивает испускаемое флуорофорами излучение. Кроме того, существенное влияние оказывает также поглощение флуоресценции гемоглобином а области 400-420 нм, что также приводит к снижению интенсивности спектров автофлуорссцспции опухоли. Поглощение гемоглобином света в области полосы Соре (400-425 нм) является причиной провала в полученных спектрах флуоресценции, однако, изменение положения минимума спектральной зависимости в этой области (417 нм для нормы и 412 для патологии) нельзя объяснить только изменением относительных концентраций различных форм гемоглобина (окси- деокси- и метгемогдобин). Определенный вклад в изменение данного положения дает также вклад флуоресценции ПЛДН. Это подтверждается явным смещением длинноволнового максимума в спектрах новообразования до 445-450 нм. Наиболее явно такое смещение проявляется в нормированных спектрах. Очевидно, что, несмотря на малое содержание НАДИ в контролируемой области, эффекты экранировки флуоресценции коллагена приводят к тому, что, для злокачественных опухолей, флуоресценция НАДН в центре опухоли преобладает. Данное смещение можно объяснить приводящим к относительному увеличению флуоресценции НАДН связыванием НАДН с белками при одновременном экранировании флуоресценции коллагена.

Рис. 4 Гистологический препарат, соответствующий спектру центральной части неороговевающего рака гортани.

При обследовании 19 пациентов с доброкачественными новообразованиями гортани и глотки (группа 11), характерным является график, представленный на рис.6.

Рис.5 Гистологический препарат, соответствующий спектру здоровой слизистой оболочки гортани.

Рис. б Спектры автофлуорссцспции фибромы гортани ex vivo (больной 17).

Мри изучении графиков, выявлены следующие закономерности: во всех представленных спектрах доброкачественных новообразований гортани и глотки интенсивность автофлуоресценции новообразования расположена от 1,3±0,12 до 3,8±0,13 отн.ед. Данные, полученные ex vivo, отличаются наличием минимумов в спектрах, соответствующих полосам поглощения гемоглобина - полосы Сорэ (рис.6). Это связано с неизбежным загрязнением образца кровыо во время его удаления. Спектров, снятых с поверхности новообразования, с интенсивностью от 0,5 отн.ед. и ниже зафиксировано не было.

Средняя интенсивность автофлуоресценции доброкачественных новообразований гортани и глотки равна 2,03±0,71 отп. ед., при коэффициенте вариации 33,9%. Средняя интенсивность автофлуоресцспции визуально здоровой слизистой оболочки 3,04±0,42, коэффициент вариации 13,4%. Изменения формы спектров флуоресценции доброкачественных новообразований сильно зависит от типа образования, места расположения, структуры и состава. В отличие от спектров плоскоклеточного рака, выявить какие-либо постоянные зависимости в спектрах in vivo не удалось. В каждом отдельном случае необходимо внимательно сопоставлять изменения в спектрах с резуль татами гистологического анализа.

Данные автофлуоресцентпой спектроскопии доброкачественных новообразований гортани и глотки соответствовали данным гистологического исследования во всех рассмотренных случаях. В процессе обработки этих данных получено среднее значение коэффициента диагностической контрастности (КДК) для доброкачественных новообразований гортани и глотки. КДК=1,6±0,41- Коэффициент вариациц равнялся 24,8%.

Для пациентов группы исследования II (доброкачественные опухоли гортани и глотки), характерны следующие гистологические особенности:

Гортанный (певческий) узелок состоит из типичной эозинофилыюй неплотной клеточной соедннигелыюй ткани, в которой находятся расширенные тонкостенные кровеносные сосуды. Многослойный плоский эпителий голосовой складки вакуолизирован. В строме содержится сравнительно мало клеток и большое количество гиалинизировапного коллагена. В некоторых узелках строма богата сосудами и почти гсмангиоматозная, а в остальных она более плотная и фиброзированная.

Папиллома состоит из множества сосочковых выростов, которые состоят из васкулярной основы соединительной ткани, покрытой толстым слоем хорошо дифференцированного плоского эпителия. Ядра клеток эпителия базофильные, в них наблюдается значительная митотическая активность. Расположенный ниже эпителий гортани сдавлен папилломой и атрофирован, а подслизистая основа инфильтрирована клетками, имеющими место при хроническом воспалении.

Исходя из вышесказанного, интенсивность автофлуоресценции доброкачественных образований может быть обусловлена следующими факторами:

1. По сравнению с плоскоклеточпым раком, клетки доброкачественной опухолевой массы расположены более рыхло, эпителий сильно вакуолизирован, что в свою очередь улучшает условия возбуждения автофлуоресценции подлежащей коллагенизировапной ткани, снижает эффект экранировки.

2. Митотическая активность клеток доброкачественных новообразований значительно выше митогической активности клеток гшоскоклеточного рака, следовательно, увеличивается содержание дыхательных ферментов (НАДН). 11АД11 является одним из основных активных флуорофоров при длине волны возбуждения 337,1 нм. Это хорошо подтверждается сравнением отношений иптенсивностей длинноволнового и коротковолнового максимумов полученных спектров. Для доброкачественных новообразований, в большинстве случаев, характерно преобладание длинноволнового пика, соответствующего флуоресценции ПАДИ.

3. Значительно снижен эффект "экрана", описанный в случае плоскоклеточиого рака, следовательно, в формировании спектра автофлуоресценции доброкачественного новообразования более активно принимают участие флуорофоры подлежащих тканей.

4. Некоторые доброкачественные новообразования (фибромы), в своей строме содержат большое количество гиалинизировапного коллагена, который является, при использованном методе возбуждения, основным флуорофором.

При анализе данных контрольной группы (111) получены следующие данные: средняя интенсивность автофлуоресценции здоровой слизистой гортани и глотки равна 2,%±0,13 отн.ед., коэффициент вариации 15%.

Табл.3 Сравнительная характеристика основных днагмистических показателен аитофлуорссцснтпои спектроскопии ценообразовании слизистой оболочки гортани и глотки

Основные диагностические показатели Группа исследовании I Группа исследовании 11 Группа исследования III

Средняя интенсивность ав г «флуоресценции новообразования (отн. сд.) 0,20±0,06 2,03±0,71

Средняя интенсивность автофлуорссцепции здоровой слизистой оболочки (огн. сд.) 2,96±0,34 3,04±0,42 2,96±0,13

Коэффициент диагностической контрастности (КДК) 14,56^5,59 1,60±0,41 1,0

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан лабораторно-клинический комплекс, воспроизводящий в широком спектральном диапазоне спектр автофлуорссцепции слизистой оболочки гортани и глотки. Комплекс позволяет исследовать влияние злокачественного новообразования на формирование спектра автофлуоресцснции, гортанная насадка па световод дает возможность использовать метод точечного зондирования, что определяет для экзофитных новообразований распространенность процесса с точностью до I мм.

2. На основе точечного гистологического исследования образца плоскоклеточного пеороговевающего рака и данных биопсии в точках снятия спектра автофлуоресцснции показано, что, фиксируемый спектр автофлуорссцепции изменяется синхронно с изменение митотической активности, начиная со здоровой слизистой оболочки, через переходную зону с определяющимися клетками злокачественной опухоли, к центру (некрозу) новообразования.

3. При применении созданного комплекса, среднее значение отношения значений интенсивности автофлуоресцеиции в спектрах злокачественного новообразования и здоровой слизистой равно 14,56± 5,59, для доброкачественного новообразования эта величина составляет 1,60±0,41.

4. Для плоскоклеточного рака характерно, наряду с общим уменьшением интенсивности флуоресценции, появление главного максимума спектра в облает 435-455 им. Данный факт можно объяснить приводящим к относительному увеличению

флуоресценции НЛДН связыванием НЛДН с белками при одновременном экранировании флуоресценции коллагена.

Основные результаты и выводы

1. Для проведения сравнительной характеристики спектров автофлуоресценции (возбуждение излучением азотного лазера, 1=337 нм) участков слизистой оболочки, подозрительных на наличие злокачественного образования, оптимальными в качестве диагностических критериев считать параметры, полученные па длине волны 440 нм.

2. Путем сопоставления данных, полученных в результате автофлуоресцентной спектроскопии и гистологического исследования идентичных участков слизистой оболочки, выявлено, что злокачественные новообразования слизистой оболочки гортани и глотки имеют значение КДК> 14,56±5,59.

3. Предложенная методика автофлуоресценции слизистой оболочки гортани и глотки дает возможность, при первичном обследовании, провести дифференциальную диагностику доброкачественных и злокачественных новообразований, позволяет хранить информацию в электронном виде для последующего динамического наблюдения за больным.

4. Использование метода точечного зондирования при проведении автофлуоресцентпой спектроскопии, оптимизирует выявление распространенности опухолевого процесса.

5. Использование метода автофлуоресцентной спектроскопии слизистой оболочки гортани и глотки дает возможность произвести прицельную биопсию новообразования.

6. Определенные в ходе исследования коэффициенты диагностической контрастное™ (КДК), позволяют оптимизировать дальнейшую лечебную тактику.

7. Автофлуоресцентная спектроскопия является простым, безопасным, неинназивным методом и может быть рекомендована в качестве экспресс-диагностики для выявления злокачественных новообразований гортани и глотки. Позволяет проводить первичный скрининг при формировании групп риска по развитию онкологических заболеваний гортани и глотки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении метода автофлуоресцентной спектроскишш измерения проводятся при легком контакте световода со слизистой гортани или глотки, перпендикулярно к исследуемой поверхности. Визуальный контроль обеспечивается стандартной процедурой непрямой ларингоскопии, орофарингоскопией,

мезофарингоскопией, при условии выключения источника света в момент регистрации показаний.

2. Автофлуорссцентную спектроскопию проводят в самом начале клинического обследования, до применения ишшшшых методов диагностики.

3. Для исследования рекомендовано выбирать 3 зоны новообразования: центральная часть новообразования; периферия новообразования (зона визуальной границы со здоровой тканыо); видимо неизмененная ткань (здоровая). За ренерную точку принимал! слизистую надгортанника, либо идентичную поражению, неизмененную слизистую противоположной стороны гортани или глотки. Для каждой локализации проводить 3-4 измерения, полученные данные усреднять.

4. Пациенты с низкой интенсивностью автофлуорсеценцин слизистой оболочки гортани п глотки (от 0,25±0,09 ош.сд. и ниже) в зоне, подозрительной на наличие новообразования, считаются группой риска, и подлежат обязательному гистологическому исследованию новообразования.

Список цитируемой литературы

J11. Абызов Р.Д. Оикоотоларипгология / Р.А.Абызов. Киев. - 2001. - 264с. JI2. Ораевский Л.Л., Летохов ВС., Рагимов С.Э. и др. Спектральная диагностика атсросклеротичсских бляшек в сосудах человека // Изв. АН ССР. Сер. Физическая. -1990. - Т. 54. - № 10. - С. 1900-1903.

J13. Svatulcrg S. New developments in laser medicine // Pliys. Scripta. - 1997. - Vol. T72. P. 69-75.

jI4. Yang Y., Mitchel L.D., Alfano R.R. Fluorescence spectroscopy of dermal wounds in rats // J.Biomed. Opt. - 1997. - Vol. 2. - N 1. P. 53 - 57.

JI5. Lohmann W., Mussmann J., Lohmann C., Kunzcl W. Native fluorescence of the ccrvix uteri as a marker for dysplasia and invasive carcinoma // Europ. J. of Obslet. & Gynecol, and Keprod. Biol. - 1989. - Vol. 31. - P.249-253.

J16. Pravdin A.B.,Chernova S.P.. Papazoglou T.G., Tucliin V.V. Tissue phantoms //Handbook of Optical Biomedical Diagnostics / V.V.Tuchin, editor.Bellingham: SPIE Press, 2002.-P.311-352.

J17. Pravdin A., Utz S., Al'khov A., Bashkalov A. Upper epidermis autolluorescenee

dynamics under laser UV irradiation// Proc. SPIE. - 1994. - Vol. 2100. - P.233-236.

J18. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика и биомедицинских исследованиях. -

Саратов: Изд-во Саратовского ун-та, 1998. - 384 с.

Л9. Утц С.Р.,Синичкин 10.П., Пилипепко Е.А. In vivo лазерная флуоресцентная спектроскопия кожи человека: влияние эритемы // Опт. спектр. - 1994. - Т.76. 5. -С.864-868.

Л10. Anderson R.R., Parrish L.S. Optical properties of human skin // The science of photomedicine/ J.D.Regan and J.A.Parrish, Eds. Plenum, New York, London, 1982. - P. 147 - 194.

Л11. Ambach W„ Blumthaler M„ Schopf Т., Ambach IL, Rabl W., Zeiger В., Hinter H. Optical characteristics of UV transmission of normal human epidermis // Z.Med. Phys. -1994. - N 4. - P.65-68.

Л12. Davis R., Savage H., Sacks P., Alfano R., Schantz S. The influence of keratin on native cellular fluorescence of human skin // Pros. SPIE. - 1996. - Vol. 2679. P. 216-226. Л13. Yappert M.C., Borchman D., Byrdwell W.C. Comparison of specific blue and green fluorescence in cataractous versus normal human lens fractions // Invest. Ophthal. Vis. Sei. -1993.-Vol. 34.-N3. P. 630-636.

Л14. Lohmann W., Schill W.-B., Bucher D„ Peters T„ Nilles M„ Schulz A„ Bohle R„ Schramm W. Tissue diagnosis using autofluorescence // Pros.SPIE. - 1993. - Vol. 2081. P.10-25.

Л15. Tamosiunas M., Makaryceva J., Lahonauskiene J. Autofluorescence of transplantable hepatoma A22 (MH-A22): prospects of tumor tissue optical biopsy// Experimental oncologu. -2004.26,2. P. 118-124

Л16. Vasileiou A., Koumantakis E., Makriginnakis A., Liu W., Fotakis C., Papazoglou T. In vitro and in vivo laser induced fluorescence detection of malignancies in the female reproductive system via their natural emission and hypocrellin probing //OSA TOPS on Medical and Biological Applications. - 1996. - N 6. - P.62-67.

Л17. Ramanujam N., Mitchell M.F., Mahadevan A., Warren S., Thomsen S., Silva E.,Richards-Kortum R. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337 nm excited laser induced fluorescence H Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. -Vol. 91. - P. 1019310197.

Л18. Чершщкий E.A., Слобожанина Е.И. Спектральный люминесцентный анализ в медицине. - Минск: Наука и техника, 1989. - 141 с.

СПИСОК РЛЕОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Марссв О.В. Возможности автофлуоресцсптной спектроскопии в диагностики новообразований гортани и глотки / О.В.Марссв, А.Б.Правдин, О.П.Афонина, К.В.Филина // Всстник оториноларингологии. - 2008.- №1.-С.39-41.

2. Марссв О.В. Автофлуорссцентная спектроскопия в применении к задачам диагностики пеоплазии глотки и гортани / О.В.Марссв, А.Б.Правдии, О.П.Афишша. 1!.В.Филипа // Проблемы оптической физики. Материалы 10-й международной молодежной научной школы но онгнке, лазерной физике н биофизике. Саратов, 2006 - С.93-100.

3. Marjcv O.W. Die Autofluoreszenz als Diagiiostiksmelliode der Kclilkopfkrcbserkrankimgcn / Marjev O.W., A.B. Prawdin, O.I.Afonina //Патология респираторного тракта: Материалы И национального конгресса ринологов Казахстана и Международной конференции молодых оториноларингологов -Асгана-Шымкспт, 2005. - С.288-289.

4. Свидетельство №51847 РФ, МКИ А 61 В 1/00 Гортанная насадка на световод / О.В.Марсев, О.И.Афопина (РФ;СГМУ). - №2005121956; Заявл. 11.07.05; Опубл. 10.03.06. Бюл. №7. - С.2.

5. Афонина О.И. Автофлуорссцентная картина препарата плоскоклеточного пеороговеваюн(сго рака гортани с гистологическим исследованием / О.И.Афопина, О.В.Мареев, А.Б.Правдии // Материалы 111 Международной научной онкологической конференции «Онкология - XXI век» г.Эйлат, Израиль. Часть II. -Пермь: Изд-во Поницаа.,2008. -С.12-14.

6. Афонина О.И. Автофлуоресцеитпая диагностика онкологических заболеваний гортани и глотки на ранних стадиях развития / О.И. Афонина //Современные проблемы развития амбулаторно-полнюпшпческой помощи и общеврачебной практики. -2006. -№1. - С.239-241.

6. Марсев О.В. Автофлуорссцсптпая диагностика ранних стадий рака гортани и глотки/ О.В. Марссв, А.Б. Правдин, О.И. Афонина // Материалы XVII съезда отоларингологов России - Санкт-Петербург, 2006. - С.386-387.

7. Афонина О.И. Особенности автофлуоресцентной спектроскопии злокачественных новообразований гортани и глотки / О.И.Афопина,Е.В.Филина // Молодежь и наука: итоги и перспективы. Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. -Саратов, 2006. - С. 263.

9. Мареев О.В. Возможности спектрально-флуоресцентной диагностики опухолевых заболеваний гортани и глотки / О.В.Мареев, А.Б. Правдин, О.И.Афонина, И.И.Ивлиев // Сборник научных статей. Материалы II научно-практической конференции оториноларингологов Южного федерельиого округа. -Майкоп,2006.-С. 113.

10. Афоинна О.И. Оптическая биопсия как метод диагностики плоскоклеточного иеороговевающего рака гортани / О.И.Афонина // Молодежь и наука: итоги и перспективы. Сборник тезисов по материалам III осенней научи.-практ. копф. студентов и молодых ученых СГМУ - Саратов,2005. - С. 142-143.

11. Афонина О.И. Автофлуоресценция как метод диагностики заболеваний гортани / О.И.Афонина // Молодые ученые - здравоохранению региона: материалы 66-ой научи.-практ.конф. студентов и молодых специалистов СГМУ - Саратов, 2005. - С.136-137.

Подписано в печать 26.04.2010 Печать офсетная. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Формат 60x84 1/16. Усл.-печ. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ № 64-Т.

Отпечатано с готового оригинал-макета Типография Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского 410012 г. Саратов, ул. Большая Казачья, д. 112 а Тел.: (8452) 27-33-85