АТФазный домен в транспортных белках вирусов растений

Лещинер, Анна Дмитриевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
АТФазный домен в транспортных белках вирусов растений
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "АТФазный домен в транспортных белках вирусов растений"

Пи \UhltLii

ЛЕЩИНЕР АННА ДМИТРИЕВНА

АТФазный ДОМЕН В ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКАХ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ

03 00.06 - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в о меле биохимии вирусов растении 11а\чно-Пи.юлондимы.кого Нпсшгугл физн ко-химической биологии нч ЛН Белозерского Московского государственного университета им М В Ломоносова

Научные руководщелн:

доктор биологических наук Калинина Наталия Олеговна

Официальные оппоненты:

члеи-корр РАСХН, доктор биологических наук.

профессор Заврнев Сергей Кириакович

доктор биологических паук Дунаевский Яков Ефимович

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им В А Эшельгардта РАН

Защита состоится ноября 2006 г в на заседании диссертационного

совета Д.501 001 76 при Московском Государственном Университете им М В Ломоносова по адресу 119992. Москва, Ленинские Горы. МГУ, НИИ физико-химической биологии им. АЛ Белозерского, Лабораторный корпус "А", ауд. 536

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М.В Ломоносова

Автореферат разослан ^ октября 2006 года.

вХ'Э" п

Ученый секретарь диссертационного совета. /ъ^ ,,

/ л, < *

доктор биологических наук Н О. Калинина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Распространение вирусной инфекции по растению происходит при участии транспортных вирусных белков (ТБ). ТБ обеспечивают внутриклеточный транспорт вирусного генома от мест репликации к плазм од ее мам клеточных стенок, межклеточный транспорт го зараженной клетки в соседние здоровые и дальний транспорт по проводящей системе растения. Транспортные системы разных групп вирусов отличаются количеством и свойствами ТБ, а также транспортной формой вируса. Геном вируса может транспортироваться в виде вириона или в виде рибонуклеопротеидного комплекса, который наряду с вирусной РНК может включать только ТБ или ТБ и белок оболочки (БО) вируса. Транспортные белки вирусов являются многофункциональными белками, взаимодействующими с одной стороны с вирусным геномом и между собой, а с другой стороны с компонентами существующих в растении путей транспорта макромолекул, необходимых для регуляции роста и развития растения. Исследование механизмов транспорта вирусов в растениях является актуальным направлением молекулярной фитовируеолоши, поскольку на достаточно простых вирусных моделях позволяет изучать функциональные и молекулярные аспекты транспорта макромолекул. В тоже время эти исследования важны для разработки эффективных способов защиты растений от вирусных инфекций.

Объектами настоящей работы являются ТБ, кодируемые первым геном тройного блока транспортных генов (ТБГ) двух типов вирусов — потекс-подобных (X-вирус картофеля, ХВК) и гордеи-подобных (полулатентный вирус мятлика, ПЛВМ), а также белок оболочки потивируса (А-вирус картофеля, АВК), важный компонент транспортной системы этой группы вирусов. ТБГ1 белки являются РНК-связывающими белками, РНК-хеликазами, относящимися к суперссмейству 1, и способны гидролгоовать НТФ in vitro (Gorbalenya and Koonin, 1993; Morozov and Solovyev, 2003). АТФазная активность потекс-подобных ТБГ1 белков необходима для межклеточного транспорта, в частности для увеличения пропускной способности плазмодесм (Morozov and Solovyev, 2003) и для супрессии посттранскрипциопного умолкания генов (Bayne et al., 2005). РНК-хеликазная активность ТБГ1 белков вирусов обоих типов, видимо, обеспечивает процесс транслокации вирусного генома через плазмодесмы в соседние клетки (Morozov and Solovyev, 2003; Zamyatnin et al., 2005; Verchot-Lubicz, 2005). Известно также, что ТБГ1 белок гордеи-подобных

вирусов формирует вирусный транспортный рибонуклеопротеид в отсутствии БО (Brakke et al., 1988; Donald et al., 1997) в отличие от потекс-подобных вирусов, где транспортной формой является вирион (Santa Cruz et al., 1998) или вирусо-подобные частицы, включающие БО (Lough et al., 2001, Karpova et al., 2006). Детальная локализация функциональных участков ТБГ1 белков остается не ясной, В белке оболочки потивирусов выявлены различные детерминанты, необходимые для сборки вириона, межклеточного и дальнего транспорта вируса (Dolja et al, 1994, 1995), однако изучения биохимических активностей БО до настоящего времени не проводилось.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было сравнительное изучение биохимических свойств НТФазно/хеликазных доменов ТБГ1 белков двух типов вирусов с ТБГ: потексвируса ХВК и гордеивируса ПЛВМ, и локализация в их составе минимального АТФазного субдомена, а также биохимическая характеристика БО ABK. В ходе исследования решались следующие задачи: картирование района, ответственного за АТФазную активность у ТБГ1 белков потексвирусов и гордеивирусов; измерение кинетических параметров реакции гидролиза АТФ; оценка неспецифической РНК-связывающей активности минимального АТФазного субдомена ТБГ1 белков с использованием различных типов нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов; выяснение функциональной роли консервативных положительно заряженных аминокислот, расположенных перед первым мотивом НТФаз/хеликаз ТБГ1 белков; изучение гомологичных белок-белковых взаимодействий ТБГ1 белков и оценка роли N-концевой части НТФазного/хеликазного домена в них; обнаружение и характеристика НТФазноЙ активности рекомбинангного белка оболочки АВК и попытка локализации АТФазного центра.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы был картирован участок НТФ азно/хеликазного домена ТБГ1 белков (состоящий из консервативных мотивов 1,1а и П и небольшого участка перед ними), отвечающий за АТФазную активность. Показано, что небольшой полипептид, видимо, представляющий отдельный N-концевой субдомен, , гидролизует АТФ с эффективностью полноразмерныхх ТБГ1 белков, а также способен кооперативно связывать одноцепочечную и двуцепочечную РНК. Для ТБГ1 белка ХВК и хеликазного домена ПЛВМ показана способность образовывать димеры и олигомеры. Показано, что консервативный остаток основной аминокислоты в N-концевой части

хеликазного домена обоих типов ТБГ1 белков необходим для эффективного гидролиза АТФ только в случае полноразмерных доменов.

Впервые выявлена и охарактеризована НТФазная активность для белка оболочки А-вируса картофеля. Показано, что за НТФазную активность БО АВК отвечает его С-концевой домен.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии им. АЛ. Белозерского от 30 мая 2006 года. Результаты работы были доложены на международных конференциях: NATO Advanced Research Workshop, "Significance of virus diseases for crop biosecurity in a deveîoping European community" Киев, Украина, 2005; Х1П International Congress of Virology "Microbes in a changing world", Сан-Франциско, США, 2005; 30ш FEBS Congress and 9й ГОВМВ Conférence "The protein world", Будапешт, Венгрия, 2005; EMBO Workshop in Plant Virology "Suppression and Circumvention of Host Defense by Plant Virus es", Хельсинки, Финляндия, 2006.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура работы. Диссертация состоит из глав: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список литературы". Работа изложена на/^^границах и содержит ^Иллюстрации.

Содержание работы

Вирусы с тройным блоком транспортных генов (ТБГ) на основании организации их геномов, свойств кодируемых белков и биологических особенностей были подразделены на два типа - потекс-подобные и гордеи-подобные. Важным отличием между вирусами с двумя типами ТБГ является структура и свойства белка, кодируемого первым геном ТБГ - ТБГ1 белка. ТБГ! белки принадлежат к суперсемейству 1 (SF1) НТФаз/хеликаз, содержащих семь консервативных мотивов: I, la, II, Ш, IV, V, VI (Gorbalenya and Koonin, 1993). ТБГ1 белок потексвирусов является, возможно, самой небольшой НТФазаой/хеликазой суперсемейства 1. НТФазно/хеликазный домен включает всю последовательность белка. В случае ТБГ1 белка гордеивирусного типа консервативные мотивы НТФаз/хеликаз SF1 локализуются в его С-концевой половине, тогда как N-концевая часть белка представляет собой дополнительный домен различной длины, в связи с чем

25К 25Кы,

ША

25К

25КгоаМ1

ЛС1Н-25К АЫ-25К

I (а II III IV

V VI

№А

&Е

1УА X

ТТТ

ОТ

ТТЛ

226 «.к. 96 «.к.

226 а.к.

98 а.к.

111 8.К.

149a.it.

63К С63К СбЗКщ

свзкЮА

СбЗК^ы! ДЫ-бЗК

I !а II III IV

II III

III III

□СЕ

К/А

¿и

К/А

пгг

ТТТ

ОС

V VI

III

ТТЛ

"ТТЛ

575 ал

268 а.к. 113 а.к.

288 а.к.

113 а.к. 171 а-к.

Рис.1. Схематическое изображение ТБГ1 белков ХВК (25К белок) (А) и ПЛВМ (63К белок) (Б) и их мутантных вариантов. Черными прямоугольниками обозначены консервативные НТФазно/хеликазные мотивы. Справа от каждого белка указано количество аминокислотных остатков в его составе. Замены 15Аг^А1а в полноразмерном белке (мутант и в укороченном белке (мутант 25ККМ[.ц) (А) и замены 315Ьу^А1а в С63К белке (мутант СбЗК ) и в укороченном белке (мутант СбЗК^щ) (Б) обозначены черными стрелками. Делеционные мутанты 25К и 63К белков, полученные ранее (Могогоу ег а!., 1999; Ка1шша е1 а!., 2001), обозначены в соответствии с ранее опубликованными написаниями названий (ДСШ-25К, ДК-25К, ¿N-63 К). Участки, содержащие невирусные последовательности, заштрихованяы.

молекулярная масса белков возрастает в 1,5-2,5 раза. Оба белка обладают активностями НТФазы, РНК-хеликазы, способны неспецифически взаимодействовать с РНК, однако их структурная организация и функции, которые они выполняют в процессе транспорта вирусного генома, заметно отличаются. Исследование биохимических активностей и катрирование районов белков, ответственных за них, проводили in vitro с использованием рекомбинантных белков.

Картирование района, ответственного за АТФазную активность у ТБГ1 белков

потексвирусов и горденвирусов

Ранее в нашей лаборатории было показано, что удаление двух последних мотивов (V и VI) не только не влияет на АТФазную активность укороченного белка, но и приводит к ее увеличению в среднем в два раза (Morozov et al., 1999). Для картирования минимального АТФазного домена в составе 25К белка ХВК был получен мутантный белок, у которого были делегированы С-концевые мотивы с III по VI (рисДА), Полученный мутантный белок (25Ki.n), состоящий из 96 N-концевых аминокислотных остатков и включающий только консервативные мотивы 1,1а и II, и полноразмерный 25К белок были экспрессированы в Е. coli. Диализованные препараты белков использовали в стандартном АТФазном анализе. Как видно на рис. 2А, АТФазные активности полноразмерных и укороченных мутантных белков практически не отличались.

В качестве отрицательных контролей использовались описанные ранее мутантные белки ДС1П-25К и AN-25K (рис.1А), которые не обладали АТФазной активностью (Morozov et al., 1999). Мутация в ДСШ-25К белке затрагивала последовательность консервативного НТФазно/хеликазного мотива II и, 1фоме того, этот мутантный белок был короче на 12 собственных (вирусных) аминокислотных остатков (рисЛА). Сравнение двух укороченных мутантных белков (25Ki.n и ДСШ-25К) позволило предположить, что N-концевая часть 25К белка, содержащая первые три консервативных НТФазно/хеликазных мотива, видимо, представляет собой минимальный структурный элемент, необходимый для гидролиза АТФ.

Для того, чтобы проверить сделанное предположение и оценить функциональное сходство между хеликазными доменами двух типов вирусов с ТБГ, был проведен делеционный анализ ферментативного С-концевого НТФазно/хеликазного домена ТБГ1 белка гордеивируса ПЛВМ (С63К белок). Был

получен делеционный мутант СбЗКщ, структурно сходный с мутангным белком 25К{. ш который содержал 113 аминокислотных остатков, включая консервативные мотвы I, 1а и II (рис Л Б). Укороченный мутантный СбЗКш белок выявил АТФазную активность, сравнимую с активностью хеликазного домена С63К, в то время как ранее полученный мутант ДЫ-бЗК (без мотивов 1,1а и II, Ка1шша ег а!., 2002) (рис.1Б) был не активен (рис.2Б).

А Б

белок, иг белок, нг

Рис.2. Сравнение АТФазной активности полноразмерного ТБГ1 белка (25К) ХВК (А) н хеликазного домена ТБГ1 белка (С63К) ПЛВМ (Б) и их мутантных вариантов. На

графиках представлена относительная активность белков, выраженная как процент гидролиза меченного [у-32Р]АТФ. Очищенные на Ш-ЬГГА агарозе рекомбинантные белки, инкубировали с [у-Э2Р]АТФ при 37°С в течение 1 часа в буфере, содержащем 20 мМ трис-НС1 рН 8,0; 1 мМ ДТТ; 5 мМ МёСЬ. Реакцию останавливали, осаждая негцдролизованный АТФ с помощью активированного угля в растворе, насыщенном монофосфатом. Супренатант просчитывали по Черенкову. (А) АТФазвая активность мутантов 25К1.я, ДИ-25К и ДСШ-25К в сравнении с активностью полноразмерного 25К белка. (Б) АТФазпая активность мутантов СбЗКьц и АЫ-бЗК в сравнении с активностью С63К белка.

Определенные кинетические параметры реакции гидролиза АТФ (Кт и Утах, таблица 1), свидетельствуют в пользу того, что нативная конформация активного центра сохраняется в составе укороченных мутантов (25Кщ и СбЗКщ) поскольку сродство (аффинность) АТФ к активному центру одинакова для НТФазно/хеликазного домена и для его Ы-концевого участка, содержащего мотивы I, 1а и П. В тоже время, молярная активность, отражающая скорость гидролиза АТФ (Утах), была приблизительно в два раза выше в случае укороченных мутантов, по сравнению с полноразмерными хеликазными доменами, АТФазная активность мутантных и полноразмерных белков незначительно стимулировалась

полирибонуклеотидами: в присутствии РНК ВТМ в 1,3-1,4 раза, а в присутствии поли(А) и поли(У) в 1,4-1,7 раза, что характерно для РНК-хеликаз SF1 (Kadare and Haenni, 1997).

Таблица 1

Кинетические параметры гидролиза АТФ хеликазными доменами и их мутантами

ТБГ1 белок кт г У maxt Хелнказный Km t Vmaxt

ХВК цМ нмоль мин"1 домен ТБГ1 (lM нмоль мин'

мг1 белка ПЛВМ 'мг1

25К 11±1.5 3.8±0.2 СбЗК 14±1.2 4±0.25

25К,и 13±2.0 16±0.5 СбЗКьп 16*1.5 14±0.4

Таким образом, N-концевой части хеликазных доменов ТБГ1 белков обоих типов, состоящей из первых трех НТФазно/хеликазных мотивов и небольшой последовательности перед первым мотивом, достаточно для правильного сворачивания и функционирования АТФазного центра, что позволяет определить этот участок как минимальный АТФазный субдомен.

Известно, что наиболее типичные клеточные и вирусные НТФазы связывают

АТФ и имеют классические мотивы Walker А (мотив I) и Walker В (мотив II).

Показано, что в Walker А мотиве аминокислотный остаток лизина взаимодействует с

фосфатами MgATP/MgADP комплекса, гидроксил серина или треонина координирует

ион Mg2\ В Walker В мотиве аспаргиновая кислота в позиции 1 отвечает за

координацию иона Mg2+, а глутаминовая кислота в позиции 2 отвечает собственно за

каталитическое расщепление НТФ (Caruters and McKay, 2002). Рентгено-структурный

анализ двух высокомолекулярных ДНК-хеликаз SF1 - РсгА белка из Baccillus

stearothermophilus (Subramanaya et al., 1996) и Rep белка из E.colt (Korolev et al.,

1997) выявил наличие четырех структурных доменов, из которых два параллельных

а-р домена, включают все канонические мотивы хеликаз. АТФ связывается с амино-

проксимальным а-р доменом, в котором и находятся мотивы Walker А и Walker В. В

структуре небольших ТБГ1 РНК-хеликаз представлены только два из четырех

структурных доменов ДНК-хеликаз SF1, а именно домены 1А и 2А, которые

включают все семь консервативных мотивов данного суперсемейства (Kalinina et al.,

2002). В состав домена 1А включены мотивы с I по III, а домена 2А - с IV по VI. Как

уже говорилось, связывание и гидролиз АТФ в значительной степени определяется

мотивами Walker А и Walker В. Роль остальных мотивов связана с взаимодействием

белка с одно- или двуцепочечными нуклеиновыми кислотами, и объединением процесса дестабилизации дуплекса с АТФазпым циклом, т.е. с активностью белка как хеликазы. В 1996 году при помощи компьютерного анализа последовательностей Кунин и Ради предположили, что N- и С-концевые домены хеликаз SF1 отвечают за разные функции, и лишь N-концевой домен обладает АТФазноЙ активностью. Наши предыдущие исследования (Morozov et al., 1999) и настоящая работа показывают, что не только мотивы V и VI, но мотив III домена 1А не требуются для обеспечения АТФазноЙ активности небольших РНК-хеликаз SF1. Таким образом, несмотря на очевидное сходство консервативных аминокислотных последовательностей РНК-хеликаз (включая ТБГ1 белки) и ДНК-хеликаз SFI, зги белки, видимо, проявляют различные структурные требования для гидролиза АТФ.

В настоящей работе мы показали, на моделях небольших НТФаз/хеликаз, какими являются ТБГ1 белки, что для гидролиза АТФ достаточно консервативных мотивов I - Walker А, 1а и II - Walker В и локализовали «минимальный АТФазный субдомен» в N-концевой части ТБГр1 белков двух типов вирусов с ТБГ. Следует отметить, что полученные нами укороченные мутаптиые белки обладают сильно выраженной способностью к образованию димеров и олигомеров (подробнее см. далее), что позволяет предполагать, что АТФазная активность может обеспечиваться димерной (олигомерной) формой мутантного белка.

Характеристика РНК-свнзывающей активности N-концевого участка хеликазного домена у ТБГ1 белков потексвирусов н гордеивирусов

РНК-связывающая активность минимального АТФазного субдомена ТБГ1 белка ХВК была проанализирована методом Норт-Вестерн. Укороченный 25Кщ мутант, в отличие от 25К белка, будучи иммобилизован на мембране, способен связывать РНК в буфере с высокой ионной силой (при концентрациях NaCl от 0 до 400 мМ) (рис.З). Данные о том, что N-концевая часть в составе 25К белка обладает высокой РЛК-связывающеЙ активностью, подтверждают ранее полученные результаты с мутантным ДСШ-25К белком, РНК-связывающие свойства которого были аналогичны свойствам 25Кщ мутанта (Morozov et al., 1999).

25К 25Kf.ii 25К 25К,.ц 25К 25К^ 25К 25Кш 25К 25К,.„

О мМ 50 мМ 100 мМ 200 мМ 400 мМ

Рис.3. Анализ РНК-связывающпх свойств полноразмерного и укороченного ТБГ1 белка ХВК Норт-Вестерн методом. Очищенные рекомбинантные белки (1-1,5 мкг) подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ. Нитроцеллюлозную мембрану с белками, перенесенными из ДСН-ПААГ, инкубировали в денатурирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-НС1 (рН 7,5); 6М мочевины и 0,1% твин-20, а затем ренатурировали в буфере, содержащем 20 мМ трис-НС1 (рН 7,5); 0,2 г/л БСА; 0,2 г/л фиккола и 0,2 г/л поливинилпирролидона. Мембраны инкубировали в течение 40 минут в ренатурирующем буфере, содержащем меченый РНК-транскрипт и возрастающие концентрации от 0 до 400 мМ №0, при 20°С, отмывали, высушивали и радноавтографиров али.

В опытах по сдвигу в геле укороченные мутанты хеликазных доменов ХВК и ПЛВМ (25Кит и С63Кщ) способны неспецифично связывать РНК (рис.4) и образовывать устойчивые к повышению ионной силы раствора (до 500 мМ КаС1), неспособные входить в агарозный гель комплексы, так же, как и полноразмерные хеликазкые домены. С-концевой участок ТБГ1 белка не обладал такой способностью.

Применение трансформации Хилла к данным по РНК связыванию показало, что коэффициент Хилла для минимальных АТФазных субдоменов значительно выше единицы (2,75 для 25К; 3,5 для 25КЬП; 2,6 для С63К; 3,4 для C63Ki.ii), что указывает на кооперативный характер взаимодействия белков с РНК. Кроме коэффициента Хилла, была определена константа диссоциации РНК:белкового комплекса Кс1. Более высокие значения Кд в случае укороченных мутантов хеликазного домена (5,5±0.5 цМ для 25К против 8±0.5 рМ для25К1.ди5.76±0.6 рМ для С63К против 9±0.5 цМ для C63Ki.ii), по-видимому, отражают тот факт, что большее количество молекул низкомолекулярного белка требуется для того, чтобы полностью «одеть» молекулу РНК. Эта же закономерность отражена и в практически двукратном отличии молярных соотношений, в которых белок полностью связывает РНК для укороченных и полноразмерных белков (рис.4).

Таким образом, Ы-концевая часть хеликазного домена ТБГ1 белков потеке- и гордеивврусн ого типов является основным, если не единственным сайтом, отвечающим за взаимодействие 25К белка, и хеликазного домена 63К белка с РНК, обеспечивая эффективное кооперативное взаимодействие с РНК в растворе,

количественные характеристики которого (коэффициент Хилла и константа диссоциации) сходны с характеристикам полноразмерных хеликазных доменов.

Ш НО» 1:1» 1:139 1ЛМ Ы« 1:180 RNA \ J9 1:5ft 1:7« litt 1:100 Ы» IrMO lrl*t Jiltt RNA

25K C63K

I.« 1:1» 1:15* 1:100 1JS» IM« Ш» ИМ» >;Э60 RNA 1:Ю Iii» IM lilt* Id« 1:3» 1:3«« UM RICA

Рис.4. Анализ РНК-связывающей активности 2SK белка ХВК (А) и хелнказного домена СбЗК ПЛВМ (Б) и соответствующих укороченных мутантных белков методом сдвига в геле агароэы. Пробы с возрастающими количествами белков инкубировали с 1 мкг РНК ВТМ в буфере, содержащем 20мМ трис-HCl (pH 8,0); 5 мМ MgCh; 1 мМ ДТТ; 1 мМ ЭДТА; 50 мМ NaCl, и анализировали электрофорезом в 1% неденатурирующем геле агарозы, содержащем бромистый этидий, ■ в ТАЭ буфере. Затем гель фотографировали в УФ. Молярные соотношения .РНК: белок указаны для каждой дорожки. РНК - контрольная дорожка оо свободной РНК.

Следует отметить, что эти данные также свидетельствуют об отличиях ТБГ1 НТФаэ/хеликаз и ДНК хеликаз SF1, для которых показано участие IV и V мотивов в связывании с нуклеиновыми кислотами и олигонуклеотидами (Caruthers and McKay, 2002). Мы предполагаем, что в случае ТБГ1 белков за связывание с РНК могут отвечать мотив 1а и следующий за ним минимально консервативный мотив TXGX, как показано для ДНК-хеликаз.

Анализ эффективности взаимодействия обоих укороченных мутантных 25 Кщ и СбЗКщ белков с оцРНК (300 нуклеотидов) и соответствующей дцРНК методом сдвига в геле показал, что оба мутанта эффективно связывали как оцРНК, так и > дцРНК, Однако, 25Кы1 и СбЗКыг белкам для полного связывания такого же количества дцРНК, требовалось в два раза более высокая концентрация белка, чем для полного связывания одРНК (рис.5).

I:i0t:110 1:1t» lältvwljte 1:340 UNA

f, 1 . < ■.: v' .. ~ : - .au, . * ■>;:

AN-25K

AN-63K

РНК

25К|-и + оцРНК СбЗКн + оцРНК

25Кн + ДЦРНК СвЗКщ + дцРНК

Рис.5. Сравнительный анализ взаимодействия укороченных мутннтных белков 25Км1 и С63Км1 с оцРНК н дцРНК методом сдвига в геле агарозы. Пробы с возрастающими количествами белков инкубировали с 0,5 мкг оцРНК и с 1 мкг дцРНК и анализировали электрофорезом в 1% неденатурирующем геле агарозы, содержащем бромистый этидий. Концентрации белков одинаковы, концентрация оцРНК в два раза выше, чем дцРНК. Молярные соотношения РНК;белок указаны для каждой дорожки. РНК - контрольная дорожка со свободной РНК.

Оба белка также эффективно взаимодействуют и с короткими оцРНК олиговуклеотидамн (длиной 21 нуклеотид) (рис.б). Эксперименты по конкурентному вытеснению радиоактивно меченного оцРНК олигонуклеотида из комплексов с 25К белком или с укороченным 25Кн1 мутантным белком при добавлении 10-ти и 100-кратного избытка оц/дцРНК олигонукле отидов и оц/дцДНК олигонуклеотидов показали (рис.7), что в случае обоих белков оц/дцРНК олигонуклеотиды являются более сильными конкурентами, чем оц/дцДНК олигонуклеотиды.

25К 26Км 0

5 4 ' V 'V ^^Р^ , Г- * :■ \ : Д; о;

12 24 60120 240 300 6001200 2400 3 6 12 30 60 120 300 6001200

Рис.6. Связывание оцРНК олигонуклеотида с полноразмерным ТБГ1 белком ХВК и его укороченным мутантом. Комплексы 25К и 25Кг.п белка с радиоактивно меченным оцРНК-олигонуклеотидом анализировали методом электрофореза в неденатурирующем 10% ПААГ с последующей радиоавтографией. Для каждой дорожки указана концентрация белка в пробе в нг, О - свободный меченый о лигону клеотид.

О дцДНК оцДНК диРНК оцРНК К К онУНК дцРНК оцДНК дцДНК О

Рнс.7. Конкурентное вытеснение оцРНК олигонуклеотнда длиной 21 нуклеотнд из комплекса с полноразмерным 25К (А) н укороченным 25Кш (Б) белками ХВК оц/дцРНК и оц/дцДНК олигонуклеотидами. Эмпирически подбирались соотношения РНЮбелок, при которых радиоактивно меченный оцРНК олигонуклеотид полностью включался в комплекс. Полученные пробы инкубировали в течение 10 мин., после чего к ним добавляли 10-ти и 100-кратный избыток немеченых соответствующих олигонуклеотидов (обозначены для каждой дорожки). Проба без добавления немеченых олигонуклеотидов обозначена как контроль (К). О - свободный меченый олигонуклеотид. Пробы анализировались как в подписи к рисунку б.

Роль консервативных положительно заряженных аминокислот, расположенных перед первым мотивом у ТЕП НТФаз/хеликаз

Для потексвируса мозаики бамбука (ВМБ) было . показано, что три положительно заряженные аминокислоты перед консервативным мотивом I важны для АТФазной и РНК-связываюгаей активности ТБГ1 белка in vitro и межклеточного транспорта вируса m vivo (Wung et al., 1999; Liou et al., 2000; Lin et al., 2004). Один из трех аминокислотных остатков, мутированных в ТБГ1 белке ВМБ, консервативен как у потекс-подобных (аргинин в положении 15 в 25К белке ХВК), так и у гордеи-подобных вирусов (лизин в положении 315 в 63К белке ПЛВМ) (Morozov and Solovyev, 2003). Для изучения функциональной роли этого консервативного аминокислотного остатка, нами были введены точечные мутации с заменой положительно заряженной аминокислоты на аланин в полноразмерные хеликазные домены и укороченные мутантные белки. Полученные мутантные белки (полноразмерные 251^, СбЗК^ и укороченные 25Кк/А1_пи СбЗК^мО (рис.1А и Б) были проанализированы на способность гидролизоватъ АТФ. Оказалось, что АТФазная активность 25KR/A и СбЗК^ мутантных белков сильно снижена по сравнению с белками дикого типа (рис.8). Значения кинетических параметров реакции гидролиза АТФ приведены в таблице 2. Для мутантных полноразмерных

белков значения Утах были практически на порядок ниже, чем для белков без точечной мутации.

белок, «г в*лок, «г

Рис.8. Влияние мутации консервативной положительно заряженной аминокислоты, расположенной перед мотивом I, на АТФазную активность полноразмерных и укороченных НТФазно/хеликазных доменов ТБГ1 белков ХВК и ПЛВМ. Условия АТФазной реакции см. рис.2. (А) АТФазная активность полноразмерного 25К белка ХВК и его точечных мутантов (полноразмерного 25Кк/А и укороченного гбК^.ц белков). (Б) АТФазная активность С63К белка (хеликазного домена 63К белка ПЛВМ) и его точечных мутантов (полноразмерного СбЗК104 и укороченного СбЗК^м белков).

Таблица 2

Кинетические параметры гидролиза АТФ мутантными белками ХВК и ПЛВМ.

ТБГ1 ХВК ЦМ нмоль мин'1 мг-1 Хелмказный домен ТБГ1 белка ПЛВМ мм нмоль мин' 1мг-1

25К™ 26±2.0 0.610.2 СбЗК^ 30±1.1 0.4±0.1

26К™\ц 21±1.5 11±0.3 С63КЮАм| 16±2.2 15±0.2

Интересно, что замена консервативного остатка не сказалась на АТФазной активности укороченных белков (рис.8). Все определенные кинетические параметры реакции гидролиза АТФ укороченными белками с точечной мутацией сходны со значениями, полученными для минимального АТФазного субдомена (таблицы 1 и 2). Таким образом, данная аминокислотная замена, по-видимому, влияет не на собственную ферментативную активность ТБГ1 белков, а на способность белка образовать и поддержать правильную активную конформацию АТФазного центра в

составе полноразмерного хеликазного домена. Эти результаты подтверждают недавно полученные данные о том, точечные мутации за пределами консервативных мотивов значительно влияют на ферментативные активности ТБГ1 белка ХВК in vitro (Bayne et al., 2005), возможно за счет нарушения внутримолекулярных взаимодействий и конформации домена.

1:4 1:6 13 1:101:12 1:14 1:16 1:18 120 1:22 1:24 РНК 1:2 1:4 1:6 1:8 1:10 1:12 1:14 1:16 1:18 1:20 1:22 РНК

2SKwa С63КЮА

1:13 1:50 1:100 1:150 1:200 1:250 1:300 1:310 1:400 1:450 1:500 рнк 1:20 1:40 1:60 1:80 1:100 1:120 1:140 1:160 1:180 рюс

25К*ДМ СбЗК^ш

Рис.9. Аналнз РНК-связывающей активности полноразмерных и укороченных ТБГ1 белков ХВК (А) и ПЛВМ (Б), содержащих точечную мутацию. Пробы с увеличивающимся количеством белка инкубировали с 1 мкг РНК ВТМ и анализировали как описано в подписи к рис.4. Молярные соотношения РНК:белок указаны для каждой дорожки. РНК - контрольная дорожка со свободной РНК.

В тоже время по РНК-связывающим свойствам точечные мутанш 25К и С63К белков не отличались от полноразмерных хеликазных доменов. Все изученные мутантные белки были способны образовывать не входящие в гель, устойчивые к повышению ионной силы раствора комплексы с РНК (рис.9), со сходными значениями Кс1 (6.8±0.7 цМ для 25КН/А; 6.75±1.3 цМ для 25К™АШ; 7.6±0.6 цМ для СбЗК^; 5.75±1 цМ для СбЗК^.о), но с несколько меньшей кооперативностью взаимодействия (коэффициент Хилла в 1,4-1,5 раза ниже: 2,1 для 25 К^; 2,4 для

л; 1,9 для СбЗК^; 2,3 для СбЗК^т). Таким образом, замена консервативной положительно заряженной аминокислоты на нейтральную не оказывала такого же сильного эффекта на РНК-связывающую активность ТБГ1 белков ХВК и ПЛВМ, как в случае ТБГ1 ВМБ.

Роль N-концевой части НТФазного/хеликазного домена ТБГ1 белков в белок-

белковых взаимодействиях

Кооперативный характер взаимодействия белка с нуклеиновой кислотой свидетельствует о способности ТБГ1 белков к гомотипичным взаимодействиям. Действительно, делеционные мутанты ТБГ1 белка способны образовывать значительное количество стабильных димеров даже в условиях электрофореза в денатурирующих условиях (рис.10). Эти результаты свидетельствовали о том, что мутантные белки, соответствующие N-концевой части хеликазного домена, видимо, способны образовывать стабильные димеры даже в присутствии ДСН. Подобные чрезвычайно стабильные олигомеры описаны для некоторых белков (Bentley et al., 2002; Gentile et al., 2002; Taliansky et al., 2003). Иммуноблот анализ показал, что и полноразмерные ТБГ1 белки ХВК и ПЛВМ, также как и укороченные мутанты способны образовывать димеры и высокомолекулярные олигомерные комплексы при мягкой обработке образцов (без ДСН и нагревания) (рисЛ1). Таким образом, N-концевая часть НТФазно/хеликазного домена ТБГ1 белков включает участок, ответственный за гомологичные белок-белковые взаимодействия. Более того, гомоолигомеры образуемые укороченными белками ТБГ1 ХВК и ПЛВМ способны эффективно связывать РНК на фильтрах (данные не показаны).

Рис.10. Анализ фракций полноразмерных и укороченных ТБГ1 белков ХВК и хеликазного домена ТБГ1 белка ПЛВМ методом электрофореза в ДСН-ПААГ.

Рекомбинантные белки, очищенные на М-ИТА агарозе, фракционировали методом электрофореза в 20% ДСН-ПААГ, пробы обрабатывали буфером для образцов по Лэмли без нагревания и без Р-меркаптоэтанола. Гель окрашивали Кумасси ярко голубым 11-250. Димеры обозначены стрелками. Справа показано положение белков-маркеров молекулярной массы.

20 м-

3« д

25K

25Ki-n

Рис.11. Анализ полноразмерных и укороченных хелпказных доменов ТБГ1 белков ХВК и ПЛВМ методом иммуно-блоттинга. Рекомбинантные белки, очищенные на Ni-NTA агарозе, фракционировали методом электрофореза в 5-15% градиентном ДСН-ПААГ для полноразмерных белков или в 20% ДСН-ПААГ для укороченных белков. Пробы обрабатывали в мягких условиях без нагревания. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и проявляли поликлональнымя антителами к 25К и 63К белкам. Мономеры (М), димеры (Д) и олигомеры (О) обозначены. Справа для каждого геля показано положение белков-маркеров молекулярной массы.

При фракционировании рекомбинантных 25К и СбЗК белков, а также их мутантов, в сахарозном градиенте были обнаружены димерные и олигомерные, но не мономерные формы белков (рис.12). Эти наблюдения согласуются с ранее опубликованными данными о способности образовывать димеры in vitro другого потекс-подобного ТБГ1 белка (Wung et al., 1999; Liou et al., 2000) и о гомотипических взаимодействиях гордеи-подобного ТБГ1 белка в дрожжевой двугибридной системе (Cowan et al., 2002). Интересно, что склонность к гомотличным взаимодействиям характерна для многих хеликаз, функционирующих в форме димера и олигомера. Для близкородственной ТБГ1 белкам по аминокислотной последовательности репликазы-хеликазы ВТМ показано, что ее активность напрямую зависит от способности к образованию гомогексамерных комплексов (Goregaoker and Culver, 2003)Лолученные данные свидетельствуют, что ТБГ1 белок потексвируса ХВК и хеликазный домен ТБГ1 белка гордеивируса ПЛВМ способны образовывать: гомоолигомеры, a N-концевая часть НТФазно/хеликазного домена ТБГ1 белков способность к гомологичным белок-белковым взаимодействиям сохраняет.

Рос. 12. Фракционирование полноразмерных ТБГ1 белков ХБК и ПЛВМ и их укороченных мутантов методом дпфференцнального ультрацентрифугироаагшя в градиентах сахарозы. Диализованные белки наносили на 10-30% градиент концентрации сахарозы (приготовленном на буфере: 50мМ трис-HCl, рН 7,8; ЮОмМ NaCl; 5мМ MgCh; 2мМ ДТТ) и после центрифугирования в течение 21 час. при 36000 об/мин и 4°С в роторе SW50, собирали фракции, которые анализировали методом иммуноблог анализа, используя антитела к 25К и 63 К белкам. На рисунках даны результаты иммунопроявления фракций 1радиента. Над ними график плотности полос (интенсивность проявления) по фракциям. Стрелками обозначены фракции, соответствующие положению маркерных белков с обозначением молекулярной массы: миоглобин (18 кДа), щелочная ангндраза (29 кДа), БСА (66 кДа), алкоголь дегидрогеназа (141 кДа), альдолаза (160 кДа), каталаза (240 кДа) и апоферритин (443 кДа).

Таким образом, в составе НТФазно/хеликазных доменов ТБГ1 транспортных белков двух типов вирусов с ТБГ - потексвируса ХВК и гордеивтфуса ПЛВМ выявлен минимальный субдомен, отвечающий за АТФазную активность белков. Субдомен локализуется в N-концевоЙ половине белка и включает первые три (1,1а и II) из семи консервативных мотивов НТФаз/хеликаз суперсемейства I и небольшой участок перед мотивом I, Полученные в работе полипептиды, происходящие из ТБГ1 белков ХВК и ПЛВМ, являются одними из самых небольших белков, обладающих АТФазной, РНК-связывающей активностями и способностью к гомотипическим взаимодействиям.

В настоящий момент достаточно сложно связать полученные in vitro результаты с активностью ТБГ1 белков в процессе транспорта вирусной инфекции. Однако, полученные данные свидетельствуют о высокой лабильности структуры хеликазного домена ТБГ1 белков, что характерно для белков с активностью НТФаз/хеликаз и указывают на возможность быстрой регуляции ферментативных активностей белка при его модификациях (например, фосфорилировании) или при

взаимодействии с другими компонентами транспортной системы. Полученные результаты также указывают на значительные отличия структуры малых НТФаз/хеликаз SF1 и высокомолекулярных ДНК хеликаз этого же семейства и функций некоторых консервативных мотивов (например, мотивы IV и V в случае ТБГ1 белков, видимо, не участвуют в связывании нуклеиновой кислоты). Очевидно, что следующим этапом изучения ТБГ1 белков должны быть структуртные исследования..

НТФазная активность рекомбинантного белка оболочки потивируса А-

вируса картофеля

Белок оболочки играет важную роль в межклеточном и дальнем транспорте нитевидных вирусов со сложно организованными транспортными системами (потекс-поти- и клостеровирусов), что позволяет определить его в случае этих вирусов как транспортный белок (Rojas et al., 1997; Urcuqui-Inchima et al., 2001). Транспортной формой генома этих вирусов является вирион или вирусо-подобные частицы, включающие БО (Dolja, 2003; Verchot-Lubicz, 2005; Torrance et al., 2006; Karpova et al., 2006). Однако анализ мутантных по гену БО геномов потексвируса ХВК показал, что образование вириона не является достаточным условием эффективного транспорта вируса, что позволило предположить дополнительные активности молекул БО, связанные с транспортной функцией (Fedorkin et al., 2000,2001). Для БО ХВК в нашей группе была обнаружена неканоническая АТФазная активность (Калинина, 2003; Rakitina et al., 2005). БО АВК имеет некоторое сходство в последовательности и значительное сходство в структурной организации с БО ХВК (Dolja et al., 1991; Koonin and Dolja, 1993; Baratova et al., Доброе и др., 2006). Более того, БО АВК способен комплементировать делецшо С-концевого участка БО ХВК, дефектного по транспорту, восстанавливая транспорт вируса в растениях (Fedorkin et al., 2000,2001).

Рекомбинантный БО АВК в условиях стандартной АТФазной реакции гидролизовал в течение 1 часа инкубации до 55-65% исходного [у-32Р]АТФ в пробе (рис.13А). АТФазная активность БО АВК заметно ингибировалась при добавлении в пробу антител против АВК, но не антител к ВТМ (рис.13Б).

АТФазная активность БО АВК полностью зависела от присутствия двухвалентных катионов Mg2+, в меньшей степени от катионов Мп2+ и почти не

стимулировалась ионами Са2+, Си2+ и Zn2+. При добавлении 10 мМ ЭДТА активность практически полностью ингибировалась (рисЛ 4).

во

IJ ■■■—ИГ с къх

■иг ж втм

О 100 200

300 400

белок, аг

0 2 4 6 8 ИГ, мкг

Рис.13. Характеристика АТФазной активности БО ABK. (А) Анализ АТФазной активности БО АВК в зависимости от концентрации белка в пробе (условия в подписи к рис.2). По оси ординат отложена относительная активность белка в процентах гидролиза меченого [у-32Р]АТФ. (Б) Анализ влияния на АТФазную активность БО АВК иммуноглобулинов (ИГ) против вирионов АВК и ВТМ. Реакция проводилась в стандартных условиях, концентрация белка в пробах - 150 иг. ИГ добавлялись в количестве 2-10 мкг в пробу. Препарат ИГ не обладал АТФазной активностью. По оси ординат отложена радиоактивность, определяемая в пробах, в имп/мин.

Рнс.14. Стимуляция АТФазной активности БО АВК двувалентными катионами.

Реакция проводилась в стандартных условиях, конечная концентрация соответствующих солей составляла 5 мМ (MgCh добавляли до концентрации 1мМ, ЗмМ и 5мМ). По оси ординат отложена радиоактивность в имп/мин. Концентрация белка в пробах - 150 нг.

Сравнение АТФазных активностей рекомбинантных белков оболочки двух нитевидных вирусов, принадлежащих к различным группам: поти- и потексвирусов,

показало, что эффективность гидролиза [у-32Р]АТФ в присутствии БО АВК была несколько ниже, чем в присутствии БО ХВК (рис.15). Рассчитанные кинетические параметры АТФазной реакции подтверждают, что хотя оба БО обладают сходной аффинностью к АТФ (Кт около 7,0 рМ), скорость гидролиза АТФ отличается более чем в 3,0 раза (Утах 1,5 нмоль мин'1 мг"1 для БО АВК и 5 нмоль мин*1 мг'1 для БО ХВК).

н < 90-

£ 80-

9 К 70-

Я а во -

п о 50-

40 -

§ 30 -

а Я 20 -

и! Ю -

¡S Оч

• бо>зк .БО/®К

О SO 100150 200250 300 350400 белок, иг

Рис.15. Сравнение АТФазной активности БО ХВК и БО АВК. Условия проведения реакции как в подписи к рис.2. На графиках представлена активность белков, выраженная в процентах гидролиза меченого [у-32Р] АТФ.

Интересно, что все рНТФ, но не дНТФ, эффективно ингибировали гидролиз [у-32Р]АТФ в присутствии БО ХВК (ЯакШпа а1., 2005). О способности БО АВК гидролизовать различные рНТФ и дНТФ судили по их эффективности в конкурентном ингибировании гидролиза радиоактивно меченной [у-32Р]АТФ. Все рНТФ ингибировали гидролиз [у-32Р]АТФ с приблизительно одинаковой эффективностью, В тоже время добавление дНТФ не вызывало значительного эффекта (рис.16А). Полученные результаты свидетельствовали о том, что оба БО способны гидролиз овать рНТФ, но не дНТФ. В связи с этими данными была проверена активность БО обоих вирусов в гидролизе [у-32Р]УТФ в условиях стандартной реакции. Оказалось, что оба БО (АВК и ХВК) способны гидролизовать УТФ с эффективностью близкой к эффективности гидролиза АТФ (рис.16Б), т.е. являются НТФазами.

Таким образом, БО АВК является М^+-зависимой НТФазой, ферментативные свойства которой сходны с ранее описанными в нашей лаборатории для рекомбинантного БО ХВК (Калинина, 2003; Какйша е1 а1., 2005).

белок, пг

Рнс.16. Угнетение АТФазной активности БО АВК немечеными НТФ и дНТФ (А) и УТФаэная активность БО ХВК и АВК (Б). Реакция проводилась в стандартных условиях, в пробы добавлялись НТФ и дНТФ в соответствующих концентрациях. По оси ординат отложена радиоактивность, определяемая в пробах в имп/мин. Концентрация белка в пробах - 150 нг. (Б) условия проведения УТФазной реакции, как описано в подписи к рис.2. По оси ординат отложена относительная активность белка, выраженная в процентах гидролиза меченого [у-32Р]УТФ.

Попытка локализации АТФазного центра в молекуле БО АВК

Анализ аминокислотной последовательности БО обоих вирусов не выявил в их составе консервативных мотивов (консенсусных последовательностей), характерных для белков с активностями НТФаз. В связи с этим на первом этапе исследования были получены делеционные мутанты БО АВК - ДСБО АВК, у которого отсутствовали 49 аминокислотных остатков с С-конца, и ÄNBO АВК, у которого были удалены 176 аминокислотных остатков с N-конца. Анализ АТФазной активности мутантных белков показал, что активность ДСБО АВК составляет менее 50% от активности полноразмерного БО АВК. В то же время мутантный ANEO АВК белок сохраняет значительную часть АТФазной активности (рис. 17).

Эти результаты указывали на участие С-концевого района белка в обеспечении АТФазной активности БО АВК. Согласно данным Baratova et al. (2001) С-концевой домен БО (аминокислотные остатки 176-266) представляет собой .двуслойную структуру с топологией ßja7ß6ß7ae, в которой один слой формируется тремя ß-тяжами, а другой двумя а-спиралями, образуя так называемую abCd единицу (Efimov, 1991), Подобные структурные единицы обнаружены в составе многих РНК-связывающих белков.

БОАВБ ДМБО ЛВК ДСБОАВК

400

Рис.17. Сравнение АТФазной активности БО АВК и мутантных белков. Реакция проводилась в стандартных условиях. По оси ординат отложена радиоактивность, определяемая в пробах, в имп/мин.

БО АВК АС БО АВК

AN БОАВК DWA БО D194/A БО Riso/A БО YWA БО N-50

й-з-да-Nt ■lAä^Wfew■йм&д | 266 а.к.

ттт^т^^тш'М 21т а.*.

[

SO s.k.

1 »• ■

Ей ^^¿^¡^fe^ s^if 1 ий'gj| 266 а.к.

266 а.к.

SO а.к.

Рис.18. Схематическое изображение БО АВК и его мутантных вариантов. Справа от каждого белка указано количество аминокислотных остатков в его составе. Положение замен 203Asp/AIa , 194Asp/A!a, 190Arg/Ala и I86Tyr/Ala в полноразмерном белке оболочке обозначено красными линиями.

Было проверено предположение, что активный центр может локализоваться в участке, включающем аминокислотные остатки с 182-210 (с топологией р5-пегля-а7) С-концевого домена АВК. С этой целью были получены мутантаые белки с заменой предположительно функционально важных аминокислотных остатков на аланин, в том числе мутангные белки по аргинину в положении 190, аспарагиновой кислоте в положении 194, тирозину в положении 186 и аспарагиновой кислоте в положении 203 (рис.18). Наше предположение о возможном участии пары позитивно и негативно

заряженных остатков, консервативных у БО нитевидных вирусов, и, как предположено ранее, формирующих солевой мостик для стабилизациии структуры БО (ОоЦа е1 а!, 1991), в качестве возможного структурного элемента активного центра, не подтвердилось: мутант В2оз/А БО полностью сохранял АТФазную активность. Хотя нам не удалось получить мутант, у которого бы полностью отсутствовала АТФазная активность, однако замены Я^А БО и В194/А БО приводили к угнетению последней более чем на 50% (рис.19). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что БО АВК является неканонической НТФ, активный центр которой, по-ввдимому, локализуется в составе С-концевого домена белка.

белок, кг

Рис.19. Сравнение АТФазной активности БО АВК и мутаитиых. На графиках представлена относительная активность белков, выраженная в процентах гидролиза меченого [у-32Р)АТФ.

Значение НТФазноЙ активности БО АВК для межклеточного транспорта потивирусов не ясно. В экспериментах с потивирусом гравировки табака (BIT) Dolja et al. (1994, 1995) показали, что абсолютно необходимым для транспорта является центральный участок БО, т.к. замена уже одного консервативного аминокислотного остатка, формирующего солевой мостик, приводила к его подавлению, возможно, за счет нарушения сборки вирусных частиц. В то же время деяеционные мутанты БО ВГТ, лишенные небольших участков (-20 а.к.) с С-конца в первом случае и N-конца во втором не теряли способности к ближнему транспорту, однако эффективность его несколько снижалась по сравнению с БО дикого типа. В настоящее время нельзя исключить возможность, что обнаруженная in vitro НТФазная активность свободных БО (потеке- и потивирусов) может требоваться на других стадиях жизненного цикла нитевидных вирусов.

Выводы

1. В составе НТФазно/хеликазных доменов ТБГ1 транспортных белков двух групп вирусов с тройным блоком транспортных генов - потексвируса Х-вируса картофеля и гордеивируса полулатентного вируса мятлика выявлен минимальный субдомен, отвечающий за АТФазную активность белков.

2. Выявленный - субдомен способен неспецифически и кооперативно взаимодействовать с РНК и образовывать гомоолигомеры,

3. Мутация консервативного остатка основной аминокислоты перед мотивом I не влияет на АТФазную активность минимального субдомена, но понижает активность полноразмерного НТФазво/хелгасазного домена у вирусов обеих групп.

4. Рекомбинантный белок оболочки потивируса А-вируса картофеля, участвующий в транспорте вирусного генома, обладает Mg+2-3 ависи мо Й НТФазной активностью in vitro. Участок, отвечающий за данную активность, вероятно, локализуется в С-концевой половине белка.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. A.D. Leshchiner, A.G. Solovyev, S.Yu. Morozov and N.O. Kalioina (2006). A minimal region in the NTPase/helicase domain of the TGBp 1 plant virus movement protein is responsible for ATPase activity and cooperative RNA binding. J. Gen. Virol. 87: 30873095.

2. D.V. Rakitina, O.L. Kantidze, A.D. Leshchiner, A.G. Solovyev, V.K. Novikov,

5.Yu. Morozov and N.O, Kalinina (2005). Coat proteins of two filamentous plant viruses display NTPase activity in vitro. FEBSLett 579,4955-4960,

3. A.D. Leshchiner, A.G. Solovyev, S.Yu. Morozov and N.O. Kalinina (2005). Role of the N-terminal partofhelicase domain ofpotex- and hordei-like TGBp 1 movement proteins in ATPase and RNA-binding activities. XIII International congress of virology, Microbes in a changing world, San Francisco, USA, 23-28 July, p. 181.

4. A.D. Leshchiner, A.G. Solovyev, S.Yu. Morozov and N.O. Kalinina (2005). Minimal ATPase subdomain of movement helicases of potex- and hordeiviruses. 30th . FEBS congress and 9th IUBMB conference, The protein world, Budapest, Hungary, 2-7July, p.41.

5. A.D. Leshchiner, D.V, Rakitina and N.O. Kalinina (2006). The region in potex- and hordei-like TGBpl NTPase/helicase domains responsible for ATP hydrolysis, RNA binding and protein-protein self-interactions. EMBO Workshop in Plant Virology, Suppression and Circumvention of Host Defense by Plant Viruses, Helsinki, Finland, 1-5 July, p. 50.

Принято к [клюпнешпо 24 10 2000 I кпочнено 25 10 2006

Заказ V уи Тираж 1001Ы

Ги по графи я «11 и ФОРМ \Т> ИНН

Mot.ki.ta Варшавское ш

\\w\v лцогОи ч ш

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лещинер, Анна Дмитриевна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы:.

Многокомпонентные транспортные системы вирусов растений.

Транспорт вирусов с тройным блоком транспортных генов.

Особенности транспортной системы гордеи-подобных вирусов.

Особенности транспортной системы потекс-подобных вирусов.

Потивирусы.

Клостеровирусы.

Материалы и методы.

Результаты.

Обсуждение.

Выводы.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Лещинер, Анна Дмитриевна

Выводы

1. В составе НТФазно/хеликазных доменов ТБГ1 транспортных белков двух групп вирусов с тройным блоком транспортных генов - потексвируса X-вируса картофеля и гордеивируса полулатентного вируса мятлика выявлен минимальный субдомен, отвечающий за АТФазную активность белков.

2. Выявленный субдомен способен неспецифически и кооперативно взаимодействовать с РНК и образовывать гомоолигомеры.

3. Мутация консервативного остатка основной аминокислоты перед мотивом I не влияет на АТФазную активность минимального субдомена, но понижает эту активность полноразмерного НТФазно/хеликазного домена у вирусов обеих групп.

4. Рекомбинантный белок оболочки потивируса А-вируса картофеля, участвующего в транспорте вирусного генома, обладает Mg^-зависимой НТФазной активностью in vitro. Участок, отвечающий за данную активность, скорее всего, локализуется в С-концевой половине белка.

Благодарности

Искренне благодарю мою научную руковолительницу Наталию Олеговну Калинину, заведующего лабораторией Сергея Юрьевича Морозова, а также Андрея Геннадьевича Соловьева. Особая благодарность заведующему кафедрой вирусологии и отдела биохимии вирусов растений за предоставление возможности проведения данной работы. Благодарю всех сотрудников кафедры вирусологии за неоценимую помощь и поддержку во время выполнения данной работы. Отдельная благодарность Марине Владимировне Архипенко, Евгению Николаевичу Доброву, Роману Алексеевичу Зиновкину, Петру Алексеевичу Иванову, Татьяне Валерьевне Комаровой, Нине Иосифовне Луховицкой, Елене Алексеевне Мининой, Виктору Александровичу Новикову, Дарье Викторовне Ракитиной, Евгению Владимировичу Скурату, Татьяне Юрьевне Тилькуновой, Михаилу Вячеславовичу Щепетильникову.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лещинер, Анна Дмитриевна, Москва

1. Alzhanova D.V, Napuli A.J, Creamer R. and Dolja V.V. (2001). Cell-to-cell movement and assembly of a plant closterovirus: roles for the capsid proteins and Hsp70 homolog. EMBO J, 20, 6997-7007.

2. Andrejeva J, Jarvekulg L, Rabenstein F, Torrance L, Harrison B.D, Saarma M. (1994). Antigenic analysis of potato virus A particles and coat protein. Ann Appl Biol, 125, 337-348.

3. Angell S.M, Davies C. and Baulcombe D.C. (1996). Cell-to-cell movement of potato virus X is associated with a change in the size-exclusion limit of plasmodesmata in trichome cells of Nicotiana clevelandii. Virology, 216, 197-201.

4. Atabekov J.G. and Dorokhov Yu.L. (1984). Plant virus-specific transport function and resistance of plants to viruses. Adv Virus Res, 29, 313364.

5. Atabekov J.G. and Taliansky M.E. (1990). Expression of a plant virus-coded transport function by different viral genomes. Adv Virus Res, 38, 201-248.

6. Atabekov J.G, Rodionova N.P, Karpova O.V, Kozlovsky S.V. and Poljakov V.Y. (2000). The movement protein-triggered in situ conversion of potato virus X virion RNA from a nontranslatable into a translatable form. Virology, 271, 259-263.

7. Atabekov J.G, Rodionova N.P, Karpova O.V, Kozlovsky S.V, Novikov V.K, Arkhipenko M.V. (2001). Translational activation of encapsidated potato virus X RNA by coat protein phosphorylation. Virology, 286(2), 466-474.

8. Baratova L.A, Efimov A.V, Dobrov E.N, Fedorova N.V, Hunt R, Badun G.A, Ksenofontov A.L, Torrance L, Jarvekulg L. (2001). In Situ spatial organization of potato virus A coat protein subunits as assessed by tritium bombardment. J Virol, 75, 9696-9702.

9. Baulcombe D. (2002). Viral suppression of systemic silencing. Trends in Microbiology, 10, 306-308.

10. Baulcombe D.C., Chapman S. and Santa Cruz S. (1995). Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections. Plant J, 7, 10451053.

11. Bayne E.H., Rakitina D.V., Morozov S. Yu., Baulcombe D.C. (2005). Cell-to-cell movement of potato potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing. Plant J, 44(3), 471-82.

12. Beck. D.L., Guilford P.J., Voot D.M., Andersen M.T. and Forster R.L. (1991). Triple gene block proteins of white clover mosaic potexvirus are required for transport. Virology, 183, 695-702.

13. Blackman L.M. and Overall R.L. (2001). Structure and function of plasmodesmata. Australian Journal of Plant Physiology, 28, 709-727.

14. Bleykasten C., Gilmer D., Guilley H., Richards K.E. and Jonard G. (1996). Beet necrotic yellow vein virus 42 kDa triple gene block protein binds nucleic acid in vitro. J Gen Virol, 77(5), 889-897.

15. Boyko V., Ferralli J., Ashby J., Schellenbaum P., Heinlein M. (2000b). Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat Cell Biol, 2(11), 826-32.

16. Boyko V., van der Laak J., Ferralli J., Suslova E., Kwon M.O., Heinlein M. (2000a). Cellular targets of functional and dysfunctional mutants of tobacco mosaic vims movement protein fused to green fluorescent protein. J Virol, 74(23), 11339-46.

17. Brakke M.K., Ball E.M. and Langenberg W.G. (1988). A non-capsid protein associated with unencapsidated virus RNA in barley infected with barley stripe mosaic virus. J Gen Virol, 69,481-491.

18. Callaway A., Giesman-Cookmeyer D., Gillock E.T., Sit T.L. and Lommel S.A. (2001). The multifunctional capsid proteins of plant viruses. Annu Rev Phytopathol, 39, 419-460.

19. Carrington J.C, Jensen P.E. and Schaad M.C. (1998). Genetic evidence for an essential role for potyvirus CI protein in cell-to-cell movement. Plant J, 14, 393-400.

20. Carrington J.C., Kasschau K.D. and Johansen L.K. (2001). Activation and suppression of RNA silencing by plant viruses. Virology, 281, 1-5.

21. Carrington J.C., Kasschau K.D., Mahajan S.K., and Schaad M.C. (1996). Cell-to-cell and long-distance transport of viruses in plants. Plant Cell, 8, 1669-1681.

22. Caruthers J.M. and McKay D. (2002). Helicase structure and mechanism. Curr Opin Struct Biol, 12, 123-133.

23. Caruthers J.M., Johnson E.R., McKay D.B. (2000). Crystal structure of yeast initiation factor 4A, a DEAD-box RNA helicase. Proc Natl Acad Sci USA, 97(24), 13080-5.

24. Chapman S., Hills G, Watts J. and Baulcombe D. (1992). Mutational analysis of the coat protein gene of potato virus X, effects on virion morphology and viral pathogenicity. Virology, 191, 223-230.

25. Cho H.S., Ha N.C., Kang L.W., Chung K.M., Back S.H., Jang S.K., Oh B.H. (1998). Crystal structure of RNA helicase from genotype lb hepatitis C virus. A feasible mechanism of unwinding duplex RNA. J Biol Chem, 273(24), 15045-52.

26. Citovsky V. and Zambryski P. (1991). How do plant virus nucleic acids move through intercellular connections? Bioessays, 13(8), 373-379.

27. Citovsky V., Knorr D., Schuster G. and Zambryski P. (1990). The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell, 60(4), 637-647.

28. Cowan G.H, Lioliopoulou R., Ziegler A., Torrance L. (2002). Subcellular localisation, protein interactions, and RNA binding of Potato mop-top virus triple gene block proteins. Virology, 298(1), 106-15.

29. Cronin S., Verchot J., Haldeman-Cahill R., Schaad M.C., Carrington J.C. (1995). Long-distance movement factor: a transport function of the potyvirus helper component proteinase. Plant Cell, 7(5), 549-59.

30. Daneholt B. (2001). Assembly and transport of a premessenger RNP particle. Proc Natl Acad Sci USA, 98(13), 7012-7017.

31. Daros J.A. and Carrington J.C. (1997). RNA binding activity of Nia proteinase of tobacco etch potyvirus. Virology, 237(2), 327-36.

32. Dawson W.O., Bubrick P., Grantham G.L. (1988). Modification of the tobacco mosaic virus coat protein gene affecting replication movement and symptomatology. Phytopatol, 78, 783-789.

33. Deom C.M., Lapidot M., Beachy R.N. (1992). Plant virus movement protein. Cell, 69, 221-224.

34. Ding B, Li Q, Nguyen L, Palukaitis P. and Lucas W.J. (1995). Cucumber mosaic virus 3 a protein potentiates cell-to-cell trafficking of CMV RNA in tobacco plants. Virology, 207, 345-353.

35. Dolja V.V, Boyko V.P., Agranovsky A.A, Koonin E.V. (1991). Phylogeny of capsid proteins of rod-shaped and filamentous RNA plant viruses: two families with distinct patterns of sequence and probably structure conservation. Virology, 184(1), 79-86.

36. Dolja V.V, Haldeman R, Robertson N.L, Dougherty W.G, Carrington J.C. (1994). Distinct functions of capsid protein in assembly and movement of tobacco etch potyvirus in plants. EMBOJ, 13, 1482-1491.

37. Dolja V.V, Haldeman-Cahill R, Montgomery A.E, Vandenbosch K.A, Carrington J.C. (1995). Capsid protein determinants involved in cell-to-cell and long distance movement of tobacco etch potyvirus. Virology, 206, 1007-1016.

38. Dolja V.V, Kreuze J.F, Valkonen J.P.T. (2006). Comparative and functional genomics of closteroviruses. Virus Res, 117, 38-51.

39. Donald R.G, Lawrence D.M. and Jackson A.O. (1997). The barley stripe mosaic virus 58-kilodalton beta(b) protein is a multifunctional RNA binding protein. J Virol, 71(2), 1538-1546.

40. Donald R.G, Zhou H, Jackson A.O. (1993). Serological analysis of barley stripe mosaic virus-encoded proteins in infected barley. Virology, 195(2), 659-68.

41. Dunoyer P, Thomas C, Harrison S, Revers F, Maule A. (2004). A cysteine-rich plant protein potentiates Potyvirus movement through an interaction with the virus genome-linked protein VPg. J Virol, 78(5), 2301-9.

42. Efimov A.V. (1991). Structure of coiled beta-beta-hairpins and betabeta-corners. FEBS Lett, 284(2), 288-92.

43. Erhardt M, Stussi-Garaud C, Guilley H, Richards K.E, Jonard G. and Bouzoubaa S. (1999). The first triple gene block protein of peanut clump virus localizes to the plasmodesmata during virus infection. Virology, 264(1), 220-229.

44. Fedorkin O.N, Solovyev A.G, Yelina N.E, Zamyatnin A.A, Zinovkin R.A, Makinen K, Schiemann J, Morozov S.Yu. (2001). Cell-to-cell movement of potato virus X involves distinct functions of the coat protein. J Gen Virol, 82,449-458.

45. Fedoroff N. (2002). RNA-binding proteins in plants: the tip of an iceberg? Curr Opin Plant Biol, 5, 452-459.

46. Fernandez A, Guo H.S, Saenz P, Simon-Buela L, Gomez de Cedrón M, Garcia J. A. (1997). The motif V of plum pox potyvirus CI RNA helicase is involved in NTP hydrolysis and is essential for virus RNA replication. Nucleic Acids Res, 25(22), 4474-80.

47. Forster R.L, Beck D.L, Guilford P.I, Voot D.M, Van Dolleweerd C.J. and Andersen M.T. (1992). The coat protein of white clover mosaic potexvirus has a role in facilitating cell-to-cell transport in plants. Virology, 191(1), 480-484.

48. Fridborg I, Grainger J, Page A, Coleman M, Findlay K. and Angelí S. (2003). TIP, a novel host factor linking callóse degradation with the cell-to-cell movement of Potato virus X. Mol Plant Microbe Interact, 16, 132140.

49. Gao Z, Johansen E, Eyers S, Thomas C.L, Noel Ellis T.H, Maule A.J. (2004). The potyvirus recessive resistance gene, sbml, identifies a novel role for translation initiation factor eIF4E in cell-to-cell trafficking. Plant J, 40(3), 376-85.

50. Ghoshroy S., Lartey R., Sheng J. and Citovsky V. (1997). Transport of proteins and nucleic acids through plasmodesmata. Ann Rev in Plant Physiol and Plant Mol Biol, 48, 27-49.

51. Gilmer D., Bouzoubaa S., Hehn A., Guilley H., Richards K. and Jonard G. (1992a). Efficient cell-to-cell movement of beet necrotic yellow vein virus requires 3'- proximal genes located on RNA 2. Virology, 189, 4047.

52. Gorbalenya A.E. and Koonin E.V. (1993). Helicases, amino acid sequence comparisons and structure-function relationships. Curr Opin Cell Biol, 3, 419-429.

53. Gorbalenya A.E., Blinov V.M, Donchenko A.P. and Koonin E.V. (1989). An NTP-binding motif is the most conserved sequence in a highly diverged nionophyletic group of proteins involved in positive strand RNA viral replication. J Mol Evol, 28(3), 256-268.

54. Goregaoker S.P., Culver J.N. (2003). Oligomerization and activity of the helicase domain of the tobacco mosaic virus 126- and 183-kilodalton replicase proteins. J Virol, 77(6), 3549-56

55. Graves-Woodward K.L., Weller S.K. (1996). Replacement of gly815 in helicase motif V alters the single-stranded DNA-dependent ATPase activity of the herpes simplex virus type 1 helicase-primase. J Biol Chem, 271(23), 13629-35.

56. Hall M.C., Matson S.W. (1999) Helicase motifs, the engine that powers DNA unwinding. Mol Microbiol, 34(5), 867-77.

57. Hamilton W.D.O. and Baulcombe D.C. (1989). Infectious RNA produced by in vitro transcription of a full-length tobacco rattle virus RNA-1 cDNA. J Gen Virol, 70, 963-968.

58. Haupt S., Cowan G.H., Ziegler A., Roberts A.G., Oparka K.J., Torrance L. (2005). Two plant-viral movement proteins traffic in the endocytic recycling pathway. Plant Cell, 17(1), 164-81.

59. Haywood V, Kragler F. and Lucas W.J. (2002). Plasmodesmata: Pathways for Protein and Ribonucleoprotein Signaling. Plant Cell, Suppl, 303-325.

60. Hefferon K.L, Doyle S. and AbouHaidar M.G. (1997). Immunological detection of the 8K protein of potato virus X (PVX) in cell walls of PYX-infected tobacco and transgenic potato. Arch Virol, 142, 425433.

61. Heinlein M. (2002a). The spread of tobacco mosaic virus infection: insights into the cellular mechanism of RNA transport. Cell Mol Life Sci, 59, 58-82.

62. Heinlein M. (2002b). Plasmodesmata: dynamic regulation and role in macromolecular cell-to-cell signaling. Curr Opin Plant Biol, 5, 1-10.

63. Herzog E, Hemmer O, Hauser S, Meyer G, Bouzoubaa S. and Fritsch C. (1998). Identification of genes involved in replication and movement of peanut clump virus. Virology, 248, 312-322.

64. Hull R. (1989). The movement of viruses in plant. Annua Rev Phytopathol, 27, 213-240.

65. Jankowsky E, Gros C.H, Shuman S. and Pyle A.M. (2001). Active disruption of an RNA-protein interaction by a DexH/D RNA helicase. Science, 291, 121-125.

66. Juuti J.T, Bamford D.H, Turna R. and Thomas G.J.Jr. (1998). Structure and NTPaseactivity of the RNA-translocatmg protein (P4) of bacteriophage phi 6. J Mol Biol, 279, 347-359.

67. Kadare G. and Haenni A-L. (1997). Virus-encoded RNA helicases. J Virol, 71, 2583-2590.

68. Kalinina N.O, Fedorkin O.N, Samuilova O.V, Maiss E, Korpela T, Morozov S.Yu. and Atabekov J.G. (1996). Expression and biochemical analyses of the recombinant potato virus X 25K movement protein. FEBS Lett, 397, 75-78.

69. Kalinina N.O, Rakitina D.V, Solovyev A.G, Schiemann J. and Morozov S.Yu. (2002). RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first gene of the triple gene block. Virology, 296, 321-329.

70. Kalinina N.O., Samuilova O.V., Fedorkin O.N., Zelenina D.A., Morozov S.Yu. (1998). Characteristics and subcellular localization of the 25 kDa protein of potato virus X. Mol biol, 4, 686-691.

71. Karasev A.V. (2000). GENETIC DIVERSITY AND EVOLUTION OF CLOSTEROVIRUSES. Annu Rev Phytopathol, 38, 293-324.

72. Karpova O.V., Rodionova N.P., Ivanov K.I., Kozlovsky S.V., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G. (1999). Phosphorylation of tobacco mosaic virus movement protein abolishes its translation repressing ability. Virology, 261(1), 20-24.

73. Kasschau K.D., Cronin S., Carrington J.C. (1997). Genome amplification and long-distance movement functions associated with the central domain of tobacco etch potyvirus helper component-proteinase. Virology, 228, 251-262.

74. Kawakami S., Watanabe Y., Beachy R.N. (2004). Tobacco mosaic virus infection spreads cell to cell as intact replication complexes. Proc Natl AcadSci USA, 101(16): 6291-6.

75. Kim J.Y., Rim Y., Wang J., Jackson D. (2005). A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev, 19(7), 788-93.

76. Kim J.Y., Yuan Z., Jackson D. (2003). Developmental regulation and significance of KNOX protein trafficking in Arabidopsis. Development, 130(18), 4351-62.

77. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Rodionova N.P., Kozlovsky S.V., Arkhipenko M.V, Atabekov J.G. (2003). AFM study of potato virus X disassembly induced by movement protein. J Mol Biol, 332(2), 321-5.

78. Koenig R., Pleij C.W.,Loss S., Burgermeister W., Aust H., Schiemann J. (2004). Molecular characterisation of potexviruses isolated from three different genera in the family Cactaceae. Arch Virol, 149(5), 903-14.

79. Koenig R., Pleij C.W.A., Beier C. and Commandeur U. (1998). Genome properties of beet virus Q, a new furo-like virus from sugarbeet, determined from unpurified virus. J Gen Virol, 79, 2027-2036.

80. Koonin E.V. (2003). A common set of conserved motifs in a vast variety of putative nucleic acid-dependent ATPases including MCM proteins involved in the initiation of eukaryotic DNA replication. Nucleic Acids Res, 21(11), 2541-7.

81. Koonin E.V. and Dolja V.V. (1993). Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses, implications of comparative analysis of amino acid sequences. Crit Rev Biochem Mol Biol, 28, 375-430.

82. Korolev S., Hsieh J, Gauss G.S, Lohman T.M., Waksman G. (1997). Major domain swiveling revealed by crystal structure of complexes of E. coli Rep helicase bound to single-stranded DNA and ADP. Cell, 90, 635-647.

83. Kragler F., Monzer J., Shash K., Xoconostle-Cazares B. and Lucas W.J. (1998). Cell-to-cell transport of proteins: requirement for unfolding and characterization of binding to a putative plasmodesmal receptor. Plant J, 15, 367-381.

84. Krishnamurthy K., Heppler M., Mitra R., Blancaflor E., Payton M., Nelson R.S., Verchot-Lubicz J. (2003). The Potato virus X TGBp3 protein associates with the ER network for virus cell-to-cell movement. Virology, 309(1), 135-51.

85. Krishnamurthy K., Mitra R., Payton M.E. and Verchot-Lubicz J. (2002). Cell-to-cell movement of the PVX 12K, 8K, or coat proteins may depend on the host, leaf developmental stage, and the PVX 25K protein. Virology, 300,269-281.

86. Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

87. Lawrence D.M and Jackson A.O. (2001). Interactions of the TGB1 protein during cell-to-cell movement of barley stripe mosaic virus. J Virol, 75(18), 8712-8723.

88. Lazarowitz S.G. and Beachy R.N. (1999). Viral movement proteins as probes for intracellular and intercellular trafficking in plants. Plant Cell, 11,535.548.

89. Leipe D.D, Wolf Y.I, Koonin E.V, Aravind L. (2002). Classification and evolution of P-loop GTPases and related ATPases. J Mol Biol, 317(1), 41-72.

90. Leonard D.A. and Zaitlin M. (1982). A temperature-sensitive strain of tobacco mosaic virus defective in cell-to-cell movement generate an altered virus-coded protein. Virology, 117,416-424.

91. Lin M.K, Chang B.Y, Liao J.T, Lin N.S, Hsu Y.H. (2004). Arg-16 and Arg-21 in the N-terminal region of the triple-gene-block protein 1 of Bamboo mosaic virus are essential for virus movement. J Gen Virol, 85, 2519.

92. Lough T.J, Emerson S.J, Lucas W.J. and Forster R.L.S. (2001). Trans-complementation of long-distance movement of white clover mosaic virus triple gene block (TGB) mutants, phloem-associated movement of TGBpl. Virology, 288, 18-28.

93. Lucas W.J. (1995). Plasmodesmata: intercellular channels for macromolecular transport in plants. Curr Opin Cell Biol, 1, 673-680.

94. Lucas W.J. (1999). Plasmodesmata and the cell-to-cell transport of proteins and nucleoprotein complexes. J Exp Bot, 50, 979-987.

95. Lucas W.J. (2006). Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes. Virology, 344(1), 169-84.

96. Lucas W.J. and Lee J.Y. (2004). Plasmodesmata as a supracellular control network in plants. Nat Rev Mol Cell Biol, 5(9), 712-26.

97. Machius M., Henry L., Palnitkar M., Deisenhofer J. (1999). Crystal structure of the DNA nucleotide excision repair enzyme UvrB from Thermus thermophilus. Proc Natl Acad Sci USA, 96(21), 11717-22.

98. Makino Y., Yamano K., Kanemaki M., Morikawa K., Kishimoto T., Shimbara N., Tanaka K., Tamura T. (1997). SUG1, a component of the 26 S proteasome, is an ATPase stimulated by specific RNAs. J Biol Chem, 272(37), 23201-5.

99. Malcuit I., Marano M.R., Kavanagh T.A., De Jong W., Forsyth A. and Baulcombe D.C. (1999). The 25-kDa movement protein of PVX elicits Nb-mediated hypersensitive cell death in potato. Mol Plant-Microbe Interact, 12, 536-543.

100. Mas P. and Beachy R.N. (1999). Replication of tobacco mosaic virus on endoplasmic reticulum and role of the cytoskeleton and virus movement protein in intracellular distribution of viral RNA .J Cell Biol, 147(5), 945-58.

101. McGeachy K.D., Barker H. (2000). Potato mop-top virus RNA can move long distance in the absence of coat protein: evidence from resistant, transgenic plants. Mol Plant-Microbe Interact, 13(1), 125-128.

102. Medina V, Peremyslov V.V., Hagiwara Y. and Dolja V.V. (1999). Subcellular localization of the HSP70-homolog encoded by beet yellows closterovirus. Virology, 260, 173-181.

103. Merai Z., Kerenyi Z., Kertesz S., Magna M., Lakatos L., Silhavy D. (2006). Double-stranded RNA binding may be a general plant RNA viral strategy to suppress RNA silencing. J Virol, 80(12), 5747-56.

104. Mitchell P. and Tollervey D. (2001). mRNA turnover. Curr Opin Cell Biol, 13, 320-325.

105. Morozov S.Y., Lukasheva L.I., Chernov B.K., Skryabin K.G. and Atabekov J.G. (1987). Nucleotide sequence of the open reading frames adjacent to the coat protein cistron in potato virus X genome. FEBS Lett, 213, 438-442.

106. Morozov S.Yu. and Solovyev A.G. (1999). Genome organization in RNA viruses. Molecular biology of plant viruses, pp. 47-98. Edited by C.L. Mandhar. Boston/Dordrecht/London: Kluwer

107. Morozov S.Yu, Dolja V.V. and Atabekov J.G. (1989). Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA-containing plant viruses. JMolEvol, 29, 52-62.

108. Morozov S.Yu, Miroshnichenko N.A, Solovyev A.G, Fedorkin O.N, Zelenina D.A, Lukasheva L.I, Karasev A.V, Dolja V.V, Atabekov J.G. (1991). Expression strategy of the potato virus X triple gene block. J Gen Virol, 72,2039-2042.

109. Morozov S.Yu, Miroshnichenko N.A, Zelenina D.A, Fedorkin O.N, Solovijev A.G, Lukasheva L.I. and Atabekov J.C. (1990). Expression of RNA transcripts of potato virus X full-length and subgenomic cDNAs. Biochimie, 72, 677-684.

110. Morozov S.Yu, Solovyev A.G, Kalinina N.O, Fedorkin O.N, Samuilova O.V, Schiemann J, Atabekov J.G. (1999). Evidence for two nonoverlapping functional domains in the potato virus X 25K movement protein. Virology, 260(l):55-63.

111. Nebenfuhr A. (2002). Vesicle traffic in the endomembrane system: a tale of COPs, Rabs and SNAREs. Currt Opin Plant Biol, 13, 97-105.

112. Nicolas O, Dunnington S.W, Gotow L.F, Pirone T.P, Hellmann G.M. (1997). Variations in the VPg protein allow a potyvirus to overcome va gene resistance in tobacco. Virology, 237(2), 452-9.

113. Niesbach-Klosgen U„ Guilley H, Jonard G. and Richards K. (1990). Immunodetection in vivo of beet necrotic yellow vein virus-encoded proteins. Virology, 178, 52-61.

114. Ohno T, Takamatsu N, Meshi T, Okada Y, Nishiguchi M. and Kiho Y. (1983). Single amino acid substitution in 30K protein of TMV defective in virus transport function. Virology, 131, 255-258.

115. Okita T.W, Choi S.B. (2002). mRNA localization in plants: targeting to the cell's cortical region and beyond. Curr Opin Plant Bio, 5(6), 553-9.

116. Oparka K.J. (2004). Getting the message across: how do plant cells exchange macromolecular complexes? Trends Plant Sci, 9(1), 33-41.

117. Oparka K.J, Roberts A.G. (2001). Plasmodesmata. A not so open-and-shut case. Plant Physiol, 125(1), 3-6.

118. Oparka K.J, Roberts A.G, Roberts I.M, Prior D.A.M. and Santa Cruz S. (1996). Viral coat protein is targeted to, but does not gate, plasmodesmata during cell-to-cell movement of potato virus X. Plant J, 10, 805-813.

119. Д35. Pause A, Sonenberg N. (1992). Mutational analysis of a DEAD box RNA helicase: the mammalian translation initiation factor eIF-4A. EMBO J, 11(7), 2643-5.

120. Peremyslov V.V, Andreev I.A, Prokhnevsky A.I, Duncan G.H, Taliansky M.E, Dolja V.V. (2004). Complex molecular architecture of beet yellows virus particles. Proc Natl Acad Sci USA, 101, 5030-5035.

121. Petty I.T. and Jackson A.O. (1990). Mutational analysis of barley stripe mosaic virus RNA beta. Virology, 179, 712-718.

122. Petty I.T, French R, Jones R.W, Jackson A.O. (1990). Identification of barley stripe mosaic virus genes involved in viral RNA replication and systemic movement. EMBO J, 9(11), 3453-7.

123. Pilipenko E.V, Viktorova E.G., Guest S.T, Agol V.I. and Roos R.P.2001). Cell-specific proteins regulate viral RNA translation and virus-induced disease. EMBO J, 20, 6899-6908.

124. Ploubidou A. and Way M. (2001). Viral transport and the cytoskeleton. Curr Opin Cell Biol, 13, 97-105.

125. Prokhnevsky A.I, Peremyslov V.V, Dolja V.V. (2005). Actin cytoskeleton is involved in targeting of a viral Hsp70 homolog to the cell periphery. J Virol, 79, 14421-14428.

126. Prokhnevsky A.I, Peremyslov V.V, Napuli A.J. and Dolja V.V.2002). Interaction between long-distance transport factor and Hsp70-related movement protein of beet yellows virus. J Virol, 76, 11003-11011.

127. Rajamaki M.L. and Valkonen J.P. (1999). The 6K2 protein and the VPg of potato virus A are determinants of systemic infection in Nicandra physaloides. Mol Plant Microbe Interact, 12, 1074-1081.

128. Rajamaki M.L. and Valkonen J.P. (2002) Viral genome-linked protein (VPg) controls accumulation and phloem-loading of a potyvirus in inoculated potato leaves. Mol Plant Microbe Interact, 15, 138-149.

129. Rakitina DV, Kantidze OL, Leshchiner AD, Solovyev AG, Novikov VK, Morozov SY, Kalinina NO. (2005). Coat proteins of two filamentous plant viruses display NTPase activity in vitro. FEBS Lett, 579(22), 4955-60.

130. Revers F., Le Gall 0., Candresse T. and Maule A.J. (1999). New advances in understanding the molecular biology of plant/potyvirus interactions. Mol Plant Microbe Interact, 12, 367-376.

131. Roberts I.M., Wang D., Rudlay K. and Maule A.J. (1998). Ultrastructural and temporal observations of the potyvirus cylindrical inclusions (CIs) show that the CI protein acts transiently in aiding virus movement. Virology, 245,173-181.

132. Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Atabekov J.G. (2003). Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. J Mol Biol, 333(3), 565-72.

133. Rodriguez-Cerezo E., Findlay K., Shaw J.G., Lomonossoff G.P., Qiu S.G., Linstead P., Shanks M. and Risco C. (1997). The coat and cylindrical inclusion proteins of a potyvirus are associated with connections between plant cells. Virology, 236, 296-306.

134. Rojas M.R., Murillo Zerbini F.M., Allison R.F., Gilbertson R.L., Lucas W.J. (1997). Capsid protein and helper component-proteinase function as potyvirus cell-to-cell movement proteins. Virology, 237, 283-295.

135. Roudet-Tavert G., German-Retana S., Delaunay T., Delecolle B., Candresse T., Le Gall O. (2002). Interaction between potyvirus helper component-proteinase and capsid protein in infected plants. J Gen Virol, 83, 1765-70.

136. Rouleau M., Smith R.J, Bancroft J.B. and Mackie G.A. (1994). Purification, properties, and subcellular localization of foxtail mosaic potexvirus 26-kDa protein. Virology, 204(1), 254-265.

137. Saito T, Yamanaka K. and Okada Y. (1990). Long-distance movementand virion assembly of tobacco mosaic virus mutants. Virology, 176, 329-336.

138. Sambrook J, Maniatis T. and Fritsch E.F. (1989). Molecular cloning: a laboratore manual. 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory.

139. Santa Cruz S, Roberts A.G, Prior D.A.M, Chapman S. and Oparka K.J. (1998). Cell-to-cell and phloem-mediated transport of potato virus X, the role of virions. Plant Cell, 10, 495-510.

140. Satyanarayana T, Gowda S, Ayllon M.A, Dawson W.O. (2004). Closterovirus bipolar virion: evidence for initiation of assembly by minor coat protein and its restriction to the genomic RNA 5 region. Proc Natl AcadSci USA, 101, 799-804.

141. Schaad M.C., Lellis A.D, Carrington J.C. (1997). VPg of tobacco etch potyvirus is a host genotype-specific determinant for long-distance movement. J Virol, 71, 8624-8631.

142. Schepetilnikov M.V, Manske U, Solovyev A.G, Zamyatnin A.A.Jr., Schiemann J, Morozov S.Y. (2005). The hydrophobic segment of Potato virus X TGBp3 is a major determinant of the protein intracellular trafficking. J Gen Virol, 86, 2379-91.

143. Schwartz M, Chen J, Janda M, Sullivan M, den Boon, J. and Ahlquist P. (2002). A positive-strand RNA virus replication complex parallels form and function of retrovirus capsids. Mol Cell, 9, 505-514.

144. Schwer B. (2001). A new twist on RNA helicases: DExH/D box proteins as RNPases. Nat Struc Biol, 8, 113-116.

145. Serazev T.V, Kalinina N.O, Nadezhdina E.S, Shanina N.A, Morozov S.Y. (2003). Potato virus X coat protein interacts with microtubules in vitro. Cell Biol, 27(3), 271-2.

146. Shukla D.D, Strike P.M., Tracy S.L, Gough K.H., Ward C.M. (1988). The N and C termini of the coat proteins of potyviruses are surface-located and the N terminus contains major virus-specific epitopes. J Gen Virol, 69, 1497-1508.

147. Silhavy D, Molnar A, Lucioli A, Szittya G, Hornyik C, Tavazza M, Burgyan J. (2002). A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21- to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO J, 21(12), 3070-80.

148. Sit T.L. and Abouhaidar M.G. (1993). Infectious RNA transcripts derived from cloned cDNA of papaya mosaic virus: effect of mutations to the capsid and polymerase proteins. J Gen Virol, 74, 1133-1140.

149. Sodeik B. (2001). Mechanisms of viral transport in the cytoplasm. Trends Microbiol, 8(10), 465-72.

150. Solovyev A.G, Savenkov E.I, Grdzelishvili V.Z, Kalinina N.O, Morozov S.Yu, Schiemann J. and Atabekov J.G. (1999). Movement of hordeivirus hybrids with exchanges in the triple gene block. Virology, 253, 278-287.

151. Solovyev A.G., Stroganova T.A, Zamyatnin Jr.AA, Fedorkin O.N., Schiemann J. and Morozov S.Yu. (2000). Subcellular sorting of small membrane-associated triple gene block proteins, TGBp3-assisted targeting of TGBp2. Virology, 269(1), 113-127.

152. Soultanas P. and Wigley D.B. (2001). Unwinding the 'Gordian knot' ofhelicase action. Trends Biochem Set, 26, 47—54.

153. Soultanas P, Dillingham M.S., Velankar S.S, Wigley D.B. (1999). DNA binding mediates conformational changes and metal ion coordination in the active site of PcrA helicase. J Mol Biol, 290(1), 137-148.

154. Stephens D.J. and Pepperkok R. (2001). Illuminating the secretory pathway: when do we need vesicles 1J Cell Sci, 114, 1053-1059.

155. Subramanya H.S., Bird L.E., Brannigan J.A., Wigley D.B. (1996). Crystal structure of a DExx box DNA helicase. Nature, 384(6607), 379-83.

156. Tamai A. and Meshi T. (2001). Cell-to-cell movement of potato virus X: the role of p!2 and p8 encoded by the second and third open reading frames of the triple gene block. Mol Plant Microbe Interact, 14, 1158-1167.

157. Theis K, Chen P.J., Skorvaga M., Van Houten B., Kisker C. (1999). Crystal Structure of Uvrb, a DNA Helicase Adapted to Nucleotide Excision Repair. Embo J, 18, 6899-6907.

158. Torrance L., Andreev I.A., Gabrenaite-Verhovskaya R., Cowan G., Makinen K., Taliansky M.E. (2006). An unusual structure at one end of potato potyvirus particles. J Mol Biol, 357(1), 1-8.

159. Tseng S.S., Weaver P.L., Liu Y, Hitomi M, Tartakoff A. M. and Chang T.H. (1998). Dbp5p, a cytosolic RNA helicase, is required for poly(A)+ RNA export. EMBO J, 17, 2651-2662.

160. Tzfira T, Rhee Y, Chen M.H., Kunik T., Citovsky V. (2000). Nucleic acid transport in plant-microbe interactions: the molecules that walk through the walls. Annu Rev Microbiol, 54, 187-219.

161. Urcuqui-Inchima S., Haenni A.-L., Bernardi F. (2001). Potyvirus proteins: a wealth of functions. Virus Res, 74, 157-175.

162. Van Lent J, Wellink J, Goldbach R. (1990). Evidence for the involvement of the 58K and 48K proteins in the intercellular movement of cowpea mosaic virus. J Gen Virol, 71, 219-223.

163. Vargason J.M., Szittya G., Burgyan J., Tanaka Hall T.M. (2003). Size selective recognition of siRNA by an RNA silencing suppressor. Cell, 115(7), 799-811.

164. Velankar S.S., Soultanas P., Dillingham M.S., Subramanya H.S., Wigley D.B. (1999). Crystal structures of complexes of PcrA DNA helicase with a DNA substrateindicate an inchworm mechanism. Cell, 97(1), 75-84.

165. Verchot J., Angell S.M. and Baulcombe D.C. (1998). In vivo translation of the triple gene block of potato virus X requires two subgenomic mRNAs. J Virol, 72(10), 8316-8320.

166. Verchot-Lubicz J. (2005). A new cell-to-cell transport model for Potexviruses. Mol Plant Microbe Interact, 18(4), 283-90.

167. Vetter I.R. and Wittinghofer A. (1999). Nucleoside triphosphate-binding proteins: different scaffolds to achieve phosphoryl transfer. Q Rev Biophys, 32(1), 1-56.

168. Voinnet O. (2001). RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics, 17, 449-459.

169. Voinnet O., Lederer C. and Baulcombe D.C. (2000). A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell, 103, 157-167.

170. Walker J.E., Saraste M., Runswick M.J., Gay N.J. (1982). Distanly related sequences in the a- and P-subunits of ATP synthetase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold .EMBOJ, 1,945-951.

171. Wieczoreck A. and Sanfacon H. (1993) Characterization and subcellular localization of tomato ringspot nepovirus putative movement protein. Virology, 194, 732-742.

172. Wung C.H, Hsu Y.H., Liou D.Y., Huang W.C, Lin N.S. and Chang B.Y. (1999). Identification of the RNA-binding sites of the triple gene block protein 1 of bamboo mosaic potexvirus. J Gen Virol, 80, 1119-1126.

173. Xiong Z, Kim K.H, Giesman-Cookmeyer D. and Lommel S.A. (1993). The roles of the red clover necrotic mosaic virus capsid and cell-to-cell movement proteins in systemic infection. Virology, 192, 27-32.

174. Yang Y, Ding B, Baulcombe D.C, Verchot J. (2000). Cell-to-cell movement of the 25K protein of Potato virus X is regulated by three other viral proteins. Mol Plant Microbe Interact, 13, 599-605.

175. Yao N, Hesson T, Cable M, Hong Z, Kwong A.D, Le H.V, Weber P.C. (1997). Structure of the hepatitis C virus RNA helicase domain. Nat Struct Biol, 4, 463-467.

176. Yao N, Reichert P,Taremi S.S, Prosise W.W, Weber P.C. (1999). Molecular views of viral polyprotein processing revealed by the crystal structure of the hepatitis C virus bifunctional protease-helicase. Structure FoldDes, 7, 1353-1363.

177. Ye K, Patel D.J. (2005). RNA silencing suppressor p21 of Beet yellows virus forms an RNA binding octameric ring structure. Structure, 13, 1375-1384.

178. Zheng H, Wang G, Zhang L. (1997). Alfalfa mosaic virus movement protein induces tubules in plant protoplasts. Mol Plant Microbe Interact, 10, 1010-1014.

179. Zhou H, Jackson A.O. (1996). Expression of the barley stripe mosaic virus RNAß "triple gene block". Virology, 216, 367-379.

180. Добров E.H, Немых M.A, Новиков B.K, Лукашина E.B, Баратова Л.А, Драчёв В.А., Ефимов A.B. (2006). ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВИРИОНОВ Х-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ И МОДИФИЦИРОВАННАЯ МОДЕЛЬ СТРУКТУРЫ ЕГО БЕЛКА ОБОЛОЧКИ. Молекулярная биология.

181. Калинина Н.О. (2003). Биохимические свойства белков, участвующих в образовании транспортных форм у некоторых РНК-содержащих вирусов растений. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в виде научного доклада

Информация о работе

Лещинер, Анна Дмитриевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.06

Диссертация

АТФазный домен в транспортных белках вирусов растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно