Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аспартильная протеиназа клубней картофеля

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аспартильная протеиназа клубней картофеля"

Р Г 6 од

] ц ЙЮН 1393

КРАСНОДАРСКИЙ ОРДЕНА ТРНДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

30БЕНК0 Владимир Яковлевич

УДК 635.21:577.156 АСПАРТИЛЬНАЯ ПРОТЕИНАЗА КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

Специальность 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Краснодар 1Э93

Работа выполнена в Кубанском государственно)! университете на кафедре биохимии и физиологии.

Научный руководитель: доктор биологических наук,профессор Х.Т.Проскуряков

Официальные оппоненты:доктор биологических наук,профессор

B.В.Мосолов

кандидат технических наук,доцент

C.Б.Иваницкий

Ведущая организация: Кубанский ордена Трудового Красного Знамени государственный аграрный университет

Защита состоится 29 ииня 1993 г. в час. на заседании

специализированного Совета К.063.40.03. при Краснодарском ордене Трудового Красного Знамени политехническом институте.

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 350072, г.Краснодар, ул. Московская, 2, корпче "О" КПИ, ученому секретари.

С диссертацией moiho ознакомиться в библиотеке Краснодарского ордена Трудового Красного Знамени политехнического института.

Автореферат разослан мая 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета,к.т.н. .доценг Q.

Й.Д.Минакова

Актуальность проблем. Процессы,происходите при формировании и созревании вегетативных репродуктивных органов,при прорастании семя:),в период покои,сопровождается распадок белка,продуктк которого используится для удовлетворения структурных м функциональных нужд.Благодаря протеолизу,происходят деградация белка,реакции ограниченного протеолиза,процессы секреции и транспорта белка через биомембраны,адаптация метаболизма к внешним условиям и другие процессы.

Исследование растительннх протеолитическнх ферментов отстает от изучения протеинаэ 1ивотных и бактерий

Наиболее изучены цистеиновне и сериновые притеиназы семян растений,среди которых не все принкмаот участие в гидролизе запасных белков при прорастании.

Если протеазы семян,плодов (папаин,бромелаин и др.) и листьев растений изучались часто,то протеазы клубней,с помоцьа которых мовет происходить размножение,изучены еце не достаточно полно,не описан процесс распада запасных белков,кдуций при прорастании.

Среди растительных протеинаэ,имекцих различный механмзм катализа и участвувцих а распаде запасных белков, не совсем ясна роль аслартильннх протеина? в мобилизации запасных белков.

Для выяснения участия и роли аспартильных протэиназ в гидролизе запасных белков в клубнях картофеля необходимо получение очищенных препаратов фермента (,иа1п1гаиЬ,1987).

Цель м задачи исследован».Цель работы состояла в выяснении участия аспг.ртилъной протеиназы клубней картофеля в мобилизации запасных белков при прорастании.

Исходя из цели работы.были поставлены следчпие задачи:

-разработать методику выделения и очистки кисло* аспартильной протеиназк клубней картофеля;

- 3 -

-подучить очихенннй препарат аспартильной протеиназк клубней картофеля;

-изучить фиеико-хнмичзские свойства очищенного фермента (рН-оптимум активности,рН стабильности,молекулярная массу,действие ингибиторов и активаторов,субстратную специфичность«влияние тен-ператиры на активность протеиназк);

-вменить локализация аспартильной протеина»! в клубив картофеля в покое и при прорастании;

-выяснить изменение активности аспартильной протеиназн h участие el в гидролизе запасных белков клубней картофеля при прорастании.

Научная новизна.разработана методика выделения и очистки аспартильной протеиназн покоящихся клубней картофеля и получен очищенный в 80 раз препарат этого фермента.

Описаны физико-химические свойства аспартильной протеиназн покоящихся клубней картофеля,динамика изменение активности проте-инг.зк и ее локализация в клубне при прорастании.

Показано,что лротзиназа гидролизует собственные бедки и участвует в мобилизации запасных белков при прорастании клубней.

Практическая ценность работн.Результаты работы иогут быть иеппльзованн для получения молоиостворамиваищего феряента из отходов крахмального производства,а также для очистки этих отходов от белков.

Апробация работн.Основные полименкя работы доломены на заседании Краснодарского отделения Российского биохимического общества (Краснодар,1991),на III симпозиуке "Химия протеолитических Ферыентоо" (Москва,26-28 апреля 1993).

Публикации.По теме диссертации опубликовано 5 ниучннх работ.

Структура н объвм работн.Диссертационная работа состоит из ввведения,обзора литературы,а такве глав.описывавщих материал и

методы,собственные результат и их обсуждение,выводов к списка литвратурн.Диссертация изложена на 134 страницах кажинопиского текста,содержит 12 таблиц и 25 рисунков.Список литературы вклвча-ет 240 литературннх источников,в том числе 144 иностранных.

Обзор ятератури.В обзоре литературы обобщены даняжа о кислых аспартилъннх протеиназах покоящихся и прэрастаящих семян,а также некоторах вегетативных органов различных растений.Рассмотрены методы выделения и очистка аспартидьних поотенназ различных растений,физико-химические свойства.присучив аспартильныы протеина-зак.Показан механизм мобилизации запасных легуминоподобных белков и рассмотрена роль аспартильннх протеиназ при гидролизе запасных белков во время прорастание семян.Обобщены литературные данные о прогеазах картофеля.

ЮТЕРОД I МЕТОД!

Объектом исследования служили здоровые клубйи картофеля (5о1апи1 Шегоздв I.) сорта Волжанник,выраженные в элитном хозяйстве совхоза Лажковский г.Краснодара.

Покоящиеся клубни картофеля исследовали через месяц после уборки урожая.Проращивание клубней осуществляли в ящиках с компостом в помещении при 20*С и относительной влажности 60-70Х. Хранение клубной картрфеля проводили в затемненном ячике при тех же условиях,что и проращивание.

Для определения прогеолитической активности в качестве субстартов использовали гембглобин и казеин.При выделении и на начальных этапах очистки применяли метод Кунитца по гидролизу казеина (Нортроп,КунитцДерриотт,1950), метод йнсока по гидролизу гемоглобина (Ап8оп,1939>.Молокзстворлживашщув активность определяли по методу Пятницкого (Пятницкий,1955).

Действие ингибиторов и активаторов на активность протекназы

определяли по расцеплении гемоглобина и створаживания молочноаце-татной смеси (МЙС).

Ингибиторнув активность пепстатина по отноменин к полученной протенназе находили .используя субстраты:казеин сиивгаыа, 1976), гемоглобин (Когк«ап,Вигк1и,1979),молочноацетатную смесь (Зобвнко, Проскуряков,1993).

Концентрации белка измеряли методом Лоури (Ьоыгу а1. ,1951),используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин. В процессе очистки концентрации белка определяли спектрсфо-тометрич«ски по поглощении при Ь=280 нм на спектрофотометре СФ-46.

Концентрирование белка проводили в диализных немках путем обдува воздухом при температуре 4°С или при комнатной температуре.

Экстракции растворимых белков осуществляли из клубней картофеля,предварительно замороменннх (Тис1ю1ка,198?).а затем сттая-ных,растворов,содержащим 0,05 Н сульфита натрия и 0,05 Н тиосульфата натрия,С,2 мХ ЭДТб.10 мМ меркаптоэтанола (КИанига.Магиуама, 1965),При очистке фермента применяли методн:высаливания сульфатом аммония (Скоупс,1985),колоночной гель-хроматографии на сефадексе £-25,й-75,С-73 сверхтонком и на молселекте 6-75,ионообменной хроматографии на КМ-целлвлозе и ДЭйЭ-целлмоэе (0стерман,1983),диск-элентрофореза в полиакриламидном геле (Маурер.1975).

Изозлектрофокусирование белков осуществляли по методу Хэглокда (Ние1апе.1967) б колонке ЛКБ-8100 объемом 110 мл при 15°С.

Определение молекулярной кассы проводили гель-фильтрацией по методу Андревса (йпйгеи8,1964) и электрофорезом в ПАйГ в присутствии додецилсулъ^ат На по методу Лэммли (ЬаемП,1975).

Математические обработку результатов исследования выполняли, используя стандартные методы вариационной статистики (Ур-бах,1979,'Лакин.1990), с применением персональной ЗВМ.

РЕЗЗЛЬТАТМ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Очистка аспартмьноЛ протвиназм

Протеолитическуи активность грубого экстракта клубней картофеля при различных рН разделяли гель-хроматографией на колонке с сефгдвксом С-75.На злвционном профиле яаблвдали 7 пиков (рис.1). В первом пике обнаруживалась молокостворамивавдая активность,которая так«е гидролизовала гемоглобин С рН = 3,0).Во втором пике

о со

ы

л

Еч

О О

ё о ч

с §

X о ш сг к ' н с о

Номер фракции

Рис. 1 .Гель-хроматография грубого якстракта покоядихся клубней картофеля на сефадвксв С-73 регистрировали ингибиториув активность по отношении к трипсину и химотрипсину.Использовали субстраты:для трипсина - казеин (рН = 7.6) и 5АПНД (рН = 8.2).для химотрипсина - MAC (РН = 5.С).Третий пик белковых фракций обладал протеолитической активностью по отношении к казеину (рН = 7,6) и расцеплял БАЛНА,Кроме ферментативной активности,этот пик содердал значительное количество ингибитора трипсина и химотрипсина.В четвертом пике регистрировали ингибитор трипсина.Пятый и дестой пики белка содердали протеолитическуи активность при кислых рН и при щелочных рН.а такмз ингиби-

» 1 2 3 4 5 6 7

0 20 30 40 50 60 70 80 90 100

тор трипсина.В седьмом пике отмечалась высокая активность по БАШ м тиачятмъмаа активность по кл?емну.Максимаяьная удельная протеолиткческая активность по гемоглобину била в первом белковом пике.Хроме того,только в атом пике нз набладали активности в щелочной области рН и тзлько в атом пике была молокостворамивапщая активность.

Определили действие некоторых ингибиторе» на молокоствораки-ваащув активность .содержащуюся в первом белковом пике после гель-хроматографиик на сефадексе С-75 грубого экстракта клубней картофеле.Ни ингибитор цистеиновых протеаз (моиойодацетат).ни ингибитор сзриновнх протеаз (фенилметилсульфонил фторид),ни ингибитор металлопротеаз'(ЭДШ.ни природннв, в том числе и собственные, ингибмторы серинсвых протеаз не влияли на молокостворамивав-щув активность первого пика.Только специфический ингибитор кислмх аспартильнмх протеаа,папстатин, ингибировал на 962 протеолити-ческув активность »того пика. Данные ингибиторного анализа позволили предположить,что в грубом акстракте покоящихся клубней картофеля содврхмтс* кислая аспартильназ молокостворавиваищая проте-иназа,которая элвируется при гель-фильтрации на сефадексе С-75 в' первом белковом пике.

На рис.2 Представлена -схема двух вариантов очистки аспар-тильной протехназы клубней картофеля.На начальных этапах работы очистку протешазы проводили по первому варианту.В этом случае удельная активность препарата фермента превышала удельную активность грубого экстрахта в 10 раз (субстрат - КйС.рН = 5.0),Выход по активности составил 1,32,а выход по белку- 0.1Х. Во втором варианте очистки препарат фермента превышал удельную активность грубого экстракта в ВО раз (субстрат - МйС.рН г 5,0) и в 80 раз (субстрат - гемоглобин,рН - 4,0),Выход по активности составил 1,9%,выход по белку - 0,03*. При очистке пв второму

Экстракт ^^^ Высаливание 1-й вариант очистки 2-й вариант очистки

Гель-фильтрация (молселект 6-25) Гедь-Фильтрация (молселвкт 6-73) Ионообменная хроматография Гель-фнльтрацкя (сефадвкс

ЬМ-целлвлоза рН 6,0

I

Ионообменна^ хроматография Ионообменная хроиатография

КМ-целлшлоза рН 4,7 ДШ-целлвлоза рН 4,3

Гель-фильтрация (сефадвкс С-75) Рехроматография ионообменям

| ДЗйЭ-целлвлоза рН 4,3

Препарат протеазн Диск-алектрофорвз в ПЙЙГ

Препарат протеазн Рис.и.Схеыа двух вариантов очистки аслартильиой протеикавк варианту ее чистота была в в раз выве.чек в случае первого варианта.Отличие второго варианта от первого г том, что во втором изменили последовательность методов очистки и использовали другой ионообменник.а также применили дополнительный атгп очистки - диск-ялектрошорез.

Отличительной псобекностьв протенназы является тот факт,что при ионообменной хроматографии на различных ионообхенникчх Скати-онообменник в первом варианте ч анионообаенник во втором варианте) происходит адсорбция кротенказы почти при одинаковых значениях рН.Вероятно, протеиназа относится к так называемым "лкпкик" белкам,которые связкваптся с ионообменняками обоих типов в одном и том ве буфере.Это обусловлено частично незлектростатическими взаимодействиями н частично неравномерным распределением зарядов на поверхности белка ССкоупс,1985 ).

Другая особенность выделенной протенназы состоит в том,что она образует активные комплексы с белками.Так, при проведении диик-электрофиреза препарата,полученного после рехроматографим на

ДЗРЗ-целлвлозе при рН 4,9,регистрировали 7 зон активных белков с различной злекгрсфоретической подвижность® (рис.3).После действия 6М мочевины на зтот препарат на злвктрофорвграммах регистрировалась только одна мажорная белковая зона (рис.3,элентрофорвграы-ма Ь).

а)

6)12 3 4 5 6 7 А г-1--, | ■ ч--г

С г

Рис.3. Диск-злектрофорез в ?.52 пслиакриЛамидном геле:а)зависи-мость оптической плотности (I) к активности по гемоглобину (2) от относительной электрофоретической подвижности белиов;б)электрофореграммы:й - препарата протеинаэы после рехроиатографии;В - препарата протеиназы после рехроматог-рафии,выдержанного 24 часа с 6 М мочевинсй;С-фракций с наибольшей удельно? активность« после диск-электрофореза

В результате очистки протеиназы по второму варианту получен гомогенный препарат аспартильной протеиназы по данным электрофореза iрис.3,злектрсфореграмма С).

Ранее разными исследователями проводилось выделение из клубной картофеля протеииаз различных групч.Так, била обнаружена цистеиновая протеиназа,активная по отиоженив к брадикинииу (HaJUa.Moriya.Moritfakf,!97?).В экстрактах листьев,корней,цветков,клубней картофеля обнаружены сериновке протеазы,обладавшие различной субстратной ипецифичностьв CSantarlus,Belitz, 1973).В грубом акстракте клубней картофеля регистрировали прсгеолити-ческув активность,ингибирцемув пепстатиком.но фермент в гомогенном состоянии не был получен tKcchano«cka. Roszkowska.Horowskl, 1979).Также не был очицен до гомогенного состояния и фермент из клубней картофеля,облад&вщий молокоствораживавжей активностьв в кислом диапазоне pH (Онивоги,1986).Еже одна цистеиновая протеиназа, изменявшая сбои активность при прорастании, была выделена и очищена до гомогенного состояния (KltaMura,Maruya«a,i98ß).

Таким образам,нами впервые получена в гомогенном состоянии протеиназа покоящихся клубней картофеля .ингибируэмая пепстати-ном,специфическим ингибитором аспартильнчх протеиназ.

2.Свойства аспартильной протеиназы клубней картофеля

По действие на гемоглобин и КйС определяли область стабильности pH получанного препарата протеиназы.Активность по КОС наиболее стабильна в диапазоне значений pH 3,5 - 6,0.

При использовании гемоглобина в качестве субстрата область стабильности находили,выдерживая 24 часа при температурах 35°С и 4°С препарат протеззн в буферах различных значений pH,а затем определяли остаточнув активность.Наиоольжая стабильность протеоли-тической активности по гемоглобину прлявилась в области значений pH 3,0 - б.0 с максимумом при pH 4,3.

Оптимум РН активности (рис.4) очищенного препарата протеина-ва клубней картофеля определяли,используя в качестве субстратов гемоглобин, хаяенн,бычий сывороточный ад ьбумин.Максимум ектив-иости для всех субстратов находился в кисло* области значений рН м не превямал 5,0.Для каввина максимальная активность иаблвдаласъ при рН = 2,8,длл гмдршшза гемоглобина прм рН « 4,0 и для бычьего сиаороточного альбумина при рН*?,0.

Определение техлврьтуриоя стабильности и температурного оп-

тимуаа активности проводили по геиог-лобику. Протеиназа сохраняет своя активность почти неизменной до 80° С. При 70°С активность падает до ЗОХ.а послз 80е I наступает денатурация фермента. Тс есть протекназу мо1-но отнести к тер-костабильным ферментам. Максимум активности протеиназы наблядали при 40°С. Поэтому при исследовании свойств очищенного препарата протеиназы инкубирование реакционной смеси осуществляли при 40*С.

Измерение молекулярной массы гомогенного препарата фзрмента осуществляли двумя способами:с поиощья сель-фильтрации на коленке

»

Рис.4.Оптимум рН активности прьтеинаэи: 1 -субстрат гемоглобин;2 -субстрат бычий сывороточный альбумин', 3-суб-страт казеин

- in -

с сефадексом 6-75 в нвтивяых условиях я диск-электрофореза в трубках с полиакриламидним гелак в присутствиям додецилсульфата натрия.По данным ге^-фильтрацм молекулярма« масса протеиназы била 22300 t 700 Да-с доверительной вероятностей Р*0.99.По данным злехтрофорева молекулярная масса протеннаан бнлй равиа 2290С ± 500 Да с той ие доверительное вероятность!, близость значений молекулярной массы.определенной в обоих методах, свидетельствует, что очищенная протеинаэа представляет собой одноцепочвкй билон.

Кзовдехтрическая точка выделетой протеина»! по данным изоэ-лек7ричегкого фокусирования в градиенте плотности сахароэи бмла в кислом диапазоне рН и раина 4,2.

Рассматривали влияние ионов некоторых металлов на активность протеиидЭн(табл.1).Двухвалентные ионе металлов практически не

Таблица 1

Влияние ионов металлов на активность прэтеиназы

г,оль

Конечная концетреция.иМ

Остаточная актиистьД

Контроль

CaClx

KnCl»

SnClt+3DTft

s

5 5 5 5 10

влияли на активность протеезы.за исключением ионов олова,которые иигибироьалк действие протеаэн на гемоглобкн на 42Х.НнгибируЩ|ее влияние ионов олова в некоторой степени блокировалось этиледхами-нотетрауксусной кислотой,хотя сама кислота такке ингмбировала активность на 122.

Действие некоторых белковкх н небелкових ингибиторов и активаторов на прстеолитичвскув активность аретвиназы по гемоглобину показано в табл.2.Из табл. 2 видно,что,кроме пепстатина,который ингибировал активность протеиназм на SIX .ни один из приведенных ингибиторов или активаторов не влиял на протеолитическув активность з значительной степени.

Таблица 2

Влиянье белковых и небелковых ингибиторов и активаторов на активность протеинази

Ингибитор или активатор

Конечная концентрация

Остаточная активностьД

Контроль

Соевый ингибитор трипсина Картофельный ингибитор хииотрипсина Картофельный ингибитор химотрипсина и трипсина Циствин

Мвркаптовтанол Монойодацетат

8-Хлормеркурий беиэоат ениливтилсульфонил фторид Папстатин

1 мг/мл

1 иг/мл

t мг/мл 25 иМ 5 ыЫ 5 мК i мМ

1 »И

0.004 мН

100 89

89

91 103 94 24 100

100 9

На графике зависимости остаточной активности от концентрации пепстатина имеется линейный участок (рис.5).Экстраполирование прямолинейного участка до пересечения с осьв абцигс показало значение концентрации ингибитора 4В нИ.При концентрации 46 нМ активность протеазы теоретически равна нуля.Так как-конечная концентрация в реакционней смеси для протеазы была 42 нИ.то можно предположить .что взаимодействие пепстатина с протеазой осудествляется зквимолярно.

Большинство ог.жсан-ных ранее кислых аспар-тнльнкх притемнаэ животного и растительного происхождения обладает оптимумом рН активности в области 2,0 - 5,0 значений рН (Тапв.Нопв,1987).Очищенная нами лротемназа также имела оптимум рН активности,не превышавший рй 5.0.

Выделенный нами фермент проявлял наибольжув стабильность в области значений рН 3,5-6,0. Такие значения области стабильности наиболее часто встречаются у кислых аспартмльннх проте-иназ других растений (Сарбаканова,Белозерский,Занров,1988; Са11езсЬ1 еЪ а1.. 1988).

Температурная стабильность кислой протеиназы покоямихся клубней картофеля в невхх исследованиях была похожа на термостабильность аспартильной протеиназы семян сгурца при рН 5.0 (Н1Нжо»вка-Ре1с еЬ а!.,1983).

Изоелектрическая точка очищенной протеиназы совпадала с неточной Ср1=4.2) кислой аспартильной протеиназы покоящихся семян гречихи'(Белозерский и др.,1984).

Значение молекулярной кассы полученной протеиназы попадало в пределы 20000-70000 Да,что наблюдалось,по литературным данным, у большинства аспартнльных протеин«,выделенных из семян и других органов различных растений.

о

0 -Ll

100 200 нй

Концентрация Рис.5.Зависимость активности протеиназы от концентрации пепс-татина

Пвпстятю полностьи ингибировал молокоствораживавдуи активность очищенной протейный и активность по гидролизу гемоглобина. Причел эквимолярное взаимодействие пепстатши с протеиназой аналогично взаимодействие пепстатина с пепсином (Кип!мЪо еЬ а1.,1974).

Таким образом,по своим фиьико-хкмичвским свойствам оччденная нами кислая протеиназа покьацихи клубней картофеля может бить отнесена к группе аслартнлъних протеиназ.

З.Дшишша «истявностм лротевиазм м еЭ роль щш прорастанп мдбней картофеля

Изменение концентрации белка а протеплктической активности в целом клубне картофеля при прорастании и хранении отражена на рис.б.

При прорастании на 20-и день пояэились проростки клубней,на 30-й день проростки выжди из грунта н на 40-й день от закладки олыта начали формироваться листки.

а) < б)

О 20 40 60 ВО 100 0 20 40 60 80 100

Дни Дни

Рис.в.Изменение концентрации белка (а) и активности (б) в целом клубне картофеля:лри прорастании - 1,прк хранении - 2

- 18 -

При хранении кяубней картофеля в период от 40 до 50 дней на клубнях появились проростки.

В течение первих 30 дней концентрация белка при прорастают оставалась примерно на окном уровне.порядка 1,92 от сирого веса.После 30-го дня концентрация белка стала умеиыатьса и к 90-му днв снизилась в 3 рава.

При хранении клубней концентрация белка в первые 80 дней уменьяилась с 15 иг/г до 11 мг/г .С 80-го дня концентрация белка оставалась на одном уровне.но меньяем.чем в начале хранения.

При прорастании молокоствораикваищая активность в первые 20 дней понкзилась.а. начиная с 20-го дая, стала возрастать.Из 40-й день активность достигла максимума,превкяаящего первоначальную активность в 1,5 раза,В дальней«»м уровень активности умень-вился и оставался на таком ве уровне,как и в покоящихся клубнях.

При хранении протеолитическая активность, приходящаяся на 1 грани сырого "веса клубней картофеля, в перввв 40 дней несколько возросла,затем к 80-му дня уменьяилась по сравнен» с активность! в начале хранения и в дальнейшем не изменялась.

Наблвдаеинй нами характер изменения содержания белка в целом клубне совпадает с изменением белка клубнвй,описанным другими исследователями.Отличия отмечается только в сроках начала резкого уменьшения содеряания белка в целом клубне.Гаи«нами наблвддлось резкое снимение белка на5$-40-йдеиКркс.6),а Девис и Росс наблядали -на20-ЗЙ-й день(0аи1е9.1?о93,Ш7),Хигамура и Маруаиа на 90-00-1 день прорастания (Шаиига,Кагиуава,1983).

Характер изменения протеолктической активности целого клубия по створаяиванив НАС при рН 5,0 в навих исследованиях имел четко выравенный пик активности на 40-й день прорастания.превыиавщий уровень активности покоящихся клубнвй в 1,9 раза (рис.0).Зтот пик совпадает с моментом наибольяего распада белка в целом клубне.

Таким образом, можно предположить,что выделенная кислая аспартяльная протеииаза участвует в мобилизации запасного белка при прорастании,

Кжмеиеииз содержанка белка и активности,приходящихся на единицу массн клубня, для различных частей клубня в процессе прорастание показано на рис.7.

Для «они "глазков" и внежиего слоя в первые 10 дней наблв-дался рост содержания бедка.После 10-го дня прорастания содержанке белка ж »тих частях клубня умеиьжалось.Наибольжая скорость распада белка отмечалась с 10-го по 50-й день прорастания.Начиная с 90-го дня скорость распада уменьшилась,Начиная с 20-го дня для., срединной зоиж и с 30-го дня до внутренней части клубня. содержание белка стало резко уменьжаться.Наибольшая скорость

О

20 40 80

О

20 40'

60 .80 100 Дни

80 100 Дни

Рис.7.Изменение концентрации белка (а) и активности (б) при прорастании^ зоне"глазков" - 1:во внежнем слое - 2;в срединном слое - 3;жо внутренней части клубня - 4

распада била » период с 20-30-го дня по 50-й день.Затем скорость распада белка уменьшилась.

В зоне роста отмечалось два четко выраженных пика активности. Во внаинеы слое такие наблвдалось два пика,но первкй пик не явно выражен.Для зоны "глазков" первый пик набллдался на 10-й день,а для внеииего слоя на 20-й дань прорастания,Второй пик для этих участков клубня приходился на 40-й день.Для внутреннего сдоя и срединной части клубня активность в первые дни умвиьжияась.а с 20-го дня медленно увеличивалась,достигнув максимума на 40-й день прорастания.Пик активности на 40-й день отмечался как в целом клубне,так и в каждой зоне клубня.

В иавнх исследованиях содержание белка в срединном слое и внутренних тканях клубня в первые 20-30 дней прорастания изменялось неаначительио (рис.7) и соответствовало изменении,которое описали Девис и Росс для внутреннего слоя (Dawles,Ross,1987).В зоне "глазков" и внешних тканях в первые 10 дней наблвдалось увеличение содержания балка,причем в "глазках" белка било больве в 1,0 раза,чем во внаыних тканях .Зто совпадает с иаблвденияии,которые описал Новак (Nowak.1977).Вероятно,при переходе от покоя к росту а тканях,выжедиих из покоя, изменяется скорость синтеза РНК и белка,а также скорость поступления низкомолекулярных метаболитов в ткани (Кораблева,Лады1внская,Ибтлицкнй,19?6).В зтэт период уменмалось содержание белка только в тканях срединной части клубня (рис.7) и поатому возможно,что рост концентрации белка во вневних тканях,и особенно,в "глазках", связан с интенсификацией синтеза РНК и белка (Кораблева,1990),который необходим для новмх тканей проростков,появивжихся на 20-й день прорастания.

В отношении протеолитической аспартильной активности болмих различий для внутренних тканей,срединной части и вневнего слоя нв наблвдалось,так же.как и у Девиса и Росса,хотя для внежних тканей

шиса не явно выраженный пик на 20-й день прорастания.В зоне ве "глазков" отличия значительны и наблядалосъ два пика активности на 10-й м 40-й дни (рис.7).Увеличение активности на 10-й день в "глазкахисопрово«далось цшныеииеи активности в других тканях,а для целого клубня в «тот момент общая активность не изменялась. Это позволяет сделать вывод,что в первые 19 дней увеличение активности в "глазках'.возмояно,обусловлено транспортам аспартиль-ной протеиназн из других тканей паренхимы.На 40-й ие день увеличение активности наблядалось во всех участках клубня и в целом клубне и»вероятно,связано с регуляцией активности или синтезои протеин&вм de novo.Этот момент связан с появлением листков и началом фотосинтетической деятельности.

Нами было исследовано действие очищенной аспартильной протеи-нави на собственные белки клубней картофеля. 6 качестве собственных белков использовали белки второго пика влвцки при гель-хроматографии грубого экстракта клубней картофеля на колонке с сефа-дексои 6-75 (рис. 1).Белки зтого пика не обладали протеолити-ческой активность* и имели иолекулярнув массу около 40000 Да.Выбор объясняется тем,что »ти белки не обладали протеолитической активность! и их молекулярная ыасса близка к молекулярной кассе основного запасного белка клубней картофеля - пататина,составляющего 80/С всех запасных белков клубня (Racusen,Foote,1980).

Определяли оптимум рН активности по отновенив к собственный белкам.Кроме того, проводили диск-злекрофорез в недвнатурирующих условиях при рН 8.6 для белков второго лика,которые инкубировали с очищенной прргеиназой в течение двух суток при 40вС.Электррфо-реграмма запасных белков показаны на .рис. 8.

На злектрофореграимме В белков,инкубируемых с протеина-зой,отсутствует белковая зона с относительной подвивностьп О,io,которая есть на электрофореграмме А белков без протеиназн.

А

1-1-1-1--1-1-1-1-1-1-1 Втноситвльная

О 0,3 1.0 подвижность

Рис.В.Диск-мекторофорез запасных белков клубня картофеля: А - без добавления аспарти>ьной протеиназы клябией; В - с добавлением аспартильной протеинааы клубней На влектрофорегракме В бол«» беков с относительной подвижность! в диапазоне от 0.64 до 0,85.8егковая зона.имевщая от-носительнув подвижность С,97, соответствует вмделвмной протеа-зе.То есть под действием аспартильной протэиназк происходит деградация запасных белков,обладавших моньвей элентрофоретической подвижностью (г = 0,10},При зтои образуется белки,обладающий больжей относительней подвивностьв Сг = 0.&4 - 0,83).

Я ходе изучения влияния рК и температуры не протеолитичегкув активность протеиназк клубней по отноженив к собственный белкам установлено ,что оптимум рН активности аспартильной протеиназы по деградации запасных белков имея значение рН * 4,0 .такой же оптимум активности протеиназа проявляла и при протеолизе гемоглобина (рис.4).Температурный оптимум активности протеиназы при действии на запаснме белки совпадал с оптимумом активности при действии на экзогенные белки при температуре 40°С.

Таким образом,свойства полученной аспартильной протеа-зы:кислый оптимум рН,увеличение активности в процессе прорастания клубней,совпадение по времени максимума активности и уменьжения концентрации белков клубня,локализация в зоне "глазков" в период образования проростков,а также гидролиз неочищенных запасных белков с оптимумом активности при рН 4.0, показывав?, что кислая ас-

партильнвя протеиназа клубней картофеля участвует в деградация запасных белков при прорастании.

Наличие в покоящихся и прораставших клубнях протвииази,сходен по свойства» с пепсином,дает возмодносто при безотходно* технологии переработки картофеле получать молокоствораиивавций фермент.Способность агпартильной протеиназы деградировать собственные белки клубней модет быть использована для очистки отходов крахмального производств«.

ВШ0Д1

¡.Выделена и очмщена (в ВО раз) до гомогенного состояния по данным электрофореза кислая аспартхлънал протеиназа покоящихся клубнэй картофеля.

2.Протеиназа представляет собой простой белок с молекулярной кассой 22300 Да по данным гель-фильтрации и 22900 Да по данных дхск-злектрофорева в присутствия додецнлсульфата натрия.

3.Протеиназа гидролхэует экзогенные белки- гемоглобин.казеин. ВСЯ и собственные белки. Оптимум рН активности для гемоглобина рН * 4,0, для казенна рЯ = 2,П.для 5СА рН « 9,0 и для собственнмх белков клубия картофеля рН » 4,0.Область рН стабильности - рН 3,5 -6,0 ;температурнмй оптимум активности ж для экзогенных и для эндогенных белков наблвдаегся при 40°С.Полная потеря активности наступает при температуре 80°С.Изоелектрическая точка протеиназы р1 * 4,2 .

4.Ингибиторы сериновых и цхстемиових протеаз (фенилме-тилсульфонил фторкд.р-хлормеркурий бенэоат.монойодацетат).белковые ингибиторы хкмотрипсмна и трипсина клубней картофеля,актива-тори Сцмстеин.меркаптоэтанол) влияния на активность протзиназы не оказывав*.Полностью активность протеиназы ннгибируется пепстати-ном,взаимодействие которого с протекназой происходит экеимолярно.

5.Кены двухвалентных металлов практически не действуют на

активность протеиназн,за исключением ионов олова,которые ингиби-руят активность на 422. Этилендиаиинотетрауксуснаа кислота в незначительной степени на 12% ингибиргует гидролиз гемоглоби-на.что указывает на возможное присутствие в активном центре про-теиназы двухвалентных ионов.

6.В покоящихся клубнях распределение аспартильной протеоли-тической активности отличается незначительно:во внутренней части клубня и срединном слое уровень активности 33 ед/г и во внежнем слое и "глазках" - 30 ед/г,

7.Выявлено изменение активности кислой аспартильной протеи-назн при хранении и увеличение активнисти при прорастании в целом хлубне и частях клубня.Наиболмая активность протеиназн при прорастании проявляется в "глазках" клубней в период образования проростков и в целом клубне и "глазкая"в период образования листков.

5.Выделенная протеиназа участвует в деградации собственных

«I

запасных белкой при прорастании.

9.Практические рекомендации:возмо«но получение из отходов крахмального производства молокоствораживавщего фермента,препарат аспартильной протеиназн можно использовать при очистке этих отходов от белков.

Список работ,опубликованных пи материалам диссертация

1.3обенко В.Я..Проскуряков М.Т.Выделение кислой молокоство-раживавщей протеазы из клубней картофеля // Некоторые вопросы медицинской и прикладной энзимологии/ Кцбан.мед,ин-т.Краснодар . 1938. С. 100—104.

2.3обенко В.Я..Проскуряков М.Т. Активность кислой протеазы в прорастающих и хранящихся клубнях картофепя//Актуальные вопроси экологии и охраны природы экосистем малых рек.4.1/Кубан. гос.ун-т.Краснодар,1992,С.68-70,

З.Зобенко В.Я..Проскуряков II.Т.Физико-химические методы очистки протеиназы клубней картофела//Тезисы докладов второго иеждународного семинара *'Кондактометрия-92".Краснодар, 1992.С.2В.

4.3обенко В.Я..Проскуряков Н.Т.Ингибирование мплокосвертыва-вцей активности ферментов пепстатином//Акт1'альные вопросы экологии и охраны природы предгорных экосистем.Ч.2/Кубан.гос.ун-т. Краснодар,1995.С.179-101.

5.3обенко В.Я.,Проскуряков К.Т. Аспартильная протеаза клубней каргофелЯ//111 симпозиум "Химия протеолитических ферментов":

Тезисы докладов и стендовых сообщений, М.,1993.С.55,

0

Подписано в печать 25.05.93. Формат бумаги 60x84 1/16. ¡¡сл.п.л. 1,3 Зч.-изд.л. 1,0. Тирам 100 экз. Заказ ОЛЙ' Подразделение оперативной полиграфии КубГУ 350023 Краснодар,ил. Октябрьская, 25