Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антивирусная активность новой лекарственной формы интерферона для местного применения

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Антивирусная активность новой лекарственной формы интерферона для местного применения"

На правах рукописи

Выжлова Евгения Николаевна

Антивирусная активность новой лекарственной формы интерферона для местного применения.

03.00.06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2008 г ^¿-Ьг^/''^

003166126

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно - исследовательский институт эгшдемиотогии и микробиоюгии имени почетного академика Н Ф Гамалеи РАМН и в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт вирусологии им ДИ Ивановского РАМН

Научные руководители

доктор биологических наук, профессор доктор биочогических наук, профессор

Валентина Васильевна Малиновская Георгий Артемьевич Галегов

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Ведущая организация ГУ НИИ вакцин

Никочай Николаевич Носик Сергей Викторович Ожерелков

и сывороток им ИИ Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится «/f» 2008 г в/У? ¿-квасов на заседании

Диссертационного совета Д 001 026 01 при Государственном учреждении Институт почиомиелига и вирусных энцефалитов имени М П Чумакова РАМН по адресу 142782 Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М П Чумакова РАМН

Автореферат разосчан « kf » <а— 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат биочогических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Проблема терапии наиболее распространенных и социально значимых вирусных инфекций (ОРВИ, инфекции вируса семейства герпеса) крайне актуальна в настоящий момент, поскольку именно эти инфекции относятся к самым распространенным вирусным инфекциям среди насетения Местные проявтения герпетической, аденовирусной или гриппозной инфекции встречаются практически у каждого человека ежегодно

В работах (Ванько Л В , Кудашов НИ и др , Железникова Г Ф , Иванова В В и др Коломиец А Г , Малевич Ю К , Котомиец Н Д ) у становлено, что инфицирование вирусами семейства герпеса ити вирусами семейства гриппа может существенно изменять иммунный ответ организма на различные патогены Выявлено (Мальханов В Б и др , Железникова Г Ф и др), что при персистенции ВПГ - инфекции, аденовиру са или вируса гриппа в тканях происходит нарушение функционирования иммунитета на местном уровне, что может приводить к вторичным бактериальным инфекциям, а также к рецидиву заболевания

Местные офтальчотогические проявления ВПГ и аденовирусной инфекции имеют общую симптоматику, зачастую невозможно четко дифференцировать эти заболевания без серодиагностики возбудителя Для вирусов гриппа так же актуальна проблема серодиагностики, поскольку многие вирусы и другие микроорганизмы, поражающие респираторный тракт, имеют общую симптоматику, а диагностика возбудителей инфекции проводится не повсеместно

Обилие специфических противовирусных препаратов не решает проблему полностью, поскольку довольно часто имеет место инфицирование вирусами с устойчивостью к специфическим лекарственным препаратам Специфические противогерпетические препараты, обладая высокой активностью при купировании проявлений инфекции, не достаточно эффективны в предупреждении возникновения рецидивов Следует отметить, что специфические химиотерапевтические препараты для терапии аденовирусных заболеваний отсутствуют

Стожности при идентификации возбудителя, изменчивость возбудителей и устойчивость к химиопрепаратам требуют применения для терапии заболеваний универсальных противовирусных средств, обладающих активностью по отношению к широкому спектру виру сов

Показано участие системы антиокислительной защиты ор1анизма в патогенезе вирусных и бактериальных инфекций, и в развитии многих других заболеваний (Впадичиров Ю А, Волгарев А П , Горбу нов Н В , Быкова НО) Доказано участие антиоксидантов в регуляции клеточного иммунитета (Новоселова Е Г , Макар В Р , Сечилетова Н В , и др , 81а§паго Я,

Pierri I, Piovano P, at all) Внутриклеточный окистительно-восстановитетьный баланс является регутяторным фактором в процессах Т- клеточной активации, секреции лимфокинов макрофагами а также клеточной гибели при апоптозе Выявлено стимулирующее воздействие антиоксидантов на фагоцитиру ющу ю активность макрофагов, антиоксиданты защищают Т-ктетки от гибели по апоптотическому типу под воздействием ФНО (Чекнев СБ) Показано, что антиоксиданты обладают противовирусной активностью in vitro при использовании антиоксидантов наблюдается торможение развития вирус -индуцированного цитопатнческого действия вируса на культуру клеток (Ананьев В А, и ДР)

Интерферон человеческий рекомбинантный альфа-2 является аналогом нативного интерферона альфа человека, относящегося к интерферонач первого типа, обладает противовирусными, иммуночодутирующими и антипролиферативнычи свойствами, и антимикробной активностью за счет способности стимулировать систему фагоцитов ИФН является универсальным противовирусным средством и высоко эффективен в отношении широкого спектра вирусов (Ершов Ф И , 90, 145)

В исследованиях (Малиновская В В ) показано, что антиоксиданты способны влиять на функционирование и активность системы ИФН в организме

Согласно данным литературы (Dal Negra et all Steward, A , Baylev, D L , Howes, С , Tupasi T E et all) местное применение препаратов интерферона для терапии вирусных инфекций является перспективным направлением, поскольку обеспечивает высокую концентрацию интерферона в очаге воспаления, и дает возчожность проводить кроме противовирусной терапии местную имчу нокоррекцию Доказано, что альтернативные пути введения лекарственных веществ через различные слизистые оболочки или кожу в некоторых случаях более приемлемы, поскольку не требуют специальных навыков и не оказывают негативного воздействия на внутренние органы человека (Aungst, В J Rogers, N J , Sheñer, E , Elkayam, R Et all, Senel S , Kremer M , Nagy К , Squier С )

Таким образом, разработка новой комбинированной пролонгированной лекарственной формы для местного применения в виде раствора, включающей интерферон альфа-2 человеческий рекомбинантный, комплекс антиоксидантов и другие вспомогательные вещества, а также изучение ее противовирусной активности, в том числе совместно с другими противовирусными средствами является перспективной задачей Цели и задачи исследования Цель исследования

разработать новую пролонгированную лекарственную форму для местного применения, обладающую широким спектром противовирусной активности на основе интерферона в

комбинации с антиоксидантами и дру гими вспомогательными веществами Исходя из этого бьпи поставлены следу ющие задачи

Обосновать состав и изучить взаимодействие основных и вспомогательных компонентов и их концентрационных соотношений с целью обеспечения необходимых физико-химических биологических и фармацевтических свойств новой лекарственной формы

Изучить активность новой лекарственной формы на модели ку льтуры клеток с использованием эталонных штаммов вир\сов простого герпеса первого и второго типа, аденовируса и виру сов гриппа

Из\чить активность новой лекарственной формы на модели культуры клеток с использованием вирусов простого герпеса и вирусов гриппа с лекарственной устойчивостью к противовиру сныу1 препаратаУ!

Изучить эффективность новой лекарственной формы в отношении клинических изолятов вируса простого герпеса и эпидемических штамуюв вирусов гриппа сезона 2006 - 2007 года

Исследовать возможность сочетанного приугенения новой лекарственной форупл и других противовиру сных препаратов, активных в отношении виру сов герпеса и гриппа (ну клеозидов и нуклеотидов, ациклических аушнов, производных фосфоновой кислоты) Оценить эффективность коу1бинации новой лекарственной форУ1ы и противовирусных препаратов в отношении вирусов герпеса и гриппа Научная новизна

В опытах in vitro показано, что комбинация интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного, выбранного коушлекса антиоксидантов унитиол - лиуюнная кислота, стабилизатора активности интерферона альбуушна сывороточного человеческого, полимера - пролонгатора натрий - карбоксиугегилце л полозы и других вспоуюгательных веществ (борной кислоты натрия тетрабората, натрия хлорида) позволяет усилить специфическую противовирусную активность интерферона в несколько раз Так в отношении ВПГ-1 штамм Л2 коутлексный состав препарата обеспечивает усиление специфической противовирусной активности в 3,85 раза

Выявлена значитетьная противовирусная активность новой лекарственной формы в отношении вирусов простого герпеса, в тоу1 числе по отношению к ВПГ-1 с гекарственной устойчивостью к ацикловиру, и по отношению к клиническиУ1 изолятаУ1 вируса простого герпеса Новая лекарственная форуга обладает выраженной противовирусной активностью по отношению к аденовирусу человека Ad5 и вирусам гриппа A H1N1/USSR/77, AH3N2/Aichi/68, варианту вируса гриппа AH3N2/Aichi/68 изотированноУ1у из легочной ткани инфицированных животных и в отношении эпидеушческих штаммов виру са гриппа А сезона 2006-2007 г , чувствительных и резистентных к рцушнтадину, а такжев отношении

эпидемического штамма вир} са гриппа В сезона 2006-2007 г

Установлено, что противовирусная активность разработанной лекарственной формы зависит от концентрации препарата, схемы внесения препарата и множественности инфицирования Препарат обладает достаточной эффективностью при внесении одновременно или непосредственно после инфицирования, наиболее эффективно противовирусное действие препарата проявляется при предварительном внесении до инфицирования что свидетельствует о потенциале лекарственной формы в качестве как лечебного так и профилактического средства

Выявлено, что разработанная лекарственная форма составляет эффективные комбинации со многими противовиру снычи препаратами причем с некоторыми из них комбинирование носит синергидный характер при совместном присутствии препаратов их концентрации, обладающие противовир\сной активностью, значительно ниже, чем концентрации для взятых в отдельности соединений, что обосновывает принципиально новые схемы терапии виру сных инфекций

Практическая значимость

Разработан состав новой пролонгированной лекарственной формы широкого спектра действия на основе интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного в комплексе с антиоксидантами и другими вспомогательными веществами, стабильныи в процессе хранения Разработанная лекарственная форма удобна для применения при многих формах вирусных инфекций и может быть использована в тех областях клинической медицины, где ранее местная терапия препаратами интерферона не проводилась в гинекологии при лечении герпес - ассоциированных эндометритов у женщин а так же в урологии при лечении герпетических \ретритов у мужчин и женщин Доказана значительная противовирусная активность разработанного препарата в отношении вирусов гриппа, простого герпеса, аденовируса, в том числе в отношении вариантов вирусов с лекарственной устойчивостью к специфическим хичиопрепаратам и в отношении клинических изолятов вирусов, выделенных от больных Пол\ченные данные о значительной противовирусной активности новой лекарственной формы в отношении различных видов вирусов позволят разработать эффективную тактику терапии в случае неэффективности традиционных химиопрепаратов Возможность комбинирования новой лекарственной формы с другими специфическими противовирусными препаратами дает основание для разработки принципиально новых схем комбинированной терапии вирусных инфекций, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений, и, следовательно, избежать проявления побочных токсических эффектов при сохранении высокой эффективности

Внедрение результатов работы

Состав разработанной лекарственной формы защищен патентом (Патент РФ 1Ш 2270692 «Пролонгированный раствор интерферона»/Малиновская В В Малиновский Е Ю, Выжтова Е Н заявители и патентообладатели Малиновская В В , Малиновский Е Ю , Выжлова ЕН- № 2004132134/15, заявл И 04 2004, оп>бл 27 02 2006-Бюл №6-7 с) 25 января 2007 года в Федеральна ю с 1ужбу по надзору в сфере здравоохранения и социального развития в ФГУ НЦЭСМП поданы документы на регистрацию разработанной лекарственной формы (торговое название Виферон, раствор для честного применения), в настоящий время проходит экспертиза с целью регистрации новой лекарственной формы К^ХУогк 47886, 105216 В соответствии с требованиями Федерального закона №86-

ФЗ от 22 06 1998 г «О лекарственных средствах» и распорядительными документами Федеральной сл\жбы Росздравнадзора в рамках регистрации новой лекарственной формы были проведены исследования общетоксического и аллергенного действия В результате экспериментального исследования, проведенного в Научно-исследоватетьскоч центре токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов, г Серпухов, на половозрелых и неполовозрелых животных, установлено, что препарат не обладает выраженными токсическими свойствами, не проявляет аллергизирующего и имму нотоксического воздействия, что дает основание для проведения дальнейших клинических исследований эффективности и переносимости нового препарата Апробация работы

Материалы диссертации доложены на конгрессе «Человек и лекарство», г Москва в 2007 году, на международном симпозиуме Общества исследоватетей интерферонов и цитокинов в Оксфорде, Англия в 2007 г По материалам диссертации опубликовано 3 нау чных работы в отечественной и зарубежной печати, а также получен патент РФ 1Ш 2270692 (Малиновская В В , Малиновский Е Ю , Выжлова Е Н «Пролонгированный раствор интерферона»)

В завершенном виде рез\ льтаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании научной конференции отдела интерферонов ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН 6 марта 2008 года

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав, содержащих резутьтаты собственных исследований, обс\ждения результатов, выводы и практические рекомендации и указателя литерал\ры изложена на 155 страницах машинописного текста, иллюстрирована 37 таблицами и 15 рисунками Список литературы состоит из 218 работ отечественных (123) и зарубежных (95) авторов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Вирусы В работе использованы 23 штамма различных вирусов вирус энцефаломиокардита мыши (ЕМС), штамм Кистинга 40614, 15 штаммов вируса простого герпеса из них два эталонных штамма ВПГ-1 штамм Л2 и ВПГ-2 13 клинических изолятов, выделенных с использованием ку льту ры клеток из материала, полученного от больных (слюна, моча, сперма), в период 2005-2006 года, а так же лабораторный штамм ВПГ-1 J12 резистентный к ацикловиру, эталонный вариант аденовируса человека Ad5, 6 штаммов вируса гриппа из них 2 эталонных варианта - вирус гриппа A H1N1/USSR/77 и вирус гриппа AH3N2/Aichi/68, вариант вируса гриппа AH3N2/Aichi/68, изолированный из легочной ткани инфицированных животных, эпидемические штаммы вируса гриппа А сезона 2006-2007 г , чувствительные и резистентные к ремантадину, эпидемический штамм вируса гриппа В сезона 2006-2007 г Штамм вируса энцефаломиокардита мыши был получен в отделе интерферона ГУ НИИ Эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи РАМН, другие эталонные штаммы были получены в лаборатории коллекционных штаммов вирусов ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН Эпидемические штаммы вируса гриппа сезона 2006-2007 любезно предоставлены ведущим научным сотрудником ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН Е И Бурцевой

Культуры клеток В работе использовали 5 линий культур клеток культуру клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), культуру клеток почки африканской зетеной мартышки, клон Е6 (Vero Е6), культуру клеток легкого эмбриона человека (MRC-5), культуру клеток почки эмбриона человека, трансформированной ДНК аденовируса типа 5 (293), культуру клеток почки собаки (MDCK) Использованные культуры относятся к перевиваемым монослойным культурам, культивирование и пересев кульлур осуществляли по общепринятым методикам с использованием питательных сред и эмбриональной телячьей сыворотки

Определение цитотоксического действия веществ О цитотоксическом действии различных веществ, включая человеческий рекомбинантный интерферон альфа-2, судили по влиянию присутствия этих веществ на жизнеспособность клеток и их морфологию За 50% тканевую цитотоксическую концентрацию вещества (ТЦД50) принимати такую концентрацию, которая вызывала цитотоксические изменения в 50% клеток на 4 сутки наблюдения (через 96 часов), для идентификации живых и мертвых клеток использовали краситель трипановый синий Также в работе определяли максимально переносимую концентрацию вещества (МПК) - концентрацию вещества, воздействие которой не вызываю видимых цитодеструктивных изменений клеточного монослоя

Определение цитопатической дозы вируса Определение 50% тканевой цитопатической

дозы вируса (ТЦИД50) проводили чикрочетодоч с использованиеч культуры клеток За ТЦИД50 вируса принимали минимальное разведение вируса, вызывающее 50% поражение клеточного чонослоя при отсутствии дегенерации клеточного монослоя в контроле В работе также определяли тканевую цитопатическую дозу вируса методом бляшкообразования Определенную таким образом цитопатическую дозу вируса выражали как число бляшкообразующих единиц в 1 мл (БОЕ/мл) Зная число клеток в 1 мл (посевная доза, умноженная на индекс пролиферации культуры), рассчитывали дозу вируса как число бляшкообразу ющих единиц на клетку (БОЕ/клетку)

Определение специфической противовирусной активности интерферона. Для определения специфической противовирусной активности препарата использовали индикаторный штамм вируса энцефалочиокардита мышей (ЕМС) и 2-3 суточный монослой ку льту ры клеток СПЭВ или Vero Опреде ление проводили в сравнении с Отрас тевым стандартным образцом активности человеческого рекомбинантного интерферона альфа —2 (ОСО 42-28-369-03), активность которого составляет 106 МЕ/чт

Определение протнвогерпетической, противоаденовирусной и противогриппозной активности веществ и препаратов in vitro Проводили путем оценки способности препарата предотвращать развитие виру синдуцированного цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, и путем оценки снижения инфекционного титра виру са под воздействием разчичных концентраций препарата Концентрацию вещества, обеспечивающую 50% ингибирование вирусного ЦПД, обозначали как ИД50, концентрацию вещества, обеспечивающую полную 100% защиту клеточного чоностоя от виру синдуцированного ЦПД, обозначали как ЭДюо В качестве оценки цитотоксичности и активности соединений использовали понятие хичиотерапевтического индекса (ХТИ), вычисляемого как отношение МПК к ИД50 Согласно данным литературы дтя хичиотерапевтического препарата значение ХТИ должно быть более или равно 3

Определение противовирусной активности комбинации соединений in vitro Проводили по методу Anhal at all, 1980 и Neyts J , De Clercg E, 1997 Концентрации одного вещества и другого в комбинации которые приводили к 50% ингибированию вирусного ЦПД, обозначали как ИДз0 и сравнивали по отношению к концентрации этого вещества, вызывающего 50% ингибирование вирусного ЦПД, если его исстедовали не в комбинации Дтя оценки эффективности комбинации использовали понятие фракционного ингибиру ющего индекса (ФИК), значение которого вычисляли по формуле

сумма ИД^соединений в комбинации)

ФИК =-

сушш ИД ^(соединений)

При значении ФИК 0,5 имеет место умеренный синергизм соединений, при значении

ФИК равном 1,0 -1,5 имеет место аддитивный эффект комбинации, при значении ФИК более 2 имеет место антагонизм соединений

Так же по рез} -штатам определения ИД50 двух веществ в комбинации строили изоболограмчы по общепринятом}' методу по оси абсцисс откладывали концентрации ИД50 одного вещества в комбинации, по оси ординат откладывали концентрации ИД50 др> гого вещества в комбинации В этих координатах строили кривую, точки которой соответствовали 50% ингибированию вирусиндуцированного ЦПД комбинации веществ в соответствующих концентрациях Синергидный противовир} сный эффект комбинации веществ выражался в наличии экспоненциальной зависимости, радиус кривизны которой быт направленной к центру оси координат, при наличии линейной зависимости эффект комбинации соединений приближался к аддитивном} При наличии экспотенциальной зависимости, ради}с кривизны которой был направлен вверх - в противоположи}ю от центра оси координат сторон}', проявлялся антагонистический эффект комбинации веществ

Препараты Для разработки новой лекарственной формы использовали след}ющие вещества интерферон человеческий рекомбинантный альфа-2, с}бстанция ФСП 42-11082-06, производства ДГУПП Вектор-фарм, Новосибирская обл пос Кольцово, активность 4* 107 МЕ/мл, натрий карбоксиметилцеллюлоза (Na-КМЦ), марки Blanose 12М31Р, 7HOF, 7MF производства фирмы Hercules Франция, гидроксиэтилцеллюлоза (ГЭЦ), марки Natrosol, 250 НХ, 250 ННХ, производства фирмы Hercules, Франция, альбумин сывороточный человеческий, 10% раствор для инф}зий, ФСП 42-0381-3757-02 производства ОАО «Биомед» им Мечникова, Россия, дичеркаптопропанс\ льфонат натрия, под торговой маркой Унитиол ФСП 42-0348-4718-03, производства ФГУП «Технолог СКТБ», Россия, лимонная кислота, ГОСТ 908-79, производства ЗАО Белгородский завод лимонной кислоты «Цитробел», Россия, борная кислота, ГФХ, производства ФГУП Мосхомфарч препараты им Семашко, Россия, натрия тетраборат, ГФ X, производства ЗАО Ярославская фармфабрика натрия хлорид, НД 42-10525-99, производства Акзо-Нобель Салт А С , Дания, цистеин НД 42-11785-01, производства Аджиномото Ко Инк Япония, метионин НД 42-11249-06 производства Аджиномото Ко Инк, Япония, кофеин бензоат натрия НД 42-12622-02, производства Шандонг Ксинху а Фармасьютикал Ко Лтд, Китай, тиочочевина (тиокарбачид), (NH2)2CS, ГОСТ 6344-73, производства ООО «МСД», Россия, этилендиаминтетра}кс}сная кислота (ЭДТА), каталог Fluka, кат №46081, дичетил сульфоксид, (CH3)2SO, каталог Sigma, кат № D2650 рибофлавин, производства ДСМ Н}тришнл Продактс Франс С а С, Франция, натрия сульфит Na2S03, каталог Sigma-Aldrich, кат № S0505, натрия тиосульфат Na2S20j, каталог Fluka кат № 72049, натрия метабисульфит Na2S2Û5, каталог Sigma-Aldnch, кат№ 161519, аскорбиновая кислота, с}бстанция, НД 42-

13554-05, производства ДСМ 11\тришн I Продактс (ЮК) Лимитед, Великобритания, калий йодистый К1, субстанция, ФСП 42-0210-0884-01, производства ОАО Троицкий йодный завод, Россия, дигидрокверцитин, субстанция, ФСП 42-0083-0185-06, производства ООО «Флавир», Россия, Ь-Цистин, [-8СН;СН(\Н;)СО:Н|; каталог АЫпсЬ, кат № С122009, >}-Ацетилцнстеин, субстанция, ФС 42-1142-88, производства ГУП «Иммунопрепарат», Россия Для изучения возможности комбинирования новой лекарственной формы и других противовирусных средств использовали следующие препараты ацикчовир, субстанция, НД 42-14057-06, производства Хубей Йтай Фармасеутикал Ко Лтд, Китай, ганцикловир, торговое название «Цимивен», производства Ф Хоффманн-Ля Рош Лтд, Швейцария, 9-[3-0-арабинофуранозиладенин (АраА), торговое название «Вира МП», производства Пьер фабр, Франция, ИДУ, 5-йод-2'-дезоксиуридин, торговое название Офтан-Иду, производства Сантэн АО, Финляндия, (Е)-5-(брочовинил)-2'-дезоксиуридин (БВДУ), торговое название «Гелпин», производства Берлин-Хеми, Германия, рибавирин, субстанция, НД 42-14800-07, производства Цзянлин Бэньда Фармасеутикал Ко Лтд, Китай, тринатриевая соль фосфорномуравьиной кислоты (ФМК), торговое название «Фоскарнет натрия», производства ООО «НПП Поликом», Россия, фосфит ацикловира, получен в Институте молекулярной биологии имени В А Энгельгардта, римантадина гидрохлорид, субстанция, НД 42-12125-02, производства Чжецзян Кангю Фармацеутикал Ко Лтд, Китай

Животные Для пол\чения изолята вируса гриппа штамм АНЗМ2/АюЬ|/68 использовали линейных белых мышей ВАЬВ/с весом 7-8 г Животных получали в питомнике РАМН

Стандарты В качестве стандарта активности человеческого рекомбинангного интерферона альфа-2 в работе использовали Отраслевой стандартный образец активности интерферона ОСО 42-28-369-03, с активностью 106 МЕ/мл, полученный в ФГУН ГИСК им Л А Тарасевича Роспотребнадзора

Статистическая обработка результатов Для получения достоверных результатов каждый эксперимент повторяли не менее трех раз Для обработки результатов эксперимента использовали описательную статистику вычисляли среднее значение, рассчитывали стандартное отклонение

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка новой лекарственной формы интерферона для местного применения

В резу льтате изучения свойств различных марок потичеров быта определена наиболее приемлемая концентрация полимера в готовой лекарственной форме - 1%, предложена технология изготовления препарата для обеспечения надлежащей микробиологической чистоты, заключающаяся в комбинации метода мембранной фильтрации термически нестабильных компонентов и метода термической стерилизации концентрата полимерной основы При исследовании способности полимера влиять на специфическую противовирусную активность ИФН было установлено, что чарка полимера не влияет на активность ИФН при изготовлении, однако в процессе хранения наибольший стабилизирующий эффект был получен при использовании натрий карбоксичетилцеллюлозы марки 7НОР Так же было установлено, что без включения в состав препарата альбумина сывороточного человеческого невозможно обеспечить стабильность ИФН в процессе хранения, определенная минимальная эффективная концентрация альбумина в НЛФ, обеспечивающая активность препарата в течение всего предполагаемого срока хранения соответствует 0 5%

При исследовании способности выбранной боратной буферной системы обеспечивать рН новой лекарственной формы в интервале 5-9, был определен состав бу ферных компонентов в готовой лекарственной форме 5,7% борной кислоты и 8,4% натрия тетрабората Выбранная буферная система обеспечивает не только рН лекарственной формы в приемлемом диапазоне, но и сохранность микробиологической чистоты препарата в процессе использования пациентом, поскольку борная кислота и натрия тетраборат обладают бактерицидной и фу нгистатической активностью

При изучении способности антиоксидантов влиять на специфическую противовирусную активность ИФН, в том числе в процессе хранения было установлено, что наибольший синергидный эффект наблюдается при использовании рибофлавина, унитиола, кофеина бензоата натрия, метионина, цистеина, аскорбиновой кислоты и тиочочевины При изучении влияния антиоксидантов на активность интерферона в процессе хранения наилучший результат был получен для унитиола Образцы, содержащие аскорбиновую кислоту, теряли свою активность в первые месяцы после изготовления, поскольку аскорбиновая кислота крайне неустойчива в водных растворах В процессе окисления аскорбиновой кислоты и других нестабильных антиоксидантов, как и в случае использования сильных восстановителей четабисульфита натрия и тиосульфата натрия, образуются перекисные радикалы, способные окислять и молекулы интерферона В образцах, содержащих легкоокисляющиеся соединения, в процессе хранения наблюдали

изменение агрегатного состояния препарата выпадение осадка и помутнение исходного раствора Таким образом, мы останови™ свой выбор на унитиоле, так как он является достаточно активным антиоксидантом, при комбинировании унитиота и ИФН наблюдается синергидныи эффект, выражаемый в увеличении специфической противовирусной активности ИФН, кроме того, унитиол способен длительно сохранять свою активность в водных растворах

При исследовании возможности включения в состав НЛФ сильных восстановителей и хелатообразователей для стабилизации активности антиоксидантов и ИФН были получены данные, свидетельствующие о том, что присутствие сильных восстановителей совместно с ИФН недопустимо, поскольку их окисление влияет на стабильность ИФН и агрегатное состояние НЛФ в процессе хранения Установлено, что наилучшей стабилизирующей активностью по отношению к ИФН и выбранному антиоксиданту обладает лимонная кислота в концентрации 0,2%

При расчете изотонических эквивалентов по ЫаС1 было предложено включить в состав НЛФ натрия хлорид в количестве 0,3%, и, таким образом, определен окончательный состав новой лекарственной формы

Интерферон человеческий рекомбинантный альфа 2,

субстанция 40000 МЕ

Унитиол 0 002 г

Лимонная кислота 0,002г

Альбумина раствор 10% 0,02 мл

Борная кислота 0,01 г

Натрия тетраборат 0 007г

Натрия хлорид 0,003г

Натрий карбоксиметилцеллюлоза 0,005г

Вода очищенная до 1 мл

Разработанная нами новая лекарственная форма обладает противовирусной активностью за счет входящего в ее состав интерферона человеческого рекомбинантного альфа-2, усиленной присутствующими в составе антиоксидантами (унитиот и лимонная кислота), стабильна в процессе хранения, имеет пролонгированное действие благодаря присутствию потимера, имеет физиологический рН за счет буферных коушонентов и изотонична, что позволяет использовать ее как на слизистых оболочках респираторного тракта и гениталий, так и для терапии офтальую логических вирусных заболеваний

Изучение спектра противовирусной активности новой лекарственной формы Характеристика выделенных на культуре клеток штаммов ВПГ При исследовании

выделенных из клинического материала вариантов вируса герпеса по МФА и реакции нейтрализации со специфическими антисыворотками установлено, что все штаммы относятся к ВПГ тип 1 Два из выделенных изолятов относятся к ацикловирчувствительным разновидностям ВПГ-1, один из изолятов умеренно чувствителен к ацикловиру и один изолят относится к ацикловирезистентным штаммам ВПГ Все 12 изолятов вируса простого герпеса высокочувствительны к тринатриевой соли фосфономуравьиной кислоты, включая варианты, имеющие низкую чувствительность к ацикловиру Все выделенные изоляты пригодны для проведения опытов m vitro и использованы нами для оценки противогерпетической активности новой лекарственной формы, а так же для оценки эффективности комбинации новой лекарственной формы с другими хичиотерапевтическими препаратами

Цитотоксичноть НЛФ и других соединений на культуре клеток СПЭВ, Vero Е6, MRC-5, 293, MDCK ТЦД50 НЛФ на кутьтуре клеток (все используемые в работе линии) равна 10000 МЕ/мл, МПК 625 МЕ/чл ТЦД5о субстанции интерферона альфа-2 человеческого рекочбинантного равна 1000 МЕ/чл, МПК 312,5 МЕ/чл

Противогерпесвирусная активность новой лекарственной формы Оценку проводили по отношению к эталонному штамму ВПГ-1 JI2, по отношению к свежевыделенным из клинического материала вариантам ВПГ, в том числе с лекарственной устойчивостью к ацикловиру Установлено, что НЛФ обладает выраженной противовирусной активностью, как при высокой так и при низкой множественности заражения ИД50 при ИМЗ 0,1 БОЕ/Кл составила 250 МЕ/мл, ИД50 при ИМЗ 0,01 БОЕ/Кл составила 156,25 МЕ/мл ЭДюо при ИМЗ 0,1 БОЕ/Кл составила 5000 МЕ/чл, ЭДюо при ИМЗ 0,01 БОЕ/Кл составила 1250 МЕ/чл Параллельно для оценки состава разработанной НЛФ мы провели анализ противогерпесвиру сной активности субстанции интерферона человеческого рекочбинантного альфа-2 ИД50 при ИМЗ 0,1 БОЕ/Кл составила 962,5 МЕ/мл, ЭДюо при ИМЗ 0,1 БОЕ/Кл составила 962,5 МЕ/мл Сравнив ИД50 при ИМЗ 0,1 БОЕ/Кл субстанции ИФН равную 962,5 МЕ/мл и НЛФ равную 250 МЕ/мл можно сделать вывод о том, что вспомогательные вещества, входящие в состав НЛФ усиливают ингибирующую активность интерферона на вирусиндуцированное ЦПД примерно в 3,85 раза

При анализе способности выбранного антиоксиданта унитиола влиять на репродукцию вируса простого герпеса в культуре клеток по сравнению с другими сильными антиоксидантачи токоферола ацетатом, аскорбиновой кислотой и антиоксиданточ Фенамоч, любезно предоставтенным директором Института им Эммануэля Бурлаковой Е Б установили, что унитиол обладает выраженной противогерпесвиру сной активностью при чалой токсичности ХТИ унитиота равен 4, ХТИ токоферола ацетата 0, фенача - 1,

раствора аскорбиновой кистоты с рН 7,16 - 0, с рН 5,48 - ботее 8 Оценка эффективности комбинации ИФН и унитиола по методу АпЬа1 а1 а11, 1980 и №у1з I, Ое С1егс§ Е, 1997 показала, что ФИК комбинации равен 0,32, что свидетельствует о значительном синергизме соединений Полученные данные свидетельствуют о том, что разработанный состав лекарственной формы обладает выраженной противогерпесвирусной активностью, и что присутствующие в НЛФ компоненты способствуют усилению специфической противовиру сной активности интерферона

При исследовании активности НЛФ в отношении выделенных изолятов ВПГ-1, в том числе по отношению к вариантам вируса с лекарственной устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам установлено, что НЛФ влияет на репродукцию вариантов ВПГ, чувствительных к ацикловиру в культуре при концентрации 6250 МЕ/мт наблюдается снижение инфекционного титра виру са в среднем на 1,9 ^ БОЕ/чл, при концентрации препарата 2500 МЕ/чл наблюдается снижение инфекционного титра вируса по сравнению с контролеч в среднем на 1,5 БОЕ/мл При изучении влияния препарата на репродукцию ацикловиррезистантных вариантов изолятов ВПГ получены следующие данные под воздействием препарата в концентрации 625 МЕ/чл происходит снижение инфекционного титра вируса на 2,5 БОЕ/чт по сравнению с контролем

Таким образом, полученные нами данные о противовирусной активности НЛФ в отношении вируса простого герпеса тапа 1 и 2, и в отношении клинических изолятов ВПГ, в том числе с лекарственной устойчивостью к ацикловиру, свидетельствуют о значительной противогерпесвиру сной активности НЛФ Активность НЛФ в отношении ацикловиррезистентных штаммов ВПГ позволит проводить терапию герпесвирусных инфекций при неэффективности традиционных хичиотерапевтических препаратов

Противоаденовирусная активность НЛФ Изучение противоаденовиру сной активности НЛФ показало, что препарат в концентрации 2000 МЕ/чл (ИД50) подавляет репродукцию аденовируса человека серотип 5 в культуре клеток 293 при низкой инфекционной чножественности заражения (в пределах 0,1 БОЕ/К л) Предварительная обработка клеток препараточ в концентрации 1000 МЕ/мл за 24 часа до инфицирования повышает проявляемую им на к\ льтуре клеток противоаденовирусну ю активность, что свидетельствует о большом потенциале препарата как профилактического средства

Противогриппозная активность НЛФ При изучении активности НЛФ по отношению к различным вариантам виру са гриппа (НЛФ вводили непосредственно после инфицирования), \становлено что препарат обладает выраженной противовирусной активностью в присутствии препарата в концентрации 5000 МЕ/чл наблюдали снижение инфекционного титра вируса гриппа А НЗШ/А1с1и/68 на 1,01 ^ ТЦИД50/МЛ, виру са гриппа А НЗШ/А1сЫ/68,

изолированного из легочной ткани белых мышей, на 1,0 ^ ТЦИД50/МЛ, вируса гриппа А Н1>уи58К/77 на 2,32 ^ ТЦИДбо/мл Показано, что в присутствии новой лекарственной формы выживаемость клеток значительно 3 величивается по сравнению с инфицированными клетками в отсутствие препарата Полученные данные свидетельствуют о противогриппозной активности НЛФ, причем активность НЛФ значительно выше в случае вируса гриппа А Щ^/иЗ 811/77

При анализе активности препарата в отношении эпидемических штаммов вируса гриппа, выделенных от больных в сезоне 2006-2007 года, в том числе по отношению к эпидемическим штаммам вируса гриппа А с резистентностью к ремантадину установлено, что наибольший противовирусный эффект достигается при предварительной обработке культуры клеток препаратом за 24 часа до инфицирования, что свидетельствует о большом потенциале НЛФ при проведении профилактики гриппа в сезон подъема заболеваемости Относительно эффективности препарата против вируса гриппа В, то она несколько ниже, чем против вируса гриппа А При одновременном внесении НЛФ с инфицированием так же выявлена активность в отношении эталонного штамма вируса гриппа А ^N1/118811/77, при внесении препарата через 24 часа после инфицирования противовирусная активность НЛФ снижается

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о значительном противовирусном эффекте новой лекарственной формы по отношению к вирусу простого герпеса, в том числе по отношению к вирусу герпеса с лекарственной устойчивостью к ацикловиру, и по отношению к вариантам вируса простого герпеса, выделенным из клинического материала Также новая лекарственная форма обладает выраженной противовирусной активностью по отношению к аденовирусу человека Ас15 и вирусам гриппа А Н^1/и58К/77 и А НЗН2/А1с1и/68, в том числе к варианту вируса гриппа, изолированному из легкого белых мышей, и в отношении эпидемических штаммов вируса гриппа А и В сезона 2006-2007 года В ходе исследования выявлена зависимость противовирусной активности новой лекарственной формы от концентрации, множественности инфицирования и схемы внесения препарата Отмечено, что предварительное внесение новой лекарственной формы (минимум за 90 минут, лучше за 24 часа) до инфицирования культуры обеспечивает более полную защиту клеточного монослоя от цитопатического действия вируса при аналогичной концентрации по сравнению с внесением препарата сразу непосредственно после инфицирования

Разработка схем комбинированной терапии различных проявлений герпетической инфекции с использованием новой лекарственной Формы и других химиотерапевтнческих препаратов

В работе изучали возможность комбинирования НЛФ и других противогерпетических препаратов ациктовира, фосфита ациктовира (ф-АЦВ), ганцикловира, 9-р-О-арабинофуранозитаденина (АраА), 5-йод-2'-дезоксиуридина (ИДУ), (Е)-5-(бромовинил)-2'-дезоксиуридина (БВДУ), рибавирина, тринатриевой соли фосфономуравьиной кистоты (ФМК) Оценку эффективности комбинации различных препаратов и НЛФ проводили по методу АпЬа1 аХ а11, 1980 и Ь'еуЧх I, Бе Clercg Е, 1997, рассчитывая значения ФИК и путем построения изоболограмм

Сравнивая ФИК комбинаций НЛФ и хичиотерапевтических препаратов, мы получили результаты, свидетельствующие о том, что НЛФ составляет довольно эффективные комбинации со всеми представленными соединениями рассчитанные значения ФИК для различных комбинаций лежат в интервале 0 2-0,66, что говорит о синергизме препаратов Не выявлено несовместимости НЛФ ни с одним из представленных соединений Наиботее эффективную комбинацию НЛФ составляет с АЦВ значение ФИК 0,2, с ИДУ и ганцикловироч значение ФИК 0 28, с новым препаратом фосфитом ациктовира ФИК равен 0,29

Табтица 1

Индекс фракционных ингибиру ющих концентраций дтя комбинаций НЛФ с противогерпесвиру снычи препаратами

Наименование кочбинации, концентрация компонентов Значение индекса ФИК Снижение ИД50 компонентов в комбинации

ИДУ 0,15 мкг/мл + НЛФ 50 МЕ/мл 0 28 ИДУ в 13 раз, НЛФ в 5 раз

АЦВ 0,05 чкг/чл + НЛФ 25 МЕ/чл 0,2 АЦВ в 9 8 раз, НЛФ вЮ раз

АраА 3 8 мкг/ мт + НЛФ 50 ME/vn 0,68 АраА в 2 раза, НЛФ в 5 раз

ФМК 8 м кг/ч л + НЛФ 50 МЕ/мл 0,45 ФМК в 3 9 раза, НЛФ в 5 раз

БВДУ 0 012 мкг/мл + НЛФ 31,25 МЕ/мл 0 325 БВДУ в 5 раз, НЛФ з 8 раз

Рибавирин 62,5 мкг/чл + НЛФ 40 МЕ/чт 0,66 Рбв в 2 раза. НЛФ в 6,25 раза

Ганцикловир 0,22 мкг/чл + НЛФ 12 5 МЕ/мл 0,28 Гнц в 4,4 раза, НЛФ в 20 раз

Ф-АЦВ 3 мкг/у!т + НЛФ 25 МЕ/мл 0,29 Ф-АЦВ в 5,2 раза, НЛФ в 10 раз

По значению индекса ФИК наиболее эффективные комбинации новая лекарственная форма составляет с ИДУ (5-йод-2'-дезоксиуридином), ацикловироч, БВДУ (5-бром-2-дезоксиуридиноч), ганцикловироч и новым противогерпесвиру сныч препаратом фосфитом ациктовира Умеренный синергизм соединений наблюдается дтя комбинации НЛФ с ФМК

(натриевая соль фосфоночуравьиной кислоты), синергизм близкий к аддитивному эффекту получен для комбинации новой лекарственной формы с рибавирином и АраА (9-Р-Б-аденинарабинозидом) Представленные в таблице 1 данные однозначно указывают на то, что при комбинированном использовании препаратов достижение противовирусного эффекта происходит при снижении концентрации соединений, что имеет явное преичу щество перед использованием противогерпесвирусных препаратов в отдельности

Изучая возможность комбинирования различных противогерпетических препаратов между собой, выявили значительный синергизм между ФМК и ИДУ ФИК комбинации равен 0,3, для ФМК и рибавирина ФИК равен 1,25 что означает аддитивный эффект комбинации препаратов

При изучении противовирусной активности комбинаций препаратов и НЛФ по отношению к клиническим изолятам ВПГ, а так же в отношении ВПГ-2 были получены аналогичные данные, что свидетельствует о широком диапазоне противогерпетической активности комбинаций специфических противогерпетических препаратов и разработанной НЛФ

Разработка схем комбинированной терапии инфекции вируса гриппа с использованием новой лекарственной формы и других химиотепапевтичееких препаратов

В процессе изучения влияния сочетаний НЛФ с римантадином и рибавирином на подавление виру синдуцированного ЦПД в культуре клеток в отношении вирусов гриппа А Н^1/и88К/77 и А НЗЫ2/А1с1н/68 установлено, что эффективность соединений в комбинации значительно превосходит таковую при использовании препаратов в отдельности при сочетании НЛФ и рибавирина наблюдается снижение ИД50 НЛФ в 4 раза, ИД50 рибавирина в 3 раза ИД50 НЛФ при комбинировании с римантадином снижается так же в 4 раза, при этом ИД50 самого римантадина в комбинации с НЛФ снижается в 2 раза Относительно эффективности комбинации римантадина и рибавирина по отношению к тем же вариантам вирусам гриппа, установлено, что соединения проявляют умеренный синергизм Значения ФИК для комбинаций препаратов приведены в таблице ниже Таблица 2

Значение ФИК комбинаций препаратов

Состав комбинации ФИК

Ричантадин + Рибавирин 1

НЛФ +Римантадин 0 75

НЛФ +Рибавирин 0,5

Следует отметить, что выявленные закономерности эффективности комбинирования препаратов имели место в случае увеличения множественности инфицирования в 100 раз, штачмовой зависимости эффективности комбинирования препаратов не обнаружено

При исследовании эффективности кочбинаций препаратов при различных схечах внесения соединений было установлено что внесение НЛФ за 24 часа до инфицирования позво ляет по ту чить более выраженное снижение инфекционного титра виру са по сравнению с вариантом, когда НЛФ вносится непосредственно в момент инфицирования используя комбинации препаратов в заведомо неэффективных концентрациях, удалось полностью ингибировать ЦПД вируса В случае увеличения множественности инфицирования противовирусный эффект комбинации несколько снижался

При изу чении эффективности комбинации НЛФ с римантадином и рибавирином (тройная комбинация) в отношении вируса гриппа А Н1Ы1/и55К/77 при различных способах введения соединений (схема №1 за 24 часа до заражения, схема №2 непосредственно сразу после инфицирования) были получены следующие данные наименьшее значение ФИК тройной комбинации равняется 0,75, что свидетельствует о синергидноч эффекте комбинации препаратов Следует отметить, что при использовании препаратов в комбинации их ИДзо были ниже в 4 раза, чем ранее установленные концентрации для взятых в отдельности соединений

ВЫВОДЫ

1 Разработана новая пролонгированная лекарственная форма интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного для честного применения включающая корректоры ПОЛ - антиоксиданты (у нитиол и лимонную кислоту), стабильная в процессе хранения в течение всего предполагаемого срока годности, имеющая пролонгированное действие благодаря присутствию полимера натрий карбокеичетилцеллюлозы физиотогическии рН за счет буферных кочпонентов и изотоничность, что позволяет использовать ее как на слизистых оболочках респираторного тракта и гениталий, так и для терапии офтальмологических проявлений вирусных инфекций

2 Новая лекарственная форма обладает выраженной противогерпетической активностью как в отношении эталонного штамча ВПГ 1 Л2 так и в отношении лабораторного штамма ВПГ1 Л2 с резистентностью к ацикловиру, так и в отношении клинических изолятов вируса простого герпеса, выделенных от больных Активность лекарственной формы зависит от множественности заражения, концентрации препарата и способа внесения При увеличении множественности заражения активность препарата несколько снижается Установлена значительная противовирусная активность лекарственной формы при внесении одновременно или непосредственно после инфицирования, что может служить основанием для использования разработанного состава в качестве лечебного средства Предварительная инкубация клеток с препараточ значительно усиливает его противовирусную активность, что свидетельствует о возчожной перспективе применения препарата для профилактики рецидивирующей ВПГ- инфекции

3 Новая лекарственная форча обладает активностью по отношению к аденовирусу человека серотип 5 Установлено что при низкой множественности заражения при почощи препарата удается значительно уменьшить проявления вирусиндуцированного ЦПД на ку льтуре клеток Так же выявлена зависимость активности препарата от способа внесения прединку бация за 24 часа до инфицирования значительно усиливает противовиру сную активность

4 Новая лекарственная форма обладает выраженной противовиру сной активностью как в отношении вируса гриппа А так и в отношении вируса гриппа В Противовирусная активность препарата по отношению к вирусу гриппа В несколько ниже Препарат активен в отношении эталонных вариантов вируса гриппа А, в отношении изолированного из легочной ткани мышей виру са гриппа, и в отношении эпидемических штаммов вируса гриппа сезона 2006-2007 года

Новая лекарственная форма составляет эффективные комбинации практически со всеми исследуемыми противовирусными препаратами Ни для одного из исследуемых соединений не обнару жен антагонизм

Установлено, что из> ченные лекарственные препараты в комбинации проявляют свою противовирусную активность в нецитотоксических концентрациях, что свидетельству ет об избирательном эффекте терапии

Комбинация новой лекарственной формы и других противовирусных препаратов позволяет уменьшить эффективные противовирусные концентрации используемых препаратов и тем самым уменьшить или избежать вовсе проявления побочных эффектов терапии Использование препаратов с разтичными механизмами действия позволит избежать появления устойчивых к терапии мутантов вируса

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Патент РФ RU 2270692 «Пролонгированный раствор интерферона»//Малиновская В В Малиновский Е Ю , Выжлова Е Н , заявители и патентообладатели Малиновская ВБ, Малиновский Е Ю Выжлова Е Н - № 2004132134/15, заявл 11 04 2004 опубл 27 02 2006 -Бюл №6 -7 с

2 Выжлова Е Н , Андронова В Л , Галегов Г А , Малиновская В В Комбинированное антигерпесвирусное действие комплексного препарата "Виферон - капли глазные" и модифицированных ну клеозидов//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2006 -том 141 -№6 -С 672-676

3 Выжлова Е Н , Андронова В Л Галегов Г А , Малиновская В В Буданов С В Кочбинирвоанная химиотерапия герпесвирусной инфекции сочетание препарата Виферон, глазные капли и специфических этиотропных лекарственных средств// Российский журнал кожных и венерических болезней, приложение «Герпес» -2007 -№2 -С 29-32

4 Eugenia N Vyzhlova, Valena L Andronova Georgiy A Galegov, Valentina V Malmovskava Synergistic antiherpesviral combination of alpha interferon and nucleoside analog or pyrophosphate analog in relation to herpes simplex virus in cell culture in vitro//Journal of interferon and cytokine research -2007 -Vol 27 -№8 -P 737-738

Подписано в печать 14 марта 2008 г

Формат 60x90/16

Объем 1,25 п л

Тираж 75 экз

Заказ № 140308118

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912V772801001

Адрес 117292, г Москва, ул Дмитрия Ульянова, д 8, кор 2 Тел 740-76-47, 125-22-73 http //www univerpnnt ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Выжлова, Евгения Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.б

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Вирусы простого герпеса, аденовирусы и вирусы гриппа как возбудители социально значимых инфекционных заболеваний.

1.1.1 Вирус простого герпеса.

1.1.2 Аденовирусы.

1.1.3 Вирусы гриппа.

1.2 Интерфероны первого типа и их роль в функционировании иммунной системы человека и патогенезе герпетической, аденовирусной и гриппозной инфекции.

1.3 Система ПОЛ-АОЗ и её роль в патогенезе вирусных инфекций.

1.4 Модели для оценки противогерпетической, противоаденовирусной и противогриппозной эффективности лекарственных средств in vitro и in vivo.

1.5 Методы оценки биологической активности интерферона.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Вирусы.

2.2 Клеточные культуры.

2.3 Определение цитотоксического действия веществ.

2.4 Определение цитопатической дозы вируса.

2.4.1 Определение 50% тканевой цитопатической дозы вируса (ТЦИД5о).

2.4.2 Определение цитопатической дозы вируса методом бляшкообразования.

2.5 Определение специфической противовирусной активности интерферона.

2.6 Определение противогерпетической активности соединений in vitro.

2.6.1 Определение антигерпесвирусного действия вещества путем оценки его способности предотвращать вирусиндуцированное цитопатическое действие (ЦПД) в культуре клеток.

2.6.2 Определение антигерпесвирусного действия вещества путем оценки снижения инфекционного титра вируса.

2.7 Определение противогерпетической активности комбинации соединений in vitro.

2.8 Определение противоаденовирусной активности соединений in vitro.

2.9. Определение противогриппозной активности соединений in vitro.

2.9.1 Определение противогриппозной активности соединений in vitro, визуальный учет цитопатического действия вируса.

2.9.2 Определение противогриппозной активности соединений in vitro, учет цитопатического действия вируса с использованием автоматического спектрофотометра.

2.10 Физико-химические методы анализа.

2.10.1 Определение плотности растворов прозрачных жидкостей.

2.10.2 Определение вязкости жидкостей.

2.10.3 Определение ¡)Н жидкостей.

2.11 Препараты.

2.11.1. Препараты для разработки новой лекарственной формы.

2.11.2 Противогерпетические химиопрепараты.

2.11.3 Препараты, активные в отношении вируса гриппа.

2.12 Животные.

2.13 Стандарты.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА НОВОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ИНТЕРФЕРОНА. ДЛЯ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ.

3.1 Изучение свойств различных марок полимерной основы.

3.2 Подбор антиоксидантов для новой лекарственной формы.

3.3 Определение тканевой цитотоксической концентрации (ТЦ50) исследуемых веществ.

3.4 Исследование влияния полимера на специфическую противовирусную активность интерферона.

3.5 Подбор концентраций альбумина для обеспечения стабильности человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2 в процессе хранения.

3.6 Подбор вспомогательных веществ для новой лекарственной формы с учетом возможности изучения in vitro с использованием культуры клеток.

3.7 Изучение влияния антиоксидантов на специфическую противовирусную активность интерферона.

3.8 Изотонирование растворов.

ГЛАВА 4. АНТИВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ НОВОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА-2.

4.1 Краткая характеристика свежевыделенных штаммов ВПГ.

4.2 Оценка цитотоксического влияния различных концентраций новой лекарственной формы на жизнеспособность клеток (определение ТЦД50).

4.3 Противогерпесвирусная активность новой лекарственной формы.

4.4 Антигерпесвирусная активность новой лекарственной формы в отношении вариантов вируса простого герпеса, изолированных из клинического материала.

4.5 Противогерпесвирусная активность НЛФ в отношении вариантов вируса простого герпеса с устойчивостью к ацикловиру.

4.6 Противоаденовирусная активность новой лекарственной формы.

4.7 Противогриппозная активность новой лекарсвтенной формы.

4.7.1 Оценка противогриппозной активности новой лекарственной формы, визуальный учет цитопатического действия вируса.

4.7.2 Оценка противогриппозной активности новой лекарственной формы, учет цитопатического действия вируса с использованием автоматического спектрофотометра.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ СОЧЕТАНИЯ НОВОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ И ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ПРОТОГО ГЕРПЕСА.

5.1 Антигерпесвирусная активность препаратов на модели вируса простого герпеса штамм Л2 в культуре клеток Vero.

5.2 Изучение эффективности комбинирования новой лекарственной формы интерферона.и различных противогерпетических препаратов (двойные комбинации).

ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ СОЧЕТАНИЯ НОВОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ И ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ГРИППА.

6.1 Противовирусная активность препаратов в отношении вируса гриппа A H]Ni/USSR/77.

6.2 Противовирусная активность комбинаций препаратов и новой лекарственной формы в отношении вирусов гриппа A HiNi/USSR/77 и A H3N2/Aichi/68.

6.3 Противовирусная активность комбинаций препаратов и новой лекарственной формы в отношении вируса гриппа A HiNi/USSR/77 при различных способах внесения исследуемых препаратов.

ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антивирусная активность новой лекарственной формы интерферона для местного применения"

Традиционно лекарственные средства для терапии вирусных инфекций вводятся системно: парентерально или per os. При применении лекарственного средства per os возможно негативное воздействие препарата на гастроинтестинальный тракт, а так же разрушение действующего вещества после гастроинтестинальной абсорбции ферментами желудочно-кишечного тракта. При парентеральном введении не происходит деградации препарата печеночными ферментами, и действующее вещество быстро попадает в системный кровоток, однако сам путь введения - инъекция довольно болезненный. Кроме того, возможно негативное местное воздействие препарата на ткани в месте введения, выражаемое в виде тканевого некроза и тромбофлебита (124,128).

В последнее время исследователи уделяют большое внимание альтернативным путям введения препаратов - через слизистые оболочки прямой кишки, респираторного тракта, глаза, влагалища и матки и другие (141, 149, 163, 173, 203). Кроме широко известного введения лекартсвенного вщества через слизистую оболочку прямой кишки (ректальное введение), описано проникновение лекарственного вещества в системный кровоток через слизистую оболочку респираторного тракта, абсорбция вещества через респираторную слизистую равна практически 100% для низкомолекулярных неполярных гидрофобных веществ, для других полярных веществ она несколько ниже, около 90-99% (186,187, 195). Так же описано введение препарата через слизистую оболочку влагалища и матки (203).

По данным литературы, многие формы вирусных инфекций поддаются местному лечению, зачастую местное применение химиотерапевтических препаратов более эффективно, чем системное, поскольку обеспечивает высокую концентрацию действующего вещества непосредственно в очаге инфекции (17, 19, 40, 44, 63, 185, 205) без токсического воздействия на организм в целом.

Грипп является массовой инфекцией, ежегодно регистрируется огромное количество эпизодов заболевания, что наносит значительный экономический ущерб. Несмотря на достаточный арсенал лечебных актуальность профилактики и лечения гриппозной инфекции крайне высока, так как в настоящий момент наблюдается распространение новых вариантов вируса гриппа, а так же вариантов вируса, имеющих лекарственную устойчивость к химиотерапевтическим препаратам (35, 36, 57,158).

Для герпесвирусов возможны несколь форм инфекции: офтальмогерпес, гениталь-ный герпес, герпетическое поражение кожи и слизистых ротоглотки, в качестве системного воздействия герпесвирусов можно отметить поражение центральной нервной системы.

Показана ассоциация некоторых урологических и гинекологических заболеваний с герпетической инфекцией: герпес - ассоциированные уретриты и эндометриты (18, 102, 103). В отдельных исследованиях выявлена связь течения пародонтита и пародонтоза с репликацией вируса герпеса в содержимом пародонтального кармана (198). В последнее время офтальмогерпес, как одно из проявлений герпесвирусной инфекции регистрируется значительно чаще, так же часто отмечается тяжелое течение заболевания (49, 70).

Герпетическая инфекция, вызываемая вирусом простого герпеса первого или второго типов является одной из самых распространенных инфекций среди населения. По данным ВОЗ к 18 годам около 90% жителей городов инфицированы одним или несколькими штаммами ВПГ (ВПГ 1 и 2-го типов, варицелла зостер, цитомегаловирус, вирус Эпштейн-Барр, ВПГ 6 и 8-го типов). По числу инфицированных людей, госпитализированных в стационары, герпесвирусная инфекция уступает только гриппу и другим ОРВИ вместе взятым. Несмотря на имеющийся в настоящий момент большой арсенал противо-герпетических средств, эффективность терапии герпетической инфекции зачастую невысока. Так же в последнее время резко возросло число людей, инфицированных вирусами с устойчивостью к противовирусным препаратам (66, 191).

Таким образом, изменьчивость вирусов, наличие устойчивых к традиционной химиотерапии штаммов вирусов и отсутствие профилактического эффекта от традиционной этиотропной противовирусной терапии требует разработки новых препаратов, обладающих универсальным механизмом противовирусного действия и широким спектром противовирусной активности.

Интерферон человеческий рекомбинантный альфа-2 является аналогом энлогенно-го интерферона альфа человека, относящегося к интерферонам первого типа, и обладает противовирусными, иммуномодулирующими и антипролиферавными свойствами. Кроме того, ИФН обладает антимикробной активностью за счет способности стимулировать систему фагоцитов. ИФН является универсальным противовирусным средством и высоко эффективен в отношении широкого спектра вирусов (37, 90, 145).

Согласно данным литературы (140, 147, 173, 185, 205, 212) местное применение препаратов интерферона для терапии вирусных инфекций является перспективным направлением, поскольку обеспечивает высокую концентрацию интерферона в очаге воспаления, а так же даёт возможность проводить кроме противовирусной терапии местную иммунокоррекцию.

Во многих работах показана связь функционирования иммунной системы и течения вирусной инфекции. Установлено, что вирусы семейства герпеса могут поражать клетки иммунной системы, вызывая вторичные иммунодефициты, доказана связь между функционированием системы интерферона и течением инфекции, вызванной вирусом семейства герпеса (21, 38, 42, 58, 132). Выявлено, что у больных ВПГ - инфекцией значительно снижена способность к продукции экзогенного интерферона и других цитокинов, запускающих механизмы специфической (адаптивной) и неспецифической (нативной) противовирусной защиты (5, 77, 79).

В последнее время проводится много исследований в области оценки влияния процессов ПОЛ в патогенезе различных заболеваний, в том числе вирусных инфекций (1,4, 6, 31, 34, 61). В работах (60, 153) показано четкое коррелирование тяжести проявлений катаракты и выраженности процессов ПОЛ в хрусталике глаза, так же доказано, что процессы ПОЛ вносят существенный вклад в течение диабетической ретинопатии (189). В работе (133) показано, что в патогенезе стромальных кератитов, в том числе и ассоциированных с вирусом герпеса, значительную роль играет апоптоз и некроз инфицированных кератиноцитов в строме роговицы. Известно, что одним из механизмов коррекции апопто-за клеток является использование антиоксидантов, позволяющих через процессы ингиби-рования ПОЛ уменьшать его интенсивность (23, 216). Влияние процессов ПОЛ на течение других вирусных инфекций изучено недостаточно, не разработаны способы коррекции ПОЛ. Так же не изучена возможность влияния с помощью антиоксидантов на интенсивность апоптоза и некроза эпителиальных клеток при развитии инфекции.

Под руководиством дбн, профессора В.В. Малиновской в течение многих лет про-вовдились исследования, направленные на поиск возможностей коррекции эндогенной системы интерферона, а так же возможностей повышения эффективности интерфероноте-рапии. Выявлена связь между течением вирусной инфекции и перекисным окислением липидов мембран (ПОЛ), показано, что при интенсификации процессов ПОЛ происходит увеличесние протеолитической активности сыворотки крови и инактивация циркулирующего интерферона. Предложены способы коррекции ПОЛ при генитальном герпесе анти-оксидантами (103). В результате проведенных многолетних исследований В.В, Малиновской был разработан комплексный препарат на основе интерферона в комбинации с анти-оксидантами в виде ректальных суппозиториев, показавший высокую эффективность в отношении широкого спектра вирусов. В настоящий момент препарат зарегистрирован на территории РФ в качестве лекарсвтенного средства под торговым названием Виферон. Данная работа являете продолжением работ Малтновской В.В. в области создания комбинированных лекаревтенных форм на основе интерферона и антиоксидантов, обладающих широким спектром противовирусной активности.

Цель исследования: разработать новую пролонгированную лекарственную форму для местного применения, обладающую широким спектром противовирусной активности на основе интерферона в комбинации с антиоксидантами и другими вспомогательными веществами.

Задачи исследования:

1. Обосновать состав и изучить взаимодействие основных и вспомогательных компонентов и их концентрационных соотношений с целью обеспечения необходимых физико-химических, биологических и фармацевтических свойств новой лекарственной формы.

2. Изучить активность новой лекарственной формы на модели культуры клеток с использованием эталонных штаммов вирусов простого герпеса первого и второго типа, аденовируса и вирусов гриппа.

3. Изучить активность новой лекарственной формы на модели с использованием культуры клеток против вирусов простого герпеса и вирусов гриппа с лекарственной устойчивостью к противовирусным препаратам.

4. Изучить эффективность новой лекарственной формы в отношении клинических изолятов вируса простого герпеса и эпидемических штаммов вирусов гриппа сезона 2006 - 2007 года.

5. Исследовать возможность сочетанного применения новой лекарственной формы и других противовирусных препаратов (аналогов нуклеозидов, аналогов пи-рофосфатов, блокаторов кальциевых каналов), активных в отношении вирусов герпеса и гриппа. Оценить эффективность комбинации новой лекарственной формы и противовирусных препаратов в отношении вирусов герпеса и гриппа.

Научная новизна:

1. В опытах in vitro показано, что комбинация интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантного, выбранного комплекса антиоксидантов, стабилизаторов активности интерферона, полимера-пролонгатора и других вспомогательных веществ позволяет усилить специфическую противовирусную активность интерферона в несколько раз. Так в отношении ВПГ-1 штамм JI2 комплексный состав препарата обеспечивает усиление специфической противовисруной активности в 3,85 раза.

2. Установлено, что противовирусная активность разработанной лекарственной формы зависит от концентрации препарата, схемы внесения препарата и множественности инфицирования. Наиболее сильно противовирусный эффект препарата проявляется при предварительном внесении до инфицирования, что свидетельствует о потенциале лекарственной формы в качестве профилактического средства.

3. Выявлена значительная противовирусная активность новой лекарственной формы в отношении широкого спектра вирусов (вирусов простого герпеса, гриппа и аденовируса), в том числе по отношению к вирусам с лекарственной устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам а так же в отношении клинических изолятов вирусов.

4. Установлено, что разработанная лекарственная форма составляет эффективные комбинации со многими противовирусными препаратами, причем с некоторыми из них комбинирование носит синергидный характер: при совместном присутствии препаратов концентрации, обладающие противовирусной активностью значительно ниже, чем таковые для взятых в отдельности соединений.

Практическая значимость

1. Разработан состав новой пролонгированной лекарственной формы широкого спектра действия на основе интерферона альфа-2 человеческого рекомбинантно-го в комплексе с антиоксидантами и другими вспомогательными веществами, стабильный в процессе хранения и удобная для применения про многих формах вирусных инфекций.

2. Полученные данные о значительной противовирусной активности новой лекарственной формы в отношении различных видов вирусов (грипп, аденовирус, герпес) позволят проводить эффективную терапию инфекции в случаях, когда клинические симптомы заболевания не позволяют точно установить диагноз без серодиагностики возбудителя.

3. Показана значительная противовирусная активность разработанной лекарственной формы в отношении вирусов с лекарственной устойчивостью к химиопрепа-ратам, что позволит проводить терапию инфекции при неэффективности общепринятой химиотерапии.

4. Разработанная лекарственная форма интерферона альфа-2 человеческого реком-бинантного позволит проводить местную противовирусную терапию в тех областях клинической медицины, где ранее местная терапия препаратами интерферона не проводилась: в гинекологии при лечении герпес - ассоциированных эндометритов у женщин, а так же в урологии при лечении герпетических уретритов у мужчин и женщин.

5. Возможность комбинирования новой лекарственной формы с другими химиоте-рапевтическими препаратами позволит снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений и, следовательно, избежать проявления побочных токсических эффектов при высокой эффективности терапии.

Внедрение результатов работы

Состав разработанной лекарственной формы защищен патентом РФ ГШ 2270692 «Пролонгированный раствор интерферона». В настоящий момент новая лекарственная форма проходит регистрацию на территории Российской Федерации в соответствие с действующим законодательством. В соответствие с требованиями Закона о лекарственных средствах РФ в Научно-исследовательском центре токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов были проведены исследования общетоксического и аллергенного действия разработанной лекарственной формы на половозрелых и неполовозрелых животных. В результате проведенного исследования установлено, что препарат не обладает выраженными токсическими свойствами, не проявляет аллергизирующего и иммуно-токсического воздействия, что даёт основание на проведение дальнейших клинических исследований эффективности и переносимости.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на конгрессе «Человек и лекарство», г. Москва' в 2007 году; на международном симпозиуме общества исследователей интерферонов и цитокинов в Оксфорд, Англия в 2007 г; По материалам диссертации опубликовано научных работ в отечественной и зарубежной печати, а также получен патент РФ ЬШ 2270692 «Пролонгированный раствор интерферона».

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании научной конференции отдела интерферонов ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 6 марта 2008 года.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав, содержащих результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации, указателя литературы: изложена на 155 страницах машинописного текста, иллюстрирована 37 таблицами и 15 рисунками. Список литературы состоит из 218 работ отечественных (123) и зарубежных авторов (95).

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Выжлова, Евгения Николаевна

выводы.

Разработана новая лекарственная форма интерферона альфа-2 человеческого реком-бинантного для местного применения, включающая корректоры ПОЛ - антиоксиданты (уни-тиол и лимонную кислоту), стабильная в процессе хранения в течение всего предполагаемого срока годности, имеющая пролонгированное действие благодаря присутствию полимера, физиологический рН за счет буферных компонентов и изотоничность, что позволяет использовать её как на слизистых оболочках респираторного тракта и гениталий, так и для терапии офтальмологических вирусных заболеваний.

Новая лекарственная форма обладает выраженной противогерпетической активностью как в отношении эталонного штамма ВПГ 1 Л2, так и в отношении лабораторного штамма ВПГ1 Л2 с резистентностью к ацикловиру, так и в отношении клинических изолятов вируса простого герпеса, выделенных от больных. Активность лекарственной формы зависит от инфекционной множественности заражения, концентрации препарата и способа внесения. При увеличении инфекционной множественности заражения активность препарата несколько снижается. Предварительная инкубация клеток с препаратом значительно усиливает его противовирусную активность, что свидетельствует о возможной перспективе применения препарата для профилактики рецидивирующей ВПГ- инфекции.

Новая лекарственная форма обладает активностью по отношению к аденовирусу человека серотип 5. Установлено, что при низкой инфекционной множественности заражения при помощи препарата удаётся значительно уменьшить проявления вирусного ЦПД на культуре клеток. Так же выявлена зависимость активности препарата от способа внесения: пре-динкубация за 24 часа до инфицирования значительно усиливает противовирусную активность.

Новая лекарственная форма обладает выраженной противовирусной активностью как в отношении вируса гриппа А, так и в отношении вируса гриппа В. Противовирусная активность препарата по отношению к вирусу гриппа В несколько ниже. Препарат активен в отношении эталонных вариантов вируса гриппа А, а так же в отношении изолированного из легочной ткани мышей вируса гриппа, а так же в отношении эпидемических штаммов вируса гриппа сезона 2006-2007 года. Получены аналогичные закономерности зависимости противовирусной активности от концентрации препарата, инфекционной множественности заражения и способе внесения, что свидетельствует об общем механизме противовирусного действия новой лекарственной формы по отношению к различным вирусам.

Новая лекарственная форма составляет эффективные комбинации практически со всеми исследуемыми противовирусными препаратами. Ни для одного из исследуемых соединений не обнаружен антагонизм.

Комбинация новой лекарственной формы и других противовирусных препаратов позволяет уменьшить эффективные терапевтические концентрации используемых препаратов и тем самым уменьшить или избежать вовсе проявления побочных эффектов терапии. Использование препаратов с различными механизмами действия позволит избежать появления устойчивых к терапии мутантов вируса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Выжлова, Евгения Николаевна, Москва

1. Акберова С.И. Модифицированные нуклиозиды в лечении офтальмогерепе-са//Вестник офтальмологии.-1997.-Т.113.-№4.-С.45-47.

2. Алексеев В.Н., Кетлинская О.С., Грузинова T.JI. Цитокины в слезной жидкости, их роль в патогенезе офтальмогерпеса//Вестник РАМН.-1996.-№1.-С.57-59.

3. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Андреева О.Т. Дислепидемия, повышенное содержание в клетках липидов при экспериментальной герпесвирусной инфекции и их коррекция антивирусными химиопрепаратами//Вопросы вирусологии.-1992.-№1.-С.61-64.

4. Амур-Саннан И.С. Исследования в области глазных капель пролонгированного действия: Автореф.дисс.канд.биол.наук.-М.,-1975.-32 с.

5. Ананьев В.А., Петренко Ю.М., Константинова JI.A., Владимиров Ю.А. Влияние ан-тиоксидантов на процесс инфицирования клеток HeLa в культуре// Вопросы виру-сологии.-1992.-№2.-С.225-228.

6. Бабаян Э.А., Машковский М.Д. О сроке годности лекарственного средст-ва//Фармация.-1984.-№2.-С. 14-16.

7. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К., Каспаров A.A., Гребенюк C.B. Герпес: этиология, диагностика, лечение/ М.: Медицина, 1986.-206 с.

8. Беседина И.В., Бессонова H.H. Выбор оптимальных условий стерилизации фильтрованием глазных капель//Фармация.- №4.-1981.-С.87-89.

9. Беседина И.В., Крачевская В.В. Оценка чистоты инъекционных растворов аптечного изготовления в процессе применения//Фармация.-1988>№6.-С.78-79.

10. Беседина И.В., Мееркон Г.Е., Мухина Г.Ю. Мембранная микрофильтрация растворов для инъекций//Фармация.-1989.-№1.-С. 24-26.

11. Бессонова Н.И. Исследования в области технологии глазных капель, содержащих водорастворимые витамины: Автореф.дисс.канд.фарм.наук.-М.,-1978.-41 с.

12. Бессонова Н.И., Белова О.И., Кулешова М.И. Изучение устойчивости глазных капель с рибифлавином//Фармация.- №2.-1977.-С.32-36.

13. Бессонова Н.И., Василевская В.Ю.Стабильность глазных капель в процессе хране-ния//Фармация.-№3.-1991.-С.28-31.

14. Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии//М.: Наука, 1982.-150 с.

15. Биоантиоксиданты и свободнорадикальная патология.-Полтава, 1987.

16. Бойко E.JI. Репродуктивное здоровье супружеских пар и его реабилитация при невынашивании беременности: Автореф.дисс.докт.мед.наук.-М., 2006.-46 с.

17. Бредис В.Б. Разработка глазных капель с консервантами: Авто-реф.дисс. .канд.фарм.наук.-М.,-1990.-42 с.

18. Ванько Л.В., Кудашов Н.И., Шейкар Ч., Матвеева Н.К„ Сухих Г.Т. Иммунный статус новорожденных детей с генерализованной формой герпетической инфекции//Иммунология.-1996.-№2.-С.50-52.

19. Васильев А.Е., Фельдштейн М.П. Полимерные материалы. М.: Наука, 1983.-210 с.

20. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И., Козлов A.B., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах. Итоги науки и техники. -М.: Биофизика, 1991.-252 с.

21. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. -М.: Наука, 1982.-252 с.

22. Волгарев А.П., Горбунов Н.В., Быкова Н.О. Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний.- Звенигород, 1990.-192 с.

23. Галегов Г. А., Андронова В. Л., Леонтьева Н. А., Львов Н. Д., Петрова И! Г. Этио-тропная лекарственная терапия вирусных инфекций//Вопросы вирусологии.-2004.-№3.-С.35-40.

24. Галегов Г.А. Лекарственная терапия герпес вирусной инфекции: фундаментальные аспекты и современные клинические достиженияУ/Consilium Medicum.-2002.-Т.4.- №5.-С.240-243.

25. Гендролис А-Ю. А. Глазные лекарственные формы в фармации.-М.: Медицина,1988.-385 с.

26. Гендролис А-Ю.А., Делтувяне И. Исследование вида упаковки на стерильность глазных капель//Актуальные вопросы производства медикаментов.- Каунас, 1977.156 с.

27. Гибадулин P.A., Денисова Т.С., Завгородний С.Г. и дР. Выделение и характеристика мутанта вируса простого герпеса типа 1, резистентного к фосфоноуксусной ки-слоте//Вопросы вирусологии.-1991 .-№4.-С.59-62.

28. Гориладзе Т.У., Гайдамака Т.Б. Комплексное лечение и профилактика рецидивов у больных офтальмогерпесом/Юфтальмологический журнал.-1987.-№3.-С. 157-161.

29. Государственная фармакопея СССР, X и ХГизданий.

30. Далгат Л.Д., Касавина Б.С., Майчук Ю.Ф. Определение молонового диальдегида в форменных элементах крови для прогнозирования течения офтальмогерпеса //Офтальмологический журнал.-198Г.-№8.-С.48-52.

31. Ерофеева М.А. Профилактика гриппа и других респираторных заболеваний в группах риска// Автореф:дис.д-ра мед.наук.-М.,2002.-30 с.

32. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и»патологии.-М.: Наука, 1996.-240 с.

33. Железникова Г. Ф., Иванова В. В., Аксенов О. А., Гнилевская 3. У., Монахова Н. Е., Мурина Е. А., Осипова 3. А., Курбатова Г. П; Варианты иммунного ответа при острых респираторно -вирусных инфекциях у детей//Вопросы вирусологии.-№6.-С. 249-253.

34. Журавлев А.И. Биоантиокислители в животном организме//Биоантиокислители: Сборник научн. трудов.-М., 1975.-С. 15-29.

35. Заплатников А.Л. Принципы рациональной терапии острых респираторных вирусных инфекций у детей раннего возраста// Русский медицинский журнал: Мать и дитя. Акушерство и гинекология. Педиатрия.-2004.-Т.12.- №13.-С.796-800.

36. Захаров М.А. Применение Унитиола как антиоксидантного препарата в терапии экземы и нейродермита у детей//Патогенез и лечение аллергодерматозов у детей: Сборник научн.трудов. -Свердловск, 1987.-С.89-92.

37. Калачев И.И., Можеренков В .П., Прокофьева Г.Л. Аскорбиновая кислота в офталь-мологии//Офтальмологический журнал.-1993.-№2.-С.42-45.

38. Каплина Э.Н, Вайнберг Ю.П. Деринат природный иммуномодулятор для детей и взрослых.- М.:Научная книга, 2004.-186 с.

39. Капранов И.К. Лечение простого и опоясывающего герпеса//Сборник научн. трудов Иркутского медицинского института Иркутск, 1980.-С.26-30.

40. Карчевская В.В., Беседина И.В. Использование микрофильтрования в аптечной технологии//Фармация.-1987.-№11 .-С.50-52.

41. Каспаров А. А Лечение герпес-вирусного кератита//Герпес.-2006.-№1.-С.13-19.

42. Каспаров А.А, Воробьёва O.K., Каспарова Е.А. Современные аспекты терапии оф-тальмогерпеса//Вестник российской академии наук.-2003.-№2.-С.44-49.

43. Каспаров A.A. Офтальмогерпес.- М.: Медицина, 1994.

44. Каспаров A.A. Современные аспекты лечения герпесвирусного керати-та//Клиническая офтальмология.-2000.-Т. 1 .-№2.-С.59-65.

45. Каспаров A.A., Войцеховская A.A., Фадеева Л.Л. Неспецифическая терапия оф-тальмогерпеса//Вестник офтальмологии.-1986.-Т.102.-№3.-С.44-47.

46. Кешишан Е.С. Касохов Т.Б. Система интерферона и её возрастные особенности. Применение препаратов интерферона в неонатальном перио-де//Рос.вестн.перинатол.и педиатр.-1993-Е.38.-№2.-С. 15-17.

47. Кисилева Л.А. Исследования антиокислительной активности витаминов и аминокислот: Автореф.дисс.канд.фарм.наук.-М.,-1989.-41 с.

48. Клебанов Г. И., Теселкин Ю. О., Бабенкова И. В., Любецкий О. Б., Владимиров Ю.А. Антиоксидантная активность сыворотки крови//Вестник РАМН.-1999г.-№2-С. 15-22.

49. Ковалевский Е.И., Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О. и дР. Антиокидантная активность фармацевтических препаратов, применяемых для лечения заболеваний глаз//Вестник офтальмологии.-1987.-Т. 103.-№4.-С.48-51.

50. Колобухина JI.B. Лечение и профилактика гриппа//Русский медицинский журнал.-2004.-№17.-С. 1000-1004.

51. Коломиец А.Г., Малевич Ю.К., Коломиец Н.Д. Вируспростого герпеса и его роль в патологии человека. -Минск,1986.-262 с.

52. Кондратьева Т.С. Технология лекарственных форм. -М.: Наука, 1991.

53. Кравчук Е. А. Роль свободнорадикального окисления в патогенезе заболеваний глаз//Вестник офтальмологии.-2004.-№5.-С.48-51.

54. Краснов М.М., Каспаров А.А., Каспарова Е.А. Клинические особенности и иммунотерапия осложненных форм аденовирусного кератоконъюнктивита// Вестник оф-тальмологии.-1998.-Т.114.-№5.-С.23-25.

55. Кухар Э.Е., Попова З.С. Изучение влияния интерферона и индукторов его образования на ткани глаза при внутриглазном введении//Актуальные вопросы офтальмо-логии.-Каунас,1980.-161 с.

56. Лабунский Э.В. Исследования в области применения основ и ПАВ: Авто-реф.дисс. .канд.фарм.наук.-М.,-1987.-38с.

57. Львов Н. Д., Андронова В. Л., Леонтьева Н. А., Галегов Г. А. Изоляция из клинического материала штаммов вируса герпеса простого, обладающих резистентностью к ацикловиру//Вопросы вирусологии.-1999.-№6.-С.247-249.

58. Львов Н. Д., Мельниченко А. В., Львов Д. Н., Никитина А. А. Лабораторная диагностика герпесвирусной инфекции человека//Вопросы вирусологии.- 2000.-№4.-С.7-13.

59. Львов Н.Д., Самойлович Е.О., Баринский И.Ф. Комбинированная терапия герпес-вирусной инфекции, экспериментальные и клинические данные//Вопросы вирусологии.- 1992.-№1.-С.8-16.

60. Лыткина И.Н., Серженко С.В. Опыт работы по профилактике острых респираторных вирусных инфекций в Москве//Детский доктор.-1999.-№1.-С.35-38.

61. Майчук Ю.Ф. Вирусные заболевания глаз.-М.: Наука, 1981.-272 с.

62. Майчук Ю.Ф. Новое в эпидемиологии и фармакотерапии глазных инфекций// Клиническая офтальмология.-2000.-Т. 1 .-№2.-С.48-52.

63. Майчук Ю.Ф. Фармакотерапия инфекционных заболеваний глаз// Антибиотики и химиотерапия.-1999.-№1.-С.26-30.

64. Майчук Ю.Ф:, Казаченко М.А. Ацикловир и ацикловир и интерферон в терапии офтальмогерепеса/Юфтальмология.-1988.-№7.-С.402-405.

65. Майчук Ю.Ф., Казаченко М.А., Шипанова А.И., Анджелов В.О., Кричевская Г.И. Новый иммуномодулятор ликопид в лечении герпетических стромальных керати-тов//Вестник офтальмологии,-1997.-Т.113:-№4.-С.23-25.

66. Майчук Ю.Ф., Яни Е.В. Новые глазные капли Локферон в лечении аденовирусных заболеваний глаз//Вестник офтальмологии.-1999.-Т.115.-№2.-0.32-25.

67. Малиновская В.В. Возрастные особенности системы интерферона: Автореф.дис.д-ра биол.наук.-М.,1985.-33 с.

68. Мальханов В. Б., Шевчук Н. Е., Марванова 3. Р. Цитокиновый статус больных оф-тальмогерпесом// Вопросы вирусологии.-2004,- №1-С.28-30.

69. Мальханов В.Б., Анджелов В.О. Клинико лабораторная диагностика хронических форм аденовирусных инфекций глаз//Метод.рекоменд.-Уфа,1984.

70. Мальханов В.Б., Грипась И.А. Интерферон, Т-лимфоциты и, иммунные комплексы при офтальмогерпесе/Юфтальмологический журнал.-1983.-№3.-С. 166-169.

71. Можеренков В.П., Усова Л.А. Витамин А в лечении глазных болез-ней//Офтальмологический журнал.-1983.-№4С.23 9-242.

72. Молдавер Б.Л. Асептическое приготовление лекарственных средств.-С-Пб, 1993.

73. Молекулярная биология мембранных структур.- М.: Биофизика, 1975.-117 с.

74. Нгуен В.К. Исследования в области устойчивости и стабильности растворов глазных капель: Автореф.дисс.канд.фарм.наук.-М., 1972.-34 с.

75. Новиков Е.И., Громов М.И., Бобров К.Ю., Попов A.C. Усовершенствование реабилитации больных после острых воспалительных заболеваний матки и ее придат-ков//Российский биомедицинский журнал.-2005.-Т. 6.-С.743-752.

76. Новиков Ю.К. Свободнорадикальное воспаление и антирадикальная защита у больных бронхиальной астмой// Пульмонология.-1997.-Т. 5.-№17.-С.9-12.

77. Новоселова Е. Г., Макар В. Р., Семилетова Н. В., Галибина И. В., Вакулова JI. А., Фесенко Е. Е. Участие антиоксидантов в регуляции клеточного иммуните-та//Иммунология.-1998.-№4.-С.ЗЗ-37.

78. Петрович Ю.А., Терехина H.A., Шмаиль К.В. Влияние селенита на активность глю-татионпероксидазы и супероксиддисмутазы в тканях глаза при герпетическом ке-ратите//Бюлл. Эксп. Биол. и мед.-1987.-№4.-С.405-407.

79. Полимеры в фармации. М.: Наука,1985.

80. Портенко Г.М., Трифонов B.C., Михирёва М.М. К сравнительной оценке применения унитиола при лечении аллергических заболеваний JIOP-органов //Аллергические реакции в эксперименте и клинике: сборник научн. трудов.-М.,1986.-119 с.

81. Противовирусные средства: руководство для врачей и фармацевтов/ Ершов Ф.И., Голубев С.Ю:, Коваленко А.Л., Ариненко Р.Ю.-Спб., 1996.-57 с.

82. Ройт Ф., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология (пер. с англ.).-М.2000.-582 с.

83. Рослый И.М., Ромм А.Р., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. О роли церулоплазмина, трансферрина и перекисного окисления липидов при бактериальных поражениях ЦНС //Патол.физиол.экспеР.-1990.-№4.-С.40-41.

84. Рыкун B.C., Майчук Ю.Ф. Клинико-экспериментальное обоснование применения токоферола в лечении офтальмогерпеса //Вестник офтальмологии.- 1988.-Т.104.-№4.-С.65-68.

85. Селькова Е.П. Современные подходы к профилактике и лечению острых респираторных вирусных инфекций// Русский медицинский журнал.-2001.-№21.-С.960-963.

86. Синев Д.Н., Гуревич И.Я. Технология и анализ лекарств.-М.,1989.

87. Соколова Л.Ф. Исследование антиокислительной активности стабилизаторов водных растворов лекарственных веществ для инъекций.-М.,1982.

88. Соколова Л.Ф., Гусева Л.Н. Новый стабилизатор для стерильных растворов новокаина //Решение актуальных задач формации на современном этапе: тез. докл. научн. конф.-М., 1994.-146 с.

89. Сомов Е.Е Герпетические и эпидемическиевирусные кератоконъюнктивиты.Спб., 1996.

90. Состояние и перспективы разработки, производства и использования вспомогательных веществ для изготовления лекарственных средств: сборник научн. трудов,-Харьков, 1987.

91. Сотникова Н.Ю., Посисеева JI.B., Анциферова Ю.С., Колесникова И.К., Бойко E.JI. Особенности системного и местного иммунитета у женщин с привычным невынашиванием различного генеза//Медицинская иммунология.-2000.-Т.2.-№2.-С.19б-197.

92. Сухинин В. П., Зарубаев В. В., Платонов В. Г., Автушенко С. С. Влияние липосо-мального бета-каротина на экспериментальную летальную гриппозную инфек-цию//Вопросы вирусологии.-1999.-№4.-С.163-167.

93. Сухих Г.Т., Ванькл Л.В., Кулаков М.В. Иммунитет и генитальный герпес.-Н. Новгород. :НГМА, 1997.-224 с.

94. Темичева Е.В. Интерфероновый статус при рецидивирующем герпесе гениталий и коррекция его нарушений: Автореф.дисс.канд.мед.наук.-М.,1989.

95. Теоретические основы приготовления лекарственных средств и их биофармацевтическая оценка. -М.,1983.

96. Терехина H.A., Петрович Ю.А. Активность антиоксидантных ферментов и хеми-люминисценция лимфоцитов периферической крови при инфицировании глаза вирусом простого герпеса//ВопР.мед.химии.-1992.-№5.-С.-62-63.

97. Травкин А.Г., Ромашченко А.Д. Новый класс лекарственных препаратов для применения в офтальмологии// Вестник офтальмологии.-1097.-Т. 113.-М6.-С. 35-36.

98. Тютенков О.Л., Филиппин H.A., Яковлева Ж.И. Тара и упаковка готовых лекарственных средств».-М^, 1982.

99. Учайкин В.Ф. Острые респираторные заболевания (ОРЗ) у детей//Детский доктор,-1999.- №l.-C.33-36.

100. Фролова'А.П. Исследование глазных капель, содержащих легкоокисляющиеся витамины: Автореф.дисс.канд.фарм.наук.-М.,1987.

101. Хабиб Ф.С-А. Стабилизация глазных капель легкоокисляющихся препаратов: Ав-тореф.дисс. канд.фарм.наук.-М., 1977.

102. Хакимова У.Х. Альбумин при лечении глазных болезней// Актуальные вопросы офтальмологии. Сборник научн. трудов.-Ташкент.,1981.

103. Хохлова Л.И. Изучение антимикробной активности консервантов в гетерогенных лекарственных формах: Автореф.дисс.канд.фарм.наук.-М.,-1984.

104. Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов и системы регулирования его интен-сивности//Структура, биосинтез и превращение липидов в организме животных и человека.-М., 1977.

105. Часовникова Л.В., Фармазюк В.Е., Серменко В.И., Владимиров Ю.А. Антиокислительное действие лекарственных препаратов, применяемых для лечения катарак-ты//Бюлл. Экспер. Биол. и мед.-1989.-№12.-С.668-669.

106. Чекнев С. Б. Активные метаболиты кислорода в обеспечении и контроле естественных цитотоксических реакций//Вестник РАМН.-1999г.-№ 2-С. 10-15.

107. Чижов Н.П., Ершов Ф.И., Индулен М.К. Основы экспериментальной терапии вирусных инфекций.-Рига.,1988.-171 с.

108. Шаимова В. А. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная защита при заболеваниях глаз//Вестник офтальмологии.-2002.-№3.-С.56-65.

109. Шепелев А.П., Корниенко И.В., Шестопалов A.B., Антипов А.Ю. Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе инфекционных болез-ней//ВопР.мед.химии.-2000.-№2.-С. 11-23.

110. Шульгина H.A., Мельников В.Я. Нарушение процессов перекисного окисления липидов и использование антиоксидантов в офтальмологии/ Деп.в ГНЦМБ.27.03.1991; №1556.

111. Шульженко А.Е. Стандартные и альтернативные подходы к диагностике и лечению герпес -вирусных инфекций: Автореф.дисс.доктора. мед.наук.-М.,2006.

112. Шумило Т.В., Борзунов Е.Е., Корытнюк P.C. Изотонирование растворов. Учебное пособие.-М.1988.

113. Энциклопедия лекарственных средств «Регистр лекарственных средств России»,-М.-2007.

114. Amir Н. S. Buccal mucosa as a route for systemic drug delivery: a review//.! Pharm Pharmaceut Sci.-l 998.-№ 1 .-P. 15-30.

115. Anderson R.E., Kretzer F.L., Rapp L.M. Free radicals and ocular disease// Adv-Exp-Med-Biol.-1994.-P.36673-36686.

116. Aungst, B.J., Rogers, N.J., Shefter, E. Comparison of nasal, rectal, buccal, sublingual and intramuscular insulin efficacy and the effects of a bile salt absorption promoter//The J. Pharmacol. Exp. Ther.-1988.-Vol. 244.-P.23-27.

117. Baskine H., Yazici Z., Baskine Y., Olgun N., Ozkul A., Bahar I.H. Effects of non toxic doses of acyclovire on nitric oxide ond cellular death responses in herpesvirus types 1 and 2 infected Hep-2 cells//Newmicrobial.-2005.-Vol.28.-№3.-P.205-213.

118. Bauer D. J. Antiviral Chemotherapy: The First Decade//British Medical journal.-1973.-№3.-P. 275-279.

119. Bean B. Antiviral therapy: current concepts and practices// Clin Microbiol Rev.-1992.-Vol. 5-№2.-P. 146-182.

120. Biswas P. S., Baneijee K., Bumseok K., Kinchington P.R., Rouse B.T. Role of inflammatory cytokine-inducedxycloxygenase 2 in the ocular immunopathologic disease herpetic stromal keratitis//Joumal of virology.-2005.-Vol. 79.-№16.- P.10589-10600.

121. Bosch-Morell F., Romra J., Puertas F.J., at all. Efficacy of the antioxidant ebselen in experimental uveitis// Free Radic.Biol.Med.-1999.-Vol. 27.-№(3-4).-P.388-391.

122. Bryson, Y. J., Kronenberg L. H. Combined antiviral effects of interferon, adenine arabi-noside, hypoxanthine arabinoside,and adenine arabinoside-5'-monophosphate in human fibroblast cultures// Antimicrob.Agents Chemother.-1977.-№l 1.-P.299-306.

123. Bukrinskaya A.G., Vorkunova N.K., Kornilayeva G.V., Narmanbetova R.A.,Vorkunova G.K. Influenza virus uncoating in infected' cells and effect of rimantadine// J. gen. Virol. -1982.-№ 60.-C.49-59.

124. Bukrinskaya A.G., Vorkunova N.K., Pushkarskaya N.L. Uncoating of a rimantadine-resistant variant of influenza virus in the presence of rimantadine//J.gen.Virol. -1982,-№ 60.-C.61-66.

125. Burlington D.B., Meiklejohn G.,Mostow S.R. Anti-influenza a virus activity of amantadine hydrochloride and rimantadine hydrochloride in ferret tracheal ciliated epithelium//Antimicrobial agents and chemotherapy.-1982.-Vol.21.-.№-5.- P. 794-799.

126. Cotarelo M., Catalán P., Sánchez-Carrillo K. et all. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents/Journal of Antimicrobial Chemotherapy.- 1999.-№44.-P.705-708

127. Cummins M.J., Papas A., Kammer G.M., Fox P.C. Treatment of primary Sjogren's syndrome with low-dose human interferon alpha administered by the oromucosal route: combined phase EI results//Arthritis Rheum.-2003.-Vol.49.-№4.-P.585-593.

128. Dal Negra, R., Turco, P., Pomari, C., and Trevisan, F., Calcitonin nasal spray in pa-tienmts with chronic asthma: a double-blind crossover study vs placebo, Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. Toxicol., 29:144-146, 1991.

129. De Clercq E. Clinical potential of the acyclic nucleoside phosphonates cidofovir, ade-fovir, and tenofovir in treatment of DNA virus and retrovirus infections// Clin.Microbiol.Rev.-2003.-Vol. 16.-№4.-P.569-596.

130. De Clercq E., Sakuma T. Baba M. Pauwels R., Balzarini J., Rosenberg I., Holy A. Antiviral activity of phosphonylmethoxyalkyl derivatives of purine and pyrimidines//Antiviral research.-1987.-Vol.8.-№5-6.-P.261-272.

131. Devis J.M., Narachi M.A., Levene H.L. et al Potency stability of recombinant interferon // J. Interferon Res.-1987.-№7.-P.203-211.

132. Douglas R.M., Moore B.W., Miles H.B., et all. Prophylactic efficacy of intranasal alpha 2 interferon against rhinovirus infection in the family setting//N Engl J Med.-1986.-№314.-P.65-70.

133. Eid P., Meritet J.F., Maury C., et all. Oromucosal interferon therapy: pharmacokinetics and pharmacodynamics//! Interferon Cytokine Res.-1999.-Vol.l9.-№2.-P.157-169.

134. Elion G.B., Singer S., Hitchings S. Antagonists of nucleic asid derivatives. VIII. Synergism in combination' of biochemicaliy related antimetabolites// J.biol.chem.-1954.-№208.-P .477-488.

135. Elkayam, R., Friedman, M., Stabholz, A., Soskolne, A.w., Sela, M.N., Golub, L. Sustained release device containing minocycline for local treatment of periodontal disease//J. Control. Rel.-1988.-№7.-P.231-236.

136. Ferrara P.-C.P., Peixoto M. L., Silva M.A., Golher R.R. Assays of human interferon in Vero cells by several methods// J. of clinical microbiology.-1979.-№4.-P.471-475.

137. Govorkova EA, Kaverin NV, Gubareva LV, Meignier B, Webster RG. Replication of influenza A viruses in a green monkey kidney continuous cell line (Vero)// J Infect Dis.-1995 .-Vol.172.-№1 .-P.250-253.

138. Govorkova EA, Murti G, Meignier B, de Taisne C, Webster RG. African green monkey kidney (Vero) cells provide an alternative host cell system for influenza A and B viruses// J V irol.-1996.-Vol.70.-№8.-P.5519-5524.

139. Green J.A., Yen T.-J., Overall J.C. Rapid quantitative, semiautomated assay for virus induced and immune human interferons//J. of clinical microbial.-1980.-№9.-P.433-438.

140. Guangming L., Shimizu I., Cui X. at all. Interferon-a enhances biological defense activities against oxidative stress in cultured rat hepatocytes and hepatic stellate cells// J. Med. Invest.-2002.-№9.-P. 172-181.

141. Hayden F. G., Douglas R. G., Simons R. Enhancement of activity against influenza viruses by combinations of antiviral agents// Antimicrobial agents and chemotherapy.-1980.-Vol. 18.-.№-4.- P. 536-5311.

142. Hayden F. G., Cote K. M., Douglas R. G. Plaque inhibition assay for drug susceptibility testing of influenza viruses//Antimicrobial agents and chemotherapy.-1980.-Vol.l7.-.№-5.- P. 865-870.

143. Hayden F. G., Schlepushkin A.N., Pushkarskaya N.L. Combined interferon-a2, rimantadine hydrochloride, and ribavirin inhibition of influenza virus replication in vitro// Antimicrobial agents and chemotherapy.-1984.-Vol.25.-.№-l.- P.53-57.

144. Head K.A. Natural therapies for ocular disorders, part one: diseases of the retina//Altern Med Rev.-1999.-Vol. 4.-№5.-P.342-359.

145. Hellberg M.R., Namil A., Delgado P., at all. Novel esters and amides of nonsteroidal antiinflammatory carboxylic acids as antioxidants and antiproliferative agents// J Med Chem.-1999.-Vol.42.-№2.-P.267-276.

146. Ishida, M., Nambu, N„ and Nagai, T. Mucosal dosage form of lidocaine for toothache using hydroxypropyl cellulose and carbopol//Chem. Pharm. Bull.-1982.-Vol.30.-P.980-984.

147. Kamataki T., Sugita 0., Naminohira S., Kitagawa H. Effects of various compounds on lipid peroxidation mediated by detergent-solubilized rat liver NADPH-cytochrome C reductase//.^ J Pharmacol.-1978.-Vol. 28.-№6.-P.837-845.

148. Kaufinan H.E. Chlinical cure of herpes simplex keratitis by 5-Iodo-deoxiuridine//Proc Soc Exp Biol Med.-1962.-№109.-P.251-252.

149. Kaufinan H.E., Heidelberget C. Therapeutic antiviral action of 5-I-fluoromethyl-2'deoxiuridine//Science.-1964.-№145.-P.585-586.

150. Kaufinan H.E., Varnell E.D. Effect of 9-p-D-arabinofuranosyladenine 5'-monofosfate and 9-p-D-arabinofuranosylhydroxanthine 5'-monofosfate on experimental herpes simplex keratitis//Antimicrob. Agents Chemother.-1976.-№12.-P.885-888.

151. Kaverin N.V., Webster R.G. Impairment of multicycle influenza virus growth in Vero (WHO) cells by loss of trypsin activity// J Virol.-1995.-Vol.69.-№4.-P.2700-2703.

152. Keadle T.L., Morris J.L., Stuart P.M. The effect of aminoguanidine on primary andtrecur-rent ocular herpes simplex virus infection//Nitric oxide.-2005.-Vol. 13,-№4;-P:247-253.

153. Kneyber M.C., Moll H.A., de Groot R. Treatment and prevention of respiratory virus in-fection//Eur. J. Pediatr.-2000.-Vol. 159.-M6.-P.399-411.

154. Krishna N., Brow F. Polyvinyl alcohol as an ophthalmic vehicle//American J. ophthal-mology.-1964.-№57.-P.99-106.

155. LaFleur D.W., Nardelly B., Tsareva T. et all. Interferon-K, a novel type 1 interferon expressed in human keratinocytes//J. biological chemistry.-2001.-Vol.276.-№43.-P.39765-39771.

156. Lee, W.E. Permeation enhancers for the nasal delivery of protein and peptide therapeu-tics//Bio Pharm.-1990.-№3.-P.22-25.

157. Lyu S.Y., RhimJ.Y., ParkW.B. Antiherpetic activities of flavonoids against herpes simplex virus type 1 (BnT-l) and type 2 (BnT-2) in vitro// Arch Pharm Res. -2005.-Vol. 28-№l 1.-P.1293-1301

158. Marcelletti J.F. Synergistic inhibithion of herpesvirus replication by docosanol and antivirus nucleoside analogs// Fntyviral res.-2002.-Vol. 56.-№2.-P. 153-166.

159. McGahan M.C., Fleisher L.N., Grimes A.M.Clinical signs of acute ocular inflammatory response to endotoxin are not altered by increasing antioxidant potency of intraocular fluids// Inflammation.-1989.-Vol. 13.-№4.-P.393-400.

160. Meager A. Biological assays for interferons/J. of Immunol. Method.-2002.-№261.-P.21-36.

161. Mire-Sluis A.R., Page L.A., Meager A. et all. An anti-cytokine bioactivity assay for inter-ferons-a, -P and -tb//J.of Immunol. Method.-1996.-№195.-P.55-61.

162. Naesens L., Lenaerts L., Andrei G., Snoeck R., Van Beers D., Holy A., Balzarini J., and De Clercq E. Antiadenovirus activities of several classes of nucleoside and nucleotide analogues//Antimicrob.Agents.Chemother.-2005.-Vol.49.-№3.-P. 1010-1016.

163. Organisciak D.T., Darrow R.M., Jiang Y.I., Marak G.E., Blanks J.C. Protection by dimethylthiourea against retinal light damage in rats//Invest Ophthalmol Vis Sci.-1992.-vol 33.-№5.-P. 1599-1609.

164. Palomba M., Melis G.B. Oral use of interferon therapy in cervical human papillomavirus infection//Clin Ter.-2000.-Vol. 151 .-№1 .-P.59-61.

165. Pedro de la Iglesia, Melon S., Lopez B. et all Rapid screening tests for determining in vitro susceptibility of herpes simplex virus clinical isolates//Joumal of Clinical Microbiol-ogy.-1998.-Vol.36,- № 8.- P.2389-2391.

166. Peretti S., Shaw A., Blanchard J., Bohm Rt, Morrow G., Lifson J. D., Gettie A., and Pope M. Immunomodulatory effects of BIir-2 infection on immature macaque dendritic cells modify innate and adaptive responses// Blood.-2005.-Vol.l06.-№4.-P.1305-1313.

167. Phillpotts R.J., Higgins P.G., Willman J.S., et all. Intranasal lymphoblastoid interferon. ("Wellferon") prophylaxis against rhinovirus.and influenza virus in volunteers//.! Interferon Res.-1984.-Vol.4.-№4.-P.535-541.

168. Rathbone, M., Drummond, B., Tucker, I. Oral cavity as a site for systemic drug deliv-ery//Adv. Drug Del. Rev.-1994.-Vol.13.-P.l-22.

169. Rathbone, M.J., Hadgraft, J. Absorption of drugs from the human oral'cavity// Int. J. Pharm.-1991 .-Vol.74.-P.9-24.

170. Rose R.C., Richer S.P., Bode A.M.Ocular oxidants and antioxidant protection// Proc Soc Exp Biol Med.-l 998.-Vol.217.-№4.-P. 397-407.

171. Ruiz L., Reyes N., Duany L., at all Long-term stabilization of recombinant human interferon alpha 2b in aqueous solution without serum albumin// Int J Pharm.-2003.-Vol.-264.-№(l-2).-P.57-72.

172. Safrin S., Phan L. In vitro activity of penciclovir against clinical isolates of acyclovir-resistant and foscarnet-resistant herpes simplex virus//Antimicrob. Agents Chemother.-1993.-Vol. 37/-№10.-P. 2241-2243

173. Saijo M., Suzutani T., Yoshida I. Effects of acyclovir, oxetanocin-G and carbocyclic oxetanocin-G in combinations on replications of herpes simplex virus type 1 and 2 in Vera cells//Tohoku J. ExP. Med.-l 992.-№167.-P.57-68.

174. Sainz BJr., and Halford W.P. Alpha/beta interferon and gamma interferon synergize to inhibit the replication of herpes simplex virus type l//Joumal of virology.-2002.-Vol.76.-№22.-P.l 1541-11550.

175. Senel S., Kremer M., Nagy. K., Squier G. Delivery of bioactive peptides, and,proteins across oral (buccal) mucosaZ/Current Pharmaceutical Biotechnology.-2001'.-№2.-P.175-186.

176. Shukla D., Spear P.G. Herpesviruses and heparan sulfate: an intimate relationship in aid of viral entry//J.Clin.Invest.-2001 .-Vol. 108.-P.503-510.

177. Sheridan J. Evaluation of antioxidant healing formulations in topical therapy of experimental cutaneous and genital herpes simplex virus infections//Antiviral research.-1997.-Vol.36.-№3.-P.157-166.

178. Smith K.O., Kennell W.L., Poirier R.H., Lynd F.T. In vitro and in vivo resistance of herpes simplex virus to 9-(2-hydroxyethoxymethyl) guanine (acycloguanosine)// Antimicrob Agents Chemother.-1980.-Vol.l7.-№ 2.-P. 144-150.

179. Smolin G., Okumoto M., Ohno S. Experimental herpetic keratitis in the guinea pig//Surv. Ophthalmol.-1976.-Vol.21.-№2.-P.205-208.

180. Soyani, A.P., Chien, Y.W. Systemic delivery of peptides and proteins across absorptive mucosae// Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems.-1996.-№13.-P.85-184.

181. Stagnaro R., Pierri I., Piovano P., at all. Thiol containing antioxidant drugs and the human immune system// Bull Eur Physiopathol Respir.-1987.-№23.-P.303-307.

182. Takano S., Ishiwata S., Nakazawa M., at all. Determination of ascorbic acid in human vitreous humor by high-performance liquid chromatography with UV detection//Curr Eye Res.-1997.-Vol. 16.-№6.-P.589-594.

183. Taylor J.L., Punda-Polic V., O'Brien WJ. Combined anti-herpes virus activity of nucleoside analogs and interferon// Curr. Eye. Res.-1991.-№10.-P.205-211.

184. Tolo H., Kauppinen H.L., Aim G., at1 all. Development of a highly purified multicompo-nent leukocyte IFN-alpha product//J Interferon Cytokine Res.-2001.-Vol.21.-№11.-P.913-920.

185. Wilhelmus KR. The treatment of herpes simplex virus epithelial keratitis//Trans Am Ophthalmol Soc.-2000.-№98.-P.505-32.

186. Wutzler P., Sauerbrei A., Klocking R., Brogmann B., Reimer K. Virucidal activity and cytotoxicity of the liposomal formulation of povidone-iodine//Antiviral Res.-2002.-Vol.54.-№2.-P.89-97.

187. Yamagata Y., Iga K., Ogawa Y. Novel sustained-release dosage forms of proteins using polyglycerol esters of fatty acids// J Control Release.-2000.-Vol. 63.-№3.-P. 319-329

188. Yazici Z., Baskine Y., Baskine H., Gecer O., Bahar I.H., Ozkul A. Study of programmed cell death in bovine herpesvirus 1 infected MDBK cells and the possible role of nitric oxide in this process//Acta vet. Hung.-2004.-Vol.52.-№3.-P.287-297.

189. Yen T.J., McBride P.T., Overall J.C., Green J.A. Automated quantitative cytopathic effect reduction assay for interferon//.!, of clinical microbiology.-1982.-№8.-P.413-415.

190. Zheng M., Atherton S.S. Cytikine profiles and inflamotary cells during Bnr-l-induced acute retinal necrosis//Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.-2005.-Vol.46.-№4.-P.1356-1363.