Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антитела к "узлу" ковалентной связи между белком VPg и РНК пикорнавирусов

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Антитела к "узлу" ковалентной связи между белком VPg и РНК пикорнавирусов"

На правах рукописи

ГАВРЮШИНА Елена Сергеевна

АНТИТЕЛА К «УЗЛУ» КОВАЛЕНТНОЙ СВЯЗИ МЕЖДУ БЕЛКОМ УРё И РНК ПИКОРНАВИРУСОВ

03.02.02 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2010

004607058

Работа выполнена в лаборатории нуклеиново-белковых взаимодействий отдела биохимии вирусов растений Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Доктор химических наук Дрыгин Юрий Фёдорович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Родионова Нина Павловна

Доктор химических наук, профессор Вейко Владимир Петрович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова

Защита состоится 25 июня 2010 года в «•{$'» часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.501.001.76 при Московском университете имени М.В. Ломоносова по адресу. 119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, строение 40, Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова, аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ. Автореферат разослан 25 мая 2010 года.

Учёный секретарь диссертационного совета ^_^ ^ Крашенинников И.А.

кандидат биологических наук Ч3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Ковалентные соединения, в которых белок связан с нуклеиновой кислотой ковалентной связью, были открыты в середине 70-х гг. прошлого столетия у многих групп вирусов животных, растений и бактерий, а также в бактериальных и эукариотических клетках (Дрыгин, 1982; Salas and Vinuela, 1980; Wimmer, 1982; Vartapetian and Bogdanov, 1987; Riechmann et al., 1992; Drygin, 1998). Ковалентные комплексы нуклеиновых кислот и белков стабильны и высоко специфичны, поскольку белок и нуклеиновая кислота в них связаны уникальной ковалентной связью.

Во всех известных природных ковалентных комплексах нуклеиновая кислота и белок соединены фосфодиэфирной связью. Структурное открытие нового класса нуклеопротеидов привело к другому открытию, уже функциональному. Оказалось, что концевые белки или их предшественники, ковалентно связанные с вирусными нуклеиновыми кислотами, являются затравками (праймерами) для репликации вирусных геномов (Salas and Vinuela, 1980; Takegami et al., 1983a; Vartapetian et al., 1984; Riechmann et al., 1992; Paul et al., 1998; De Jong and van der Vliet, 1999).

Среди вирусных РНК-белковых ковалентных комплексов наиболее подробно в структурном и функциональном плане изучены комплексы РНК и 5'-концевого белка VPg пикорнавирусов (Lee et al., 1976, 1977; Drygin et al., 1977; Flanegan et al., 1977; Nomoto et al., 1977), калицивирусов (Schaffer et al., 1980; Machin et al., 2001), потивирусов (Murphy et al., 1991; Riechmann et al., 1992) и комовирусов (Drygin et al., 1987; Carette et al„ 2001). У пикорнавирусов 3-й остаток тирозина белка ЗВ (VPg) связан с 5'-концевым остатком уридинфосфата вирусного генома. Идентичная структура «узла связи», Tyr-pUp, найдена у потивирусов и калицивирусов, хотя остаток тирозина находится в другом положении. У комовирусов реализуется фосфодиэфирная связь 5'-концевого остатка уридинфосфата РНК с остатком серина белка VPg (Ser-pUp).

Подобные ДНК-белковые ковалентные комплексы подробно изучены у аденовирусов (Lindenbaum et al., 1986) и бактериофагов q>29 (Salas and Vinuela, 1980; Blanco et al., 1992) и (pXI74 (Eisenberg, 1980; Roth et al., 1984; Sanhueza and Eisenberg, 1984, 1985).

Показано, что концевые белки, связанные фосфодиэфирной связью с геномными РНК или ДНК вирусов, играют ключевую роль в инициации их репликации, поскольку либо сами эти белки, либо их предшественники являются праймерами для синтеза вирусных нуклеиновых кислот (Salas and Vinuela, 1980; Takegami et al., 1983a,b; Vartapetian et al., 1984; Lindenbaum et al., 1986; Harris et al., 1994; Schaad et al., 1997; Carette et al., 2001). У бактериофагов с одноцепочечной ДНК (например, рХ174) в процессе репликации образуется

промежуточный ковалентный комплекс между белком А и геномной ДНК (Eisenberg, 1980; Roth et al., 1984; Sanhueza and Eisenberg, 1984, 1985).

Интересно, что подобные по структуре «узла связи» промежуточные ковалентные комплексы образуют вирусные и клеточные ДНК-топоизомеразы I рода (Tse et al., 1980; Wang et al., 1996). ДНК-топоизомеразы I рода вносят одноцепочечные разрывы в молекулы ДНК, образуя фосфодиэфирную связь между остатком тирозина, входящего в состав активного центра фермента (Tse et al., 1980), и 5'- или З-'концевым нуклеотидом - как правило, с остатком тимидинфосфата.

Недавно in vitro были получены комплексы между РНК и бактериальной ДНК-топоизомеразой III (Wang et al., 1996). ДНК-топоизомеразы в комплексе с РНК были способны к реакции трансэтерификации, а значит, эти комплексы подобны промежуточным активным фосфодиэфирам, которые образуются через остатки тирозина ДНК-топоизомераз и нуклеотидным фосфатом - с большой вероятностью, с уридинфосфатом.

Таким образом, ключевой структурой для разнообразных комплексов вирусной и клеточной природы является Tyr-pUp - фосфодиэфир остатка тирозина белка и уридин-(5', 3')-дифосфата. Логично предположить, что антитела на такую структуру могут быть полезным инструментом для анализа образования, функционирования и диссоциации вышеуказанных как вирусных, так и клеточных ковалентных соединений белков и нуклеиновых кислот.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является создание инструмента для поиска и изучения вирусных ковалентных комплексов PHK-VPg, содержащих «узел связи» Tyr-pUp, и структурно подобных им гипотетических клеточных комплексов. Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1. Получение и характеристика модельного соединения, имитирующего «узловую» структуру между остатком тирозина белка VPg и 5'-концевым остатком уридиловой кислоты РНК пикорнавирусов.

2. Синтез антигена - конъюгата модельного соединения с лизоцимом и получение к нему антисыворотки.

3. Выделение и очистка антител к «узловой» структуре.

4. Анализ специфичности препарата антител на нитратцеллюлозной мембране методом «иммунозолото» in vitro.

5. Исследование пикорнавирусной инфекции в клетках с помощью очищенного препарата антител к «узловой» структуре in vivo.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Разработан эффективный синтез модельного соединения - гаптена, содержащего «узловую структуру», - в растворе, позволяющий получать миллиграммовые количества целевого вещества. Структура полученного соединения доказана методами обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ), УФ-спектрофотометрии и время-пролетной масс-спектрометрии.

Разработан метод выделения и получен препарат поликлональных антител, специфически узнающих антиген и природный комплекс РНК-УРд пикорнавирусов.

Показано, что антитела к «узловой» структуре связываются с местами локализации репликации пикорнавирусной РНК в инфицированных клетках.

Результаты работы могут быть использованы в научных исследованиях в молекулярной и клеточной биологии, вирусологии и иммунологии. Возможно применение антител к «узловой» структуре для изучения механизмов репликации вирусных РНК и для исследования известных и поиска гипотетических клеточных соединений, содержащих подобную «узловую» структуру.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на XV рабочем совещании Европейской исследовательской группы по молекулярной биологии пикорнавирусов (Барселона, Испания, 2008) и на XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010).

Публикации.

Опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура работы.

Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы»,

изложена на_страницах, содержит_рисунков и 1 таблицу. Список литературы

включает_источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Получение и характеристика модельного соединения, имитирующего узловую» структуру Туг-р1р

Для изучения вирусных ковалентных комплексов РНК-\Ф§ в живых клетках и для исследования вирусных инфекций необходимо было иметь антитела к «узловой» структуре между РНК и белком - небольшому по молекулярной массе фрагменту комплекса, содержащему остаток аминокислоты (тирозина) и нуклеотидный остаток (уридиндифосфат), связанные между собой фосфодиэфирной связью. Этот фрагмент является слабым антигеном, поэтому для получения антител требуются повторные иммунизации животных и, следовательно, существенные количества антигена. Выделение вирусных РНК-белковых ковалентных комплексов из клеток является довольно сложной и дорогостоящей процедурой и не позволяет получать «узловую» структуру в миллиграммовых количествах, необходимых для достижения высоких титров целевых антител в антисыворотках. В связи с этим был проведен химический синтез модельного соединения, содержащего «узел связи» Туг-р11р (структура модельного соединения приведена на рис. 1).

АсГЛН .СОМНМе

Рис. 1. Структура целевого модельного соединения, содержащего «узел связи» Туг-р11р (выделен красным).

Сначала синтез модельного соединения Туг-рирЧСРЬ^МНг осуществляли методом автоматизированного олигонуклеотидного синтеза с использованием твердофазного носителя - стекло с контролируемым размером пор, модифицированное Ы-(6-(0-диметокситритил)-гексил)-(2-карбоксамид)-фталимидильными группами, содержащего защищенный аминогексанол путем последовательной конденсации с амидофосфитами уридина и тирозина. Этот метод оказался довольно дорогим и малопроизводительным вследствие ограниченной удельной загрузки аминогексанола на твердофазном носителе и низкого выхода промежуточного продукта на стадии присоединения амидофосфита тирозина (не более 60%).

Далее синтез модельного соединения (Ы(Ас),СО(ЫНМе)]Туг-(5'Р—>0)ир-0-(СНг)бМН2 фосфорамидитным методом проводили в растворе в 4 стадии (схема синтеза

4

представлена на рис. 2). На каждой стадии выход продукта был более 90%. Для селективного связывания аминогруппы аминогексанольного производного модельного соединения с белком-носителем аминогруппу остатка тирозина защищали ацетильной группой. Предложенный метод оказался эффективным для синтеза миллиграммовых количеств модельного соединения.

ига

о otbdms ХН

А I

амидофосфитуридина 1.5-этилтиотетразол, DMTiO MeCN

+

_ иг

TFANH

N-трифторацетиламиногексанол

О OTBDMS QH 2. иод, ТГФ-лиридин-вода

1.95% АсОН 2. NCICHjfcOPfNPr^

Г % EtNHPr'2+ CH2CI2

P-Q

U га a otbdms

cn

0=Р-0

ДсЯКГ XONHMe

IV

1. МеИН2Л1НэИ20 Z Et^«3HF, Et^l, ДМФЯ

NH2

III

N-AcTyr-OMe,

5-этилтиотетразол,

MeCN

fttMH _ XQQMe

Рис. 2. Схема синтеза [N(Ac),CO(NHMe)lTyr-(5'P—0)Up-0-(CH2)6NH2.

Полученное модельное соединение было выделено из реакционной смеси методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на сорбенте С18 в градиенте концентрации ацетонитрила в 100 мМ ацетате триэтиламмония. На рис. ЗА виден мажорный пик, соотвествующий целевому продукту (время выхода 18-20

мин). Полученный продукт был очищен методом ОФ ВЭЖХ в той же системе (на рис. ЗВ виден пик той же формы и с тем же временем выхода), а затем его гомогенность была исследована методом ОФ ВЭЖХ на сорбенте С18 в градиенте концентрации ацетонитрила 0100% при рН от 2,07 до 7,00 (в 10 мМ ацетате аммония, подкисленном уксусной кислотой). На рис. 4 видно, что полученное вещество гомогенно (дает один пик без расщепления) в широком диапазоне рН.

Аи 1500

1000 500

о 'у л

в 0 5 10 15 20 25 30 35 min

Рис. 3. ОФ ВЭЖХ модельного соединения N-Ac-Tyr-pUp-(CH2)6NH2 на сорбенте С18 в градиенте концентрации ацетонитрила мин 0%, 4-26 мин 0->20%, 26-30 мин 20->100%, 30-34 мин 100%, 34-38 мин 100->0%, 38-46 мин 0%, рН 7,0); А - смесь продуктов, В - индивидуальное вещество.

Модельное соединение было также охарактеризовано методами время-пролетной масс-спектрометрии (MALDI TOF) и УФ-спектрофотометрии. На масс-спектре виден мажорный пик с молекулярной массой, соответствующий расчетной массе модельного соединения (рис. 5). Наличие фосфодиэфирной связи между остатками тирозина и уридиловой кислоты в модельном соединении было подтверждено обработкой этого

вещества фосфодиэстеразой змеиного яда с последующим масс-спеетрометрическим анализом продуктов гидролиза.

рН 2.07

рН 2.92

рН 4.01

рН 5.02

рН S.76

рН 7.00

Рис. 4. ОФ ВЭЖХ модельного соединения N-Ac-Tyr-pUp-(CHj)<iNH2 на сорбенте С18 в градиенте концентрации ацетоннтрила при различных рН.

intens.

6000

2000

823 1

600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 т/г Рис. 5. Масс-спектр модельного соединения ГЧ-Ас-Туг-рир-(СН2)бМН2.

По данным УФ-спектрофотометрии, модельное соединение имеет спектр поглощения, соответствующий нуклеиновым кислотам, с максимумом при 262 нм и минимумом при 233 нм (рис. 6).

240 260

Длина волны, нм

Рис. 6. УФ-спектр поглощения модельного соединения Г*)-Ас-Туг-рир-(СН2)бГ'Ш2.

Синтез антигена - конъюгата модельного соединения с лизоцимом

Поскольку синтезированное производное уридиндифосфата и тирозина является лишь гаптеном, с помощью глутарового диальдегида был получен его конъюгат с лизоцимом куриного яйца ([К(Ас),СО(КНМс)]Туг-(5Т^О)Ь^-ОЧСН2)6ЫН2-ГА-лизоцим), структура которого была подтверждена методами УФ-спектрофотометрии и масс-спектрометрии.

14320

д о 4000 6000 юм 10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000"*

¡528916132

в 0 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000.4

Рис. 7. Масс-спектрометрическая характеристика лизоцима (А) и антигена Туг-рЧр-ГА-лизоцим (В). 14320 - ^модифицированный лизоцим; 15289 - лизоцим, связанный с 1 молекулой гаптена, 2 молекулами ГА и 3 молекулами воды; 16132 - лизоцим, связанный с 2 молекулами гаптена, 3 молекулами ГА и 3 молекулами воды; 16930 - лизоцим, связанный с 3 молекулами гаптена, 4 молекулами ГА и 3 молекулами воды.

Молекула лизоцима содержит 7 остатков лизина, присоединение гаптена к белку происходит за счет связывания глутарового диальдегида с е-аминогруппами остатков лизина белка и аминогруппы аминогексанольного заместителя молекулы гаптена. В смеси продуктов реакции были определены немодифицированный лизоцим (молекулярная масса 14320) и коньюгаты лизоцима с 1,2 и 3 молекулами модельного соединения (рис. 7А и 7В).

Получение препарата антител к «узловой» структуре Известно, что нуклеиновые кислоты, нуклеотиды и их производные являются слабыми антигенами. В связи с этим было проведено 7 иммунизации кролика конъюгатом модельного соединения с лизоцимом. Для получения препарата антител антисыворотки подвергали сульфат-аммонийному фракционированию (Harlow and Lane, 1988), затем проводили аффинную хроматографию на протеин G сефарозе (оптический профиль элюции при 280 нм изображен на рис. 8). Далее проводили очистку препарата иммуноглобулинов от примесной нуклеазной активности путем двукратной гель-фильтрации на сефакриле S-200 (оптические профили представлены на рис. 9). На колонку наносили фракции 3-12 элюата иммуноглобулинов после протеин G сефарозы (С = 5,68 мг/мл), для повторной гель-фильтрации использовали все фракции иммуноглобулинов после первой гель-фильтрации. Наличие примесной нуклеазной активности в препаратах антител определяли путем инкубации РНК вируса табачной мозаики (ВТМ) в препаратах антител (30 мин при 37°С) с последующим электрофорезом в 1% агарозном геле в ТВЕ-системе. После двукратной гель-фильтрации на сефакриле S-200 препарат антител к «узловой» структуре практически не содержал примесной нуклеазной активности.

3.s00 1 , . . :

3.000 ..........t - f- Г-:!.....'.....?■■■:?.....I.....i t 4-1.....^—j—г—I

2,500 -—i-i—i

о z.ooo-Фг3

OD..... ....

« ...............

< 1.500 ■.....; ' "1

1.000 -* 1 ";

0.500 -г5ээ

о.ош irarl fr-t~*-7~'-t~*~J ' 1 ' 1 »■«-».♦

о 5 10 15 20 25

фракции

Рис. 8. Оптический профиль элюции антител к «узлу связи» на колонке с протеин G сефарозой.

Рис. 9. Оптические профили первой (А) и второй (В) гель-фильтрации антител к «узлу связи» на сефакриле 8-200.

Характеристика специфичности препарата антител к «узловой» структуре

Специфичность препарата антител к «узловой» структуре анализировали методом «дот-иммунозолото» на нитратцеллюлозных мембранах. Модельное соединение само по себе не удерживается на мембране, поэтому с помощью глутарового диальдегида был синтезирован коньюгат модельного соединения с бычьим сывороточным альбумином. Как видно на рис. 10, антитела к лизоциму, содержащиеся в антисыворотках, не дают перекрестной реакции с БСА, что позволяет детектировать антитела именно к гаптену.

15 2D

фракции

10 15 20

Фракции

1 2 3 4 5

Преиммунная сыворотка

Антисыворотка после 4-й иммунизации iil < , ; «

Антисыворотка после 5-й иммунизации ■ ■ --Щ * !

Антисыворотка после 6-й иммунизации «¿4 т ,

Антисыворотка после 7-й иммунизации

Рис. 10. Анализ антисывороток к «узлу иммунозолото»:

1 - БСА (25 пмоль)- отрицательный контроль;

2 - Tyr-pUp-ГА-БСА (30 пмоль «узла связи»);

3 - Tyr-pUp-ГА-БСА (150 пмоль «узла связи»);

4 - Tyr-pUp-ГА-БСА (750 пмоль «узла связи»);

5 - лизоцим (25 пмоль).

связи» (разведение 1/25) методом «дот-

Показано, что очищенный на протеин в сефарозе препарат антител к модельному соединению узнает 2 пикомоля «узла связи» в составе конъюгата Туг-рир-ГА-БСА (рис. 11). 1 2 3 4 5

ЧвД

Рис. 11. Проверка узнавания конъюгата Туг-р11р-ГА-БСА антителами после очистки на протеин С сефарозе (С = 1,6 мг/мл) методом «дот-иммунозолото»:

1 - Туг-рир-ГА-БСА (0,4 пмоль «узла связи», 0,1 пмоль БСА);

2 - Туг-рир-ГА-БСА (2 пмоль «узла связи», 0,5 пмоль БСА);

3 - Туг-рир-ГА-БСА (10 пмоль «узла связи», 2,5 пмоль БСА);

4 - Туг-рир-ГА-БСА (50 пмоль «узла связи», 12,5 пмоль БСА);

5 - БСА (12,5 пмоль).

Модельное соединение, имитирующее «узловую» структуру Туг-рЦр, содержит урадил и сахарофосфатное звено. Каждая молекула РНК содержит тысячи остатков урацила и сахарофосфатных звеньев, поэтому препарат антител к модельному соединению дает заметную перекрестную реакцию с полиуридиловой кислотой и с РНК вируса табачной мозаики, не имеющей концевого белка

1 2 3 4 5

1' ' • Г", «* i

Рис. 12. Определение специфичности антител к «узлу связи» после очистки на протеин G сефарозе (С = 0,16 мг/мл) методом «дот-иммунозолото»:

1 - Tyr-pUp-ГА-БСА (10 пмоль «узла связи», 2,5 пмоль БСА),

2 - Tyr-pUp-ГА-БСА (50 пмоль «узла связи», 12,5 пмоль БСА),

3 - БСА (12,5 пмоль),

4 - poly(U) (125 пмоль нуклеотидов),

5 - РНК ВТМ (125 пмоль нуклеотидов).

Чтобы выявить целевые антитела именно к «узлово£^структуре, был использован

подход, в котором резко повышается доля анализируемого «узлового» звена ковалентного

комплекса VPg-PHK, удерживаемого нитратцеллюлозной мембраной. Хорошо известно, что

белки и нуклеотиды, связанные с белками, прочно удерживаются на нитратцеллюлозной

мембране, а для удержания нуклеотидов и нуклеиновых кислот необходима дополнительная

фиксация УФ-светом. В связи с этим РНК вируса Менго, РНК Х-вируса картофеля (ХВК) и

полиуридиловую кислоту подвергали исчерпывающему щелочному гидролизу (0,1 М NaOH,

20 мин при 100°С). Фосфодиэфирная связь между 5'-концевым остатком уридиловой

кислоты РНК и остатком тирозина белка VPg устойчива в этих условиях (Yuodka and

Sasnauskene, 1974). Нейтрализованные гидролизаты нуклеиновых кислот наносили на

мембраны без пришивания ультрафиолетовым светом и отмывали мембраны от

несвязавшихся продуктов щелочного гидролиза - моно- и олигонукпеотидов - водой. Белок

VPg, ковалентно связанный с 5'-концевым уридиндифосфатом, при этом удерживается на

12

мембране, а свободные нуклеотиды не удерживаются. Было показано, что препарат антител узнает гидролизат РНК вируса Менго, не узнает гидролизат ро1у(и) и дает фоновую реакцию с РНК ХВК (рис. 13А), которая практически исчезает при добавлении ро!у(11) и РНК ХВК к

препарату антител (рис. 13В).

1 2 3 4 5

Контрольный препарат антител • О

Тот же препарат антител с добавлением ро1у(и) и РНК ХВК (по 0,167 мкг = 500 пмоль нуклеотидов) \

Рис. 13. Определение специфичности антител к «узлу связи» после очистки на протеин С сефарозе (С = 0,8 мг/мл) методом «дот-иммунозолото» с гидролизатами РНК:

1 - смесь нуклеозид-5'-монофосфатов (58,24 нмоль),

2 - Туг-рир-ГА-БСА (7,5 пмоль «узла связи»),

3 - гидролизат 20,25 мкт ро1у(11),

4 - гидролизат 20,25 мкт РНК вируса Менго (7,5 пмоль = 58,24 нмоль нуклеотидов),

5 - гидролизат 20,25 мкг РНК ХВК.

Исследование пикорнавирусной инфекции в клетках

с помощью очищенного препарата антител к «узловой» структуре

Рис. 14. Исследование инфекнии, вызываемой НКУ2 в клетках НеЬа В, с помощью антител к «узлу связи» после очистки на протеин С сефарозе и двукратной гель-фильтрации на сефакриле 8-200 (С = 0,07 мг/мл) и аффинно очищенных антител к белку НК\ 2 (С = 0,016 мг/мл).

Независимое доказательство специфичности препарата антител к «узловой» структуре было проведено на живых клетках методом иммунофлуоресцентной микроскопии. Для этого клетки НеЬа В инфицировали вирусом обыкновенной простуды человека 2 (НЯУ2, пикорнавирус) в течение 8 ч, затем инфицированные и неинфицированные клетки обрабатывали раздельно первичными антителами (антитела к «узлу связи» после очистки на протеин в сефарозе и двукратной гель-фильтрации на сефакриле 8-200 и аффинно очищенными антителами к белку НЯУ2) и вторичными антителами (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с флуоресцентными красителями ТЯ1ТС и РГГС).

Первичные антитела к белку НЯУ2, вторичные антитела с ТШТС

Первичные антитела к «узлу связи», вторичные антитела с Р1ТС

Совмещение

Рис. 15. Совмещение инфицированных НЯУ2 клеток НеЬа В, обработанных первичными антителами к «узлу связи» и вторичными антителами с ТШТС, и обработанных первичными антителами к белку VPg Ш*У2 и вторичными антителами с ПТС. На рисунке видно, что антитела к «узлу связи» и антитела к белку \Т« Н Я\ 2 узнают одни и те же структуры в инфицированных клетках.

При инкубации неинфицированных клеток НеЬа В с обоими препаратами первичных антител в клетках наблюдали равномерное слабое свечение всей цитоплазмы. В инфицированных и неинфицированных клетках, обработанных вторичными антителами без первичных антител, также было равномерное фоновое свечение цитоплазмы. При инкубации инфицированных клеток как с препаратом антител к белку УР§ НЛУ2, так и с препаратом антител к «узловой» структуре наблюдали островки яркой дискретной флуоресценции, сосредоточенные по периферии ядра и в псевдоподиях (рис. 14). Островки флуоресценции сохранялись и при обработке инфицированных клеток РНКазой А в условиях исчерпывающего гидролиза РНК (С = 1 мг/мл, 1 ч при 37°С) (ОаоиэЬ 1964). Ранее нами было показано, что фосфодиэфирная связь между УР§ и РНК устойчива к обработке панкреатической РНКазой (Гулевич, 2000). Следовательно, наблюдаемая дискретно

локализованная флуоресценция вызвана связыванием антител с «узловой» структурой Туг-pUp, а не с сахарофосфатным остовом РНК.

При совмещении фотографий клеток, обработанных антителами к «узлу связи» и обработанных антителами к белку VPg HRV2, островки флуоресценции полностью перекрывались (рис. 15). Антитела к «узловой» структуре узнавали те же островки инфекции в инфицированных клетках, что и антитела к белку VPg. Следовательно, эти антитела специфически узнают места локализации репликации вирусной РНК, ассоциированные с мембранами гладкого эндоплазматического ретикулума в перинуклеарном пространстве.

Таким образом, совокупные полученные результаты указывают на высокую специфичность препарата антител к «узловой» структуре, узнающих узел ковалентной связи Tyr-pUp в вирусных ковалентных комплексах РНК-VPg.

ВЫВОДЫ

1. Предложен простой и эффективный фосфорамидитный метод препаративного синтеза в растворе модельного соединения (гаптена), содержащего «узловую» структуру ковалентного комплекса РНК-VPg пикорнавирусов, а именно 5'-фосфодиэфирное производное уридиндифосфата и тирозина. Методами структурного анализа доказана идентичность полученного соединения целевому гаптену.

2. С помощью бифункционального агента получены конъюгаты гаптена с лизоцимом (антиген) и БСА (аналит). Состав антигена был определен время-пролетной масс-спектрометрией. На антиген были получены и очищены поликлональные антитела кролика, специфичность которых доказана in vitro иммунохимическим методом на нитратцеллюлозной мембране.

3. Антитела к модельному гаптену, имитирующему «узел» ковалентной связи между 5'-концом РНК и белком VPg пикорнавирусов, специфически узнают пикорнавирусные ковалентные комплексы РНК-VPg и места локализации репликации пикорнавирусной РНК в инфицированой клетке.

4. Получен инструмент - антитела к «узловой» структуре - для обнаружения и исследования структурно подобных природных ковалентных соединений белков и РНК вирусного и клеточного происхождения как in vitro, так и т vivo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гаврюшина Е.С. Кооперация между белками пикорнавирусов для преодоления защитных механизмов клетки. // Журнал Общей Биологии. - 2009. - Т. 70. - С. 24524В.

2. Сушко А.Д., Яминский И.В., Гаврюшина Е.С., Дрыгин Ю.Ф. Высвобождение РНК из вируса обыкновенной простуды человека HRV2 в кислой среде. // Коллоидный журнал. - 2010. - Т. 72. - С. 1-6.

3. Гаврюшина Е.С., Вахитова Е.Р. Получение и анализ специфичности антител к узловой структуре коваленгной связи между РНК и терминальным белком VPg пикорнавирусов. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. 11-15 мая. Тезисы докладов. - 2008. - С. 92.

4. Drygin Yu.F., Sushko A.D., Gavryushina E.S., Yaminsky I.V., Pickl-Herk A., Blaas D. AFM study of RNA exiting from Picornavirus virions. XV Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses. Sitges, Barcelona. May 26-30. - 2008. -P. 128.

5. Drygin Yu.F., Kirikova M.N., Barskii A.V., Gallyamov M.O., Grokhovskaya A.S., Gavryushina E.S., Zatsepin T.S., Nadezhdina E.S. Antibodies to virus genomes. XV Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses. Sitges, Barcelona. May 26-30. - 2008. - P. 174.

6. Гаврюшина E.C., Зацепин T.C., Торопыгин И.Ю. Получение и анализ специфичности антител к «узловой» структуре между белком VPg и РНК пикорнавирусов. XVII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010». Секция Биология. Москва. 12-15 апреля. Тезисы докладов. - 2010. - С. 197198.

Подписано в печать:

20.05.2010

Заказ № 3797 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гаврюшина, Елена Сергеевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. КОВАЛЕНТНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ БЕЛКОВ И РНК У

РНК-CO ДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Пикорна-подобные вирусы

1.1.1. Пикорнавирусы

1.1.2. Калицивирусы

1.1.3. Потивирусы

1.1.4. Комовирусы

1.2. Собемо-подобные вирусы

1.3. Бирнавирусы

1.4. Консервативность структуры вирусных ковалентных комплексов РНК-VPg и механизма инициации репликации вирусных геномов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Синтез антигена и получение антисывороток

2.1.1. Твердофазный синтез модельного соединения [A^(Ac),CO(NHMe)]Tyr-(5'P->0)Up-0-(CH2)6NH

2.1.2. Синтез модельного соединения [A^(Ac),CO(NIIMe)]Tyr-(5'P—>0)Up-0-(CH2)6NH2 в растворе

2.1.3. Обработка модельного соединения [N(Ac),CO(NHMe)]Tyr-(5'P—>0)Up-0-(CH2)6NH2 фосфодиэстеразой

2.1.4. Синтез антигена - конъюгата модельного соединения с лизоцимом

2.1.5. Синтез аналита - конъюгата модельного соединения с БСА

2.1.6. Иммунизация кроликов и получение антисывороток

2.2. Получение препаратов иммуноглобулинов к модельному соединению 37 2.2.1. Сульфат-аммонийное фракционирование антисывороток

2.2.2. Ионообменная хроматография на DEAE-Toyopearl 650М

2.2.3. Хроматография антител на протеин G сефарозе

2.2.4. Очистка препаратов иммуноглобулинов к модельному соединению от примесной РНКазной активности

2.2.4.1. Хроматография на протеин А сефарозе

2.2.4.2. Гель-фильтрация на сефадексе G

2.2.4.3. Гель-фильтрация антител па сефакриле S

2.2.4.4. Проверка препаратов антител на наличие примесной нуклеазной активности

2.3. Аффинная очистка антител к «узлу связи»

2.3.1. Синтез аффинного сорбента с poly(U)

2.3.1.1. Гидролиз poly(U) нуклеазой S

2.3.1.2. Окисление poly(U) перйодатом натрия

2.3.1.3. Синтез конъюгата BSA-poly(U) по Эрлангеру и Байзеру

2.3.1.4. Синтез ро1у(и)-БСА-сефарозы

2.3.2. Очистка антител на ро1у(и)-БСА-сефарозе

2.3.3. Синтез аффинного сорбента с модельным соединением [7V(Ac),C0(NHMe)]Tyr-(5'P^0)Up-0-(CH2)6NH

2.3.4. Очистка антител на сорбенте с модельным соединением [7V(Ac)3C0(NHMe)]Tyr-(5'P^0)Up-0-(CH2)6NH

2.4. Характеристика препаратов антител на разных стадиях очистки методом «иммупозолото»

2.4.1. Анализ узнавания РНК и белков препаратами антител методом иммунодота

2.4.2. Анализ взаимодействия препаратов антител с гидролизованными РНК методом иммунодота

2.4.3. Анализ узнавания РНК препаратами антител методом иммуноблота

2.5. Исследование пикорнавирусной инфекции в клетках HeLa с помощью препарата антител к «узлу связи»

2.5.1. Культивирование клеток HeLa в монослое

2.5.2. Заражение клеток HeLa вирусом обыкновенной простуды человека 2 для получения вирусного инокулята

2.5.3. Титрование препаратов вируса обыкновенной простуды человека

2.5.4. Подготовка предметных стекол с монослоем клеток HeLa

2.5.5. Одноцикловое заражение клеток HeLa HRV2 и фиксация клеток

2.5.6. Фиксация клеток метанолом

2.5.7. Фиксация клеток формальдегидом

2.5.8. Исследование пикорнавирусной инфекции в клетках HeLa методом иммунофлуоресцентной микроскопии

2.6. Получение ДНК-зондов для детекции пнкорнавируспых РНК in vitro и in

2.6.1. Характеристика плазмид

2.6.2. Синтез зондов ДНК-(диен)платина

2.6.3. Проверка системы детекции

2.6.3.1.Проверка узнавания антител к ДНК-(диен)платине вторичными антителами

2.6.3.2. Проверка специфичности антител к ДНК-зонду методом иммуноферментного анализа (ИФА)

2.6.3.3. Проверка специфичности антител к ДНК-зонду методом «иммунозолото»

2.6.4. Получение препаратов неинфицированных и инфицированных клеток Кребс II и HeLa

2.6.4.1. Культивирование клеток Кребс II и HeLa

2.6.4.2. Получение вирусных инокулятов

2.6.4.3. Одноцикловое заражение клеток асцитной карциномы Кребс II вирусом Менго

2.6.4.4. Одноцикловое заражение клеток HeLa вирусом обыкновенной простуды человека

2.6.5. Получение препаратов суммарной РНК неинфицированных и инфицированных клеток Кребс II и HeLa

2.6.5.1. Выделение суммарной РНК клеток Кребс II с помощью НТХА на микроколонках

2.6.5.2. Получение препарата суммарной РНК клеток Кребс II и HeLa фенольным методом

2.6.5.3. Выделение суммарной РНК клеток Кребс II и HeLa с помощью НТХА без микроколонок

2.6.5.4. Спектрофотометрическая и электрофоретическая характеристика препаратов суммарной РНК

2.6.6. Определение специфичности ДНК-зондов

2.6.6.1. Определение специфичности ДНК-зондов методами молекулярной гибридизации и иммуноферментного анализа (МГА-ИФА)

2.6.6.2. Определение специфичности ДНК-зондов методом МГА-иммунозолото

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Синтез гаптена, антигена и аналита

3.1.1. Синтез модельного соединения [Af(Ac),CO(TSfHMe)]Tyr-(5'P—>0)Up-0-(CH2)6NH

3.1.2. Синтез антигена - конъюгата модельного соединения с лизоцимом

3.1.3. Синтез аналита - конъюгата модельного соединения с БСА

3.2. Получение препаратов иммуноглобулинов к модельному соединению

3.2.1. Ионообменная хроматография на DEAE-Toyopearl 650М

3.2.2. Хроматография антител к «узлу связи» на протеин G сефарозе

3.2.3. Очистка препаратов иммуноглобулинов к модельному соединению от примесной РНКазной активности

3.2.3.2. Гель-фильтрация антител к «узлу связи» на сефакриле S

3.2.4. Аффинная очистка антител к «узлу связи» на сорбенте с poly(U)

3.2.5. Аффинная очистка антител на сорбенте с модельным соединением [7V(Ac),C0(NHMe)]Tyr-(5'P^0)Up-0-(CH2)6NH

3.3. Характеристика специфичности препаратов антител к «узловой» структуре

3.4. Исследование пнкорнавируспой инфекции в клетках с помощью очищенного препарата антител к «узловой» структуре

3.5. Получение ДНК-зондов для детекции пикорнавирусных РНК in vitro и in vivo.

3.5.1. Характеристика плазмид

3.5.2. Проверка системы детекции

3.5.3. Получение и характеристика препаратов суммарной РНК неинфицированных и инфицированных клеток Кребс II и HeLa

3.5.4. Определение специфичности ДНК-зондов

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5. ВЫВОДЫ 95 БЛАГОДАРНОСТИ 96 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

В работе использованы следующие сокращения:

БОЕ бляшкообразующая единица

БСА бычий сывороточный альбумин

ВСЛК (PLRV) вирус скручивания листьев картофеля (Potato leafroll virus)

ВТМ (TMV) вирус табачной мозаики (Tobacco mosaic virus)

ГА глутаровый диальдегид

ДМФА диметилформамид

ИФА иммуноферментный анализ кДНК комплементарная последовательность ДНК, получаемая путем обратной транскрипции последовательности РНК

НТО нетранслируемая область

НТХА нетоксичный хаотропный агент

ОРС (ORF) открытая рамка считывания (open reading frame)

ОТ-ПЦР полимеразная цепная реакция на основе реакции обратной транскрипции

ОФ ВЭЖХ обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

ПААГ полиакриламидный гель

ПЭГ-6000 полиэтиленгликоль М =

ТДВ тридистиллированная вода

УФ (UV) ультрафиолетовый свет

ФТС фетальная телячья сыворотка

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

ЭР эндоплазматический ретикулум сге цис-репликативный элемент (c/.v-replicativc element)

DEAE диэтиламиноэтил

DMEM среда Игла, модифицированная Дульбекко (Dulbecco's modified Eagle's medium)

EMCV вирус энцефаломиокардита (Encephalomyocarditis virus)

FCV кошачий калицивирус

HEPES динатриевая соль М-2-гидроксиэтилпиперазин->Г-2-этансульфоновой кислоты

HRV риновирус человека (Human Rhinovirus)

IRES участок внутренней посадки рибосом (internal ribosome entry site)

MEM минимальная среда (minimal essential medium)

MNV1 мышиный норовирус 1 (Murine Norovirus 1)

NS неструктурный вирусный белок

NTPase нуклеозидтрифосфатаза

РАВР ро1у(А)-связывающий белок (poly(A) binding protein)

PCBP ро1у(С)-связывающий белок (poly(C) binding protein) poly(A) полиадениловая кислота poly(C) полицитидиловая кислота poly(U) полиуридиловая кислота

PBS фосфатно-солевой буфер

PEMV вирус бугорчатой мозаики гороха (Pea enation mosaic virus)

SDS додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulfate)

20xSSC стандартный цитрат натрия (standard sodium citrate)

TBS солевой буфер с трис-(гидроксиметил)аминометаном (tris buffered saline)

ToRSV неповирус кольцевой пятнистости томата (Tomato ringspot nepovirus)

VPg вирусный белок, ковалентно связанный с геномом (Viral Protein genomelinked)

XBK (PYX) Х-вирус картофеля (Potato virus X)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антитела к "узлу" ковалентной связи между белком VPg и РНК пикорнавирусов"

В 70-е годы прошлого столетия экспериментально было доказано существование природных ковалентных комплексов вирусных нуклеиновых кислот и белков — нуклеопротеидов нового класса (Lee et al., 1976, 1977; Flanegan et al., 1977; Nomoto et al., 1977a; Ambros and Baltimore, 1978). Нуклеопротеиды, в которых белок связан с нуклеиновой кислотой ковалентной связью, были найдены у многих групп вирусов животных, растений и бактерий, а также в бактериальных и эукариотических клетках (Дрыгин, 1982; Salas and Vinuela, 1980; Wimmer, 1982; Vartapetian and Bogdanov, 1987; Riechmann et al., 1992; Drygin, 1998). Ковалентпые комплексы нуклеиновых кислот и белков стабильны и высоко специфичны, поскольку белок и нуклеиновая кислота в них связаны уникальной ковалентной связью.

Во всех известных природных ковалентных комплексах нуклеиновая кислота и белок соединены фосфодиэфирной связью. Структурное открытие нового класса нуклеопротеидов привело к другому открытию, уже функциональному, - был открыт новый механизм инициации репликации вирусных нуклеиновых кислот. Оказалось, что концевые белки или их предшественники, ковалентно связанные с вирусными нуклеиновыми кислотами, являются затравками (праймерами) для репликации вирусных геномов (Salas and Vinuela, 1980; Takegami et al., 1983a; Vartapetian et al., 1984; Riechmann et al., 1992; Paul et al., 1998; De Jong and van der Vliet, 1999).

Среди вирусных РНК-белковых ковалентных комплексов наиболее подробно в структурном и функциональном плане изучены комплексы РНК и 5'-концевого белка VPg пикорнавирусов (Вартапетян и др., 1979; Дрыгин и др., 1979; Lee et al., 1976, 1977; Flanegan et al., 1977; Nomoto et al., 1977a; Ambros and Baltimore, 1978; Vartapetian et al., 1980), калицивирусов (Schaffer et al., 1980; Machin et al., 2001), потивирусов (Murphy et al., 1991; Riechmann et al., 1992) и комовирусов (Drygin et al., 1987; Carette et al., 2001). У пикорнавирусов 3-й остаток тирозина белка ЗВ (VPg) связан с 5'-концевым остатком уридинфосфата вирусного генома. Идентичная структура «узла связи», Tyr-pUp, найдена у потивирусов и калицивирусов, хотя остаток тирозина находится в другом положении полипептида. У комовирусов реализуется фосфодиэфирная связь 5'-концевого остатка уридинфосфата РНК с остатком серина белка VPg (Ser-pUp).

Подобные ДНК-белковые ковалентные комплексы подробно изучены у аденовирусов (Lindenbaum et al., 1986) и бактериофагов <p29 (Salas and Vinuela, 1980; Blanco et al., 1992) и <pX174 (Eisenberg, 1980; Roth et al., 1984; Sanhueza and Eisenberg, 1984, 1985).

Показано, что концевые белки, связанные фосфодиэфирной связью с геномными РНК или ДНК вирусов, играют ключевую роль в инициации их репликации, поскольку либо сами эти белки, либо их, предшественники являются праймерами для синтеза вирусных нуклеиновых кислот (Salas and Vinuela, 1980; Takegami et al., 1983a,b; Vartapetian et al., 1984; Lindenbaum et al., 1986; Andino et al., 1993; Harris et al., 1994; Schaad et al., 1997; Carette et al., 2001). У бактериофагов с одноцепочечной ДНК (например, фХ174) в процессе репликации образуется промежуточный ковалентный комплекс между белком А и геномной ДНК (Eisenberg, 1980; Roth et al., 1984; Sanhueza and Eisenberg, 1984, 1985).

Интересно, что подобные по структуре «узла связи» промежуточные ковалентные комплексы образуют вирусные и клеточные ДНК-топоизомеразы I рода (Tse et al., 1980; Wang et al., 1996). ДНК-топоизомеразы I рода вносят одноцепочечные разрывы в молекулы ДНК, образуя фосфодиэфирную связь между остатком тирозина, входящего в состав активного центра фермента (Tse et al., 1980), и 5'- или З-'концевым нуклеотидом -как правило, с остатком тимидинфосфата.

Недавно in vitro были получены комплексы между РНК и бактериальной ДНК-топоизомеразой III (Wang et al., 1996). ДНК-топоизомеразы в комплексе с РНК были способны к реакции трансэтерификации, а значит, эти комплексы подобны промежуточным активным фосфодиэфирам, которые образуются через остатки тирозина ДНК-топоизомераз и нуклеотидным фосфатом - с большой вероятностью, с уридинфосфатом.

Таким образом, и ключевой структурой для разнообразных комплексов вирусной и клеточной природы является Tyr-pUp - фосфодиэфир остатка тирозина белка и уридин-(5', 3')-дифосфата. Логично предположить, что антитела на такую структуру могут быть полезным универсальным инструментом для поиска и последующего анализа таких комплексов, изучения механизма их образования и диссоциации, исследования и регуляции их функций.

Целью настоящей работы является разработка инструмента для поиска и изучения вирусных ковалентных комплексов PHK-VPg, содержащих «узел связи» Tyr-pUp, и структурно подобных им гипотетических клеточных комплексов. Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1. Получение и характеристика модельного соединения, гаптена, имитирующего «узловую» структуру между остатком тирозина белка VPg и 5'-концевым остатком уридиловой кислоты РНК пикорнавирусов.

2. Синтез антигена - конъюгата модельного соединения с лизоцимом и получение к нему антисыворотки.

3. Выделение и очистка антител к «узловой» структуре.

4. Анализ специфичности препарата антител на нитратцеллюлозной мембране методом «иммунозолото» in vitro.

5. Исследование пикорнавирусной инфекции в клетках с помощью очищенного препарата антител к «узловой» структуре in vivo.

Дополнительно поставленной задачей было разработка метода молекулярной детекции пикорнавирусных РНК и, как следствие, создание набора и разработка протокола для диагностики инфекций, вызываемых представителями родов Cardiovirus (вирусы энцефаломиокардита и Менго) и Rhinovirus (вирус обыкновенной простуды человека) семейства пикорнавирусов.

В нашей лаборатории для этой задачи были разработаны и с успехом использовались методы выделения суммарной РНК из клеток растений с помощью нетоксичного хаотропного агента, а для детекции РНК вирусов растений — метод молекулярной гибридизации вирусных РНК и ДНК-зондов, меченных хлордиэтилентриаминоплатиной хлористой. Интересно было адаптировать эти методы для выделения суммарной РНК из клеток животных, а также синтезировать ДНК-(диен)платиновые зонды для определения кардио- и риновирусных РНК в препаратах суммарных РНК клеток, подобрать условия гибридизации ДНК-зондов с вирусными РНК и проверить чувствительность детекции гетеродуплексов ДНК-зоидов и РНК иммунохимическими методами.

На защиту выносятся следующие научные положения, обладающие элементом новизны:

1. Разработан эффективный синтез модельного соединения (гаптена), содержащего «узловую структуру», в растворе, позволяющий получать миллиграммовые количества целевого вещества. Структура полученного соединения доказана методами обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ), УФ-спектрофотометрии и время-пролетной масс-спектрометрии (MALDI TOF).

2. Разработан синтез антигена и аналита, методы выделения поликлональных антител, специфически узнающих антиген и природный комплекс PHK-VPg пикорнавирусов. Показано, что антитела к «узловой» структуре связываются с местами локализации репликации пикорнавирусной РНК в инфицированных клетках.

3. Результаты работы могут быть использованы в научных исследованиях в молекулярной и клеточной биологии, вирусологии и иммунологии. Возможно применение антител к «узловой» структуре для изучения механизмов репликации вирусных РНК и для исследования известных и поиска гипотетических клеточных соединений, содержащих подобную «узловую» структуру.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Гаврюшина, Елена Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

1. Предложен простой и эффективный фосфорамидитный метод препаративного синтеза в растворе модельного соединения (гаптена), содержащего «узловую» структуру ковалентного комплекса РНК-VPg пикорнавирусов, а именно 5'-фосфодиэфирное производное уридиндифосфата и тирозина. Методами структурного анализа доказана идентичность полученного соединения целевому гаптену.

2. С помощью бифункционального агента получены конъюгаты гаптена с лизоцимом (антиген) и БСА (аналит). Состав антигена был определен время-пролетной масс-спектрометрией. На антиген были получены и очищены поликлональные антитела кролика, специфичность которых доказана in vitro иммунохимическим методом на нитратцеллюлозной мембране.

3. Антитела к модельному гаптену, имитирующему «узел» ковалентной связи между 5'-концом РНК и белком VPg пикорнавирусов, специфически узнают пикорнавирусные ковалентные комплексы РНК-VPg и места локализации репликации пикорнавирусной РНК в инфицированой клетке.

4. Получен инструмент — антитела к «узловой» структуре — для обнаружения и исследования структурно подобных природных ковалентных соединений белков и РНК вирусного и клеточного происхождения как in vitro, так и in vivo.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю благодарность моему научному руководителю Ю.Ф. Дрыгину за руководство и помощь в проведении работы, Т.М. Дмитриевой за практические советы и помощь в заражении клеток асцитной карциномы Кребс II вирусами энцефаломиокардита и Менго, Т.С. Зацепину за синтез модельного соединения и его анализ методом ОФ ВЭЖХ, В.Н. Ташлицкому за проведение ОФ ВЭЖХ гаптена при различных рН, И.Ю. Торопыгину за проведение масс-спектрометрии гаптена и антигена, Т.В. Выгодиной, М.А. Немых, Ю.А. Смирновой и Т.А. Семашко за помощь в проведении УФ-спектрофотометрии, профессору Д. Блаасу и Ангеле Марии Пикль-Херк за предоставление препарата вируса обыкновенной простуды человека 2, сотрудникам лаборатории биохимии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова (А.П. Гмылю, П.В. Лидскому, М.В. Бардиной, О.В. Микитась, М.А. Простовой) за помощь в культивировании клеток ITeLa В В и заражении их вирусом обыкновенной простуды человека 2, профессору Е.С. Надеждиной и С.А. Бряпцевой за проведение иммунофлуоресцентной микроскопии клеток HeLa В В, а также профессору В.И. Тишкову и С.В. Хороненковой, Д.Н. Ахаеву, профессору И.В. Яминскому и А.Д. Сушко, О.А. Кондаковой, С.Н. Чиркову, А.Н. Блинцову, П.А. Иванову, И.И. Кирееву, сотрудникам отдела хроматографии (Л.А. Баратовой, Н.В. Федоровой и А.В. Тимофеевой).

Данная работа была проведена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты БНТС № 06-04-90609 и ОФИ-ц № 08-04-13613) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (гос. контракт № 5635Р/8091).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гаврюшина, Елена Сергеевна, Москва

1. Вартапетян А. Б., Дрыгин Ю. Ф., Чумаков К. М. (1979). Фосфодиэфирная связь РНК вируса энцефаломиокардита с остатком тирозина белка VPg. Биоорганическая химия, 5, 1876-1878.

2. Гулевич А. Ю., Юсупова Р. А., Дрыгин Ю. Ф. (2001). Фосфодиэстераза из клеток асцитной карциномы Кребса II специфически гидролизует связь между ВПг и РНК вируса энцефаломиокардита. Биохимия, 66, 425-430.

3. Дрыгин Ю. Ф. (1982). Ковалентно связанные белки и нуклеиновые кислоты -новый класс природных соединений. Итоги науки и техники, серия Молекулярная биология, 11, 139-189.

4. Дрыгин Ю. Ф., Вартаиетян А. Б., Чумаков К. М. (1979). Ковалентное соединение РНК и белка в вирусе энцефаломиокардита. Молекулярная биология, 13, 777-787.

5. Иванова О. А., Веньяминова А. Г., Репкова М. Н., Дрыгин Ю. Ф. (2005). Синтез модельного фосфодиэфирного «узла связи» между белком и РНК-ВПг пикорнавирусов, получение и характеристика антител к модельному соединению. Биохимия, 70, 1258-1266.

6. Кондакова О. А., Дрыгин Ю. Ф. (1999). Диагностика вироидного заболевания картофеля зондами (диен)Р1-ДНК. Биотехнология, № 4, с. 83-90.

7. Чумаков К. М., Чичкова Н. В., Агол В. И. (1979). 5'-концевая последовательность РНК вируса энцефаломиокардита: локализация полиЦ-тракта и роль в трансляции. Доклады Академии наук СССР, 246, 994-996.

8. Шапот B.C. (1968). Нуклеазы. Издательство «Медицина». Москва. С. 13, 52, 56.

9. Agol V. I., Paul А. V., Wimmer Е. (1999). Paradoxes of the replication of picornaviral genomes. Virus Res., 62, 129-147.

10. Ambros V. and Baltimore D. (1978). Protein is linked to the 5' end of poliovirus RNA by a phosphodiester linkage to tyrosine. J. Biol. Chem., 253, 5263-5266.

11. Ambros V., Pettersson R. F., and Baltimore D. (1978). An enzymatic activity in uninfected cells that cleaves the linkage between poliovirion RNA and the 5' terminal protein. Cell, 15, 1439-1446.

12. Andino R., Rieckhof G. E., Achacoso P. L., Baltimore D. (1993). Poliovirus RNA synthesis utilizes an RNP complex formed around the 5'-end of viral RNA. EMBO J., 12, 3587-3598.

13. Barton D. J., O'Donnel B. J. and Paul A. V. (2001). 5' cloverleaf in poliovirus RNA is a cis-acting replication element required for negative-strand synthesis. EMBO J., 20, 1439-1448.

14. Bienz K., Egger D., Pfister Т., and Troxler M. (1992). Structural and functional characterization of the poliovirus replication complex. J. Virol., 66, 2740-2747.

15. Blanco L., Bemad A., Esteban J. A., and Salas M. (1992). DNA-independent deoxynucleotidylation of the ф29 terminal protein by the ф29 DNA polymerase. J. Biol. Chem., 267, 1225-1230.

16. Blanco L. and Salas M. (1996). Relating structure to function in ф29 DNA polymerase. J. Biol. Chem., 271, 8509-8512.

17. Bordunova O. A., Turina О. V., Nadezhdina E. S., Shatskaya G. S., Veiko V. P., and Drygin Yu. F. (1998). Antibodies against EMC virus RNA-VPg recognize Tyr-(5'P—>0)-pU and immunostain infected cells. FEBS Lett., 422, 57-60.

18. Burroughs J. N., and Brown F. (1978). Presence of a covalently linked protein on calicivirus RNA. J. Gen. Virol., 41, 443-446.

19. Caliguiri L. A., and Tamm I. (1970). The role of cytoplasmic membranes in poliovirus biosynthesis. Virology, 42, 100-111.

20. Calvert J. C., Nagy E., Soler M., and Dobos P. (1991). Characterization of the VPg-dsRNA linkage of infectious pancreatic necrosis virus. J. Gen. Virol., 72, 2563-2567.

21. Carette J. E., Giihl K., Wellink J., and van Kammen A. (2002a). Coalescence of the sites of cowpea mosaic virus RNA replication into a cytopathic structure. J. Virol., 76, 6235-6243.

22. Carette J. E., Kujawa A., Giihl K., Verver J., Wellink J., and van Kammen A. (2001). Mutational Analysis of the genome-linked protein of cowpea mosaic virus. Virology, 290,21-29.

23. Carette J. E., Verver J., Martens J., van Kampen Т., Wellink J., and van Kammen A. (2002b). Characterization of plant proteins that interact with cowpea mosaic virus '60K' protein in the yeast two-hybrid system. J. Gen. Virol., 83, 885-893.

24. Caruthers M. H., Barone A. D., Beaucage S. L., Dodds D. R., Fisher E. F., McBride L. J., Matteucci M., Stabinsky Z., and Tang J. Y. (1987). Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. Methods Enzymol., 154, 87313.

25. Claeboe C. D., Gao R., and Hecht S. M. (2003). 3'-modified oligonucleotides by reverse DNA synthesis. Nucleic Acids Res., 31, 5685-5691.

26. Daoust R. (1964). In vitro binding of nucleic acids to tissue sections after removal of tissue nucleic acids. J. Histochem. Cytochem., 12, 640-645.

27. Datta U., and Dasgupta A. (1994). Expression and subcelllar localization of poliovirus VPg precursor protein ЗАВ in eukaryotic cells: evidence for glycosylation in vitro. J. Virol., 68, 4468-4477.

28. De Jong R. N., and van der Vliet P. C. (1999). Mechanism of DNA replication in eucaryotic cells: cellular host factors stimulating adenovirus replication. Gene, 236, 1-12.

29. Drygin Yu. F. (1998). Natural covalent complexes of nucleic acids and proteins: some comments on practice and theory on the path from well-known complexes to new ones. Nucl. Acids Res., 26, 4791-4796.

30. Drygin Yu. F., Sapotsky M. V., and Bogdanov A. A. (1987). Radish mosaic virus VPg. Characteristics and linkage with virion RNAs. FEBS Letters, 215, 247-251.

31. Duechler M., Skern Т., Blaas D., Berger В., Sommergruber W., and КиесЫег E. (1989). Human rhinovirus serotype 2: in vitro synthesis of an infectious RNA. Virology, 168, 159-161.

32. Duke G. M., and Palmenberg A. C. (1989). Cloning and synthesis of infectious cardiovirus RNAs containing short, discrete poly(C) tracts. J. Virol., 63, 1822-1826.

33. Duncan R., Nagy E., Krell P. J., and Dobos P. (1987). Synthesis of the infectious pancreatic necrosis virus polyprotein, detection of virus encoded protease, and fine structure mapping of genome segment A coding regions. J. Virol., 61, 3655-3664.

34. Dunoyer P., Thomas C., Harrison S., Revers F., Maule A. (2004). A cysteine-rich plant protein potentiates Potyvirus movement through an interaction with the virus genome-linked protein VPg. J. Virol., 78, 2301-2309.

35. Eisenberg S. (1980). Cleavage of cpX174 single-stranded DNA by gene A protein and formation of a tight protein-DNA complex. J. Virol., 35, 409-413.

36. Erlanger, B. F., and Beiser, S. M. (1964). Antibodies specific for ribonucleosides and ribonucleotides and their reaction with DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 52, 68-74.

37. Fraenkel-Conrat H., and Steinschneider A. (1968). Stepwise degradation of RNA: periodate followed by aniline cleavage. In: Methods in Enzymology, Vol. XII, part B. Academic Press, New York and London. Eds. L. Grossman and K. Moldave. P. 243-246.

38. Ghosh A., Dasgupta R., Salerno-Rife Т., Rutgers Т., and Kaesberg P. (1979). Southern bean mosaic viral RNA has a 5'-linked protein but lacks 3' terminal poly(A). Nucl. Acids Res., 7, 2137-2146.

39. Goodfellow I. G., Chaundry Y., Richardson A., Meredith J. M., Almond J. W., Barclay W. S., and Evans D. J. (2000). Identification of a c/s-acting replicating element (CRE) within the poliovirus coding region. J. Virol., 74, 4590-4600.

40. Goodfellow I. G., Kerrigan D., and Evans D. J. (2003). Structure and function of the poliovirus c/.v-acting replication element (CRE). RNA, 9, 124-137.

41. Harlow E., and Lane D. (1988). Antibodies. Cold Spring Harbor Laboratory. P. 298299, 301-305.

42. Herbert T. P., Brierley I., and Brown T. D. K. (1997). Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation. J.Gen. Virol., 78, 1033-1040.

43. Jagadish M. N., Staton V. J., Hudson P. J., and Azad A. A. (1988). Birnavirus precursor polyprotein is processed in Escherichia coli by its own virus encoded polypeptide. J. Virol., 62, 1084-1087.

44. Kriek N. M. A. J., Meeuwenoord N. J., van den Elst H., Heus H. A., van der Marel G. A., and Filippov D. V. (2006). Chemical synthesis of picornaviral protein primers of RNA replication. Org. Biomol. Chem., 4, 3576-86.

45. Kusov Y. Y., and Gauss-Muller V. (1997). In vitro RNA binding of the hepatitis A virus proteinase 3C (HAV 3Cpr0) to secondary structure elements within the 5' terminus of the HAV genome. RNA, 3, 291-302.

46. Lee Y. F., Nomoto A., and Wimmer E. (1976). The genome of poliovirus is an exceptional eukaryotic mRNA. Progr. Nucleic Acid Res. Mol.Biol., 19, 89-96.

47. Lee Y. F., Nomoto A., Detjen B. W., and Wimmer E. (1977). The genome-linked protein of picornaviruses. I. A protein covalently linked to poliovirus genome RNA. Proc Natl. Acad. Sci. USA, 74, 59-63.

48. Leonard S., Plante D., Wittmann S., Daigneault N., Fortin M. G., and Laliberte J. F. (2000). Complex formation between potyvirus VPg and translation eukaryotic initiation factor 4E correlates with virus infectivity. J. Virol., 74, 7730-7737.

49. Lindenbaum J. O., Field J., and Hurwitz J. (1986). The adenovirus DNA binding protein and adenovirus DNA polymerase interact to catalyse elongation of primed DNA templates. J. Biol. Chem., 261, 10218-10227.

50. Liu J., Wei Т., and Kwang J. (2004). Membrane-association properties of avian encephalomyelitis virus protein ЗА. Virology, 321, 297-306.

51. Machfn A., Alonso J. M. M., and Parra F. (2001). Identification of the amino acid residue involved in rabbit hemorragic disease virus VPg uridylylation. J. Biol. Chem., 276,27787-27792.

52. Mayo M. A., Barker II., Robinson D. J., Tamada Т., and Harrison B. D. (1982). Evidence that potato leafroll virus RNA is positive-stranded, is linked to a small protein and does not contain polyadenylate. J. Gen. Virol., 59, 163-167.

53. Mayo M. A., Robinson D. J., Jolly C. A., and Hyman L. (1989). Nucleotide sequence of potato leafroll luteovirus RNA. J. Gen. Virol., 70, 1037-1051.

54. Mirzayan C., and Wimmer E. (1994). Biochemical studies on poliovirus polypeptide 2C: Evidence for ATPase activity. Virology, 189, 547-555.

55. Mitra Т., Sosnovtsev S. V., and Green K. Y. (2004). Mutagenesis of tyrosine 24 in the VPg protein is lethal for feline calicivirus. J. Virol., 78, 4931-4935.

56. Morasco B. J., Sharma N., Parilla J., and Flanegan J. B. (2003). Poliovirus cre{2C)-dependent synthesis of VpgpUpU is required for positive- but not negative-strand RNA synthesis. J. Virol., 77, 5136-5144.

57. Nomoto A., Detien В., Pozzati R., and Wimmer E. (1977a). The location of polio genome protein in viral RNAs and its implication for RNA synthesis. Nature, 268, 208-213.

58. Nomoto A., Kitamura N., Golini F., and Wimmer E. (1977b). The 5' terminal structures of poliovirion RNA and poliovirus mRNA differ only in the genome-linked protein VPg. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5345-5349.

59. Paul A. V., Molla A., and Wimmer E. (1994). Studies of a putative amphipathic helix in the N-terminus of poliovirus 2C. Virology, 199, 188-199.

60. Paul A. V., Peters J., Mugavero J., Yin J., van Boom J. H., and Wimmer E. (2003a). Biochemical and genetic studies of the VPg uridylylation reaction catalyzed by the RNA polymerase of poliovirus. J. Virol., 77, 891-904.

61. Paul A. V., Rieder E., Kim D. W., van Boom J. H., and Wimmer E. (2000). Identification of an RNA hairpin in poliovirus RNA that serves as the primary template in the in vitro uridylylation of VPg. J. Virol., 74, 10359-10370.

62. Paul A. V., van Boom J. H., Filippov D., and Wimmer E. (1998). Protein-primed RNA synthesis by purified poliovirus RNA polymerase. Nature, 393, 280-284.

63. Paul A. V., Yin J., Mugavero J., Rieder E., Liu Y., Wimmer E. (2003b). A "slide-back" mechanism for the initiation of protein-primed RNA synthesis by the RNA polymerase of poliovirus. J. Biol. Chem., 278, 43951-43960.

64. Pelletier J., and Sonenberg N. (1989). Internal dinding of eukaryotic ribosomes on poliovirus RNA: translation in HeLa cell extracts. J. Virol, 63, 441-444.

65. Persson R. H., and Macdonald R. D. (1982). Evidence that infectious pancreatic necrosis virus has a genome-linked protein. J. Virol., 44, 437-443.

66. Pettersson R. F., Ambros V., and Baltimore D. (1978). Identificztion of a protein linked to nascent poliovirus RNA and to the polyuridylic acid of negative-strand RNA. J. Virol., 27, 357-365.

67. Pettersson R. F., Flanegan J. В., Rose J. K., and Baltimore D. (1977). 5'-terminal nucleotide sequences of poliovirus polyribosomal RNA and virion RNA are identical. Nature, 268, 270-272.

68. Porter A. G. (1993). Picornavirus nonstructural proteins: emerging roles in virus replication and inhibition of host cell functions. J. Virol., 67, 6917-6921.

69. Puustinen P., and Makinen K. (2004). Uridylylation of the potyvirus VPg by viral replicase Nib correlates with the nucleotide binding capacity of VPg. J. Biol. Chem., 279,38103-38110.

70. Riechmann J. L., Lain S., and Garcia J. A. (1992). Highlights and prospects of potyvirus molecular biology. J. Gen. Virol., 73, 1-16.

71. Roth M. J., Brown D. R., and Hurwitz J. (1984). Analysis of bacteriophage (pX174 gene A protein-mediated termination and reinitiation of (pX DNA synthesis. J. Biol. Chem., 259, 10556-10568.

72. Sadowy E., Maasen A., Juszczuk M., David C., Zagorski-Ostoja W., Gronenborn В., and Hulanicka M. D. (2001). The ORFO product of Potato leafroll virus is indispensable for virus accumulation. J. Gen. Virol., 82, 1529-1532.

73. Salas M., and Vinuela E. (1980). Proteins covalently linked to viral nucleic acids. TIBS, 191-193.

74. Sanhueza S., and Eisenberg S. (1984). Cleavage of single-stranded DNA by the (pX174 A* protein: The A*-single-stranded DNA covalent linkage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,4285-4289.

75. Sanhueza S., and Eisenberg S. (1985). Bacteriophage (pX174 A protein cleaves single-stranded DNA and binds to it covalently through a tyrosyl-dAMP phosphodiester bond. J. Virol., 53, 695-697.

76. Schaad M. С., Jensen P. E., and Carrington J. C. (1997). Formation of plant RNA virus replication complexes on membranes: role of an endoplasmic reticulum-targeted viral protein. EMBO J., 16, 4049-4059.

77. Semler B. L., Anderson C. W., Hanecak R., Dorner L. F., and Wimmer E. (1982). A membrane-associated precursor to poliovirus VPg identified by immunoprecipitation with antibodies directed against a synthetic heptapeptide. Cell, 28, 405-412.

78. Takeda N., Kuhn R. J., Yang C. F., Takegami Т., and Wimmer E. (1986). Initiation of poliovirus plus-strand RNA synthesis in a membrane complex of infected HeLa В cells. J. Virol., 60, 43-53.

79. Takegami Т., Kuhn R. J., Anderson C. W., and Wimmer E. (1983a). Membrane-dependent uridylylation of the genome-linked protein VPg of poliovirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7447-7451.

80. Takegami Т., Semler B. L., Anderson C. W., and Wimmer E. (1983b). Membrane fractions active in poliovirus RNA replication contain VPg precursor polypeptides. Virology, 128, 33-47.

81. Teterina N. L., Egger D., Bienz K., Brown D. M., Semler B. L., and Ehrenfeld E. (2001). Requirements for assembly of poliovirus replication complexes and negative-strand RNA synthesis. J. Virol., 75, 3841-3850.

82. Towner J. S., Но Т. V., and Semler B. L. (1996). Determinants of membrane association for poliovirus protein ЗАВ. J. Biol. Chem., 271, 26810-26818.

83. Tse Y.-C., Kirkegaard K., and Wang, J. C. (1980). Covalent bonds between protein and DNA. Formation of phosphotyrosine linkage between certain DNA topoisomerases and DNA. J. Biol. Chem., 255, 5560-5565.

84. Vartapetian А. В., and Bogdanov A. A. (1987). Proteins covalently linked to viral genomes. Prog. Nucleic Aeid Res. Mol. Biol., 34, 209-251.

85. Vartapetian, А. В., Drygin, Yu. F., Chumakov, К. M., and Bogdanov, A. A. (1980). The structure of the covalent linkage between proteins and RNA in encephalomyoearditis virus. Nucl. Aeids Res., 8, 3729-3742.

86. Vartapetian А. В., Koonin E. V., Agol V. I., and Bogdanov A. A. (1984). Encephalomiocarditis virus RNA synthesis in vitro is protein-primed. EMBO J., 3, 2593-2598.

87. Wang A., Han S., and Sanfa?on H. (2004). Topogenesis of the NTB-VPg protein of Tomato ringspot nepovirus: definition of the C-terminal trensmembrane domain. J. Gen. Virol., 85, 535-545.

88. Wang H., Di Gate R. J., and Seeman N. C. (1996). An RNA topoisomerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9477 9482.

89. Wimmer E. (1982). Genome-linked proteins of viruses. Cell, 28, 199-201.

90. Wobus С. E., Skaf J. S., Schultz M. H., and de Zoeten G. A. (1998). Sequencing, genomic localization and initial characterization of the VPg of pea enation mosaic enamovirus. J. Gen. Virol., 79, 2023-2025.

91. Yambao M. L. M., Masuta C., Nakahara K., and Uyeda I. (2003). The central and C-terminal domains of VPg of clover yellow vein virus are important for VPg-HCPro and VPg-VPg interactions. J. Gen. Virol., 84, 2861-2869.