Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антикомплементарная активность бактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антикомплементарная активность бактерий"

Министерство здравоохранения Н>

Челябинский государствен?шй медищшскмй инстигут

На правах рукописи

БРУДАСТОВ Юрий Авенирович

УМ: 576. 809. 7+616-078. 7

МТШШ1ШЕ1ЖНТАР1Ш АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ

03. 00. О?- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени ¡сацщщата оддацннских наук

ЧЕЛЯБИНСК -

Работа выполнена на каФедое микробиологии Оренбургского государственного медицинского института

Научный ржоЕодитель: Член-корр. ЛЕН РФ, доктор

цинскик наук, профессор О, Е Бухарин. 0&-1шальше оппонента: доктор медивднскнк нал<,

профессор й. И. Долгушин. Д01СЮР йедишнския наук, профессор 3. Н. Кондоапхжа. Бедушее учрезтете: Институт экологии и генетики микроорганизмов УгХЗ РАН'

Зашита состоится "___"_______________1992 года

в_____-часов на заседании аюдиализировашюго совета

К. ОМ. ОЧ-. 03 при Челябкнскон государственном медицинском лпс^гсуте по адресу: 454092, Челябинск-92', ул. Боровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челя-бшского государственного кедшинского института. Автореферат разослан "_____"_____________1992 года.

Ученый секретарь атешашзщхэвашого совета кандшат.медшдинских наук

Е и, Жигалова

. . «

" " ! ОБ"?/,Я XÄPÄKTEPKCTISKA РДБОТП

/лсгуагьггость проблемы. Исследования последних лет убедительно свидетельствуют о том, что факторы, инактивирующие механизмы естественной резистентности мзкроорганизма, обеспечивают патогенам возможность длительного персистирования в организме хозяина. Примерен реализации такого механизма персис-теншш может сдунить антилизоцииная активность бактерий, разработка и внедрение методов регистрации которой позволили существенно повысить качество решения диагностических и прогностических задач инфекционной клиники (Бухарин 0. Е , 1990). К настоящему времени описаны и другие > факторы персистенции Саистэрий - антиинтерфероновая (Соколов Sß., 1990) и антиим-. куиоглобулиновая (Чернохвостова Е. В., 1987) активности микроорганизмов, деградирующие соответствующие механизмы защити хозяина. К сожалению, открытие остается вопрос о наличии аналогичного свойства бактерий в отношении ключевого фактора не-специфчческой резистентности - системы комплемента,тем более, что последняя задействована в сашх различных гуморальных и клеточных реакциях макроорганизма, направленных на поддержа-■ние его гомеостаза (Куэник Б. И. и соазт., 1989; Etrvajigr T. G. & AD. Bôfus, 1982).

С другой стороны, почти столетняя история изучения взаимодействия системы комплемента и бактерий свидетельствует об их чрезвычайном разнообразии (Taylor P.W.., 1983; Joiner К. А. , 1988). Механизмы, обеспечивающие низкоэффективную активацию и функционирование комплемента при прямом взаимодействии последнего с бактериями, занимают в этих исследованиях центральное место (Joiner К. А. ,1988) и изучаются лишь с точки зрения комплементрезистентности бактерий. Этот интегральный показатель устойчивости к комплементопосредованному киллингу и лизису играет, по мнению ряда ученых, роль фактора вирулентности грамнегативных возбудителей (Taylor P. V. , 1988; Joiner К. А., 1988; Kubens В. S. et al., 1989). Такой подход способствует расшифровке особенностей патогенеза инфекционных процессов, сопровождающихся бактериемией. Однако ситуация остается куда менее ясной в отношении целого ряда других инфекций, при

которых роль комплемента как ключевого киллера бактерий не столь очевиднч (инфекции с, гранулематозныы ответом тканей, при которых концентрации внеклеточно циркулирующих медиаторов -весьма низки), и где определенное место в развитии инфекционного процесса отводится лейкоцитарной система комплемента (5игк)зто 1982; 1983). Ке исключено, что воздействовать

на функционирование этой системы "выгоднее" и эффективнее ди-. стантно, выбрасывая во внеклеточное пространство продукты, влияющие на ее активацию. Вопроси хе дистантной инактивации комплемента остаются на сегодняшний,день недостаточно изученными, что послужило основой для разработки нового интегрального показателя - антикомплементаряой активности бактерий и оценки его биологической ролл в инфекционной патологии.

Цель кеелйдавшшя. Изучение способности бактерий иншстк-вировать комплемент и оценка биологической рож этого признака.

Задачи исследования: ' .

1. Разработать методические подходы к определению анти-комплеыентарной активности бактерий.

2. Дать характеристику различных видов бактерий по анти-коиплементарному признаку.

3. Определить биологическую роль антикошлементарной активности бактерий в инфекционной патологии.

Иаучзал каштана. разработаны методы регистрации антиком-• плементарной активности бактерий на основе принципа отсроченного антагонизма с подбором высокочувствительного к комплементу штамма, а тага© на основе адаптации к потребностям определения антикомплементарной активности комплемент^ависимого иммунного гемолиза. Материалы по разработке бактериологического метода определения антикомплементарной активности положены в основу заявленного "Способа определения антикомпле<«эн-. тарной активности бактерий", на который получено положительное решение ЫИИГГО пб заявке N 4903111/13(012616) от 15,11. • 1901 г.

Представлена характеристика изученных штаммов бактерий по антикомплементарному признаку: определены частоты встречаемости и средние уровни признака у штаммов различных групп, отличающихся как по видовой принадлежности, так и по источнику выделения. Во всех случаях показана связь изучаемого свойства с источником выделения штаммов, а выраженные отличия в распространенности и уровнях признака у золотистых и эпидер-мальных стафилококков при применении бактериологического метода индикации активности позволили рекомендовать последний в качестве теста для дифференциации названных видов стафилококков.

На модели экспериментальной инфекции, а также в клинико-бактериологическом исследовании проанализирована Оиологичес-. кая роль антикомплементарной активности бактерий и сделан вывод о ее персистентиой значимости. В частности, показано, что: а) в системе "стафилококки - макроорганизм" происходит прей мущественнсе накопление бактерий, обладающих более высокой активностью; б) более высокий уровень антикомплементарного признака кишечных палочек - возбудителей холецистита и хронического'пиелонефрита - способствует пролонгированию инфекционного процесса и выживаемости бактерий в очаге, что выражалось меньшим падением за период лечения степени бактериурш и большей вероятностью послеоперационных осложнений при различных формах холецистита.

Практическая ценность. Полученные данные расширяют теоретические представления о биологических свойствах патогенных и условно-патогенных бактерий, приближая к пониманию патогенеза инфекционных заболеваний. Эти материалы используются в процессе преподавания раздела "Инфекция и иммунитет" курса медицинской микробиологии в ОГМИ.

Практическое значение исследований определяется применением разработанных способов определения антикомплементарной активности бактерий в качестве, дополнительного теста для дифференциации стафилококков и для расшифровки персистентного потэнциаяа бактерий в клинико-лабораторных и экологических исследованиях.

Полученные фактические материалы использованы также в разработке "Микробиологический мониторинг подземных вод Оренбургского региона", представленной на тематической выставке "Экологическая обстановка в ряде регионов России" (1991 г.), . удостоенной серебряной медали ВДНХ СССР.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на итоговой конференции молодых ученых ОГШ (1992 г.), на заседании областного лабораторного совета (г.Оренбург,. 1992г.). . Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедры микробиологии ОГШ, Оренбургского отделения Всероссийского научного общества эпидемиологов и микробиологов и на заседании проблемной комиссии института "Микробная экология человека в ' норме и при патологии" (г.Оренбург, 1992 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи, получено положительное решение по заявке на изобретение, оформлен пристендовый листок ВДНХ СССР.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из » введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, вьлодов и указателя литературы, включающего Й6 отечественных и 10"? зарубежных источника.

Текст диссертации изложен на 145 страницах маашнокиси и иллюстрирован 11 таблицами и 22 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Катеркалвы н методы исследования. Работа выполнена на 326 штаммах грамотрицательных бактерий, главным образом кишечных палочек,и на 577 .штаммах золотистых и эпидермальных ста-, филококков, выделенных из объектов окружающей среды, от бактерионосителей и от больных людей.. Использовались общепринятые методы идентификации бактерий и изучения некоторых их биологических характеристик, в том числе продукции протеина А золотистыми стафилококками (Фоменко Г.А., 1980; БдошзЪ Н., БЬа^Щчеш а , 1969), комплементрезистентности кишечных пало-

- Б -

чек (Бухарин О. а, Созыкин R JL , 1979), антилизоцимной активности бактерий (Бухарин 0.R и соавт., 1984), протеолитичес-кой и гемолитической активности бактерий, а также классические методы определения активности комплемента в гемолитической системе (Кзбот Б., Мейер М., 1968; Joiner К. А. et al. , 1983).

Изучение биологической роли антикомплементарной активности бактерий на модели экспериментальной инфекции проводили при интраорбитальном заражении мышей линии СБА отобранным штаммом золотистого стафилококка с последующим контролем признака у клонов, высеваемых из почечной ткани животных, в которой выявляется преимущественное накопление стафилококков (Анатолий С. А., Антоновская М.И., 1966).

Статистическая обработка результатов проводилась общепринятыми методиками с использованием критерия Стьюдента,корреляционного, дисперсионного и регрессионного анализов (Лакин Г.Ф., 1990).

Разработка методов определения антикомиюшнтаркой активности бактерий. Для определения антикомплементарной активности бактерий: были разработаны методические подходы, основанные на принципе отсроченного антагонизма и применении ком-плементзависимого иммунного гемолиза.

В первом 'случае исследования по выбору индикаторной культуры, позволяющей тестировать наличие или отсутствие в среде комплемента, привели к обнаружению тта\ма кишечной палочки, проявляющего высокую чувствительность к комплементарному кил-лингу. Этот штамм, производный от Е. coli К12, характеризуется типичными видовыми свойствами, находится в R-форме и депонирован в музее живых бактериальных культур РИСК им. JLA. Та-расевича под регистрационным номером 212. Бактериологическое определение антикомплементарной активности бактерий, основанное на применении штамма N212 в качестве индикаторной культуры на комплемент. заключалось в выращивании исследуемых бактерий на слое питательного агара, последующей их инактивации в парах хлороформа, наслаивании второго слоя агара, содержащего сыворотку - источник комплемента, инкубации для диффузии

и реализации продуктами жизнедеятельности испытуемых бактерий антикомплементарных свойств, наслаивании третьего слоя агара, содержащего взвесь индикаторных бактерий штамма N212 и инкубации для выявления антикомплементарной активности, которая, учитывалась по наличию зон роста индикаторной культуры вокруг колоний исследуемых штаммов, где произошла инактивация комплемента.

Разработанный метод определения антикомплементарной активности позволяет, таким образом, тестировать инактивацию комплемента по убыванию комплементзависимого киллинга в отношении чувствительного штамма N212. Проведенные в последующем эксперименты по изучению' взаимозависимостей различных путей активации системы комплемента и бактерицидностыо в отношении йтамма N212 показали, что термолабильная бактери^идность сывороток (всего 67 сывороток) наилучшим образом коррелировала • с активностью в классическом пути активации (р -0.78) и в меньшей степени с активностью в альтернативном пути (р-0.57). Подобные результаты позволяют предположить, что киллинг кишечных палочек индикаторного штамма осуществляется с преимущественным участием классической активации комплемента. Однако предложенный методический подход не позволяет повысить информативность определения, уточняя, например, мишени и кинетику антикомплементарного действия,количественную его сторону, локализацию антикомплемеятарного фактора. Эта информации могла бы быть собрана только при применении общепринятых в настоящее время в иммунологии методов количественного тестирования комплемента, что послужило причиной разработки альтернативного методического подхода к определению антикомплементарной активности бактерий, сснованного на комплементзависимом иммунном гемолизе.

Гемолитический метод определения интересующего нас свойства основан на тестировании- уоывания активности комплемента под влиянием продуктов жизнедеятельности бактерий при использовании разработанной нами методики парциального гемолиза в агаровом геле. Основой методики является комплементчувствительный слой агара, содержащий сенсибилизированные эритроциты барана в концентрации 0.25 млрд. /мл и приготовленный на стан-

дартном веронал-мединаловом буфере (Кэбот Е., Мейер М. ,1968) с концентрацией ионов Са++ и -0.01М. Использовался агар "ВасЬо", Регак, с конечной концентрацией в слое - IX.

На поверхность предварительно охлажденной до 4'С агари-зованной суспензии эритроцитов по шаблону наносили стандартные капли супернатантов суточных бульонных культур исследуемых штаммов бактерий объемом 10 мкл. Пластины с агаром инкубировали на холоду до полного впитывания супернатантов, и затем в те.же точки по тому же шаблону наносили по 10 мкл сыворотки - источника комплемента. Далее пластины инкубировали при 4'С в течение 16-24 часов для диффузии и реализации антикомплементарных свойств бактериальными продуктами. Проявление зон гемолиза осуществляли при 37'С в течение 60 минут и останавливали погружением пластин в холодный (8-10'С) буферный раствор. Измерение поглощения света в зонах гемолиза производили при длинах волн 600-640нм (денситометр ДМ-1,светофильтр N4). При этом ряды зон гемолиза выравнивались параллельно направлению движения предметного столика прибора, установка темнового тока осуществлялась согласно инструкции к прибору, установку конца щкглы (100%. пропускания) производила! по зоне гемолиза, полученной нанесением на агар с эритроцитами сапонина, вызывающего 100%-ный гемолиз в месте нанесения.

Денситограмма представляет собой кривую, состоящую из чередующихся участков, .соответствующих поглощению негемолизи-рованного комплементчувствительного слоя (фоновый уровень) и уровням поглощения отдельных зон гемолиза (см. рисунок 1). Вычисление функционально активного комплемента в соответствующей зоне гемолиза производили следующим образом. Измеряли на денситограмме падение поглощения для соответствующей зоны гемолиза (в мм), относили полученную величину к величине падения поглощения в зоне гемолиза со 100Х-ным лизисом эритроцитов и получали таким образом степень падения поглощения в каждой зоне гемолиза Затем по уравнению У-0.27*1пХ+1.02, полученному в предварительных экспериментах с различными концентрациями эритроцитов, где X - полученная величина степени падения поглощения в зоне гемолиза, а У - степень гемолиза в последней, и известному уравнению Крога (Кзбот Е. , Мейер М.,

Рисунок 1. Денс1ггогргшма в методе парциального гемолиза в гелю для определении аюжошлеиет'ар-но# акткшюстк бактерий.

Схематическое изображение пластины с зонами гемолиза

Денситометр ДМ-1

Схема денситограммы

---"7

н

гА

И

3

I

Х2

ХЗ

Х4

т

Условные обозначения. Цифрами (1-4) обозначены зоны гемолиза п соответствующие им участки денситограммы. XI-Х4 - величины пропускания для соответствующих зон гемолиза. Отношения Х2.ХЗ.Х4 к XI равны степеням падения поглощения в зонах гемолиза.

1958) с коэффициентом 1/п=0. 27 (соответствует используемой концентрации эритроцитов) производили перерасчет оптического параметра в величину активности комплемента, выраженную в гемолитических единицах (СН50). За величину антикомплегентарной активности принимали разность меящу активностью в контрольных зонах гемолиза, где вместо супернатанта применяли питательный бульон, и активностью в соответствующих штаммам опытных зонах гемолиза, разность, перерасчитанную умножением на 100 на 1 мл супернатанта. Таким образом, за 1 единицу антикомплементарной активности (1 анти-СН50, далее просто 1 ед.) принимали такую активность супернатанта суточной бульонной культуры бактерий исследуемого штамма, которая при контакте 1 мл супернатанта с 1 мл сыворотки обеспечивала инактивацию 1 гемолитической единицы комплемента.

В процессе разработки методики выяснилось также, что в предлагаемых режимах взаимодействия комплемента с продуктами .тазнедеятельиости бактерий гемолизины последних не влияли на результат. Крокэ того, наблюдалась сильная положительная тор-реляционная связь (г=0. 94; р<0. 01) между антикомплементарно-стьга одних и тех гв супернатантов в отношении человеческого коютлемента и комплемента морской свинки, что послужило основанием для применения в дальнейших экспериментах лиофилиаиро-ванной сыворотки морской свинки (препарат для РСК). Ошибка определения антикомплементарной активности не превышала 10% уровня. Вычисления автоматизировались с помощью микро-ЭВМ типа Щ-52 И Ж-85.

■ Сравнительный анализ гредложвнных методов определения антикомплементарной активности бактерий, проведенный на двух независимых выборках штаммов золотистых стафилококков (п-112) показал высокую степень корреляции мезду результатами, полученными этими методами (р -0.70). Это дало основание считать, что данные методики описывают один и тот же биологический феномен. При этом техническое осуществление бактериологического метода проще, требует меньшей тщательности и не нуждается в дополнительном оборудовании. Однако по таким позициям, как информативность, возможность количественного учета результата, а также чувствительность, бактериологический метод язно

- ю -

уступает методу парциального гемолиза в геле. Тем не менее меньшая чувствительность бактериологического метода определения изучаемого признака обусловила то, что при его использовании были выявлены существенные отличия в распространенности признака у золотистых и эпидермальных стафилококков (89.4 +3. ?Х и 2.9+2.0%соответственно). Это позволило рекомендовать бактериологический метод индикации антикомплементарной ■ активности в качестве дополнительного теста, дифференцируюцэ-• го указанные виды стафилококков. Метод парциального гемолиза в геле как более информативный и чувствительный стал методом выбора для дальнейших исследований, результаты которых приведены ниже.

Таким образом, разработаны методы, пригодные для определения антикомплементарчой активности бактерий. Это дало возможность расширить представления о вариантах взаимодействия типа "комплемент-бактерия", для оценки которого в настоящее время используется пока лишь один интегральный показатель -комплементрезиетентность (Joiner К. А., 1988; Kubens В. S. et al., 1989). С другой стороны предлагаемые методические подходы яглягася логическим продолжением работы по изучению бактериальных факторов, инактивирующих механизмы естественной резистентности макроорганизма, и наряду с методами определения антилизоцимной активности бактерий (Бухарин 0. Е и соавт., 19С4) и оценки способности бактерий инактивировать бактерицидную составляющую препаратов человеческого лейкоцитарного интерферона (Бухарин O.E.,- Соколов В.Ю., А. с. N1564191) могли бы составить комплекс исследований по выявлению персистентных свойств бактерий.

Характеристика бактерий по ашяикомллешкгарному признаку. Изучение широты распространения антикомплементарной активности бактерий и её уровней проводилось на выборках, состоящих из 295 штаммов золотистых и эпидермальных стафилококков, 219 штаммов кишечной палочки, 48 штаммов клебсиелл пневмонии, а также на 26 штаммах других видов. Группа золотистых стафилококков включала 36 штаммов, выделенных из воздуха, 99 штаммов, выделенных от бактерионосителей, и 20 штаммов, выделен-

Таблица 1

Распростратшгость и уровни анткксидиемелтарной активности бактерий

I . ! Источники выделения бактерий

I Вид бактерий I-------------------------------------

I (п) ' внешняя среда I бактерио- ! больные

1 ! (музей) 1 носители 1

Staphylococcus

aureus

(n-155)

Staphylococcus

epidermidis

(n-140)

Escherichia

coll

(n-219)

Klebsiella pneumoniae (n=48)

55. 6+2. 8

2. 8+0. 9

83. 8+0. 7 SO. 0+3. 0

7. 2+0. 9

36. 8+1. 4 63. 9+1. 3 1.8+0.6 3.7+0.8

50. 9+0. 9 2. 4+0. 5 83.3+6.2 a 4.4+1.7 a

П

a

6. 5+2. 0

a

83. 5+0. 7 8. 9+1.2 100.0 8.3+1.3

Условные обозначения: В числителе - 7. распространенности признака. В знаменателе - средний уровень признака (в ед.). а - музейные штаммы клебсиелл. 3 - значения не определялись.

ных от больных с ранеЕой инфекцией. Группа эпидермальных стафилококков состояла из 68 штаммов, выделенных из воздуха, и 72 штаммов, выделенных от бактерионосителей. Кишечные палочки были представлены 110 штаммами, выделенными из различных проб воды хозяйственного и питьевого назначения, и 109 штаммами, выделенными от больных хроническим пиелонефритом и различными формами холецистита. Среди штаммов клебсиелд 36 штата,¡ов были выделены от больных с различными формами кишечной клебсиэлле-зной инфекции, а 12 цггаммов являлись музейными. Данные о распространенности и уровнях антикомплементарного признака в названных выборках иггаммов представлены в таблице 1, из которой видно, , что антикомллементарная активность бактерий достаточно широко распространена. При этом-, зависимость средних уровней и пенетрантности этого свойства от источника выделения штаммов свидетельствовала о его значении во взаимодействии бактерий с макроорганизмом. 5

Изучение взаимосвязи антикоыплекентарной активности с продукцией протеаа, гемолизинов, протеина к (золотистыми стафилококками) проведено на 62 штаммах золотистых и 44 штаммах эпидермальных стафилококков,' а также на 60 штаммах кишечных палочек, для которых дополнительно исследЪвалась взаимосвязь с комплементрезистентностью. Кроме того, на 40 штаммах кишечных палочек были' изучены корреляционные связи антикомплементарного признака с антилизоцимной активностью.

Проведенные исследования показали, что ант«комплементарная активность не коррелировала с такими биологическими характеристиками бактерий, как гемолитический и протеолитический признаки, продукция протеина А золотистыми стафилококками, а также с антилизоцимным признаком. Вместе с тем, антикомплементарные свойства кишечных палочек были слабо, но достоверно связаны с их комплементрезистентностью (11=0.254; р<0.05). Вы-сглзаяо предположение о независимой детерминации изучаемого свойства от указанных биологических характеристик бактерий, за исюночением устойчивости к сыворотке. Б отношении последнего свойства предполагается наличие общих с антикомплементарной активностью механизмов реализации. При этом низкий коэф-

фициент нелинейной корреляции и соответствующий низкий уровень детерминированности связи (около 62) может объясняться тем, что устойчивость к комплементарному киллингу является интегрированным показателем, зависящим от влияния большого количества самых разнообразных факторов (Taylor P.W. , 1988). В то же время реальные претенденты на роль -общего механизма реализации антикомплементарной активности и комплементрезис-тентности, такие как traT-протеин наружной мембраны, способный блокировать комплементарный каскад (Pramoonjago P. et al. , 1990), обеспечивают, как правило, невысокий уровень устойчивости к летальному действию системы комплемента (Taylor P. V. , 1983, 1988).

Бггалогшеское значеннэ анткксмплешотаргай шстгашости бактерий. Выявление биологической роли антикомплементарного признака бактерий проводили на модели экспериментальной стафилококковой инфекции при интраорбитальном зарачвнии мышей линии СБА, а также в клинико-бактериологическом исследовании, проведенном у 47 больных хроническим пиелонефритом и 42 больных холециститом.

В ходе экспериментального интраорбитального инфицирова-. ния мышей отобранным штаммом стафилококка, ч популяционной структуре которого лишь 301 клонов обладали антикомплементарной активностью, было выяснено, что по мере увеличения срока после заражения наблюдалось достоверное нарастание доли ста-фило.'сокков, обладающих изучаемым свойством, в том числе к более выраженным. Параллельно с распространенностью данного признака нарастал и средний субполуляционный уровень активности. Шк этих двух показателей приходился на конец третьей недели после заражения (рис. 2). Иными словами, естественный отбор и накопление стафилококков осуществлялось в пользу бактерий, обладающих антикомплемэнтарным признаком, что и послужило основанием для постулирования положительного вклада изучаемого признака в выживаемость стафилококков в макроорганизме, то ест/- й персистентный потенциал этих бактерий.

Изучено 67 штаммов кишечной палочки, выделенных от 47 больных хроническим пиелонефритом. обладали типичными

Рисунок 2.

Динамика уровня антикомплементаршй активности в ходе, экспериментального инфекционного процесса.

свойствами, присущими данному виду бактерий, были охарактери-' зованы по антикомплементарной активности сразу же после выделения в чистой культуре. Антикомплементарная активность была обнаружена у 80. 6+1.2% штаммов (54 штамма); диапазон величин •активности составил от 3.3 до 26. 4 ед. В 37 случаях помимо определения антикомплементарной активности выявляли показатель бактериурии по методике Фэлъдман Ю. Ц. (1984), который ' выражали в последующем в виде степени бактериурии (СБУ), разный десятичному логарифму концентрации кишечных палочек в одном миллилитре мочи. Было обнаружено, что СБУ коррелировала с антикомплементарной активностью кишечных палочек. Корреляционные связи подтверждались коэффициентом нелинейной корреляции Пирсона ( +0. 467-, р<0.01) и в дисперсионном анализе (р<0.05). При этом примерно 221 от общего варьирования СБУ обеспечивалось варьированием антикомплементарного признака выделенных штаммов. Обнаружение такого рода связи продиктовало необходимость исследования обоих показателей в процессе лечения. С этой целью антикомплементарная активность и СБУ изучались до и после лечения обострения хронического пиелонефрита в относительно однородной выборке больных в возрасте от 5 до 12 лет (16 больных), получавших однотипную антибиотико-терапию. В процессе лечения оба параметра как правило снижались, за исключением одного случая, когда антикомплементарная активность повысилась, и трех случаев, когда СБУ остачась на прежнем уровне. Анализ изменений обсемекенности мочи и изменений антикомплементарной активности показал, что существует достоверная связь (р<0.05) между величинами падения анализируемых параметров с коэффициентом детерминации 0.441. Наилучшим же образом коррелировали между собой аитикомплементарная активность до лечения и снижение СБУ за время лечения. Выявленная связь оказалась сильной, отрицательной, статистически значимой на высоком уровне (р<0.01) и подтверждалась корреляционным методом (г--0.766) и в дисперсионном анализе (р<0. 01), Примерно 60Х от оОдьго варьирования процента снижения СБУ определялось вариабельностью антикомплементарной активности кишечных палочек до лечения. Указанные связи описаны эмпирическими уравнениями; зависимость процента падения СБУ от уровня

Рисунок 3.

Зависимость падения степени бактермурии (СБУ) от уровня антикомплементарной акткшюсти (ARA) Е. coli ' до лечения.

Снижение бактериурии (в 2) -

АКА (в ед.)

Примечание: Уравнение регрессии - Y--4.42*Х+93.71;

коэффициент корреляции г—0.766; р<0.01.

изучаемого признака, определенного до лечения, представлена на рисунке 3. Высказано предположение, что антикомплементарная активность кишечных палочек, возбудителей хронического пиелонефрита, является одним из факторов, определяющих "судьбу" бактериурии, являясь признаком, контролирующим выживание эшерихий в инфицированных мочевых путях. Необходимость определения такого параметра в практике диктуется рядом причин.

' Во-первых, показатель обсемененности мочи при инфекциях мочевых путей в настоящее время рассматривается как недостаточно надежный критерий ренальной локализации инфекции, где наблюдается длительное персистирование возбудителя (Stamm W. Е. et al., 1989). Во-вторых, комплементрезистентноеть бактерий, в некоторой степени связанная с ренальной локализацией (Gover Р. Е. et al.1972), также не надежна в плане прогнозирования. динамики бактериурии, так как одинаково выражена и у штаммов, выделяющихся из мочи однократно, и у штаммов, длительно пер-систирующих в мочевых путях (Lomberg Н. et al., 1989). В-третьих, не обладают достаточной прогностической ценностью при инфекциях мочевых путей и такие маркеры персистенции бактерий, как их антилизоцимная активность и способность инактиви-ровать бактерицидную фракцию препаратов человеческого лейкоцитарного интерферона (Зыкова JLC. и соавт., 1990).

Исследовано 42 штамма кишечных палочек, выделенных из стенки желчного^пузыря от больных, оперированных по поводу острого и.обострения хронического холецистита Представленная выборка содержала 15 штаммов от больных с недеструктивными формами холецистита и 27 штаммов от больных с деструктивными процессами. В каждой из групп встречались штаммы, выделенные от больных с неосложненным течением заболевания и больных с послеоперационными осложнениями. В группе штаммов от больных с деструктивным холециститом выделялись штаммы, выделенные 'при первично осложненном холецистите (перихолецистит, холангит, механическая желтуха). В сформированных таким образом группах ппаммов,. соответствующие пяти клиническим вариантам холецистита, средние уровни антикомплементарной &ктивнос-ти составили соответственно: 419+2.2, 11.8+2.4 и Ю. 3+2.9 ед. при деструктивных холециститах, с неосложненным течением, с

осложненным течением и с осложнениями в послеоперационном периоде; 3.0+1.7 и 10.0+2.9 ед. при недеструктивных холециститах с неосложненным течением и осложнениями в послеоперационном периоде соответственно. Очевидно, что штаммы, выделенные при деструктивном и не деструктивном холецистите, мало отлича-.ются друг от друга по уровню антикомплементарного признака, в то время как наблюдались существенные отличия в уровне признака между штаммами от больных с осложненными и неосложнен-ными формами заболевания.

Группировка наблюдаемых случаев по антикомплементарной активности с учетом частоты встречаемости послеоперационных осложнений в каждом из интервалов позволила выявить эмпирическую зависимость верогтности послеоперационных осложнений от величины антикомплементарного признака кишечных палочек -возбудителей холецистита Эта зависимость (рис. 4) отражает корреляционную связь между этими параметрами: если янтикомиле ментарная активность превышала 10 ед., частота осложнений была более 50Х, а при уровне активности более 15 ед. приближалась к 100%. Таким образом, антикомплементарный признак кишечных палбчек, выделяющихся при холециститах из стеяки желчного пузыря, .едва ли прямо способствует проявлению деструктивных изменений в ней. В то же время, с наблюдаемым свойством связано пролонгирование инфекционного процесса. Очевидно, антикомплементарная активность и в случае с холециститами в определенной мере обеспечивает выживаемость кишечных палочек в очаге воспаления. Проводя параллели с антикомплементарным признаком уропатогенных штаммов кишечной палочки,следует подчеркнуть пригодность изучаемого нами свойства для повышения информативности бактериологических исследований при холецистите. Необходимость поиска новых биологических характеристик бактерий с этой целью обуславливается ведущей ролью инфекции в развитии послеоперационных осложнений с одной стороны (Шкроб O.C. и соавт. , 1987; Подаячин П. В и соавт. , .1988), и малой информативностью известных факторов патогенности в плане прогнозирования течения процесса - с другой стороны (Зак В. И. , Швецов O.A. , 1990).

Излодкнные материалы по изучению биологической роли ая-

Р?:суиск i.

Oaintcîff сеть вероатассга ¡изслеоперацкогоояс осложнений пр;г холецкстаго от • ai гп 'л с • -j и: о кг;; гга р но i ï ак-•xjiBiíccT-! (АКЛ) дозбудотеля.

Число осложнений (в X)

АКА (в ед. )

тикомплементарной активности бактерий позволили рекомендовать 'определение этого свойства для прогнозирования особенностей течения инфекционных процессов. Выявление экологической и персистентной значимости признака позволило использовать его для санитарной оценки качества води наряду с известными пер-скстентными характеристиками Е. coli в разработке "Микробиологический мониторинг подземных вод Оренбургского региона", экспонированной на тематической выставке "Экологическая обстановка в ряде регионов России" (ВДНХ СССР, 1991 г.), и удостоенной серебряной медали выставки.

Оценивая фактический материал в целом, следует выделоть два главных момента: во-первых, антикомплементарная аютив-ность бактерий (как интегральный показатель внеклеточной инактивации последними комплемента) является распространенны;! признаком и существенно зависит от источника выделения; во-вторых, антикомплементарная активность, по всей £ видимости, контролирует вьштаемость бактерий в макроорганизме, то есть ответственна за их переистенцию, что делает изучение механизмов осуществления антикомплементарного действия перспективны}!

(1

как с теоретической, так it с практическом точки зрения.,

N

ВЫВОДИ

1. Разработаны методы определения антикомплементарной активности бактерий на основе подбора индикаторного штамма на комплемент, а также с применением комплементзависимого иммунного гемолиза. Определены достоинства и недостатки разработанных методов при их использовании в лабораторной практике.

2. Определены частоты встречаемости и средние уровни ан-тикомплемен^арной активности у бактерий различных групп, отличающихся видовой принадлежностью и источниками выделения. Распространение изучаемого признака, как и его величина нарастали в ряду: окружающая среда - бактерионосители - больные.

3. Изучение взаимосвязи антикомплементарной активности с некоторыми факторами патогенности бактерий выявило, что этот признак не коррелировал с продукцией протеина А (золотистыми стафилококками), гемолизинов, протеаз, антилиэоцимного фактора и был слабо связан с комплементрезистентностыо кишечных

палочек.

4. Показано повышение уровня антикомплементарного признака в популяциях зблотистых стафилококков при экспериментальном инфекционном процессе на мышах, обусловленное накоплением клонов, обладающих этим признаком, в том числе и более выраженным.

5. Исследование ан'тикомплементарной активности кишечных палочек, выделенных от больных холециститом, выявило корреляционную связь признака с вероятностью послеоперационных осложнений, что может быть использовано для прогнозирования последних в клинической практике.

6. При изучении антикомплементарной активности кишечных палочек - возбудителей хронического пиелонефрита - установлена связь данного свойства с выживаемостью бактерий в инфицированных мочевых путях, что позволило использовать его з качестве критерия длительности бактериурии.

Публикации по теш диссертации

1. Антикомплементарная активность бактерий. // Персистен-ция бактерий: Сб. научн. трудов (Под ред. О. В. Бухарина). - Куйбышев: КШ, 1990. - С. 100-107.

2. Антикомплементарные, свойства кишечных палочек. // Современные проблемы развития медицины: Тез. докл. конф. молодых ученых.- Оренбург, 1992,- С.б.

3. Микробиологический мониторинг подземных вод Оренбургского региона. /Ж : Пристендовый листок ВДНХ СССР, 1991.-С. 1. Совместно с 0. К Бухариным и В. А. Гриценко.

4. Способ определения антикомплементарной активности бактерий. //Заявка на изобретение N4909111/13(012615).-Поло.жи-телыгае решение ВНШГПЭ от 15.11.91. Совместно с О. В. Бухариным, Д. Г. Дерябиным и О. Л. Черновой.

НЛ Рэтапринт О Г ПИ Заказ N>1314 Тираж 100 экз.