Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антикомплиментарная активность бактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антикомплиментарная активность бактерий"

'V л'1

VI I I ч, Г;-

Министерство здр явоохранешш РФ

Челябинский гссударсгвегашп! медицинский институт

На правах рукописи

БРУДАСТОВ Юрий Авенирович

УМ-' 576. 809. 7+616-078. 7'

Л1ГШШШ11ЕМШ{ТЛРШШ АКТИВНОСТЬ ВА1СТЕРШ1 03. 00. 07-микробиология

АВТОРЕФЕРАТ дкссертацш! на соисишше ученой степени !сандидата мэдшцшсгао: наук

ЧЕЛЯБИНСК - 1092

Работа выполнена на кафедре микробиологии Оренбургского государственного медицинского института

Научный руководитель: Член-корр. ЛЕН РФ, доктор неди-щнских наук, профессор О, В. Бухарин. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук.

профессор И. И. Долгушин. доктор Медицинских наук, профессор 3. Н. Кондратова. Еедушее учреждение: Инстатут экологии и генетики микро-

орга^измов У:Ю ран

Зашита состоится "________1992 года

в_____часов на заседании Специализированного совета

К. ОМ. 04.03 при Челябинском государственном медицинском шслггуте по адресу: 454092, Челябинск-92(, ул. Боровского, б1!.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинского государствешюрр медицинского института. Автореферат разослан я ___1992 года.

Учеиьй секретарь Саешашзировашого совета

кандидат .медицинских наук Н. и. Жигалова

\ СЕДАЯ :(ДРЖТЕР"СТ1С1Л РАБОТ; I

Л'ггуалыгостл прсйлош. Исследования последних лет убедительно свидетельствуют о ток, что факторы, ннагсгивирущие механизмы естественной резистентности макроорганизма, обеспечиваю? патогенам возможность длительного персистирования в организме хозяина. Примером реализации тшсого механизма персис-■генции ногат служить аптилкзоцимная активность бактерий, разработка и внедрение методов регистрации которой позволили существенно повысить качество решения диагностических и прогностических задач инфекционной клиники (Бухарин 0. В. , 1990). К настоящему времени описаны и другие J факторы персистенции бактерий - аитнинтерфероновая (Соколов ED., 1990) и антиим-. муноглобулиновая (Чернохвсстова Е. В., 1987) активности микроорганизмов, деградирующие соответствующе механизмы защиты хозяина. К соталению, открытым остается вопрос о наличии аналогичного свойства бактерий в отношении ключевого фактора не-специфчческой резистентности - системы комплемента,тем более, что последняя задействована в самых различных гуморальных и клеточных реакциях мзкрооргшшзма, направленных на поддержа-■ние его гомэостаза (Кузник Б. К. и соавт., 1989; Egvang Т. G. & A.D. Befus, 1982).

С другой стороны, почти столетняя история изучения взаимодействия системы комплемента и бактерий свидетельствует об их чрезвычайном разнообразии (Taylor Р. V/. , 1983; Joiner К. А. , 1988). Механизмы, обеспечивающие' низкоэффективную активацию и функционирование комплемента при прямом взаимодействии последнего с бактериями, занимают в этих исследованиях центральное место (Joiner К. А. ,1988) и изучаются лишь с точки зрения комплементрезистентности бактерий. Этот интегральный показатель устойчивости к комплементопосредованкому киллингу и лизису играет, по мнению ряда ученых, роль фактора вирулентности грамнегативных возбудителей (Taylor Р. У. , 1988; Joiner К." А., 1988; Kubens В. S. et al., 1989). Такой подход способствует расшифровке особенностей патогенеза инфекционных процессов. сопровождающихся бактериемией. Однако ситуация остается куда менее ясной в отношении целого ряда других инфекций,при

которых роль комплемента как ключевого киллера бактерий не столь очевид!'-'. (инфекции с гранулематозным ответом тканей, при которых концентрации внеклеточно циркулирующих медиаторов весьма низки), и где определенное место в развитии инфекционного процесса отводится лейкоцитарной системе комплемента (5ип<±зто J. 5. , 1982; 1983). Не исключено, что воздействовать на функционирование этой системы "выгоднее" и эффективнее да-, стантно, выбрасывая во внеклеточное пространство продукты, влияющие на ее активацию. Вопросы жэ дистантной инактивации комплемента остаются на сегодняшний, день недостаточно изученными, что послужило основой для разработки нового интегрального показателя - антикомплементариой активности бактерий и оценки его биологической роли в инфекционной патологии.

Цель исследования. Изучение способности бактерий инакти-вировать комплемент и оценка биологической роли этого признака.

Задачи ксследоглшиз:

1. Разработать методические подходы к определению антикомплементарной активности бактерий.

2. Дать характеристику различных видов бактерий по анти-кохплементарному признаку.

3. Определить биологическую роль антикомплементарной активности бактерий в инфекционной патологии.

Научная копязяа. Разработаны методы регистрации антикомплементарной активности бактерий на основе принципа отсроченного антагонизма с подбором высокочувствительного к комплементу штамма, а также на основе адаптации к потребностям определения антикомплементарной активности комплементьависимого иммунного гемолиза. Материалы по разработке бактериологического метода определения антикомплементарной активности положены в основу заявленного "Способа определения антикомплементарной активности бактерий", на который получено положительное решение ЫИИГПЗ по заявке N 4909111/13(012616) от 15.11. 1991 г.

Представлена характеристика изученных штаммов бактерий по антикомплементарному признаку: определены частоты встречаемости и средние уровни признака у штаммов различных групп, отличающихся как по видовой принадлежности, так и по источнику выделения..Во всех случаях показана связь изучаемого свойства с источником выделения штаммов, а выраженные отличия в распространенности и уровнях признака у золотистых и эпидер-мальных стафилококков при применении бактериологического метода индикации активности позволили рекомендовать последний в качестве теста для дифференциации названных видов стафилококков.

На модели экспериментальной инфекции, а также в клинико-бактериологическом исследовании проанализирована биологичес-. кая роль антикомплементарной активности бактерий и сделан вывод о ее персистентной значимости. В частности, показано,что: а) в системе "стафилококки - макроорганизм" происходит прей мужественное накопление бактерий, обладающих более высокой активностью; б) более высокий уровень антикомплементарного признака кишечных палочек - возбудителей холецистита и хронического' пиелонефрита - способствует пролонгированию инфекционного процесса и выживаемости бактерий в очаге, что выражалось меньшим падением за период лечения степени бактериурки и большей вероятностью послеоперационных осложнений при различных формах холецистита.

Практнчеюсая ценность. Полученные данные расширяют теоретические представления о биологических свойствах патогенных и условно-патогенных бактерий, приближая к пониманию патогенеза инфекционных заболеваний. Эти материалы используются в процессе преподавания раздела "Инфекция и иммунитет" курса медицинской микробиологии в ОГМИ.

Практическое значение исследований определяется применением разработанных способов определения антикомплементарной активности бактерий в качестве, дополнительного теста для дифференциации стафилококков и для расшифровки персистентного потэнцнала бактерий в клинико-лабораторных и экологических исследованиях.'

Полученные фактические материалы использованы также в разработке "Микробиологический мониторинг подземных вод Оренбургского региона", представленной на тематической выставке "Экологическая обстановка в ряде регионов России" (1991 г.), , удостоенной серебряной медали ВДНХ СССР.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены . на итоговой конференции молодых ученых ОГМИ (1992 г.), на заседании областного лабораторного совета (г.Оренбург,. 1992г.). ., Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедры микробиологии ОГМИ, Оренбургского отделения Всероссийского научного общества эпидемиологов и микробиологов и на заседании проблемной комиссии института "Микробная экология человека в; норме и при патологии" (г.Оренбург, 1992 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи, получено положительное решение по заявке на изобретение, оформлен пристендовый листок ВДНХ СССР.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из » введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего ¿6 отечественных и 10°. зарубежных источника.

Текст диссертации изложен на 145 страницах машинописи и иллюстрирован 11 таблицами и 22 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалвы и метода исследования. Работа выполнена на 326 штаммах грамотрицательных бактерий, главным образом кишечных палочек,и на 577 штаммах золотистых и эпидермальных ста-, филококков, выделенных из объектов окружающей среды, от бактерионосителей и от больных людей.. Использовались общепринятые методы идентификации бактерий и изучения некоторых их биологических характеристик,в том числе продукции протеина А золотистыми стафилококками (Фоменко Г. А., 1980; З^ШбЬ Н., БЬаХепЬеш &, 1969), комплементрезистентности кишечных пало-

чек (Бухарин О. В., Созыкин В. JL , 1979), антилизоцимной активности бактерий (Бухарин О. В. и соавт. , 1984), протеолитичес-кой и гемолитической активности бактерий» а также классические методы определения активности комплемента в гемолитической системе (Кэбот Е., Мейер № , 1968; Joiner К. А. et al. , 1983).

Изучение биологической роли антикомплементарной активности бактерий на модели экспериментальной инфекции проводили при интраорбитальном заражении мышей линии СБА отобранным штаммом золотистого стафилококка с последующим контролем признака у клонов, высеваемых из почечной ткани животных, в которой выявляется преимущественное накопление стафилококков (Анатолий С. А., Антоновская М. И., 1966).

Статистическая обработка результатов проводилась общепринятыми методиками с использованием критерия Стьюдента,корреляционного, дисперсионного и регрессионного анализов (Лакин Г.Ф., 1990).

Разработка методов определения анядашплеиентарной активности бактерий. Для определения антикомплементарной активности бактерий, были разработаны методические подходы, основанные на принципе отсроченного антагонизма и применении ком-племенгзависимого иммунного гемолиза.

В первом .'случае исследования по выбору индикаторной культуры, позволяющей тестировать наличие или отсутствие в среде комплемента, привели к обнаружению шта'хма кишечной палочки, продляющего высокую чувствительность к комплементарному кил-лингу. Этот штамм, производный от Е. coli К12, характеризуется типичными видовыми свойствами, находится в R-форме и депонирован в музее живых бактериальных культур ГИСК им. JL А. Тарасовича под регистрационным номером 212. Бактериологическое определение антикомплементарной активности бактерий, основанное на применении штамма N212 в качестве индикаторной культуры на комплемент, заключалось в выращивании исследуемых бактерий на слое питательного агара, последующей их инактивации в парах хлороформа, наслаивании второго слоя агара, содержащего сыворотку - источник комплёмента, инкубации для диффузии

и реализации продуктами жизнедеятельности испытуемых бактерий антикомплементарных сбойств, наслаивании третьего слоя агара, содержащего взвесь индикаторных бактерий штамма N212 и инкубации для выявления антикомплементарной активности, которая учитывалась по наличию зон роста индикаторной культуры вокруг колоний исследуемых штаммов, где произошла инактивация комплемента.

Разработанный метод определения антикомплементарной активности позволяет, таким образом, тестировать инактивацию комплемента по убыванию комплементзависимого киллинга в отношении чувствительного штамма N212. Проведенные в последующем эксперименты по изучению' взаимозависимостей различных путей активации системы комплемента и бактерицидностью в отношении штамма N212 показали, что термолабильная бактери^идность сывороток (всего 67 сывороток) наилучшим образом коррелировала с активностью в классическом пути активации (р -0.78) и в меньшей степени с активность» в альтернативном пути (р-0.57). Шдобные результаты позволяют предположить, что киллинг кишечных палочек индикаторного штамма осуществляется с преимущественным участием классической активации комплемента Однако предложенный методический подход не позволяет повысить инфор-

I

мативноеть определения, уточняя, например, мишени и кинетику антикоыплемэнтарного действия,количественную его сторону, локализацию антикомплементарного фактора. Эта информации могла бы быть собрана только при применении общепринятых в настоящее время в иммунологии методов количественного тестирования комплемента, что послужило причиной разработки альтернативного методического подхода к определению антикомплементарной активности бактерий, основанного на комплементаависимом иммунном гемолизе.

Гемолитический м«тод определения интересующего нас свойства основан на тестировании- убывания активности комплемента под влиянием продуктов жизнедеятельности бактерий при использовании разработанной наш методики парциального гемолиза в агаровом геле. Основой методики является комплементчувствит.е-льный слой агара, содержаний сенсибилизированные эритроциты барана в концентрации 0.25 млрд. /мл и приготовленный на стан-

дартном веронал-мединаловом буфере (Кэбот Е. , Мейер М. ,1968) с концентрацией ионов Са++ и -0. 01М. Использовался агар "Бас1о", Регак, с конечной концентрацией в слое - 1%.

На поверхность предварительно охлажденной до 4'С агари-зованной суспензии эритроцитов по шаблону наносили стандартные капли супернатантов суточных бульонных культур исследуемых штаммов бактерий объемом 10 мкл. Пластины с агаром инкубировали на холоду до полного впитывания супернатантов, и затем в те же точки по тому же шаблону наносили по 10 мкл сыворотки - источника комплемента. Далее пластины инкубировали при 4'С в течение 16-24 часов для диффузии и реализации анти-коютлементарных свойств бактериальными продуктами. Проявление зон гемолиза осуществляли при 37'С в течение 60 минут и останавливали погружением пластин в холодный (8-10'С) буферный раствор. Измерение поглощения света в зонах гемолиза производили при длинах волн 600-640нм (денситометр ДМ-1,светофильтр N4). При этом ряды зон гемолиза выравнивались параллельно направлению движения предметного столика прибора, установка темнового тока осуществлялась согласно инструкции к прибору, установку конца прслы (100% пропускания) производили по зоне гемолиза, полученной нанесением на агар с эритроцитами сапонина, вызывающего 100%-ннй гемолиз в месте нанесения.

Денситограмма представляет собой кривую, состоящую из чередующихся участков,.соответствующих поглощению негемолизи-рованного комплементчувствителыюго слоя (фоновый уровень) и уровням поглощения отдельных зон гемолиза (см. рисунок 1). Вычисление функционально активного комплемента в соответствующей зоне гемолиза производили следующим образом. Измеряли на денситограмме падение поглощения для соответствующей зоны гемолиза (в мм), относили полученную величину к величине падения поглощения в зоне гемолиза со 100%-ным лизисом эритроцитов и получали таким образом степень падения поглощения в каждой зоне гемолиза Затем по уравнению У-0.27*1пХ+1.02, полученному в предварительных экспериментах с различными концентрациями эритроцитов, где X - полученная величина степени падения поглощения в зоне гемолиза, а У - степень гемолиза в последней, и известному уравнению Крога (Кэбот Е. , Мейер М. ,

ШШ »

Рисунок 1. Даис^люгра,\сгя. п кетодз парциального гемолиза в гелэ для опрзделешаз шотЕшготяаы^гтар-ной анташюстк бактерий.

Схематическое изображение пластины с зонами гемолиза.

1

Денситометр ДМ-1

V

пЛ

2

Схема денситограммы

---~7

Л

3

XI

Х2

хз

Х4

Л_1

Услеш[ыо обозначения, Цифрами (1-4) обозначены зоны гемолиза п соответствующие им участки денситограммы. Х1-Х4 - величины пропускания для соответствующих зон гемолиза. Отношения Х2,ХЗ,Х4 к XI равны степеням падения поглощения в зонах гемолиза

1958) с коэффициентом 1/п=0.27 (соответствует используемой концентрации эритроцитов) производили перерасчет оптического параметра в величину активности комплемента, выраженную в гемолитических единицах (СН50). За величину антикомплементарной активности принимали разность между активностью в контрольных зонах гемолиза, где вместо супернатанта применяли питательный бульон, и активностью в соответствующих штаммам опытных зонах гемолиза, разность, перерасчитанную умножением на 100 на 1 мл супернатанта. Таким образом, за 1 единицу .антикомплементарной активности (1 анти-СН50, далее просто 1 ед.) принимали такую активность супернатанта суточной бульонной культуры бактерий исследуемого штамма, которая при контакте 1 »ал супернатанта с 1 мл сыворотки обеспечивала инактивацию 1 гемолитической единицы комплемента

В процессе разработки методики выяснилось также, что в предлагаемых режимах взаимодействия комплемента с продуктами жизнедеятельности бактерий гемолизины последних не влияли на результат. Кроме того, наблюдалась сильная положительная корреляционная связь (г»0.94; р<0.01) между антикомплементарно-стью одних и тех же супернатантов в отношении человеческого комплемента и комплемента морской свинки, что послужило основанием для применения в дальнейших экспериментах лиофилизиро-ванной сыворотки морской свинки (препарат для РСК). Ошибка определения антикомплементарной активности не превышала 10% уровня. Вычисления автоматизировались с'помощью микро-ЭВМ типа Ж- 52 и МК-85.

■ Сравнительный анализ предложенных методов определения антикомплементарной активности бактерий, проведенный на двух независимых выборках штаммов золотистых стафилококков (п-112) показал высокую степень корреляции между результатами, полученными этими методами (у -0.70). Это дало основание считать, что данные методики описывают один и тот же биологический феномен. При этом техническое осуществление бактериологического метода проще, требует меньшей тщательности и не нуждается в дополнительном оборудовании. Однако по таким позициям, как .информативность, возможность количественного учета результата, а также чувствительность, бактериологический метод язно

. , - 10 -уступает методу парциального гемолиза в геле. Тем не менее меньшая чувствительность бактериологического метода определения изучаемого признака обусловила то, что при его использовании были выявлены существенные отличия в распространенности признака у золотистых и эпидермальных стафилококков (89.4 +3.2% и 2.9+2.0X соответственно). Это позволило рекомендовать бактериологический метод индикации антикомплёментарной • активности в качестве дополнительного теста, дифференцирующе- • го указанные виды стафилококков. Метод парциального гемолиза в геле как более информативный и чувствительный стал методом выбора для дальнейших исследований, результаты которых приведены ниже.

Таким образом, разработаны методы, пригодные для определения антикомплементарчой активности бактерий. Это дало возможность расширить представления о вариантах взаимодействия типа "комплемент-бактерия", для оценки которого в настоящее время используется пока лишь один интегральный показатель -комплементрезистентность (Joiner К. А. , 1988; Kubens В. S. et al., 1989). С другой стороны предлагаемые методические подходы яшлются логическим продолжением работы по изучению бактериальных факторов, инактивирующих механизмы естественной резистентности макроорганизма, и наряду с методами определения антилизоцимной активности бактерий (Бухарин 0. В. и соавт., , 19L4) и оценки способности бактерий инактивировать бактерицидную составляющую препаратов человеческого лейкоцитарного интерферона (Бухарин 0. L ,• Соколов В. Id , А. с. N1564191) могли бы составить комплекс исследований по выявлению персистентных свойств бактерий.

Характеристика, бактерий по ангикомплеиенхарноцу признаку.

Изучение широты распространения антикомплементарной активное- ■ ти бактерий и её уровней проводилось на выборках, состоящих из 295 штаммов золотистых и эпидермальных стафилококков, 219 иггаммов кишечной палочки, 48 штаммов клебсиелл пневмонии, а ; также на 26 штаммах других видов.' Группа золотистых стафило-кокксв включала 36 штаммов, выделенных из воздуха, 99 штам- ? мов, выделенных от бактерионосителей, и 20 штаммов, выделен- ■/ >

Таблица 1

Распространенность и уровни антикошхдеьюнтарной актив] юстн бактерий

I I Источники выделения бактерий

! Вид бактерий 1 1 (п) ! 1 ! внешняя среда 1 (музей) ! бактерионосители ! больные 1 1 1 I 1

Staphylococcus aureus (n-155) 55.6+2. 8 83. 8+0. 7 90. 0+3. 0

2. 8+0. 9 7.2+0. 9 6. 5+2. 0

Staphylococcus epidermidis (n-140) 36. 8+1. 4 1. 8+0. 6 63. 9+1. 3 3.7+0. 8 а

Escherich;a coll (n»219) ' 50. 9+0. 9 im 83. 5+0.7

2. 4+0. 5 8. 9+1.2

Klebsiella pneumoniae (n-48) 83.3+6.2 * а 100.0

4.4+1.7 * 8.3+1. 3

Условные обозначения: В числителе - 7. распространенности. признака. В знаменателе - средний уровень признака (в ед.). * - музейные штаммы клебсиелл. 3 - значения не определялись.

ных от больных с раневой инфекцией. Группа эпидермальных стафилококков состояла из 68 штаммов, выделенных из воздуха, и 72 штаммов, выделенных от бактерионосителей. Кишечные палочки были представлены 110 штаммами, выделенными из различных проб воды хозяйственного и питьевого назначения, и 109 штаммами, выделенными от больных хроническим пиелонефритом и различными формами холецистита Среди штаммов клебсиелл 36 штаммов были выделены от больных с различными формами кишечной клебсиелле-зной инфекции, а 12 штаммов являлись музейными. Данные о распространенности и уровнях антикомплементарного признака в названных выборках штаммов представлены в таблице 1, из которой видно, что антикомплементарная активность бактерий достаточно широко распространена. При этом-, зависимость средних уровней и пенетрантности этого свойства от источника выделения штаммов свидетельствовала о его значении во взаимодействии бактерий с макроорганизмом. ;

Изучение взаимосвязи антикомплементарной активности с продукцией протеаз, гемолизинов, протеина А (золотистыми стафилококками) проведено на 62 штаммах золотистых и 44 штаммах эпидермальных стафилококков,' а также на 60 штаммах кишечных палочек, для которых дополнительно исследЪвалась взаимосвязь с комплементрезистентностыо. Кроме того, на 40 штаммах кишечных палочек были изучены корреляционные связи антикомплементарного признака с антилизоцимной активностью.

Проведенные исследования показали, что антикомплементарная активность не коррелировала с такими биологическими.характеристиками бактерий, как гемолитический и протеолитический признаки, продукция протеина А золотистыми стафилококками, а также с ачтилизоцимным признаком. Вместе с тем, антикомплементарные свойства кишечных палочек были слабо, но достоверно связаны с их комплементрезистентностыо (Ь=0.254; р<0.05). Высказано предположение о независимой детерминации изучаемого свойства от указанных биологических характеристик бактерий, за исключением устойчивости к сыворотке. В отношении последнего свойства предполагается наличие общих с антикомплементарной активностью механизмов реализации. При этом низкий коэф-

фициент нелинейной корреляции и соответствующий низкий уровень детерминированности связи (около 6%) может объясняться тем, что устойчивость к комплементарному киллингу является интегрированным показателем, зависящим от влияния большого количества самых разнообразных факторов (Taylor Р. V. , 1988). В то .та время реальные претенденты на роль общего механизма реализации антикомплементарной активности и комплементрезис-тентности, такие как traT-протеин наружной мембраны, способный блокировать комплементарный каскад (Pramoonjago Р. et al. , 1990), обеспечивают, как правило, невысокий уровень устойчивости к летальному действию системы комплемента (Taylor Р. У. , 1983, 1988).

Биаяопмескоэ значение алгг;"ссмпксне!rrapiюЛ аотнг;:ости бзктер^Л Выявление биологической роли антикомплемент:фного признака бактерий проводили на модели экспериментально!": стафилококковой инфекции при интраорбитальном заралззнни мкшей линии СБА, а тага» в клинико-бактериологическом исследовании, проведенном у 47 больных хроническим пиелонефритом и ЛЯ Сольных холециститом.

В ходе экспериментального интраорбитального ин^ицирова-. ния мышей отобранным штаммом стафилококка, ч популяционной структуре которого лишь 30% клонов обладали антикомплементарной активностью, было выяснено, что по мэре увеличения срока после заражения наблюдалось достоверное нарастание доли стафилококков, обладающих изучаемым свойством, в том числе и более выраженным. Параллельно с распространенностью данного признака нарастал и средний субпопуляционныЯ уровень активности. Пик этих двух показателей приходился на конец третьей недели после заражения (рис. 2). Иными словами, естественный отбор и накопление стафилококков осуществлялось в пользу бактерий, обладающих антикомплементарным признаком, что и послужило основанием для постулирования положительного вклада изу-• чаемого признака в выживаемость стафилококков в макроорганизме, то есть в персистентный потенциал этих бактерий.

Изучено 67 штаммов кишечной палочки, выделенных от 47 больных хроническим пиелонефритом. Штампы обладали т»лн:чяыми

Рисунок 2.

Динамика уровня ангккомплемекгарной шгаашости в ходе* экспериментального инфекционного процесса.

Срок после заражения (в сутках).

свойствами, присущими данному виду бактерий, были охарактеризованы по антикомплементарной активности сразу же после выделения в чистой культуре. Антикомплементарная активность боа обнаружена у 80.6+1.2% штаммов (54 штамма); диапазон величин •активности составил от 3.3 до 26.4 ед. В 37 случаях помимо определения антикомплементарной активности выявляли показатель бактериурии по методике Фгльдман Ю. М. (1984), который выражали в последующем в виде степени бактериурии (СБУ), равный десятичному логарифму концентрации кишечных палочек в одном миллилитре мочи. Было обнаружено, что СБУ коррелировала с антикомплементарной активностью кишечных палочек. Корреляционные связи подтверждались коэффициентом нелинейной корреляции Пирсона (+0. 467; р<0.01) и в дисперсионном анализе (р<0.05). При этом примерно 22% от общего варьирования СБУ обеспечивалось варьированием антикомплементарного признака выделенных штаммов. Обнаружение такого рода связи продиктовало необходимость исследования обоих показателей в процессе лечения. С этой целью антикомплементарная активность и СБУ изучались до и после лечения обострения хронического пиелонефрита в относительно однородной выборке больных в возрасте от 5 до 12 лет (16 больных), получавших однотипную антибиотико-терапию. В процессе лечения оба параметра как правило снижались, за исключением одного случая, когда ана-икомплементарная активность-повысилась, и трех случаев, когда СБУ осталась на прежнем уровне. Анализ изменений обсемененноети мочи и изменений антикомплементарной активности показал, что существует достоверная связь (р<0. 05) между величинами падения анализируемых параметров с коэффициентом детерминации 0.441. Наилучшим же образом коррелировали между собой антикомплементарная активность до лечения и снижение СБУ за время лечения. Выявленная связь оказалась сильной, отрицательной, статистически значимой на высоком уровне (р<0.01) и подтверждалась корреляционным методом (г--0.766) и в дисперсионном анализе (р<0.01). Примерно 60% от общего варьирования процента снижения СБУ определялось вариабельностью антикомплементарной активности кишечных палочек до лечения. Указанные связи описаны эмпири"пс-кими уравнениями; зависимость процента падения СБУ от уровня

Рисунок 3.

Зависимость падения степени бактериурми (СБУ) от уровня антикомплементарной активности (АКЛ) ELcoli 1 до лечения.

Снижение бактериурии (в X) -

АКА (в ед.)

Примечание: Уравнение регрессии - Y— 4. 42*Х+93. 71;

коэффициент корреляции г--0.766;р<0.01.

изучаемого признака, определенного до лечения, представлена на рисунке 3. Высказано предположение, что антикомплементарная активность кишечных палочек, возбудителей хронического пиелонефрита, является одним из факторов, определяющих "судьбу" бактериурии, являясь признаком, контролирующим выживание эшерихий в инфицированных мочевых путях. Необходимость определения такого параметра в практике диктуется рядом причин. Во-первых, показатель обсемененности мочи при инфекциях мочевых путей в настоящее время рассматривается как недостаточно надежный критерий ренальной локализации инфекции, где наблюдается длительное персистирование возбудителя (Stamm W. Е. et al., 1989). Во-вторых, комплементрезистентность бактерий, в некоторой степени связанная с ренальной локализацией (Gover Р. Е. et al.1972), также не надежна в плане прогнозирования динамики бактериурии, так как одинаково выражена и у штаммов, выделяющихся из мочи однократно, и у штаммов, длительно пер-систирующих в мочевых путях (Lomberg Н. et al., 1989). В-третьих, не обладают достаточной прогностической ценностью при инфекциях мочевых путей и такие маркеры персистенции бактерий, как их антилизоцимная активность и способность инактиви-ровать бактерицидную фракцию препаратов человеческого лейкоцитарного интерферона (Зыкова Л. С. и соавт., 1990).

Исследовано 42 штамма кишечных палочек, выделенных из стенки желчного^пузыря от больных, оперированных по поводу острого и.обострения хронического холецистита. Представленная выборка содержала 15 штаммов от больных с недеструктивными формами холецистита и 27 штаммов от больных с деструктивными процессами. В каждой из групп встречались штаммы, выделенные от больных с неосложненным течением заболевания и больных с послеоперационными осложнениями. В группе штаммов от больных с деструктивным холециститом выделялись штаммы, выделенные при первично осложненном холецистите (перихолецистит, холангит, механическая желтуха). В сформированных таким образом группах штаммов,.соответствующих пяти клиническим вариантам холецистита, средние уровни антикомплементарной активности составили соответственно: 4*. 9+2.2, 11.8+2.4 и 10.3+2.9 ед. при дестр>ктивных холециститах с неосложненным течением, с

осложненным течением и с осложнениями в послеоперационном периоде; 3.0+1.7 и 10.0+2.9 ед. при недеструктивных холециститах с неосложненным течением и осложнениями в послеоперационном периоде соответственно. Очевидно, что штаммы, выделенные при деструктивном и недеструктивном холецистите, мало отличаются друг от друга по уровню антикомплементарного признака, в то время как наблюдались существенные отличия в уровне признака между штаммами от больных с осложненными и неосложнен-ными формами заболевания.

Группировка наблюдаемых случаев по антикомплементарной активности с учетом частоты встречаемости послеоперационных осложнений в каждом из интервалов позволила выявить эмпирическую зависимость верогтности послеоперационных осложнений от величины антикомплементарного признака кишечных палочек -возбудителей холецистита. Эта зависимость (рис.4) отражает корреляционную связь между этими параметрами: если гштикомп-лементарная активность превышала 10 ед., частота осложнений была более 50%, а при уровне активности более 15 ед. приближалась к 100%. Таким образом, антикомплейентарный признак кишечных палочек, выделяющихся при холециститах из стекки желчного пузыря, .едва ли прямо способствует проявлению деструктивных изменений в ней. В то же время, с наблюдаемым свойством связано пролонгирование инфекционного процесса. Очевидно, антикомплементарная активность и в случае с холециститами в определенной мере обеспечивает выживаемость кишечных палочек в очаге воспаления. Проводя параллели с антикомплементарным признаком уропатогенных штаммов кишечной палочки,следует подчеркнуть пригодность изучаемого нами свойства для повышения информативности бактериологических исследований при холецистите. Необходимость поиска новых биологических характеристик бактерий с этой целью обуславливается ведущей ролью инфекции в развитии послеоперационных осложнений с . одной стороны (Шкроб О. С. и соавт. , 1987; Подаячин П. В. и соавт. , .1988), и малой информативностью известных факторов патогенности в плане прогнозирования течения процесса - с другой стороны (Зак В. И. , Швецов С. Л. , 1990).

Излолзнные материалы по изучению биологической роли ан-

Рлсунс;: А.

Эангс!"гссть вероптясст:; нослсоперацпошплх осло.;;-:;еш:й при халецгстате от-азпмултлемелтаркой активности (ЛКА) зозбудггеля.

Число осложнений (в %)

АКА ( в ед.)

тикомплементарной активности бактерий позволили рекомендовать 'определение этого свойства для прогнозирования особенностей течения инфекционных процессов. Выявление экологической и перскстентной значимости признака позволило использовать его для санитарной оценки качества воды наряду с известными пер-систентными характеристиками Е. colí в разработке "Микробиологический мониторинг подземных вод Оренбургского региона", экспонированной на тематической выставке "Экологическая обстановка в ряде регионов России" (ВДНХ СССР, 1991 г.), и удостоенной серебряной медали выставки.

Оценивая фактический материал в целом, следует выделить два главных момента: во-первых, антикомплементарная активность бактерий (как интегральный показатель внеклеточной инактивации послэдними комплемента) является распространению.! признаком и существенно зависит от источника выделении; во-вторых, антикомплементарная активность, по всей i видимости, контролирует выживаемость бактерий ь макроорганизме, то есть ответственна за их персистенцию, что делает изучение механизмов осуществления антикомплементарного действия перспективны},! как с теоретической, так П с практической точки зрения.

ч

выводи

1. Разработаны методы определения антикомплементарной активности бактерий на основе подбора индикаторного штамма на комплемент, а также с применением комплеыентзависимого иммунного гемолиза Определены достоинства и недостатки разработанных методов при их использовании в лабораторной практике.

2. Определены частоты встречаемости и средние уровни антикомплементарной активности у бактерий различных групп, отличающихся видовой принадлежностью и источниками выделения. Распространение изучаемого признака, как и его величина нарастали в ряду: окружающая среда - бактерионосители - больные.

3. Изучение взаимосвязи антикомплементарной активности с некоторыми факторами патогенности бактерий выявило, что этот признак не коррелировал с.продукцией протеина А (золотистыми стафилококками), гемолизинов, протеаз, антилиэоцимного фактора и был слабо связан с кэмплементрезистентностью кишечных

палочек.

4. Показано повышение уровня антикомплементарного признака в популяциях золотистых стафилококков при экспериментальном инфекционном процессе на мышах, обусловленное накоплением клонов, обладающих этим признаком, в том числе и более выраженным.

5. Исследование антикомплементарной активности кишечных палочек, выделенных от больных холециститом, выявило корреляционную связь признака с вероятностью послеоперационных осложнений, что может быть использовано для прогнозирования последних в клинической практике.

6. При изучении антикомплементарной активности кишечных палочек - возбудителей хронического пиелонефрита - установлена связь данного свойства с выживаемостью бактерий в инфицированных мочевых путях, что позволило использовать его в качестве критерия длительности бактериурии.

Публикации по теме диссертация:

1. Антикомплементарная активность бактерий.// Персистен-ция бактерий:Сб. научн. трудов (Под ред. О. В.Бухарина).- Куйбышев: КМИ, 1990. - С. 100-107.

2. Антикомплементарные, свойства кишечньгх палочек. // Современные проблемы развития медицины: Тез. докл. конф. молодых ученых. - Оренбург, 1992.- С. 6.

3. Микробиологический мониторинг подземных вод Оренбургского региона //М.: Пристендовый листок ВДНХ СССР, 1991. -С. 1. Совместно с О. В. Бухариным и В. А. Гриценко.

4. Способ определения антикомплементарной активности бактерий.//Заявка на изобретение N4909111/13(012615).-Положительное решение ВНИИГПЭ от 15.11.91. Совместно с О. В. Бухариным, Д. Г. Дерябиным и 0. Л. Черновой.

НЛ Ротапринт ОГПИ Заказ №1314 Тираж 100 экз.