Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бактериальная трансформация органических веществ при гетеротрофном питании фитопланктона

ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Бактериальная трансформация органических веществ при гетеротрофном питании фитопланктона"

од

' • Иг

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи■ УДК 581.132

ФРЕНКЕЛЬ ОЛЕГ АБРАМОВИЧ

БАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ПРИ ГЕТЕРОТРОФНОМ ПИТАНИИ ФИТОПЛАНКТОНА

03. 00.18 - гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994 год

Работа выполнена на кафедре гидробиологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель - кандидат биологических наук, доцент

А. П. САДЧИКОВ

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор В.А.АБАКУМОВ кандидат биологических наук О.А.ЕГОРОВА

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт

биологии Ростовского государственного университета

Защита состоится ". Ж " А^ЛЯ 1994 Г. в . _час.

на заседании Специализированного совета Д.053.05.71 при Московском государственном университете по адресу: 119899, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ

Автореферат разослан "_" _1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета ц¿¿^¡-¿и/е

кандидат биологических наук А.Г. Дмитриева

Актуальность темы. Деструкция органического вещества в водных экосистемах осуществляется в основном за счет жизнедеятельности микроорганизмов; в связи с интенсивным обменом веществ через сообщество бактерий и водорослей трансформируется значительная часть растворенного органического вещества (РОВ).

Гетеротрофная активность бактерий и водорослей изучается довольно интенсивно. Большое количество работ было проведено на культурах микроорганизмов; в природных водоемах исследований такого плана значительно меньше. Для изучения гетеротрофной активности микроорганизмов чаше всего используются меченые низкомолекулярные соединения. Однако их применение не всегда в должной мере отражает процессы, протекающие в водоемах, т.к. в последних в основном представлено высокомолекулярное РОВ. Его потребление требует предварительного гидролиза экзофермен-тами, выделяемыми в среду микроорганизмами. В некоторых случаях фитопланктон природных водоемов потребляет РОВ лучше или наравне с бактериями (особенно на глубинах с недостаточной ос-вещеннностью) (Федоров, Каниковская, 1984; Каниковская, Федоров, 1987). В этом случае возникает вопрос о способности водорослей выделять в среду экзоферменты. И второе, связаны ли эти процессы с их гетеротрофной активностью. В водных экосиситемах эти процессы практически не изучены. На основании изложенного были сформулированы цели и задачи настоящего исследования.

Цель и задачи исследований. Цель исследований состояла в изучении закономерностей прижизненного выделения РОВ пресноводным фитопланктоном, как одного из источников поступления в водоем органических веществ; наблюдении за потреблением водорослями и бактериями органических веществ разной молекулярной массы и изучении ферментативной активности в природных водое-

- з -

мах, культурах водорослей и бактерий.

Программой исследований предусматривалось решение следующих задач:

1. Изучение прижизненного выделения РОВ природным фитопланктоном.

2. Изучение потребления сообществом фито- и бактериопланк-тона низко- и высокомолекулярных органических веществ.

3. Определение ферментативной активности (на примере про-теолитической) в пресноводных водоемах и культурах водорослей.

4. Изучение протеолитической и гетеротрофной активности альгологически и бактериально чистых культур некоторых сине-зеленых (цианобактерий) и зеленых водорослей.

5. Изучение протеолитической и гетеротрофной активности в культурах бактерий (на примере Bacillus subtilis).

Научная новизна. Разработан комплекс методов определения гетеротрофной и ферментативной активности водорослей и бактерий применительно к пресноводным водоемам. В природных и лабораторных условиях изучены процессы деградации и последующей ассимиляции высокомолекулярных белковых соединений альго-бак-териальным сообществом.

Сопоставление величин гетеротрофной активности водорослей и бактерий позволило уточнить статус этих микроорганизмов в трофической пирамиде водного биоценоза.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы учреждениями Государственного комитета по охране природы, органами санитарно-эпидемиологического контроля за состоянием пресноводных экосистем. На основе вскрытых закономерностей в потреблении органических субстратов пресноводными сообществами фито- и бактериопланктона можно

прогнозировать способность водоемов к самоочищению, с учетом функционирования литических бактериальных экзоферментов. Предложенный подход дает возможность быстро оценить направление энергопотоков органического вещества в водоеме.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на заседании Московского общества испытателей природы в г. Москве (1988 г.), школы-семинара на оз. Севан "Современные проблемы изучения планктона" (198Э г.). Всесоюзной конференции "Методология экологического нормирования" в г. Харькове (1990 г.), 6 Конференции молодых ученых Казанского института биологии РАН в г. Казани (1990 г.), Ростовской научно-прикладной школы-семинара в г. Ростове-на-Дону ( 1990 г.).

Публикации. Материалы исследований изложены в 10 публикациях, из которых 2 находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста и состоит из введения, 8 глав, включающих в себя обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждения результатов и выводы; иллюстрирована 42 рисунками, 3 таблицами. Список литературы состоит из 117 отечественных и 40 иностранных работ.:: СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика места работы, материалы и методы исследований. В главе дается краткая характеристика исследуемых водоемов, условия культивирования водорослей, методы проведения экспериментов по определению гетеротрофной и протеолитической активности бактерий и водорослей.

Работа выполнялась с 198? по 1991 гг. Изучение фототроф-ной и гетеротрофной активности фито- и бактериопланктона проводили на мезотрофном и звтрофном водоемах. Лабораторные

исследования выполняли на альгологически и бактериально чистых культурах некоторых синезеленых (цианобактерий) и зеленых водорослей. В качестве метки использовали низкомолекулярные сое-

4Ц АЦ Jü 4U

динения (NaH СО3, С - глутаминовая кислота, С - аланин, С -

%

гидролизат водорослей, Н -глицил-лейцин) и высокомолекулярные ( I -бычий сывороточный альбумин, Н- иммуноглобулин человека).

Изучение гетеротрофной и протеолитической активности проводили на альгологически чистых культурах Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda. Spirulina sp., аксеничных культурах синезеленых - Anabaena variabilis, Nostoc rouscorum, Osclllatoria sp. и зеленых Ch. vulgaris, s.quadricauda, Chlamydomonas gyrus и на бактерии Bacillus subtilis и природном фито-и бактериопланктоне.

Протеолитическую активность определяли методом, основанным на изменении поляризации флуоресценции меченого флуоресцентным красителем флуоресцеинизотиацианатом (ФИТЦ) . белка-иммуноглобулина G (IgG-ФИТЦ) под воздействием протеаз, выделяемых в среду микроорганизмами (Савицкий, 1987). Воду с культурой водорослей, бактерий, фито-и бактериопланктоном фильтровали через мембранные фильтры и, таким образом, получали безбактериальный фильтрат и фильтрат с бактериями. Затем в сообщество фито-и бактериопланктона, водорослей, бактерий и безбактериальный фильтрат добавляли IgG-ФИТЦ (концентрация 1,25 мкг/мл), который при наличии протеаз гидролизовался. Для определения наличия протеаз на повехности клеток водорослей; фермент смывали с фильтров баратным буфером и добавляли IgG-ФИТЦ. Пробы с IgG-ФИТЦ инкубировали в течение 3 ч (анализ проводили через каждый час). Измерение поляризации флуоресценции меченого белка осуществляли на TDX-анализаторе (фирма ABBOTT. США).

В бактериально чистых культурах водорослей постоянно осуществляли контроль за наличием в среде гетеротрофных бактерий. Для этого в культуральную жидкость добавляли мясо - пептонный бульон (МПБ) и инкубировали в термостате в течение 1 суток при

о

температуре 25 С. Помутнение МПБ указывает на присутствие бактерий.

Гетеротрофную активность микроорганизмов определяли по включению в клетки меченых радионуклидами органических веществ. Для этого в склянкй с микроорганизмами добавляли меченые низ-ко-и высокомолекулярные соединения с таким расчетом, чтобы в 1 мл воды было около 100 тыс.имп/мин и экспонировали в течение 4 часов. После экспозиции содержимое склянок делили на водорослевую и бактериальную фракций, фильтровали через мембранные фильтры и подсчитывали их радиоактивность на сцинтилляционном счетчике "йасКЬега 1217" (фирма 1КВ, Швеция). Для определения сорбции метки на клетках водорослей и бактерий, последних убивали формалином, после чего добавляли соответствующее количество меченого органического вещества и определяли их радиоактивность.

Результаты и их обсуждение Методические опыты. В данной главе представлены результаты экспериментов по изучению количества прижизненных выделений РОВ фитопланктоном (Садчиков, Френкель, 1990а). В методических опытах определялась степень очистки пробы от со^в зависимости от характера и способа барботации. Показано, что барботация пробы воздухом (при рН 2,8-3,0) в течении 30 мин практически полностью удаляет СО^; величина активности пробы в конце эксперимента снижается до фоновых значений. Длительное хранение меченого РОВ (до 15 суток) возможно в сцинтилляцион-ной жидкости, при фиксации пробы формалином и в замороженном

виде.

Опыты по изучению сорбции мембранными фильтрами меченой соды, аминокислоты и белка показали, что фильтры на целлюлозной основе (Сынпор) в 1,5-2 раза больше сорбируют метвд 14

№Н С03). чем фильтры на лавсановой основе (производство

в г. Дубне Московской обл.) (Садчиков, Френкель, 19906). При

"отмывании" фильтров в парах кислоты и на бумаге смоченной 0.1

4к

НС1 удаляется только 22% сорбированной НаН С03, которая не смк

вается даже в сцинтилляционной жидкости. На фильтре "Сынпор"

14

сорбируется около 4% внесенной в среду С-глутаминовой кислоты и около половины меченого белка, которые не смываются дистилли рованной водой.

Усовершенствована методика определения' протеолитическо активности в водных экосистемах методом поляризации флуоресценции для ее использования в гидробиологических исследованиях. По величине поляризации флуоресценции моямо судить об изме нении размеров молекул в процессе их ферментативного расщепления. Суть метода заключается в том, что в анализируемую пробу добавляется иммуноглобулин С (^О, меченый флуоресцентным кра сителем флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). ■ и на приборе "ТОХ-анализаторе" анализируется поляризация флуоресценции. По действием ферментов-протеаз происходит деградация белк 1вС-ФИТЦ, которая и регистрируется на приборе. Данный мето позволяет с большой точностью определять скорость ферментатив ных процессов в водных экосистемах. Время одного измерения около 1 мин. а коэффициент вариации результатов не превышае 5-10%.

Динамика продуцирования органического вещества фитопланктоном с учетом внеклеточных выделений РОВ. Автохтонное РОВ

поступает в среду в виде прижизненных и посмертных выделений различных организмов, и в первую очередь водорослей. У водорослей этот процесс протекает не только днем, но. и ночью. По данным ряда авторов (сводка в книге В. В.Бульона, 1983) эти величины достигают 50% и более от включенного при фотосинтезе углерода. По нашим данным в поверхностном слое Можайского водохранилища (1987г.) экскреция органического вещества фитопланктоном осуществлялась в течение суток, включая сумерки и ночное время. В разное время суток водоросли выделяли в среду 2-98% от включенного при фотосинтезе углерода; минимальные (относительные) значения наблюдались днем, тогда как ночью, в утренние и вечерние часы - наоборот, максимальные (рис. 1). Значительная часть ^ внеклеточных выделений поступает в среду с 20 ч вечера и до 8 ч утра; на это время приходится от 30% до 70% суточной внеклеточной продукции. В среднем за сутки водоросли Быделяли в среду 17-43% от включенного в клетку углерода. Так как внеклеточные продукты в основном представлены легкоусвояемыми компонентами РОВ (Максимова, Горская, 1980; Там-биев, Кирикова, 1981), то фитопланктон круглосуточно "подкармливает" микроорганизмы своими метаболитами.

На долю водорослей размером до 20 мкм приходилось 23% суточной продукции; на долю средней фракции-,(20-50 мкм) - 4%. Сетной фитопланктон (размер более 50 мкм ) продуцировал основную массу органического вещества; на его долю приходилось 73% суточной продукции.

Потребление низкомолекулярных органических соединений фи-то-и бактериопланктоном. Исследования, проведенные в 1987 г. на мезотрофном Можайском водохранилище, показали, что водоросли и бактерии потребляли низкоколекулярные органические вещества (в

«кгС/л'4 200-1

20 ишь 128? г,

вре;:я с;

о-ч ч-з S4Z Û-16 itio 20-14 ' (часы)

Рес. I. Суточная дпкагджа o6z& (внутрм: внеглего^ продукт::; учасгле групп водоросле

продуцировавши органического вещества îiozaiic зодохр^пглыза (I9S7 г.) зшгрйховако - вцугршше гочяся продуздхе

fggj)- водоросли pa3-:epo;j до 20 иш:

I - водоросли размером 20-50 т.!

)- водоросли раз~ерэи более 50 1:кц

)- внеклеточная продукция

О-

частности, меченую по С глутаминовую кислоту) в течении суток, как ночью, так и днем. Причем, фитопланктон включал в свои клетки аминокислоту более интенсивно, чем бактерии; на его долю приходилось 60-71% потребленного микроорганизмами РОВ.

Потребление органического вещества водорослями в течении суток протекало неравномерно; в одних случаях значительная ее часть включалась в клетки в утренние и вечерние часы, в других - днем. Среди водорослей наибольшей гетеротрофной активностью обладала фракция размером до 20 мкм, на долю которой приходилось 54-66% потребленного фитопланктоном органического вещества.

Биомасса фитопланктона не всегда являлась определяющей в соотношении потребления РОВ водорослями и бактериями. Гетеротрофная активность фитопланктона в значительной степени определялась присутствием в его составе мелких; форм водорослей (наннопланктона); чем больше было последних, тем интенсивнее фитопланктон потреблял РОВ.

В августе во время интенсивного развития фитопланктона наблюдалась не только высокая активность водорослей (фотосинтез и потребление РОВ), но и бактерий. В это время гетеротрофная активность последних была в 5-15 раз выше, чем в другое

* „ <чп

время сезона. В августе продукция бактерии, измеренная С-ме-тодом (Романенко, Кузнецов, 1974), была в 17-27 раз выше, чем в июне и июле. То есть, потребление бактериями органического и минерального углерода находилось в прямой зависимости.

В потреблении органического вещества бактериями в течении суток не наблюдалось сколь-либо заметной закономерности; в одних опытах основная масса аминокислот потреблялась с 12 до 20 часов, в других - в 20-24 ч или днем - 8-12 ч. Однако можно

- и -

отметить, что пики гетеротрофной активности бактерий и водорослей в течении суток в какой-то мере совпадали.

В 1988 г. были получены сходные результаты. На долю бактерий мезотрофного водохранилища приходилось от 18 до 61% потребленного в течение суток фито- и бактериопланктоном РОВ (глутаминовая кислота) (рис.2). Бактерии лучше всего потребляли РОВ в первой половине лета, когда в планктоне в основном была представлена крупная фракция фитопланктона (более 50 мкм). В августе и сентябре, когда в планктоне доминировали водоросли размером до 50 мкм, на долю бактерий приходилось 18-21% потребленного в течение суток субстрата.

Фитопланктон мезотрофного водохранилища и эвтрофного пруда в течении суток потреблял от 39 до 82% потребленного микроорганизмами РОВ (глутаминовая кислота и гидролизат водорослей). Причем, основную массу органического вещества потреблял наннопланктон; в опытах с гидролизатом на его долю приходилось 80-94% потребленного фитопланктоном субстрата, а - с глутамино-вой кислотой - 56-92%.

Сезонные наблюдения (в 1988 г.) за потреблением меченой глутаминовой кислоты фито- и бактериопланктоном Можайского водохранилища показали, что фитопланктон почти на треть лучше ее использовал, чем бактерии. По-видимому, одной из причин этого является низкая численность бактерий, т.к. в данном случае расчет шел на абсолютные показатели без учета численности и биомассы этих микроорганизмов в водоеме.

В потреблении органического вещества водорослями наблюдалось несколько пиков: в июне при низкой биомассе фитопланктона и в августе при снижении его биомассы. По-видимому, это связано с тем. что в начале лета несмотря на небольшую биомассу во-

дорослей наблюдалось большое их разнообразие; в планктоне присутствовали зеленые, диатомовые, пирофитовые, синезеленые и др., среди которых всегда найдутся группы испытывающие недостаток в данном субстрате. Кроме того, в это время водоросли прижизненно выделяли в среду относительно большое количество РОВ (Садчиков. Козлов, 1993), которое могло стимулировать гетеротрофную активность не только бактерий, .но и водорослей. Что и наблюдалось. В августе снижение биомассы фитопланктона происходило в основном за счет отмирания наннопланктона. тогда как крупные формы (в основном Сегаиит МгакИпеПа) сохраняли свою численность. Кроме того, в августе снижение численности одних* групп водорослей происходило параллельно с развитием других, а как известно, в этот период физиологическая активность резко возрастает.

Удельная гетеротрофная активность наннопланктона была в 10-50 раз выше сетного фитопланктона (размер более 50 мкм). Пики гетеротрофной активности наннопланктона приходились на период низкой биомассы водорослей (июнь) или начало развития фитопланктона (июль, август). Наибольшие значения гетеротрофной активности бактерий наблюдались в июне, а наименьшие - в августе-сентябре. В первой половине лета их удельная гетеротрофная активность была в несколько раз выше,, чем в другое время сезона.

Проведенные исследования показали, что. фитопланктон обладает высокой гетеротрофной активностью и при достаточно высокой его биомассе может создавать конкуренцию бактериям в потреблении низкомолекулярных органических веществ.

Потребление фито- и бактериопланхтоном высокомолекулярных органических соединений. В природных водоемах значительная

часть РОВ представлена высокомолекулярными соединениями (Кузнецов, 1970), потребление которых требует предварительного гидролиза экзоферментами. Как было показано выше водоросли активно потребляли низкомолекулярное РОВ, однако не совсем ясно как они будут реагировать на поступление в среду высокомолекулярных соединений (в частности, белков).

Исследования, проведенные в небольшом пруду, расположенном на территории ботанического сада МГУ, показали, что фито- и

4ц

бактериопланктон потребляет как аминокислоту ( С-глутаминовая

3 *

кислота), так и белок ( Н-альбумин), причем количество включенной в клетку метки чаще всего зависит от развития этих микроорганизмов и в первую очередь бактерий. Белок наиболее активно включался в клетки бактерий и водорослей при отмирании фитопланктона в конце июня и начале августа (Садчиков, Козлов, Ско-беева,1982); поступление в среду органических веществ стимулировало гетеротрофную активность организмов. При интенсивном развитии водорослей в июле потребление органических веществ было минимальным.

Общая картина потребления белка водорослями и бактериями была сходной (рис.3); различие состояло лишь в небольшой временной сдвинутости этих процессов. Бактерии быстрее реагировали на отмирание фитопланктона, чем водоросли; гетеротрофная активность у них протекала интенсивнее, чем у фототрофов. В среднем за сезон на долю бактерий приходилось 65% потребленного микроорганизмами меченого альбумина (на долю водорослей - соответственно 35%). В течение всего летнего сезона бактерии больше, чем водоросли потребляли меченый белок (рис.3). При потреблении белка на долю водорослей в среднем за сезон приходилось 35% от общего потребления его микроорганизмами, а в отношении акино-

усл.ед./ч

ор2-

ооч Н

июнь

июль

| август 1 3»

Рис. 3. Сезонная динамика потребления белка (^1-бычш сывороточный альбукш:) бактериопланктоком (I) а йзтояяаяк-тонои (2) пруда, расположенного ка территории ботанического сада МГУ

к

ф

п

о

5. 58р;.:е::таггзная (I) л гетсрогро^гл (2) ЫИПЗЕООТЬ культуры ЗасШив виЪьШа 3 - схвавкосгь безби?терц:л1>-

хислот - несколько выше - 44%. В отдельные.периоды вегетацион-;Юго сезона водоросли в несколько раз больше потребляли глута-яшовую кислоту, чем бактерии.

Полученные результаты показали, что фитопланктон потреб-пял аминокислоту лучше или наравне с бактериями, тогда как бе-пок в основной массе утилизировался бактериями.

Ферментативная и гетеротрофная активность бактерий и во-цорослей. В природных водоемах основная масса РОВ представлена высокомолекулярными соединениями, тогда как через клеточную стенку микроорганизмов могут проникать только небольшие молекулы. Поэтому крупные соединения должны быть предварительно гидролизованы экзоферментами. В гетерогенных системах (почвах, илах, а в водной толще - на поверхности детрита) выделенный в среду фермент локализован в непосредственной близости от клетки, а продукты гидролиза субстрата сразу же потребляются этими организмами (Купревич, Щербакова, 1966; Хазиев, 1976). В толще воды (гомогенная система) наблюдается иная картина; фермент выделенный в среду одной группой организмов, как образно отмечено в работе А.X.Тамбиева (1964), поступает в копилку РОВ водоема. Продукты гидролиза потребляются всей биотой независимо от того могут они или наоборот не могут экскретировать в среду лити-ческие ферменты. То есть, несмотря на неодинаковую способность организмов выделять в среду экзоферменты многие из них (а это бактерии, водоросли, грибы, одноклеточные и,. по-видимому, многоклеточные животные) способны потреблять .низкомолекулярные соединения, что и было показано многими исследователями ( сводка в обзорах Ю. И. Сорокина, 1973; Б. Л.Гутельмахера, А.П.Садчико-ва, Т.Г.Филипповой, 1988). А скорость потребления РОВ организмами во многом зависит от их физиологических возможностей, кон-

центрации органического вещества в среде, многих биотических и абиотических факторов.

Потребление органического вещества бактериями и водорослями вызывает резонный вопрос о способности этих групп микроорганизмов выделять в среду литические экзоферменты и о взаимосвязи этих процессов с их гетеротрофной активностью. Чтобы ответить на некоторые из этих вопросов и был проведен_ряд экспериментов с природным фито-и бактериопланктоном и лабораторными культурами водорослей и бактерий.

Исследования на природном водоеме показали, что в воде присутствуют протеазы, которые гидролизуют белок до его составляющих; последние потребляются как бактериями, так и водорослями. Ферментативные процессы протекают в присутствии природного сообщества фито-и бактериопланктона, одних только бактерий и в профильтрованной ("чистой") воде. Способность "чистой воды" к ферментативному гидролизу белка указывает на наличие экзопроте-аз в свободном состоянии. На долю фильтрата приходится 76% от ферментативной активности воды, в которой .находится природное сообщество фито-и бактериопланктона. Показатели ферментативной активности воды с одними только бактериями практически совпадают с аналогичными результатами воды с фито-и бактериопланктоном, что указывает на доминирующую роль бактерий в ферментативных процессах. Пики гетеротрофной и ферментативной активности фито-и бактериопланктона совпадали, что опять же подчеркивает взаимосвязь этих процессов. То же самое наблюдали и в альголо-гически чистых культурах Scenedesmus quadricauda (рис.4), Chlorella vulgaris, Spirulina sp. и бактерии Bacillus subtilis (рис. 5). На долю "чистой" культуральной жидкости В.subtilis приходилось 69% протеолитической активности среды, в которой

Рес. 4. аерг-знтатизноя п гетеротрофная активность аль-ГОЛОГПЧеСКП 4HCTÍS: культ^ф Scenedesisus quad-ricauda

1 - бэр^епгагпглся сеззвность еообщеогва водо-

рослей i:

2 - сер.:эптатпзная: аптпзпоотъ сощтсхвутнг:

баптерпп

о - фгриентатлзная гатпзпость бегбаг.терпг.льного йпльтрата

4 - гетеротрофная активность водорослей

5 - гетеротрофная активность сопутствующий

бантетпн *

находились эти бактерии. У водорослей (Splrullna sp., S. quadricauda, Ch.vulgaris) аналогичные показатели составляли соответственно 94%, 75%, 50%. Наличие ферментов в свободном состоянии дает возможность утилизировать продукты гидролиза субстрата всеми присутствующими организмами, как бактериями/ так и водорослями. Так как в культурах водорослей находились бактерии (а их численность была в пределах 1-5 млн.кл/мл), в этих опытах трудно установить источник продуцирования эк-зопротеаз. Это могут быть как бактерии, так и водоросли, тем более , что результаты ферментативной активности водорослей (вместе с бактериями) выше, чем одних только бактерий. То есть, складывается впечатление, что и водоросли вносят свою долю экзоферментов в их общее количество. Однако если учесть, что при отфильтровывании водорослей возможно частичное удаление бактерий (особенно конгломератов), детритно-бактериальных ассоциаций, то это приводит к заниженным ¡результатам ферментативной активности бактерий. Если предположить такой вариант, то результаты ферментативной активности сообщества водорослей и бактерий и одних только бактерий должны быть несколько ближе, чем представлено на рисунке 4.

Необходимо обратить внимание и на другой факт; в культуре В.subtllls (рис.5) гетеротрофная активность предшествует ферментативной активности, тогда как у водорослей (в частности у S.quadricauda), (рис. 4) она идет с опозданием на несколько дней. Эти косвенные данные указывают на то, что водоросли как бы ждут появления с среде легкоусвояемых компонентов и уже тогда начинают их потреблять.

Далее возникает вопрос, а выделяют ли экзопротеазы сами водоросли? Эксперименты с бактериально чистыми культурами

Anabaena variabilis, Hostoc muscorum, Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda, Chlamydomonas gyrus показали, что эти водоросли довольно хорошо потребляют меченую аминокислоту, однако экзопротеазы не выделяли (то есть. Ферментативная активность среды с водорослями, на поверхности клеток и в фильтрате не наблюдалась). Исключение составляли опыты с N. muscorum, о которых речь пойдет„ниже. Некоторые виды водорослей культивировали в течение трех недель; во всех случаях водоросли обладали гетеротрофной активностью (то есть, потребляли меченую аминокислоту), однако в культуральной жидкости ферментативные процессы не наблюдались.

Учитывая, что экзоферменты в основном являются индуци-бельными (то естьвыделяются в среду при появлении субстрата), некоторые виды водорослей культивировали в присутствии белка. Показано, что и в этом случае протеолитическая активность в бактериально чистых культурах водорослей не наблюдалась. Внесение белка в среду не влияло на потребление глута-миновой кислоты, что еще раз указывает на отсутствие протеоли-тической активности у перечисленных выше видов водорослей. При заражении культуры водорослей бактериями (что произошло на 25 сутки культивирования A.variabilis и N. muscorum), в среде в этот день наблюдался ферментаивный гидролиз белка.

В опытах с N.muscorum ферментативный гидролиз белка наблюдался на поверхности колоний (начиная с 5-х суток культивирования). В культуральной среде с водорослями и в фильтрате этого явления не наблюдалось. Мы связываем ферментативную активность на поверхности колоний N.muscorum с деятельностью симбиотических бактерий, погруженных в слизь этой колониальной водоросли.

В природных условиях водоросли обитают совместно с бактериями и в этом случае возможна "помощь" со стороны последних в ферментативном гидролизе белков и совместном потреблении низкомолекулярных соединений. Добавление фильтрата В.subtilis в культуры A. variabilis и S. quadrlcauda приводило к появлению в среде ферментативных процессов и увеличению гетеротрофной активности водорослей. У зеленой водоросли она возросла в 2 раза, а у синезеленой - в 7 раз. Добавление фильтрата водорослей в культуру В.subtilis практически не влияло на ферментативную активность бактерий; гетеротрофная активность в одном случае (фильтрат Scenedesmus) не изменялась. а в другом (фильтрат Anabaena) - уменьшилась в 9 раз..В аналогичных опытах с использованием меченых аминокислот, пептида. белка наблюдалась такая же картина; гетеротрофная активность бактерий практически полностью ингибировалась, тогда как ферментативный гидролиз белка в культуральной жидкости оставался на уровне контроля. Эти эксперименты показывают, что фильтрат синезеленых содержит вещества отрицательно влияющие на включение в клетки бактерий низкомолекулярных соединений - продуктов ферментативного гидролиза белков. При этом снижение протеолитической активности в культуральной среде бактерий не происходит. Зеленая водоросль не оказывает никакого влияния на гетеротрофную и ферментативную активность бактерий. Во всем этом есть определенный экологический смысл, что и будет рассмотрено ниже.

Исследования с использованием меченых аминокислот и белка показали, что В.subtilis хорошо потребляет эти соединения. Аксеничные культуры зеленых и синезеленых водорослей потребляли только аминокислоту. Таким образом, безбактериаль-

ные культуры водорослей белок не потребляли, что подтверждает предыдущие эксперименты о неспособности ими выделять в среду экзопротеазы.

Таким образом, основная роль в ферментативном гидролизе РОВ (имеется ввиду белок) принадлежит бактериям, тогда как аминокислоты потребляются как бактериями, так и водорослями. Однако такой тип взаимоотношений вряд ли эффективен для жизнедеятельности бактерий, хотя нельзя не исключать и своеобразный симбиоз между сообществом водорослей и бактерий; водоросли "подкармливают" бактерии своими прижизненными выделениями, а бактерии "помогают" им гидролизовать большие молекулы до простых соединений, способных проникать через клеточную мембрану.

Рассмотрим более подробно одну из версий, которая в какой-то мере позволяет объяснить механизм взаимоотношений водорослей и бактерий.

Выделение фермента бактериями определяется наличием в среде субстрата. В его присутствии происходит гидролиз и идет накопление низкомолекулярных продуктов, которые и потребляются микроорганизмами. Повышение их концентрации выше какого-то определенного порога приводит к блокировке синтеза и, соответственно, выделения фермента. Таким образом, организм контролирует секрецию фермента и прекращает^ его бесполезный синтез. Обладая высокой удельной поверхностью, бактерии могут потреблять органические вещества при более низких концентрациях, чем водоросли (Wright,Hobble. 1965). ■ Поэтому они должны поддерживать очень низкие концентрации конечного продукта, ниже порога потребления этого вещества водорослями. Для того, чтобы повысить концентрацию продукта до необходимой фототро-

фам, последним вероятнее всего необходимо каким-то способом блокировать проникновение в бактериальные клетки продуктов ферментативного гидролиза субстрата. В этом случае скорость ферментативной активности бактерий будет оставаться на прежнем уровне, а продукты гидролиза будут накапливаться в среде. Такой механизм взаимоотношения водорослей и бактерий вполне возможен, тем более, что удалось показатьчто фильтрат сине-зеленой A.variabilis приводит к снижению потребления В.subtilis меченых аминокислотой в 9 раз, тогда как протеоли-тическая активность практически не изменялась. Фильтрат зеленых Ch.vulgaris и S. quadrlcauda не оказывал такого воздействия на бактерий. Известно, что многие синезеленые являются ингибиторами развития бактерий, так что вполне вероятен описанный выше механизм воздействия этих водорослей на бактерий. Между зелеными водорослями и бактериями в природных условиях не наблюдаются такие явные антагонистические взаимоотношения, что и подтверждают описанные выше эксперименты.

ВЫВОДЫ

1. Фитопланктон мезотрофного и эвтрофного водоемов потреблял низкомолекулярные органические вещества (аминокислоты, гидролизат водорослей) лучше, чем бактериопланктон: в течение суток на его долю приходилось 39-82%, а в течение летнего сезона - 52-71%. Наибольшей гетеротрофной активностью обладали фракции водорослей размером до 20 мкм и до- 50 мкм; на их долю приходилось соответственно 54-66% и 56-94% от потребленного фитопланктоном РОВ.

2. Удельная гетеротрофная активность фитопланктона мезотрофного водоема размером до 50 мкм была в 10-50 раз выше, чем более крупной фракции водорослей, а бактерий - еще боль-

ше. В природных водоемах около 80% низкомолекулярных соединений (аминокислоты, гидролизат водорослей) потреблялось бактериями и водорослями размером до 20 мкм. ..

3. В культурах самая мелкая по размеру водоросль Chlamydomonas gyrus потребляла меченую аминокислоту в 19-58 раз лучше, чем более крупные зеленые и синезеленые водоросли, а бактерия Bacillus subtilIs утилизовала это соединение в 50 раз интенсивнее, чем С.gyrus.

4. Высокомолекулярные органические соединения (на примере белка) бактериопланктон мезотрофного водоема потреблял в среднем на 20-50% больше, чем водоросли; интенсивность потребления меченого белка связана с протеолитической активностью водных экосистем. ; ;

5. С помощью впервые примененного в гидробиологических исследованиях метода определения протеолитической активности с использованием поляризации флуоресценции показано, что в природных водоемах протеолитическая активность протекает не только в присутствии фито- и бактериопланктона, но ив профильтрованной воде. На долю фильтрата приходится 76% от протеолитической активности сообщества фито-и бактериопланктона; в культурах водорослей (Scenedesmus quadricauda, Chlorella vulgaris. Splrulina sp.) и бактерии В.subtilis этот показатель составлял соответственно 75%, 50%, 94% и 69%. Наличие протеаз в свободном состоянии дает возможность потреблять продукты гидролиза субстрата всеми присутствующими микроорганизмами, как бактериями, так и водорослями.

6. В бактериально чистых культурах некоторых зеленых (С.gyrus, 'Ch.vulgaris, S.quadricauda) и синезеленых (Anabaena variabilis, Oscillatoria sp.) протеолитическая активность не

наблюдалась. Они потребляли только низкомолекулярные соединения (меченые аминокислоты, дипептид); меченый белок (иммуноглобулин) не включался в их клетки. В культуральной среде В. subtilis наблюдался ферментативный гидролиз белка и происходило потребление бактериями как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных органических соединений!

7. При заражении аксеничных культур.зеленых и синезеле-ных водорослей бактериями (В.subtilis) в среде наблюдалась протеолитическая активность и происходило потребление меченого белка водорослями.

8. Добавление фильтрата В.subtilis к аксеничным культурам A.variabilis и S.quadrlcauda приводило к появлению в среде водорослей протеолитических процессов и увеличению их гетеротрофной активности - зеленой в 2 раза,; синезеленой - в 7 раз.

9. Добавление фильтрата водорослей к В.subtilis не влияло на ее ферментативную активность: гетеротрофная активность бактерий в одном случае не изменялась (при: добавлении . фильтрата S.quadricauda), а в другом - (при добавлении фильтрата A. variabilis) уменьшалась в 9 раз. Это указывает на то, что выделения синезеленых отрицательно влияют на потребление органических веществ бактериями.

СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертации

1. Садчиков А.П., Френкель О.А. Прижизненное выделение растворенного органического вещества фитопланктоном (методические аспекты)// - Гидробиол. журн.. 1990а, т. 26, N 1, с. 84-87.

2. Френкель O.A.. Садчиков A.II. Прижизненное выделение органического вещества фитопланктоном - один из показателей состояния экосистемы. - Тез. докладов Всес. конф. "Методика экологического нормирования", Харьков, 16-20 апреля 1990 г., ч. II "Проблемы оценки антропогенного влияния на экосистемы", Харьков. 1990, с. 70.

3. Ануфриев В.А., Садчиков А.П., Френкель O.A. Суточное изменение физиологической активности водорослей и бактерий. -Матер. 6 науч. конф. молодых ученых Казан, ин-та биол. Казан, филиала АН СССР, - Казань, 1990 - с. 233-235. Деп. в ВИНИТИ 20.02.90, N 1014-В90.

4. Френкель O.A., Садчиков A.n., Еремин С.А. Ферментативная и гетеротрофная активность водорослей и бактерий. -Тез. 6-й Ростовской научно-пркладной школы-семинара 10-14 сентября 1990 г. в Ростове-на-Дону. - "Механизмы адаптации животных и растений к экспериментальным факторам среды", 1990, т.1. с. 164-165.

5. Садчиков A.n., Френкель O.A. Сорбция меченых соединений мембранными фильтрами// - Информ. бюлл. Биология внутренних ВОД АН СССР, 19906, К 89, с. 81-83.

6. Садчиков А.П., Френкель O.A.. Скобеева Т.Н. Ферментативная и гетеротрофная активность водорослей и бактерий// -Гидробиол. журн., 1992, т. 28, N 6. с. 51-55.

7. Садчиков A.n., Френкель O.A., Дмитровский Л.Г., Еремин С. А. Ферментативная и гетеротрофная активность водорослей и бактерий при потреблении меченых аминокислот, дипептида и белков// - Гидробиол. журн., 1993, т. 29. N 3. с. 71-76.

8. Садчиков А.П., Френкель O.A. Влияние концентрации белка на протеолитическуй активность бактерий (на примере

Bacillus subtllis)// - Гидробиол. зкурн., 1993, т. 29, N 4. с. 81-85.

9. Садчиков А.П., Френкель O.A. Суточная динамика продуцирования органического вещества фитопланктоном (с учетом внеклеточных выделений РОВ)// - Гидробиол. журн. (в печати).

10. Садчиков А.П., Френкель O.A., Еремин С.А. Определение ферментативной активности в водных„экосистемах методом поляризации флуоресценции.// - Гидробиол. журн. (в печати).