Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антигенные детерминанты продуктов гена env вируса иммунодефицита человка типа I, синтезируемых в бактериях Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Антигенные детерминанты продуктов гена env вируса иммунодефицита человка типа I, синтезируемых в бактериях Escherichia coli"

; 0 л " гГ

I "

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. ИВАНОВСКОГО

СЕРГЕЕВ Олег Витальевич

АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРИШНТЫ ПРОДУКТОВ ГЕНА env BliPyCA ЖМУНОДЕФИШГГА ЧЕЛОВЕКА ТИПА I, СИНТЕЗИРУЕМЫХ Б БАКТЕРИЯХ escherichia coli

Специальность 03. 00. 03 - молекулярная биология

Автореферат

Москва - 1292 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте

вирусологии им. Л И. Ивановского РАМЕ

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук М. М Гар^ев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ;

доктор б»оло1'ическик наук А А- Кущ доктор медицинских наук Г. Р. Мацевич

ЬВДУЩЕЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

Центр молекулярной диагностики Минздрава РСФСР

на заседании Специализированного Совета Д 001. 20. 01 при НИИ вирусологии им. Л И. Ивановского РАМН (123(398, Москва, Д-98, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ виру-си логин им. Д. И. Ивановского РАМН.

Ученый секретарь Специализированного Совета

Защита диссертации

Автореферат разослан

кандидат медицинских наук

А. М. Жуковский

Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ I) является этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СГЩД) - тяжелого расстройства иммунной системы, сопровождающегося развитием оппортунистических инфекций и иеонластическкх образований, неизбежно приводящих к. летальному походу.

В настоящее время-в число основных задач медицинской вирусологии входят создание эффективных тест-систем, позволяющих своевременно выявлять больных и вирусоносигелей, и разработка подходов к созданию анти-ВИЧ-вакцины. • Так как домен наружного оелка вириона, отвечающий за образование вирус-нейтрализущих антител в высоких титрах, представляет собой гипервариабельную последовательность и эти антитела обладают типовой специфичностью, аффективной может предполагаться вакцина, содержащая главный нейтрализующий домен нескольких вариантов вируса. Поя-ышшиьсн в последнее время данные показьшают наличие географической специфичности вариабельных эпитопов поверхностных гли-копротеинов. В связи с этим получение отдельных фрагментов ур1^0 представляет интерес для использования их при типирова-нии ШЧ позитивных сьвороток крови.

Получение препаративных количеств белков вирусных частиц для серологических исследований является, однако, трудоемким, дорогостоящим и небезопасным процессом. Одним из способов преодоления указанных затруднений является конструирование штампов микроорганизмов, способных синтезировать вирусспецифичес-К.И« полипептиды с использованием современных методов генной инженерии. Такие рекомбинантные антигены могут быть использованы но только для создания диагностических препаратов, но также являться основой для получения вакцин и сывороток.

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было получение рекомбинантных плазмид, способных обеспечить синтез рекомбинантных белков, содержащих в своем составе отдельные антигенные детерминанты области е™ ВИЧ-1, исследование антигенных и иымуногенных свойств этих полипептидов,

учение возможности их использования ДЛЯ ЛИЯ ГНОСТИКИ СИПоро к кропи на наличии антител к вирусу, л тпкже для рыяплення тител к отдельным фрагментам gpTßO.

В связи с этим в задачи исследования входило:

L Конструирование рекомбинянтных плазмид, содержащих агмонтн ДНК об.пясти, env, детерминирующих синтез нируссиепи ческих последовательностей.

2. Изучение экспрессии гибридных гглазмид, содержащих нос допательности вирусного генома, в бактериях Е.соН.

3. Исследование иммунологических cboüCtb полученных гиб динх белков, а также возможности их использования дли обнп ■жения антител в смворотках крови вирусонооитэлеЛ.

<5. Использование полученных гибридных белкой дня изучения ¡тителышго ответа ВИЧ-инфицированных лиц и шляп лени л раз ли líi данного ответа в пределах СССР.

Научная новизна работы. В результате проведенной рпбпты т получен набор рекомбинянтных плазмид, содержащих фрагмент ■на env гюд промотором гена В-галактозидязы (1 асZ) в состапе мзмидного вектора pUR290. Анализ экспрессии гибридных плаз 1л. рКС, pR2 pV3jR, рЕЗ, рЕ4 и pFfi позволил установить, что п ж.териях F. coll происходит синтез гибридных ¡юлииентидоп, со фж.зших яирусспецифичяские последовательности в С-конце П га ж-гозидазн. Полученные полипеитиды обладают лнтигенжлщ *ойствами вирусных белков и способны связываться с антителами ВИЧ-Т. Кроме того, антитела, полученные при иммунизации #ц )тнмх этими рекомбинантными белками, способны вапимодеГютво 1ть с белками вирусных частиц.

Гибридные белки, синтезирующиеся в бактериях E.coli, ene являют im менее 15% от тотального белкя клетки и образуют так 13|,!наепые тельца включения, что значительно упрощает их тщетна и очистку для дальнейших исследований.

Практическое значение работы заключается R «юнользмпапии

полученных рекомбинантных белков для изучения антительного отце га ШЧ-инфицированных лиц методом непрямого ИФА.

На защиту выносятся еледукщие положен»«:

1. Сконструированные рекомбинантние плаэмиды рЕХ, рЕ2, рv 3jk , рЕ 3, рЕ 4 и рЕ6, содержащие фрагменты генома ВИЧ-I, детерминируют синтез гибридных белков, способных специфически взаимодействовать с антителами к этому вирусу. Уровень синтеза ¡юкомбшшнтнш лолииептидов составлял не менее 15% от тоталь-цого оелка клетки, и они накапливаются в бактериях E.colt в виде нерастворимых телец включения.

2. Иммунизация кроликов гибридными белками, содержащими антигенные детерминанты продуктов гена env ВИЧ-I, приводит к uO|.vrjohaiiino специфических антител, способных взаимодействовать с патнвными вирусными env-белками.

3. Гекоыбинаитные полипептнды пригодны для создания диагностических тест-систем на антитела к ВИЧ-1.

4. С помощью метода твердофазного имыуноферментного анализа (ИФА) с использованием полученных полипептидов, а также синтетических олигопептидов выявлены различия частоты встреча-mn/ш антител к. фрагментам рекомбшантного gpI60 в сыворотках различного географического происхождения.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Ьсееишиих конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пущине на- Оке, 1990), "Новые методы диагностики СПИД, других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы" (Алушта, 1990), на I болгаро- советском симпозиуме по вирусным инфекциям (Варна, 1990).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Объем работы составляет 133 страницы машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 7 таблицами и 9 рисунками. Список литературы включает

TfSI наименование.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Получение рекомбинантных плазмид, содержащих последова тялыюсти гена nnv ШЧ-1.

Для про падения работы по клонированию последовательностей гена env В1Ч-1 были выбраны два штамма вируса: iii v 111 it и htvorcsf. Выбор штаммов основан на том, что hib и j R с s г про являют существенные различия. Во-первых, 111 В является класои ческим лимфотропным штампом, в то время как. jrcsf обладает выраженным нейротропизмом. Бо-вторьгх, последовать и-иостп области v3 донных штампов значительно различаются.

Б работе в качестве источника ДНК нTLV—11 IB использован» плазмиду рВНТО, любезно предоставленную доктором Р. Гплло (США), сконструированную на основе вектора рSР6-1 с Фрапкчгти ДНК генома вируса размером 8926 пар нуклеотидов. В качество источника ДНК ВИЧ-1 штамма jrcsf использовалась плачмпда pv K--JR с SF, также полученная от доктора Р. Галло.

Для создания конструкций, обеспечивающих экспрессию основных антигенных детерминант ВИЧ-1, локализованных в области env, мы воспользовались векторными плазмидами серии pur '<100 (рис. I). Особенностью векторов этой серии является локализация полилиикерной области в 3'-конце гена lacz, что поз во пет получать гибридные белки,N-концевая часть которых представлена полноразмерной В-галактозидазой, а С-конец - белковыми продуктами клонируемого гена или его фрагмента, причем встраивании этой последовательности можно осуществить во всех трпх ранках считывания, используя разные плазмиды серии pur, а нм-чшч pur 290, pur 291, ptir 292. Выбор этой системы был обусловлен том, что, во-первых, уровень синтеза гибоидных полнпоптидом дог ni-"пот 20 30% от тотального бежа клетки; во-вторых, дяннм* по

296 33 ) 49§ Sil SÇ9 604а.н.

4 ' Xх- i i

Ил1Муни£)им1(МЛ|Г№Й i. ; ! . ! I J

)ЛН1РПЫ ——" 1

вир

шус - HL'Hlft.iMjyiü^ne

1 ЭГМЮНЫ

29В ЭМ 458 484

. i V

! I

616 632 728 751а и

v s \ s J I Ii

418 432 а.н.

Сайг cShjwÍíhhh CiM

V1/2 V3 V4 V5 V6

U К 30 120 200 3Q0 355 511

f j" CÏ.....I ' IJ C2 Г 1 C3|"C4~|C51

l-;>-----------—9pi2ô--------------------—i—

J К 274 465

AIG I I eov i

856

i:

■i il MI 5925 Kpnl

<.<!(.tibi

I

— gp41---— -

640 75/ J_I ~TAA

66©

7Í95 77/5 8055

Bam HI

pE6

PE1

Bglll

IJE2 Bçjl II

(PV3JR) У—

PE3 Hinülll

pE4

t iirUllf

-4 - -4

('ПС. I. Структура шследоватепыюстей gpI20 и gp41 и схема клонирования фрагментов х^ена anv HIV-I-IIIB, кодирующих указанные антигенные детерминанты

лииептиды някаи лпваются в клочках в по растворимо it форме (тещ, ца включения), что существенно облегчает их очистку; в-третьих, молекулярная масса полученных рбкомбинантннх поли пептидов превышает токовую для основной массы белков Г. mil, что существенно для тестирования их в лизятях клеток.

Вирус-специфические последовательности полученных ила:)

Таблица I.

Гибридные полипеитиды, синтезируемые под контролем рекомбинянтньгх нлязшд.

| Расчетная мясоа| Координаты | Нлязмндя| гибридного | последователь - [ Фрч7'мянт qplfifl I

рП

рК2 pV3jR рКЭ pR4

pFA

белка (о) 14.3280

Т40654

Т 40372

13Я257

ИЛ 136

T9BI53

ности gpf60 (як)|

43 - 274 Н-КОНЦ. половина

дрТ20

274 - 465 Области V3 Г.4 qplVM) HIV -1118

270 - 457 Области V3 r,4 qpT20 HI V -<]RC SF

465 - 640 4? С-К.0НЦ. як ррГЙО и 129 N-кони, пк чр41

640 - 056 др41 без N конц. участка

дрТбО без сШЧП ПЬ -43 - 75 J но го пептида и Кб 0--К.ОИЦ. ак. потачка

г.шд, обозначенных pEl, pf2, рЕЭ, рЕ4 и рЕб, кодируют полипептиды, включающие соответственно следующие порции gpI60 HIV —I IIB (таол. I): 43 - 274 аминокислотные остатки (N-концевая половина <jpI2Q); 274 - 465 (участок, содержащий третью вариабельную область штамма HIB); 465 - 640 аминокислоты (47С-концевых аминокислот ур 120 и I29n -концевых аминокислот др "41); 640 - 856 аминокислоты (основную часть др 41) и 43-751 (последовательность ур 160 без 13 N-концевых остатков gpI20 и 105 С-концевых . ур 41). Шшзмида pV3jr кодирует полипептид, содержащий фрагмент др 120 H1V-JRCSF с координатами 270 - 457 аминокислоты, который включает третью вариабельную область указанного штамма

( ТаОЛ. I).

Таким образом, был получен набор плазмид, содержащих последовательно расположенные фрагменты гена env, которые образуют в совокупности практически полную последовательность гена. Наряду с этим получена плазмида, которая имеет в своем составе цельную последовательность гена без 538 пар нуклеотидов, расположенных в 3'- концевой области.

Изучение экспрессии вирус-специфических последовательностей в составе полученных плазмид в бактериях е.coli.

Экспрессия фрагментов области env в клетках Е. coli в составе данных плазмид была изучена методом электрофореза в 610% иолиакриламидном геле с последующей окраскою геля Кумасси к250. результаты представлены на рис.2. Как видно из представленных результатов, в лнзатах бактерий Е. coli HBIQI, трансформированных плазмндами pv3JR и рЕ1-4, помимо мажорной полосы, соответствующей В-галактозндазе (молекулярная масса 115 кД), присутствуют дополнительные полипептнды с молекулярной массой, соответствующей расчетной: 138-143 кД (рис.2, треки б-в). В контрольном препарате лизата бактерий Е. coli HB IOI/pUR 290 аналогичные поли' )птиды отсутствуют (рис. 2, трек а). В ли-

затэх бактерий Е. colt ИВ 101, содержащих гибридную плпчииду рЕ6, присутствуют дополнительные нолшюптидм с молекулярной массой от J85 до 130 кД (рис. 2, трек ж).

Л Г

, -- 200 кД i - 175 ) - 750

ь ^

¿1 »i ' ! - loo

I

а б в г д е ж Рис.2, Электрофоретический анализ лизатов бактерий е. coli HR 101, содержащих рекомбинангкые плазмиды рЕ1(б), рЕ2(в), pv30R(г), рЕЗ(д), рЕ4(е) и рЕб(ж). Трек а (контроль) -лизат клеток Е. coll HBlOI/pUR 290.' Все представленные пробы получены в виде телец включения. Справа - шкапа молекулярных масс (кД), рассчитанная на основе маркерных белков. Окраска геля - по Laßmmll (Кумасси R250).

Синтез гибридных полипептидов высокой молекулярной массы в клетках бактерий, трансформированных получеными плаз мидами, указывает на совпадение рамок считывания гена 1 а с г и встроен ных Biiv-фрагментов и прямую ориентацию последних в каждом случае.

Антигенные свойства полипептидов-продуктов рекомбинантных плаз мид б млн изучены'методом иммуноблота с использованием сывороток ВИЧ-нкфицированннх пациентов. Результаты представлены на рис. 3. Как видно из приведенных данных, белки с молекуляр-

ной ¡.иосой 138-143 к.Д способны специфически взаимодействовать о антителами сывороток крови вирусоносителей с образованием 1юлос (рис.3, треки б--о); при этом в контрольном препарате (рис.Э, трек а), содержащем дизат клеток НВ 101 /рий 290, ана логичные полосы отсутствуют. Полипептиды массою 185-130 кД, оонарушешше в лизатах клеток Е. си) I ,НВЮ1/рЕ-6, также специфически взаимодействуют с антителами крови вирусоносителей ( рис. 3, трек ж).

Представленные результаты свидетельствуют, что синтезируемый рекомбинантныа полипептиды содержат в своем состава чи V специфические последовательности с антигенными детерминантами ВИ'Ы. Существование продукта рШ в виде набора полипел-тидон с молекулярной массой, меньшей расчетной, свидетельству-вероятно, о неспецифическом нротеолизе гибридного.

I

- 175 кД

- 150

- 100

Гио. 3.

а б в где я Анализ белков, содержащих последовательности рекомбн-налтного gр 160, методом иммуноблота. Представленные env-специфическиб белки синтезированы под контролем: рЕ1(б), рЕ2( в), pv3JR(г), рЕЗ(д), ,рЕ4(е) ирБ6(ж). Трек а (контроль) - лизат клеток Е. colt HBlOI/pUR 290. Справа - шкала молекулярных масс (кД), рассчитанная на основе маркерных белков.

лолшшптида - "предшественника", который, скорее всего, идет по нескольким сайтам при условии равной вероятности их протео-лиза. С протеолитическим нарезанием, возможно, связано при сутствие В-галактозидазы в лизатах бактерий, содержащих любую из гибридных плазмид (белок массой 115 кД, рис.2).

Использование генно-инженерных антигенов ВИЧ-1 для иммунизации животных.

С целью изучения иммуногенных свойств рекомбннантных по -липептидов, содержащих последовательности gpI60, мы иммунизро-вали кроликов белковыми препаратами, л полученными из клеток, которые были трансформированы гибридными плазмидами. Титр антител в сыворотках крови иммунизированных животных определяли методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем фирм Ou Pont И Behring.

Результаты исследования приведены на рис. 4. Как видно из полученных данных, env-специфическпе последовательности в составе рассматриваемых полипептидов обладают низкой нммуноген иостыа титры антител, узнающих ВИЧ-антнгены, через шесть ме сяцев иммунизации составлял: для продуктов рЕ2 и рЕ6 - I: 2000, рЕЗ - 1:1000, рЕТ и рЕ4 - 1:500. Тем не менее, полученные результаты свидетельствуют, что гибридные полипептиды способны не только специфически взаимодействовать с антителами к ВИЧ-1 в сыворотках крови инфицнровачных, но и вызывать образование антител, реагирующих с вирионными белками, при иммунизации ла бораторных животных.

Лабораторный вариант тест-системы определения антител к enV-белкам ВИЧ-1.

Учитывая тот факт, что полученные рекомбинантные шишпеп тпды обладают антигенными и пммуногеннымл свойствами вирусных

1 '2000

1 1000

1 : 500

1 : 100 1 : 50 1 <0

1 £ 3 А 5 6

Рис.. 4. Лпиашнсп титров ВИЧ-специфических антител в сыворотках кроликов, иммунизированных рекомбинэнтными полипептида-пи. Но оси абсцисс указано время (в месяцах), по оси ординат - тигры антител. Стрелками указаны сроки введения эмульсии антигена с полным адъювантом Фройндя. Обозначения иммунизации продуктами:

л - рЕГ, о - рЕ2; а - рЕЗ; а - рЕ4; • - рЕ6

белков, мы изучили возможность их применения в качестве зондо-ьпл антигенов при проведении массового скрининга клинических сывороток крови методом твердофазного имглуноформонтного анализа (ИЬ\), направленного но идентификацию антител к различным антигенным детерминантам дрХбО.

Для щучония донной возможности мы проанализировали 487

образцов сывороток, взятых от больных, вирусоносителей и здоровых доноров, в реакции ИФА с использованием продукта рЕБ (содержит полную последовательность рекомбинантного урКО) в качество зондового антигена. Эти же сыворотки исследовали на присутствие антител к ВИЧ-I, используя иммунофврыентные системы фирм "Organon" и "Du Pont". Было обнаружено, что из 234 сывороток, позитивных в реакции с очищенным вирусным антигеном в названных коммерческих системах ИФА, лишь 3 оказались env-не-гативными в нашей системе. Из 253 образцов, негативных в коммерческих тест-системах, с продуктом рЕб 6 дали позитивную реакцию.

Таким образом, специфичность и чувствительность полученной тест-системы составляют соответственно 97, 6% и 98, 7 %, что позволяет с достаточной точностью устанавливать наличие или отсутствие антител к env-белкам в сыворотках крови при использовании ее для лабораторного исследования сывороток.

Реакция панели env-позитивных сывороток с последовательностями различных областей др 160 HIV-IIIB.

Общее число сывороток, отобранных по содержанию антител к др 160 HIV-IIIB и проходивших дальнейшие исследования , составило 231. Из 231 исследованной сыворотки крови, содержащей антитела к продукту гена env штамма mv -nu, семнадцать сывороток (что составляет 7,4% от общего числа) не проявили специфичности в реакции с каким-либо фрагментом др 160 вируса того же штамма в составе продуктов рЕ1-рЕ4, хотя были позитивными в реакции с продуктом рЕб. В остальных сыворотках удалось выявить антитела к той или иной порции др 160.

Для оценки встречаемости антител к различным фрагментам рекомбинантного др160 мы подсчитали, в скольких процентах исследованных образцов присутствуют антитела к каждой из последовательностей.

- 13 -

Большая часть сывороток: из всех регионов (80% от общего числа) содоринт антитела к N-концевой половине gpl.20, тогда как на С-концввую область gр41 антитела выявлены лишь в 15% всех исследованных образцов. Антитела к. последовательностям, содержащим вариабельный и консервативный иммунодоминантные гшитопы, встречается соответственно в 66% и 62% от общего чис ла исследованных сывороток (табл.2).

Таблица 2.

Доля сывороток в региональных выборках, содержащих антитела к каждому из фрагментов рекомбинантного 9 р.160,

Продукты плаз -МИД И кодируемые ими фрагменты дрГбО | Число образцов и % | от общего числа выборки | Ленинград] Минск | Ростов | Элиста | 6 | 45 | 116 | 64 Обшее число и 23 Г.

¡>Е1 N-конц. gpJ20 | 6(100«) 1 1 | 37(82%)| 1 1 л . _ __I 83( 72%) | _____ _ I 59(92%) 185(80%)

рГ.2 И pV3.1R Области V3 П4 | 4(67%) | 38( 84?) | 1 64(55%)| 1 46( 67%) 752( 66%)

PF3 4P 120/41 | 6(100%) | 34( 76%) | 1 1 64( 55%) | 1 39( 6Т%) 143(62%)

РЕ4 С кони. С)р41 1 К m) | 13( 29%)| 1 1 14(1.2%)] 1 7( ].]%) 35( ГМ)

Примечание. Наличие антител оценивалось в реакции 1К'Л. Разведение сывороток I: 100.

Ночучежшо данные отличаются от результатов других авто

ров, которые сообщают о реактивности свыше 90% исследованных сывороток с последовательностью консервативного иммунодоми-наитного эпитопа, расположенного в й-концевой порции др41.

Представляло интерес рассмотреть типы реактивности сыво роток но каждому из четырех отдельно взятых регионов. Из нее -ледованных 231 сыворотки 6 были получены из Ленинграда, 64 -из Элисты, 116 - из Ростова-на-Дону и 45 - из Минска.

Частота встречаемости в сыворотках антител к последовательностям, несущим иммунодоминантныэ эпитопы УЗ и н-коицевой области др41 (продукты рекомбинантных плазмид рЕ2, рУЗоя в первом случае и рЕЗ - во втором), варьирует в зависимости от происхождения сывороток. Так, доля образцов, дающих реакцию с фрагментом V3-е 4 любого из штаммов, составляет 67, 84, 55 и 72 % для ленинградской, минской, ростовской и элистинской панелей соответственно. По относительно малой встречаемости антител к С-концу др120 и м-концу др41 сходны сыворотки, полученные из Элисты и из Ростова (61% и 55% соответственно). Сыворотки, собранные в Минске, занимают промежуточное положение по расп ространенности антител к области протеолиза между образцами из Ленинграда и южных регионов. Обращает внимание тот факт, что • :реди сывороток, полученных из Минска, с С-концевым фрагментом реагируют 29% (табл.2).

Таким образом, анализ сывороток по их профилю реактивности позволяет обособить образцы, полученные из южных регионов, от остальных исследованных сывороток по относительно низкому содержанию антител, узнающих и ммун о доминантные эпитопы в составе продукта рЕЗ. Отмечаемая особенность, по-видимому, связана с различиями в формировании инфекции южной и северо-западной популяций.

Реакция епу-иозитивиых сывороток с последовательностями уЗ-домена в составе рекомбинантных полипептидов и синтетических олпгопептидов

Как принято считать в настоящее время, ■ для обнаружения иопуляциоиных сходств и различий вариантов вируса наибольшую ценность представляет последовательность УЗ: вследствие ее вариабельности вырабатываемые к ней антитела проявляют высокую типоспецпфичность в серологических реакциях с использованием гомологичных последовательностей штаммов БИЧ-1.

Результаты исследования сывороток на содержание антител к гигифвприлбольпыи последовательностям двух штаммов показали, что из ш<'стн сывороток ленинградского происхождения ни одна не содержит питител, узнающих последовательность УЗ-С4 иIV —1118 (в составе продукта рЕ2); четыре сыворотки дают специфическую реакцию с гомологичной последовательностью Ш \i-JRCSF (в составе рУЗ.ж). Среди образцов, собранных в остальных регионах, встречаются содержащие антитела к данному фрагменту др160 как обоих штампов, ток. и какого-либо ОДНОГО из них.

В сыворотках элистинской панели (общее число 6-1) обнаружены только лво, которые содержат антитела, специфические по отношению к \i3-f.4 ^ я С 5 Г. Вместе с тем, в 29 образцах (46%) присутствуй антитела к. данной последовательности обоих штаммов. В ростовской панели возрастает число образцов с содержащим! ,ик$| специфических антител параллельно с уменьшением сы-1>.ц.пт»к с дв<>пк.он специфичностью ( соответственно 2-1% и 15% обрачцоь). Мне но сывороток., б которых присутствуют антитела, мпгот» только V3-с4 щи, составляет для Элисты 15 (23%), лля ("'остова - (.9 (16:'.').

Л а цьп'чшег! уменьшение относительного числа сывороток со '.»чнифично'-.тью по отношению к Ш В параллельно с увеличением А"пи с|.!иорпГок, содержащих антитела к УЗ-С4 Л?С5Г, наблюдается и образцах из Минска, в которых первые составляют 6 из 45 (13"), а вторые - 15 из 45 (33%). Доля сывороток, проявляющих ач ую оп.чшфичность, в данной на ноли составляет Г/ из У, (ПН-).

- 16 -

Результаты сравнения сывороток на присутствие антител к фрагментам Ч3-С4 двух штаммов приведены в табл. 3.

Таблица 3.

Количество сывороток в разных панелях, содержащих антитела к области УЗ-С4 др160 штаммов 1IIВ и л?С5р (в составе продуктов рЕ2 и руЗлО.

| Число образцов и % от общего числа выборки| Общее

Штамм | . | число

ВИЧ-1 | Ленинград | Минск | Ростов | Элиста | и % | б | 45 | 116 | 64 | 231

111в 1 - I 6 (13%) 1 19 (Ш0| 15(23%) ч ~ ........ 1 40(17%)

лсбр | 4(67%) 115(332)1 28 (24%) | 2(3%) | 49(21/)

111В+ *) | - |1? (38%) | 17 < 15%)I 29(46%) |63(27%)

^СБ? | 1111

Примечание: *) - число и % сывороток, давших позитивную реак-цию как с продуктом рЕ2, так и с продуктом р V3.)н.

Т. о., в панелях сывороток в ряду Элиста-Ростов-Минек о тми -чается уменьшение встречаемости антител, реагирующих с V3 с4 1П8, с одновременным увеличением распространенности УЗ-С 4~Л<С -с пецифических антител.

Рекомбинантные полипептиды, использованные нами в приди дущем исследовании, помимо УЗ содержат области 03, v I и 14, поэтому мы не исключаем участие антител к последним трем доминам в наблюдаемых серологических реакциях. Поэтому диагностическая ценность указанных полнпептпдов представляется более низкой, чем таковая синтетических олнгопептидов. Б связи с этим представляло интерес изучить реактивность сывороток раз-

личного географического происхождения по отношению к олигоиеп тнднм.

В работе были использованы олигопаптнды коммерческой происхождения, соответствующие области УЗ штаммов мн, 111 в(нхв2), г321, НЛ1, гЗ и 26 ( рис, 5), Последовательности у:

¡1! гаммы мм

(сов. Америка/Европа) нхп2

(сон. Аме р! пса /Евро на) /321

(Африка I) «Л»

( Африка I) 7 3

( Африка 2) ?6

(Африка 2)

Аминокислотные последовательности ЙКВ1Н1вРвАГУТТКН

й К - 1 -

- <■ . 5 ..

- « 6 - Н Г

с 5 1 р -

1) Н -.....V 1 Г,

-..РАСО I) . I О

К V ни 1-01. .Я Г, Й 1

Рис. Г). Аминокислотная пос ледовательность синтетически олнгопоптидоп, гомологичных области УЗ штаммов ВИЧ -7, использованных в работе.

укачанных нпмммов являются нрототипннми для большинства вариантов ВПЧ-1. циркулирующих в Кнропо и Северной Америке (1ПВ; НИ), центральной (г321; млО и восточной Африке (гЗ и гб).

22 выпоротки, полученные из Минска, и 74 сыворотки из Ристона и Элисты, которые использовались в данном исследовании, (Миш отобрпнм из числа обрлацов, позитивных как в реакции <: впрпоннымн епу и дад-белками, так. и с продуктом рЬ'Я.

Ппу.льтаты исследования продетанллнм в таблице 4.

Как видно и:) приведенных данных, пнтитолл к. УЗ

НIV-111В ( НХВ2) содержатся в малом числе сывороток, но процент таких образцов в обеих выборках сходный (9% и 12%).

В минской панели существенно выше, чем в ростово-элис-

Таблица 4.

Реактивность сывороток по отношению к УЗ-зпитопам различных штаммов ВИЧ-1 в реакции ИФА.

Происхождение и общее число исслед. сыв-к

Абсолютное число и процент (в скобках) образцов, давших позитивную реакцию с пептидами, гомологичными области уЗ указанных штаммов

мм

НХВ2

Z32I

mal

23

г б

Минск 22

18 (82%)

2

(9%)

8

(36%)

3

(14%)

II (50%)

3

(14%)

Юг России 73

37 (50%)

9

(12%)

12 (16%)

35 (47%)

10 (14%)

40 (54*)

Примечание. Позитивными считались сыворотки, давшие превышение величины сигнала над cutoff в 2 и более раз. Разведение сывороток 1:50.

тинской, доля сывороток, содержащих антитела к v3 hiv-Z3: в перво!4 случае они составляют 50%, тогда как во втором - лишь 14%.

Процент образцов, реагирующих с последовательностями v3 штаммов MN и Z32I, также выше в минской выборке,' хотя в этих случаях разница не столь велика. Так, сыворотки, содержащие антитела к третьей вариабельной области hiv-hn, составляют 82% минской панели и 50% - южнороссийской; содержащие антитела к

- 19 -

V3 HIV-Z32I - 362! и 16% соответственно.

С другой стороны, в ростово-элистинскои выборке по срав-ноию с минской значительно выше процент сывороток, несущих антитела к гипервариабельному донесу HIV-MAL и HIV-Z6 (47% и 34%; 54% и 14% соответственно).

Таким образом, сыворотки минского и ростово-элистинского происхождения обнаруживают существенное различие в реактивности па отношению к последовательности V3 различных штаммов вируса. Наиболее характерной особенностью является преобладание в минской выборке сывороток, реагирующих с последовательностью V3 штаммов, типичных для западноевропейского и североамериканского ротонов; тогда как в ростово-элистинской - дающих реакцию с областью V3 африканских штаммов.

Заключение

Б результате проведанных экспериментов осуществлено клонирование рестрикцнонных фрагментов гона env ВИЧ-I в составе нолилинкериых последовательностей плазмидных векторов E.coli серии pUR с целью получения рекомбинэнтных плазмид: (pFI, рЕ2, |)V3,;r, plvl, рЕ4 и рЕ6), которые способны экспрессировоть гибридные полиноптиды, несущие антигенные детерминанты gpI60.

Исследование полученных полипептидов показало, что они содержат основные антигенные детерминанты gpI20 и др41, вследствие чего способны узнавать вирус-специфические антитела в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных лиц. Иммунизация лабораторных животных данными рекомбинянтными бедками привела к образованию антител, способных реагировать с вирионными антигенами, что свидетельствует об иммуногенности полипептидов.

Так как. было показано, что полученные рекомбннантные по-лииептиды специфически реагируют с антителами к вирусным белкам в сыворотках крови вирусоносителей при использовании их в ипч'пп'пе зондовмх антигенов в 1Ш, на их основе был создан ла-

бораторный вариант тест-системы ИФА для выявления в сыворотках антител к последовательностям gpI60.

В ходе серологических исследований нами была выявлена разная диагностическая ценность различных фрагментов рекомби-нантного др 160; наибольшую ценность представляет полноразмерная последовательность env-продукта. Было показано также значительное сходство образцов ростовского и элистинского происхождения по реактивности сьвороток к различным фрагментам рекомбинантного gpI60 и их отличие от сывороток из Ленинграда и Минска, что отражает особенности эпидемиологического процесса в исследуемых популяциях.

Однако, сравнение данных о распространенности антител к третьему вариабельному домену др 120 различных штаммов ВИЧ -I в зависимости от географического происхождения сывороток, полученных при использовании нашей системы ИФА и системы на основе синтетических олигопептидов, обнаружило большую адекватность последнего подхода для проведения популяциоиного серотипировання.

Выводы

1. Получен набор рекомбинантных плазмид (pEI, рЕ2, pv3ju, рЕЗ, рЕ4 и рЕ6), содержащих фрагменты гена env ВИЧ-I штаммов HIV-llIB и HIV-JRCSF, которые кодируют функциональные домены

ЭР 160.

2. Данные плаэмиды обзспечиваюг в клетках Е. coli штамма hb 101 высокий уровень синтеза рекомбинантных полипептидов, содержащих основные антигенные детерминанты gpI20 и др41 и обладающих антигенными и иммуногенными свойствами белков env в 114 -I.

3. На основе полученных рекомбинантных белков создан лабораторный вариант тест-системы иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления антител к последовательностям gpI60 в сыворотках крови вирусоноситвлей.

- 21 -

4. Показано, что различные фрагменты рекомбинантного <ipI60 в составе полученных полипептидов представляют разную диагностическую ценность: 80% сывороток реагирует с N-концевой половиной gpI2D; 66% и 62% даюгг реакцию с фрагментами, включающими гинервориабельный и константный иммунодоминантные эшпо-иы соответственно; 15% узнают трансмембранную часть gp4I; наибольшее число сывороток (98,7%) реагирует с полноразмерной последовательностью gpI60.

5. Установленные профили реактивности сывороток, собранных в различных географических регионах, коррелируют с особенностями эпидемиологического процесса в исследуемых популяциях.

Список научных трудов по теме диссертации

1. Бобков А. Ф. , Сергеев 0. Н , Шулешш С. Е , Бобкова М. Р., Казеннова Е. В , Гаряев М. М. - "Получение генно-инженерных антигенов дня диагностики ВИЧ-инфекции". Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые методы диагностики СПВД других вирусных п бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы". Алушта, 1990, с. 34.

2. Сергеев 0. В., Бобков А. Ф., Казеннова Е. В., Гараев М. М.

• "Иммуногпнность различных участков белков оболочки вируса иммунодефицита человека". Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии". Путино-на-Оке, 1990, с. fiV-'SR

3. Казеннова Е. В. , Бобкова М. Р., Бобков А. Ф., Сергеев 0. В., JiynnuiBBHM Н. В., Рараев RM. - "Экспрессия фрагмента гена priv ВИЧ-I в клетках бактерий Escherichia coli". "Вопр. виру-сон. ",1991, т. 36, с. 122-125.

■1. Гараев И. М. , Бобков А. Ф., Казеннова Е. В. , Шулешш ('. П., Бобкова М. Р., Лукашевич Н. В., Сергеев 0. В. - "Экспрессия '1р;>гп>штов генома ВИЧ в бактериях". Тезисы докладов 1 болгаро-со-.оток.ого симпозиума по вирусным инфекциям. Варна, Болгария, Г^п, с. 123-124.