Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимические исследования антигенной структуры некоторых диагностически важных протеинов вирусов иммунодефицита человека и вируса гепатита В

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимические исследования антигенной структуры некоторых диагностически важных протеинов вирусов иммунодефицита человека и вируса гепатита В"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

КВЕТКАУСКАЙТЕ РАЙМОНДА ПРАНОВНА

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ

НЕКОТОРЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИ ВАЖНЫХ ПРОТЕИНОВ ВИРУСОВ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ВИРУСА ГЕПАТИТА В

■ (03. 00.04 - Биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Москва 1991

гаоота выполнена в Всесоюзном научном центре молекулярной диагностики и лечения Ш СССР.

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор Е. С. Северин доктор биологических наук ¡а Ю. Венгеров

Официальные оппоненты: доктор химических наук

профессор Ы. И. Титов кандидат биологических наук . А. И. Старов

Ведущая организация: йкститут молекулярной биологии АН СССР

Защита состоится "Р.З •• 1991 г', в часов

на заседании Специализированного совета Д. 053. 05. 3£ при Московском государственном университете по адресу: 119892, г. Москва, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией молеко ознакомиться в библиотеке Биологического факультета ¡¿ГУ.

Автореферат разослан "30 " ОКТЛОрЗ 1991 г.

Ученый секретарь

специализированного совета а Лейкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека ГО-1) и вирус гепатита В (ВГВ) являются возбудителями опасных фекупонных заболеваний - синдрома преобретенного иммунодефи-та (СПИД) и гепатита Е СПИД - тяжелое поражение иммунной стемы, сопровождающееся развитием оппортунистических инфекций неопластических заболеваний, неизбежно приводящее к летально-исходу. ВГВ является причиной не только острой формы гепати-, но и хронических форм - цирроза печени и гепатоцеллвдярной рциномы. Одним из путей распространения этих инфекций являет-их передача с донорской кровью.

В борьбе с этими инфекциями, наряду с другими, активно звиваются направления, связанные с созданием вакцин против íx вирусов и методов своевременного выявления больных и виру-юсителей. Оба этих направления опираются на получение вирус-I антигенов. В последние годы вместо естественных вирусных :игенов как для вакцин, так и для диагностических систем все >е применяются генно-инженерные белки вирусов, экспрессируе-! в различных системах или синтетические пептиды

Во всех случаях эффективность применения вирусных антиге-I как естественных, так и подученных биотехнологическими ме-:ами для вакцин и диагностики зависит от степени их чистоты, |уногеннос'ти, способности связыватся с антителами, вырабаты-вдимися у больных или вирусоноеителей. В связи с этим, иссле-ания, связанные с разработкой методов получения, очистки ре-бцнантных антигенов ВИЧ и ВГВ, а также характеристикой взаи-ействия этих антигенов с антителами больных и вирусоносите-являотся чрезвычайно актуальными.

Дели и задачи исследования. Основной целью настоящей рабо-была разработка методов получения высокоэффективной чистки омбивантных белков вируса иммунодефицита человека и вируса атита В, а также^ исследование иммунологических свойств _и можностей использования этих полипептидов для исследований эроток крови на наличие антител к вирусу и создание новых изнтов таких систем.

Научная новизна работы Шлучены клетки Е. col i DH1(X) с эмбинантной плазмидой pASX3. экспрессирующие гибридный бе, содержащий полную последователиность В-галактозидазы и ви--дацифическую последовательность оболочечного белка ВИЧ-1. ученный белок обладал зирусспвцифическими антигенными свайе-

- г -

твами, которые были сравнены со свойствами химерных белков, содержащих другие вирусспецифические последовательности. .

Исследованы различные варианты очистки белков и разработаны технологные варианты очистки: для белков ВИЧ-1 - на основе гель-фильтрации, а для поверхностного антигена ВГВ - с помощьк аффинной хроматографии на основе моноклональных антител.

Практическое значение работы заключается в создании диагностических тест-систем на основе генно-инженерных антигенов для определения антител к ВЯЧ-1 и ВГВ в сыворотках крови людей с применением В-лактамазы и пероксидазы.

Апробация работа Результаты исследований были представлены на 19 и 20-й конференциях ОЕБО (Италия, 1989 и Венгрия, 1990). В завершенном виде диссертационная работа апробирована 28 ноября 1990 г. на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ,

Публикации. По теш диссертации опубликовано 5 работ. Обьеи и структура работы. Диссертация состоит из введения,

обзора литературы, экспериментальной части (включающей разделы "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение"), выводов, списка литературы, содержащего 197 работ. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, включая 19 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ К МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Штаммы-продуценты. Продуцент оболочечного белка ВИЧ-l был получен в результате трансформации Е.coli DH1 (л) рекомбинант-шй плазмидой рАЗХЗ по методу Cohen Е (1972). с модификациями. В работе такяе использовали штамм Е. coli Н-12 НВ101, трансформированный рекомбинантными плазмидами рЕб, pHS72, pHG37, pHBG7, предоставленные Гараевым М.М.(ИВ им. Д.И.Ивановского АМН СССР).

Получение очищенного HBsAg из сыворотки серопозитивных доноров проводили по методу В. А. Ананьева.

• Природный и рекомбинантный осповакцинный HBsAg (субтип "ad") выделяли на нммуносорбенте с МКА к HBsAg по методу Симонова Ей. иjcoaBT.(1987) в модификации. Источника»« HBsAg соответственно служили плазма крови больного вирусным гепатитом В и сульфат аммонийная фракция культуральной жидкости клеток линии CV-1. зараженных рекомбинантным штаммом вируса осповакцины HBsl, содержащим ген HBsAjf. Генноиняенерный материал был пре-

зставлен Гибадулиным P.A. (ИВ им. Д.И. Ивановского АМН СССР).

Биохимические методы. Ib лучение очищенных препаратов гек-э-иняенерных белкой проводили методом обработки культуральной гспензии ДНКазой и лизоцимом с последувшей 2-х стадийной гедь-шьтрацией: 1) гель-фильтрация на колонке с Сефакрилом S-200 'harmacia), уравновешенной 0,05 М трис-HCl буферным растворам, I 7,5, содержали* 0,15 М NaCl и 1 Z ДСЕ Элюцию проводили со соростыо 15-20 мл/ч, собирали фракции объемом 2 мл;

гель-фильтрация методом ВЭЖХ на установке FPLC (Pharmacia), мунологически активные фракций, полученные после 1-ой стадии метки, предварительно обработанные 20% ТХУ и растворенные в шимальном объеме <КБР, содержащего 12 ДСН и 1Z 2-меркаптоэта->л (2-МЭ) наносили на колонку "Superóse б HR 10/30"(Pharmacia), авновешенную <КБР, содержащим 0,1% ДСЕ Здвдию проводили со оростью 0,5 мл/ч: собирали фракции объемом 0,5 мл.

Получение У-глобулиновой фракции гипериммунных антисыворо-к и АЖ проводили по методу Kekwick R. (1940) трехкратным осаж-нием насыщенным раствором (NHq^SOi,; IgG-фракции АЯ-по методу oh Н. (1986) осаждением каприловой кислотой (Serva) и (HH4)iS0i| В качестве ферментов-маркеров применяли пероксидазу хрена ПО"Биолар", г.Олайне) и В-лактамазу из Bacillus licheníformis 9/с (псковский экспериментальный завод ВНИИ антибиотиков).

Излучение коныогатов антител с пероксидазой и В-лактамазой зучали по Wilson М.В. (1978) методом периодатного окисления и Avrameas S. (1969) одноступенчатым глутаральдегидным методом.

Электрофорез в полиакриламвдном геле (ПААГ) в присутствии Í проводили в системе Laentnli U. К. (1970). Перенос белков из \Г на нитроцэллшозный фильтр осуществляли по методу Towbtn Н. al. (1S79) с модификациями,

Иммунохимические методы. Иммуносорбенты с моноклональными гителами (MRA) готовили по рекомендациям фирмы-изготовителя основе CNBr-активированной сефарозы 4В (Pharmacia).

Иммуноферментные исследования проводили по методам Gues-1 j. L.(1981) с модификациями на 96-луночных планшетах произ-1ства Mikrotestplatte (ГДР)Titertek (ФРГ) и Московского НИИ зтехники. В качестве хромогенов для определения энзиматичес-? активности ферментов использовали: длк перокекдазы - с-фе-кндиамин (Merck, ФРГ); дзя В-лактамазы - иодинол (Борисове-

кий хиыфармзавод), содержала® калиевую соль бекзшшеницилли Результаты тйОД регистрировали на фотометре "Multiskai" длинах еслк 492 и 620 вм соответственно для двух ферментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И .ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение экспрессии env-специфической последовательности гибридной плазмиды pASX3 в бактериях Е. coli. Для получения продуцента, экспрессирующего часть оболоч* кого белка env ЗИЧ-1 была проведена трансформация Е.coli DHU плазмидной ДНК с частотой 1-2 х 107 ампициллину резистентж трансформантов на 1мкг ДНК pASX3. Плазмидный вектор pASX3, cf струкрованный на основе вектора рЕХ2 с вставкой фрагмента плг миды pAS3, содержал ген устойчивости к ампициллину, а также i ную нуклеотшшую последовательность В-галактозидазы и часть г верхностного белка env ВЙЧ-1 под контролем промотора фага^РС Для отбора продуцентов, зксярессирующих антигенные дете ыинанты ВЙЧ-1, способные взаимодействовать со специфически антителами, циркулирующими в сыворотках крови* больных, исло.1 зовали метод непрямого твердофазного иммуноферментного анали (тИФА). В результате были исследованы 24 клона; наибольшей'и мунологическсй активностью обладал клон G3.

Ввиду того, что рамки считывания В-галактозидазы и клон рованного фрагмента совпадали., ожидалось получение белка, К'-к цевая часть которого представлена В-галактозидазой, а С-конец вирусспецифической последовательностью, с расчетной молекуля] ной массой 159876 Д. Электрофоретический анализ белков позводи установить, что, действительно, в препаратах лизатов бактерщ Е. coli DK1( A )/pASX3 присутствовала полоса с кажущейся моле к: лярвой массой 160 кД (рис. 1А, дорожка 1), близкой к рас четно* отсутствовавшая в контрольном препарате Е. coli DHl(A)/pEX2 (р> A3, дорожка 2). Для обнаружения белков, содержащих вирусслевд фические антигенные детерминанты, был использован метод иммунс блотинга. На рис. 1Б и 1В представлены данные электрофореза и и мунобдотикса, очищенного на Сефакриле S-200 генно-инженерног антигена с каадпаейся молекулярной массой 160 кД. Эти результат показывают, что данный антиген способен взаимодействовать с специфическими антителами сывороток крови вирусоносителей. Пр; этом в контрольном препарате Е. coli DHl(X)/p£X2. а также в пре-

- Б -

ас. í. Анализ белков, экспрессируемых под контролем рексмби-антной плазмиды рАЗХЗ в клетках Е. coliDHICA): А-злектрсфо-гграша лизатов клона 03(1) и Е. col i DHl(A)\pE>2(2); -электрофореграмма фракций белков, очищенных на Сефакриле -200; В-исследование антигенов в реакции идауноблотингз; -4 - фракции элзоции 22-25. Справа укасаны размеры гибридах белков, слева - молекулярная масса маркеров (кД).

атах генно-инженерных белков, продуцируемых клетками,"прояв-■шх" сывороткой крови здорового донора полосы отсутствовали.

Таким образом, можно заключить, что полученная .гибридная змида pASX3, содержащая последовательность генома ШЧ-1, эк-зссируется в бактериях Б. coli DH1 (X) и детерминирует синтез эидного белка, способного взаимодействовать с антителами еы-эток крови вирусоносителей.

2. Исследование иммуногенных свойстз гибридных белков, содержащих вирусспецифические последовательности.

Наряду с полученным штаммом в работе также использовал:! цуценты, зкспрессируюдае участки разной лливы оболочечных и ацевинных белков (рис. 2).

Рис. 2. Схема размещения фрагментов ДНК генов env и gag генома ВИЧ-1, кодирующих оболочечные и сердцевинные белки, в различных векторах: 1,4-полные последовательности gag и env;

2,3-части gag, кодируемые плазмидаш pHG37 и pHG72 соответственно; 5-7-части env, кодируе- . мые рЕб, рНВ67 и PASX3 соответственно. Нумерация, нуклеотидов по Ratner L. (1985).

1) Е. col i НВ101, трансформированный рекомбинантной плазми-дой рЕб, вирусспецифическая последовательность которой кодирует 469 аминокислот с С-конца гликопротеина gpl20 и 240 N-концевых аминокислот трансмембранного гликопротеина gp41;

2) Е.coli НВ101, трансформированный рекомбинантной плазми-дой pHBGV, вирусспецифическая последовательность которой кодирует гидрофильный домен трансмембранного гликопротеина gp41 в 128 аминокислот и 44 аминокислоты с С-конца gpl20;

3) £ coli 0Н1(Я), трансформированный рекомбинантной плазми-дой pASX3." с вирусспецифической последовательностью, кодирующей 44 С-концевых аминокислот gpl20 и полную последовательность gp41

. 4) E.coli НВ101, трансформированный рекомбинантной плазми-дой pHG37, вирусспецифическая последовательность которой включает 36 аминокислот С-концевого остатка р17 и 173 N-концевые аминокислоты р24;

5} Е. coli HB103/pHG72, содержащий рекомбинантную дуплициро-ванную плазмиду рН337, в которой рамка "хвоста" первого фрагмента совпадает с рамкой "головы" второго.

Общим свойством всех этих гибридных белкЬв являлось при-

333

_ 739

Г'рр I

1432

Ж.

1 Р9

[звак I 1735Г

I Збак 173ак

I Збак Х73ах

631

1258

Рв[ I 2

□ ?

5779

уХгр

7335

6370

9P«

II II. II II1

1 469м 1 240ах 1 ;

5325 ! ! ! 8057 '

|44аЦ I28ex_J I

¡ ; 7721 ;

345а*

7200

5

- ? -

утстзие полной последовательности В-галактозидазы на N-конце.

Лйзаты клеток, содержащие гибридные белки, были хроматог-афичееки очищены на Сефакриле S-200 и по взаимодействию с ан-ителами сывороток вирусоносителей охарактеризованы методом епрямого тМФА. В таблице 1 представлены иммунологические ха-жтеристики антигенов с разными вирусспецифическими псследова-гльностями: 2-рабочее разведение препаратов генно-инженерных: элксв - разведение, в котором максимально эффективно проявляясь антигенные свойства; 3-соотношение сигналов для положи-. гльной и отрицательной сыворотки; 4-фоновые значения для отри-иельных сывороток, отражающие уровень неспецифических взаимо-?йствий. ГЗо данным таблицы 1 лучшими антигенными характеристики обладали белки, экспрессируемые плазмидами рАЗХЗ и pHG72.

Таблица 1

Иммунологические характеристики антигенов env и gag-экспрессируемых в разных векторных системах

5азвание Рабочее разведение 0П492 С+/ОП492 С- ОП492 С-

¡лазмиды антигена

1 2 3 л.

ASX3 1/1000-1/2000 ' 7,5+0,5. С,12±0,03

Еб '1/500-1/600 5,6+0,4 0,16+0,04

НЬ37 1/800-1/1000 б,8±0,4 0,13±0,03

HG37 1/700-1/800 7,3±0,5 0,13+0,03

HG72 1/1000-1/1500 • 8,5±0,5 0,11+0,03

Наиболее длинный полипептид (продукт экспрессии плззмиды 5) оказался наименее реакционоспособным по отношению к специ-ческим антителам.4 Это можно объяснить влиянием В-галактозида-, присутствующей на Н-конце ©р120, на конформашш определён-¡1 вирусспецифической последовательности и стерическую доступов антигенных детерминант, данного полипептида в' процессе аимодействия АГ-АТ. Наиболее вероятно,- что здесь происходит аимодействие белкового доме ^а. в подипептиде В-галактозидазы с язко расположенными М-концевыми аминокислотами (отсутствуюзд-з других генно-илденерных йолипептидах), последовательность

которых имеет предрасположенность к такому взаимодействию.

В случае экспрессии сердцевинного белка ВИЧ-1, предпочти тельным вариантом, оказался продукт экспрессии Е. coli НВ101 pHG72. Это согласуется с эмпирическими данными, свидетельству« «ими об образовании более прочного комплекса АГ-АТ при многом ратном повторении антигенных детерминант.

3. Разработка методов очистки гибридных белков, содержащих вирусспецифические последовательности областей env и gag генома ВИЧ-1.

Разработка простых и воспроизводимых для значительных ко личеств белка «етодов очистки, генно-инженерных белков представ : ляет интерес как для диагностики, так и для получения ьысокозф фективных вакцин, фи работе с генно-инженерными белками накопление основной массы химерных белков происходит в составе т. н. телец включения (inclusion bodies) (Goeddel Н. et al. 1970), об ладаюиих выраженными гидрофобными свойствами. Возникшая проблема растворения с наименьшим повреждением нативйой структуры reí но-инженерных антигенов может быть решена с помощью детергентов в специально подобранных концентрациях.

Гибридные белки в лизатах бактерий растворяли добавление» ионного детергента ДОН. После растворения основной массы белкоз лиэаты наносили на колонку с Сефакрилом S-200 и проводили гель-фильтрацию как описано в главе "Материалы и методы". Собранные фракции исследовали методом непрямого тИФА. На рисунке ЗА преде тавлев хроматографический профиль и иммунологическая активяост! фракций злюируемого белка, экспрессируемого в системе Е. со]i/ рАЗХЗ. Наиболее активными оказались фракции 22-25 (первый nw злюции) Так как молекулярная масса всех гибридных белков превышала таковую для основной массы белков клетки, то это позволило применить единую схему хроматографической очистки для всех ген-но~ин*енерных антигенов с одинаковым профилем злюции и иммунологической активности. Данные по электрофорезу и иммуноблотингу (рис. 1Б и 1В) подтвердили присутствие в фракциях 22-25 иммуно-логически активного белка с кажущейся молекулярной массой 160 кД, что соответствовало теоретически расчитанной.

Очищенные на Сефакриле S-200 антигены обрабатывали 20% ТХУ, образовавшийся осадок растворяли в ÍCBPJ содержащем 17. ДСН

I,Of

.0,5

1,0

0,5

l2,0

1,0

Г0 20

30

40 50 60 N* ФРАКЦИИ

2,0

1,5

1,0

0,5

a

в

04 ON •d-

w s SJ СЦ Рч О

о ta •4

Рис. 3. Хрсматогра-фическое выделение генно-инженерного антигена env ВИЧ-1, экспрессируемого в Е.coli DH1 (Л)\ PASX3, яа Сефакри-ле S-200 (А) и на Суперозг 6 (Б): 1-профиль элюции яри длине волны 280 hm-, 2-иммунологическая активность по данным 1 тйФА.

10 20 30

40 _5Ö_ 60 ' № ФРАКЦИИ

Z 2-Ю. Было замечено, что после обработки 7Х/ антигенная явность по данным "тИФА генно-инженерных белков, зкспрессируе-плазмидой pASX3 увеличилась (таблица 2). По-видимому, спо-юсть оболочечного белка (env) связываться со специфическими гаелами повышается в результате модифицирующего влияния ТХУ фетичную структуру гибридного белка только при наличии опоенной аминокислотной последовательности. В случае обработ-ТХУ сердцевинного белка (gag), экспрессируемого плазмидой '2, особого улучшения реакции со специфическими антителами '.аблюдали (таблица 2).

Активные фракции после чроматографической очистки на Се-!нле S-200 обработанные ТХУ растворяли в 1СБР, содержащей II подвергали разделению ЗЭЖХ на колонке Супереза-5. В слу-

чае антигена env наиболее иммукологически активные фракции 19-21 (рис. ЗБ) соответствовали элюции белков, молекулярная масса которых значительно превышала 150 кД. Электрофоретический анализ показал присутствие в первом пике белков с кажущейся молекулярной массой 160 кД. Очевидно, что здесь происходит агрегация env антигена при снижении концентрации детергента от 1% (в случае гель-фильтрации на Сефакриле S-200) до 0,1% (в случае ЮЖХ). При ВЗЖХ на колонке Суперозы-6 антигена gag агрегации не наблюдали. По-видимому, решающую роль в ассоциации этих белков (как и в случае модифицирующего действия ТУУ) играет аминокислотный состав вирусспецифической части химерного белка.

Повышения специфичности реакции АГ-АТ можно достигнуть не только тщательной очисткой антигена от баластных клеточных белков, но и отщеплением неспецифической части генно-инженерного полипептида. Представленная методика хроматографической очистки была применена для разделения реакционной смеси, полученной в результате протеолитичеекого расщепления генно-инженерного белка, экспрессируемого плазмидой pHG72. В работе была использована вирусспецифическая протеаза ВЙЧ-1, экспрессируемая плазмидой pPR6 (Оленин С.А., 1990), которая в природном варианте расщепляет предшественника сердцевинного белка на границе р17 и р24. Схема протеолитичеекого расщепления гибридного полипептида (р165) с удвоенными последовательностями р17 и р24 представлена на рис. 4.

Л -галаггозкага

шгзвх

iis л

зу

36а»| Г73ах [36ак| 173м

PIS5

4 й

PII9

I 19 1Й )4 ifl j 19 <а ) pis

Рис. 4. Схема расщепления специфической протеазой генно-инженерного белка, экспрессируемого в Е. coli HB101\pHG72: 1 и 2-сайты расщепления.

1

| 19 Д I« Jflf р23

2 ! 19 да 1 рхэ

Реакционную смесь подвергали гель-фильтрации по стандарт-i методике. .Как и следовало ожидать, данные по иммуноблотингу гИФА показали,. что наиболее иммунологически активные фракции цержали только вирусспецифические последовательности с кажутся молекулярной массой 23 и 19 кД. Таким образом, удаление специфической последовательности В-галактозидазы, в два раза гвьшаюшей последовательность генно-инженерного антигена, зна-[■ельно улучшило связывание этого антигена оз специфическими рителами. Отщепление неспецифичесгазй последовательности от сомбинантных белков благоприятно влияет на образование анти-I к вирусным антигенным детерминантам, что с~здует учесть при ¿унизацш животных, а также при получении шзгчн на основе шо-инженерных белков.

Таблица 2

Сравнительная характеристика иммунологической активности в тйФА препаратов env и gag антигенов, полученных одно- и двустадийными методами гель-фильтрации

>па- Значение ОП492С+/ОП492С-

'Ы Источник генно-инженерного материала для сорбции

шо- • Лизат Иммунологически активные фракции:

se- клеток очистка на обработка очистка на

шых Е. coll Сефакриле ТХУ Сефакриле S-200

1KOB S-200 и Суперозе-6

IV 5,0±0,5 7,5±0,5 9,1±0,4 13,0±0,5

tg 5,2±0,5 8,5±0,5 8,9±0,3 12,0±0,5

На основе данных изучения активности в тИФА различных ген-инженерных продуктов на разных стадиях очистки был разрабо-простой и эффективный метод 2-х стадийного выделения: на онке Сефакрила S-200 с последующим проведением ВЗЖХ на Супе-е-б. Сравнительные данные по иммунологической активности личных типов препаратов env и gag (лизаты, препараты, полу-ные после 1-й стадии и 2-х стадий хроматографической очист-представлены в таблице 2.

4. Разработка методов очистки природного и генно-инженерного НВбАк.

При разработке методов детекции специфических антител НВзАе также возникает проблема получения и очистки антигеяж препаратов. Традиционные методы получения очищенного НВзАг I плазмы вирусоносителей дороги, трудоемки и не позволяют избе виться от контаминирующих примесей. В связи с этим представля ется актуальным решение задачи наработки препаратов НВзАг с пс мощью имыуносорбентов на основе МКА, а также использование н только вирусных, но и генно-инженерных антигенов. Результат иммуноаффинной очистки естественного и рекомбинантного НВзА представлены в таблице 3.

Таблица 3

Иммунохимические параметры очистки НВзАг при использовании аффинного иммуносорбекта на осноЕе моноклональных антител

N Источ- Элюирую- Количест- Количест- Отнопение Степень

ник ¡ций во НВзАд, во НВзА^, антигенной очистки

НВзАе раствор нанесен- злюиро- активности за одну

ного на ванного элюата к стадию*

колонку, с колон- исходной, а'

В ТИФА ки, в тИФА в тИФА... а

(мкг) (мкг) (%) . ,

1. Плазма 0,2 М ЫаНСО, 170±1,5 • 76 4200

крови 0,5 Ы Ш..0Н 225±1,5 >153+1,5 68 3730

2. Клетки 0,2 М.МаНСХ^ 75+1,5 52+1,5 69 4810 .

СЧ-1 0,5 М Ш„0Н 75±1,5 46±1,5 - 61 . 4520

* а'и а* - количества НВзАг в пересчете на 1 мг бедка артиген-содержащего материала до (а) и после (а')-очистки.

Исходная концентрация природного НВзА&, определенная с помощью ИФ тест-системы для детекции НВзАг, составила 16±0,1 'мкг/мл, рекомбинантного осповакцикного НВзА5 - 5±0Д мкг/мл.

При разработке ИФ тест-систем для определения антител классов и к НЗзАе использовали способ аффинной очистки природного .и рекомбинантного НВзАе на иммуиосорбентах с иммоби-

юваяной ¡ей-фракцией моноклональных (МКА) антител к НВэАг. )Н ЖАК 22.

В результате процедур иммуноаффинной очистки был получен ¡парат, содержащий НВбА^ в димерной (49 кД) и мономерной фор: (25 и 30 кД), что согласуется с литературными данными (Коз-юкая Т. М., Пушен ЕЕ, 1986). Применение аффинного иымуно->бента позволило очистить природный и рекомбинантный НВзАг в О-4500 раз. Очищенные препараты НВзАе со>: заняли антигенную ивность и были пригодны для создания ИФ тест-систем для вы-еняя анти-НВзАд 1г6 и 1гМ и определения титров АЗ,' содерзяа-МКА к НВзАг.

Таким образом, способ очистки АГ с исполк „'ваикь.« аффинных уносорбентов является перспективным методически подходом, орый в сравнении с традиционными методами менее дорог и тру-мок и позволяет применять иммунорорбенты на основе как ПКА, и МКА. Наиболее привлекательным представляется применение уносорбентов на основе МКА, т. к. они удобны вследствие гомо-аости МКА по специфичности и аффинитету, возможностей нарами МКА в большом количестве и получения препаратов АГ с ми-Шзным содержанием контаминирующих примесей.

5. Создание иммуноферментных тест-систем для диагностики БИЧ-1 и НВзАе.

5.1. Получение и характеристика иммуноферментных конъюгатов.

В работе использовали конъюгаты иммуноспецифических компо-•ов с пероксидазой и В-лактамазой. Фермент бактериального нахождения, В-лактамаза, гидролизухшая В-лактамное кольцо щиллинов и цефалоспоринов, является защитным ферментом бак-[й и поэтому не имеет прямых аналогов и эндогенных субстра-

в организме теплокровных животных (Леви М.И. ,1985). Другими муществами применения В-лактамазы в тйФА являются высокая ильность и удельная активность по отношению к бензилпеницил-

и возможность визуальной регистрации результатов анализа.

Несмотря на все преимущества В-лактамазного коныогата, он аходит широкого применения. Наиболее часто используемая ме-ка конъюгирования одноступенчатым глутарйльдегидным методом аает недостатками, связанными с низкой эффективностью конъ-эвания и потерей активности антител и фермента вследствие

полимеризации конъюгатов.

Для приготовления В-лактамазных конъюгатов с антителами н ми был разработан модифицированный метод периодатного окисле ния. В разработанной методике сначала окисляли полисахаридных носителей (фиколл, декстраны), с альдегидными формами котори по -NH группам связывали антитела и В-лактамазу. Было проведен сравнительное исследование иммунологической активности перокси дазного и В-лактамазных конъюгатов с AT против IgG и IgM чело века, приготовленных различными методами. Из анализа результа тов следовало, что предложенный метод позволяет получать В-лак тамазные конъюгаты, близкие по имунохимическим характеристика к иммунопероксидазным канъюгатам, синтезируемым классически яериодатным методом и значительно превосходит качественные по

казатели одноступенчатого глутаральдегидного способа. »

5.2. Использование- генно-инженерных полипептидов ВИЧ-1 для исследования сывороток крови в тИФА.

Разработанные методики получения и очистки генно-инженерных антигенов были применены при создании ИФ тест-системы rju определения антител к ВИЧ-1.. В качестве основного подхода i оценке пригодности созданной тест-системы необходимо рассмотреть данные ее клинической апробации при массовом использованш сывороток больных в сравнении с результатами других тестов.

При создании диагностической тест-системы для определена антител к ВИЧ-1 были использовайы,,генно-инженерные белки, представляющие антигенные детерминанты оболочечного env и сердцевинного gag белка, продуктов экспрессии в Е. coli плазмид pASXí и pHG72 соответственно. Препараты были очищены 2-д стадийны? методом гелп^фильтрации.

Методом тИФА было проанализировано 120 положительных и ЮС отрицательных сывороток, предварительно протестированных в ко-мерческих системах фирм "Ortho Diagnostics" и "Organor",. а также методом вестерн-блотинга. -Были Использованы два типа систем выявления: с пероксидазным и В-'лактамазкым конъюгатами. Данные представлены на рисунке 5. При использовании пероксидазного ко-нъюгата 9%. сыьороток от здоровых доноров имели повышенное "фоновое" значение, что приближало их к положительным сывороткам, содержащим небольшое количество антител. Применение В-лактамаз

- 1Б -

í реакции в системе выявления позволило четко разграничить 'налы положительных и отрицательных сывороток, повысить спе-¡ичность тест-системы и снизить количество проблематичных сы-юток.

гЛг 2,0 1,6 1,2 О,В

шж

so *

10 %

23 #

32 *

ш

75 *

22 %

3%

7 *

шж.

.5. Результаты исследования 100 отрицательных (1,3) и 120 ожительных (2,4) на присутствие антител к БИЧ-1 с прийене-м пероксидазного (1,2) и В-лактамазного (3,4) конъюгатов.

При тестировании большого количества клинического материа-:егда возникает проблема так называемых "серых" сывороток, эжащих незначительное количество антител или/и плохо взаи-»ствуквдих с конкретным антигеном. Повышение качества анали-)жно достигнуть путем усовершенствования не только неспеци-:ких компонентов тест-системы, но и за счет улучшения эф-гвности реакции АГ-АТ.

В связи с тем, что ИФ тест-система была создана на основе -инженерных антигенов, содержащих неспецифическую амино-

- 1В -

кислотную последовательность В-галактозидазы, представляло ш: терес исследование сывороток, содержащих антитела к различив антигенным детерминантам, на взаимодействие с таким же антиге наш, . свободными от баластного полияептида В качестве таког антигена бьш использован генно-инженерный белок, экспрессйруе мый плазмидой рН672, обработанный специфической протеазой очшпенный 1-о стадийной гель-фильтрацией на Сефакриде Б-200. Для сорбции использовали фракции полипептидов р23 и р19, соде г яащие только вирусспецифическую часть химерного белка. В качее тве контрольного образца был использован нерасщепленный поли пептид (р165), очищенный таким же образом. Было исследовано 2 сывороток, содержащих специфические антитела к ВИЧ-1 и предва рительно протестированные в методе имыуноблотинга (ИВ им. Ива яовского АМН СССР). 88 сывороток из 90 положительных с обоими антигенами давали положительный результат. 2 слабо полозкитель ные сйворотки с нерасщэпленным антигеном взаимодействовали пло хо и давали отрицательный, результат, в-то время как взаимодейс твие с антигеном, не содержащим В-галактозидазы, происходил достаточно хорошо. По-видимому, сыворотки, не взаимодействуете с нерасщепленным антигеном содержали специфические .антитела зпитопам, которых экранировала'В-галактозидаза-Удаление неспе цифической части генно-инженерного антигена освобождает нужнь антигенные детерминанты для взаимодействия со специфическим антителами, снижает количество проблематичных сывороток до ми нимума и таким образом- повышает качество диагностическс тест-системы. •

5.3. Разработка системы иммуноферментных.диагностических тестов для выявления антител к НВБАг.

• Использующиеся для выявления серологических маркеров воэ будителя методы РПР, ВИЭФ, РИА либо недостаточно чувствительнь либо обладают рядом существенных недостатков при выявлении ан ти-ИВзАе антител. Дуть к-решению этих проблем заключается в ис пользовании высокоспещфичных ЫКА в комплексе с антисывороткаь к НВзАг. Цри создании диагностикумов для выявления АТ к НВз/ задача наработки очищенного препарата вирусного.АГ решается помощью методического подхода, включающего гибридошую технолс ги» с целью приготовления аффинных сорбентов для очистки Н1±зАд

Одним из методов диагностики ЕГВ, выявления хронического жительства HBsAg и контроля донорской крови является опреде-■ние специфических IgQ и IgM к HBsAg. В разработанном тесте [аншеты для Шк сорбировали аффинно очищенным препаратом HBsAg концентрации 5 мкг/мл. После блокировки вносили исследуемые и нтрольные образцы сывороток. Связавшиеся AT выявляли перокси-зными конъюгатами кроличьих IgG против ¡gG или IgM человека в тимально подобранных разведениях.

При анализе исследуемых сывороток совпадение результатов положительным образцам, было получено в 92,4 Z случаев, по рицательным - в 97,8 %; совпадающие результаты по всем образ-v< были получены в 94,3 X случаев.

Таким образом, можно заключить, что разработанная ИФ тест-:тема для выявления анти-HBsAg обладают высокой чувствительный и специфичностью, что позволяет значительно увеличить ядент достоверного определения AT k BFB при исследовании сы~ >оток крови доноров и больных.

ВЫВОДЫ

1. Получен штамм продуцент Escherichia coli DH1CA), транс->мированный рекомбинантной плазмидой pASX3, экспрессирукшй усспецифическую последовательность 44 С-концевых аминокислот 20 и полную последовательность gp41 оболочечного белка -1. Охарактеризованы по взаимодействию с антителами рекомби-тные полипептиды, продуцируемые этим и другими штаммами, эк-гссирующими разные вирусспецифические последовательности.

2. Разработаны методы получения высокоочищенных рекомби-гных полипептидов, продуцируемых в Е. coli. Предложен проси воспроизводимый метод очистки генно-инженерных антигенов, ^одных для определения специфических антител к ловерхностно-1 сердцевинному антигену вируса иммунодефицита человека.

3. Разработан модифицированный метод синтеза конъюгатов [тел с В-лактамазой. Создана и апробирована иммуноферментная -система для определения антител к ВИЧ-1 с использованием о-инженерных антигенов, пероксидазного и В-лактамазного ко-атов.

4. Разработана методика аффинной очистки' поверхностного гена вируса гепатита В из плазмы крови вирусоносителей и

рекомбинантного из клеток культуры CV-1 с применением сорбентс на основе моноклональных антител.

5. Разработана и апробирована иммуноферментная тест-систе ма для выявления антител классов Íg6 и IgM к поверхностному at тигену вируса гепатита В на основе HBsAg, очищенного методе аффинной хрезматографии.

•Список работ, опубликованных по теме дисертации:

1. Воронов A.R , Сакаян RH., Кветкаускайте Р. Е ,. Грамотн на Е. А., Федорова 0. Е , Кущ А. А., Венгеров Ю. Ю. "Система иммув ферментных диагностических тестов для выявления HBsAg и антите к нему". Материалы III Всероссийского съезда инфекционистов, Москва-Смоленск, 1989, С. 158-159.

2. Simonov V.l., Kvietkauskaíte R. P., Vorobyev S. M., Voro nov A. V., Sranovsky N. N., Gibadulin R. F. , Kushch A. A. , Venge rov Yu. Yu. "Immunoaffinity purification of natural and recombi nant hepatitis В surface antigens". 19th meeting of FEBS, Rome 1989, P. FR219. '

3. Kvietkauskaíte R. P. , Voronov A. V. , Lang H. M., Vengerov Yu. Yu. "Expression, purification and application for beta-lac-tamase EIA of HIV 1 gene env recombinant product". 20th meetin of FEBS. Budapest, Hungary, 1990, P. P-Th365.

4. Кветкаускайте P.IL-, Мягких И.В., Воронов A.B. "Иммуно-В-лактамазная тест-система для определения антител к ВИЧ 1 на основе очищенных рекомбинантных антигенов". Всесоюзная школа-с мшар "Молекулярная биология и медицина", Ленинград,. 1990, С.7:

5. Кветкаускайте P. ÏL , Воронов А. Е , Мягких И. Е , Камаев; M. а , Гараев M. М., Венгеров JG. Ю. "Создание и апробация иммуно ферментной тест-системы для определения антител к ВИЧ-1 с использованием хроматографически очищенных генно-инженерных антигенов". Сборник научных трудов НИИ Гриппа: Мэлекулярная вирусология и медицинская биотехнология, Ленинград, 1990, С. 106-114.