Антигенное картирование молекулы гемагглютинина вируса гриппа H5N1 и влияние изменения антигенной структуры на вирулентность

Крылов, Петр Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антигенное картирование молекулы гемагглютинина вируса гриппа H5N1 и влияние изменения антигенной структуры на вирулентность
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Антигенное картирование молекулы гемагглютинина вируса гриппа H5N1 и влияние изменения антигенной структуры на вирулентность"

на правах рукописи

@046И2336

Крылов Петр Сергеевич

АНТИГЕННОЕ КАРТИРОВАНИЕ МОЛЕКУЛЫ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА Н5Ш И ВЛИЯНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ НА ВИРУЛЕНТНОСТЬ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

2 0 МДй 2(П0

004602336

Работа выполнена в Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (лаборатории физиологии вирусов)

Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор, академик

РАМН

Каверин Николай Вениаминович.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

Народицкий Борис Савельевич

Доктор биологических наук Селнмова Людмила Мндатовна

Ведущее Учреждение:

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится « 6 I » /И (л Я 2010 г в часов на заседании Диссертационного Совета Д.001.020.01 при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН

Автореферат диссертации разослан « 2 $ » 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Е. И. Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Одним из наиболее распространенных вирусов, патогенных для человека и животных, является вирус гриппа А. Вирус гриппа А, в отличие от вирусов гриппа В и С, способен вызывать не только локальные вспышки и сезонные эпидемии, но и глобальные пандемии, охватывающие весь земной шар и случающиеся с интервалом 10-40 лет, поражая миллионы и десятки миллионов человек. Вирус гриппа А имеет широкий круг хозяев и отличается значительной вариабельностью. Вариабельность характерна для всех белков вируса гриппа А, но наиболее вариабельны поверхностные гликопротеины вириона, гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), определяющие иммунный ответ. Известны два пути изменения этих белков. Первый - антигенный дрейф, присущий в основном вирусам гриппа человека. В человеческой популяции на вирус давит коллективный иммунитет. В таких условиях мутации, позволяющие вирусу преодолеть иммунитет, дают ему серьезное преимущество и закрепляются. В итоге антигенные варианты сменяют друг друга. Второй путь - антигенный сдвиг или шифт (от англ. shift), то есть изменение антигенной формулы из-за замены гена и соответствующего белка в результате реассортации генов. Если два вируса гриппа А заражают одну и ту же клетку, то в вирусном потомстве многие вирусные частицы окажутся реассортантными, то есть получившими часть генов от одного вируса-родителя, а часть - от другого. К вирусу гриппа, получившему ген НА (или НА и NA) от вируса гриппа птиц, который ранее не циркулировал в человеческой популяции, у населения нет иммунитета.

В настоящее время описаны 16 антигенных подтипов НА (Н1-Н16) и 9 подтипов NA (N1-N9) вируса гриппа А. Разные подтипы вируса гриппа поражают не только птиц, но и свиней (HI, НЗ), лошадей (НЗ, Н7), тюленей (Н4, Н7), норок (НЮ). У птиц, являющихся главным природным резервуаром вируса гриппа А, выделяют вирусы всех подтипов НА, однако у разных видов те или иные подтипы встречаются с разной частотой. Возможно, что многообразие вариантов подтипов НА, циркулирующих в природе, этим не ограничивается.

Основной мишенью для вирус-нейтрализующих антител, которые играют главную роль в защите от гриппозной инфекции, является НА. В человеческой популяции к настоящему времени циркулируют вирусы гриппа А, НА которых относятся к двум подтипам: HI и НЗ. Другие подтипы НА (Н2, Н4-Н16) в настоящее время не циркулируют в человеческой популяции. Поэтому люди не обладают иммунной защитой против вирусов подтипов Н4-Н16, а против вируса подтипа Н2 иммунитетом обладают лица старше 42 лет, так как подтип Н2 циркулировал с 1957 по 1968 гг. Нельзя исключить, что вирус гриппа А

любого подтипа, отсутствующего в человеческой популяции, может быть источником гена НА вирусов будущих пандемий.

Подтип Н5 находится в центре внимания вирусологов после осени 1997 г., когда в Гонконге была отмечена первая серия заболеваний человека в результате заражения высокопатогенным вирусом гриппа птиц H5N1. Из 18 человек, зараженных вирусом гриппа A/Hong Kong/156/97 подтипа H5N1, 6 погибли. Было установлено, что вирус передавался от кур к человеку, передачи от человека к человеку зарегистрировано не было. Секвенирование генов вирусов, выделенных от человека и от птиц, показало, что все гены вируса, выделенного от человека, были им получены от вируса, вызвавшего эпизоотию у кур.

В 2003 году в Юго-Восточной Азии вновь были зафиксированы случаи заражения людей вирусом гриппа А подтипа H5N1. С 2004 года в Таиланде, Вьетнаме, Камбодже, Индонезии и Китае зарегистрированы заболевания людей с высокой летальностью, вызванные этим вирусом. В 2005 году эпизоотии среди птиц, вызванные вирусом H5N1 отмечены в России, Украине и в Центральной Европе. В 2006 году эпизоотии были зафиксированы в Турции и в странах Африки, имеются случаи заражения людей с летальным исходом. По данным ВОЗ к настоящему моменту заболело 489 человек, из них умерло 289. Люди, как правило, заражались вирусом H5N1 только от птиц, массовая передача этих вирусов от человека к человеку пока еще не зарегистрирована. Имеются основания полагать, что для приобретения вирусом способности распространяться среди людей достаточно нескольких мутаций. Другим фактором, повышающим вероятность приобретения вирусом подтипа H5N1 способности к распространению среди людей, может быть его скрещивание с вирусом гриппа человека. В связи с отсутствием у людей антител к НА вирусов подтипа Н5 и активной циркуляцией этих вирусов в природе, вирусы этого подтипа обладают потенциалом пандемических агентов. При возникновении пандемии, вызванной высоковирулентными вирусами гриппа, относящимися к подтипу Н5, последствия могут оказаться гораздо более тяжелыми, нежели при прежних пандемиях. Вирусы этого подтипа часто обладают особыми свойствами, которые позволяют им поражать многие ткани организма и вызывать у птиц тяжелейшую, обычно смертельную инфекцию. Те вирусы, которые оказались способны заражать человека, также вызывали заболевание с необычно высокой смертностью.

Для всех подтипов НА известна аминокислотная последовательность, но в остальном разные подтипы НА исследованы в разной степени. Лишь немногие из 16 подтипов НА были охарактеризованы в отношении местоположения и структуры антигенных участков (сайтов) в трехмерной модели молекулы НА. Картирование антигенных сайтов молекулы НА подтипа НЗ впервые было осуществлено в 1981 г. [Wiley et al., 1981]. На протяжении последующих

20 лет трехмерная структура молекулы НА была известна только для подтипа НЗ. Поэтому первые попытки картирования антигенных сайтов для подтипов Н1 и Н2, а также ориентировочного картирования НА подтипа Н5, осуществлялись с использованием кристаллографической модели НЗ. После того, как в 2001 г. была получена рентгено-кристаллическая структура НА подтипа Н5, в Лаборатории физиологии вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского было проведено детальное антигенное картирование молекулы НА подтипа Н5. Картирование проводилось с помощью селекции мутантов, резистентных к моноклональным антителам (эскейп-мутантов) и их характеристики посредством перекрестных иммунологических реакций и секвенирования НА. В ходе этих исследований была выявлена вариабельность вирулентности эскейп-мутантов, коррелирующая с определенными аминокислотными заменами в НА.

После начала широкого распространения высокопатогенного вируса подтипа Н5Ш возникла необходимость получения данных об особенностях антигенной структуры его НА. Вирус ГОШ обладает значительной вариабельностью. Известно, что разные варианты вируса различаются как по антигенной специфичности НА, так и по уровню вирулентности. Однако до начала наших исследований в научной литературе отсутствовали какие-либо данные о картировании антигенных сайтов в структуре молекулы НА вирусаГОШ, атакже о зависимости изменений вирулентности от антигенной вариабельности. Актуальность исследования этих проблем обусловлена необходимостью углубления знаний о высокопатогенном вирусе гриппа ГОШ, обладающем пандемическим потенциалом. Получение информации по этой проблеме создает базис для подхода к разработке профилактического и лечебного применения моноклональных антител, а также для прогноза антигенного дрейфа в случае начала циркуляции вируса ГОШ в человеческой популяции и для подбора противопандемических вакцинных штаммов.

Цели и задачи исследования:

Провести картирование распределения антигенных сайтов в трехмерной структуре молекулы НА вируса гриппа подтипа Н5Ш. Выявить особенности структуры антигенных сайтов НА вируса ГОШ по сравнению с НА ранее охарактеризованных вирусов подтипа Н5. Охарактеризовать эпитопы НА, взаимодействующие с моноклональными антителами, полученными против вируса А/У1еШат/1203/04 (ГОШ). Выявить влияние аминокислотных замен в НА подтипа Н5, меняющих его антигенные свойства, на вирулентность вируса.

Для достижения поставленных целей было необходимо решить следующие задачи:

1. Получить эскейп-мутанты вируса гриппа А подтипа Н5Ы1, резистентные к моноклональным антителам, и определить их перекрестную реактивность с моноклональными антителами

2. Провести анализ результатов секвенирования генов гемагглютинина всех эскейп-мутантов с целью выявления локализации мутаций, определяющих их устойчивость к моноклональным антителам

3. Охарактеризовать панель моноклональных антител против вируса гриппа А/У1еШат/1203/04 по распознаваемым ими в молекуле НА эпитопам

4. Осуществить антигенное картирование молекулы гемагглютинина с использованием трехмерной модели гемагглютинина подтипа Н5

5. Охарактеризовать полученные эскейп-мутанты по их вирулентности для мышей и провести реадаптацию низковирулентных эскейп-мутантов

6. Провести реассортационный анализ низковирулентных эскейп-мутантов и их реадаптированных вариантов для выяснения влияния аминокислотных замен в НА вируса подтипа Н5 на вирулентность

Научная новизна и практическое значение работы

Данная работа расширяет представление об особенностях антигенной структуры молекулы гемагглютинина подтипа Н5, и об участках молекулы гемагглютинина, которые определяют вариации антигенной специфичности в процессе эволюции.

Полученные данные впервые описывают распределение антигенно значимых участков в трехмерной структуре молекулы НА вируса гриппа подтипа Н5Ы1.

Проведенный анализ влияния аминокислотных замен в НА на вирулентность вируса впервые достоверно демонстрирует снижение вирулентности под действием мутаций, меняющих антигенную специфичность НА подтипа Н5, и восстановление вирулентности при дополнительных мутациях в НА, приобретенных при пассировании вируса на животных.

Работа имеет преимущественно теоретический характер, но полученные данные в будущем должны будут приниматься во внимание при решении практических проблем. В связи с продолжающейся эволюцией высокопатогенных вирусов подтипа Н5Ы1 и их выраженной патогенностью для человека, данные по картированию молекулы НА вируса подтипа Н5Ы1 будут важны для оценки характера изменений НА у циркулирующих штаммов в аспекте их влияния на антигенную специфичность. Это может быть

существенным для подбора штаммов, которые будут использованы в производстве вакцин. Результаты исследования вариаций антигенности при аминокислотных заменах в антигенных сайтах важны для раннего выявления штаммов, имеющих высокий потенциал патогенности.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Антигенное картирование молекулы гемагглютинина (НА) высокопатогенного вируса гриппа H5N1 с использованием трехмерной модели гемагглютинина подтипа Н5 выявило локализацию, протяженность и структуру двух антигенных сайтов в трехмерной структуре молекулы НА вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1).

2. Моноклональные антитела против НА вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1) имеют ряд особенностей, отличающих их от охарактеризованных ранее монокпональных антител против НА подтипа Н5.

3. Некоторые моноклональные антитела против НА подтипа Н5 способны распознавать аминокислотные позиции, локализованные в двух разных антигенных сайтах.

4. У эскейп-мугантов, имеющих аминокислотную замену S145F в НА, выявлено резкое снижение вирулентности для мышей. Вирулентность восстанавливается в результате реадаптации низковирулентных эскейп-мутантов посредством пассажей на мышах при интраназальном заражении.

5. Роль аминокислотной замены S145F в НА для снижения вирулентности подтверждена реассортационным анализом, проведенным с использованием скрещивания и с применением сайт-специфического мутагенеза. Восстановление вирулентности при пассировании низковирулентных эскейп-мутантов может быть обусловлено как дополнительными мутациями в гене НА, так и изменениями в других генах.

6. Аминокислотные замены в НА эскейп-мутантов вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1), совпадают с аминокислотными заменами у природных высокопатогенных изолятов H5N1, относящихся к разным ветвям филогенетического дерева, что указывает на существенное значение вариаций, охарактеризованных в настоящей работе, для эволюции иммунологических свойств и вирулентности вирусов подтипа H5N1.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на XIV Международном конгрессе по вирусологии, Стамбул, Турция, 2008 г.; II Ежегодной конференции молодых ученых НИИ

вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва, 2009 г.; 28й Ежегодной конференции Американского Общества Вирусологов, Ванкувер, Канада, 2009 г.

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 21 апреля 2010 года.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 научных работы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, и 2 - в материалах международного конгресса и конференции.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана на 133 печатных страницах, состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация содержит 4 схемы, 14 таблиц и S рисунков. Список использованной литературы содержит 218 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Вирусы

Вирус VNH5N1-PR8/CDC-RG (H5N1), полученный методом реверсной генетики, содержащий гены НА и NA от высоковирулентного вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1), а все остальные внутренние гены от высокопродуктивного вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), был любезно предоставлен доктором Р. Донисом (CDC, Атланта, США). Ген НА этого вируса был модифицирован сайт-специфическим мутагенезом путем удаления полиосновного участка в области сайта нарезания, после чего вирус перестал быть вирулентным для цыплят и хорьков, что позволило использовать его для работы в обычных условиях.

Вирус A/Mallard/Pennsylvania/10218/84-MA (H5N2), адаптированный к мышам, [Smirnov et al., 2000], был получен из лаборатории субвирусных структур НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (зав. лаб. проф. Ю. А. Смирнов). Эскейп-мутанты этого вируса т4б(7), m46(8), ш55(2), т58(1), ш24В9, ш46(7)-55, ш46(7)-55-24В9, ш55(2)-24В9, ш58(1)-

24В9, были получены ранее в лаборатории физиологии вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (зав. лаб. проф. Н. В. Каверин) [Kaverin et al., 2002].

Вирус A/Swine/Hong Kong/9/98-MA (H9N2) был ранее адаптирован к мышам в лаборатории физиологии вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН [Kaverin et al., 2004].

Вирусы накапливали в 10-дневных куриных эмбрионах. Эмбрионы заражали в-аллантоисную полость с множественностью 1000 ЭИД50 на эмбрион, инкубировали в течение 48 часов при 37°С, охлаждали в течение ночи при 4°С и собирали вируссодержащую аллантоисную жидкость в стерильные маркированные пробирки. Вирусы титровали в реакции гемагглютинации (РГА). Вируссодержащую аллантоисную жидкость хранили при 4°С или фасовали в криопробирки по 1 мл и хранили при - 80°С.

Моноклональные антитела (МКАТ)

Были использованы МКАТ против гемагглютинина вируса гриппа A/Vietnam/1203/04 (H5N1) (VN04-2, VN04-8, VN04-9, VN04-10, VN04-13, VN04-15, и VN04-16), МКАТ против НА вируса A/Chicken/Pennsylvania/8125/83 (H5N2) (ср46, ср55, ср58, ср79, 176/26, 364/1 и 777/1) и МКАТ против НА вируса A/Swine/Hong Kong/9/98 (H9N2) (G9-27, 7В10, 15F1 и 8С4). МКАТ были любезно предоставлены доктором Р.Г. Вебстером (Детская клиника Сент-Джуд, Мемфис, США) в виде асцитной жидкости мышей.

Получение эскейп-мутантов: селекция и клонирование

Для получения эскейп-мутантов вируса гриппа А использовали методику Вебстера и Лэйвера [Webster et al., 1980] с некоторыми модификациями. Вируссодержащую аллантоисную жидкость разводили до концентрации инфекционного вируса 2х 107 ЭИД50/мл, смешивали с равным объемом МКАТ в концентрации 256-512 ЕТГА (единица торможения гемагглютинации) и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Смесью заражали 10-дневные куриные эмбрионы в аллантоисную полость, 4 эмбриона для каждого МКАТ. Эмбрионы инкубировали при 37°С 48 часов. С собранной вируссодержащей аллантоисной жидкостью ставили РТГА с моноклональным антителом, которым обрабатывали исходный вирусный материал. Варианты, которые оказались устойчивыми к данному МКАТ, отбирали для дальнейшего проведения шестикратного клонирования в куриных эмбрионах методом предельных разведений. После каждого клонирования определяли гемагглютинирующий и инфекционный титр вируссодержащего материала. После первого, второго и последнего клонирования ставили РГГА с соответствующим

моноклональным антителом. Мутанты обозначали по названию МКАТ, использованным для их селекции.

Пассирование вируса на мышах для реадаптации.

Для реадаптации низковирулентных эскейп-мутантов проводили серийное пассирование вирусов на мышах. Белых мышей весом 6-8 г., заражали интраназально неразведенной вируссодержащей аллантоисной жидкостью. Спустя 48 часов часть мышей забивали, а другую часть оставляли, чтобы регистрировать гибель или выживание. Легкие забитых мышей подвергали гомогенизации в 3-х мл раствора Хенкса до образования однородной массы. Полученную гомогенизированную суспензию центрифугировали 10 минут при 2000 об/мин, отбирали супернатант и использовали его для дальнейшего пассирования на мышах и для постановки РГА с целью определения накопления вируса в легких. В конце серии пассажей проводили 3-х кратное клонирование вируса на куриных эмбрионах, используя метод предельных разведений, с целью получения однородной вирусной популяции.

Определение 50% летальной дозы вирусов для мышей (ЛД50).

Мышей заражали интраназально, под легким эфирным наркозом десятикратными разведениями вируса, по 8 мышей на каждое разведение. Учет количества павших и выживших мышей вели ежедневно в течение 10 дней. Среднее значение ЛД50 определяли, используя метод Кербера в модификации Ашмарина, а также метод Рида и Менча. Вирулентность вируса выражали как 1о§м (ЛД50/ ЭИД50). Достоверность различий между группами рассчитывали по критериям Фишера и Стьюдента. Параллельно с титрованием инфекционности на мышах проводили титрование вируса на куриных эмбрионах для определения соотношения ЛД50/ ЭИД50.

Получение реассортантов методом скрещивания и селекции.

Для получения реассортантов была использована методика Шульмана и Палези, с некоторыми модификациями [Яибпеуа й а1., 1993]. Вирус-родитель в титре 107- 108 ЭИД50 подвергали УФ-облучению в дозе, которая обеспечивает снижение инфекционного титра на 6 ^ ЭИД50. Облученный вирусный материал смешивали с равным объемом неразведенной аллантоисной жидкости, содержащей второй вирус-родитель в титре 5х 108 - 5><109 ЭИД50. Не разводя полученной смеси, заражали десятидневные куриные эмбрионы в аллантоисную полость. Инкубировали 10-12 часов при 37°С, тем самым давая вирусу возможность пройти только один цикл репликации. Для устранения фенотипически смешанных вирусных частиц

проводили дополнительный пассаж, используя для заражения разведенную в 100 раз аллантоисную жидкость, собранную на предыдущем этапе. Эмбрионы инкубировали при 37°С в течение 10-12 часов. Собранный материал подвергали обработке смесью МКАТ против НА того вируса-родителя, который не был инактивирован УФ облучением, и затем десятикратными разведениями обработанного материала заражали десятидневные куриные эмбрионы, по 12 эмбрионов на каждое разведение. Сбор аллантоисной жидкости производили раздельно из каждого эмбриона. Вирус, собранный из эмбрионов, зараженных предельными разведениями (не более 3 инфицированных эмбрионов из 12), использовали для дальнейшего клонирования методом предельных разведений. Клонирование проводили 6 раз. В ходе клонирования определяли специфичность НА собранного вируса в РТГА с моноклональными антителами.

Получение реассортантов сайт-специфическим мутагенезом.

Для внесения мутаций в ген НА был использован набор QuikChange II site-directed mutagenesis kit (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). Использована 8-плазмидная система, содержащая ДНК-копии геномных сегментов НА и NA вируса VNH5N1-PR8/CDC-RG (H5N1) и 6 геномных сегментов вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). В качестве вектора была использована плазмида pHW2000, любезно предоставленная доктором Р. Г. Вебстером, (Детская клиника Сент-Джуд, Мемфис, США).

Процесс внесения мутаций проходил в 3 этапа. На первом этапе посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) было получено большое количество копий вектора, содержащего геномный сегмент НА, с внесенной в НА заменой. На втором этапе продукты ПЦР обрабатывали рестриктазой Dpn I. На третьем этапе проводили трансформацию клеток Е. coli штамма ТОР-Ю ДНК, содержащими мутации. Следующим этапом было выделение высоко-копийной ДНК плазмиды из культуры бактерий. Для выделения использовали набор QIAprep Spin Miniprep Kit фирмы Qiagen.

Для выявления наличия вносимых мутаций в гене НА высоко-копийную ДНК секвенировали в Hartwell Center for Bioinformatics and Biotechnology, St. Jude Children's Research Hospital.

Плазмидную трансфекцию проводили в смешанной культуре клеток MDCK и клеток 293. Вируссодержащую культуральную жидкость использовали для заражения 10-дневных куриных эмбрионов.

Для того чтобы удостовериться в наличии нужных замен в НА и отсутствии нежелательных замен в NA, полученный вирусный материал был предварительно подготовлен и секвенирован. Предварительная подготовка заключалась в выделении

вирусной РНК, постановке ПЦР для генов НА и NA, проведении гель-электрофореза в агарозном геле и выделении из геля продуктов ПЦР (см. ниже).

Праймеры для секвенирования (Табл. 1, 2) были любезно предоставлены доктором Р. Вебстером (Детская клиника Сент-Джуд, Мемфис, США).

Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для выделения РНК из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов использовали набор «RNEasy Mini Kit» фирмы QIAGEN. Выделение РНК проводили согласно приложенным к набору методическим указаниям.

Обратную транскрипцию проводили с использованием тех же праймеров и дезоксинуклеозидов, которые в дальнейшем использовались для полимеразной цепной реакции (ПЦР). При постановке ПЦР для последующего частичного секвенирования амплификата с целью генотипирования реассортантов использовали праймеры, описанные в Табл. 3. Результаты оценивали при помощи электрофореза в агарозном геле.

Электрофорез в агарозном геле.

Анализ специфичности реакции, количества накопленного амплификата и его чистоты проводили при помощи электрофореза в 1,5 % агарозном геле. В электрофорезный буферный раствор добавляли этидиум бромид в концентрации 10 мг/мл. Для определения молекулярного веса фрагментов были использованы маркеры молекулярных весов GeneRuler™ 1 Kb DNA Ladder либо 1 Kb Plus DNA Ladder.

Автоматическое секвенирование.

Секвенирование в рамках работы по сайт-специфическому мутагенезу проводили в Hartwell Center for Bioinformatics and Biotechnology, St. Jude Children's Research Hospital. Секвенирование остальных образцов, проведено д.б.н. A.A. Шиловым. Секвенирование проводили на базе НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, с использованием секвенатора DNA ABI Prism 3130 ("Applied Biosystems") и BigDye Terminator v3.1 kit. Праймеры были подобраны таким образом, чтобы получаемые фрагменты, длинной 500 - 600 нуклеотидных остатков, перекрывались на достаточное число нуклеотидов для осуществления корректного прочтения концевых участков и точного выравнивания полученных фрагментов последовательности относительно друг друга. Для секвенирования каждого из полученных фрагментов использовали два праймера: прямой (форвард) и обратный (реверс). Нуклеотидные последовательности записывалась в файл, доступный для дальнейшей работы с ним.

Таблица 1. Праймеры для секвенирования гена гемагглютинина

Название Нуклеотидная последовательность Направление Ген

H5-543qh CATACCCAACAATAAAGAG forward HA

Н5-950 AGAGTGTCCCAAATATGTCAAATCA forward HA

H5-12S5 GAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGA forward HA

Н5-1520 AGTGTGAGAAATGGAACGTATGACTAT forward HA

H5-550R TTATTGTAGGTCCTCTTTATTGTTGG reverse HA

H5-980R CAGTTTATCTGATTTGACATATTTGGG reverse HA

H5-1275R TCTTGTTTAAATTCTCTATTCTCCTTTC reverse HA

H5-1550R GATAGTCATACGTTCCATTTCTCACACT reverse HA

Таблица 2. Праймеры для секвенирования гена нейраминедазы

Название Нуклеотидная последовательность Направление Ген

NA-l TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT forward NA

NA1-420 AGGTTTGAGTCTGTTGCTTGGT forward NA

NA1-916 GCTGGCGAAATCACATGTGTG forward NA

NA1-536R CAATGTTCTGTAAGGGCTTCT reverse NA

NA1-916R CACACATGTGATTTCGCCAGC reverse NA

NA-1413R ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGG AGTTTTTT reverse NA

Таблица 3. Набор праймеров для частичного секвенирования генов вируса гриппа А/витпе/Нопй К^/9/98-МА (Н91Ч2)

Название Нуклеотидная последовательность Направление Ген

Ba-PB2-100 GTGGACCATATGGCCATAAT forward PB2

Bm-PBl-126 AGGAACAGGATACACCATGG forward PB1

Bm-PA-723 GGATGGATTCGAACCGAACG forward PA

Bm-HA-2 GCAAAAGCAGGGGAATTTCAC forward HA

Bm-NP-54 TCAAGGCACCAAAACGATCT forward NP

Ba-NA-20 ATGAATCCAAATCAGAAGATAAT forward NA

Bm-M-33 TTCTAACCGAGGTCGAAACG forward M

Bm-NS-10 AGGGTGACAAAAACATAATGG forward NS

Ba-PB2-1602 CTCTGTTCCCTGTGTTTCAC reverse PB2

Bm-PBl-1259 AACATGCCCATCATCATTCC reverse PB1

Bm-PA-2108 ATCAGGCACTCCTCAATTGC reverse PA

Bm-HA-1741 GTAGAAACAAGGGTGTTTTTGC reverse HA

Ba-NA-1381 GAG С CTGTT С С ATAGGT ACC reverse NA

Программная обработка результатов.

Анализ нуклеотидных последовательностей.

Файлы с фрагментами нуклеотидной последовательности, каждый из которых соответствовал определенному праймеру, обрабатывались программным продуктом Lasergene sequence' analysis (DNASTAR). Для получения аминокислотных последовательностей собранные нуклеотидные последовательности транслировали, используя программу SeqMan.

Статистическая обработка результатов экспериментов.

Использовали два метода статистической обработки получаемых результатов. Случайные ошибки эксперимента вычисляли с учетом коэффициента Стьюдента. Кроме того, применялась оценка достоверности различий в опытах по иммунной защите с использованием критерия («мерила») %2 [Финни, 1957]. Значение Р (уровень значимости критерия х2) брали из таблиц, приведенных в справочной литературе [Финни, 1957]. Количество степеней свободы рассчитывали по формуле: v = (г - 1)(с - 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Антигенное картирование молекулы НА вируса подтипа H5N1

Рекомбинантный вирус VNH5N1-PR8/CDC-RG (H5N1), использованный в качестве вируса дикого типа для селекции эскейп-мутантов, содержит гены НА и NA высокопатогенного вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Вирус не обладает высокой вирулентностью, поскольку ген НА этого вируса был модифицирован сайт-специфическим мутагенезом (см. Материалы и методы). Для получения эскейп-мутантов использовали панель из 7 МКАТ VN04-2, VN04-8, VN04-9, VN04-10, VN04-I3, VN04-15 и VN04-16, полученные против штамма A/Vietnam/1203/04 (H5N1), и одно МКАТ 777/1, полученное против штамма A/Chicken/Pennsylvania/8125/83 (H5N2).

Для получения эскейп-мутантов после обработки вируса дикого типа МКАТ отбирали варианты, устойчивые к данному МКАТ по результатам РТГА. Варианты использовали для шестикратного клонирования в куриных эмбрионах методом предельных разведений. Были получены тринадцать мутантов вируса VNH5N1-PR8/CDC-RG (H5NI). По два мутанта были получены селекцией каждым из МКАТ VN04-2, VN04-9, VN04-13, VN0415, 777/1 и по одному мутанту каждым из МКАТ VN04-8, VN04-10, VN04-16. Обозначение каждого эскейп-мутанта вируса VNH5N1-PR8/CDC-RG (H5N1) включает номер

МКАТ, использованного для селекции, и номер клона. В названия мутантов вируса А/Ма11аг(1/Репп5у1уаша/10218/84 (Н5Ы2) дополнительно включено краткое обозначение вируса (Табл. 4).

Таблица 4. Перекрестная РТГА эскейп-мутантов вируса гриппа подтипа Н51\1 с панелью МКАТ, использованных для селекции мутантов.

Моноклональные антитела

вирусы VN04-2 VN04-8 VN04-9 VN04-10 VN04-13 VN04-15 VN04-16 777/1

VNH5N1-PR8/CDC-RG 102400 25600 102400 25600 25600 6400 12800 51200

ш2(1) 800 25600 25600 12800 25600 6400 12800 51200

ш2(4) 200 25600 102400 12800 25600 6400 12800 51200

т8(9) 102400 <200 102400 25600 25600 <200 12800 12800

ш9(5) 51200 6400 <200 200 12800 1600 <200 <200

т9(6) 102400 6400 <200 12800 <200 1600 6400 <200

in 10 51200 12800 <200 <200 12800 6400 <200 <200

ml3(I3) 51200 <200 51200 6400 <200 <200 6400 <200

ml3(16) 25600 3200 <200 6400 <200 1600 6400 <200

ml5(17) 51200 <200 51200 25600 3200 <200 6400 <200

ml5(20) 51200 <200 51200 25600 12800 <200 6400 25600

ml6 51200 12800 <200 <200 12800 6400 <200 <200

m777/l(2) 102400 <200 51200 25600 6400 <200 6400 <200

m777/2(4) 51200 <200 25600 12800 25600 1600 6400 <200

Курсивом отмечены значения титров РТГА МКАТ с эскейп-мутантами, где наблюдалось отсутствие реакции или снижении титра более чем на 5(то есть в 32 раза), чем титр данного МКАТ с вирусом дикого типа

Все полученные эскейп-мутанты были тестированы в реакции РТГА с панелью МКАТ (Табл. 4). Резистентными к МКАТ считали те эскейп-мутанты, которые либо не реагировали с этим МКАТ в РТГА, либо реагировали в титре по крайней мере на 5 (то есть в 32 раза) более низком, чем титр данного МКАТ с вирусом дикого типа.

Результаты реакции демонстрируют различия в специфичности МКАТ, реагирующих с НА вируса АМетат/1203/04 (Н5Ы1). Эпитопы, распознаваемые МКАТ ¥N04-9, ¥N04-10 и ¥N04-16 частично перекрываются, как и эпитопы МКАТ ¥N04-8 и ¥N04-15. Данные выявили узкую специфичность МКАТ УЫ04-2 и необычно широкую специфичность МКАТ 777/1. Результаты РТГА указывают на существование в НА двух антигенных детерминант,

каждая из которых реагирует с группой МКАТ: первая реагирует с МКАТ VN04-9, VN04-10 и VN04-16, вторая - с МКАТ VN04-8 и VN04-15.

Для выявления аминокислот, вовлеченных во взаимодействие НА вируса A/V¡etnam/1203/04 (H5N1) с МКАТ, мы провели секвенирование генов НА эскейп-мутантов. Ген НА вируса дикого типа VNH5N1-PR8/CDC-RG (H5N1) тоже был секвенирован. Секвенирование показало, что полученные эскейп-мутанты несут одну или две аминокислотные замены в составе субъединицы НА1 (Табл. 5). В субъединице НА2 замены отсутствуют.

Аминокислотные замены, селекционированные МКАТ VN04-8 и VN04-15, были расположены в районе 140-145 (нумерация по НЗ), то есть в участке, образующем антигенный сайт А в молекуле НА подтипа НЗ [Wiley et al., 1981]. Мутации, селекционированые МКАТ VN04-2, VN04-9, VN04-10, VN04-16, сгруппированы в районе, простирающемся от позиции 155 до позиции 166, что соответствует части антигенного сайта В мол. НА подтипа НЗ и части антигенного сайта Sa подтипа HI [Catón et al., 1982].

Под действием МКАТ VN04-13 были отобраны два мутанта, имеющие аминокислотные замены в двух разных участках. Мутант ш13(13) имел замену S145F в петле 140-145, что объясняет его резистентность к МКАТ VN04-8 и VN04-15. Другой мутант ш13(16) не имел замен в этом сайте. Напротив, он имел две мутации (D187N и К193Е) в участке, соответствующем части сайта В подтипа НЗ. Замена К193Е, очевидно, является антигенно значимой, так как МКАТ VN04-13 не реагировало с мутантом ш9(6), который тоже имеет замену К193Е.

МКАТ 777/1 также распознавало замены в двух удаленных участках антигенного сайта. Аминокислотные замены в области, соответствующей сайту В подтипа НЗ (позиции 156 и 193), так же как и аминокислотная замена в позиции 145 в участке, соответствующем сайту А, устраняли реакцию этого МКАТ с эскейп-мутантами. Однако оба мутанта, отобранные МКАТ 777/1, имели замены в позиции 145, S145P для мутанта ш777/1(2) и S145T для ш777/1(4).

Таблица 5. Аминокислотные замены в генах НА эскейп-мутантов вируса гриппа подтипа Н51Ч1

Аминокислотные замены

Эскейп-мутанты -

НЭ нумерация " Н5 нумерация *

т2(1) S126Y; I155T S121Y; I151T

т2(4) R166G R162G

ш8(9) K144E K140E

т9(5) K156E K152E

m 9(6) T160A; K193E T156A;K189E

тЮ K156E K152E

т13(13) S145F S141F

т13(16) D187N; K193E D183N; K189E

т15(17) S145P S141P

m 15(20) G143E G139E

ml6 K156N K152N

m777/l(2) S145P S141P

m777/2(4) S145T S141T

mDK/PA/777/l(5) S145Y S141Y

mDK/PA/777/l(7) S145F S141F

"Аминокислотная нумерация по подтипам НА НЗ и 115

Чтобы расширить данные по антигенной специфичности МКАТ, использованных нами для селекции эскейп-мутантов, представлялось целесообразным исследовать их в перекрестной РТГА с одиночными, двойными и тройными эскейп-мутантами вируса A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2), полученными и описанными ранее [Kaverin et al., 2002].

Результаты РТГА МКАТ, полученных к вирусу A/Vietnam/1203/04 (H5N1), с эскейп-мутантами вируса A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) подтвердили и расширили данные, полученные при характеристике эскейп-мутантов, селекционированных МКАТ к вирусу A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Эти результаты позволяют нам разделить МКАТ на 3 группы. МКАТ VN04-2, VN04-9, VN04-10, VN04-16 реагируют со сложным эпитопом, содержащим часть антигенного сайта В молекулы НА подтипа НЗ и часть сайта Sa мол. НА подтипа Н1, причем эпитоп, распознаваемый каждым МКАТ, охватывает лишь небольшую часть этого сайта. Два МКАТ, VN04-8 и VN04-15, реагируют с эпитопом, соответствующим сайту А НА подтипа НЗ. Эпитопы, распознаваемые МКАТ VN04-13 и 777/1 включают аминокислотные остатки, локализованные в двух разных антигенных сайтах.

Полученные данные секвенирования эскейп-мутантов вируса УЫШШ-РКЯ/СОС-КО (Н5М1)были использованы для определения локализации антигенных сайтов в трехмерной структуре молекулы гемагглютинина подтипа Н5 (Рис.1).

Рис. 1. Схематическое расположение антигенных сайтов НА подтипа Н5 в трехмерной структуре молекулы (вид с дистального конца глобулы). Сайт А обозначен зеленым цветом; Сайт В обозначен синим цветом. Нумерация аминокислот по НЗ.

Картирование было осуществлено с помощью программы RasMol 2,6, трехмерная структура НА вируса A/Duck/Singapore/3/97 (H5N1) была взята из Protein Data Bank (номер 1JSM). Картирование показало, что аминокислотные замены, расположенные в позициях 140-145, находятся в латеральной петле глобулы (в области, соответствующей антигенному сайту А в молекуле НА подтипа НЗ) и в широкой зоне дистальной части глобулы, простирающейся от позиции 155 до позиции 166 и включающей позицию 193, что соответствует части антигенного сайта В молекуле НА подтипа НЗ и части сайта Sa НА подтипа HI.

Полученные данные дают более полную информацию о протяженности и структуре антигенных сайтов в структуре молекулы НА подтипа Н5, нежели результаты, полученные в предыдущих работах [Kaverin et al., 2002, Kaverin et al., 2004]. Выявлены 4 позиции аминокислотных замен, которые не были описаны ранее в антигенных сайтах НА подтипа Н5 (143, 155, 166 и 193). Роль трех замен (в позициях 143, 166 и 193) очевидна. Картирование в трехмерной структуре демонстрирует, что участки, соответствующие сайту А и В у НЗ,

расположены в НА подтипа Н5 намного ближе друг к другу, чем сайты А и В в молекуле НА подтипа НЗ [Wiley et al., 1981]. Следует полагать, что выявленная в нашей работе способность анти-Н5-МКАТ VN04-13 и 777/1 перекрывать два антигенных сайта объясняется именно этой особенностью антигенной архитектуры молекулы НА подтипа Н5 (Рис. 2).

Рис. 2. Антигенные сайты гемагглютинина подтипа Н5 (вид сверху)

Примечание: верхний рисунок - взаимодействие моноклонального антитела У1Х04-13 с сайтами А и В; нижний рисунок - взаимодействие моноклонального антитела 777/1 с сайтами А и В; сайт А обозначен зеленым цветом; сайт В обозначен синим цветом цифрами обозначены позиции аминокислот в нумерации НЗ

Аминокислотные замены в НА эскейп-мутантов, часто совпадают с аминокислотными заменами у изолятов Н5Ы1, относящихся к разным ветвям филогенетического дерева (клэйдам). Поэтому обнаруженные нами эффекты влияния аминокислотных замен в НА на вирулентность вируса могут иметь существенное значение для понимания вариаций вирулентности вирусов подтипа Н5Ш.

Сравнительная характеристика вирулентности эскейп-мутантов при интраназальном

заражении мышей

Определение вирулентности у полученных нами эскейп-мутантов подтипа Н5 представляет интерес в связи с потенциалом вируса подтипа Н5Ж как эпидемиологически важного агента и его антигенной эволюцией.

Были исследованы на вирулентность для мышей 13 полученных эскейп-мутантов с одной или двумя аминокислотными заменами в антигенно значимых зонах (Табл. 6).

Таблица 6. Влияние аминокислотных замен в НА эскейп-мутантов на вирулентность для мышей

Вирусы Вирулентность** Замена в НА*

УШ5Ш-Р1Ш;ОС-[Ш (Н5Ш) 4,04±0,58 -

ш8(9) 4,32±0,34 К144Е

ш13(13) 6,10±0,28 5145Р

ш13(16) 3,49±0,55 0187М, К193Е

ш15(17) 4,37±0,30 Э145Р

ш15(20) 4,62±0,54 вМЗЕ

ш2(1) 3,75±0,78 Б126У, И55Т

ш2(4) 4,04±0,54 Я1660

ш9(5) 4,37±0,47 К156Е

ш9(6) 3,62±0,92 Т160А, К193Е

шЮ 4,36±0,28 К156Е

ш16 3,62±0,78 К156Ы

т777/1(2) 4,35±0,32 Б145Р

т777/1(4) 4,15±0,24 8145Т

М1с1/РА/84-МА 3,52 ± 0,68 -

пОЖ/РА/777/1(5) 3,81 ±0,48 Б145У

тОК/РА/777/1(7) 6,37 ±0,36 8145Р

*Нумерация по НА подтипа НЗ

**Вирулентность выражена как ЛД50/ ЭИД50 ± стандартная ошибка среднейх^, где ^ коэффициент Стьюдента с вероятностью а = 0,95

Вирулентность эскейп-мутантов была сопоставлена с вирулентностью исходного вируса УНН5М1-РК8/СОС-ЯО. Уровень вирулентности выражали как отношение

ЛД50/ЭИД50, то есть чем выше значение, указанное в таблице, тем ниже вирулентность. Значительное и статистически достоверное снижение вирулентности наблюдается у мутанта ш13(13), имеющего замену S145F в латеральной петле, соответствующей сайту А подтипа НЗ. При этом мутанты, имевшие иные замены по этой позиции (S145Y и S145T) сохраняли уровень вирулентности вируса дикого типа. Уровень вирулентности остальных эскейп-мутантов вируса VNH5N1-PR8/CDC-RG не имеет статистически достоверных отличий от вирулентности вируса дикого типа.

Для того, что бы расширить данные по вирулентности мы провели селекцию эскейп-мутантов вируса A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) с помощью МКАТ 777/1. Были получены 2 эскейп-мутанта, mDK/PА/777/1 (5) и mDK/PA/777/l(7) с аминокислотными заменами в НА соответственно S145Y и S145F. Определение вирулентности для мышей показало, что мутант mDK/PA/777/l(7), имеющий замену S145F, обладал сниженной вирулентностью по сравнению с исходным адаптированным к мышам вирусом A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2). Вирулентность этого мутанта была близкой к вирулентности эскейп-мутанта т13(13) вируса VNH5N1-PR8/CDC-RG, имеющего ту же замену (Табл. 6). Этот результат указывает на замену S145F как на вероятную причину снижения вирулентности.

Эскейп-мутанты ш13(13) и mDK/PA/777/l(7), как показало параллельное титрование инфекционное™ на мышах и на куриных эмбрионах, обладают очень низкой вирулентностью и вызывают гибель мышей только при инокуляции высокой дозы вируса (Табл. 6). Была предпринята попытка повысить вирулентность этих эскейп-мутантов посредством серийных пассажей на мышах при интраназальной инокуляции, то есть провести реадаптацию мутантов к мышам. Для каждого низковирулентного эскейп-мутанта было получено по 4 реадаптированных варианта. Было проведено секвенирование генов НА реадаптированных вариантов. Секвенирование показало, что все реадаптированные варианты сохранили замену S145F. Реадаптированные варианты мутанта т13(13) приобрели дополнительную замену в позиции 186. Реадаптированные варианта RAml3(13)12, RAml3(13)16 и RAml3(13)17 имели замену N1861, а вариант RAml3(13)13 имел замену N186T. Ни у одного из четырех реадаптированных вариантов мутанта mDK/P А/777/1 (7) не возникли новые аминокислотные замены в НА.

Была определена вирулентность полученных реадаптантов. Уровень вирулентности всех реадаптированных вариантов превышал вирулентность вируса дикого типа (Табл. 7). При этом уровень вирулентности варьировал, различаясь даже у тех клонов, которые имели одинаковую замену в положении 186. Эти вариации вирулентности, так же как и отсутствие аминокислотных замен в НА у реадаптированных вариантов мутанта mDK/P А/777/1 (7),

указывали на возможное участие иных генов, нежели НА, в усилении вирулентности, хотя и не исключали роли аминокислотной замены в НА в позиции 186. Подтверждение роли иных генов, нежели ген НА, в усилении вирулентности при пассажах было получено при пассировании на мышах вируса дикого типа УМН5М1-РК.8/СВС-КО. В результате после 9 интраназальных пассажей было получено 4 варианта: УЫ-ЯС/9р1, \Т\[-1Ш/9рЗ, УМ-1Ш/9р4, и УМ-1Ю/9р6. Вирулентность полученных четырех пассированных вариантов значительно превышала вирулентность вируса дикого типа УМИбШ-РЯВ/СОС-КО, причем один из этих вариантов (\П\[-1Ю/9р1) не имел замен в НА (Табл. 7). Эти данные однозначно указывают на возможность восстановления вирулентности эскейп-мутантов при пассировании за счет мутаций в иных генах, нежели НА.

Таблица 7. Усиление вирулентности при пассировании на мышах вируса дикого типа УМ15М-РК8/СОС-11С и низковирулентных эскейп-мутантов ш13(13) и шОК/РА/7771(7)

Вирус Аминокислотные замены в НА* Вирулентность**

угчн5ш-Р1Шсос:-кс - 4,04 ±0,58

У1Ч-ЯС/9р1 - 2,15 ±0,28

УГ\'-1*С/9рЗ Т219А 1,87 ±0,36

У1М-КС/9р4 Р221Б 2,20 ± 0,30

У1Ч-КС/9р6 вгозр 1,75 ±0,52

ш13(13) Б145Р 6,10 ±0,28

ИАт13(13)12 Э145Р; N1861 1,75 ±0,42

11АтгЗ(13)13 8145Р;Ш86Т 2,73 ± 0,38

КАт13(13)16 8145Б; N1861 3,04 ± 0,48

1*Ат13(13)17 5145Р; N1861 2,02 ±0,38

М1с1/РА/84-МА - 3,52 ±0,68

тОК/РА/777/1(7) Э145Р 6,37 ± 0,36

1ШтОК/РА/777/1(7)8 Б145Р 3,25 ± 0,28

ИА/шО К/РА/777/1 (7) 9 5145Р 3,22 ± 0,66

КА/тОК/РА/777/1(7)М Э145Р 3,29 ± 0,54

КА/тБК/РА/777/1(7)13) Э145Р 4,12 ±0,44

*Нумерация по НА подтипа НЗ

"Вирулентность выражена как ^ ЛД50/ ЭИД50 ± стандартная ошибка средней*^, где („ коэффициент Стьюдента с вероятностью а = 0,95

Реассортационный анализ генетических основ вирулентности низковирулентного эскейп-мутанта и его реадаптированного варианта

Поскольку целью настоящего исследования было изучение роли мутаций в гене НА в изменениях уровня вирулентности, мы не проводили идентификацию мутаций, возникающих в иных вирусных генах в процессе реадаптации. Напротив, нам представлялось необходимым устранить влияние иных генов, с тем, чтобы определить влияние аминокислотных замен в НА на снижение вирулентности у эскейп-мутанта и на ее усиление при реадаптации. Для этого следовало получить набор реассортантов, у которых все гены, кроме гена НА, были бы одинаковыми, а ген НА был бы получен либо от вируса дикого типа, либо от низковирулентного эскейп-мутанта, либо от реадаптированного варианта (Рис. 3). В качестве донора всех генов, кроме НА, мы использовали ранее адаптированный к мышам в лаборатории физиологии вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского вариант вируса А/8\ипе/Н<^ Коп&адв (Н9Ш) (3\¥/НК/9/98-МА) [Кауепп е! а!., 2004].

Рис. 3. Получение реассортантов, содержащих ген НА либо вируса дикого типа, либо от низковирулентного эскейп-мутанта, либо от реадаптированного варианта. Все остальные гены получены от вируса 8и/ПК/9/98-МА

Для определения вирулентности были выбраны 3 реассортанта, УК-БХУ^), ш13(13)-SW(6) и КАт13(13)16-5\У(21), содержавшие 7 генов вируса 8«</НК/9/98-МА и получившие ген НА соответственно от вируса УМН5Ш-Р118/СОС-1Ш, от мутанта ш13(13) и от реадаптированного варианта ЯАт13(13)16. Результаты определения вирулентности выявили у реассортанта, имеющего ген НА дикого типа, уровень вирулентности, близкий к вирулентности вирусов-родителей. Реассортант, содержавший ген НА эскейп-мутанта, имел уровень вирулентности, сниженный на 1,5 ЛД50/ ЭИД50 по сравнению с вирулентностью исходного вируса. У реассортанта, содержащего НА реадаптированного варианта, уровень вирулентности оказался восстановленным (Табл. 8). Таким образом, определение вирулентности одногенных реассортантов подтвердило значение аминокислотных замен в НА для снижения вирулентности эскейп-мутанта и для восстановлении вирулентности при его реадаптации.

Таблица 8. Вирулентность «одногенных» реассортантов, получивших ген гемагглютинина Н5 от вируса дикого типа, от эскейп-мутанта и от реадаптированного варианта

Вирус Аминокислотные замены в НА* Вирулентность**

У1Ч-8^¥(7) - 3,50 ±0,38

т13(13)-8\У(6) 5145Р 5,04 ± 0,28

1*Ат13(13)16-5\У(21) Э145Р; N1861 3,32 ± 0,32

*Нумерации по НА подтипа НЗ

*Вирулентность выражена как ЛД50/ ЭИД50 ± стандартная ошибка среднеИх^, где ^ коэффициент Стьюдента с вероятностью а = 0,95

Результаты исследования свойств «одногенных» реассортантов, содержащих НА либо вируса дикого типа, либо эскейп-мутанта, либо реадаптированного варианта, а остальные 7 генов получивших от другого вируса-родителя, подтвердили вероятную роль мутаций в НА в снижении вирулентности эскейп-мутантов и в восстановлении вирулентности при реадаптации. Однако реассортанты были получены классической методикой скрещивания с последующей селекцией нейтрализующими антителами. Поскольку этот подход требует значительного количества пассажей при скрещивании и клонировании, обычно у реассортантных клонов в разных генах могут возникать нуклеотидные, а иногда и аминокислотные замены. Такая замена была выявлена у реассортанта 11Ат13(13)16-5\У(21) в гене РВ2 (0195Ы). Чтобы исключить влияние таких замен на фенотипические свойства реассортантов, мы прибегли к методу сайт-специфического мутагенеза, при котором

мутации, соответствующие мутациям в НА эскейп-мутанта и реадаптированного варианта, вводились непосредственно в ген НА.

Путем плазмидной трансфекции были получены 3 рекомбинантных вируса, содержащих 6 внутренних генов вирулентного для мышей штамма A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Ген NA у рекомбинантных вирусов был получен от вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Ген НА у реассортанта rg-Viet/1203/04><PR/8 был идентичен гену НА вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1) с удаленным сайтом разрезания. Гены НА у реассортантов rg-Viet/1203/04*PR/8-145F и rg-Viet/1203/04xPR/8-145F-186I были идентичны соответственно гену НА низковирулентного мутанта ш13(13) и гену НА его реадаптированного варианта Raml3(13)16,

Для определения вирулентности мышей линии BALB/c 8-недельного возраста заражали 10-кратными разведениями вируса интраназально под изофлюрановым наркозом и наблюдали в течение 25 дней с регистрацией летальности и ежедневным взвешиванием. Одновременно с заражением мышей вирус титровали методом предельных разведений на 10-дневных эмбрионах кур для определения ЭИД50. Определение вирулентности для мышей показало, что мутант rg-Viet/1203/04xPR/8-145F, содержащий аминокислотную замену S145F в НА, имеет сниженную вирулентность по отношению к вирусу rg-Viet/1203/04xPR/8, не имеющему замен в НА (Табл. 9). Дополнительная замена N1861, аналогичная замене в НА реадаптированных вариантов RAml3(13)12, RAml3(13)16 и RAml3(13)17, полностью восстанавливает вирулентность до уровня вирулентности реассортанта A/Viet/1203/04xPR/8, содержащего ген НА без сайт-специфических мутаций. Снижение и восстановление вирулентности четко выявляются по динамике гибели зараженных мышей (Рис. 4).

Таблица 9. Вариации вирулентности для мышей линии ВАЬВ/с у рекомбинантных вирусов, полученных сайт-специфическим мутагенезом и плазмидной трансфекцией

Вирус Аминокислотные замены в НА* Вирулентность**

rg-Viet/1203/04 xPR/8 - 2,91 ±0.42

rg-Viet/1203/04xPR/8-145F S145F 3,92 ±0.31

rg-Viet/1203/04*PR/8-J45F-l86I SI45F; N1S6I 2,83 ± 0.32

*Нумерация по НА подтипа НЗ.

**Вирулентность выражена как ^ ЛДго/ ЭИД50 ± стандартная ошибка средней*^, где 1а коэффициент Стьюдента с вероятностью а = 0,95

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Рис. 4. Гибель мышей линии ВЛЬВ/с при заражении вирусами, полученными плазмидной трансфекциеи. Доза заражения 104,5 ЭИДзо- Кривая 1 - г§-\Че1/1203/04*141/8, кривая 2 - ^-У1е1/1203/04хРШ8-145Р, кривая 3 - ^-У|е(/1203/04хРН/8-145Р-1861. По оси абсцисс - дни после заражения. По оси ординат - количество живых мышей.

Выводы

1. Впервые осуществлено антигенное картирование молекулы гемагглютинина (НА) высокопатогенного вируса гриппа H5N1 с использованием трехмерной модели гемагглютинина подтипа Н5 посредством селекции эскейп-мутантов моноклональными антителами с последующим секвенированием мугантных генов НА и определения их перекрестной реактивности с моноклональными антителами.

2. Определена локализация, протяженность и структура двух антигенных сайтов в трехмерной структуре молекулы НА вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1).

3. Выявлены особенности моноклональных антител против НА вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1), отличающие их от охарактеризованных ранее моноклональных антител против НА подтипа Н5. Идентифицированы 4 ранее не описанные аминокислотные позиции в НА подипа Н5, распознаваемые моноклональными антителами. В Зх других позициях выявлены ранее не описанные аминокислотные замены, меняющие антигенную специфичность НА.

4. Впервые выявлена способность некоторых моноклональных антител против НА подтипа Н5 распознавать аминокислотные позиции, локализованные в двух разных антигенных сайтах.

5. У двух эскейп-мутантов, имеющих аминокислотную замену S145F в НА, выявлено резкое снижение вирулентности для мышей. Реадаптация низковирулентных эскейп-мутантов посредством пассажей на мышах при интраназальном заражении приводила к восстановлению вирулентности.

6. Реассортационный анализ, проведенный с использованием скрещивания и с применением сайт-специфического мутагенеза, показал, что снижение вирулентности эскейп-мутантов, имеющих замену S145F в НА, вызвано именно этой заменой. Восстановление вирулентности при пассировании низковирулентных эскейп-мутантов может быть обусловлено как дополнительными мутациями в гене НА, так и изменениями в других генах.

7. Аминокислотные замены в НА эскейп-мутантов вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1), совпадают с аминокислотными заменами у природных высокопатогенных изолятов H5N1, относящихся к разным ветвям филогенетического дерева. Это указывает на существенное значение вариаций антигенных сайтов, идентифицированных и

охарактеризованных в настоящей работе, для эволюции иммунологических свойств и вирулентности вирусов подтипа H5N1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kaverin N.V., Rudneva I.A., Govorkova Е.А., Timofeeva T.A., Shilov A.A., Kochergin-Nikitsky K.S., Krylov P.S., Webster R.G. Epitope mapping of the hemagglutinin molecule of a highly pathogenic H5N1 influenza virus by using monoclonal antibodies. Journal of Virology. 2007,81,12911-12917.

2. Руднева И.А., Каверин H.B., Тимофеева T.A., Шилов А.А., Варнч H.JI., Кочергин—Никитский К.С., Крылов П.С., Львов Д.К. Оптимизация генного состава реассортантов, содержащих геммаглютиннн вируса гриппа подтипа Н5, и их эффективность в опытах перекрестной иммунной защиты. Вопросы вирусологии. 2008, Т.53, №1, стр. 24-27.

3. Крылов П.С., Руднева И.А., Тимофеева Т.А., Шилов А.А., Игнатьева А.В., Говоркова Е.А., Каверин II.B. Аминокислотные замены в гемагглютинине вируса гриппа подтипа Н5, влияющие на антигенную специфичность и вирулентность вируса. Вопросы вирусологии. 2009, Т.54, №5, стр. 14-19.

4. Kaverin N.V., Rudneva I.A., Govorkova Е.А., Shilov A.A., Timofeeva T.A., Ilyushina N.A., Khalenkov A.M., Krylov P.S., Webster R.G. Mutations in hemagglutinin of H5 and H9 influenza virus escape mutants acquired during re-adaptation to mice restore virulence to wild-type level. International Union of Microbiological Societies, XIV. International Congress of Virology, Istanbul, Turkey, 10-15 August, 2008, VP-504.

5. Krylov P.S., Rudneva I.A., Shilov A.A., Timofeeva T.A., Kaverin N.V. Decrease and restoration of virulence of H5 influenza virus by amino acid changes in the HA. American Society for Virology, 28th Annua! Meeting, Vancouver, ВС, Canada, 11-15 July, 2009, W50-1.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубочайшую благодарность моему научному руководителю доктору медицинских наук, академику РАМН, заведующему лабораторией физиологии вирусов Каверину Николаю Вениаминовичу за предоставление возможности проводить данные исследования, определение целей, всестороннюю помощь и внимание к проводимой работе. Искренне благодарю ведущего научного сотрудника лаборатории физиологии вирусов Рудневу Ирину Александровну за поддержку, понимание и терпение, всемерную помощь и ценные советы в работе. Благодарю ведущего научного сотрудника Шилова Александра Александровича за помощь в проведении секвенирования. Выражаю благодарность старшему научному сотруднику Говорковой Елене Анатольевне за помощь, поддержку в проведении работы по сайт-специфическому мутагенезу и плазмидной трансфекции. Благодарю старшего научного сотрудника лаборатории физиологии вирусов Тимофееву Татьяну Анатольевну, ведущего научного сотрудника лаборатории физиологии вирусов Варич Наталью Львовну и остальных сотрудников лаборатории физиологии вирусов за помощь и поддержку в ходе проведения научной работы. Выражаю благодарность и признательность директору НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, академику РАМН Д. К. Львову за предоставленную возможность проведения работы.

Подписано в печать: 26.04.10

Объем: 1,5 усл.печ.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 256 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г.Москва, пр-т Вернадского, 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антигенное картирование молекулы гемагглютинина вируса гриппа H5N1 и влияние изменения антигенной структуры на вирулентность"

Актуальность темы.6

Цели исследования.9

Научная новизна и практическое значение работы.11

Основные положения, выносимые на защиту.:.12

Часть I. Обзор литературы.14

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Крылов, Петр Сергеевич

Выводы

1. Впервые осуществлено антигенное картирование молекулы гемагглютинина (НА) высокопатогенного вируса гриппа H5N1 с использованием трехмерной модели гемагглютинина подтипа Н5 посредством селекции эскейп-мутантов моноклональными антителами с последующим секвенированием мутантных генов НА и определения их перекрестной реактивности с моноклональными антителами.

7. Аминокислотные замены в НА эскейп-мутантов вируса АЛ/1е1:пат/1203/04 (Н5Ш), совпадают с аминокислотными заменами у природных высокопатогенных изолятов Н5№, относящихся к разным ветвям филогенетического дерева. Это указывает на существенное значение вариаций антигенных сайтов, идентифицированных и охарактеризованных в настоящей работе, для эволюции иммунологических свойств и вирулентности вирусов подтипа Н5]Ч1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Крылов, Петр Сергеевич, Москва

1. Ашмарин И.П. Вычисление LD50 при малом числе подопотных животных. ЖМЭИ. 1959, 2, стр. 102.

2. Бейли Н. Математика в биологии и медицине. Мир. 1970.

3. Бессмертный B.C., Ткачева М.Н. Статистические методы в эпидемиологии. Гос. Издат. Мед. Лит. 1961.

4. Букринская А.Г. Вирусология. Москва. Медицина. 1986, стр. 274-288.

5. Гендон Ю.З. Эпизоотии гриппа птиц и борьба с ними. Журн. микробиол. 2006, № 5, стр. 17-28.

6. Гмурман В.Е. Теория вероятностей и математическая статистика (4-е издание). Москва. Высшая школа. 1972, стр. 145-146.

7. Карпухин Г.И. Грипп: Руководство для врачей. Санк-Петербург, издательство Гиппократ. 2001, стр. 360.

8. Кингсбери Д.У. Орто- и парамиксовирусы и их репликация. Вирусология. Под ред. Б. Филдса и Д. Найпа, Москва. Мир. 1989, Том 2, стр. 446-486.

9. Львов Д.К., Ямникова С.С., Федякина И.Т., Аристова В.А., Львов Д.Н., Ломакина Н.Ф., Петрова Е.С., Злобин В.И., Хаснатинов М.А., Чепургина Е.А., Ковтунов А.И., Джаркенов А.Ф., Санков М.Н.,

10. Леонова Г.Н., Маслов Д.В., Щелканов М.Ю., Непоклонов Е.А., Алипер Т.И. Экология и эволюция вирусов гриппа в России (1979-2002). Вопр. вирусол. 2004, Т.49, № 3, стр. 17-24.

11. Львов Д.К., Прилипов А.Г., Щелканов М.Ю., Дерябин П.Г., Шилов

12. Смирнов Ю.А., Липатов А.С., Окуно И., Гительман А.К. Общий антигенный эпитоп в гемагглютинине вирусов гриппа А (HI, Н2, Н5, Н6). Вопр. вирусол. 1999, т.44, №3, стр. 111-115.

13. Соколов Б.П., Руднева И.А. Изучение изменчивости белков вируса гриппа А. Вопр. вирусол. 1981, №1, Т.4, стр. 471-477.

14. Финни Д.Д. Применение статистики в опытном деле. Москва, Государственное статистическое издательство. 1957, стр. 14-32.

15. Шубладзе А.К., Гайдамович С .Я. Краткий курс практической вирусологии. Москва. Медгиз. 1964, стр. 379.

16. Allen Н., McCauley J., Waterfield М., Gething M.J. Influenza virus RNA segment 7 has the coding capacity for two polypeptides. Virology. 1980, 107, 548-51.

17. Area E., Martin-Benito J., Gastaminza P., Torreira E., Valpuesta J.M., Carrascosa J.L., Ortin J. 3D structure of the influenza virus polymerase complex: localization of subunit domains. Proc Natl. Acad. Sci. 2004, 101,308-313.

18. Austin F.J., Webster R.G. Antigenic mapping of an avian HI influenza virus hemagglutinin and interrelationships of HI viruses from humans, pigs and birds. J.Gen.Virol. 1986, 67, 983-992.

19. Biswas S.K, Nayak D.P. Mutational analysis of the conserved motifs of influenza A virus polymerase basic protein 1. J. Virol. 1994, 68, 1819-1826.

20. Blaas D., Patzelt E., Kuechler E. Identification of the cap binding protein of influenza virus. Nucleic Acids Res. 1982, 10, 4803-4812.

21. Bosch F., Orlich M., Klenk H.D., Rott R. The structure of the hemagglutinin, a determinant for the pathogenicity of influenza viruses. Virology. 1979, 95, 197-207.

22. Both G.W., Sleigh M.J. Conservation and variation in the hemagglutinins of Hong Kong subtype influenza viruses during antigenic drift. J. Virol. 1981, 39, 663-72.

23. Braam J., Ulmanen I., Krug R.M. Molecular model of a eucaryotic transcription complex: functions and movements of influenza P proteins during capped RNA-primed transcription. Cell. 1983, 34, 609-618.

24. Brand C.M., Skehel J.J. Crystalline antigen from the influenza virus envelope. Nat. New Biol. 1972, 238, 145-147.

25. Brown E.G. Increased virulence of a mouse-adapted variant of influenza A/FM/1/47 virus is controlled by mutations in genome segments 4, 5, 7, and 8. J. Virol. 1990, 64, 4523-4533.

26. Caton A.J., Browlee G.G., Yewdell J.W., Gerhard W. The antigenic structure of the influenza virus A/PR/8/34 hemagglutinin (HI subtype). Cel. 1982,31,417-427.

27. Chen G.W., Chang S.C., Mok C.K., Lo Y.L., Kung Y.N., Huang J.H., Shih Y.H., Wang J.Y., Chiang C., Chen C.J., Shih S.R. Genomic signatures of human versus avian influenza A viruses. Emerg. Infect. Dis. 2006, 12, 1353-1360.

28. Chen H., Bright R.A., Subbarao K., Smith C., Cox N.J., Katz J.M., Matsuoka Y. Polygenic virulence factors involved in pathogenesis of 1997 Hong Kong H5N1 influenza viruses in mice. Virus Res. 2007, 128, 159-163.

29. Chen H., Smith G.J., Zhang S.Y., Qin K., Wang J., Li K.S., Webster R.G., Peiris J.S., Guan Y. Avian flu: H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl. Nature. 2005, 436, 191-192.

30. Chen W., Calvo P.A., Malide D., Gibbs J., Schubert U., Bacik I., Basta S., O'Neill R., Schickli J., Palese P., Henklein P., Bennink J.R., Yewdell J.W. A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death. Nat. Med. 2001,7, 1306-1312.

31. Cianci C., Tiley L., Krystal M. Differential activation of the influenza virus polymerase via template RNA binding. J. Virol. 1995, 69, 3995-3999.

32. Claas E.C., Osterhaus A.D., van Beek R., De Jong J.C., Rimmelzwaan G.F., Senne D.A., Krauss S., Shortridge K.F., Webster R.G. Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet. 1998,351,472-477.

33. Colman P.M. Influenza virus neuraminidase: enzyme and antigen. The Influenza Viruses. 1989, 175-218.

34. Colman P.M. Influenza virus neuraminidase: structure, antibodies, and inhibitors. Protein Sci. 1994, 3, 1687-1696.

35. Colman P.M., Hoyne P.A., Lawrence M.C. Sequence and structure alignment of paramyxovirus haemagglutinin-neuraminidase (HN) with influenza virus neuraminidase. J. Virol. 1993, 67, 2972-2980.

36. Colman P.M., Varghese J.N., Laver W.G. Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virus neuraminidase. Nature. 1983, 303, 41-44.

37. Compans R.W. Influenza virus proteins. II. Association with components of the cytoplasm. Virology. 1973, 51, 56-70.

38. Compans R.W., Content J., Duesberg P.H. Structure of the ribonucleoprotein of influenza virus. J. Virol. 1972, 10, 795-800.

39. Conenello G.M., Zamarin D., Perrone L.A., Tumpey T., Palese P. A single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence. PLoS. Pathog. 2007, 3, 1414-1421.

40. Cox N.J., Bender C. The molecular epidemiology of influenza viruses. Virology. 1995, 6, 359-370.

41. Deng T., Sharps J., Fodor E., Brownlee G.G. In vitro assembly of PB2 with a PB1-PA dimer supports a new model of assembly of influenza A viruspolymerase subunits into a functional trimeric complex. J. Virol. 2005, 79, 8669-8674.

42. Dias A., Bouvier D., Crepin T., McCarthy A.A., Hart D.J., Baudin F., Cusack S., Ruigrok R.W. The cap-snatching endonuclease of influenza virus polymerase resides in the PA subunit. Nature. 2009, 458, 914-918.

43. Dopheide T.A., Ward C.W. The carboxyl-terminal sequence of the heavy chain of a Hong Kong influenza haemagglutinin. Eur. J. Biochem. 1978, 85, 393-398.

44. Dybing J.K., Schultz-Cherry S., Swayne D.E., Suarez D.L., Perdue M.L. Distinct pathogenesis of Hong Kong-origin H5N1 viruses in mice compared to that of other highly pathogenic H5 avian influenza viruses. J. Virol. 2000, 74, 1443-1450.

45. Engelhardt O.G., Smith M., Fodor E. Association of the influenza A vims RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 2005, 79, 5812-5818.

46. Finkelstein D.B., Mukatira S., Mehta P.K., Obenauer J.C., Su X., Webster R.G., Naeve C.W. Persistent host markers in pandemic and H5N1 influenza viruses. J. Virol. 2007, 81, 10292-10299.

47. Flanagan M.T., Skehel J.J. The conformation of influenza virus haemagglutinin. FEBS Lett. 1977, 80, 57-60.

48. Fodor E., Crow M., Mingay L.J., Deng T., Sharps J., Fechter P., Brownlee G.G. A single amino acid mutation in the PA subunit of the influenza virus RNA polymerase inhibits endonucleolytic cleavage of capped RNAs. J. Virol. 2002, 76, 8989-9001.

49. Fodor E., Mingay L.J., Crow M., Deng T., Brownlee G.G. A single amino acid mutation in the PA subunit of the influenza virus RNA polymerasepromotes the generation of defective interfering RNAs. J. Virol. 2003, 77, 5017-5020.

50. Fodor E., Smith M. The PA subunit is required for efficient nuclear accumulation of the PB1 subunit of the influenza A virus RNA polymerase complex. J. Virol. 2004, 78, 9144-9153.

51. Gabriel, G., Dauber B., Wolff T., Planz O., Klenk H. D., Stech J. The viral polymerase mediates adaptation of an avian influenza virus to a mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. 2005, 102, 18590-18595.

52. Gao P., Watanabe S., Ito T., Goto H., Wells K., McGregor M., Cooley A. Kawaoka Y. Biological heterogeneity, including systemic replication in mice, of H5N1 influenza A virus isolates from humans in Hong Kong. J. Virol. 1999, 73,3184-3189.

53. Gerhard W., Yewdell J., Frankel M. In. Structure and Variation in Influenza Virus. N. Y. Elsevier. 1980, 273-280.

54. Gibbs J.S., Malide D., Hornung F., Bennink J.R., Yewdell J.W. The influenza A virus PB1-F2 protein targets the inner mitochondrial membranevia a predicted basic amphipathic helix that disrupts mitochondrial function. J. Virol. 2003, 77, 7214-7224.

55. Goldsmith C. S., Balish A. CDC Atlanta (http://www.cdc.gov/media/subtopic/libraiy/diseases.htm)

56. Gomez-Puertas P., Albo C., Perez-Pastrana E., Vivo A., Portela A. Influenza virus matrix protein is the major driving force in virus budding. J. Virol. 2000, 7, 11538-11547.

57. Gonzalez S., Ortin J. Characterization of influenza virus PB1 protein binding to viral RNA: two separate regions of the protein contribute to the interaction domain. J. Virol. 1999, 73, 631-637.

58. Gottshalk A. The chemistry of virus receptor. The viruses. 1959, 51 61.

59. Ha Y., Stevens D.J., Skehel J.J., Wiley D.C. H5 avian and H9 swine influenza virus haemagglutinin structures: possible origin of influenza subtypes. EMBO J. 2002, 21, 865-875.

60. Ha Y., Stevens D.J., Skehel J .J., Wiley D.C. X-ray structure of H5 avian and H9 swine influenza virus hemagglutinins bound to avian and human receptor analogs. Proc. Natl. Acad. Sci. 2001, 98, 11181-11186.

61. Hagen M., Chung T.D., Butcher J.A., Krystal M. Recombinant influenza virus polymerase: requirement of both 5'and 3' viral ends for endonuclease activity. J. Virol. 1994, 68, 1509-1515.

62. Hatta M., Gao P., Halfmann P., Kawaoka Y. Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses. Science. 2001, 293, 1840-1842.

63. Hoffinann E., Lipatov A.S., Webby R.J., Govorkova E.A., Webster R.G. Role of specific hemagglutinin amino acids in the immunogenicity and protection of H5N1 influenza virus vaccines. Proc. Natl. Acad. Sci. 2005, 102, 12915-12920.

64. Holsinger L.J., Nichani D., Pinto L.H., Lamb R.A. Influenza A virus M2 ion channel protein, a structure-function analysis. J. Virol. 1994, 68, 1551-1563.

65. Honda A., Mizumoto K., Ishihama A. Two separate sequences of PB2 subunit constitute the RNA cap-binding site of influenza virus RNA polymerase. Genes Cells. 1999, 4, 475-485.

66. Horimoto T., Kawaoka Y. Biologic effects of introducing additional basic amino acid residues into the hemagglutinin cleavage site of a virulent avian influenza virus. Virus Res. 1997, 50, 35-40.

67. Horimoto T., Kawaoka Y. Reverse genetics provides direct evidence for a correlation of hemagglutinin cleavability and virulence of avian influenza A virus. J.Virol. 1994, 68, 3120-3128.

68. Huang R.T., Wahn K., Klenk H.D., Rott R. Fusion between cell membrane and liposomes containing the glycoproteins of influenza virus. Virology. 1980, 104, 294-302.

69. Huarte M., Falcon A., Nakaya Y., Ortín J., García-Sastre A., Nieto A. Threonine 157 of influenza virus PA polymerase subunit modulates RNA replication in infectious viruses. J. Virol. 2003, 77, 6007-6013.

70. Inglis S.C., Gething M.J., Brown C.M. Relationship between the messenger RNAs transcribed from two overlapping genes of influenza virus. Nucleic Acids Res. 1980, 8, 3575-3589.

71. Jackson D.C., Nestorowicz A. antigenic determinants of influenza virus hemagglutinin. Virology. 1985, 145, 72-83.

72. Jiao P., Tian G., Li Y., Deng G., Jiang Y., Liu C., Liu W., Bu Z., Kawaoka Y., Chen H. A single-amino-acid substitution in the NS1 protein changes the pathogenicity of H5N1 avian influenza viruses in mice. J. Virol. 2008, 82, 1146-1154.

73. Katz J.M., Lu X., Tumpey T.M., Smith C.B., Shaw M.W., Subbarao K. Molecular correlates of influenza A H5N1 virus pathogenesis in mice. J. Virol. 2000, 74, 10807-10810.

74. Katz J.M., Webster R.G. Amino acid sequence identity between the HA1 of influenza A (H3N2) viruses grown in mammalian and primary chick kidney cells. J. Gen. Virol. 1992, 73, 1159-1165.

75. Kawaoka Y., Webster R.G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 1988, 85, 324-328.

76. Kell W., Klenk H.D., Schwarz R.T. Carbohydrates of influenza virus. III. Nature of oligosaccharide-protein linkage in viral glycoproteins. J. Virol. 1979,31,253-256.

77. Kell W., Niemann H., Schwars R.T., Klenk H.D. Carbohydrates of influenza virus. V. Oligosaccharides attached to individual glycosylation sites of the hemagglutinin of fowl plaque virus. Virology. 1984, 133, 77-91.

78. Klenk H.D., Compans R.W., Choppin W.P. An electron microscopic study of the presence or absence of neuraminic acid in enveloped viruses. Virology. 1970, 42, 1158-1162.

79. Klenk H.D., Garten W. Host cell proteases controlling virus pathogenicity. Trends. Microbiol. 1994, 2, 39-43.

80. Klenk H.D., Rott R., Orlich M., Biodorn J. Activation of influenza A viruses by trypsin treatment. Virology. 1975, 68, 426-439.

81. Krug R.M., Etkind P.R. Cytoplasmic and nuclear virus-specific proteins in influenza virus-infected MDCK cells. Virology. 1973, 56, 334-348.

82. Krug R.M., Soeiro R. Studies on the intranuclear localization of influenza virus-specific proteins. Virology. 1975, 64, 378-387.

83. Lai C.J, Markoff L.J, Zimmerman S., Cohen B., Berndt J.A., Chanock R.M. Cloning DNA sequences from influenza viral RNA segments. Proc Natl. Acad. Sci. 1980, 77,210-214.

84. Lamb R.A., Choppin P.W. Identification of a second protein (M2) encoded by RNA segment 7 of influenza virus. Virology. 1981, 112, 729-737.

85. Lamb R.A., Choppin P.W. The gene structure and replication of influenza virus. Ann. Rev. Biochem. 1983, 52, 467-506.

86. Lamb R.A., Krug R.M. Orthomyxoviridae. In: Fields Virology. Section 2, Specific Virus Families. Eds B.N. Fields and D.M. Knipe, Lippincott, Williams & Wilkins, 2001, 1091-1137.

87. Lamb R.A., Lai C.J. Conservation of the influenza virus membrane protein (Ml) amino acid sequence and an open reading frame of RNA segment 7 encoding a second protein (M2) in H1N1 and H3N2 strains. Virology. 1981, 112, 746-751.

88. Lamb R.A., Lai C.J., Choppin P.W. Sequences of mRNAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus: colinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 1981, 78, 4170-4174.

89. Laver W.G., Air G.M., Dopheide T.A., Ward C.W. Amino acid sequence changes in the haemagglutinin of A/Hong Kong (H3N2) influenza virus during the period 1968-77. Nature. 1980, 283, 454-457.

90. Laver W.G., Air G.M., Webster R.G. Mechanism of antigenic drift in influenza vims. Amino acid sequence changes in an antigenically active region of Hong Kong (H3N2) influenza virus hemagglutinin. J. Mol. Biol. 1981, 145,339-361.

91. Laver W.G., Gerhard W., Webster R.G, Frankel M.E., Air G.M. Antigenic drift in type A influenza virus: peptide mapping and antigenic analysis of A/PR/8/34 (HON1) variants selected with monoclonal antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1425-1429.

92. Lazarowitz S., Choppin P. Enhancement of the infectivity of influenza A and B viruses by proteolytic cleavage of the hemagglutinin polypeptide. Virology. 1975, 68, 440-454.

93. Lazarowitz S.G., Compans R.W., Choppin P.W. Influenza virus structural and nonstructural proteins in infected cells and their plasma membranes. Virology. 1971, 46, 830-843.

94. Li M.L., Ramirez B.C., Krug R.M. RNA-dependent activation of primer RNA production by influenza virus polymerase: different regions of the same protein subunit constitute the two required RNA-binding sites. EMBO J. 1998, 17, 5844-5852.

95. Li M.L., Rao P., Krug R.M. The active sites of the influenza cap-dependent endonuclease are on different polymerase subunits. EMBO J. 2001, 20, 2078-2086.

96. Li Z., Chen H., Jiao P., Deng G., Tian G., Li Y., Hoffmann E., Webster R.G, Matsuoka Y., Yu K. Molecular basis of replication of duck H5N1 influenza viruses in a mammalian mouse model. J. Virol. 2005, 79, 12058-12064.

97. Lipatov A.S., Govorkova E.A., Webby R.J., Ozaki H., Eiris M., Guan Y., Poon L., Webster R.G. Influenza: emergence and control. J. Virol. 2004, 78, 8951-8959.

98. Lu X., Tumpey T.M., Morken T., Zaki S.R., Cox N.J., Katz J.M. A mouse model for the evaluation of pathogenesis and immunity to influenza A (H5N1) viruses isolated from humans. J. Virol. 1999, 73, 5903-5911.

99. Lu Y., Qian X.Y., Krug R.M. The influenza virus NS1 protein: a novel inhibitor of pre-mRNA splicing. Genes. Dev. 1994, 8, 1817-1828.

100. Lu Y., Wambach M., Katze M.G., Krug R.M. Binding of the influenza virus NS1 protein to double-stranded RNA inhibits the activation of the proteinkinase that phosphorylates the elF-2 translation initiation factor. Virology. 1995,214, 222-228.

101. Maeda Y., Horimoto T., Kawaoka Y. Classification and genome structure of influenza virus. Nippon Rinsho. 2003, 61, 1886-1891.

102. Martin K., Helenius A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: the viral matrix protein (Ml) promotes export and inhibits import. Cell. 1991, 67, 117-130.

103. Matrosovich M., Zhou N., Kawaoka Y., Webster R.G. The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties. J. Virol. 1999, 73, 11461155.

104. Naffakh N., Massin P., van der Werf S. The transcription/ replication activity of the polymerase of influenza A viruses is not correlated with the level of proteolysis induced by the PA subunit. Virology 2001, 285, 244-252.

105. Nakajima K. Influenza virus genome structure and encoded proteins. Nippon Rinsho. 1997, 55, 2542-2546.

106. Nakamura K., Compans R.W. Glycopeptide components of influenza viral glycoproteins. Virology. 1978, 86, 432-442.

107. Nakamura K., Compans R.W. Host cell- and virus strain-dependent differences in oligosaccharides of hemagglutinin glycoproteins of influenza A viruses. Virology. 1979, 95, 8-23.

108. Ohtsu Y., Honda Y., Sakata Y., Kato H., Toyoda T. Fine mapping of the subunit binding sites of influenza virus RNA polymerase. Microbiol. Immunol. 2002, 46, 167-175.

109. Oxford J.S., Hockley D.J. Orthomyxoviridae. Animal virus structure. 1987, 213-232.

110. Palese P. New biochemical techniques for the characterization of viruses to assist the epidemiologist. J. Infect. Dis. 1980, 142, 633-635.

111. Palese P., Elliott R., Baez M. Genetic variation among influenza viruses. Academic Press. 1981, 127-140.

112. Palese P., Schulman J.L. Differences in RNA patterns of influenza A viruses. J. Virol. 1976, 17, 876-884.

113. Palese P., Shaw M.L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. In: Fields Virology. Eds Knipe D.M. and Howley P.M., Lippincott, Williams & Wilkins, 2007, 2, 1648-1678.

114. Palese P., Tobita K., Ueda M., Compans R.W. Characterization of temperature sensitive influenza virus mutants defective in neuraminidase. Virology. 1974, 61, 397-410.

115. Patterson K.D., Pyle G.F. The geography and mortality of the 1918 influenza pandemic. Bull Hist Med. 1991, 65, 4-21.

116. Peiris J.S., de Jong M.D., Guan Y. Avian Influenza Virus (H5N1): a Threat to Human Health. Clin. Micro. Rev. 2007, 243-267.

117. Philpott M., Hioe C., Sheerar M., Hinshaw V.S. Hemagglutinin mutations related to attenuation and altered cell tropism of a virulent avian influenza A virus. J. Virol. 1990, 64,2941-2947.

118. Pons M.W., Schulze I.T., Hirst G.K., Hauser R. Isolation and characterization of the ribonucleoprotein of influenza virus. Virology. 1969, 39, 250-259.

119. Poole E., Elton D., Medcalf L., Digard P. Functional domains of the influenza A virus PB2 protein: identification of NP- and PB1-binding sites. Virology. 2004, 321, 120-133.

120. Porter A.G., Barber C., Carey N.H., Hallewell R.A., Threlfall G., Emtage J.S. Complete nucleotide sequence of an influenza virus hemagglutinin gene from cloned DNA. Nature. 1979, 282, 471-477.

121. Privalsky M.L., Penhoet E.E. Influenza virus proteins: identity, synthesis, and modification analyzed by two-dimensional gel electrophoresis. Proc. Natl. Acad. Sci. 1978, 75, 3625-3629.

122. Privalsky M.L., Penhoet E.E. Phosphorylated protein component present in influenza virions. J. Virol. 1977, 24, 401-405.

123. Privalsky M.L., Penhoet E.E. The structure and synthesis of influenza virus phosphoproteins. J. Biol. Chem. 1981, 256, 5368-5376.

124. Qian X.Y., Alonso-Caplen F., Krug R.M. Two functional domains of the influenza virus NS1 protein are required for regulation of nuclear export of mRNA. J. Virol. 1994, 68, 2433-2441.

125. Qiu Y., Krug R.M. The influenza virus NS1 protein is a poly(A)-binding protein that inhibits nuclear export of mRNAs containing poly(A). J. Virol. 1994, 68, 2425-2432.

126. Qiu Y., Nemeroff M., Krug R.M. The influenza virus NS1 protein binds to a specific region in human U6 snRNA and inhibits U6-U2 and U6-U4 snRNA interactions during splicing. RNA. 1995, 1, 304-316.

127. Rafelson M.E., Jr., SCHNEIR M., WILSON V.W. Jr. Studies on the neuraminidase of influenza virus. II. Additional properties of the, enzymes from the Asian and PR 8 strains. Arch Biochem Biophys. 1963, 103, 424430.

128. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am. J. Hyg. 1938, 27, 493-497.

129. Robertson J.S., Bootman J.S., Newman R., Oxford J.S., Daniels R.S., Webster R.G., Schild G.C. Structural changes in the haemagglutinin whichaccompany egg adaptation of an influenza A(H1N1) virus. Virology. 1987, 160,31-37.

130. Rogers G.N., Paulson J.C. Receptor determinants of human and animal influenza virus isolates: differences in receptor specificity of the H3 hemagglutinin based on species of origin. Virology. 1983, 127, 361-373.

131. Rogers G.N., Pritchett T.J., Lane J.L., Paulson J.C. Differential sensitivity of human, avian, and equine influenza A viruses to a glycoprotein inhibitor of infection: selection of receptor specific variants. Virology. 1983, 131, 394408.

132. Rott R. Molecular basis of infectivity and pathogenicity of myxovirus. Brief review. Arch Virol. 1979, 59, 285-298.

133. Rott R., Becht H., Orlich M. The significance of influenza virus neuraminidase in immunity. J. Gen. Virol. 1974, 22, 35-41.

134. Rott R., Reinacher M., Orlich M., Klenk H.D. Cleavability of hemagglutinin determines spread of avian influenza viruses in the chorioallantoic membrane of chicken embryo. Arch. Virol. 1980, 65, 123-133.

135. Rudneva I.A., Ilyushina N.A., Timofeeva T.A., Webster R.G., Kaverin N.V. Restoration of virulence of escape mutants of H5 and H9 influenza viruses by their readaptation to mice. J. Gen. Virol. 2005, 86, 2831-2838.

136. Russell R.J., Gamblin S.J., Haire L.F., Stevens D.J., Xiao B., Ha Y., Skehel J.J. HI and H7 influenza hemagglutinin structures extend a structural classification of hemagglutinin subtypes. Virology. 2004, 325, 287-296.

137. Sanz-Ezquerro J.J., de la Luna S., Ortin J., Nieto A. Individual expression of influenza virus PA protein induces degradation of coexpressed proteins. J. Virol. 1995, 69, 2420-2426.

138. Schild G.C. Evidence for a new type-specific structural antigen of the influenza virus particle. J. Gen. Virol. 1972, 15, 99-103.

139. Schulman J.L., Khakpour M., Kilbourne E.D. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice. J. Virol. 1968, 2, 778-786.

140. Schulman J.L., Palese P. Selection and identification of influenza virus recombinants of defined genetic composition. J. Virol. 1976, 20, 248-254.

141. Schulman J.L., Palese P. Virulence factors of influenza A viruses: WSN virus neuraminidase required for plaque production in MDBK cells. J Virol. 1977, 24, 170-176.

142. Schulze I.T. The structure of influenza virus. II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 1972, 47, 181196.

143. Schwarz R.T., Schmidt M.F., Anwer U., Klenk H.D. Carbohydrates of influenza virus. I. Glycopeptides derived from viral glycoproteins after labeling with radioactive sugars. J. Virol. 1977, 23, 217-226.

144. Seo S. H., Hoffmann E., Webster R. G. The NS1 gene of H5N1 influenza viruses circumvents the host anti-viral cytokyne responses. Virus. Res. 2005, 103, 107-113.

145. Seo S.H., Hoffmann E., Webster R.G. Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses. Nat. Med. 2002, 8, 950-954.

146. Shestopalov A.M., Durimanov A.G., Evseenko V.A., Ternovoi V.A., Rassadkin Y.N., Razumova Y.V., Zaykovskaya A.V., Zolotykh S.I., Netesov S.V. H5N1 influenza virus, domestic birds, Western Siberia, Russia. Emerg. Infect. Dis. 2006, 12, 1167-1168.

147. Skehel J J. Polypeptide synthesis in influenza virus-infected cells. Virology. 1972, 49, 23-36.

148. Skehel J.J., Waterfields M.D. Studies on primary structure of the influenza virus hemagglutinin. Proc. Natl. Acad. Sci. 1975, 72, 93-97.

149. Smimov Y.A., Lipatov A.S., Van Beek R., Gitelman A.K., Osterhaus A.D., Claas E.C. Characterization of adaptation of an avian influenza A (H5N2) virus to a mammalian host. Acta. Virol. 2000, 44, 1-8.

150. Stevens J., Blixt O., Tumpey T.M., Taubenberger J.K., Paulson J.C., Wilson I.A. Structure and receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1 influenza virus. Science, 2006, 312, 404-410.

151. Suarez D.L., Perdue M.L., Cox N., Rowe T., Bender C., Huang J., Swayne D.E. Comparisons of highly virulent H5N1 influenza A viruses isolated from humans and chickens from Hong Kong. J. Virol. 1998, 78, 6678-6688.

152. Subbarao E.K., London W., Murphy B.R. A single amino acid in the PB2 gene of influenza A virus is a determinant of host range. J. Virol. 1993, 67, 1761-1764.

153. Sugiura A., Ueda M. Neurovirulence of recombinants between virulent and avirulent virus strains. Virology. 1980, 101, 440-449.

154. Sun L., Lu X., Li C., Wang M., Liu Q., Li Z., Liu F., Li Q., Belser J.A.,

155. Hancock K., Shu Y., Katz J.M., Liang M., and Li D. Generation, characterization and epitope mapping of two neutralizing and protective human recombinant antibodies against influenza A H5N1 viruses. PLoS ONE. 2009, 4, 5476.

156. Taubenberger J.K. The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus. Proc. Am. Philos. Soc. 2006, 150, 86-112.

157. Taubenberger J.K., Reid A.H., Lourens R.M., Wang R., Jin G., Fanning T.G. Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes. Nature. 2005, 437, 889-893.

158. Tsuchiya E., Sugawara K., Hongo S., Matsuzaki Y., Muraki Y., Li Z.N., Nakamura K. Antigenic structure of the haemagglutinin of human influenza A/H2N2 vims. J.Gen.Virol. 2001, 82, 2475-2484.

159. Tumpey T.M., Basler C.F., Aguilar P.V., Zeng H., Solorzano A., Swayne D.E., Cox N.J., Katz J.M., Taubenberger J.K., Palese P., García-Sastre A. Characterization of the reconstructed 1918 spanish influenza pandemic virus. Science. 2005, 310, 77-80.

160. Twu K.Y., Kuo R.L., Marklund J., Krug R.M. The H5N1 influenza virus NS genes selected after 1998 enhance virus replication in mammalian cells. J. Virol. 2007,81,8112-8121.

161. Ulmanen I., Broni B.A., Krug R.M. Role of two of the influenza virus core P proteins in recognizing cap 1 structures (m7GpppNm) on RNAs and ininitiating viral RNA transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. 1981, 78, 73557359.

162. Varghese J.N., Colman P.M. Three-dimensional structure of the neuraminidase of influenza virus A/Tokyo/3/67 at 2.2 A resolution. J. Mol. Biol. 1991,221,473-486.

163. Varghese J.N., Laver W.G., Colman P.M. Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9 A resolution. Nature. 1983, 303, 35-40.

164. Varghese J.N., McKimm-Breschkin J., Caldwell J.B., Kortt A.A., Colman P.M. The structure of the complex between influenza virus neuraminidase and sialic acid, the viral receptor. Proteins Struct Funct Genetics. 1992, 14, 327-332.

165. Veit M., Kretzschmar E., Kuroda K., Garten W., Schmidt M.F., Klenk H.D., Rott R. Site-specific mutagenesis identifies three cysteine residues in the cytoplasmic tail as acylation sites of influenza virus hemagglutinin. J. Virol. 1991,65,2491-2500.

166. Ward C.W., Dopheide T.A. Primary structure of the Hong Kong (H3) haemagglutinin. Br. Med. Bull. 1979, 35, 51-56.

167. Waterfield M., Espelie K., Elder K., Skehel J. Structure of the haemagglutinin of influenza virus. Br. Med. Bull. 1979, 35, 57-63.

168. Waterfield M., Gething M.J., Scrace G., Skehel J. Structure and Variation in Influenza Virus. Elsevier. 1980, 11-20.

169. Webster R.G., Laver W.G. Preparation and properties of antibody directed specifically against the neuraminidase of influenza virus. J. Immunol. 1967, 99, 49-55.

170. Wharton S.A., Weis W., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure, function and antigenicity of the hemagglutinin of influenza virus. The Influenza Viruses. 1989, 153-174.

171. White J., Matlin K., Helenius A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 1981, 89, 674-679.

172. Wiley D.C., Shekel J.J. the structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annu. Rev. Biochem. 1987, 56, 365-394.

173. Wiley D.C., Skehel J.J., Waterfield M. Evidence from studies with a cross-linking reagent that the haemagglutinin of influenza virus is a trimer. Virology. 1977, 79, 446-448.

174. Wiley D.C., Wilson I.A., Skehel J.J. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza hemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature. 1981, 289, 373-378.

175. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A resolution. Nature. 1981, 289, 366-373.

176. Winter G., Fields S. Cloning of influenza cDNA ino M13: the sequence of the RNA segment encoding the A/PR/8/34 matrix protein. Nucleic Acids Res. 1980, 8, 1965-1974.

177. Winter G., Fields S. The structure of the gene encoding the nucleoprotein of human influenza virus A/PR/8/34. Virology 1981, 114, 423-428.

178. Wrigley N.G., Brown E.B., Daniels R.S., Douglas A.R., Shekel J J., Wiley D.C. Electrone microscopy of influenza hemagglutinin-monoclonal antibody complexes. Virology. 1973, 131, 308-314.

179. Wu W.L., Chen Y., Wang P., Song W., Lau S.Y., Rayner J.M., Smith G.J., Webster R.G., Peiris J.S., Lin T., Xia N., Guan Y., Chen H. Antigenic profile of avian H5N1 viruses in Asia from 2002 to 2007. J. Virol. 2008, 82, 1798-1807.

180. Xu R., McBride R., Paulson J.C., Basler C.F., Wilson I.A. Structure, receptor binding, and antigenicity of influenza virus hemagglutinins from the 1957 H2N2 pandemic. J. Virol. 2010, 84, 1715-1721.

181. Yewdell J.W., Webster R.G., Gerhard W.U. Antigenic variation in three distinct determinants of an influenza type A haemagglutinin molecule. Nature. 1979, 279, 246-248.

182. Zhirnov O.P. Solubilization of matrix protein Ml/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 1990, 176, 274-279.

Информация о работе

Крылов, Петр Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Антигенное картирование молекулы гемагглютинина вируса гриппа H5N1 и влияние изменения антигенной структуры на вирулентность - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Антигенное картирование молекулы гемагглютинина вируса гриппа H5N1 и влияние изменения антигенной структуры на вирулентность - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы